CN115884793A - 具有含肽接头的位点特异性抗体-药物缀合物 - Google Patents

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M·I·达梅林
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Abstract

本公开内容总体上涉及包含含肽接头的抗体‑药物缀合物和作为治疗剂和/或诊断剂来使用这些缀合物的方法。本文还公开了可用于与靶向部分(例如，抗体)、药物或二者缀合以产生所述抗体‑药物缀合物的含肽支架。

Description

具有含肽接头的位点特异性抗体-药物缀合物
相关申请
本申请要求2020年1月9日提交的美国临时申请号62/958,916和2020年6月18日提交的63/040,735的优先权和利益。这些申请各自的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表的引用并入
2021年1月6日创建，大小为49KB，名称为“MRSN-029_001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
传统上，药物主要由经口(作为固体药丸和液体)或作为注射剂分配的小分子组成。在过去三十年里，制剂(即，控制药物递送的途径和/或速率和允许在需要的位点递送治疗剂的组合物)已变得日益常见和复杂。然而，关于新疗法的开发以及施用它们的机制的许多问题和挑战仍待解决。例如，许多药物显示有限或否则降低的效力和治疗效果，这是因为它们一般在到达体内的所需靶标之前经受部分降解，在并非靶标的组织中积累，和/或具有短的半衰期。
因此，药物递送系统领域中的一个目标是通过可利用生理学或化学机制或二者稳定药物和/或延长半衰期和控制治疗剂的体内转移的系统，递送完整的药物至特异性靶向的身体区域。
已开发抗体-药物缀合物作为靶标特异性治疗剂。针对各种癌细胞-表面抗原的抗体已与不同的细胞毒性剂，包括但不限于微管蛋白抑制剂(例如，美登素类、奥瑞他汀类和紫杉烷类，参见例如美国专利号5,208,020；5,416,064；6,333,410；6,441,163；6,340,701；6,372,738；6,436,931；6,596,757；和7,276,497)和DNA-相互作用治疗剂(例如，卡奇霉素、阿霉素和CC-1065类似物，参见例如美国专利号5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,534,660；6,756,397；和6,630,579)缀合。具有这些细胞毒性药物中的一些的抗体-药物缀合物正在临床中被活跃研究用于癌症疗法(参见例如，Ricart,A.D.和Tolcher,A.W.,2007,Nature Clinical Practice,4,245-255；Krop等,2010,J.Clin.Oncol.,28,2698-2704)。然而，现有的抗体-药物缀合物已表现出局限性。主要的局限性是它们因为有限数量的靶向抗原和/或癌症药物例如奥瑞他汀类、甲氨蝶呤、柔红霉素、美登素类、紫杉烷类和长春新碱的相对中等的细胞毒性而不能递送足够浓度的药物至靶标位点。一种实现显著细胞毒性的方法是通过直接或间接地连接大量的药物分子至抗体。然而，如此大量修饰的抗体通常表现出与靶标抗原的结合受损和/或从血流中快速体内清除。因此，需要改进递送足够浓度的药物至靶标使得药物的最大细胞毒性得以实现的能力。
通过共价键将药物部分缀合至抗体通常导致异质的分子混合物，其中药物部分在抗体上的多个位点连接。在一些实施方案中，细胞毒性药物通常已经通过抗体的赖氨酸或半胱氨酸残基被缀合到抗体，从而产生异质的抗体-药物缀合物混合物。根据反应条件，异质的混合物通常含有0至约8个在抗体上的各个位点连接的药物部分的分布。分析和制备方法不足以分离和表征从缀合反应产生的异质混合物内的这些抗体-药物缀合物种类分子。另外，因为控制反应条件的困难，缀合过程可能是不可再现的。因此，需要可再现地产生具有位点特异性(关于抗体中的缀合位点)和/或化学计量学(关于抗体和药物之间的比率)的抗体-药物缀合物。
发明内容
本公开内容的特征在于具有位点特异性的抗体-药物缀合物。这些位点特异性靶向部分-药物缀合物表现出受控的药物载量以及与靶标抗原的强结合。在一些实施方案中，靶向部分是基于蛋白质的识别分子(PBRM)。本公开内容的特征还在于含肽支架，其可用于与PBRM、药物或二者缀合，以获得靶向部分-药物缀合物。
在一些方面，本公开内容提供了式(I’)的抗体-药物缀合物：
Figure GDA0004100926510000031
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
d13是1-约12的整数；
抗体是修饰的抗体；
LP’是将修饰的抗体连接至MP的二价接头部分；其中相应的单价部分LP包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的官能团形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM是键，或三价或四价接头，并且当LM是键时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000032
表示T1和MA的直接或间接连接；
D的每次出现独立地是具有分子量≤约5kDa的治疗剂；以及
LD的每次出现独立地是将D连接至MA的二价接头部分，并且包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些方面，本公开内容提供抗体-药物缀合物，具有式(XXX)：
Figure GDA0004100926510000041
其中每个RA是
Figure GDA0004100926510000042
其中d13是2；和抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团。
本公开内容还提供了包含所述缀合物的组合物、其制备方法和其治疗各种病症，包括但不限于癌症的使用方法。
在一些实施方案中，本公开内容进一步涉及药物组合物，其包含本文所述的支架或缀合物和药学上可接受的载体。
在一些方面，本公开内容涉及用于制备抗体-药物缀合物的方法。
在一些方面，本公开内容涉及用于制备抗体-药物缀合物的方法，其包括本文所述的一个或多个步骤。
在一些实施方案中，本公开内容涉及缀合物或方法，其中在治疗第一天和之后每三周或四周以约7mg/m2至162mg/m2的剂量将有效量的缀合物给予受试者。
在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的受试者的病症(例如，癌症)的方法，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的病症(例如，癌症)的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物用于治疗有需要的受试者的病症(例如，癌症)的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的病症(例如，癌症)，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及在怀疑具有病症的受试者中诊断所述病症的方法。所述方法包括给予怀疑具有所述病症的受试者有效量的本文所述的缀合物，或进行测定以检测来自所述受试者的样品中的靶标抗原/受体，以确定所述受试者是否表达靶标抗原或受体。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文清楚另外指明。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料通过引用结合。本文引用的参考资料不被承认是要求保护的发明的现有技术。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不意图是限制性的。
本发明的其它特征和优势根据以下详细描述和权利要求是明显的。
附图说明
图1是显示抗体聚糖的不同糖型(G0、G1、G2、G0F、GIF、G2F和M5)的图。
图2是显示在存在内切糖苷酶的情况下糖型G0、G1、G2、G0F、GIF、G2F和M5的混合物的去糖基化的方案。
图3是显示用于制备叠氮基-修饰的抗体的方法的方案，其中包含末端-GlcNAc部分的中间体抗体与叠氮基-修饰的UDP-GalNAc衍生物分子在存在糖基转移酶的情况下反应。
图4是显示制备叠氮基-修饰的抗体的方法的实施方案的方案。
图5是显示制备抗体-药物缀合物的方法的实施方案的方案，其中叠氮基-修饰的抗体缀合至包含紧绷的(strained)环炔基的接头-药物部分。
图6是显示修饰的抗体的图。
图7是显示在携带OVCAR3肿瘤的小鼠模型中XMT-1535抗体-药物缀合物：0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷的缀合物11，0.025mg/kg、0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷的缀合物7，和0.1mg/kg有效载荷的未结合对照缀合物10的抗肿瘤功效的图。
图8是显示在NSCLC PDX CTG-0852小鼠模型中XMT-1535抗体-药物缀合物：0.025mg/kg、0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷的缀合物7，和0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷的未结合对照缀合物10的抗肿瘤功效的图。
图9是显示在携带JIMT-1肿瘤的小鼠模型中HER2抗体-药物缀合物：0.067mg/kg和0.199mg/kg有效载荷的缀合物9和缀合物13的抗肿瘤功效的图。
图10是显示在携带JIMT-1肿瘤的小鼠模型中HER2抗体-药物缀合物：各自0.017mg/kg、0.033mg/kg或0.067mg/kg有效载荷的缀合物8和缀合物12以及0.067mg/kg有效载荷的未结合对照抗体-药物缀合物缀合物10的抗肿瘤功效的图。
图11-18显示在大鼠中在响应缀合物11或缀合物7暴露时的毒理学参数(分别为AST、ALT、ALP、RBC、WBC、中性粒细胞、淋巴细胞和血红蛋白)的水平。
图19-21显示在大鼠中在响应缀合物8或缀合物12暴露时的关键毒理学参数(分别为AST、ALT和ALP)的水平。
具体实施方式
本公开内容提供新的靶向部分-药物缀合物、用于制备所述缀合物的支架、用于制备所述缀合物或支架的合成方法、含有所述支架和/或缀合物的药物组合物以及其各种用途。
定义
在一些实施方案中，本公开内容的化合物和特定官能团的定义也在本文中更详细描述。为了本公开内容的目的，化学元素根据化学和物理手册第75版内封面的元素周期表CAS版本来识别，并且特定官能团通常按其中所述来定义。此外，有机化学的一般原理以及特定的官能部分和反应性描述于“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,UniversityScience Books,Sausalito:1999，其整体内容通过引用并入本文。此外，本领域普通技术人员将理解，本文所述的合成方法利用各种保护基。
在以下说明书和权利要求书中冠词“一个”、“一种”和“所述”的使用应解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有(having)”、如在“具有化学式”中的“具有(being of)”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)，除非另外注明，否则允许但不要求包括另外的要素或步骤。在一些实施方案中，具有某一式的支架包括该式中显示的所有组件，并且也可能包括该式中未显示的另外的组件。此外，每当在实施方案中使用“包含”或其它开放式术语时，应理解可使用中间术语“基本上由……组成”或封闭式术语“由……组成”来更小范围地保护所述实施方案。
如本文使用的，表述“A、B或C中的一个或多个”、“一个或多个A、B或C”、“A、B和C中的一个或多个”、“一个或多个A、B和C”等可互换使用，并且全都指从A、B和/或C中的选择，即一个或多个A、一个或多个B、一个或多个C、或其任何组合。
术语“约”、“大约”或“大概”，当结合数值使用时，意指包括值合集或范围。例如，“约X”包括±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％或±0.1％的X的值范围，其中X是数值。
值范围的描述仅意图用作分别提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另外指明，并且每个单独值结合到说明书中，如同其在本文中分别描述一样。除非另外指明，本文使用的范围包括该范围的两个端值。例如，表述“x是1和6之间的整数”和“x是1-6的整数”都意指“x是1、2、3、4、5或6”，即术语“X和Y之间”和“X-Y的范围”包括X和Y以及它们之间的整数。
“保护基”：如本文使用的，术语保护基意指特定的官能部分，例如O、S或N，被临时封闭，使得反应可在多官能化合物的其它反应位点选择性进行。如本文详述的，可使用氧、硫、氮和碳保护基。在一些实施方案中，可使用示例性的氧保护基。在一些实施方案中，使用氮保护基。在一些实施方案中，可使用示例性的硫保护基。此外，各种保护基描述于“Protective Groups in Organic Synthesis”Third Ed.Greene,T.W.和Wuts,P.G.编辑,John Wiley&Sons,NewYork:1999，其整体内容通过引用结合到本文中。
“离去基”是指在键异裂时携带一对电子离开的分子片段。离去基可以是阴离子或中性分子。离去基包括但不限于卤化物，例如Cl-、Br-和I-，磺酸酯，例如对甲苯磺酸酯("甲苯磺酸酯"、TsO-)和RC(O)O-，其中R是H、脂肪族、杂脂肪族、碳环或杂环烷基部分。
“糖"是指单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。术语"糖衍生物"是指单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括但不限于，氨基糖和糖酸。糖衍生物的实例还包括表示为S’(F’)X1的化合物，其中S’是糖或糖衍生物，F’是官能团，以及x1表示官能团的数量。
如本文使用的术语“核心-GlcNAc部分”是指包含与抗体连接(例如，通过GlcNAc的C1位置)的GlcNAc(例如，核心-GlcNAc)的单糖、多糖或寡糖部分。在一些实施方案中，GlcNAc通过与抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子的N-糖苷键连接至抗体。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分存在于抗体的天然糖基化位点或在抗体上的不同位点引入。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分是单糖(例如，核心-GlcNAc部分也是末端-GlcNAc部分)。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖，例如，核心-GlcNAc部分是二糖核心-GlcNAc-(α1-6-Fuc)部分(其可称为GlcNAc(Fuc))。因此，当抗体包含核心-GlcNAc部分时，抗体可包含单糖或二糖核心-GlcNAc部分，并且核心-GlcNAc部分可进一步包含岩藻糖(例如，二糖核心-GlcNAc(Fuc)部分)。如果核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖，岩藻糖可经α-1,6连接至核心-GlcNAc部分的O-6。进一步包含岩藻糖的核心-GlcNAc部分可称为核心-GlcNAc(Fuc)。
术语“核心-GlcNAc”是指作为多糖或寡糖的一部分的内部GlcNAc，其中多糖或寡糖通过内部GlcNAc连接至抗体。
如本文使用的术语“末端-GlcNAc部分”是指包含GlcNAc的部分，所述GlcNAc连接至抗体并具有可用于进一步修饰(例如，用P”-S”-A”的化合物)的末端官能团。在一些实施方案中，末端-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。在一些实施方案中，末端-GlcNAc部分通过糖蛋白(例如，抗体聚糖)的核心-GlcNAc部分与内切糖苷酶反应来形成。
"核苷酸"以其普通的科学含义使用，并且是指由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)和一个、两个或三个磷酸酯基团构成的分子。在没有磷酸酯基团的情况下，核碱基和糖构成核苷。核苷酸因此也可称为单磷酸核苷、二磷酸核苷或三磷酸核苷。核碱基可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
"蛋白质"以其普通的科学含义使用，并且包括包含约10或更多个氨基酸的多肽。蛋白质可包含天然或非天然氨基酸。
"糖蛋白"在本文以其普通的科学含义使用，并且是指包含与蛋白质共价键合的一个或多个单糖或寡糖链("聚糖")的蛋白质。聚糖可连接至蛋白质上的羟基(O-连接的聚糖)，蛋白质上的酰胺官能(N-糖蛋白)或蛋白质上的碳(C-糖蛋白)。糖蛋白可包含超过一种聚糖，可包含一种或多种单糖和一种或多种寡糖聚糖的组合，和可包含N-连接、O-连接和C-连接的聚糖的组合。估计全部蛋白质中超过50％具有某种形式的糖基化，因此称为糖蛋白。
"聚糖"在本文中以其普通的科学含义使用，并且是指与蛋白质连接的单糖或寡糖链。因此，聚糖是指糖蛋白的碳水化合物部分。聚糖通过一个糖的C-1碳连接至蛋白质，所述糖可以没有进一步的取代(单糖)或可以在其一个或多个羟基处被进一步取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1-约10个糖部分。然而，当较长的糖链连接至蛋白质时，所述糖链也被视为聚糖。糖蛋白的聚糖可以是单糖。聚糖也可以是寡糖。糖蛋白的寡糖链可以是线性或分支的。在寡糖中，直接连接至蛋白质的糖被称为核心糖。在寡糖中，没有直接连接至蛋白质并且连接至至少两个其它糖的糖被称为内部糖。在寡糖中，没有直接连接至蛋白质而是连接至单一其它糖，即在其一个或多个其它羟基处没有携带进一步的糖取代基的糖被称为末端糖。为避免疑惑，在糖蛋白的寡糖中可存在多个末端糖，但仅一个核心糖。聚糖可以是O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在去连接的聚糖中，单糖或寡糖聚糖键合至蛋白质的氨基酸中的C-原子。
“糖基转移酶”是指参与合成糖蛋白和糖脂上存在的复杂碳水化合物的酶的超家族。
“N-乙酰半乳糖胺基转移酶”(GalNAc-T)是催化添加N-乙酰基-D-半乳糖胺至蛋白质的N-乙酰基-D-半乳糖胺转移酶。
如本文使用的“生物相容的”意图描述在与体液或活细胞或组织接触时发挥最小破坏性或宿主反应效果的化合物。因此，如本文使用的生物相容的基团是指脂肪族、环烷基、杂脂肪族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分，其落入上文和本文定义的术语生物相容的定义内。如本文使用的术语"生物相容性"也意指化合物显示与识别蛋白质，例如天然存在的抗体、细胞蛋白质、细胞和生物系统的其它组分的最小相互作用，除非这样的相互作用是特别需要的。因此，特别意图引起上述最小相互作用的物质和官能团，例如药物和前药，被视为生物相容的。在一些实施方案中，(除了意图是细胞毒性的化合物之外，例如抗肿瘤剂)，如果在等同于化合物体内半衰期的时间内(例如，对于体内给予的化合物的50％被消除/清除所需的时间段)它们以类似于预期全身体内浓度的浓度在体外添加到正常细胞导致少于或等于1％细胞死亡，并且它们的体内给予引起最少和医学可接受的炎症、外来物反应、免疫毒性、化学毒性和/或其它此类不良作用，则化合物是“生物相容的”。在上述语句中，术语“正常细胞”是指不意图受到被测试的化合物破坏或以其它方式显著影响的细胞。
“可生物降解的”：如本文使用的，“可生物降解的”化合物或部分为当被细胞摄取时可通过溶酶体或其它化学机制或通过水解分解成细胞可重新利用或处理而对细胞没有显著毒性作用的组分的那些。本文使用的术语“可生物裂解的”具有与“可生物降解的”相同的含义。一些缀合物(或它们的组分，例如含肽支架以及支架和抗体或药物分子之间的接头)的生物降解也可在细胞外，例如在动物体的低pH区域中，例如发炎的区域，在紧靠活化的巨噬细胞或释放降解促进因子的其它细胞附近提高。本文公开的缀合物或支架的完整性可例如通过尺寸排阻HPLC或LC/MS测量。尽管在一些情况下较快的降解可能是优选的，但总体上，本文公开的缀合物或支架在细胞中以不超过其片段被细胞代谢或分泌的速率的速率降解可能是更加需要的。在一些实施方案中，本文公开的缀合物或支架的生物降解副产物是生物相容的。
“亲水的”：术语"亲水的"与该术语在本领域中的常见含义没有实质不同，并且表示含有可电离、极性或可极化的原子或可能以其它方式被水分子溶剂化的化学部分。因此，如本文使用的，亲水的部分或基团是指脂肪族、环烷基、杂脂肪族、杂环烷基、芳基或杂芳基部分，其落入如上文定义的术语亲水的定义内。本文公开的化合物(包括药物、缀合物和支架)的亲水性可通过测定水合能直接测量，通过两个液相之间的研究，通过HIC色谱法，或通过具有已知疏水性的固相色谱法测定。
“多糖”、“碳水化合物”或“寡糖”：术语“多糖”、“碳水化合物”或“寡糖”是本领域已知的，并且通常是指具有化学式(CH2O)n的物质和它们的衍生物，其中通常n>2。碳水化合物是多羟基醛或多羟基酮，或通过简单的化学转换，例如水解、氧化或还原，变化成此类物质。这些循环单元(单糖)可彼此连接以形成具有很少(寡糖)或若干(多糖)单糖单元的分子。通常，具有明确定义的数量、类型和定位的单糖单元的碳水化合物被称为寡糖，而由可变数量和/或定位的单糖单元的分子的混合物组成的碳水化合物称为多糖。术语“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”在本文可互换使用。多糖可包括天然糖和/或天然存在的糖的衍生物。
“药物”：如本文使用的，术语“药物”是指具有生物学活性并且在给予有需要的受试者后提供所需的生理学作用的化合物(例如，活性药物成分)。
“前药”：如本文使用的，术语“前药”是指活性药物的前体，即，可转化为活性药物的化合物。通常，这样的前药经过体内加工，其将药物转换为生理学活性形式。在一些情况下，前药本身可具有所需的生理作用。所需的生理作用可以是例如，治疗的、细胞毒性的、免疫调节的，等等。
“细胞毒性的”：如本文所用的，术语“细胞毒性的”意指对细胞或选择的细胞群(例如，癌细胞)有毒性。毒性作用可导致细胞死亡和/或溶解。在一些实施方案中，毒性作用可以是对细胞的亚致死破坏性作用，例如减慢或阻止细胞生长。为了实现细胞毒性作用，药物或前药可以是DNA损伤剂、微管破坏剂或细胞毒性蛋白质或多肽等等。
“细胞生长抑制的”：如本文所用的，术语“细胞生长抑制的”是指抑制或阻止细胞生长和/或增殖的药物或其它化合物。
“小分子”：如本文使用的，术语“小分子”是指具有相对低的分子量的分子，无论天然存在还是人工产生的(例如，通过化学合成)。在一些实施方案中，小分子具有生物活性，因为它们在动物(例如，哺乳动物；人类)中产生局部或全身作用。在一些实施方案中，小分子是药物，并且小分子被称为“药物分子”或“药物”或“治疗剂”。在一些实施方案中，药物分子具有小于或等于约5kDa(例如，小于或等于约1.5kDa)的MW。在一些实施方案中，药物分子选自Axel Kleemann和Jurgen Engel的“Pharmaceutical Substances:Syntheses,Patents,Applications”,Thieme Medical Publishing,1999以及“MerckIndex:AnEncyclopedia of Chemicals,Drugs,and Biologicals”,Susan Budavari等编辑,CRCPress,1996中存在的化合物，二者通过引用结合到本文中。在一些实施方案中，本公开中使用的药物是具有针对靶细胞或途径的抗增殖(细胞生长抑制和/或细胞毒性)活性的治疗剂。
如本文所用的“活性形式”是指显示预期的体内或体外药学功效的化合物形式。特别地，当预期通过本公开内容的缀合物递送的药物分子从缀合物释放时，活性形式可以是药物本身或其衍生物，其显示预期的治疗性质。药物从缀合物的释放可通过裂解接头的可生物降解的键实现，所述接头将药物连接至本公开内容的支架或缀合物。
“诊断标签”：如本文使用的，术语诊断标签是指原子、原子团、部分或官能团、纳米晶体或物质组成的其它离散元素，其可使用本领域已知的分析方法在体内或离体被检测。当与本公开内容的缀合物结合时，这样的诊断标签允许在体内监测缀合物。备选地或此外，包括诊断标签的构建体和组合物可用于监测生物功能或结构。
“动物”：如本文使用的，术语动物是指人类以及非人动物，包括例如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、蠕虫和单细胞。在一些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、灵长类动物或猪)。动物可以是转基因非人动物。术语“受试者”包括动物。
“有效量”：一般而言，在涉及活性剂或药物递送装置时，术语“有效量”是指引起需要的生物反应所需的量。如本领域普通技术人员所理解的，药剂或装置的有效量可根据例如需要的生物终点、待递送的药剂、包封基质的组成、目标组织等因素而变化。
如本文所用的"天然氨基酸"是指天然存在的蛋白质中发现的常见天然存在的L-氨基酸中的任何一种或其立体异构体。除非另外指明，对氨基酸的提及包括氨基酸本身和其立体异构体。
如本文所用的"非天然氨基酸"是指任何不是天然氨基酸的氨基酸。这包括例如，包含α-、β-、γ-、D-、L-氨基酰基残基的氨基酸。更通常地，非天然氨基酸包含通式
Figure GDA0004100926510000151
的残基，其中侧链R不是自然中存在的氨基酸侧链。
如本文使用的，"烷基"本身或作为其它术语的一部分是指取代的或未取代的、直链或分支的、饱和或不饱和的、具有指定数目的碳原子的烃(例如，"-C1-8烷基"或"-C1-10烷基”是指分别具有1-8或1-10个碳原子的烷基)。当未指定碳原子的数目时，烷基具有1-8个碳原子。在一些实施方案中，烷基是未取代的。烷基可以被一个或多个基团取代。在一些实施方案中，烷基是饱和的。
如本文使用的，"亚烷基"本身或作为其它术语的一部分是指取代的或未取代的、饱和或不饱和的、分支或直链或环状的规定数目的碳原子、通常2-10个碳原子的烃基团，并具有通过从母体烷烃的相同或两个不同的碳原子除去两个氢原子得到的两个单价基团中心。在一些实施方案中，亚烷基是分支或直链的烃(即，其不是环状的烃)。在文本提供的任何实施方案中，亚烷基可以是饱和的亚烷基。
如本文使用的，"芳基"本身或作为其它术语的一部分意指取代的或未取代的、6-20个碳(例如，6-14个碳)原子的单价碳环芳香族烃基团，其通过从母体芳香族环系统的单一碳原子除去一个氢原子得到。一些芳基在示例性的结构中表示为"Ar"。
如本文使用的，"亚芳基"本身或作为其它术语的一部分是上文定义的芳基，其中芳基氢原子之一被替换为键(即，其是二价的)，并且可以呈邻位、间位或对位取向。
在一些实施方案中，例如当多官能接头或药物单元包含亚芳基时，亚芳基是上文定义的芳基，其中芳基氢原子中的一个或两个被替换为键(即，亚芳基可以是二价或三价的)。
如本文使用的，"杂环”本身或作为其它术语的一部分是指单价、取代的或未取代的、芳香族(“杂芳基”)或非芳香族(“杂环烷基”)的单环、双环、三环或四环系统，其具有一定数目(例如，3-8个或C3-8)的碳原子(亦称为环成员)和1-4个杂原子环成员，独立地是N、O、P或S，并且通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子得到。杂环中的一个或多个N、C或S原子可被氧化。包括杂原子的环可以是芳香族或非芳香族的。除非另外指明，杂环在任何杂原子或碳原子处连接至其侧基，这产生稳定的结构。
"杂环基"或"杂环基-"在本文中使用时是指上文定义的杂环基团(例如，C3-8杂环)，其中杂环的一个或多个另外的氢原子被替换为键(即，其是多价的，例如二价或三价的)。在一些实施方案中，当亲水基团、多官能接头或接头-药物部分包含杂环基时，杂环基是上文定义的杂环基团，其中杂环基团的氢原子中的一个或两个被替换为键(即，杂环基可以是二价或三价的)。
"碳环"本身或作为其它术语的一部分在本文中使用时是单价、取代的或未取代的、芳香族(“芳基”)或饱和或不饱和的非芳香族(“环烷基”)的单环、双环、三环或四环碳环系统，其具有一定数目(例如，3-8个或C3-8)的碳原子(亦称为环成员)，通过从母体环系统的环原子除去一个氢原子得到。碳环可以是3、4、5、6、7或8元的。
"碳环基"或"碳环基-"本身或作为其它术语的一部分在本文中使用时是指上文定义的C3-8碳环基团，其中碳环基团的另一个氢原子被替换为键(即，其是二价的)。在一些实施方案中，例如当亲水基团、多官能接头或接头-药物部分包含碳环基时，碳环基是上文定义的碳环基团，其中碳环基团的氢原子中的一个或两个被替换为键(即，碳环基可以是二价或三价的)。
除非另外指明，"杂烷基"本身或与其它术语组合在本文中使用时意指稳定的直链或支链的烃或其组合，完全饱和或含有1-3个不饱和度，由指定数目的碳原子和1-10个(例如，1-3个)杂原子O、N、Si或S组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化和氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N和S可位于杂烷基的任何内部位置或烷基连接至分子的剩余部分的位置。杂原子Si可位于杂烷基的任何位置，包括烷基连接至分子的剩余部分的位置。在一些实施方案中，至多两个杂原子可以是连续的。在一些实施方案中，C1-4杂烷基或杂亚烷基具有1-4个碳原子和1或2个杂原子，并且C1-3杂烷基或杂亚烷基具有1-3个碳原子和1或2个杂原子。在一些实施方案中，杂烷基或杂亚烷基是饱和的。
"杂亚烷基"本身或作为其它取代基的一部分在本文中使用时意指从杂烷基(如上所述)衍生的二价基团，如通过-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-举例说明。对于杂亚烷基，杂原子也可占据任一链端或两个链端。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，没有表明连接基团的取向。在选择的实施方案中，例如当亲水基团、多官能接头或接头-药物部分包含杂亚烷基时，杂亚烷基是上文定义的杂烷基，其中杂烷基的氢原子中的一个或两个被替换为键(即，杂亚烷基可以是二价或三价的)。
“任选取代的"在本文中使用时意指化学部分(例如烷基、杂烷基、碳环和杂环等)是取代的或未取代的。除非另外指明，本文公开的化学部分是任选取代的。当化学部分是取代的时，一个或多个氢原子各自独立地被取代基替换。典型的取代基包括但不限于，-X’、-R’、-O、-OR’、-SR’、-S-、-N(R’)2、-N(R’)3、＝NR’、-C(X’)3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)N(R’)2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’,-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R’、-C(＝O)X’、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2 -、-C(＝S)OR’、-C(＝O)SR’、-C(＝S)SR’、-C(＝O)N(R’)2、-C(＝S)N(R’)2或-C(＝NR’)N(R’)2，其中每个X’独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；和每个R’独立地是-H、-C1-20烷基、-C6-20芳基、-C3-C14杂环、保护基或前药部分。典型的取代基还包括氧代(＝O)。
如本文使用的“接头-药物部分"是指本文公开的缀合物的非靶向(例如，非抗体)部分。接头-药物部分的接头组分具有释放机制，其被称为可释放组装单元，插入在多官能接头和药物单元之间。在一些实施方案中，接头-药物部分是缀合物的非抗体(例如，非靶向)部分。
如本文使用的“多官能接头”是指连接一个或多个亲水基团、一个或多个药物单元和靶向部分(例如，抗体)以形成本文公开的缀合物或支架的接头。将这些组分连接至多官能接头可以是平行的或连续的。在一些实施方案中，多官能接头包含在靶向部分和亲水基团之间的肽部分，其中所述肽部分包括至少两个氨基酸。在其它实施方案中，当亲水基团是多元醇或其衍生物时，多官能接头不必然包含至少两个氨基酸的肽部分。在其它实施方案中，当亲水基团是葡糖基胺、二葡糖基胺、三葡糖基胺或其衍生物时，多官能接头不必然包含至少两个氨基酸的肽部分。
如本文使用的，“游离药物"是指药物部分的生物活性形式，其没有直接或间接地共价连接至亲水基团，或指配体单元的降解产物。游离药物当通过释放机制从多官能接头裂解后直接存在时可指药物，所述释放机制通过接头-药物部分的可释放组装单元提供，或者可指随后的细胞内转化或代谢。在一些实施方案中，游离药物具有形式H-D或可作为带电荷部分存在。在一些实施方案中，药理学活性物类可能不是母体药物，并且可能包括药物通过其连接至靶向部分的接头的组分，其没有经历随后的细胞内代谢。
疏水性可使用clogP测量，或clogP被定义为辛醇/水分配系数(包括隐含的氢)的对数，和可使用来自Chemical Computing group的程序MOETM计算(使用以下计算的clogP值：Wildman,S.A.,Crippen,G.M.；Prediction ofPhysiochemical Parameters by AtomicContributions；J.Chem.Inf.Comput.Sci.39No.5(1999)868-873)。
在一些实施方案中，本公开内容提供包含一群靶向部分-药物缀合物的靶向部分-药物缀合物组合物。靶向部分-药物缀合物包含靶向部分单元和与其连接的多个接头-药物部分。在一些实施方案中，缀合物中存在平均约2-约12、约2-约10、约2-约8、约2-约6、约2-约4或约1-约2个接头-药物部分(例如，式(I’)的d13)/靶向部分。与靶向部分上的特异性位点的示例性连接是通过修饰靶向部分N-聚糖以含有叠氮基、酮基或炔基。
本公开内容意图包括本发明的化合物中存在的原子的所有同位素(例如，氢同位素和碳同位素)。
本公开内容的化合物、支架或缀合物可以超过一种异构体形式存在。应理解，当本文描述化合物、支架或缀合物时，本公开内容提及化合物、支架或缀合物的所有异构体。当适用时，这样的公开内容提及区域异构体、光学异构体和互变异构体。光学异构体包括对映异构体和非对映体、手性异构体和非手性异构体。光学异构体包括分离的光学异构体以及光学异构体的混合物，包括外消旋和非外消旋混合物。异构体可呈分离的形式或与一种或多种其它异构体的混合物。除非另外指明，本文所述的任何化合物、支架或缀合物意指化合物、支架或缀合物的每种异构体，或其任何混合物。当化合物、支架或缀合物作为特定异构体描述时，应理解本公开内容不限于该特定异构体，而是可以指该特定异构体作为任选的实施方案。
本公开内容的化合物、支架或缀合物可作为顺式和/或反式异构体存在。除非另外指明，本文所述的任何化合物、支架或缀合物意指化合物、支架或缀合物的顺式异构体或反式异构体，以及其任何混合物。当化合物、支架或缀合物作为顺式或反式异构体描述时，应理解本公开内容不限于该特定顺式或反式异构体，而是可以指该特定顺式或反式异构体作为任选的实施方案。
本公开内容的化合物、支架或缀合物可作为区域异构体存在。除非另外指明，本文所述的任何化合物、支架或缀合物意指化合物、支架或缀合物的每种区域异构体，或其任何混合物。当化合物、支架或缀合物作为特定区域异构体描述时，应理解本公开内容不限于该特定区域异构体，而是可以指该特定区域异构体作为任选的实施方案。本公开内容的化合物、支架或缀合物的记载或描述，在没有特定立体构型指定时或对于少于所有手性中心进行此类指定时，对于此类未指定的手性中心，意图包括化合物的外消旋体、外消旋混合物、每种单独的对映异构体、非对映异构体混合物和每种单独的非对映体，其中这样的形式由于存在一个或多个不对称中心而是可能的。
抗体-药物缀合物和支架
在一些实施方案中，本公开内容提供具有位点特异性的抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，缀合物是可生物降解的和生物相容的，和/或显示高药物载量和与靶标抗原的强结合。
在一些实施方案中，本公开内容提供抗体-药物缀合物，其包含靶向部分(例如，抗体)和一个或多个接头-药物部分，其中靶向部分与一个或多个接头-药物部分共价连接。
在一些实施方案中，本公开内容提供可用于与靶向部分(例如，抗体)缀合以形成本文公开的缀合物的支架。
在一些实施方案中，靶向部分是抗体。
在一些方面，本公开内容提供抗体-药物缀合物，其包含靶向部分(例如，抗体)和与靶向部分共价连接的一个或多个接头-药物部分，其中：
每个接头-药物部分包含多官能接头，其通过对于每个药物单元的可释放组装单元中间性将靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一个或多个治疗剂(D))，并将亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；
可释放组装单元能够在靶向部分所靶向的靶标位点附近释放游离药物；以及
多官能接头包含在靶向部分和亲水基团之间的肽部分，其中肽部分包含至少两个氨基酸。
在一些方面，本公开内容提供抗体-药物缀合物，其包含靶向部分(例如，抗体)和与靶向部分共价连接的一个或多个接头-药物部分，其中：
每个接头-药物部分包含多官能接头，其通过对于每个药物单元的可释放组装单元中间性将靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一个或多个治疗剂(D))，并将亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；以及
可释放组装单元能够在靶向部分所靶向的靶标位点附近释放游离药物。
在一些方面，本公开内容提供式(I’)的抗体-药物缀合物：
Figure GDA0004100926510000211
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
d13是1-约12的整数；
抗体是修饰的抗体；
