CN116917323A

CN116917323A - 靶向b7h4的抗体-药物缀合物及其使用方法

Info

Publication number: CN116917323A
Application number: CN202280018212.5A
Authority: CN
Inventors: T·B·洛温格; C-N·钱; M·I·达梅林; D·托德
Original assignee: Mersana Therapeutics Inc
Current assignee: Mersana Therapeutics Inc
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-10-20

Abstract

本公开内容总体上涉及抗体‑药物缀合物，其包含特异性地结合可溶形式的或膜结合的(即，当在细胞表面上表达时)的人B7‑H4的单克隆抗体，以及使用这些缀合物作为治疗剂和/或诊断剂的方法。

Description

靶向B7H4的抗体-药物缀合物及其使用方法

相关申请

本申请要求2021年1月4日提交的美国临时申请号63/133,707和2021年4月9日提交的美国临时申请号63/172,968的优先权和权益。这些申请中的每一篇的内容特此通过引用整体并入。

序列表通过引用并入

创建于2022年1月3日并且大小为118KB的名为“MRSN-034_001WO_SeqList.txt”的文本文件的内容特此通过引用整体并入。

背景技术

B7-H4(也被称作B7-H4、B7x、B7S1、B7-S1和VTCN1)是一种I型跨膜蛋白并且是B7蛋白超家族的一个成员，其提供与T细胞受体抗原信号结合的辅助信号(co-signal)。B7-H4是T细胞功能的负调节剂，并且T细胞的连接会抑制其生长、细胞因子分泌和细胞毒性。小鼠体内的B7-H4的消除不会影响免疫细胞稳态，并且也不会出现自身免疫迹象。未知且未鉴定B7-H4的受体。

人B7-H4已经映射在1号染色体上，并且由跨度为66kb的6个外显子和5个内含子构成，其中外显子6用于选择性剪接以生成两种不同的转录物。它是一种282个氨基酸的蛋白(包括氨基端信号序列)，其中预计-227个氨基酸在氨基端信号序列切割以后位于细胞外空间中。B7-H4包含Ig-样V-结构域、Ig-样C结构域、跨膜结构域和短细胞质尾巴。

虽然健康组织中的B7-H4表达在蛋白水平上相对有限，但是B7-H4在几种实体瘤(诸如乳房、卵巢和子宫内膜的妇科癌)中始终过表达。B7-H4在肿瘤中的表达倾向于与不良预后相关。B7-H4的受体尚不清楚，但据信它在T细胞上表达。认为B7-H4直接抑制T细胞活性。

多种治疗方式可用于治疗晚期癌症，包括放射疗法、使用细胞毒性抗肿瘤剂的常规化学疗法、激素疗法(芳香酶抑制剂、黄体生成素释放激素类似物)、二膦酸盐和信号转导抑制剂。但是不幸的是，许多患者对这些治疗方式中的任一种要么应答不佳，要么根本没有应答。因此，需要鉴定靶向B7-H4的生物活性的新治疗剂。

因此，需要靶向B7-H4的生物活性的疗法。

发明内容

在一些方面，本公开内容提供了一种分离的特异性地结合B7-H4的抗体，所述抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ ID NO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。

在一些方面，所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变序列。在一些方面，所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。在一些方面，所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列的轻链可变序列。在一些方面，所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。

在一些方面，所述分离的抗体是单克隆抗体。在一些方面，所述分离的抗体是兔、小鼠、嵌合的、人源化的或全人的单克隆抗体。在一些方面，所述分离的抗体是IgG同种型。在一些方面，所述分离的抗体是IgG1同种型。

在一些方面，所述分离的抗体与特定分离的抗体竞争对人B7-H4的特异性结合，所述特定分离的抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。在一些方面，所述分离的抗体与特定分离的抗体竞争对人B7-H4的特异性结合，所述特定分离的抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变序列，或者所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。

在一些方面，本公开内容提供了一种B7-H4抗体-药物缀合物，其包含本公开内容的分离的抗体。

在一些方面，一个或多个接头-药物部分共价地连接至所述靶向部分，其中：每个接头-药物部分包含一个多功能接头，该接头通过每个药物单元的可释放组装单元的中间体将所述靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一种或多种治疗剂(D))，并将一个亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；所述可释放组装单元能够在所述靶向部分所靶向的靶位点附近释放游离药物；并且所述多功能接头包含在所述靶向部分和所述亲水基团之间的肽部分，其中所述肽部分包含至少两个氨基酸。

在一些方面，本公开内容提供了一种缀合物，其选自表A1和表A2中的缀合物中的任一种。

在一些方面，本公开内容提供了一种缀合物，其选自表B1和表B2中的缀合物中的任一种。

在一些方面，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用治疗有效量的本公开内容的缀合物。

在一些方面，本公开内容提供了一种缀合物，其用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症。

在一些方面，本公开内容提供了本公开内容的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病症。在一些方面，本公开内容提供了本公开内容的缀合物用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的用途。

在一些方面，本公开内容的任一个实施方案的方法、缀合物或用途，所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。

在一些方面，本公开内容的任一个实施方案的方法、缀合物或用途，所述疾病或病症是癌症。在一些方面，本公开内容的任一个实施方案的方法、缀合物或用途，所述癌症是B7-H4阳性的癌症。

在一些方面，本公开内容的任一个实施方案的方法、缀合物或用途，所述B7-H4阳性的癌症选自胆管癌、乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫癌、甲状腺癌、肾癌、头颈癌、胃癌、黑素瘤、胆管癌、胆管上皮癌(cholangial carcinoma)、胰腺癌、结肠癌和膀胱癌。

在一些方面，所述受试者是人。

在一些方面，本公开内容进一步包含将治疗剂施用给受试者。

附图说明

图1的图显示了抗体聚糖的不同糖型(G0、Gl、G2、G0F、GIF、G2F和M5)。

图2是显示在有内切糖苷酶存在下糖型G0、Gl、G2、G0F、GIF、G2F和M5的混合物的去糖基化的图解。

图3是显示用于制备叠氮基修饰的抗体的工艺的图解，其中在有糖基转移酶存在下使包含末端-GlcNAc部分的中间体抗体与叠氮基修饰的UDP-GalNAc衍生物分子反应。

图4是显示制备叠氮基修饰的抗体的工艺的一个实施方案的图解。

图5是显示制备抗体-药物缀合物的工艺的一个实施方案的图解，其中将叠氮基修饰的抗体缀合至包含应变环炔基基团的接头-药物部分。

图6的图显示了一种修饰的抗体。

图7的图显示了B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物的抗肿瘤效力：在MX-1TNBC异种移植物小鼠模型中的缀合物9-1(2.46/0.075或4.92/0.150mg/kg)、缀合物11(2.28/0.075或4.56/0.150mg/kg)、缀合物3(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)、缀合物6(2.30/0.075或4.61/0.150mg/kg)、缀合物7(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)和缀合物1-1(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。

图8的图显示了B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物的抗肿瘤效力：在MX-1TNBC异种移植物小鼠模型中的缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物10(14.37/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或0.75/0.050mg/kg)、缀合物1-2(5.37/0.177、2.33/0.077或1.79/0.059mg/kg)、缀合物2-1(13.45/0.150、4.60/0.050或2.30/0.025mg/kg)和XMT-1604B7-H4_2F9V18(13.80/0mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。

图9的图显示了B