LP’是将修饰的抗体连接至MP的二价接头部分，其中相应的单价部分LP包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的官能团形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM是键，或三价或四价接头，并且当LM是键(即二价接头)时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000221
表示T1和MA的直接或间接连接；
D的每次出现独立地是具有分子量≤约5kDa的治疗剂；以及
LD的每次出现独立地是将D连接至MA的二价接头部分，并包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些方面，本公开内容提供式(IV)的抗体-药物缀合物或式(II)-(III)和(V)-(VI)中任一个的支架：
Figure GDA0004100926510000222
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
d13是1-约12的整数；
抗体是修饰的抗体；
LP’是将修饰的抗体连接至MP的二价接头部分；其中相应的单价部分LP包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的反应性部分形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM当存在时是键，或三价或四价接头，并且当LM是键(即二价接头)时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000231
表示T1和MA的直接或间接连接；
当存在时，WD的每次出现独立地是能够与具有分子量≤约5kDa的治疗剂(“D”)的官能团形成共价键的官能团；以及
LD的每次出现独立地是将WD或D连接至MA的二价接头部分，并且LD包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些方面，本公开内容提供式(IV’)的抗体-药物缀合物或式(II’)-(III’)和(V’)-(VI’)中任一个的支架：
Figure GDA0004100926510000241
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
d13是1-约12的整数；
抗体是修饰的抗体；
LP’是将修饰的抗体连接至MP的二价接头部分；其中相应的单价部分LP包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的反应性部分形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM当存在时是键，或三价或四价接头，并且当LM是键(即二价接头)时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000251
表示T1和MA的直接或间接连接；
当存在时，WD的每次出现独立地是能够与具有分子量≤约5kDa的治疗剂(“D”)的官能团形成共价键的官能团；以及
LD的每次出现独立地是将WD或D连接至MA的二价接头部分，并且LD包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些方面，本公开内容提供式(VII)-(XII)中任一个的含肽支架：
Figure GDA0004100926510000252
Figure GDA0004100926510000261
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
LP是单价接头部分，其包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的反应性部分形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM当存在时是键，或三价或四价接头，并且当LM是键(即二价接头)时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3当存在时是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000262
表示T1和MA的直接或间接连接；
WD的每次出现独立地是能够与具有分子量≤约5kDa的治疗剂(“D”)的官能团形成共价键的官能团；以及
LD的每次出现独立地是将WD或D连接至MA的二价接头部分，并且LD包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些方面，本公开内容提供式(VII’)-(XII’)中任一个的含肽支架：
Figure GDA0004100926510000271
其中
a2是1-3的整数；
a3是0-1的整数；
a4是1-约5的整数；
a5是1-3的整数；
LP是单价接头部分，其包含官能团WP，其能够与修饰的抗体的反应性部分形成共价键；
MP是Stretcher单元；
LM当存在时是键，或三价或四价接头，并且当LM是键时，a2是1，当LM是三价接头时，a2是2，或当LM是四价接头时，a2是3；
L3当存在时是含羰基部分；
MA包含肽部分，其包含至少两个氨基酸；
T1是亲水基团，并且T1和MA之间的
Figure GDA0004100926510000281
表示T1和MA的直接或间接连接；
WD的每次出现独立地是能够与具有分子量≤约5kDa的治疗剂(“D”)的官能团形成共价键的官能团；以及
LD的每次出现独立地是将WD或D连接至MA的二价接头部分，并且LD包含至少一个可切割的键，使得当该键断裂时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
当适用时，本公开内容的缀合物和支架可包括一个或多个以下特征。
在一些实施方案中，d13是2-12、2-10、2-8、2-6、2-4、1-2、4-10、4-8、4-6、6-12、6-10、6-8、8-14、8-12或8-10的整数。
在一些实施方案中，d13是范围为1-2的整数(例如，d13是1或2)。在一些实施方案中，d13是范围为2-4的整数(例如，d13是2、3或4)。在一些实施方案中，d13是范围为4-6的整数(例如，d13是4、5或6)。在一些实施方案中，d13是范围为6-8的整数(例如，d13是6、7或8)。在一些实施方案中，d13是范围为6-10的整数(例如，d13是6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，d13是1或2。在一些实施方案中，d13是1。在一些实施方案中，d13是2。
在一些实施方案中，每个L3当存在时独立地是*-C1-12烷基-C(O)-**、*-NH-C1-12烷基-C(O)-**或*-C1-12烷基-C(O)-NH-C1-12烷基-C(O)-**，其中*表示与另一个L3(当存在时)或与LM的连接；和**表示与另一个L3(当存在时)或与MA的连接。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-CH2CH2-C(O)-**或是*-NH-CH2CH2-C(O)-**，其中*表示与另一个L3(当存在时)或与LM的连接；和**表示与另一个L3(当存在时)或与MA的连接。
在一些实施方案中，a3是2或更大，至少一个L3是*-C1-12烷基-C(O)-**，和至少一个L3是*-NH-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-C(O)-**或*NH-CH2CH2-C(O)-CH2CH2-C(O)-**，其中*表示与LM的连接；和**表示与MA的连接。
在一些实施方案中，a4是1。在一些实施方案中，a4是2。在一些实施方案中，a4是3。
变量LP和LP’
在一些实施方案中，LP’通过LP的官能团(例如，WP)和修饰的抗体的反应性部分(例如，*-GlcNAc-S”-A”的修饰的GlcNAc部分)之间的反应形成。
在一些实施方案中，LP’包含在LP的官能团(例如，WP)和修饰的抗体的反应性部分(例如，*-GlcNAc-S”-A”的修饰的GlcNAc部分)之间形成的三唑基。
在一些实施方案中，每个LP当没有连接至抗体时包含末端基团WP。
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000291
Figure GDA0004100926510000301
其中
R8j是氢、卤素、C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)，
其中C1-24烷基任选地被一个或多个O、N或S截断，和其中C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)任选被一个或多个C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、-O(C1-C12烷基)、-O(C2-C12烯基)、-O(C2-C12炔基)、-O(C3-C12环烷基)、卤素、氨基、氧代或甲硅烷基取代，
其中C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、-O(C1-C12烷基)、-O(C2-C12烯基)、-O(C2-C12炔基)、-O(C3-C12环烷基)是任选取代的，和其中C1-C12烷基、C3-C12环烷基、-O(C1-C12烷基)或-O(C3-C12环烷基)任选地被一个或多个O、N或S截断；
R10j是氢、卤素、C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)，
其中C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)是任选取代的；
每个R11j独立地是氢、C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)；
每个R12j独立地是卤素、-OR10j、-NO2、-CN、-S(O)2R10j、C1-24烷基(例如，C1-6烷基)、C6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C1-24烷基)-(C6-24环烷基)、-(C1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C1-24烷基)-(C6-24芳基)或-(C1-24烷基)-(6-24元杂芳基)；以及u2是范围为0-8的整数。
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000311
Figure GDA0004100926510000312
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000313
在一些实施方案中，每个R11j是氢。在一些实施方案中，u2是0。在一些实施方案中，R8j是氢。
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000321
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000322
在一些实施方案中，至少一个R12j是吸电子基团，例如，对于Hammett取代基常数σ具有正值的基团。在一些实施方案中，合适的吸电子基团是本领域已知的。在一些实施方案中，至少一个R12j是卤素(例如，F或Cl)、-OR10j、-NO2、-CN、-S(O)2R7j、取代的C1-C12烷基或取代的C6-C12芳基，其中至少一个取代基是吸电子基团。在一些实施方案中，至少一个R12j是氟化的C1-C12烷基(例如，-CF3)、氟化的C5-C12芳基(例如，-C6F5)或卤代烷基化的C5-C12芳基(例如，-[3,5-(CF3)2(C6H3)])。
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000323
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000331
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000332
在一些实施方案中，每个R11j是氢。在一些实施方案中，u2是0。
在一些实施方案中，至少一个WP是
Figure GDA0004100926510000333
在一些实施方案中，每个WP当存在时独立地是：
Figure GDA0004100926510000334
在一些实施方案中，每个WP是
Figure GDA0004100926510000341
在一些实施方案中，每个LP’当连接至抗体时包含连接基团WP’。
在一些实施方案中，至少一个WP’是
Figure GDA0004100926510000342
在一些实施方案中，至少一个WP’是
Figure GDA0004100926510000343
在一些实施方案中，至少一个WP’是
Figure GDA0004100926510000344
/>
在一些实施方案中，至少一个WP’是
Figure GDA0004100926510000351
在一些实施方案中，至少一个WP’是
Figure GDA0004100926510000352
Stretcher单元MP
在一些实施方案中，MP是
Figure GDA0004100926510000353
Figure GDA0004100926510000354
/>
Figure GDA0004100926510000361
其中*表示连接至LP’或LP和**表示连接至LM或MA；
每个R66独立地是NH或O；每个R3独立地是–C(O)-NR5-或–NR5-C(O)-；
每个R5独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、COOH或COO-C1-6烷基；
R4是键或-NR5-(CR20R21)-C(O)-；
每个R20和R21独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化的C6-10芳基、多羟基化的C6-10芳基、5-12元杂环、C3-8环烷基、羟基化的C3-8环烷基、多羟基化的C3-8环烷基或天然或非天然氨基酸的侧链；
每个b1独立地是范围为0-6的整数；
每个e1独立地是范围为0-8的整数；
每个f1独立地是范围为1-6的整数；和
每个g2独立地是范围为1-4的整数。
在一些实施方案中，b1是0。在一些实施方案中，b1是1。
在一些实施方案中，每个f1独立地是1或2。在一些实施方案中，f1是1。在一些实施方案中，f1是2。
在一些实施方案中，g2是1或2。在一些实施方案中，g2是1。在一些实施方案中，g2是2。
应理解，对于MP的实施方案，*表示连接至LP’或LP和**表示连接至LM或MA。
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000371
在一些实施方案中，MP是
Figure GDA0004100926510000381
在一些实施方案中，MP是
Figure GDA0004100926510000382
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000383
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000384
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000385
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000386
在一些实施方案中，MP是：
Figure GDA0004100926510000387
变量LM和WM
在一些实施方案中，LM是键(即二价接头或具有2个臂)，或多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)，其中每个臂可相同或不同。
在一些实施方案中，LM是键(即二价接头或具有2个臂)，或多臂接头(例如，四价或具有4个臂；或三价，具有3个臂)，其中每个臂可相同或不同。
应理解，如本文使用的术语“臂”是指LM的一部分，其(1)连接至MP或(2)连接至L3(当存在时)或连接至MA(当L3不存在时)。
在一些实施方案中，LM是键(即二价接头或具有2个臂)。
在一些实施方案中，LM是多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)，其中每个臂可相同或不同。在一些实施方案中，LM是多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)。
在一些实施方案中，LM是具有3个臂的三价接头，其中每个臂可相同或不同。
在一些实施方案中，LM是具有4个臂的四价接头，其中每个臂可相同或不同。
在一些实施方案中，a2是2和LM是
Figure GDA0004100926510000391
Figure GDA0004100926510000401
其中：
Figure GDA0004100926510000402
表示连接至MP；
Y1表示连接至L3(当存在时)或连接至MA(当L3不存在时)；
R2和R'2各自独立地是氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-19分支的烷基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-10芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、C2-6烷酰基、任选取代的芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、任选取代的C2-6烷酰基、任选取代的C2-6烷酰基氧基、任选取代的C2-6取代的烷酰基氧基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8中的每个当存在时是范围独立地为0-10的整数；以及
d1、d2、d3、d4、d5和d7中的每个当存在时是范围独立地为0-10的整数。
在一些实施方案中，a2是2和LM是
Figure GDA0004100926510000403
Figure GDA0004100926510000411
其中：
Figure GDA0004100926510000412
表示连接至MP；
Y1表示连接至L3(当存在时)或连接至MA(当L3不存在时)；
R2和R'2各自独立地是氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-19分支的烷基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-10芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、C2-6烷酰基、任选取代的芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、任选取代的C2-6烷酰基、任选取代的C2-6烷酰基氧基、任选取代的C2-6取代的烷酰基氧基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8中的每个当存在时是范围独立地为0-10的整数；以及
d1、d2、d3、d4、d5和d7中的每个当存在时是范围独立地为0-10的整数。
在一些实施方案中，a2是2和LM是
Figure GDA0004100926510000421
在一些实施方案中，a2是2和LM是
Figure GDA0004100926510000422
在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8当存在时各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是0或1。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是0、1或2。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是0。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是1。在一些实施方案中，c1、c2、c3、c4、c5、c7和c8各自独立地是2。
在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7当存在时各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是0或1。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是1、2、3或4。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是1。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是2。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是3。在一些实施方案中，d1、d2、d3、d4、d5和d7各自独立地是4。
在一些实施方案中，R2和R'2各自独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、-COOH或-COO-C1-6烷基。在一些实施方案中，R2和R'2各自独立地是氢或C1-6烷基。在一些实施方案中，R2和R'2各自独立地是氢。在一些实施方案中，R2和R'2各自独立地是C1-6烷基。
在一些实施方案中，LM是：
Figure GDA0004100926510000431
在一些实施方案中，a2是3和LM是
Figure GDA0004100926510000432
/>
Figure GDA0004100926510000441
其中：
Figure GDA0004100926510000451
表示连接至MP；/>
Y1表示连接至L3(当存在时)或连接至MA(当L3不存在时)；
R2和R'2各自独立地是氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-19分支的烷基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-10芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、C2-6烷酰基、任选取代的芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、任选取代的C2-6烷酰基、任选取代的C2-6烷酰基氧基、任选取代的C2-6取代的烷酰基氧基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8中的每个是范围独立地为0-10的整数；
d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7和d8中的每个是范围独立地为0-10的整数；和
e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7和e8中的每个是范围独立地为0-10的整数。
在一些实施方案中，a2是3和LM是
Figure GDA0004100926510000452
/>
Figure GDA0004100926510000461
/>
Figure GDA0004100926510000471
其中：
Figure GDA0004100926510000472
表示连接至MP；
Y1表示连接至L3(当存在时)或连接至MA(当L3不存在时)；
R2和R'2各自独立地是氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的C2-6烯基、任选取代的C2-6炔基、任选取代的C3-19分支的烷基、任选取代的C3-8环烷基、任选取代的C6-10芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、C2-6烷酰基、任选取代的芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、任选取代的C2-6烷酰基、任选取代的C2-6烷酰基氧基、任选取代的C2-6取代的烷酰基氧基、-COOH或-COO-C1-6烷基；
c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7和c8中的每个是范围独立地为0-10的整数；
d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7和d8中的每个是范围独立地为0-10的整数；和
e1、e2、e3、e4、e5、e6、e7和e8中的每个是范围独立地为0-10的整数。
在一些实施方案中，a2是3和LM是
Figure GDA0004100926510000481
在一些实施方案中，a2是3和LM是
Figure GDA0004100926510000482
在一些实施方案中，-LM-(L3)a2-是：
Figure GDA0004100926510000483
在其中氨基酸单元具有两个连接位点(即末端药物单元)的一些实施方案中，上述连接位点之一可被替换为例如H、OH或C1-3未取代的烷基。
在一些实施方案中，当LM是多臂接头和尚未连接至Stretcher单元MP时，WM是LM的末端和WM的每次出现独立地是氢、保护基、离去基或能够通过形成共价键将LM连接至MP的官能团。
在一些实施方案中，WM是胺保护基。在一些实施方案中，WM是BOC。
在一些实施方案中，WM是胺保护基和LM是
Figure GDA0004100926510000484
在一些实施方案中，WM是胺保护基和LM是
Figure GDA0004100926510000491
在一些实施方案中，WM是BOC和LM是
Figure GDA0004100926510000492
在一些实施方案中，WM是胺保护基和LM是
Figure GDA0004100926510000493
在一些实施方案中，WM是BOC和LM是
Figure GDA0004100926510000494
在一些实施方案中，WM包含胺基团。在一些实施方案中，WM包含-C(O)-(CH2)w-NH2，其中w是1-6的整数。在一些实施方案中，WM是-C(O)-CH2-NH2。
在一些实施方案中，WM是-C(O)-CH2-NH2和LM是
Figure GDA0004100926510000495
在一些实施方案中，WM是-C(O)-CH2-NH2和LM是
Figure GDA0004100926510000496
在一些实施方案中，WM是H。
变量L3
在一些实施方案中，每个L3当存在时是含羰基部分。
应理解，对于L3的实施方案，*表示连接至另一个L3(当存在时)或LM；和**表示连接至另一个L3(当存在时)或MA。
在一些实施方案中，每个L3当存在时独立地是*-C1-12烷基-C(O)-**、*-NH-C1-12烷基-C(O)-**或*-C1-12烷基-C(O)-NH-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，L3是*-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-NH-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，L3是*-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-C1-12烷基-C(O)-NH-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，至少一个L3是*-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，L3是*-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，a3是2或更大，至少一个L3是*-C1-12烷基-C(O)-**，和至少一个L3是*-NH-C1-12烷基-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*-CH2CH2-C(O)-NH-CH2CH2-C(O)-**。
在一些实施方案中，(L3)a3是*NH-CH2CH2-C(O)-CH2CH2-C(O)-**。
变量MA
在一些实施方案中，MA是接头部分，其能够连接一个或多个药物和一个或多个亲水基团至LP或LP’。在一些实施方案中，MA包含至少两个氨基酸的肽部分。在一些实施方案中，氨基酸在文本称为“AA”和多个氨基酸称为“AA’s”。
在一些实施方案中，肽部分是能够与-LD-D单元形成共价键并允许连接多个药物的部分。在一些实施方案中，肽部分包含单一AA单元或具有两个或更多个AA单元(例如，2-10、2-6或2、3、4、5或6个)，其中AA单元各自独立地是天然或非天然氨基酸、氨基醇、氨基醛、二胺、多胺或其组合。在一些实施方案中，为了具有需要数目的连接，至少一个AA单元将具有官能化的侧链以提供-LD-D单元的连接。在一些实施方案中，示例性的官能化的AA单元(例如，氨基酸、氨基醇或氨基醛)包括例如，叠氮基或炔官能化的AA单元(例如，经修饰以具有叠氮化物基团或炔基团的氨基酸、氨基醇或氨基醛)。在一些实施方案中，叠氮化物基团或炔基团用于使用点击化学的连接。
在一些实施方案中，肽部分具有2-12个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有2-10个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有2-6个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有2、3、4、5或6个AA单元。
在一些实施方案中，肽部分具有2个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有3个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有4个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有5个AA单元。在一些实施方案中，肽部分具有6个AA单元。
在一些实施方案中，肽部分内的连接或与缀合物、其中间体或支架的其它组分的连接可例如通过氨基、羧基或其它官能团。在一些实施方案中，肽部分的每个氨基酸可独立地是含有硫醇的氨基酸的D或L异构体。在一些实施方案中，肽部分的每个氨基酸可独立地是含有硫醇的氨基酸的D异构体。在一些实施方案中，肽部分的每个氨基酸可独立地是含有硫醇的氨基酸的L异构体。在一些实施方案中，含有硫醇的氨基酸可以是例如，半胱氨酸、同型半胱氨酸或青霉胺。
在一些实施方案中，构成肽部分的每个氨基酸可独立地是以下氨基酸的L或D异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环基-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸(statine)、二氨基烷酸、其立体异构体或其衍生物。
在一些实施方案中，构成肽部分的每个氨基酸独立地是半胱氨酸、同型半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸或其立体异构体。
在一些实施方案中，肽部分包含单肽、二肽、三肽、四肽或五肽。在一些实施方案中，肽部分包含五肽。
在一些实施方案中，肽部分包含至少约5个氨基酸(例如，5、6、7、8、9或10个氨基酸)。在一些实施方案中，肽部分包含至多约10个氨基酸。
在一些实施方案中，构成肽部分的每个氨基酸独立地是甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸。
在一些实施方案中，肽部分包含至少4个甘氨酸和至少1个丝氨酸，例如，(甘氨酸)4和丝氨酸，其中丝氨酸在沿肽链的任何位置，例如(丝氨酸)-(甘氨酸)4；(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)3；(甘氨酸)2-(丝氨酸)-(甘氨酸)2；(甘氨酸)3-(丝氨酸)-(甘氨酸)；或(甘氨酸)4-(丝氨酸)。
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)或(丝氨酸)-(甘氨酸)4。在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)。在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)4。
在一些实施方案中，肽部分包含至少4个甘氨酸和至少1个谷氨酸，例如，(甘氨酸)4和谷氨酸，其中谷氨酸在沿肽链的任何位置。
在一些实施方案中，肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)4或(甘氨酸)4-(谷氨酸)。
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中丝氨酸在沿肽链的任何位置。
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸在沿肽链的任何位置。在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中丝氨酸在沿肽链的任何位置。
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)1-4-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过一个甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过丝氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)1-4，其中：
肽部分通过丝氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
应理解，对于肽部分的实施方案，*表示连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)。在一些实施方案中，**表示连接至T1(当存在时)或–OH(当T1不存在时)。在一些实施方案中，***表示连接至LD(当存在时)或氢(当LD不存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000531
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过丝氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过丝氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000541
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过一个甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过丝氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000542
在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)1-4，其中：
肽部分通过丝氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过一个甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000543
在一些实施方案中，肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)-4，其中：
肽部分通过丝氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过一个甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000544
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)1-4-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过β-丙氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过丝氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000551
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(丝氨酸)，其中：
肽部分通过β-丙氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过丝氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过丝氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000552
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)1-4-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过一个甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000553
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000561
在一些实施方案中，肽部分包含(甘氨酸)4-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过一个甘氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000562
在一些实施方案中，肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)1-4，其中：
肽部分通过谷氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过一个甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000563
在一些实施方案中，肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)4，其中：
肽部分通过谷氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过一个甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000571
在一些实施方案中，肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)，其中：
肽部分通过谷氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过一个甘氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000572
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)1-4-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过β-丙氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000573
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)4-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过β-丙氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000581
在一些实施方案中，肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：
肽部分通过β-丙氨酸连接至L3(当存在时)或LM(当L3不存在时)；肽部分通过谷氨酸连接至T1(当存在时)；和肽部分通过谷氨酸连接至LD(当存在时)。
在一些实施方案中，肽部分包含
Figure GDA0004100926510000582
/>
变量LD和WD
在一些实施方案中，LD的每次出现独立地是将D连接至MA的二价接头部分并包含至少一个可切割的键，使得当键被切割时，D以活性形式释放用于其预期的治疗效果。
在一些实施方案中，LD是可释放组装单元的组分。在一些实施方案中，LD是可释放组装单元。在一些实施方案中，LD包含一个可切割的键。在一些实施方案中，LD包含多个切割位点或键。
在一些实施方案中，用于形成可切割的键的官能团可包括例如，形成二硫键的巯基，形成腙键的醛、酮或肼基团，形成肟键的羟基胺基团，形成肽键的羧基或氨基，形成酯键的羧基或羟基，以及形成糖苷键的糖。在一些实施方案中，LD包含通过二硫化物交换可切割的二硫键、在酸性pH下可切割的酸不稳定键和/或通过水解酶可切割的键。在一些实施方案中，LD包含氨基甲酸酯键(即-O-C(O)-NR-，其中R是氢或烷基等)。
在一些实施方案中，LD中可切割的键的结构和序列可使得键通过靶标位点处存在的酶的作用被切割。在一些实施方案中，可切割的键可通过其它机制而是可切割的。
在一些实施方案中，LD中可切割的键的结构和序列可使得键通过靶标位点处存在的酶的作用被切割。在一些实施方案中，可切割的键可通过其它机制而是可切割的。
在一些实施方案中，可切割的键可通过一种或多种酶，包括肿瘤相关的蛋白酶，经酶促切割以释放药物单元或D，其中本公开内容的缀合物或其中间体或支架在释放以提供药物单元或D时在体内被质子化。
在一些实施方案中，LD可包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸可以是天然或非天然的，和/或D或L异构体，条件是存在可切割的键。在一些实施方案中，LD包含α、β或γ氨基酸，其可以是天然或非天然的。在一些实施方案中，LD包含连续序列的1-12个(例如，1-6、或1-4、或1-3、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)氨基酸。
在一些实施方案中，LD可包含天然氨基酸。在一些实施方案中，LD可包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，LD不包含天然氨基酸。在一些实施方案中，LD不包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，LD可包含与非天然氨基酸连接的天然氨基酸。在一些实施方案中，LD可包含与天然氨基酸的D-异构体连接的天然氨基酸。在一些实施方案中，LD包含二肽，例如-Val-Cit-、-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
在一些实施方案中，LD包含单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。
在一些实施方案中，LD包含肽(例如，1-12个氨基酸的肽)，其与药物单元直接缀合。在一些这样的实施方案中，肽是单一氨基酸。在一些这样的实施方案中，肽是二肽。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基烷酸、氨基炔酸、氨基烷二酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环基-烷酸、杂环基-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基烷酸和其衍生物。
在一些实施方案中，每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、瓜氨酸和其衍生物。
在一些实施方案中，每个氨基酸选自蛋白质原性和非蛋白质原性氨基酸。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸可独立地选自以下氨基酸的L或D异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基炔酸、氨基烷二酸、杂环基-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基烷酸、缬氨酸、瓜氨酸和其衍生物。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸独立地是半胱氨酸、同型半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸或丙氨酸。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸独立地选自以下氨基酸的L-异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸独立地选自以下氨基酸的D-异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。
在一些实施方案中，LD中的每个氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异谷氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、瓜氨酸或天冬氨酸。
在一些实施方案中，LD包含β-丙氨酸。在一些实施方案中，LD包含(β-丙氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，LD包含(β-丙氨酸)和任选地丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。
在一些实施方案中，LD包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。
在一些实施方案中，LD包含(β-丙氨酸)-(谷氨酰胺)。
在一些实施方案中，LD包含(β-丙氨酸)-(谷氨酰胺))-(丙氨酸)。
在一些实施方案中，LD包含谷氨酸和任选地丙氨酸、甘氨酸、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。
在一些实施方案中，LD包含2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，Ww包含(R)-2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，Ww包含谷氨酸。在一些实施方案中，Ww包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，LD包含(谷氨酸)-(甘氨酸)-(丙氨酸)。
在一些实施方案中，LD包含L-谷氨酸、D-谷氨酸、(L-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)、D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)或(D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)。在一些实施方案中，除了一个或多个氨基酸之外，LD还包含氨基甲酸酯键。
在一些实施方案中，LD可在对于特定酶的酶促切割的选择性方面被设计和优化。在一些实施方案中，特定酶是肿瘤相关的蛋白酶。在一些实施方案中，LD包含其切割被组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶催化的键。
在一些实施方案中，LD包含糖切割位点。在一些实施方案中，LD包含通过氧糖苷键连接至自降解基团(self-immolative group)的糖部分(Su)。在一些实施方案中，“自降解基团”可以是三官能化学部分，其能够将三个分隔的化学部分(即，糖部分(通过糖苷键)、药物单元(直接或间接)和MA(直接或间接))共价连接在一起。在一些实施方案中，糖苷键可在靶标位点处被切割以启动一系列自降解反应，其导致药物释放。
治疗剂、药物单元或D
在一些实施方案中，治疗剂是具有分子量≤约5kDa(例如，具有分子量≤约4kDa、≤约3kDa、≤约1.5kDa或≤约1kDa)的小分子。
在一些实施方案中，治疗剂具有约小于1nM的IC50。在一些实施方案中，治疗剂具有小于1nM的IC50。
在一些实施方案中，治疗剂具有约大于1nM的IC50(例如，治疗剂具有约1-50nM的IC50)。在一些实施方案中，治疗剂具有约大于1nM的IC50。在一些实施方案中，治疗剂具有大于1nM的IC50(例如，治疗剂具有1-50nM的IC50)。在一些实施方案中，治疗剂具有大于1nM的IC50。
在一些实施方案中，一些具有大于约1nM的IC50的治疗剂(例如，“不太有效的药物”)不适合使用公认的缀合技术与抗体缀合。不希望受到理论的约束，这样的治疗剂具有不足以使用常规技术在靶向抗体-药物缀合物中使用的效力，因为足够拷贝数的药物(即超过8个)不能在没有导致缀合物的药代动力学和物理化学性质降低的情况下使用本领域公认的技术缀合。在一些实施方案中，足够高载量的这些不太有效的药物可使用本文所述的缀合策略实现，从而导致高载量的治疗剂，同时维持需要的药代动力学和物理化学性质。在一些实施方案中，本公开内容涉及抗体-药物缀合物，其包含抗体、支架和至少8个治疗剂部分，其中治疗剂具有大于约1nM的IC50。
在一些实施方案中，药物是以下药物的衍生物：(a)奥瑞他汀化合物；(b)卡奇霉素化合物；(c)多卡霉素化合物；(d)SN38；(e)吡咯并苯二氮杂
Figure GDA0004100926510000631
(f)长春花化合物；(g)微管溶素化合物；(h)非天然喜树碱化合物；(i)美登素类化合物；(j)DNA结合药物；(k)激酶抑制剂；(l)MEK抑制剂；(m)KSP抑制剂；(n)拓扑异构酶抑制剂；(o)DNA-烷基化药物；(p)RNA聚合酶；(q)PARP抑制剂；(r)NAMPT抑制剂；(s)拓扑异构酶抑制剂；(t)蛋白质合成抑制剂；(u)DNA-结合药物；(v)DNA嵌入药物；或(w)免疫调节化合物，如US2018/0154018中所描述的，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，用于本公开内容的药物是奥瑞他汀F-羟基丙基酰胺-L-丙氨酸。
在一些实施方案中，奥瑞他汀是式(X)的化合物：
Figure GDA0004100926510000632
其中：
R31和R32各自独立地是氢或C1-8烷基并且R31和R32至多一个是H；
R33是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、C1-8烷基-C6-10芳基、X1-(C3-8碳环)、C3-8杂环或X1-(C3-8杂环)；
R34是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、X1-C6-10芳基、X1-(C3-8碳环)、C3-8杂环或X1-(C3-8杂环)；
R35是氢或甲基；
或者R34和R35与它们连接的碳原子一起形成具有式-(CR55R41)b-的碳环，其中R55和R41各自独立地是氢或C1-8烷基和b是3-7的整数；
R36是氢或C1-8烷基；
R37是氢、C1-8烷基、C3-8碳环、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、-X1-(C3-8碳环)、C3-8杂环或–X1-(C3-8杂环)；
每个R38独立地是氢、OH、C1-8烷基、C3-8碳环或O-(C1-8烷基)；
R53是：
Figure GDA0004100926510000641
或R54；
R39是氢、C1-8烷基、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、C3-8碳环、C3-8杂环、-X1-C3-8杂环、-C1-8亚烷基-NH2或(CH2)2SCH3；
每个X1独立地是C1-10亚烷基或C3-10环亚烷基；
R44是氢或C1-8烷基；
R45是X3-R42或NH-R19；
X3是O或S；
R19是氢、OH、氨基、C1-8烷基氨基或–[C(R20R21)]a-R22；
R42是氨基、C1-6烷基氨基或–[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化的C6-10芳基、多羟基化的C6-10芳基、5-12元杂环、C3-8环烷基、羟基化的C3-8环烷基、多羟基化的C3-8环烷基或天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
每个R23独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、–COOH或–COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮环状化合物；
R82是-NR23或氧；
R54是–C(R56)2-–C(R56)2-C6-10芳基、–C(R56)2-–C(R56)2-C3-8杂环或–C(R56)2-–C(R56)2-C3-8碳环；
R56独立地是H、OH、C1-8烷基、C3-8碳环、–O-C1-8烷基、–O-C(O)-R29或–O-R23-O-C1-6烷基-NH2；
R29是氨基、5-12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、–[C(R20R21)]a-R22或–R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是本文定义的R47；
R28不存在、是NR23或氧；
a是1-6的整数；c是0-3的整数；d是1-3的整数；和f是1-12的整数。
在一些实施方案中，在式(X)的奥瑞他汀化合物中：
R39是苄基或
Figure GDA0004100926510000651
和R44是氢。
在一些实施方案中，奥瑞他汀是式(Xa)的化合物：
Figure GDA0004100926510000652
其中：
R33至R38和R44如本文所定义，
R31和R32之一是氢或C1-8烷基和另一个是：
Figure GDA0004100926510000653
其中：
R83是氢或CH3；
R84是C1-6烷基或C6-10芳基；
每个R12’独立地是卤素、-C1-8烷基、-O-C1-8烷基、硝基或氰基；
h是0-4的整数；
u是整数0或1；
R53是：
Figure GDA0004100926510000661
或R54；
R39是氢、C1-8烷基、C6-10芳基、-X1-C6-10芳基、C3-8碳环、C3-8杂环、-X1-C3-8杂环、-C1-8亚烷基-NH2或(CH2)2SCH3，
每个X1独立地是C1-10亚烷基或C3-10环亚烷基；
R45是X3-R42或NH-R19；
X3是O或S；
R19是氢、OH、氨基、C1-8烷基氨基或–[C(R20R21)]a-R22；
R42是氢、氨基、C1-6烷基氨基或–[C(R20R21)]a-R22；
R20和R21各自独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化的C6-10芳基、多羟基化的C6-10芳基、5-12元杂环、C3-8环烷基、羟基化的C3-8环烷基、多羟基化的C3-8环烷基或天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(O-CH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
每个R23独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、–COOH或–COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮环状化合物；
R82是-NR23或氧；
R54是–C(R56)2-–C(R56)2-C6-10芳基、–C(R56)2-–C(R56)2-C3-8杂环或–C(R56)2-–C(R56)2-C3-8碳环；
R56独立地是氢、OH、C1-8烷基、C3-8碳环、–O-C1-8烷基、–O-C(O)-R29或–O-R23-O-C1-6烷基-NH2；
R29是氨基、5-12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、–[C(R20R21)]a-R22或–R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R28不存在、是NR23或氧；
a是1-6的整数；c是0-3的整数；d是1-3的整数；和f是1-12的整数。
在一些实施方案中，式(Xa)的奥瑞他汀化合物是式(XIa)或式(XIb)的化合物：
Figure GDA0004100926510000671
其中：
R92是：
Figure GDA0004100926510000672
以及
R83是氢或CH3。
在一些实施方案中，式(X)的奥瑞他汀是式(XI)、式(XII)或式(XIII)的化合物：
其中式(XI)的化合物是：
Figure GDA0004100926510000673
其中R31是氢或CH3和R42是–CH3或任一个以下结构：
Figure GDA0004100926510000674
/>
Figure GDA0004100926510000681
其中：
a是1-6的整数；c是0-3的整数；和g是整数2-6；
其中式(XII)的化合物是：
Figure GDA0004100926510000682
其中R31是氢或CH3和R40是氢、-OH、–NH2或任一个以下结构：
Figure GDA0004100926510000691
其中：
a是1-6的整数；g是整数2-6；和c是0-3的整数；
其中式(XIII)的化合物是：
Figure GDA0004100926510000701
其中：
R31是氢或CH3；
R29是氨基、5-12元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22、–R28-[C(R20R21)]a-R22或–R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R20和R21各自独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、羟基化的C6-10芳基、多羟基化的C6-10芳基、5-12元杂环、C3-8环烷基、羟基化的C3-8环烷基、多羟基化的C3-8环烷基或天然或非天然氨基酸的侧链；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
每个R23独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、–COOH或–COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮环状化合物；
R82是-NR23或氧；
R28不存在、是NR23或氧；
a是1-6的整数；c是0-3的整数；d是1-3的整数；和f是1-12的整数。
在式(XII)的一些实施方案中，R40是
Figure GDA0004100926510000711
在一些实施方案中，式(XII)的化合物是式(XIIa)、(XIIb)、(XIIc)、(XIId)、(XIIe)、(XIIf)、(XIIg)或(XIIh)的化合物：
Figure GDA0004100926510000712
/>
Figure GDA0004100926510000721
/>
Figure GDA0004100926510000731
在式(XIII)的化合物的一些实施方案中，R29是–NH2、5元杂环烷基、-R28-C1-6烷基-R22、R28-C5-12杂环烷基-C1-6烷基-R22或–R28-C1-6烷基-C6-12芳基-C1-6烷基-R22；或R29是如本文所定义的R47；
R28不存在、是NR23或氧；
R22是–OH、-NHR23、–COOH、-R82-C(O)(CH2)c-C(H)(R23)-N(H)(R23)、-R82-C(O)(CH2)d-(OCH2-CH2)f-N(H)(R23)或–R82-(C(O)-CH(X2)-NH)d-R77；
每个R23独立地是氢、C1-6烷基、C6-10芳基、C3-8环烷基、–COOH或–COO-C1-6烷基；
X2是天然或非天然氨基酸的侧链；
R77是氢或X2和NR77形成含氮环状化合物；
R82是-NR23或氧；
c是0-3的整数；d是1-3的整数；和f是1-12的整数。在一些实施方案中，R29是任一个以下结构：
Figure GDA0004100926510000741
/>
Figure GDA0004100926510000751
其中：
a是1-6的整数；c是0-3的整数；和g是2-6的整数。
Figure GDA0004100926510000752
其中R42是H、-CH3(m/z＝760)、
Figure GDA0004100926510000753
(m/z＝802.6)、/>
Figure GDA0004100926510000754
(m/z＝790)或
Figure GDA0004100926510000755
(m/z＝804)；
Figure GDA0004100926510000756
其中R40是H、
Figure GDA0004100926510000757
(m/z＝803.5)、/>
Figure GDA0004100926510000758
(m/z＝789.1)、
Figure GDA0004100926510000759
(m/z＝974.2)、/>
Figure GDA00041009265100007510
(m/z＝874.5)、/>
Figure GDA0004100926510000761
(m/z＝902.2)、/>
Figure GDA0004100926510000762
-OH(m/z＝788)、/>
Figure GDA0004100926510000763
(m/z＝803.4)、/>
Figure GDA0004100926510000764
(m/z＝803.4)、/>
Figure GDA0004100926510000765
(m/z＝874.4)、/>
Figure GDA0004100926510000766
(m/z＝874.4)、
Figure GDA0004100926510000767
(m/z＝874.4)、/>
Figure GDA0004100926510000768
(m/z＝874.4)、/>
Figure GDA0004100926510000769
(m/z＝900.2)、/>
Figure GDA00041009265100007610
(m/z＝900.2)、/>
Figure GDA00041009265100007611
(m/z＝900.5)、/>
Figure GDA00041009265100007612
(m/z＝900.5)、/>
Figure GDA00041009265100007613
(m/z＝1016.6)、/>
Figure GDA00041009265100007614
(m/z＝989.5)或
Figure GDA00041009265100007615
(m/z＝975.5)；或者
Figure GDA00041009265100007616
其中-C(O)-R29是
Figure GDA0004100926510000771
(m/z＝903.2)、/>
Figure GDA0004100926510000772
(m/z＝803.1)、
Figure GDA0004100926510000773
(m/z＝790)、/>
Figure GDA0004100926510000774
(m/z＝832.6)、/>
Figure GDA0004100926510000775
(m/z＝829.1)或
Figure GDA0004100926510000776
(m/z＝802)。
在一些实施方案中，D是：
Figure GDA0004100926510000777
在一些实施方案中，D是：
Figure GDA0004100926510000778
亲水基团或T1
在一些实施方案中，本公开内容的缀合物或支架中包括的亲水基团是水溶性的和基本上非抗原的聚合物。在一些实施方案中，亲水基团的实例包括但不限于，多元醇、聚醚、聚阴离子、聚阳离子、多聚磷酸、多胺、多糖、多羟基化合物、多聚赖氨酸和其衍生物。在一些实施方案中，亲水基团的一端可被官能化，使得其可通过不可切割的连键或通过可切割的连键共价连接至多官能接头或MA接头(例如，MA接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，官能化可例如通过胺、硫醇、NHS酯、马来酰亚胺、炔、叠氮化物、羰基或其它官能团。在一些实施方案中，亲水基团的另一个或多个末端是游离的和非系链的。在一些实施方案中，所谓“非系链的”是指亲水基团没有连接至另一个部分，例如D或药物单元、可释放组装单元或本公开内容的缀合物或支架的其它组分。在一些实施方案中，亲水基团的游离和非系链的末端可包括甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团。在一些实施方案中，甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团用作亲水基团的一个或多个末端的帽。
在一些实施方案中，可切割的连键是指在血浆中循环时对切割不显著敏感，但在细胞内或肿瘤内环境中对切割敏感的连键。在一些实施方案中，非-可切割的连键在任何生物环境中对切割都不显著敏感。在一些实施方案中，腙的化学水解、二硫化物的还原和肽键或糖苷键的酶促切割是可切割的连键的实例。在一些实施方案中，亲水基团的示例性的连接是通过酰胺连键、醚连键、酯连键、腙连键、肟连键、二硫化物连键、肽连键或三唑连键。在一些实施方案中，亲水基团与多官能接头或MA接头(例如，MA接头中的氨基酸)的连接是通过酰胺连键。
在其中本公开内容的缀合物或支架包含超过一个亲水基团的一些实施方案中，多个亲水基团可以是相同或不同的化学部分。在一些实施方案中，多个亲水基团可在单一连接位点或不同位点处连接至多官能接头或MA接头。
在一些实施方案中，加入亲水基团对于得到的缀合物的药代动力学可具有两个潜在的影响。在一些实施方案中，需要的影响是清除率降低(并且由此暴露增加)，这是由于药物或药物-接头的暴露的疏水性元件引起的非特异性相互作用降低导致。在一些实施方案中，不需要的影响是体积和分配速率降低，这是由于缀合物的分子量增加导致。在一些实施方案中，增加亲水基团的分子量增加了缀合物的水动力半径，导致扩散性降低，这可能降低缀合物渗入肿瘤的能力。在一些实施方案中，足够大的亲水基团用于降低缀合物清除率，由此增加血浆暴露，但不太大以很大程度上降低其扩散性，这可能降低缀合物到达预期的靶细胞群体的能力。
在一些实施方案中，亲水基团包括但不限于，糖醇(亦称为多元醇、多羟基醇、醛醇或糖醇(glycitol))或其衍生物(例如，氨基多元醇)、碳水化合物(例如，糖)、聚乙烯醇、碳水化合物基聚合物(例如，葡聚糖)、羟基丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚氧化烯和/或其共聚物。
在一些实施方案中，亲水基团包含多个羟基，例如包含单糖、寡糖、多糖等的部分。在一些实施方案中，亲水基团包含多个-(CR58OH)-基团，其中R58是-H或C1-8烷基。
在一些实施方案中，亲水基团包含一个或多个具有下式的片段：
Figure GDA0004100926510000791
其中n1是0-约6的整数；每个R58独立地是氢或C1-8烷基；R60是键、C1-6烷基接头或–CHR59-，其中R59是氢、烷基、环烷基或芳基烷基；R61是CH2OR62、COOR62、-(CH2)n2COOR62或被一个或多个羟基取代的杂环烷基；R62是氢或C1-8烷基；和n2是1-约5的整数。
在一些实施方案中，R58是氢；R60是键或C1-6烷基接头；n1是1-约6的整数；和R61是CH2OH或COOH。在一些实施方案中，R58是氢；R60是–CHR59-；n1是0；和R61是被一个或多个羟基取代的杂环烷基，例如单糖。
在一些实施方案中，亲水基团包含葡糖基胺、二胺或三胺。
在一些实施方案中，亲水基团包含一个或多个以下片段或其立体异构体：
Figure GDA0004100926510000792
/>
Figure GDA0004100926510000801
其中：
R59是氢、C1-8烷基、环烷基或芳基烷基；
n1是1-约6的整数；n2是1-约5的整数；和n3是约1-约3的整数。
应理解，本文预期亲水基团的所有立体化学形式。在上式中，亲水基团可以衍生自核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其它糖，并保留这些分子上存在的侧面羟基和烷基的立体化学排列。在一些实施方案中，应理解在前式中，各种脱氧化合物也是预期的。作为说明，对于亲水基团，适用时预期一个或多个以下特征：
在一些实施方案中，n3是2或3。在一些实施方案中，n3是2。在一些实施方案中，n3是3。在一些实施方案中，n1是1、2或3。在一些实施方案中，n1是1。在一些实施方案中，n1是2。在一些实施方案中，n1是3。在一些实施方案中，n2是1。
在一些实施方案中，R59是H。
在一些实施方案中，亲水基团包含：
Figure GDA0004100926510000811
在一些实施方案中，亲水基团包含：
Figure GDA0004100926510000812
/>
在一些实施方案中，亲水基团包含：
Figure GDA0004100926510000813
在一些实施方案中，亲水基团包含
Figure GDA0004100926510000814
其中n4是1-约25的整数；
每个R63独立地是氢或C1-8烷基；
R64是键或C1-8烷基接头；
R65是氢、C1-8烷基或-(CH2)n2COOR62；
R62是氢或C1-8烷基；以及
n2是1-约5的整数。
在一些实施方案中，亲水基团包含：
Figure GDA0004100926510000815
在一些实施方案中，n4是约2-约20、约4-约16、约6-约12或约8-约12的整数。
在一些实施方案中，n4是约2-约20的整数。在一些实施方案中，n4是约4-约16的整数。在一些实施方案中，n4是约6-约12的整数。在一些实施方案中，n4是约8-约12的整数。
在一些实施方案中，n4是6、7、8、9、10、11或12。
在一些实施方案中，n4是8或12。
在一些实施方案中，n4是8。
在一些实施方案中，T’包含：
Figure GDA0004100926510000821
其中n4是约2-约20、约4-约16、约6-约12或约8-约12的整数。
在一些实施方案中，n4是6、7、8、9、10、11或12。
在一些实施方案中，n4是8或12。
在一些实施方案中，n4是8。
在一些实施方案中，亲水基团包含聚醚，例如聚亚烷基二醇(PAO)。在一些实施方案中，PAO包括但不限于C1-6环氧烷的聚合物，特别是环氧乙烷的聚合物。在一些实施方案中，聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，聚乙二醇是mPEG。
在一些实施方案中，亲水基团包含PEG单元，其包含一个或多个PEG链。在一些实施方案中，PEG链可例如以线性、分支或星形构型连接在一起。在一些实施方案中，除了包含重复的PEG亚单元之外，PEG单元还可包含非-PEG材料(例如，以促进多个PEG链的彼此偶联或促进与氨基酸的偶联)。
在一些实施方案中，PEG单元可通过反应性基团共价结合至多官能接头或MA接头(例如，MA接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，反应性基团是活化的PEG分子可与其结合的那些基团(例如，游离氨基或羧基)。在一些实施方案中，N-末端氨基酸和赖氨酸(K)具有游离的氨基；和C-末端氨基酸残基具有游离的羧基。巯基(例如，存在于半胱氨酸残基上)也可用作反应性基团以供连接PEG。
在一些实施方案中，PEG单元可通过使用甲氧基化的PEG("mPEG")连接至多官能接头或MA接头(例如，MA接头中的氨基酸)，所述mPEG具有不同的反应性部分，包括但不限于琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、mPEG-亚氨酸酯、对硝基苯基碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和氰尿酰氯。在一些实施方案中，可使用多种PEG物类，和基本上可使用任何合适的反应性PEG试剂。在一些实施方案中，反应性PEG试剂在连接至多官能接头或MA接头(例如，MA接头中的氨基酸)后将导致形成氨基甲酸酯或酰胺键。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元、至少20个亚单元、至少21个亚单元、至少22个亚单元、至少23个亚单元或至少24个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含不超过约72个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元或至少12个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元或至少12个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元、至少7个亚单元或至少8个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含至少6个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含至少7个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含至少8个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含一个或多个线性PEG链，各自具有至少2个亚单元、至少3个亚单元、至少4个亚单元、至少5个亚单元、至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元、至少20个亚单元、至少21个亚单元、至少22个亚单元、至少23个亚单元或至少24个亚单元。在一些实施方案中，PEG单元包含合计至少6个亚单元、至少8个亚单元、至少10个亚单元或至少12个亚单元。在一些这样的实施方案中，PEG单元包含不超过合计约72个亚单元。在一些这样的实施方案中，PEG单元包含不超过合计约36个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含合计4-72、4-60、4-48、4-36或4-24个亚单元；5-72、5-60、5-48、5-36或5-24个亚单元；6-72、6-60、6-48、6-36或6-24个亚单元；7-72、7-60、7-48、7-36或7-24个亚单元；8-72、8-60、8-48、8-36或8-24个亚单元；9-72、9-60、9-48、9-36或9-24个亚单元；10-72、10-60、10-48、10-36或10-24个亚单元；11-72、11-60、11-48、11-36或11-24个亚单元；12-72、12-60、12-48、12-36或12-24个亚单元；13-72、13-60、13-48、13-36或13-24个亚单元；14-72、14-60、14-48、14-36或14-24个亚单元；15-72、15-60、15-48、15-36或15-24个亚单元；16-72、16-60、16-48、16-36或16-24个亚单元；17-72、17-60、17-48、17-36或17-24个亚单元；18-72、18-60、18-48、18-36或18-24个亚单元；19-72、19-60、19-48、19-36或19-24个亚单元；20-72、20-60、20-48、20-36或20-24个亚单元；21-72、21-60、21-48、21-36或21-24个亚单元；22-72、22-60、22-48、22-36或22-24个亚单元；23-72、23-60、23-48、23-36或23-24个亚单元；或24-72、24-60、24-48、24-36个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元包含一个或多个线性PEG链，其具有合计4-72、4-60、4-48、4-36或4-24个亚单元；5-72、5-60、5-48、5-36或5-24个亚单元；6-72、6-60、6-48、6-36或6-24个亚单元；7-72、7-60、7-48、7-36或7-24个亚单元；8-72、8-60、8-48、8-36或8-24个亚单元；9-72、9-60、9-48、9-36或9-24个亚单元；10-72、10-60、10-48、10-36或10-24个亚单元；11-72、11-60、11-48、11-36或11-24个亚单元；12-72、12-60、12-48、12-36或12-24个亚单元；13-72、13-60、13-48、13-36或13-24个亚单元；14-72、14-60、14-48、14-36或14-24个亚单元；15-72、15-60、15-48、15-36或15-24个亚单元；16-72、16-60、16-48、16-36或16-24个亚单元；17-72、17-60、17-48、17-36或17-24个亚单元；18-72、18-60、18-48、18-36或18-24个亚单元；19-72、19-60、19-48、19-36或19-24个亚单元；20-72、20-60、20-48、20-36或20-24个亚单元；21-72、21-60、21-48、21-36或21-24个亚单元；22-72、22-60、22-48、22-36或22-24个亚单元；23-72、23-60、23-48、23-36或23-24个亚单元；或24-72、24-60、24-48、24-36个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元是衍生的线性单一PEG链，其具有至少2个亚单元、至少3个亚单元、至少4个亚单元、至少5个亚单元、至少6个亚单元、至少7个亚单元、至少8个亚单元、至少9个亚单元、至少10个亚单元、至少11个亚单元、至少12个亚单元、至少13个亚单元、至少14个亚单元、至少15个亚单元、至少16个亚单元、至少17个亚单元、至少18个亚单元、至少19个亚单元、至少20个亚单元、至少21个亚单元、至少22个亚单元、至少23个亚单元或至少24个亚单元。
在一些实施方案中，PEG单元是衍生的线性单一PEG链，其具有6-72、6-60、6-48、6-36或6-24个亚单元；7-72、7-60、7-48、7-36或7-24个亚单元；8-72、8-60、8-48、8-36或8-24个亚单元；9-72、9-60、9-48、9-36或9-24个亚单元；10-72、10-60、10-48、10-36或10-24个亚单元；11-72、11-60、11-48、11-36或11-24个亚单元；12-72、12-60、12-48、12-36或12-24个亚单元；13-72、13-60、13-48、13-36或13-24个亚单元；14-72、14-60、14-48、14-36或14-24个亚单元；15-72、15-60、15-48、15-36或15-24个亚单元；16-72、16-60、16-48、16-36或16-24个亚单元；17-72、17-60、17-48、17-36或17-24个亚单元；18-72、18-60、18-48、18-36或18-24个亚单元；19-72、19-60、19-48、19-36或19-24个亚单元；20-72、20-60、20-48、20-36或20-24个亚单元；21-72、21-60、21-48、21-36或21-24个亚单元；22-72、22-60、22-48、22-36或22-24个亚单元；23-72、23-60、23-48、23-36或23-24个亚单元；或24-72、24-60、24-48、24-36个亚单元。
在一些实施方案中，适合于本文公开的缀合物、支架和方法的亲水基团的实例可见于例如，US 8,367,065第13栏；US 8524696第6栏；WO2015/057699和WO 2014/062697，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。
抗体
如本文使用的，术语"抗体"是指由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别和结合至特异性抗原。在一些实施方案中，抗体是糖蛋白。在一些实施方案中，抗体可以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、骆驼化单结构域抗体、细胞内抗体(“intrabodies”)、重组抗体、抗独特型抗体、结构域抗体、线性抗体、多特异性抗体、抗体片段(例如，Fv、Fab、F(ab)2、F(ab)3、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2)、单链可变片段抗体(scFv)、串联/双-scFv、Fc、pFc’、scFvFc(或scFv-Fc)、二硫化物Fv(dsfv)、双特异性抗体(bc-scFv)例如BiTE抗体；骆驼抗体、重新表面化抗体、人源化抗体、全人抗体、单-结构域抗体(sdAb，亦称为
Figure GDA0004100926510000861
)、嵌合抗体、包含至少一个人恒定区的嵌合抗体、双重亲和力抗体例如双重亲和力重靶向蛋白质(DARTTM)、二价(或双价)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)，包括但不限于minibodies、diabodies、triabodies或tribodies、tetrabodies等，和多价抗体。
如本文使用的，术语"抗体片段"是指免疫球蛋白分子的结合至其靶标的至少一部分可变区，即抗原-结合区。如本文使用的，术语“抗体”是指全长抗体和抗体片段，除非另外指明。在一些实施方案中，术语包括遗传改造的抗体、抗体的衍生物、抗体的片段，和可通过本领域已知的方法获得。在一些实施方案中，抗体可经改造以包含至少一个化学反应性基团。
在一些实施方案中，包含核心-N-乙酰基葡糖胺取代基(核心-GlcNAc部分)的糖蛋白是包含核心-N-乙酰基葡糖胺取代基(核心-GlcNAc部分)的抗体。在一些实施方案中，糖蛋白是单克隆抗体(mAb)IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体是lgG1抗体。在一些实施方案中，当所述抗体是完整抗体时，抗体在每条重链上包含一个或多个(例如，一个)核心-GlcNAc部分，所述核心-GlcNAc部分任选地被岩藻糖基化。在一些实施方案中，完整抗体包含两个或更多个(例如，两个)任选地岩藻糖基化的核心-GlcNAc部分。在一些实施方案中，当所述抗体是单链抗体或抗体片段，例如Fab或Fc片段时，抗体包含一个或多个核心-GlcNAc部分，其任选地被岩藻糖基化。在一些实施方案中，在包含核心-GlcNAc部分的抗体中，所述核心-GlcNAc部分可位于抗体上的任何位置，条件是所述取代基不阻碍抗体的抗原-结合位点。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分存在于抗体的天然N-糖基化位点处。在一些实施方案中，抗体包含或经改造以包含至少一个化学反应性基团或化学反应性氨基酸部分或侧链。
在一些实施方案中，抗体能够将缀合物引导至特定的组织、细胞或细胞中的位置。在一些实施方案中，抗体能够将缀合物引导至培养物或完整生物体或二者中。在一些实施方案中，抗体包含存在于靶细胞的细胞表面上的配体，所述抗体以有效的特异性、亲和力和亲合力与其结合。在一些实施方案中，抗体将缀合物引导至肝脏以外的组织。在一些实施方案中，抗体将缀合物引导至特定的组织，例如肝脏、肾脏、肺或胰腺。在一些实施方案中，抗体将缀合物引导至靶细胞(例如，癌细胞)、细胞(例如，癌细胞)上表达的受体、基质组织或与癌症有关的蛋白质(例如，肿瘤抗原)。在一些实施方案中，包含肿瘤血管系统的细胞可被靶向。在一些实施方案中，抗体能够将缀合物引导至特定类型的细胞，例如，特异性靶向肝脏中的肝细胞，而不是Kupffer细胞。在一些实施方案中，抗体能够将缀合物引导至网状内皮或淋巴系统的细胞或专门的吞噬细胞，例如巨噬细胞或嗜酸粒细胞。在一些实施方案中，缀合物本身是有效的递送系统，不需要特异性靶向。
在一些实施方案中，抗体能够将缀合物引导至细胞内的位置(例如，细胞核、细胞质或内体)。在一些实施方案中，抗体增强细胞结合至受体，或细胞质运输至细胞核和核进入，或从内体或其它细胞内囊泡的释放。
在一些实施方案中，缀合物包含Her-2或NaPi2b抗体。在一些实施方案中，适合于缀合物的Her-2抗体是曲妥珠单抗。在一些实施方案中，适合于缀合物的Her-2抗体包括WO2015/195917和PCT/US2018/019873中描述的那些，其各自通过引用以其整体并入本文。
NaPi2b抗体
在一些实施方案中，适合于缀合的NaPi2b抗体结合至SLC34A2的胞外区。在一些实施方案中，本公开内容提供NaPi2b靶向的单克隆抗体，其特异性识别NaPi2b，亦称为钠依赖性磷酸运输蛋白2B。在一些实施方案中，用于本文公开的缀合物的NaPi2b抗体能够并可用于调节，例如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b的至少一种生物活性。在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括结合可溶性NaPi2b的抗体。在一些实施方案中，NaPi2b抗体特异性结合至人NaPi2b的胞外结构域(ECD)上的表位。这些抗体在本文统称为“NaPi2b”抗体。
在一些实施方案中，本文提供的NaPi2b抗体-药物缀合物包括以≤1μM(例如，≤100nM；≤10nM；和≤1nM)的平衡解离常数(Kd或KD)结合至NaPi2b表位的抗体。在一些实施方案中，用于本文公开的抗体-药物缀合物的NaPi2b抗体显示出范围大约为≤1nM至约1pM的Kd。
在一些实施方案中，本文提供的NaPi2b抗体-药物缀合物可包括用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b的功能活性的抗体。在一些实施方案中，NaPi2b的功能活性包括例如，参与跨细胞无机磷酸盐(Pi)吸收，从而有助于维持体内磷酸盐稳态。在一些实施方案中，NaPi2b抗体通过部分或完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰跨细胞无机磷酸盐吸收，完全或部分地抑制NaPi2b功能活性。
在一些实施方案中，当与不存在本文所述的NaPi2b抗体的结合的情况下的NaPi2b功能活性水平相比，在存在NaPi2b抗体的情况下NaPi2b功能活性的水平降低至少95％，例如96％、97％、98％、99％或100％时，NaPi2b抗体被视为完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b功能活性。在一些实施方案中，当与不存在本文所述的NaPi2b抗体的结合的情况下的NaPi2b活性水平相比，在存在NaPi2b抗体的情况下NaPi2b活性的水平降低少于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，NaPi2b抗体被视为部分地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b功能活性。
在一些实施方案中，本文公开的示例性抗体包括XMT-1535抗体。这些抗体显示对人NaPi2b的特异性，并且它们已经表明抑制NaPi2b活性。
NaPi2b人或人源化单克隆抗体XMT-1535包括在下表1提供的氨基酸和相应的核酸序列中所示的重链(HC)、重链可变区(VH)、轻链(LC)和轻链可变区(VL)。各抗体的可变重链区和可变轻链区在下面的氨基酸序列中用阴影表示。重链和轻链的互补决定区(CDR)在下面提供的氨基酸序列中用下划线表示。XMT-1535抗体的氨基酸，包括互补决定区(CDR)，通过E.A.Kabat等定义(参见Kabat,E.A.等,Sequences of Protein of immunologicalinterest,第五版,US Department of Health and Human Services,US GovernmentPrinting Office(1991))并公开于US专利8,603,474。
表1：NaPi2b人或人源化单克隆抗体XMT-1535序列
SEQ ID NO: 序列描述
1 XMT-1535重链氨基酸序列
2 XMT-1535轻链氨基酸序列
3 XMT-1535重链可变区
4 XMT-1535轻链可变区
5 XMT-1535CDRH1
6 XMT-1535CDRH2
7 XMT-1535CDRH3
8 XMT-1535CDRL1
9 XMT-1535CDRL2
10 XMT-1535CDRL3
11 XMT-1535IgG1重链恒定区
12 XMT-1535轻链恒定区
13 XMT-1535重链可变区核酸序列
14 XMT-1535轻链可变区核酸序列
15 全长人NaPi2b序列
本文公开的抗体特异性结合至人NaPi2b的胞外结构域(ECD)上的表位。
在一些实施方案中，本领域技术人员将认识到，有可能在无需过度实验的情况下测定单克隆抗体是否具有与本文公开的单克隆抗体(例如，XMT-1535、10H1.11.4B)相同的特异性，这通过确定前者是否阻止后者结合至天然结合配偶体或已知与NaPi2b缔合的其它分子进行。如果测试的单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如通过本文公开的单克隆抗体的结合降低所示，则两种单克隆抗体结合至相同或密切相关的表位。
用于测定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的备选方法是用可溶性NaPi2b预孵育本文公开的单克隆抗体(所述抗体通常对可溶性NaPi2b具有反应性)，然后加入测试的单克隆抗体以确定测试的单克隆抗体是否在其结合NaPi2b的能力方面受到抑制。如果测试的单克隆抗体受到抑制，则在所有的可能性中，其具有与本文公开的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。
本文公开的单克隆抗体的筛选也可例如通过测量NaPi2b介导的活性，并确定测试的单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b活性进行。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含具有与选自SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有与选自SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:4的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:1的重链氨基酸序列和SEQID NO:2的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:5的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:6的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:7的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:8的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:9的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:10的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRH2，其包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRH3，其包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRL1，其包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRL2，其包含与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和CDRL3，其包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括在可变结构域序列中的一个或多个保守的氨基酸取代，例如在可变结构域序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守的取代。在一些实施方案中，这些保守的氨基酸取代在CDR区中，例如，在所有CDR中累积进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守的取代，和在一些具体的实施方案中，在每个CDR序列，例如SEQ ID NO:5-10中可存在至多1、2、3或4个保守的氨基酸取代。
在一些实施方案中，本领域技术人员将认识到，有可能在无需过度实验的情况下测定单克隆抗体是否具有与单克隆抗体XMT-1535相同的特异性，这通过确定前者是否阻止后者结合至天然结合配偶体或已知与NaPi2b缔合的其它分子进行。如果测试的单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如通过本文公开的单克隆抗体的结合降低所示，则两种单克隆抗体结合至相同或密切相关的表位。
在一些实施方案中，用于测定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的备选方法是用可溶性NaPi2b预孵育本文公开的单克隆抗体(所述抗体通常对可溶性NaPi2b具有反应性)，然后加入测试的单克隆抗体以确定测试的单克隆抗体在其结合NaPi2b的能力方面是否受到抑制。在一些实施方案中，如果测试的单克隆抗体受到抑制，则其与本文公开的单克隆抗体具有相同或功能等同的表位特异性。
本文公开的单克隆抗体的筛选也可例如通过测量NaPi2b介导的活性，并确定测试的单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰NaPi2b活性进行。
在一些实施方案中，适合于缀合的NaPi2b抗体可通过众所周知的技术产生和纯化，例如，WO 2009/097128、WO 2017/160754和US 16/136,706，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
HER2抗体
在一些实施方案中，适合缀合的HER2抗体结合可溶形式或膜结合(即当在细胞表面上表达时)的人HER2。在一些实施方案中，本公开内容提供单克隆抗体，其结合HER2并且是人源化或完全人的。在一些实施方案中，本公开内容提供特异性结合HER2的单克隆抗体。这些抗体在本文中统称为“HER2”抗体。
在一些实施方案中，适合于缀合HER2抗体以≤1μM(例如，≤100nM；≤10nM；≤1nM)的平衡解离常数(Kd或KD)结合至HER2表位。在一些实施方案中，本公开内容提供单克隆抗体，其结合HER2并且是人源化或完全人的。例如，本文提供的HER2抗体显示出范围大约为≤1nM至约1pM的Kd。
在一些实施方案中，本文公开的HER2抗体用于调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰HER2的功能活性。在一些实施方案中，HER2的功能活性包括例如，调节PI3K-Akt途径活性。在一些实施方案中，HER2抗体通过部分或完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰PI3K-Akt途径活性，完全或部分地抑制HER2功能活性。PI3K-Akt途径活性使用任何用于检测PI3K-Akt途径活性的公认方法评价，包括但不限于在存在和不存在本文公开的抗体或抗原结合片段的情况下检测磷酸化Akt水平。
在一些实施方案中，当与不存在与本文所述的HER2抗体结合的情况下HER2功能活性水平相比，存在HER2抗体的情况下HER2功能活性水平降低至少80％，例如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％时，HER2抗体被视为完全地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰HER2功能活性。在一些实施方案中，当与不存在与本文所述的HER2抗体结合的情况下HER2活性水平相比，存在HER2抗体的情况下HER2活性水平降低小于95％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％时，HER2抗体被视为部分地调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰HER2功能活性。
在一些实施方案中，本文公开的示例性的抗体包括XMT-1519抗体。该抗体显示对人HER2的特异性，并且其已显示体外抑制HER2功能活性。
HER-2单克隆抗体XMT-1519包括下表2提供的氨基酸和相应的核酸序列中所示的重链(HC)、重链可变区(VH)、轻链(LC)和轻链可变区(VL)。各抗体的可变重链区和可变轻链区在下面的氨基酸序列中用阴影表示。重链和轻链的互补决定区(CDR)在下面提供的氨基酸序列中用下划线表示。氨基酸，包括互补决定区(CDR)，通过E.A.Kabat等定义(参见Kabat,E.A.等,Sequences of Protein of immunological interest,第五版,USDepartment of Health and Human Services,US Government Printing Office(1991))。
表2：HER2人或人源化单克隆抗体XMT-1519序列
Figure GDA0004100926510000951
本文公开的抗体和其抗原结合片段特异性结合至包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的全长人HER2受体上的表位。
本文公开的抗体和其抗原结合片段特异性结合至包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的人HER2受体的胞外结构域(ECD)上的表位。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体表现出不同于本领域描述的抗体的HER2结合特征。在一些实施方案中，本文公开的抗体结合至HER2的不同表位，因为它们彼此交叉阻断，但不与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Fab37或chA21交叉阻断结合至HER2。此外，与已知的抗体相反，本文公开的抗体可有效内化至表达HER2的细胞中，而不促进细胞增殖。
在一些实施方案中，本文公开的抗体是完全人单克隆抗体，其结合至新表位和/或具有其它有利性质以供治疗用途。在一些实施方案中，示例性的性质包括但不限于，对以高或低水平表达人HER2的癌细胞的有利的结合特征，对重组人和食蟹猴HER2的特异性结合，在结合HER2时有效内化，当作为抗体药物缀合物(ADC)给予时杀死表达高或低水平的HER2的癌细胞的高能力，对表达HER2的癌细胞的增殖没有显著的激动作用，和/或对表达HER2的细胞提供有效抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导杀伤，以及前述性质的任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人HER2受体的胞外结构域的残基452-531、SEQ ID NO:16的残基474-553或SEQ ID NO:31的残基452-531。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括结合人HER2受体的结构域IV的N末端的至少一部分，但不与结合至人HER2受体的表位4D5的抗体交叉竞争的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段不与曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体，因为曲妥珠单抗已知结合人HER2受体的表位4D5。如本文使用的，术语人HER2受体的表位4D5是指人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基529-627、SEQ ID NO:16的残基551-649或SEQ ID NO:31的残基529-627。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人HER2受体的胞外结构域的残基452-500、SEQ ID NO:16的残基474-522或SEQ ID NO:31的残基452-500。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少一个选自人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530的氨基酸残基，例如SEQ ID NO:16的残基543、547和552，和SEQ ID NO:31的残基521、525和530。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性结合至人HER2受体的胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少两个选自人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530的氨基酸残基。在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基E521、L525和R530。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括抗体或其抗原结合片段，其结合至人HER2受体的结构域III的至少一部分和结构域IV的N末端的至少一部分，但不与Fab37单克隆抗体或结合至人HER2受体的表位4D5的抗体交叉竞争。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段不与Fab37单克隆抗体和/或曲妥珠单抗交叉竞争结合至人HER2受体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括人HER2受体的胞外结构域的残基520-531、SEQ ID NO:16的残基542-553或SEQ ID NO:31的残基520-531。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少一个选自人HER2受体的胞外结构域的残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499的氨基酸残基，例如SEQ ID NO:16的残基475、478、495、498、517、518、519和521，或SEQ ID NO:31的残基453、456、473、476、495、496、497和499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性结合至人HER2受体的胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基或至少六个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性结合至人HER2受体的胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基C453、H456、H473、N476、R495、G496、H497和W499。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，本文公开的抗体还包括特异性结合至人HER2受体的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少一个氨基酸残基，其选自人HER2受体的胞外结构域的残基C453、H473、N476、R495、H497和W499，例如SEQ ID NO:16的残基475、495、498、517、519和521，或SEQ ID NO:31的残基453、473、476、495、497和499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性结合至人HER2受体的胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位包括至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基或至少六个氨基酸残基，所述氨基酸残基选自人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497和W499。在一些实施方案中，本文公开的抗体包括特异性结合至人HER2受体的胞外结构域的表位的抗体或其抗原结合片段，所述表位至少包括人HER2受体的胞外结构域的氨基酸残基C453、H473、N476、R495、H497和W499。在一些实施方案中，任何或所有这些抗体或其抗原结合片段还结合食蟹猴HER2受体上的至少一个表位。
在一些实施方案中，这些抗体显示对人HER2的特异性，并且它们已经显示调节，例如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰PI3K-Akt途径，这通过减少磷酸化AKT的水平促进细胞存活。在一些实施方案中，这些抗体以与曲妥珠单抗或其生物类似物内化的速率相同或基本相似的速率，从表达HER2的细胞的细胞表面内化。在一些实施方案中，这些抗体和抗原结合片段具有这样的内化速率，其中约50％的时间0结合的总表面在4小时内被内化。
在一些实施方案中本文公开的抗体包含具有与选自SEQ ID NO:17的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的重链可变区，和具有与选自SEQID NO:24的序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列，和与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:17的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:24的轻链可变区氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:19的重链氨基酸序列和SEQID NO:26的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包含SEQ ID NO:20的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:21的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:22的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:27的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:28的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:29的CDRL3氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文公开的抗体包括在可变结构域序列中的一个或多个保守的氨基酸取代，例如在可变结构域序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守的取代。在一些实施方案中，这些保守的氨基酸取代在CDR区中，例如，在所有CDR中累积进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个保守的取代。在一些实施方案中，在每个CDR序列，例如SEQ ID NO:20-22和27-29中可存在至多1、2、3或4个保守的氨基酸取代。
本领域技术人员将认识到，有可能在无需过度实验的情况下测定单克隆抗体是否具有与单克隆抗体XMT-1519相同的特异性，这通过确定前者是否阻止后者结合至天然结合配偶体或已知与HER2缔合的其它分子进行。在一些实施方案中，如果测试的单克隆抗体与本文公开的单克隆抗体竞争，如通过本文公开的单克隆抗体的结合减少所示，则两种单克隆抗体结合至相同或密切相关的表位。
在一些实施方案中，用于测定单克隆抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性的备选方法是用可溶性HER2预孵育本文公开的单克隆抗体(所述抗体与可溶性HER2通常具有反应性)，然后加入测试的单克隆抗体以确定测试的单克隆抗体在其结合HER2的能力方面是否受到抑制。如果测试的单克隆抗体受到抑制，则在所有可能性下，其具有与本文公开的单克隆抗体相同或功能等同的表位特异性。
在一些实施方案中，本文公开的单克隆抗体的筛选还可例如通过测量HER2介导的PI3K-Akt途径活性，并确定测试的单克隆抗体是否能够调节、阻断、抑制、减少、拮抗、中和或以其它方式干扰PI3K-Akt途径活性进行。在一些实施方案中，适合于缀合的HER2抗体可通过众所周知的技术产生和纯化，例如，WO 2015/195917和PCT/US2018/019873，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
修饰的抗体
在一些实施方案中，抗体是修饰的抗体。
在修饰的抗体的一些实施方案中，*表示直接或间接连接至修饰的抗体的剩余部分。在一些实施方案中，S”是糖或衍生的糖。在一些实施方案中，A”是能够与接头-药物部分的官能团形成共价键的官能团。
在一些实施方案中，修饰的抗体在缀合之前包含*-S″-A″的糖-衍生物部分。
在一些实施方案中，修饰的抗体在区域290-305中包含天冬酰胺基团(例如，N297)。在一些实施方案中，糖-衍生物部分直接或间接连接至天冬酰胺基团(例如，N297)。
在一些实施方案中，修饰的抗体在缀合之前包含修饰的GlcNAc部分＊-GIcNAc-S″-A″，其中GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺。
在一些实施方案中，修饰的GlcNAc部分通过GlcNAc的C1位置连接至修饰的抗体的剩余部分。在一些实施方案中，修饰的GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。
在一些实施方案中，修饰的GlcNAc部分直接或间接连接至天冬酰胺基团(例如，N297)。
在一些实施方案中，修饰的抗体通过A”和接头-药物部分的官能团之间形成的共价键缀合至接头-药物部分。
在一些实施方案中，本公开内容的修饰的抗体通过包括以下的方法获得：
(a)使包含抗体和核心-GlcNAc部分的糖蛋白(例如，抗体聚糖)与内切糖苷酶接触，从而形成包含抗体和末端-GlcNAc部分的中间体抗体，并且任选地，末端-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖；以及
(b)在存在糖基转移酶的情况下使中间体抗体与具有结构P″-S″-A″的化合物接触，从而形成包含抗体和修饰的GlcNAc部分＊-GIcNAc-S″-A″的修饰的抗体，并且任选地，修饰的GlcNAc部分在GlcNAc的C1位置连接至修饰的抗体的剩余部分；其中
GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；
S”是糖或衍生的糖；
A”是叠氮基、酮基或炔基；以及
P”是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)或胞苷二磷酸(CDP)。
在一些实施方案中，步骤(a)和(b)序贯进行。在一些实施方案中，步骤(a)和(b)同时进行。
在一些实施方案中，抗体聚糖包含糖型G0、Gl、G2、G0F、GIF、G2F和M5的混合物(例如，图1所示的糖型)。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体(mAb)。
在一些实施方案中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG抗体，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体是IgGl抗体。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体，和抗体聚糖包含一个或多个核心-GlcNAc部分。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体，和抗体聚糖包含连接至抗体的每条重链的一个或多个核心-GlcNAc部分。
在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体，和抗体聚糖包含连接至全长抗体的两个或更多个核心-GlcNAc部分。
在一些实施方案中，抗体是全长抗体，和抗体聚糖包含连接至全长抗体的两个核心-GlcNAc部分。
在一些实施方案中，两个或更多个核心-GlcNAc部分的至少一个进一步包含岩藻糖。
在一些实施方案中，两个或更多个核心-GlcNAc部分的每一个进一步包含岩藻糖。
在一些实施方案中，抗体是单链抗体或抗体片段(例如，Fab或Fc片段)，抗体聚糖包含连接至抗体的一个或多个核心-GlcNAc部分(其任选地进一步包含岩藻糖)。
在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分连接至抗体的某一位置，其中核心-GlcNAc部分不显著阻碍抗体的抗原-结合位点。
在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分连接至抗体的Fc片段。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分连接至CH结构域。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分连接至抗体的Fab或Fc片段。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分通过与抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子的N-糖苷键连接至抗体。在一些实施方案中，核心-GlcNAc部分连接至抗体的天然N-糖基化位点。
在一些实施方案中，抗体是IgG，抗体和核心-GlcNAc部分连接至IgG的天然N-糖基化位点。
在一些实施方案中，抗体是IgG，抗体和核心-GlcNAc部分连接至IgG的天然N-糖基化位点(例如，IgG的N297 N-糖基化位点)。在一些实施方案中，N297 N-糖基化位点存在于IgG抗体的重链的保守的Fc区，在区域290-305的天冬酰胺(例如，N297)处。
在一些实施方案中，中间体抗体具有式(XXII)：
Figure GDA0004100926510001031
其中：
Ab是抗体；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；Fuc是岩藻糖；u3是0或1；和u4是范围为1-16的整数。
在一些实施方案中，u4是范围为1-10的整数。在一些实施方案中，u4是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，u4是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，u4是1、2、3或4。在一些实施方案中，u4是2或4。在一些实施方案中，u4是1或2。在一些实施方案中，u4是1。在一些实施方案中，u4是2。
在一些实施方案中，抗体包含一个核心-GlcNAc部分(例如，u4是1)。在一些实施方案中，抗体包含两个核心-GlcNAc部分(例如，u4是2)。
在一些实施方案中，修饰的抗体通过方案1中概述的方法获得。如下所述，在存在糖基转移酶的情况下使包含一个末端-GlcNAc部分的式(XXIII)的中间体抗体与具有结构P″-S″-A″的化合物接触，提供包含一个修饰的GlcNAc部分的修饰的抗体(例如，式(XXIIIa)的修饰的抗体)。
在一些实施方案中，修饰的抗体通过在存在糖基转移酶的情况下使包含两个末端-GlcNAc部分的式(XXIV)的中间体抗体与具有结构P″-S″-A″的化合物接触，提供包含两个修饰的GlcNAc部分的修饰的抗体(例如，式(XXIVa)的修饰的抗体)获得。
方案1
Figure GDA0004100926510001041
其中u3、Ab、S”、A”和P”如本文所定义。
在一些实施方案中，在本公开内容的方法中待修饰的抗体聚糖包含聚糖，所述聚糖包含核心-GlcNAc部分，即在聚糖的非还原端存在的GlcNAc部分。在一些实施方案中，聚糖包含一个或多个糖部分和可以是线性或分支的。
在一些实施方案中，在与内切糖苷酶反应后，可形成包含末端GlcNAc部分的中间体抗体(例如，式(XXIII)或(XXIV)的中间体抗体)。
在一些实施方案中，该方法的步骤(a)(去糖基化或修剪)显示在图2中，其中将抗体糖型G2F、GIF、G0F、G2、Gl、G0和M5(例如，见图1)以及可能另外的糖型(例如，三触角(triantennary)聚糖)的混合物转变为包含末端GlcNAc部分的中间体抗体，其任选地包含岩藻糖(例如，u3是0或1)。
在一些实施方案中，内切糖苷酶是内切糖苷酶Endo S、Endo SH、Endo S2、EndoS49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或其组合。
在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49或其组合。
在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo S或Endo SH或其组合。在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo SH。
在一些实施方案中，该方法的步骤(b)(形成修饰的抗体)显示在图3中，其中中间体抗体包含单克隆抗体(mAb)和在单克隆抗体(mAb)的每条重链上的末端GlcNAc部分(其任选地包含岩藻糖(例如，u3是0或1))。在一些实施方案中，在步骤(b)中，末端-GlcNAc部分被转变为修饰的GlcNAc部分。在一些实施方案中，所述转变可通过在存在糖基转移酶的情况下末端GlcNAc部分与P″-S″-A″的化合物反应执行。
在一些实施方案中，P″-S″-A″的化合物是GalNAz-UDP(例如，4-AzGalNAc-UDP)。在一些实施方案中，末端-GlcNAc部分是*-GlcNAc-GalNAz或*-GlcNAc(Fuc)-GalNAz，其中*表示连接至修饰的抗体的剩余部分。
在一些实施方案中，去糖基化/修剪步骤和形成修饰的抗体的步骤序贯进行。
在一些实施方案中，去糖基化/修剪步骤和形成修饰的抗体的步骤同时进行。
在一些实施方案中，用于制备修饰的抗体的方法在合适的缓冲溶液中进行，例如缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、Tris和甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Tris缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一些实施方案中，该方法在范围为约4-约50℃的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在范围为约10-约45℃的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在范围为约20-约40℃的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在范围为约30-约37℃的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在约30℃的温度下进行。在一些实施方案中，该方法在30℃的温度下进行。
在一些实施方案中，该方法在范围为约5-约9(例如，约5.5-约8.5、约6-约8或约7-约8)的pH值进行。在一些实施方案中，该方法在约7.4的pH值进行。
在一些实施方案中，用于制备修饰的抗体的方法显示在图4中。
在一些实施方案中，用于制备修饰的抗体的方法包括：
使包含抗体和连接至抗体的位点N297的核心-GlcNAc部分的糖蛋白(例如，抗体聚糖)与内切糖苷酶Endo SH接触，从而形成包含末端GlcNAc部分的中间体抗体；以及
在存在β-(l,4)-GalNAcT酶的情况下使中间体抗体与4-AzGalNAc-UDP接触，从而形成包含修饰的GlcNAc部分的修饰的抗体；
其中步骤(a)和(b)同时进行。
在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo SH，其为通过富含Gly的间隔序列连接的两种内切糖苷酶Endo S和Endo H之间的融合物，所述间隔序列包含内部6xHis标签，导致总分子量为139kDa。
在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶包含N-末端6xHis标签和具有总分子量45.7kDa。在一些实施方案中，含有N-末端6xHis标签的β-(l,4)-GalNAcT酶衍生自粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)。
在一些实施方案中，该方法在PBS缓冲液中在约7.4的pH值和约30℃的温度下进行。
内切糖苷酶
内切糖苷酶是能够切割聚糖结构的内部糖苷连键，从而重塑或修剪聚糖结构的酶。例如，内切糖苷酶可用于异质聚糖群体的简易均质化，此时它们在保守的聚糖区域内的可预测位点切割。一类内切糖苷酶包含endo-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(EC 3.2.1.96，常称为Endo S或ENGases)，一类通过水解Ν,Ν'-二乙酰基壳二糖核心的β-l,4-糖苷键从糖蛋白除去N-聚糖的水解酶(如描述于Wong等.Chem.Rev.2011,111,4259，其通过引用以其整体并入本文)，留下单一核心N-连接的GlcNAc残基。Endo-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶在自然界广泛发现，具有常见的化学酶变体，包括Endo D，其对于少甘露糖具有特异性；Endo A和Endo H，其对于高甘露糖具有特异性；Endo F亚型，其范围从高甘露糖至二触角复合物；和Endo M，其可切割除了岩藻糖基化聚糖之外的大多数N-聚糖结构(高甘露糖/复合型/杂合型)，并且对于高甘露糖型寡糖的水解活性显著高于复合型和杂合型寡糖。在一些实施方案中，这些ENGase显示对于远端N-聚糖结构的特异性，并且对于展示它的蛋白质没有特异性，使得它们可用于在天然条件下从糖蛋白切割大多数N-连接的聚糖。
在一些实施方案中，内切糖苷酶Fl、F2和F3适合于天然蛋白质的去糖基化。EndoFl、F2和F3的连键特异性提示将蛋白质去糖基化的一般策略，其可除去所有类型的N-连接的寡糖，而不使蛋白质变性。在一些实施方案中，二触角和三触角结构可分别被内切糖苷酶F2和F3直接除去。在一些实施方案中，寡甘露糖和杂合结构可被Endo Fl除去。
Endo S是从酿脓链球菌分泌的内切糖苷酶，也属于糖苷水解酶家族18，如公开于Collin等(EMBO J.,2001,20,3046)，其通过引用以其整体并入本文。与上文提及的ENGase相反，Endo S具有更加确定的特异性和对于仅切割人IgG的Fc结构域中保守的N-聚糖的特异性(迄今为止没有鉴定其它底物)，提示酶和IgG之间的蛋白质-蛋白质相互作用提供该特异性。
Endo S49，亦称为Endo S2，描述于WO 2013/037824，其通过引用以其整体并入本文，从酿脓链球菌NZ131分离，并且是Endo S的同源物。Endo S49具有对天然IgG特异性的内切糖苷酶活性和切割比Endo S更多种类的Fc聚糖。
Endo SH是通过富含Gly的间隔序列连接的两种内切糖苷酶Endo S和Endo H之间的融合物。Endo SH在聚糖链的核心区域中的两个N-乙酰基葡糖胺(GluNAc)部分之间特异性切割N-连接的聚糖。
在一些实施方案中，用于使抗体去糖基化的内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、EndoS2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3、Endo H、Endo M、Endo A或其组合。在一些实施方案中，用于使抗体去糖基化的内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3、Endo H或其组合。在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2或Endo S49。
在一些实施方案中，当待修剪的聚糖是复杂类型的二触角结构时，内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或其组合。
在一些实施方案中，当糖蛋白是抗体和待修剪的寡糖是复杂类型的二触角结构并且存在于N297处的IgG保守N-糖基化位点时，内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、EndoS49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或其组合。在一些实施方案中内切糖苷酶是Endo S、EndoSH、Endo S2、Endo S49或其组合。
在一些实施方案中，当糖蛋白是抗体和待修剪的聚糖是复杂类型的二触角结构并且不存在于N297处的IgG保守N-糖基化位点时，内切糖苷酶是Endo Fl、Endo F2、Endo F3或其组合。
在一些实施方案中，当待修剪的聚糖是高甘露糖时，内切糖苷酶是Endo H、EndoM、Endo A、Endo F1或其组合。
在一些实施方案中，当糖蛋白是抗体和待修剪的寡糖除了具有复杂类型的二触角结构之外还是高甘露糖，存在于N297处的IgG保守N-糖基化位点时，内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49或其组合。在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo S或EndoSH。在一些实施方案中，内切糖苷酶是Endo SH。
在一些实施方案中，如本文所定义的内切糖苷酶包含编码易于纯化的标签的序列。在一些实施方案中，所述标签包括但不限于FLAG-标签、poly(His)-标签、HA-标签、Myc-标签、SUMO-标签、GST-标签、MBP-标签或CBP-标签。在一些实施方案中，所述标签是6xHis标签。在一些实施方案中，所述标签在酶的C-末端或在内部残基处共价连接至内切糖苷酶。在一些实施方案中，所述标签在酶的N末端共价连接至内切糖苷酶。
在一些实施方案中，Endo SH是通过富含Gly的间隔序列连接的两种内切糖苷酶Endo S和Endo H之间的融合物，所述间隔序列包含内部6xHis标签，导致总分子量139kDa。
糖基转移酶
形成修饰的抗体的方法包括在存在糖基转移酶的情况下用式S”(A”)-P”的化合物处理去糖基化/修剪的抗体(任选地具有岩藻糖基化末端N-乙酰基葡糖胺(Gal-NAc)部分)，以形成修饰的抗体，其具有通过β-1,4-O-糖苷键在GalNAc部分的C1处键合至抗体的GlcNAc-S”(A”)取代基。
在一些实施方案中，糖基转移酶是β-l,4-半乳糖基转移酶(4Gal-T)、β-(1,4)-乙酰半乳糖胺基转移酶(β-(l,4)-GalNAcT或GalNAcT)或其突变体。
β-(1,4)-乙酰半乳糖胺基转移酶(β-(l,4)-GalNAcTs或GalNAcTs)已在许多生物中鉴定，包括人类、秀丽隐杆线虫(Kawar等,J.Biol.Chem.2002,277,34924,通过引用以其整体并入本文)、黑腹果蝇(Hoskins等.Science 2007,316,1625,通过引用以其整体并入本文)和粉纹夜蛾(Vadaie等,J.Biol.Chem.2004,279,33501,通过引用以其整体并入本文)。
β-(l,4)-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β-(l,4)-GalNAcTs)是本领域已知的。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT是催化N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)从尿苷二磷酸-GalNAc(UDP-GalNAc，亦称为GalNAc-UDP)转移至糖蛋白聚糖的末端GlcNAc部分的酶，其中GalNAc部分的C1通过β-1,4-O-糖苷键连接至抗体。在一些实施方案中，末端GlcNAc部分是岩藻糖基化的。
在一些实施方案中，用于本发明的方法的β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自无脊椎动物β-(l,4)-GalNAcT酶，例如是或衍生自从无脊椎动物物种来源的β-(l,4)-GalNAcT。β-(1,4)-GalNAcT酶可以是或可以衍生自本领域技术人员已知的任何无脊椎动物β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自从线虫门，例如色矛纲(Chromadorea)或尾感器纲(Secernentea)，或节肢动物门(Arthropoda)，例如昆虫纲来源的β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自从秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、Caenorhabditis remanei、Caenorhabditis briggsae、猪蛔虫(Ascaris suum)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、Wuchereria bancrofti、Loa loa、Cerapachys biroi、Zootermopsisnevadensis、Camponotusfloridanus、Crassostreagigas或Danausplexippus(例如，从秀丽隐杆线虫、猪蛔虫、粉纹夜蛾或黑腹果蝇)来源的β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自从秀丽隐杆线虫、猪蛔虫或粉纹夜蛾来源的β-(l,4)-GalNAcT酶。在其它实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自从粉纹夜蛾来源的β-(l,4)-GalNAcT酶。
术语"衍生自"包括例如截短的酶、突变体酶、包含易于纯化的标签的酶或这些修饰的组合。衍生自因此是指具有分别通过取代、插入、缺失或添加一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20或更多个)氨基酸从天然存在的β-(l,4)-GalNAcT酶改变的氨基酸序列。衍生自β-(l,4)-GalNAcT酶的β-(l,4)-GalNAcT酶在本文亦称为衍生的β-(1,4)-GalNAcT酶或修饰的β-(l,4)-GalNAcT酶或β-(l,4)-GalNAcT突变体酶。
在一些实施方案中，衍生的β-(l,4)-GalNAcT酶通过添加额外的N-或C-末端氨基酸或化学部分或通过缺失N-或C-末端氨基酸进行修饰以增加稳定性、溶解度、活性和/或易于纯化。
在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶通过缺失N-末端胞质结构域和跨膜结构域修饰，称为截短的酶。
其中一个或多个氨基酸已被取代、添加或缺失的β-(l,4)-GalNAcT酶在本文亦称为突变体β-(l,4)-GalNAcT酶或衍生的β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶通过缺失N-末端胞质结构域和跨膜结构域而修饰并通过取代一个或多个氨基酸而突变。取代一个或多个氨基酸在本文亦称为突变。包含一个或多个取代的氨基酸的酶亦称为突变体酶。
在一些实施方案中，当糖基转移酶是β-(l,4)-GalNAcT酶或截短的β-(l,4)-GalNAcT酶时，所述酶进一步包含一个或多个突变。在一些实施方案中，这些突变包括但不限于在位置257处异亮氨酸(He，亦称为I)被亮氨酸(Leu，亦称为L)、甲硫氨酸(Met，亦称为M)或丙氨酸(Ala，亦称为A)取代。在一些实施方案中，在位置312处甲硫氨酸(Met，亦称为M)被组氨酸(His，亦称为H)取代也包括在内。应注意，氨基酸位置的编号在本文基于野生型β-(l,4)-GalNAcT酶中的氨基酸位置编号。当β-(l,4)-GalNAcT酶是例如截短的酶时，本文用于指示氨基酸取代的位置的编号对应于相应的野生型β-(l,4)-GalNAcT酶中的氨基酸位置编号。
在一些实施方案中，糖基转移酶是包含突变体催化结构域的β(l,4)-GalT酶。
催化结构域可具有野生型酶中发现的氨基酸序列，或具有不同于野生型序列的氨基酸序列。具有不同于野生型序列的氨基酸序列的催化结构域在本文称为突变体催化结构域。在一些实施方案中，突变可包含单一氨基酸改变(例如，点突变)或多个氨基酸改变(例如，1-10，或1-6，或1、2、3或4，或1或2个氨基酸)，或缺失或插入一个或多个氨基酸(例如，1-10、或1-6、或1、2、3或4、或1或2个氨基酸)。在一些实施方案中，所述突变体催化结构域可以全长酶，例如β(l,4)-半乳糖基转移酶或α(l,3)-N-半乳糖基转移酶存在，但也可以包含所述突变体催化结构域的多肽片段或重组多肽存在，任选地与额外的氨基酸连接。
β(l,4)-半乳糖基转移酶I在本文称为GalT。这样的突变体GalT催化结构域公开于例如WO 2004/063344，其通过引用以其整体并入本文。WO 2004/063344还公开了GalT的Tyr-289突变体和它们的制备方法。这些突变体称为Y289L、Y289N或Y289I。
在一些实施方案中，GalT突变体催化结构域是Y289L、Y289N、Y289I、Y284L或R228K。在一些实施方案中，GalT突变体催化结构域是Y289L。
在一些实施方案中，GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalTY289I、GalT Y289A、GalT Y289N和GalT Y289L突变体可通过定点诱变方法产生，其描述于例如WO2004063344、Qasba等,Prot.Expr.Pur.2003,30,219和Qasba等,J.Biol.Chem.2002,277,20833(全都通过引用以其整体并入本文)。在GalT Y289F中，位置289处的酪氨酸氨基酸(Y)被苯丙氨酸(F)氨基酸替换，在GalT Y289M中，所述酪氨酸被甲硫氨酸(M)氨基酸替换，在GalT Y289V中被缬氨酸(V)氨基酸替换，在GalT Y289G中被甘氨酸(G)氨基酸替换，在GalT Y289I中被异亮氨酸(I)氨基酸替换和在Y289A中被丙氨酸(A)氨基酸替换。
在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶包含编码易于纯化的标签的序列。在一些实施方案中，所述标签包括但不限于FLAG-标签、多聚(His)-标签、HA-标签、Myc-标签、SUMO-标签、GST-标签、MBP-标签或CBP-标签。在其它实施方案中，所述标签是6xHis标签。在一些实施方案中，所述标签在酶的C-末端共价连接至β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，所述标签在酶的N末端共价连接至β-(l,4)-GalNAcT酶。
在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶包含N-末端6xHis标签并具有总分子量45.7kDa。在一些实施方案中，含有N-末端6xHis标签的β-(l,4)-GalNAcT酶衍生自粉纹夜蛾。
P”-S”-A”的分子
在一些实施方案中，用于制备本公开内容的修饰抗体的方法的P”-S”-A”分子可以是作为合适的半乳糖基转移酶催化剂的底物的任何糖衍生物核苷酸。
在一些实施方案中，S”-A”是糖衍生物部分，其中：
S”是糖或衍生的糖；和A”是能够与接头-药物部分的官能团形成共价键的官能团。
在一些实施方案中，A”是叠氮基、酮基或炔基部分。在一些实施方案中，A”是叠氮基或酮基部分。在一些实施方案中，A”是叠氮基部分。在一些实施方案中，A”是-N3。在一些实施方案中，A”是酮基部分。
在一些实施方案中，A”是-[C(R8k)2]x2C(O)R9k，其中：
R9k是甲基或任选取代的C2-24烷基；
每个R8k独立地是氢、卤素或R9k；和
x2是范围为0-24的整数。
在一些实施方案中，x2是范围为0-10的整数。在一些实施方案中，x2是0、1、2、3、4、5或6。
在一些实施方案中，每个R8k是氢。
在一些实施方案中，A”是炔基部分。在一些实施方案中，A”是末端炔基、环炔基或杂环基炔基部分。在一些实施方案中，A”是末端炔基部分。在一些实施方案中，A”是环炔基部分。在一些实施方案中，A”是杂环基炔基部分。
在一些实施方案中，A”是-[C(R8k)2]x2-C≡C-R8k基团，其中R8k和x2如本文所定义。在一些实施方案中，A”是-[CH2]x2-C≡CH。
在一些实施方案中，S”-A”衍生自糖或衍生的糖，例如氨基糖或以其它方式衍生的糖。在一些实施方案中，糖和衍生的糖的实例包括但不限于半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、葡糖醛酸(Gcu)和岩藻糖(Fuc)。应理解，氨基糖是其中羟基(OH)被胺基团替换的糖。氨基糖的实例包括但不限于N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。以其它方式衍生的糖的实例包括但不限于葡糖醛酸(Gcu)和N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)。
在一些实施方案中，S”-A”衍生自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)或N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GlcNAc、Glc、Gal或GalNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GlcNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Glc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Gal或GalNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Gal。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GalNAc。
在一些实施方案中，官能团A”可以各种方式连接至S”。
在一些实施方案中，A”直接连接至S”的糖或衍生的糖的C2、C3、C4或C6位置的碳原子(例如，不是相应位置处的羟基)。
在一些实施方案中，S”是岩藻糖或衍生的岩藻糖，其缺少任何羟基C6位置。在一些实施方案中，当A”连接至岩藻糖或衍生的岩藻糖的C6位置时，A”直接连接至C6位置的碳原子。
在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，和A”连接至S”的糖或衍生的糖的C2、C4或C6位置。
在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，和A”直接连接至S”的糖或衍生的糖的C2、C3、C4或C6位置的碳原子(例如，不是相应位置处的羟基)。在一些实施方案中，S”-A”是6-叠氮基岩藻糖(6-AzFuc)。在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，和A”连接至氨基糖或衍生的氨基糖的N-乙酰基部分(例如，通过用叠氮基乙酰基部分替换乙酰基部分)。在一些实施方案中，S”-A”是2-叠氮基乙酰氨基半乳糖(GalNAz)、6-叠氮基-6-脱氧半乳糖(6-AzGal)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖(6-AzGalNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖(4-AzGalNAc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰氨基半乳糖(6-AzGalNAz)、2-叠氮基乙酰氨基葡萄糖(GlcNAz)、6-叠氮基-6-脱氧葡萄糖(6-AzGlc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰氨基葡萄糖(6-AzGlcNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰氨基葡萄糖(4-AzGlcNAc)或6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰氨基葡萄糖(6-AzGlcNAz)。在一些实施方案中，S”-A”是GalNAz、4-AzGalNAc、GlcNAz或6-AzGlcNAc。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)、(XXXIVc)或(XXIVd)的化合物，或其盐。
在一些实施方案中，A”是酮基，和A”直接连接至S”的糖或衍生的糖的C2位置处的碳原子(例如，不是相应位置处的羟基)。
在一些实施方案中，A”连接至氨基糖或衍生的氨基糖，例如C2-衍生的氨基糖的氮原子。在一些实施方案中，衍生的氨基糖包含-NC(O)-R9k的部分，其中R9k是甲基或任选取代的C2-24烷基(例如，乙基)。
在一些实施方案中，R9k是乙基。
在一些实施方案中，S”-A”是2-脱氧-(2-氧代丙基)-半乳糖(2-酮基-Gal)、2-N-丙酰基-半乳糖胺(2-N-丙酰基Gal-NAc)、2-N-(4-氧代戊酰基)-半乳糖胺(2-N-Lev-Gal)或2-N-丁酰基-半乳糖胺(2-N-丁酰基-GalNAc)。在一些实施方案中，S”-A”是2-酮基GalNAc或2-N-丙酰基-GalNAc。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVe)或(XXIVf)的化合物，或其盐。
在一些实施方案中，A”是末端炔基、环炔基或杂环基炔基。在一些实施方案中，A”连接至S”的C2-衍生的氨基糖。
在一些实施方案中，S”-A”是2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVg)的化合物或其盐。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVd)的化合物或其盐。
在一些实施方案中，P”-S”-A”的化合物可根据本领域已知的各种方法合成。在一些实施方案中，化合物通过将核苷单磷酸或核苷二磷酸P”连接至糖衍生物S″-A″合成，例如公开于Wang等(Chem.Eur.J.16:13343-13345(2010))、Piller等(ACS Chem.Biol.7:753(2012))、Piller等(Bioorg.Med.Chem.Lett.15:5459-5462(2005)和PCT Appl’nPub.No.WO/2009/102820，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，P”是核苷单或二磷酸。在一些实施方案中，P”是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)或胞苷单磷酸(CMP)。在一些实施方案中，P”是尿苷二磷酸(UDP)。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)、(XXIVc)、(XXIVd)、(XXIVe)、(XXIVf)或(XXIVg)的化合物：
Figure GDA0004100926510001161
或其盐，其中：R9k是C2-24烷基。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是GalNAz-UDP(例如，式(XXIVb))、6-AzGal-UDP(例如，式(XXIVc))、6-AzGalNAc-UDP(例如，式(XXIVd))、4-AzGalNAz-UDP、6-AzGalNAz-UDP、6-AzGlc-UDP、6-AzGlcNAz-UDP、2-酮基Gal-UDP(例如，式(XXIVe))、2-N-丙酰基GalNAc-UDP(例如，式(XXIVf)，其中R9k是乙基)或2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP(例如，式(XXIVg))。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是GalNAz-UDP或4-AzGalNAc-UDP。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)或(XXIVd)的化合物。GalNAz-UDP(例如，式(XXIVb))和6-AzGalNAc-UDP(例如，式(XXIVd))的合成公开于Piller等(Bioorg.Med.Chem.Lett.15:5459-5462(2005))和Wang等(Chem.Eur.J.16:13343-13345(2010))，其各自通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，P”-S”-A”是4-AzGalNAc-UDP。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVd)的化合物或其盐。2-酮基Gal-UDP(XXIVe)的合成公开于Qasba等(J.Am.Chem.Soc.125:16162(2003))和其支持信息，二者通过引用以其整体结合到本文中。
2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP的合成公开于PCT申请公开号WO/2009/102820，其通过引用以其整体并入本文。
抗体药物缀合物
在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物可通过使本公开内容的修饰抗体与包含官能团(例如，WP)的接头-药物部分反应获得，所述官能团能够与修饰抗体中的修饰GlcNAc部分＊-GIcNAc-S″-A″的官能团A”形成共价键。
在一些实施方案中，WP包含炔基例如，环炔基、杂环基炔基或末端炔基。
在一些实施方案中，修饰的抗体的官能团A”是叠氮基、酮基或炔基。在一些实施方案中，修饰的抗体的官能团A”是叠氮基。在一些实施方案中，修饰的抗体的叠氮基官能团A”与接头-药物部分的WP的炔基(例如，环炔基、杂环基炔基或末端炔基)反应以形成三唑部分(例如，通过环加成反应)。叠氮基和炔基的环加成反应在本领域称为“点击化学”。
在一些实施方案中，接头-药物部分的WP包含末端炔基，和环加成反应可在存在催化剂(例如，Cu(I)催化剂)的情况下进行。
在一些实施方案中，接头-药物部分的WP包含环炔基或杂环基炔基(例如，紧绷的环炔基或杂环基炔基)。
在一些实施方案中，接头-药物部分的WP包含紧绷的环炔基或杂环基炔基，和环加成反应可在存在或不存在催化剂的情况下进行。在一些实施方案中，环加成反应可通过称为应变促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)的反应自发发生，这在本领域称为“无金属点击化学”。在一些实施方案中，紧绷的环炔基或杂环基炔基如本文所述的。
在一些实施方案中，在缀合后，修饰的抗体的官能团A”和接头-药物部分的WP形成三唑部分。
在一些实施方案中，在缀合后，修饰的抗体的官能团A”和接头-药物部分的WP形成式(XXXV)的三唑部分：
Figure GDA0004100926510001181
其中*表示直接或间接连接至修饰的抗体的剩余部分；和**表示连接至Mp。
在一些实施方案中，当本公开内容的叠氮化物-修饰的抗体通过环加成反应与包含炔基的接头-药物部分反应以形成抗体-药物缀合物时，抗体-药物缀合物中形成的三唑部分可抵抗水解和/或其它降解途径。
在一些实施方案中，当本公开内容的醛或酮-修饰的抗体与包含羟基胺或肼的接头-药物部分反应时，抗体-药物缀合物中得到的肟或腙部分可在中性条件下是相对惰性的。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物可具有高稳定性。
在一些实施方案中，本公开内容的修饰的抗体和抗体-药物缀合物可通过实用合成路线合成，因为用于引入官能团A”(例如，叠氮基、酮基或炔基)至抗体中的方法是直接的和通常适用的。
在一些实施方案中，本公开内容的位点特异性抗体-药物缀合物通过包括使修饰的抗体与接头-药物部分反应的方法获得，其中：
接头-药物部分包含环炔基或杂环基炔基，
修饰的抗体在缀合之前包含抗体和通过GlcNAc的C1位置连接至抗体的修饰的GlcNAc部分＊-GlcNAc-S″-A″；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；S”是糖或衍生的糖；和A”是叠氮基。
在一些实施方案中，A”是环炔基或杂环基炔基。在一些实施方案中，A”是环炔基。在一些实施方案中，A”是杂环基炔基。
在一些实施方案中，A”是紧绷的环炔基或杂环基炔基。在一些实施方案中，A”是紧绷的环炔基。在一些实施方案中，A”是紧绷的杂环基炔基。
在一些实施方案中，本公开内容的位点特异性抗体-药物缀合物通过包括以下步骤的方法获得：
(a)使式(XXII)的中间体抗体：
Figure GDA0004100926510001191
其中：
Ab是抗体；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；Fuc是岩藻糖；u3是0或1；和d13是范围为1-12的整数；
与化合物P″-S″-A″在存在半乳糖基转移酶的情况下接触，其中：
S”是糖或衍生的糖；A”是叠氮基；和P是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)或胞苷二磷酸(CDP)；
从而形成包含修饰的GlcNAc部分＊-GlcNAc-S″-A″的修饰的抗体(任选地，修饰的GlcNAc部分在GlcNAc的C1位置处连接至修饰的抗体的剩余部分)；和
(b)使修饰的抗体与包含紧绷的环炔基或杂环基炔基的接头-药物部分反应，从而形成抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，用于制备位点特异性抗体-药物缀合物的方法如图5所述。
在一些实施方案中，在抗体的每个氨基酸N297处包含叠氮基的修饰的抗体与包含紧绷的环炔基或杂环基炔基的接头-药物部分通过无金属点击化学缀合以形成本公开内容的位点特异性抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，当修饰的抗体包含至少一个叠氮基部分和接头-药物部分包含紧绷的环炔基时，存在铜催化剂对于修饰的抗体的叠氮基和接头-药物部分的紧绷的环炔基或杂环基炔基之间的环加成反应而言不是必需的。在一些实施方案中，环加成反应在不存在铜催化剂的情况下进行，这可减轻在该方法中使用铜催化剂的数个可能的缺点。
在一些实施方案中，Cu(I)催化剂通常在抗体的叠氮基部分和末端炔部分的环加成中是必需的。在一些实施方案中，可能需要条件的大量优化和细微调整以找到用于高效转化的最优参数。然而，即使在这样的条件下，不能总是完全避免同时形成反应性氧物类，这进而可对抗体/蛋白质导致氧化破坏(例如，甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸或二硫键的氧化)。其它方案已经采用Cu(I)来源，例如CuBr，用于标记固定的细胞和合成糖蛋白。在这些情况下，Cu(I)在空气中的不稳定性导致需要非常过量的Cu(例如，大于4mm)和配体用于高效反应，这也可能产生抗体/蛋白质破坏或沉淀，以及在纯化后存在残留金属的风险。因此，在存在铜催化剂的情况下含有叠氮基的抗体与末端炔的缀合可导致通过不需要的氨基酸氧化形成大量副产物。
在一些实施方案中，包含叠氮基(例如，在抗体的每个氨基酸N297处)的修饰的抗体与包含紧绷的环炔基或杂环基炔基的接头-药物部分缀合(例如，通过无金属点击化学)。
在一些实施方案中，在缀合后，修饰的抗体的叠氮基部分和接头-药物部分的紧绷的环炔基或杂环基炔基形成式(XXXV)的三唑部分：
Figure GDA0004100926510001201
其中*表示直接或间接连接至修饰的抗体的剩余部分；和**表示连接至Mp。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物包含一个或多个存在的D、其中每个D独立地是治疗剂(例如，药物)，其中一个或多个存在的D可以相同或不同。
在一些实施方案中，抗体的一个或多个特定位点连接至接头-药物部分，其中连接至一个或多个特定位点的接头-药物部分可以相同或不同。在一些实施方案中，包含一个或多个存在的D的一个或多个接头-药物部分连接至一个抗体。
在一些实施方案中，D是(a)奥瑞他汀化合物；(b)卡奇霉素化合物；(c)多卡霉素化合物；(d)SN38；(e)吡咯并苯二氮杂
Figure GDA0004100926510001215
(f)长春花化合物；(g)微管溶素化合物；(h)非天然喜树碱化合物；(i)美登素类化合物；(j)DNA结合药物；(k)激酶抑制剂；(l)MEK抑制剂；(m)KSP抑制剂；(n)拓扑异构酶抑制剂；(o)DNA-烷基化药物；(p)RNA聚合酶；(q)PARP抑制剂；(r)NAMPT抑制剂；(s)拓扑异构酶抑制剂；(t)蛋白质合成抑制剂；(u)DNA-结合药物；(v)DNA嵌入药物；或(w)免疫调节化合物。
在一些实施方案中，D是(a)奥瑞他汀化合物；(b)卡奇霉素化合物；(c)多卡霉素化合物；(d)喜树碱化合物；(e)吡咯并苯二氮杂
Figure GDA0004100926510001216
化合物；(f)长春花化合物；或其类似物。
在一些实施方案中，奥瑞他汀化合物是奥瑞他汀、多拉司他丁、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、奥瑞他汀F、AF-HPA、MMAF-HPA或苯二胺(AFP)。
在一些实施方案中，多卡霉素或其类似物是多卡霉素A、多卡霉素B1、多卡霉素B2、多卡霉素C1、多卡霉素C2、多卡霉素D、多卡霉素SA、CC-1065、adozelesin、bizelesin或carzelesin。
在一些实施方案中，喜树碱化合物是喜树碱、CPT-11(伊立替康)、SN-38或拓扑替康。
在一些实施方案中，吡咯并苯二氮杂
Figure GDA0004100926510001211
化合物是吡咯并苯二氮杂/>
Figure GDA0004100926510001212
单体、对称的吡咯并苯二氮杂/>
Figure GDA0004100926510001213
二聚体或不对称的吡咯并苯二氮杂/>
Figure GDA0004100926510001214
二聚体。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体-药物缀合物包含修饰的抗体，其具有分子量约40kDa或更大(例如，约60kDa或更大；约80kDa或更大；约100kDa或更大；约120kDa或更大；约140kDa或更大；约160kDa或更大；约180kDa或更大；或约200kDa或更大；或约40-200kDa、约40-180kDa、约40-140kDa、约60-200kDa、约60-180kDa、约60-140kDa、约80-200kDa、约80-180kDa、约80-140kDa、约100-200kDa、约100-180kDa或约100-140kDa)。
在一些实施方案中，修饰的抗体具有分子量约40kDa或更大(例如，约60kDa或更大；约80kDa或更大；约100kDa或更大；约120kDa或更大；约140kDa或更大；约160kDa或更大；约180kDa或更大；或约200kDa或更大；或约40-200kDa、约40-180kDa、约40-140kDa、约60-200kDa、约60-180kDa、约60-140kDa、约80-200kDa、约80-180kDa、约80-140kDa、约100-200kDa、约100-180kDa或约100-140kDa)和在氨基酸N297处被修饰。
在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是12或更少。在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(连接点的总数)是10或更少。在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是8或更少。在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是6或更少。在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是4或更少。在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是2或更少。
在一些实施方案中，在接头-药物部分和抗体之间形成的特定键的总数(或者连接点的总数)是2。
在一些实施方案中(例如，对于与一个或多个接头-药物部分缀合)，修饰的抗体具有分子量约140kDa-约180kDa。在对于与一个或多个接头-药物部分缀合的一些实施方案中，修饰的抗体具有分子量140kDa-180kDa。
在一些实施方案中，在该分子量范围的抗体包括但不限于例如，全长抗体，例如IgG或IgM。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的抗体、接头或治疗剂可根据本领域已知的各种技术和方法组装成本公开内容的缀合物或支架。本公开内容的缀合物和产生缀合物的方法在本文中描述(例如，通过非限制性实施方案和实例)。
在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间形成的键的总数(或连接点的总数)是12或更少。
在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是大于1:1和小于或等于12:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1至10:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1或约2:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约2:1至约4:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约4:1、约3:1或约2:1。在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约2:1或1:1。
在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约6:1、约5:1、约4:1或约3:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是1:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约3:1、约2:1或约1:1。
在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约8:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约6:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约5:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约4:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约3:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约2:1。在一些实施方案中，a2是3，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是2:1，和在治疗剂(D)和修饰的抗体之间的比率是约1:1。
在一些实施方案中，在接头-药物部分和修饰的抗体之间的比率是约2:1。
在一些实施方案中，抗体在区域290-305(例如，N297)中包含天冬酰胺基团，其连接至包含官能团A”的糖-衍生物部分；和修饰的抗体通过在A”和接头-药物部分的官能团之间形成的共价键缀合至接头-药物部分。
在一些实施方案中，接头-药物部分包含至少两个官能团，其各自能够与修饰的抗体的糖-衍生物部分的官能团A”形成共价键(例如，在抗体的氨基酸N297处)以形成抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中(例如，对于缀合至接头-药物部分)，修饰的抗体具有分子量40kDa或更大(例如，60kDa或更大；80kDa或更大；或100kDa或更大；120kDa或更大；140kDa或更大；160kDa或更大；或180kDa或更大)。在一些实施方案中，在修饰的抗体和接头-药物部分之间的比率是约1:1至约1:2。
在一些实施方案中，在该分子量范围的抗体包括但不限于全长抗体(例如，IgG和IgM)。
在一些实施方案中(例如，对于与一个或多个接头-药物部分缀合)，修饰的抗体具有分子量60kDa-120kDa。在一些实施方案中，在修饰的抗体和接头-药物部分之间的比率是约1:1至约1:2。
在一些实施方案中，在该分子量范围的抗体包括但不限于，抗体片段(例如，Fab2、scFcFv和骆驼抗体)。
在一些实施方案中(例如，对于与一个或多个接头-药物部分缀合)，修饰的抗体具有分子量40kDa-80kDa。在一些实施方案中，在修饰的抗体和接头-药物部分之间的比率是约1:1至约1:2。
在一些实施方案中，本公开内容的抗体药物缀合物和支架可通过广泛渗滤纯化(例如，以除去任何原材料)。如果需要的话，可通过尺寸排阻色谱法进行另外的纯化以除去任何聚集缀合物。在一些实施方案中，纯化的缀合物或支架包含小于5％w/w(例如，<2％w/w)的聚集缀合物，如通过SEC测定的；小于0.5％w/w(例如，<0.1％w/w)的游离(未缀合)药物，如通过RP-HPLC测定的；小于1％w/w携带含肽支架的药物，如通过SEC测定的；和/或小于2％w/w(例如，<1％w/w)的未缀合抗体，如通过HIC-HPLC测定的。
在一些实施方案中，接头-药物部分选自下表B中描述的支架。
表B
Figure GDA0004100926510001261
/>
Figure GDA0004100926510001271
/>
Figure GDA0004100926510001281
/>
Figure GDA0004100926510001291
/>
Figure GDA0004100926510001301
/>
Figure GDA0004100926510001311
/>
Figure GDA0004100926510001321
/>
Figure GDA0004100926510001331
/>
Figure GDA0004100926510001341
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物选自下表C中描述的缀合物。
表C
Figure GDA0004100926510001351
/>
Figure GDA0004100926510001361
/>
Figure GDA0004100926510001371
/>
Figure GDA0004100926510001381
/>
Figure GDA0004100926510001391
/>
Figure GDA0004100926510001401
/>
Figure GDA0004100926510001411
/>
Figure GDA0004100926510001421
/>
Figure GDA0004100926510001431
其中：
■是GlcNAc；△是Fuc；
Figure GDA0004100926510001434
是GalNAc；和d13是如本文所定义。
应理解，除非另外指明，在本公开内容中符号■是指GlcNAc。应理解，除非另外指明，在本公开内容中符号△是指岩藻糖。应理解，除非另外指明，在本公开内容中符号
Figure GDA0004100926510001435
是指GalNAc。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)：
Figure GDA0004100926510001432
其中：
每个RA是
Figure GDA0004100926510001433
/>
Figure GDA0004100926510001441
d13是2；和一个或多个接头-药物部分在抗体的N297处连接至天冬酰胺基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)：
Figure GDA0004100926510001442
其中每个RA是：
Figure GDA0004100926510001451
/>
Figure GDA0004100926510001461
/>
Figure GDA0004100926510001471
/>
Figure GDA0004100926510001481
/>
Figure GDA0004100926510001491
d13是2；和抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001492
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001501
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001502
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001511
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001512
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001521
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001522
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是：
Figure GDA0004100926510001531
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXX)，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001532
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXXII-1)、(XXXII-2)、(XXXII-3)或(XXXII-4)：
Figure GDA0004100926510001541
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXXIII)：
Figure GDA0004100926510001542
其中每个RB是：
Figure GDA0004100926510001551
/>
Figure GDA0004100926510001561
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXXII-1)、(XXXII-2)、(XXXII-3)、(XXXII-4)或(XXXIII)，其中-LD-D的部分是：
Figure GDA0004100926510001562
/>
Figure GDA0004100926510001571
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXXII-1)、(XXXII-2)、(XXXII-3)、(XXXII-4)或(XXXIII)，其中-LD-D的部分是：
Figure GDA0004100926510001572
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物具有式(XXXIV)：
Figure GDA0004100926510001573
其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001581
/>
Figure GDA0004100926510001591
/>
Figure GDA0004100926510001601
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物是式(XXXIV)的缀合物，其中每个RA是
Figure GDA0004100926510001602
任选地，抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团；和任选地，抗体在修饰之前是NaPi2b抗体XMT-1535，其公开于美国申请号15/457,574。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物是式(XXXV)的缀合物：
Figure GDA0004100926510001611
其中
d13是2；
抗体是NaPi2b抗体，其包含：包含氨基酸序列GYTFTGYNIH(SEQ ID NO:5)的CDRH1；包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYKQKFRG(SEQ ID NO:6)的CDRH2；包含氨基酸序列GETARATFAY(SEQ ID NO:7)的CDRH3；包含氨基酸序列SASQDIGNFLN(SEQ ID NO:8)的CDRL1；包含氨基酸序列YTSSLYS(SEQ ID NO:9)的CDRL2；包含氨基酸序列QQYSKLPLT(SEQ ID NO:10)的CDRL3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；
接头-药物部分在抗体的N297处连接至天冬酰胺基团；
■是GlcNAc；△是Fuc；和□是GalNAc。
在一些实施方案中，抗体-药物缀合物是式(XXXVI)的缀合物：
Figure GDA0004100926510001621
其中
d13是整数2；
抗体是NaPi2b抗体，其包含：包含氨基酸序列GYTFTGYNIH(SEQ ID NO:5)的CDRH1；包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYKQKFRG(SEQ ID NO:6)的CDRH2；包含氨基酸序列GETARATFAY(SEQ ID NO:7)的CDRH3；包含氨基酸序列SASQDIGNFLN(SEQ ID NO:8)的CDRL1；包含氨基酸序列YTSSLYS(SEQ ID NO:9)的CDRL2；包含氨基酸序列QQYSKLPLT(SEQ ID NO:10)的CDRL3；包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的重链；和包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的轻链；
接头-药物部分在抗体的N297处连接至天冬酰胺基团；
■是GlcNAc；△是Fuc；和□是GalNAc。
药物组合物
在本公开内容的一些实施方案中，包括药物组合物，其包含在可接受的载体，例如稳定剂、缓冲剂等中的本文公开的一种或多种缀合物。在一些实施方案中，缀合物可通过标准方法给予和引入到受试者中，含或不含稳定剂、缓冲剂等，以形成药物组合物。在一些实施方案中，给予可以是胃肠外给予，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注，或颅内例如鞘内或脑室内给予。在一些实施方案中，缀合物可作为用于注射给予的无菌溶液和/或混悬液；用于注射/输注之前重构的冻干粉；局部组合物；用于口服给予的片剂、胶囊或酏剂；或用于直肠给予的栓剂，和本领域已知的其它组合物配制和使用。
药物组合物或制剂是指呈合适于给予，例如全身给予至细胞或受试者包括例如人的形式的组合物或制剂。合适的形式部分依赖于用途或进入途径，例如经口、吸入、透皮或通过注射/输注。这样的形式不应阻止组合物或制剂达到靶细胞(即，药物需要递送的细胞)。
所谓的“全身给予”是指体内全身吸收或累积缀合物在血流中，接着分布到全身。导致全身吸收的给予途径包括但不限于：静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。本公开内容的缀合物的使用可通过抗体的特异性使药物递送局部化在某些细胞例如癌细胞中。
“药学上可接受的制剂”意指允许缀合物有效分布在最合适于其所需活性的身体位置的组合物或制剂。在一些实施方案中，有效递送在通过网状内皮系统清除或可导致减少功效或毒性的脱靶结合产生之前发生。适合于与缀合物配制的试剂的非限制性实例包括：P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)，其可增强活性剂进入CNS；可生物降解的聚合物，例如多聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球，用于在脑内植入后持续释放递送；和负载纳米颗粒，例如用聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些，其可跨过血脑屏障递送活性剂和可改变神经元摄取机制。
在本公开内容的一些实施方案中，提供经制备用于贮存或给予的药物组合物，其包含在药学上可接受的载体或稀释剂中的药学有效量的所需缀合物。在一些实施方案中，用于治疗用途的可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂是药学领域众所周知的。在一些实施方案中，可提供缓冲剂、防腐剂、填充剂、分散剂、稳定剂或染料。在一些实施方案中，可使用抗氧化剂和助悬剂。
如本文使用的术语“药学有效量”是指治疗、改善或预防所鉴定的疾病或病况或显示可检测的治疗或抑制效果的药剂的量。效果可通过本领域已知的任何测定法检测。对于受试者的准确有效量将取决于受试者的体重、大小和健康；病况的性质和程度；和选择给予的治疗剂或治疗剂组合。
在一些实施方案中，对于任何缀合物，药学有效量可初始在细胞培养测定法，例如，肿瘤细胞的培养测定法中或在动物模型，通常大鼠、小鼠、兔、狗或猪中估计。在一些实施方案中，动物模型也可用于测定合适的浓度范围和给予途径。在一些实施方案中，这样的信息然后可用于在人类中确定有用的剂量和给予途径。在一些实施方案中，治疗和/或预防功效和毒性可通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如，ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％的群体致死的剂量)。在一些实施方案中，在毒性和治疗和/或预防效果之间的剂量比是治疗指数，和其可表示为比值LD50/ED50。在一些实施方案中，药物组合物显示大的治疗指数。在一些实施方案中，剂量可在取决于使用的剂型、患者的敏感性和给予途径的该范围内改变。
在一些实施方案中，可在数个细胞系中使用细胞效价Glo评价药物或其衍生物、药物-缀合物或PBRM-药物缀合物抑制肿瘤生长的能力。剂量应答曲线可使用SoftMax Pro软件产生，和IC50值可从四参数曲线拟合测定。使用的细胞系可包括作为PBRM的靶标的那些和不是在测试的缀合物中含有的PBRM的靶标的对照细胞系。
在一些实施方案中，缀合物经配制用于通过注射的胃肠外给予，包括使用常规的插管技术或输注。在一些实施方案中，用于注射的制剂可以单位剂型提供，例如在安瓿中或在多剂量容器中，具有添加的防腐剂。在一些实施方案中，缀合物可在无菌介质中经胃肠外给予。在一些实施方案中，取决于使用的溶媒和浓度，缀合物可悬浮或溶解在溶媒中。在一些实施方案中，辅助剂例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂可溶解在溶媒中。如本文所用的术语“胃肠外”包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等。此外，提供了包含缀合物和药学上可接受的载体的药物制剂。一种或多种缀合物可与一种或多种无毒的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或辅助剂，和如果需要的话其它活性成分结合存在。
在一些实施方案中，无菌注射制剂也可是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液。在一些实施方案中，可使用的可接受的溶媒和溶剂是水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。在一些实施方案中，无菌的固定油常规用作溶剂或悬浮介质。在一些实施方案中，可使用温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。在一些实施方案中，脂肪酸例如油酸可用于注射剂的制备。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物和组合物可以合适的形式(例如，胃肠外或静脉内)给予。
在一些实施方案中，缀合物可一周一次给予，持续六周或更长。在一些实施方案中，缀合物可每两周、三周或四周一次给予。在一些实施方案中，在约50-约400mL的生理盐水中给予推注剂量，其中可加入约5-约10mL的人血清白蛋白。在一些实施方案中，经24小时的期间，在约250-约500mL的生理盐水中给予连续输注，其中可加入约25-约50mL的人血清白蛋白。
在一些实施方案中，治疗后约1至约4周(例如，治疗后约3周或治疗后约4周)，患者可接受第二个疗程。
在一些实施方案中，治疗有效量可基于另一规律方案，即每日、每周、每月或每年基础或改变给予天数、周数、月数等的无规律方案提供。在一些实施方案中，待给予的治疗有效量可改变。在一些实施方案中，对于第一剂量的治疗有效量高于对于一个或多个后续剂量的治疗有效量。在一些实施方案中，对于第一剂量的治疗有效量低于对于一个或多个后续剂量的治疗有效量。在一些实施方案中，等效剂量可在各个时间段内给予，包括但不限于约每2小时、约每6小时、约每8小时、约每12小时、约每24小时、约每36小时、约每48小时、约每72小时、约每周、约每2周、约每3周、约每月和约每2月。在一些实施方案中，对应于完成疗程的剂量的次数和频率将根据相关的监管机构的建议和保健从业人员的判断确定。在一些实施方案中，本文所述的治疗有效量是指在给定的时间段给予的总量；即，如果给予超过一种不同的本文所述的缀合物，治疗有效量对应于给予的总量。应理解，对于具体受试者的特定剂量水平取决于各种因素，包括特定缀合物的活性，年龄、体重、一般健康、性别、饮食、给予次数、给予途径和排泄速率，与其它活性剂的组合，和正经历治疗的具体疾病的严重性。
在一些实施方案中，本文公开的缀合物的治疗有效量总体上涉及实现治疗目标需要的量。在一些实施方案中，这可以是抗体和其靶标抗原之间的结合相互作用，在某些情况下，其干扰靶标发挥功能。在一些实施方案中，需要给予的量此外取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，和还将取决于给予的抗体从其给予其它受试者的自由体积耗尽的速率。在一些实施方案中，作为非限制性实例，本文公开的缀合物的治疗有效剂量的范围可以是约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重、约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重或约0.1mg/kg体重至约150mg/kg体重。在一些实施方案中，给药频率范围可以是例如每天两次至每月一次(例如，每天一次、每周一次、每隔一周一次、每三周一次或每月一次)。在一些实施方案中，本文公开的缀合物可以约0.1mg/kg至约20mg/kg(例如，0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.67mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg)通过输注(例如，作为单一剂量，每周、每2周、每3周或4周)静脉内给予。在一些实施方案中，本文公开的缀合物可以约0.1mg/kg至约20mg/kg(例如，0.2mg/kg、0.5mg/kg、0.67mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、19mg/kg或20mg/kg)给予(例如，作为单一剂量，每周、每2周、每3周或每月)用于治疗癌症。
在一些实施方案中，本文公开的缀合物可以约7mg/m2至约162mg/m2(例如，7mg/m2、14mg/m2、28mg/m2、56mg/m2、84mg/m2、112mg/m2、135mg/m2或162mg/m2)通过输注(例如，作为单一剂量，每周、每2周、每3周或每4周)静脉内给予。用于分配药剂的大量包装或药盒是本领域已知的，用于定期口服使用。在一些实施方案中，包装具有对于每个时期的指示。在一些实施方案中，包装是标记的罩泡包装、调谐(dial)分配包装或瓶。在一些实施方案中，药盒的包装方式本身可适应于给予，例如注射器、吸管、滴管或其它这样的装置，所述制剂可从其应用于受影响的身体区域，注射到受试者中，或甚至应用于药盒的其它组分和与其混合。
使用方法
在一些实施方案中，本公开内容提供治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括给予所述受试者治疗有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物，用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物，用于治疗有需要的受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物用于治疗有需要的受试者的癌症的用途。在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的癌症，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的表达NaPi2b的癌症，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括给予所述受试者有效量的至少一种本公开内容的缀合物；其中在生物降解后所述缀合物释放一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，本公开内容提供治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，包括给予所述受试者有效量的至少一种本公开内容的缀合物；其中在生物降解后所述缀合物释放一种或多种治疗剂。
在一些实施方案中，所述疾病是癌症。
在一些实施方案中，本文提供的含有NaPi2b靶向的抗体-药物缀合物的癌症疗法以足以发挥治疗有用效果的量给予。通常，活性剂以不导致治疗的患者的不需要的副作用或最小化或减少观察到的副作用的量给予。表达NaPi2b的癌症包括例如，卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、乳头状肾细胞癌、唾液管癌、乳头状甲状腺癌、透明细胞肾癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌和胆管癌。
确定给予受试者的活性剂，包括NaPi2b靶向的聚合物抗体-药物缀合物的准确量在本领域技术人员的水平内。例如，这样的药剂和用于治疗癌症和实体瘤的用途是本领域众所周知的。因此，这样的药剂的剂量可基于对于在给定给予途径下药剂的标准给药方案选择。
应理解，准确剂量和治疗持续时间随着治疗的组织或肿瘤而变化，和可使用已知的测试方案或通过从体内或体外试验数据外推根据经验确定，和/或可从该特定药剂的已知给药方案确定。应注意，浓度和剂量值也可随着治疗的个体的年龄、个体的重量、给予途径和/或疾病的程度或严重性和在医学从业者的水平内考虑的其它因素改变。一般而言，选择剂量方案以限制毒性。应注意，主治医师知道如何以及何时由于毒性或骨髓、肝脏或肾脏或其它组织功能异常而终止、暂停或调整疗法以降低剂量。相反，主治医师也知道如果临床反应不够的话(排除毒性副作用)，如何以及何时调整治疗至更高水平。还应理解，对于任何特定的受试者，具体的剂量方案应该随时间根据个体需要和给予或监管给予制剂的人的职业判断调整，和本文阐述的浓度范围仅是示例性的，不意图限制其范围。
例如，NaPi2b靶向的聚合物抗体-药物缀合物以治疗有效量给予以减小肿瘤体积。
给予一定量的NaPi2b靶向的聚合物抗体-药物缀合物以治疗疾病或病况，例如癌症或实体瘤可通过标准临床技术测定。此外，体外测定和动物模型可用于帮助鉴定最佳剂量范围。可根据经验确定的准确剂量可取决于给予途径、治疗的疾病类型和疾病的严重性。
在一些实施方案中，本文提供的缀合物经静脉内给予。在对于静脉内给予的一些实施方案中，缀合物可通过推进或推注、通过输注或通过其组合给予。在一些实施方案中，输注时间可是约1分钟至3小时、例如约1分钟至约2小时或约1分钟至约60分钟或至少10分钟、40分钟或60分钟。
在一些实施方案中，剂量是约7mg/m2至162mg/m2(例如7mg/m2、14mg/m2、28mg/m2、56mg/m2、84mg/m2、112mg/m2、135mg/m2或162mg/m2)。在一些实施方案中，剂量是约6.5mg/m2至约7.5mg/m2、约13.5mg/m2至约14.5mg/m2、约27.5mg/m2至约28.5mg/m2、约55.5mg/m2至约56.5mg/m2、约83.5mg/m2至约84.5mg/m2、约111.5mg/m2至约112.5mg/m2、约134.5mg/m2至约135.5mg/m2或约161.5mg/m2至约162mg/m2)。在一些实施方案中，剂量经静脉内每三周一次(即21天周期)或每四周一次(即28天周期)给予。
给予的频率和时机以及剂量可在一个给予周期内周期性给予以维持活性剂的连续和/或长期效果，持续所需的时间长度。提供的NaPi2b靶向抗体-药物缀合物的组合物可每小时、每天、每周、每月、每年或一次给予。给予周期的时间长度可根据经验确定，和取决于待治疗的疾病、疾病的严重性、具体患者和主治医师技术水平内的其它考虑。用本文提供的组合疗法的治疗的时间长度可以是1周、2周、1月、几个月、1年、几年或更久。
在一些实施方案中，给予NaPi2b靶向抗体-药物缀合物的频率是一天1次、每隔一天、每周2次、每周1次、每2周1次、每3周1次或每4周1次。在疗程期间剂量可分成多个给予周期。例如，NaPi2b靶向抗体-药物缀合物可在约1月、2月、3月、4月、5月、6月、1年或更久期间以一定频率给予。给予频率可以在整个周期期间相同或可以不同。在一些实施方案中，NaPi2b靶向抗体-药物缀合物给予至少1周2次，持续给予周期的第一周。第一周后，频率可继续1周2次，可增加至超过1周2次，或可减少至不超过1周1次。根据给予的具体剂量、治疗的疾病或病况、疾病或病况的严重性、受试者的年龄和其它类似因素确定具体剂量频率和给予周期在技术人员的水平内。
在一些实施方案中，如果疾病症状在没有中断治疗的情况下持续，治疗可继续另外的时间长度。在疗程中，可监测疾病和/或治疗相关的毒性或副作用的证据。
NaPi2b靶向抗体-药物缀合物的给予周期可调节以增加中断治疗期，以提供免于药剂暴露的休息期。中断治疗的时间长度可以是预定时间或可以根据经验确定，取决于患者如何响应或根据观察到的副作用。例如，治疗可中断1周、2周、3周、1月或几个月。在一些实施方案中，中断治疗期并入患者给药方案的周期内。
示例性的给药方案是21天或28天的治疗周期或给予周期。在一些实施方案中，给药方案是28天的治疗周期或给予周期。在一些实施方案中，本文公开的NaPi2b靶向抗体-药物缀合物在第1天给予，接着20天没有给药或在第1天给予，接着27天没有给药。确定准确给予周期和给药方案在本领域技术人员的水平内。
在一些实施方案中，给予周期可以是任何所需的时间长度(例如，21天周期或28天周期给予可重复，持续任何时间长度)。例如，21天周期或28天周期给予可重复2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、12月、1.5年、2年、2.5年、3年或更久。
在一些实施方案中，表达NaPi2b的癌症包括例如，卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、乳头状肾细胞癌、唾液管癌、乳头状甲状腺癌、透明细胞肾癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌和胆管癌。
在一些实施方案中，表达NaPi2b的癌症包括例如，卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、乳头状肾细胞癌、唾液管癌和乳头状甲状腺癌。
在一些实施方案中，本公开内容涉及治疗有需要的受试者的卵巢癌或非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物在制备用于治疗有需要的受试者的卵巢癌或非小细胞肺癌(NSCLC)的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供本文公开的缀合物用于治疗有需要的受试者的卵巢癌或非小细胞肺癌(NSCLC)的用途。
在一些实施方案中，本公开内容提供缀合物，用于治疗有需要的受试者的卵巢癌或非小细胞肺癌(NSCLC)，包括给予所述受试者有效量的本文公开的缀合物。
在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，NSCLC被亚分型为腺癌。
在一些实施方案中，卵巢癌是耐铂卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。在一些实施方案中，卵巢癌是耐铂、高级浆液性卵巢癌。
在一些实施方案中，癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，癌症是乳头状肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症是唾液管癌。在一些实施方案中，癌症是乳头状甲状腺癌。
在一些实施方案中，受试者患有上皮卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、耐铂卵巢癌、非鳞状NSCLC癌症、进行性、放射性碘-难治性、局部复发性或转移性疾病乳头状甲状腺癌或上皮子宫内膜癌。
在一些实施方案中，患有上皮卵巢癌的受试者被亚分型为高级卵巢癌、低级浆液性卵巢癌或透明细胞卵巢癌。
在一些实施方案中，患有卵巢癌的受试者已接受用化学治疗剂，例如多西他赛、阿霉素、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、nab-紫杉醇、吉西他滨和顺铂；血管生成抑制剂，例如贝伐单抗(Avastin)；PARP抑制剂，例如niraparib(Zejula)、olaparib(Lynparza)和veliparib；olaparib(Lynparza)与贝伐单抗的组合；或其组合的在先治疗。
在一些实施方案中，患有卵巢癌的受试者已接收在先单药化疗，例如聚乙二醇化的脂质体阿霉素，用紫杉醇、拓扑替康、吉西他滨、PARP抑制剂等每周治疗。
在一些实施方案中，患有卵巢癌的受试者已接收不超过3线的在先治疗线，例如化学疗法组合，例如卡铂加紫杉醇、聚乙二醇化的脂质体阿霉素、用紫杉醇、多西他赛、拓扑替康、吉西他滨、PARP抑制剂等每周治疗。
在一些实施方案中，患有卵巢癌的受试者已接收不超过3线的在先治疗线，包括至少1线的含铂方案。在一些实施方案中，患有卵巢癌的受试者已接收不超过4线的在先治疗线，具有或没有至少1线的含铂方案。
在一些实施方案中，患有NSCLC癌症的受试者被亚分型为腺癌。在一些实施方案中，患有腺癌NSCLC癌症的受试者可能是转移性或复发性的。
在一些实施方案中，受试者患有NSCLC和已接受在先治疗，例如用基于铂的化学疗法(顺铂或卡铂)和PD-1或PD-L1单克隆抗体。在一些实施方案中，受试者患有NSCLC和已接受用卡铂/紫杉醇、abraxane nab-紫杉醇、多西他赛、培美曲塞、吉西他滨或多西他赛和雷莫芦单抗的组合的在先治疗。
在一些实施方案中，受试者患有NSCLC和已接受至多2个在先化学疗法线。
在一些实施方案中，受试者患有NSCLC和没有接受用细胞毒性剂的另外的在先治疗或没有接受免疫疗法。在另一个实施方案中，患有NSCLC的受试者已经记录为不耐性或疾病进展，具有已知的致癌突变，对其存在批准的疗法(例如ALK易位、EGFR突变或KRAS突变)。
在一些实施方案中，患有NSCLC癌症的受试者用NaPi2b抗体-药物缀合物和PD-1或PD-L1单克隆抗体，例如纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗或阿维鲁单抗治疗。
在一些实施方案中，患有NSCLC癌症的受试者用NaPi2b抗体-药物缀合物和PD-1或PD-L1单克隆抗体派姆单抗治疗。
在一些实施方案中，受试者用NaPi2b抗体-药物缀合物与以下组合治疗：PARP抑制剂，例如olaparib、niraparib、rucaparib、talazoparib等；PD1/PDL-1抑制剂，例如纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗等；化学疗法，例如卡铂、顺铂、奥沙利铂、doxil、环磷酰胺、吉西他滨、拓扑替康、培美曲赛等；VEGF抑制剂，例如贝伐单抗、雷莫芦单抗等；酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼、阿法替尼、厄洛替尼、达克替尼、奥希替尼、培唑帕尼等；ALK抑制剂，例如艾乐替尼、克唑替尼、色替尼、布加替尼等；或BRAF抑制剂，例如达拉非尼、曲美替尼等。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施方案中，受试者用NaPi2b抗体-药物缀合物与派姆单抗、卡铂、doxil、贝伐单抗或PARP抑制剂组合治疗。
在一些实施方案中，受试者患有乳头状甲状腺癌，其对在先激酶抑制剂疗法具有抵抗性或不耐性，或已经接受对于低级、激素受体-阳性子宫内膜样腺癌的在先治疗。
在一些实施方案中，子宫内膜癌不是基质肿瘤或癌肉瘤。在一些实施方案中，受试者患有子宫内膜癌和已接受用卡铂/紫杉醇或类似方案的在先治疗。
在一些实施方案中，受试者患有乳头状肾细胞癌或透明细胞肾癌，其以乳头状生长模式为主。在一个实施方案中，受试者具有唾液管癌在标准全身疗法后已经进展的组织学诊断。
在一些实施方案中，受试者对化学疗法难治，包括标准的前线化学治疗剂。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。在本说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文清楚另外指明。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不意图是限制性的。
在整个说明书中，在化合物、支架和组合物被描述为具有、包括或包含特定组分时，设想该组合物也基本上由所列举的组分组成，或者由所列举的组分组成。类似地，在方法或过程被描述为具有、包括或包含特定过程步骤时，该过程也基本上由所列举的过程步骤组成，或者由所列举的过程步骤组成。此外，应理解的是，步骤的顺序或者执行某些动作的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
本文描述的所有方法可以任何合适的次序进行，除非本文中另有指示或上下文另外明显矛盾。本文中提供的任何和所有的实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地例示本发明并且不应被解释为是对权利要求范围的限制，除非另外明确地声称。说明书中的语言都不应被解释为指示任何未要求保护的要素对于要求保护的内容是必需的。
合成方法
任何可用的技术可用于制备缀合物或其组合物，以及可用于制备它们的中间体和组分(例如，支架)。在一些实施方案中，可使用半合成和全合成方法。
产生本文公开的缀合物或支架的通用方法在下面的方案2和3中，以及在同时待审的US 15/819,650中说明，其公开内容以其整体结合到本文中。这些方案中的变量(例如，MP、MA、L3、WD、WM、LD和LP’等)具有与本文所述相同的定义，除非另外指明。
方案2
Figure GDA0004100926510001761
方案3
Figure GDA0004100926510001771
其中抗体是本公开内容的修饰的抗体。
本公开内容的合成方法可容许广泛变化的官能团；因此可使用各种替换的起始材料。该方法通常在总体方法结束时或接近总体方法结束时提供所需的最终化合物，但是在某些情况下可能需要进一步转化化合物为其药学上可接受的盐、酯或前药。
用于本公开内容的缀合物的药物化合物可使用市售可得的起始材料、文献中已知的化合物或从易于制备的中间体，通过使用本领域技术人员已知或技术人员根据本文的教导显而易见的标准合成方法和程序，以各种方式制备。用于制备有机分子的标准合成方法和程序以及官能团转换和操作可从相关的科学文献或从本领域的标准科教书获得。尽管不限于任何一个或几个来源，但经典科教书，例如Smith,M.B.,March,J.,March’s AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版,John Wiley&Sons:New York,2001；和Greene,T.W.,Wuts,P.G.M.,Protective Groups in OrganicSynthesis,第3版,John Wiley&Sons:New York,1999(以引用的方式并入本文)是本领域的技术人员已知的有用且公认的有机合成参考教科书。以下合成方法的描述打算用作例示而非限制用于制备本公开的化合物的一般程序。
本公开的缀合物和包含于其中的药物化合物可以通过本领域技术人员熟悉的各种方法进行制备。具有本文所描述的各化学式的本公开的缀合物或化合物可以根据下列程序，由市售可得的起始原料或使用文献程序可以制备的起始原料来制备。这些程序显示了本公开的代表性缀合物的制备。
一旦被生产出来，通过上述方法设计、选择和/或优化的缀合物就可以使用本领域技术人员已知的各种试验进行表征，以确定该缀合物是否具有生物活性。在一些实施方案中，可以通过常规的试验包括，但不限于如下文所描述的那些试验来表征该缀合物，以确定它们是否具有预期的活性、结合活性和/或结合特异性。
此外，高通量筛选可以用于加速使用此类试验的分析。用于进行高通量筛选的一般方法学描述于，例如Devlin(1998)High Throughput Screening,Marcel Dekker和美国专利号5,763,263中。高通量试验可以使用一种或多种不同的试验技术，包括但不限于下文描述的那些。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料通过引用以其整体结合。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不意图是限制性的。
实施例
以下工作实施例是接头、药物分子和抗体或抗体片段，及其制备方法的例示。这些不意欲进行限制，并且本领域技术人员将容易理解可利用其他试剂或方法。
缩写
下列缩写用于后续的反应方案和合成实施例。该列表并不意味着是本申请中所使用的缩写的全部清单，因为有机合成领域的技术人员容易理解的额外的标准缩写也可以用于合成方案和实施例。
缩写：
ACN 乙腈
AF 奥瑞他汀F
AF-HPA 奥瑞他汀F羟基丙基酰胺
ALP 碱性磷酸酶
ALT 丙氨酸氨基转移酶
AST 天冬氨酸氨基转移酶
aq 水性
CE 毛细管电泳
CR 完全消退
DAD 二极管阵列检测器
DAR 药物:抗体比
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙基胺
DMEM Dulbecco氏改良的Eagle培养基
DMF 二甲基甲酰胺
EDC 1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺
EDTA 乙二胺四乙酸
ELISA 酶联免疫吸附测定
Endo SH 内切糖苷酶SH
FBS 胎牛血清
Fuc 岩藻糖
GalNAcT 糖基转移酶
HIC 疏水相互作用色谱法
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HRP 辣根过氧化物酶
IV 静脉内
LC 液相色谱法
MS 质谱
MTV 中位肿瘤体积
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PBST 含有Tween的磷酸盐缓冲盐水
PR 部分消退
RBC 红细胞
RP-HPLC 反相高效液相色谱法
SDS 十二烷基硫酸钠
SEC 尺寸排阻色谱法
TBS Tris缓冲盐水
TFS 无瘤生存
TGI 肿瘤生长抑制
TCEP 三[2-羧基乙基]膦
TEAA 三乙基乙酸铵
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TMB 四甲基联苯胺
UDP 尿苷二磷酸
UF/DF 超滤/渗滤
WBC 白细胞
WCX 弱阳离子交换色谱法
一般信息
所有试剂购自相关的提供商，除非另外指明。
XMT-1535(抗NaPi2b抗体)公开于2017年3月13日提交的同时待审申请US 15/457,574，其整个内容通过引用并入本文。XMT-1519(抗Her2抗体)公开于2017年1月31日刊登的US 9,555,112和2017年8月22日刊登的US 9,738,720，其整个内容通过引用并入本文。
Endo SH如PCT申请WO 2017137459中所述制备，其整个内容通过引用并入本文。UDP-叠氮基糖和GalNAcT如US 9,988,662中所述制备，其整个内容通过引用并入本文。
肿瘤生长抑制(％TGI)定义为治疗和对照组之间的中位肿瘤体积(MTV)的百分比差异。在每个功效研究中测量肿瘤大小以确定肿瘤生长抑制(TGI)。
HPLC纯化在Phenomenex Gemini 5μm C18
Figure GDA0004100926510001811
250x10mm半制备型柱上进行。适用时，缀合物的药物含量通过分光光度法测定，否则进行RP-HPLC、LC/MS或1H-NMR以定量测定药物含量。
抗体-药物缀合物的蛋白质含量通过280nm分光光度法或通过ELISA测定。
抗体-药物缀合物、携带支架的药物或抗体支架按需要通过广泛渗滤、HIC或蛋白A纯化(即除去残留的未反应药物、未缀合抗体、酶或起始材料)。如果需要，通过SEC或HIC进行额外纯化以除去聚集的抗体-药物缀合物。一般而言，纯化的抗体-药物缀合物含有<5％(w/w)(例如，<2％(w/w))的聚集抗体-药物缀合物，如通过SEC测定；<0.5％(w/w)(例如，<0.1％(w/w))的游离(未缀合)药物，如通过RP-HPLC和/或LC-MS/MS测定；<1％(w/w)的游离药物缀合物，如通过SEC和/或RP-HPLC测定；和<2％(w/w)(例如，<1％(w/w))的未缀合抗体或抗体片段，如通过HIC-HPLC和/或RP-HPLC测定。还原或部分还原的抗体使用文献中描述的程序制备，参见例如Francisco等，Blood 102(4):1458-1465(2003)。总药物(缀合和未缀合)浓度通过RP-HPLC测定或从DAR反算，如通过CE-SDS测量的。
为了测定在生物样品中的游离AF-HPA药物的浓度、酸化样品用ACN处理。提取游离药物和分析ACN上清液。为了测定在非临床样品中缀合的AF-HPA的浓度，样品使用抗-IgG1抗体包被的磁珠进行免疫捕获，接着深度碱性水解。含有释放的AF-HPA药物的ACN上清液通过LC-MS/MS分析。在使用抗-IgG1抗体的免疫捕获后，在非临床样品中的总抗体浓度通过在胰蛋白酶消化后检测对于抗体独特的肽序列，通过LC-MS/MS测量。对于临床样品，可进行相同的程序，不同之处在于抗-独特型抗体用于免疫捕获以避免内源性抗体的干扰。
游离AF和AF-HPA的分析通过RP-HPLC使用C4柱、ACN梯度和UV检测进行。将峰面积整合，并与AF和AF-HPA标准比较。该方法对于在血浆和组织匀浆物中的AF和AF-HPA是定量的和在浓度范围0.1ng/mL至150ng/mL内是线性的。在用NaOH(aq)水解后释放的总药物(AF-HPA)在相同条件下测量，动态范围从1ng/mL至5,000ng/mL。总抗体标准范围是0.1μg/mL至100μg/mL。
抗体-药物缀合物的疏水性通过HIC-HPLC在配备有二极管阵列检测器(DAD)的Shimadzu Prominence HPLC系统上测定。TSK凝胶丁基-NPR柱(2.5μm粒径)保持在35℃用于这些分析。流动相A是1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠和pH 7.0，和流动相B是25mM磷酸钠、10％异丙基醇和pH 7.0。用0-100％线性梯度的流动相B经25分钟进行分离。流速是1mL/min。样品注射液范围是约10μg至100μg。
药物:抗体比(DAR)通过使抗体-药物缀合物进行深度碱性水解测定。释放的AF-HPA然后用RP-HPLC从标准曲线定量。测量的AF-HPA浓度与抗体含量相关联，以测定DAR。
实施例1：支架6的合成
Figure GDA0004100926510001831
步骤1.化合物3
Figure GDA0004100926510001841
化合物1(548mg，0.165mmol，如US 15/819,650所述制备，其整个内容通过引用并入本文)、水(14mL)、NMP(1.4mL)、EDC(158mg，0.824mmol)和HOAt(112mg、0.824mmol)在冰浴中搅拌，和用1N NaHCO3(aq)将pH调节至约6.5。加入化合物2(696mg，0.577mmol)，接着pH调节至约6.5。得到的混合物冷搅拌3h。加入另外的EDC、HOAt和化合物2(198mg，0.164mmol)和搅拌继续过夜。反应混合物在C18柱(275g)上用从10％至50％至90％v/v ACN/H2O(0.1％TFA)的ACN/H2O(0.1％TFA)逐步梯度纯化。所需的级分冻干，得到化合物3，为白色无定形固体(825mg，76％收率)。MS:2120.04(3+)，1590.27(4+)，1272.41(5+)。
步骤2.化合物4
Figure GDA0004100926510001851
在玻璃帕尔瓶中向化合物3(825mg、0.126mmol)、EtOH(90mL)和水(9.00mL)的混合物加入乙酸(0.288mL，5.04mmol)。通过混合物鼓泡氩气，接着加入Pd/C(134mg，0.126mmol)。将瓶连接至氢化装置，然后连续真空泵抽，填入氩气，然后填入氢(0.762mg，0.378mmol)至30psi，和将混合物剧烈搅拌过夜。反应混合物通过硅胶塞过滤，和浓缩成油。将油溶于ACN/H2O(0.1％TFA)和冻干，以获得化合物4，为白色无定形固体(790mg，100％收率)。MS：2094.65(3+)，1570.98(4+)，1257.18(5+)。
步骤3.化合物5
Figure GDA0004100926510001861
向化合物4(100mg，0.016mmol)溶于THF(1.5mL)和水(1.5mL)的冰冷溶液中加入甲酸(4.5mL，117mmol)。将溶液冷搅拌15分钟，然后在室温过夜。除去THF，和得到的混合物用水稀释，和在C18柱(150g)上使用ACN/H2O(0.1％TFA)作为流动相纯化。所需的级分冻干，得到化合物5，为白色无定形固体(71mg，72％收率)。MS:2060.97(3+)，1545.98(4+)，1236.99(5+)。
步骤4.支架6
Figure GDA0004100926510001871
向化合物5(71mg，0.011mmol)在DCM(5mL)和DMF(0.500mL)中的冰冷溶液加入((1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(5.02mg，0.017mmol)和DIPEA(0.018mL，0.103mmol)，最终pH约8-9。18h后，加入DMF(1.5mL)至反应混合物和将混合物在室温下搅拌2h，然后在制备型HPLC上使用ACN/H2O(0.1％AcOH)作为流动相浓缩和纯化。所需的级分冻干，得到支架6，为白色无定形固体(34mg，47％收率)。MS:2120.04(3+)，1590.27(4+)，1272.41(5+)。
实施例2：支架6的XMT-1535药物缀合物的合成(缀合物7，DAR6.0)
Figure GDA0004100926510001881
其中：■是GlcNAc；△是Fuc；和□是GalNAc。
步骤1.叠氮基修饰的XMT-1535抗体
按以下顺序向XMT-1535抗体(910.6mg，6.22μmole)/TBS pH 7.6加入：TBS(249μL，pH 7.6)、Endo SH(9.10mg，0.065μmole)、GalNAcT(77.9mg，1.69μmole)、UDP-叠氮基糖(144mg，227μmole)和MnCl2(76mg，604μmole)以实现最终抗体浓度15g/L。将反应物以30rpm在30℃搅拌过夜。粗制叠氮基修饰的XMT-1535抗体通过蛋白A色谱法和透析纯化以得到叠氮基修饰的XMT-1535抗体(880mg，97％收率)。
步骤2.支架6的XMT-1535药物缀合物(缀合物7，DAR 6.0)
将叠氮基修饰的XMT-1535抗体(300mg，2.05μmole)/PBS pH 7.4(5.5mL)和支架6(127.2mg，20.0μmole)在水中轻轻混合，然后在30℃放置20小时，没有摇动或震动。粗产物通过UF/DF和HIC纯化以得到缀合物7(132mg，44％收率)，其具有6.6的DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例3：支架6的XMT-1519缀合物的合成(缀合物8，DAR 7.3)
Figure GDA0004100926510001891
其中：■是GlcNAc；△是Fuc；和□是GalNAc。
缀合物8如实施例2所述合成，不同之处在于叠氮基-修饰的XMT-1519(400mg，2.78μmole)用于步骤2，代替叠氮基-修饰的XMT-1535抗体。纯化的缀合物8(163mg，41％收率)具有7.3的药物DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例4：支架6的曲妥珠单抗缀合物的合成(缀合物9，DAR 7.3)
Figure GDA0004100926510001901
其中：■是GlcNAc；Δ是Fuc；和□是GalNAc。
缀合物9如实施例2所述合成，不同之处在于叠氮基-修饰的曲妥珠单抗(35mg，0.239μmol)用于步骤2，代替叠氮基-修饰的XMT-1535抗体。纯化的缀合物9具有7.3的DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例5：支架6的利妥昔单抗缀合物的合成(缀合物10，DAR 6.8)
Figure GDA0004100926510001911
/>
其中：■是GlcNAc；△是Fuc；和□是GalNAc。
缀合物10如实施例2所述合成，不同之处在于叠氮基-修饰的利妥昔单抗(40mg，0.28μmole)用于步骤2，代替叠氮基-修饰的XMT-1535抗体。纯化的缀合物10具有6.8的药物DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例6：XMT-1535缀合物11的合成(DAR 6.5)
Figure GDA0004100926510001921
向XMT-1535(200mg，1.37μmol)在乙酸钠缓冲液(25mM，pH 5.5，21.1mL)中的溶液在+4℃加入TEAA(aq，50mM)和EDTA(1mM，pH 7.0，18.95mL)。使用NaHCO3(aq，1.0M)将得到的混合物的pH调节至pH 7.0，接着加入TCEP(1.37mg，4.77μmole)/TEAA(aq，50mM)和EDTA(1mM，pH 7.0)。90分钟后，使用乙酸(aq，1.0M)将反应混合物的pH调节至pH 6.0。加入支架6的马来酰亚胺基支架(79.8mg，12.3μmol，如US 15/819,650中所述制备，其整个内容通过引用并入本文)/TEAA(aq，50mM，9.5mL)和EDTA(1mM，pH 7.0)，和将得到的混合物在+4℃搅拌2小时。2小时后，通过加入L-半胱氨酸(8.28mg，68.3μmole)将反应淬灭。粗产物通过UF/DF和HIC纯化(75.2mg，38％收率)，得到随机缀合物11。纯化的缀合物11具有6.5的DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例7：XMT-1519缀合物12的合成(DAR 6.6)
Figure GDA0004100926510001931
缀合物12如实施例6所述合成，不同之处在于XMT-1519抗体(500mg，3.47μmole)用于替换XMT-1535抗体。纯化的随机缀合物12具有6.6的DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例8：曲妥珠单抗缀合物13的合成(DAR 6.4)
Figure GDA0004100926510001941
/>
缀合物13如实施例6所述合成，不同之处在于曲妥珠单抗(40mg，0.273μmole)用于替换XMT-1535抗体和在室温下进行还原。纯化的随机缀合物13具有6.4的DAR，如通过水解接着RP-HPLC测定。
实施例9：通过ELISA，NaPi2b抗体-药物缀合物结合至NaPi2b肽
通过与肽(1μg/mL，在PBS中)在+4℃孵育过夜，将人NaPi2b衍生的肽(QINVTVPSTANCTSPSLCWTDGIQNWTMKN)涂布到96孔板的每个孔的表面上。然后通过在室温下用BSA(3％，在PBS中，含有0.1％Tween 20(PBST))孵育1小时将孔封闭。一系列稀释度(0.017nM至1μM；3倍连续稀释，在3％BSA/PBS中)的测试物(XMT-1535、缀合物7或缀合物11)然后加入各孔，和将板在室温下孵育1小时，轻轻摇动。通过用PBST(3x)洗涤除去未结合的测试物。缀合至HRP的第二抗-人IgG(0.16μg/mL，在PBST中)在各孔中孵育1小时。通过用PBST(3x)洗涤除去未结合的第二抗体。HRP底物TMB加入至各孔和孵育直到显现蓝色。通过加入硫酸(0.2N，100μL)淬灭反应。在读板器上(Molecular Devices，Spectramax M5)测量450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism软件将各值作图。通过四参数曲线拟合测定EC50值。表I概述了结合值(EC50)。
表I
Figure GDA0004100926510001951
如表I所示，XMT-1535、缀合物7和缀合物11显示相当的EC50值。结果显示为对于缀合物7和缀合物11的三次重复实验的平均EC50值和标准偏差，和对于XMT-1535的两次重复实验的平均EC50值。
实施例9A：通过ELISA，NaPi2b抗体-药物缀合物结合至NaPi2b肽
NaPi2b抗体-药物缀合物结合至NaPi2b衍生的肽如实施例9所述进行，不同之处在于使用衍生自人([Cyc(12,18)]Ac-QINVTVPSTANCTSPSLCWTDGIQNWTMKN-酰胺)、食蟹猴([Cyc(12,18)]Ac-QMNVTVPSMANCTSPSLCWTDGIQIWTMKN-酰胺)、大鼠([Cyc(12,18)]Ac-EENVTVPSPDNCTSPSYCWTDGIQTWTIQN-酰胺)或小鼠([Cyc(12,18)]Ac-EMNVTVPSTDNCTSPSYCWTDGIQTWTIQN-酰胺)的NaPi2b衍生的肽。表IA概述了结合值(EC50)。
表IA
Figure GDA0004100926510001952
/>
Figure GDA0004100926510001961
如表IA所示，对于结合至来自人、食蟹猴、大鼠和小鼠的NaPi2b肽，XMT-1535、缀合物7和缀合物11显示相当的EC50值。结果显示为对于每种测试物的两次重复实验的平均EC50值。
实施例10：通过ELISA，Her2-靶向抗体-药物缀合物结合至重组HER2蛋白质
通过以1μg/mL在PBS中在+4℃孵育过夜，将重组人HER2(Acro Biosystems)包被到96孔板的各孔表面上。然后通过在室温下用PBST孵育1小时封闭孔。一系列稀释度(9.54×10-5nM至100nM，4倍连续稀释，在1％BSA/PBS中)的测试物(XMT-1519、缀合物8或缀合物12)然后加入至各孔和在室温下将板孵育1小时，轻轻摇动。未结合的测试物通过用PBST(3x)洗涤除去。缀合至HRP的第二抗-人IgG(0.16μg/ml，在PBST中)在各孔中孵育1小时。未结合的第二抗体通过用PBST(3x)洗涤除去。将HRP底物TMB加入各孔和孵育直到显现蓝色。通过加入硫酸(0.2N，100μL)淬灭反应。在读板器上(Molecular Devices，Spectramax M5)测量450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism软件将各值作图。通过四参数曲线拟合测定EC50值。表II概述了平均结合值(EC50)。
表II
测试物 平均HER2结合值EC<sub>50</sub>(nM)
XMT-1519 0.25
缀合物8 0.51
缀合物12 0.47
如表II所示，XMT-1519、缀合物8和缀合物12显示相当的EC50值。结果为对于每种测试物的2次重复实验的平均EC50值。
实施例11：抗体-药物缀合物与NaPi2b衍生的肽的结合亲和力
XMT-1535、缀合物7和缀合物11与固定的NaPi2b衍生的肽抗原的结合动力学通过Biolayer Interferometry(BLI；Octet；ForteBio)测定。对于XMT-1535、缀合物7和缀合物11的结合常数使用标准Octet程序(ForteBio)测定。在动力学缓冲液(10x)中将生物素化的NaPi2b衍生的肽(QINVTVPSTANCTSPSLCWTDGIQNWTMKN-生物素；Genscript)固定至链霉亲和素Octet传感器。传感器然后在动力学缓冲液(10x)中用生物胞素(50μg/mL)封闭。递增浓度的XMT-1535、缀合物7或缀合物11然后与固定的肽在动力学缓冲液(10x)中缔合。
表III概述了在25℃下对于XMT-1535、缀合物7和缀合物11与NaPi2b衍生的肽的Kd(平衡解离常数)、kon(缔合速率)和koff(解离速率)。
表III
Figure GDA0004100926510001971
如表III所示，XMT-1535、缀合物7和缀合物11对于其结合至NaPi2b衍生的肽显示相当的Kd值。结果显示为对于每种测试物的四次重复实验的平均值和标准偏差值。
实施例12：抗体-药物缀合物与Fc受体的结合亲和力
XMT-1535、缀合物7和缀合物11与Fc受体(FcRn、FcγRI、FcγRIIA(H167)和FcγRIIIA(V176)的结合动力学通过Biolayer Interferometry(BLI；ForteBio Octet QKe)在25℃测定。为了测试与Fcγ受体的结合，在动力学缓冲液(1x)中将XMT-1535、缀合物7和缀合物11稀释至1μg/mL和在抗-人Fab-CH1(FAB2G)生物传感器上捕获10分钟。所有稀释和基线测量在动力学缓冲液(1x)中进行。在每个捕获步骤之前61分钟和之后进行基线测量。与各种Fc受体的缔合测量以7个浓度(1μM至100nM，2倍连续稀释)进行5分钟。解离进行15分钟。结合常数用迹线的总拟合平均值使用1:1模型计算。对于XMT-1535、缀合物7和缀合物11与Fc受体的结合常数使用标准Octet程序(ForteBio)测定。动力学参数使用Octet软件(ForteBio)计算。
为了测试与FcRn受体的结合，XMT-1535、缀合物7和缀合物11与Fab-CH1(FAB2G)生物传感器的缔合如上所述进行。缔合后，传感器在FcRn结合缓冲液(Boston Bioproducts；稀释至100mM NaH2PO4、0.05％Tween 20、pH 6.0)中洗涤5分钟。缔合和解离步骤在FcRn结合缓冲液中进行。对FcRn蛋白质(Immunitrack)的缔合测量以7个浓度(从1μM至100nM，2倍连续稀释)测量5分钟。解离进行15分钟。结合常数用迹线的总拟合平均值使用1:1模型计算。
表IV-VII概述了对于每种测试物，对于人FcRn(表IV)、FcγRI(表V)、FcγRIIAH167(表VI)和FcγRIIIA V167(表VII)的Kd(平衡解离常数)、kon(缔合速率)和koff(解离速率)。
表IV
Figure GDA0004100926510001981
如表IV所示，XMT-1535、缀合物7和缀合物11显示相当的FcRn Kd值。结果显示为对于缀合物7和缀合物11的五次重复实验的平均值和标准偏差值，和对于XMT-1535抗体的两次重复实验的平均值。
表V
Figure GDA0004100926510001991
如表V所示，与缀合物11和XMT-1535相比，缀合物7显示较大的FcγRI Kd和较高的koff值。结果显示为对于缀合物7和XMT-1535的三次重复实验的平均值和标准偏差值，和对于缀合物11的两次重复实验的平均亲和力值。
表VI
Figure GDA0004100926510001992
如表VI所示，缀合物7没有结合至FcγRIIA，而缀合物11和XMT-1535对于结合至FcγRIIA具有类似的Kd。结果显示为对于缀合物7和XMT-1535的三次重复实验的平均值和标准偏差值，和对于缀合物11的两次重复实验的平均值。
表VII
Figure GDA0004100926510002001
如表VII所示，缀合物7没有结合至FcγRIIIA，而缀合物11和XMT-1535对于结合至FcγRIIIA具有相似的Kd。结果显示为对于每种测试物的两次重复实验的平均值。
实施例13：对于NaPi2b抗体-药物缀合物的细胞结合测定
XMT-1535、缀合物7和缀合物11与培养的OVCAR3人卵巢癌细胞的细胞表面结合使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)评价。在含有FBS(20％，ATCC)和1％青霉素/链霉素(1％)的RPMI-1640培养基(ATCC)中生长的OVCAR3细胞通过用Accutase细胞解离溶液(Innovative Cell Technologies)处理解离。将解离的细胞在培养基中研磨，和以密度50,000个细胞/培养基(75μL)置于96孔U底板中。用一系列浓度(1μM至0.5nM；3倍连续稀释)的测试物(XMT-1535、缀合物7或缀合物11)，总体积100μL含6％山羊血清的RPMI-1640，将细胞在冰上孵育3小时。细胞用冰冷的PBS(3x)洗涤，在每个洗涤步骤之间以1,000×RCF沉淀和在冰上重悬浮在含2％山羊血清(100μL)和第二荧光标记的抗体Alexa
Figure GDA0004100926510002002
647-标记的山羊抗-人IgG(5μg/mL，Life Technologies)的RPMI-1640中1小时。细胞用冰冷的PBS(3x)洗涤，和重悬浮在含1％多聚甲醛(100μL)的冰冷的PBS中。在流式细胞仪上对于每个处理通过分析5,000个细胞测定每细胞的荧光。对于每个处理的中位数荧光值作图，和EC50值用GraphpadPrism软件通过四参数曲线拟合计算。
表VIII概述了XMT-1535、缀合物7和缀合物11对于结合至OVCAR3细胞的细胞表面上的NaPi2b的EC50值。
表VIII
测试物 平均OVCAR3结合值EC<sub>50</sub>(nM)
XMT-1535 11.20
缀合物7 8.15
缀合物11 6.56
如表VIII所示，XMT-1535、缀合物7和缀合物11显示相当的EC50值。结果为对于每种测试物的两次重复实验的平均值。
实施例14：对于HER2抗体-药物缀合物的细胞结合测定
抗体-药物缀合物与JIMT-1细胞的细胞表面结合使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)评价。在含有FBS(10％，ATCC)的DMEM培养基(ATCC)中生长的JIMT-1细胞通过用Accutase细胞解离溶液(Innovative CellTechnologies，San Diego，CA)处理解离。解离的细胞在培养基中研磨，和以密度50,000个细胞在75μL培养基中置于96孔U底板中。用一系列浓度(1μM至0.5nM；3倍连续稀释)的测试物(XMT-1519、缀合物8、缀合物9、缀合物12或缀合物13)在含6％山羊血清(100μL)的DMEM中将细胞在冰上孵育3小时。细胞用冰冷的PBS洗涤三次，在每个洗涤步骤之间以1,000×RCF沉淀，和在冰上重悬浮于含2％山羊血清(100μL)和第二荧光标记的抗体Alexa
Figure GDA0004100926510002011
647-标记的山羊抗-人IgG(5μg/mL，Life Technologies)的DMEM中1小时。细胞用冰冷的PBS(3x)洗涤，和重悬浮于含1％多聚甲醛(100μL)的冰冷的PBS中。在流式细胞仪上对于每个处理通过分析5,000个细胞测定每细胞的荧光量。将对于每个处理的中位数荧光值作图，和EC50值用GraphpadPrism软件通过四参数曲线拟合计算。
表IX概述了抗体-药物缀合物和XMT-1519抗体对于结合至JIMT-1细胞的细胞表面上的HER2的EC50值。
表IX
测试物 平均JIMT-1结合值EC<sub>50</sub>(nM)
XMT-1519 0.71
缀合物8 0.77
缀合物9 0.11
缀合物12 0.59
缀合物13 0.14
如表IX所示，XMT-1519、缀合物8、缀合物9、缀合物12和缀合物13显示在窄范围内的EC50值。结果显示为对于XMT-1519、缀合物8和缀合物12的两次重复实验的平均值，和来自缀合物9和缀合物13的单次实验的EC50值。
实施例15：对于NaPi2b-抗体-药物缀合物的细胞毒性测定
在肿瘤细胞系OVCAR3中体外使用CellTiter-
Figure GDA0004100926510002021
(Promega Corp)评价缀合物7和缀合物11的抗增殖性质。细胞以5,000个细胞/孔的密度置于白色壁(体积)96孔板中，并允许在37℃在5％CO2的潮湿气氛中贴壁过夜。细胞用递增浓度的测试物(缀合物7或缀合物11或对照缀合物10)孵育。三天后，在室温下将CellTiter-/>
Figure GDA0004100926510002022
试剂加入至孔。10分钟后使用SpectraMax M5读板器(Molecular Devices)测量发光信号。剂量应答曲线使用GraphpadPrism软件产生。EC50值从四参数曲线拟合测定。表X概述了处理6天后缀合物7、缀合物11和对照缀合物10的EC50值。
表X
测试物 平均EC<sub>50</sub>(nM)
缀合物7 0.39
缀合物11 0.53
缀合物10 120.24
如表X所示，缀合物7和缀合物11显示相当的效力，而对照抗体-药物缀合物，缀合物10的效力是缀合物7和缀合物11的1/200。结果显示为对于每种测试物的两次重复实验的平均值。
实施例16：对于HER2-抗体-药物缀合物的细胞成活力测定
体外使用CellTiter-
Figure GDA0004100926510002031
(Promega Corp)，在肿瘤细胞系JIMT-1中评价缀合物8、缀合物10和缀合物12的抗增殖性质，和在肿瘤细胞系JIMT-1和SKBR3中评价缀合物9和缀合物13的抗增殖性质。细胞以5,000个细胞/孔的密度置于白色壁(体积)96孔板中，并允许在37℃在5％CO2的潮湿气氛中贴壁过夜。细胞与递增浓度的测试物(缀合物8、缀合物9、缀合物10、缀合物12或缀合物13)孵育。对于缀合物9和缀合物13，3天后，或对于缀合物8、缀合物12和对照抗体-药物缀合物，缀合物10，6天后，在室温下将CellTiter-/>
Figure GDA0004100926510002032
试剂加入孔。10分钟后使用SpectraMax M5读板器(MolecularDevices)测量发光信号。剂量应答曲线使用GraphpadPrism软件产生。EC50值从四参数曲线拟合测定。
表XI概述了处理6天后缀合物8、缀合物12和对照抗体-药物缀合物，缀合物10的EC50值。
表XI
测试物 JIMT-1EC<sub>50</sub>(nM) 标准偏差
缀合物8 3.18 1.08
缀合物12 4.12 1.27
缀合物10 128.75 90.56
如表XI所示，缀合物8和缀合物12显示相当的效力。缀合物8和缀合物12的效力均是对照抗体-药物缀合物，缀合物10的超过25倍。结果为对于每种测试物的三次重复实验的平均值。
表XII概述了处理3天后缀合物9和缀合物13的EC50值。
表XII
测试物 JIMT-1EC<sub>50</sub>(nM) SKBR3EC<sub>50</sub>(nM)
缀合物9 0.72 0.088
缀合物13 0.98 0.088
如表XII所示，缀合物9和缀合物13在JIMT-1和SKBR3细胞系中均显示相当的效力。结果为对于每种测试物的单次实验的值。
实施例17：在小鼠中在给予NaPi2b抗体-药物缀合物后的血浆暴露
雌性无胸腺裸鼠皮下接种OVCAR3细胞(每组n＝4)。缀合物7、缀合物11或溶媒以0.05mg/kg剂量的有效载荷作为单一剂量在第1天静脉内给药(每组平均肿瘤大小174-176mm3；范围126-257mm3)。在给药后10分钟、24小时、96小时、168小时、336小时和504小时收集血浆。血浆中缀合的AF-HPA浓度通过LC-MS/MS分析测定，如表XIII中概述。
表XIII
Figure GDA0004100926510002041
如表XIII所示，相对于缀合物11，缀合物7显示缀合的AF-HPA的更高的AUC和更短的t1/2以及更低的Clobs和Volss(分布体积)。Cmax和t1/2值对于缀合物7和缀合物11几乎等同。
实施例18：在小鼠中在给予NaPi2b抗体-药物缀合物后的组织分布
雌性无胸腺裸鼠皮下接种OVCAR3细胞。37只携带肿瘤的小鼠(平均肿瘤体积418.5mm3；范围204-698mm3)以0.05mg/kg有效载荷给予单一剂量的缀合物7。血浆、肿瘤组织、脾脏、肺、肝脏和肾脏在1、24、48、72、96、168、336、504(每组四只小鼠)和672小时(五只小鼠)后收获。此外，向四只携带肿瘤的小鼠(平均肿瘤体积653.7mm3；范围589-687mm3)给予溶媒对照并1小时后收获。将组织匀浆化，然后总药物浓度、游离AF-HPA和游离AF浓度通过LC-MS/MS分析测定；缀合的药物的浓度通过以下计算：[总药物–(游离AF-HPA+游离AF)]。组织分布的结果概述于表XIV。
表XIV
Figure GDA0004100926510002051
NC＝不可计算。BQL＝低于定量限。
实施例19：在大鼠中在给予NaPi2b抗体-药物缀合物后的血浆暴露
雌性Sprague-Dawley大鼠以剂量0.34mg/kg有效载荷(每组n＝4)经IV推注到尾静脉中接种缀合物7或缀合物11。在给药后10分钟、24小时、96小时、168小时、336小时和504小时收集血浆。在血浆中缀合的AF-HPA浓度通过LC-MS/MS分析测定，如概述于表XV。
表XV
Figure GDA0004100926510002052
如表XV所示，相对于缀合物11，缀合物7显示缀合的AF-HPA的更高的AUC inf、更低的Cmax、更短的t1/2、更低的Clobs和更低的Volss。
实施例20：在食蟹猴中在给予NaPi2b抗体-药物缀合物后的血浆暴露
雌性食蟹猴以1mg/kg抗体通过IV输注30分钟(每组n＝2)，静脉内注射缀合物7或缀合物11。在给药后1小时、8小时、24小时、48小时、96小时、168小时、240小时、288小时、336小时、456小时和504小时收集血浆。在血浆中缀合的AF-HPA浓度通过LC-MS/MS分析测定，如概述于表XVI。
表XVI
Figure GDA0004100926510002061
如表XVI所示，相对于缀合物11，缀合物7具有缀合的AF-HPA的更长的t1/2、更大的AUCinf和更低的Clobs和Volss。Cmax值对于两种缀合物几乎相等。
实施例21：在食蟹猴中在给予NaPi2b抗体-药物缀合物后的血浆暴露
食蟹猴(n＝3雄性；n＝3雌性)以1.86、3.72或5.60mg/kg抗体通过IV输注45分钟，静脉内注射缀合物7。给药前和给药后1小时、6小时、24小时、96小时、168小时、240小时、336小时和504小时收集血浆。血浆中缀合的AF-HPA浓度通过LC-MS/MS分析测定，如概述于表XVII。
表XVII
Figure GDA0004100926510002062
表XVII概述了缀合物7的清除率、半衰期和AUCinf。
实施例22：在OVCAR3中对于给予NaPi2b抗体-药物缀合物的肿瘤生长响应
雌性无胸腺裸鼠皮下接种OVCAR3细胞(每组n＝8)。缀合物7、缀合物11、对照缀合物10或溶媒作为单一剂量在第1天静脉内给药(每组平均肿瘤大小167-168mm3；范围85-297mm3)。在图7中指定的时间使用数字卡尺测量肿瘤大小。计算肿瘤体积并用于确定肿瘤生长的延迟。当肿瘤到达大小≥1500mm3时处死小鼠。对于每组，肿瘤体积报告为平均值±SEM。
图7提供在作为单一剂量在第1天IV给予0.025mg/kg、0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷的缀合物7、缀合物11或对照缀合物10，或溶媒后，在皮下接种OVCAR3细胞的小鼠中(每组n＝8)的肿瘤响应的结果。
在第33天，除了缀合物10之外，所有测试物导致60％或更大的肿瘤生长抑制(TGI)。缀合物10治疗导致43％的TGI。用0.1mg/kg和0.05mg/kg的缀合物7治疗和用0.1mg/kg的缀合物11治疗通过导致到第33天，组平均肿瘤体积低于100mm3和大多数肿瘤消退，证实最显著的功效。用0.1mg/kg的缀合物7治疗显示针对OVCAR3肿瘤的最大功效，如通过直到第102天(研究最后一天)的延长肿瘤生长抑制所证明的，包括3个肿瘤实现完全消退。随着研究进行，所有其它组经历肿瘤再次生长。
实施例23：在CTG-0852中对给予NaPi2b抗体-药物缀合物的肿瘤生长响应
无胸腺小鼠皮下接种CTG-0852肺腺癌细胞(每组n＝8)。缀合物7(0.025mg/kg、0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷)、对照缀合物10(0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷)或溶媒作为单一剂量在第1天静脉内给药(每组平均肿瘤大小150-300mm3；范围85-297mm3)。计算肿瘤体积并用于确定肿瘤生长延迟。当肿瘤到达大小≥1500mm3时处死小鼠。图8显示对于每组的肿瘤体积报告为平均值±SEM。
图8提供在作为单一剂量在第1天IV给予缀合物7(0.025mg/kg、0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷)、对照缀合物10(0.05mg/kg或0.1mg/kg有效载荷)或溶媒后，在皮下接种CTG-0852肺腺癌细胞的小鼠中(每组n＝8)对于肿瘤响应的结果。
缀合物7显示在所有剂量水平下的剂量依赖性、靶标依赖性肿瘤生长抑制(TGI)(图8)。在剂量0.1mg/kg有效载荷下，缀合物7显示118％的TGI，并且引起持续的肿瘤消退至第49天，之后平均肿瘤体积缓慢增加。0.05mg/kg有效载荷的缀合物7显示102％的TGI和引起肿瘤消退直到第28天，之后平均肿瘤体积增加。0.025mg/kg有效载荷的缀合物7引起肿瘤生长抑制(TGI＝77％)。0.1mg/kg有效载荷的剂量的缀合物10治疗导致28％的TGI，而0.05mg/kg有效载荷的剂量导致51％的TGI。
实施例24：对给予HER2抗体-药物缀合物的肿瘤生长响应
雌性CB.17SCID小鼠皮下接种JIMT-1细胞。缀合物8、缀合物9、缀合物12、缀合物13、缀合物10或溶媒作为单一剂量在第1天静脉内给药(肿瘤体积＝150-200mm3)。在图9和10中指定的时间使用数字卡尺测量肿瘤大小。计算肿瘤体积并用于确定肿瘤生长延迟。当肿瘤到达大小≥1000mm3时处死小鼠。对于每组，肿瘤体积报告为平均值±SEM。
图9提供在给予缀合物9或缀合物13的携带JIMT-1肿瘤的小鼠中(每组n＝10)对于肿瘤响应的结果。用缀合物9和缀合物13治疗的所有小鼠显示延长肿瘤生长抑制，并且用两种抗体-药物缀合物在测试的两个剂量(0.067mg/kg和0.199mg/kg有效载荷)下，没有肿瘤再次生长。
图10提供在作为单一剂量在第1天IV给予溶媒或0.017mg/kg、0.033mg/kg或0.067mg/kg有效载荷的缀合物8、缀合物12或对照缀合物10(每组n＝8)后，在皮下接种JIMT-1细胞的小鼠中(每组n＝8)对于肿瘤响应的结果。用0.033mg/kg和0.067mg/kg的缀合物8和0.067mg/kg的缀合物12治疗通过导致组平均肿瘤体积低于50mm3和大多数肿瘤到第19天消退，证实最显著的功效。用0.067mg/kg的缀合物8治疗显示针对JIMT-1的最大功效，如通过延长肿瘤生长抑制直到第109天(研究最后一天)所证明的，因为对于所有肿瘤显示消退。随着研究进行，所有其它组经历肿瘤再次生长。
实施例25：在大鼠中抗体-药物缀合物的毒性评价
抗体-药物缀合物的毒性在大鼠研究中评价。将基于有效载荷0.17mg/kg、0.34mg/kg或0.51mg/kg的抗NaPi2b抗体-药物缀合物(缀合物7或缀合物11)或抗HER2抗体-药物缀合物(缀合物8或缀合物12)，或溶媒给予雌性Sprague-Dawley大鼠的尾静脉(每组n＝5)。给药后8天，从每只动物采集血液用于血液学和毒理学分析。
图11-18显示基于从实施例18所述的研究计算的结果，在响应暴露于缀合物7或缀合物11时关键的毒理学参数的水平。相对于缀合物11，缀合物7显示关键毒理学参数AST、ALT、ALP、WBC、中性粒细胞、淋巴细胞、毒理学参数RBC和血红蛋白的较低的暴露依赖性水平。
图19-21显示基于从实施例18所述的研究计算的结果，在响应暴露于缀合物8或缀合物12时关键的毒理学参数的水平。相对于缀合物12，缀合物8显示关键毒理学参数AST、ALT和ALP的较低的暴露依赖性水平。
等同方案
在上文附带的详述中阐明了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管类似或等同于本文所述的那些的任何方法和材料可用于实践或测试本公开内容，现在描述了方法和材料。本公开内容的其它特征、目标和优势从详述和权利要求将显而易见。在说明书和所附权利要求中，单数形式包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本说明书中引用的所有专利和出版物均以引用方式并入。
上述描述仅出于说明的目的而呈现，并不旨在将本发明限制为所公开的精确形式，而是由所附权利要求限制。
序列表
<110> 梅尔莎纳医疗公司
<120> 具有含肽接头的位点特异性抗体-药物缀合物
<130> MRSN-029/001WO (322140-2414)
<150> US 62/958,916
<151> 2020-01-09
<150> US 63/040,735
<151> 2020-06-18
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Thr Ala Arg Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Leu
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
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Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Thr Ala Arg Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120
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<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Asn Ile His
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<213> 智人
<400> 6
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys Gln Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Glu Thr Ala Arg Ala Thr Phe Ala Tyr
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<213> 智人
<400> 8
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<213> 智人
<400> 9
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
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<213> 智人
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Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> DNA
<213> 智人
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caagttcagc tggttcagtc tggcgccgag gttgtgaaac ctggcgcctc tgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctacaaca tccactgggt caagcaggcc 120
cctggacagg gactcgaatg gatcggagcc atctatcccg gcaacggcga caccagctac 180
aagcagaagt tccggggcag agccacactg accgccgata caagcaccag caccgtgtac 240
atggaactga gcagcctgag aagcgaggac agcgccgtgt actattgcgc cagaggcgaa 300
acagccagag ccacctttgc ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt tagctct 357
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gatattcaga tgacacagag ccccagcagc ctgtctgcct ctgtgggaga cagagtgacc 60
atcacctgta gcgccagcca ggatatcggc aacttcctga actggtatca gcagaaaccc 120
ggcaagaccg tgaaggtgct gatctactac acctccagcc tgtacagcgg cgtgcccagc 180
agattttctg gcagcggctc tggcaccgac tacaccctga ccatatctag cctgcagcct 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaagc tgcccctgac atttggccag 300
ggcaccaagc tggaactgaa g 321
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<213> 智人
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Met Ala Pro Trp Pro Glu Leu Gly Asp Ala Gln Pro Asn Pro Asp Lys
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Tyr Leu Glu Gly Ala Ala Gly Gln Gln Pro Thr Ala Pro Asp Lys Ser
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Lys Trp Ser Glu Arg Asp Thr Lys Gly Lys Ile Leu Cys Phe Phe Gln
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Gly Ile Gly Arg Leu Ile Leu Leu Leu Gly Phe Leu Tyr Phe Phe Val
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Met Ala Gly Gln Phe Phe Ser Asn Ser Ser Ile Met Ser Asn Pro Leu
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Leu Gly Leu Val Ile Gly Val Leu Val Thr Val Leu Val Gln Ser Ser
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Thr Val Arg Ala Ala Ile Pro Ile Ile Met Gly Ala Asn Ile Gly Thr
180 185 190
Ser Ile Thr Asn Thr Ile Val Ala Leu Met Gln Val Gly Asp Arg Ser
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Trp Leu Ser Val Leu Val Leu Leu Pro Val Glu Val Ala Thr His Tyr
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Leu Glu Ile Ile Thr Gln Leu Ile Val Glu Ser Phe His Phe Lys Asn
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Gly Glu Asp Ala Pro Asp Leu Leu Lys Val Ile Thr Lys Pro Phe Thr
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Lys Leu Ile Val Gln Leu Asp Lys Lys Val Ile Ser Gln Ile Ala Met
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Asn Asp Glu Lys Ala Lys Asn Lys Ser Leu Val Lys Ile Trp Cys Lys
290 295 300
Thr Phe Thr Asn Lys Thr Gln Ile Asn Val Thr Val Pro Ser Thr Ala
305 310 315 320
Asn Cys Thr Ser Pro Ser Leu Cys Trp Thr Asp Gly Ile Gln Asn Trp
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Leu Ile Leu Ser Leu Leu Val Leu Cys Gly Cys Leu Ile Met Ile Val
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Lys Ile Leu Gly Ser Val Leu Lys Gly Gln Val Ala Thr Val Ile Lys
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Lys Thr Ile Asn Thr Asp Phe Pro Phe Pro Phe Ala Trp Leu Thr Gly
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Tyr Leu Ala Ile Leu Val Gly Ala Gly Met Thr Phe Ile Val Gln Ser
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Ser Ser Val Phe Thr Ser Ala Leu Thr Pro Leu Ile Gly Ile Gly Val
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Ile Thr Ile Glu Arg Ala Tyr Pro Leu Thr Leu Gly Ser Asn Ile Gly
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Thr Thr Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Ser Pro Gly Asn Ala
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Ser Gly Ile Leu Leu Trp Tyr Pro Ile Pro Phe Thr Arg Leu Pro Ile
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Arg Met Ala Lys Gly Leu Gly Asn Ile Ser Ala Lys Tyr Arg Trp Phe
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530 535 540
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Pro Val Val Phe Ile Ile Ile Leu Val Leu Cys Leu Arg Leu Leu Gln
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Ala Leu
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<213> 智人
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Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
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Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
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Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
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Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
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Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
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Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
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Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
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Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
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Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
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Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
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Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
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Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
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Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
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Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
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Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
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Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
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Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
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Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
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Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
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Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
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Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
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Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
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Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
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Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
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Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 19
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gly Gly His Gly Tyr Phe Asp Leu
1 5
<210> 23
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人
<400> 23
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtagta gtagtagtac catatactac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggcggtgt actactgcgc cagaggtgga 300
cacggatatt tcgacctatg ggggagaggt accttggtca ccgtctcctc a 351
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His His Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Gln Gln Tyr His His Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 30
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人
<400> 30
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtaccacc acagtcctct cacttttggc 300
ggagggacca aggttgagat caaa 324
<210> 31
<211> 630
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr
625 630

Claims (33)

1.抗体-药物缀合物，具有式(XXX)：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(XXX)，
其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE004
其中d13是2；并且所述抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团。
2.前述权利要求中任一项所述的缀合物，具有式(XXX)：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
(XXX)，
其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE007
/>
Figure DEST_PATH_IMAGE009
/>
Figure DEST_PATH_IMAGE011
/>
Figure DEST_PATH_IMAGE013
/>
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中d13是2；并且所述抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团。
3.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE017
。
4.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE019
。
5.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE021
。
6.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE023
。
7.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE025
。
8.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE027
。
9.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE029
。
10.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE031
。
11.前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中每个RA是
Figure DEST_PATH_IMAGE033
。
12.一种缀合物，具有下式：
Figure DEST_PATH_IMAGE035
其中
d13是2；
抗体是NaPi2b抗体，其包含：包含氨基酸序列GYTFTGYNIH (SEQ ID NO: 5)的CDRH1；包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYKQKFRG (SEQ ID NO: 6)的CDRH2；包含氨基酸序列GETARATFAY(SEQ ID NO: 7)的CDRH3；包含氨基酸序列SASQDIGNFLN (SEQ ID NO: 8)的CDRL1；包含氨基酸序列YTSSLYS (SEQ ID NO: 9)的CDRL2；和包含氨基酸序列QQYSKLPLT (SEQ ID NO:10)的CDRL3；
所述抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团；
Figure DEST_PATH_IMAGE037
是GlcNAc；/>
Figure DEST_PATH_IMAGE039
是Fuc；和/>
Figure DEST_PATH_IMAGE041
是GalNAc。
13. 权利要求12的缀合物，其中所述NaPi2b抗体包含SEQ ID NO: 1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 2的轻链氨基酸序列。
14.一种缀合物，具有下式
Figure DEST_PATH_IMAGE043
其中
d13是2；
抗体是NaPi2b抗体，其包含：包含氨基酸序列GYTFTGYNIH (SEQ ID NO: 5)的CDRH1；包含氨基酸序列AIYPGNGDTSYKQKFRG (SEQ ID NO: 6)的CDRH2；包含氨基酸序列GETARATFAY(SEQ ID NO: 7)的CDRH3；包含氨基酸序列SASQDIGNFLN (SEQ ID NO: 8)的CDRL1；包含氨基酸序列YTSSLYS (SEQ ID NO: 9)的CDRL2；和包含氨基酸序列QQYSKLPLT (SEQ ID NO:10)的CDRL3；
所述抗体包含在N297处与缀合物的剩余部分连接的一个或多个天冬酰胺基团；
Figure DEST_PATH_IMAGE045
是GlcNAc；/>
Figure DEST_PATH_IMAGE047
是Fuc；和/>
Figure DEST_PATH_IMAGE049
是GalNAc。
15. 权利要求14的缀合物，其中所述NaPi2b抗体包含SEQ ID NO: 1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO: 2的轻链氨基酸序列。
16. 一种用于制备抗体-药物缀合物的方法，包括使修饰的抗体与支架反应，所述支架选自表B中描述的支架，从而形成位点特异性抗体-药物缀合物，其中所述修饰的抗体通过以下步骤获得：使包含抗体和与抗体的位点N297连接的核心-GlcNAc部分的糖蛋白与内切糖苷酶Endo SH接触，从而形成包含末端GlcNAc部分的中间体抗体；和在β-(l,4)-GalNAcT酶的存在下使中间体抗体与4-AzGalNAc-UDP接触，从而形成包含修饰GlcNAc部分的修饰的抗体；其中步骤(a)和(b)同时进行。
17.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的缀合物和药学上可接受的载体。
18.前述权利要求中任一项的缀合物，用于治疗有需要的受试者的癌症，其中将有效量的缀合物给予所述受试者。
19.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括给予所述受试者有效量的前述权利要求中任一项的缀合物。
20.权利要求19的方法，其中所述癌症是表达NaPi2b的癌症，其选自卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、乳头状肾细胞癌、唾液管癌、乳头状甲状腺癌、透明细胞肾癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌和胆管癌。
21.权利要求20的方法，其中所述表达NaPi2b的癌症是卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫内膜癌、乳头状肾细胞癌、唾液管癌或乳头状甲状腺癌。
22.权利要求20的方法，其中所述表达NaPi2b的癌症是卵巢癌或非小细胞肺癌(NSCLC)。
23. 权利要求20的方法，其中在治疗第一天以及之后每三周或四周以约7 mg/m2至162mg/m2的剂量，将有效量的缀合物给予所述受试者。
24. 权利要求20的方法，其中所述剂量是约7 mg/m2至约162 mg/m2，例如7 mg/m2、14mg/m2、28 mg/m2、56 mg/m2、84 mg/m2、112 mg/m2、135 mg/m2或162 mg/m2。
25.权利要求20的方法，其中所述卵巢癌是耐铂卵巢癌。
26.权利要求20的方法，其中所述卵巢癌是高级浆液性卵巢癌。
27.权利要求20的方法，其中所述卵巢癌是耐铂、高级浆液性卵巢癌。
28.权利要求20的方法，其中所述卵巢癌已接受在先的单药化疗。
29.权利要求20的方法，其中患有卵巢癌的受试者已接受不超过3线的在先治疗线。
30.权利要求20的方法，其中患有卵巢癌的受试者已接受不超过3线的在先治疗线，其包括至少1线的含铂方案。
31.权利要求20的方法，其中患有卵巢癌的受试者已接受不超过4线的在先治疗线，其具有或没有至少1线的含铂方案。
32.权利要求20的方法，其中NSCLC被亚分型为腺癌。
33.权利要求20的方法，其中所述受试者患有NSCLC并且已接受用基于铂的化疗(顺铂或卡铂)和PD-1或PD-L1单克隆抗体的在先治疗。
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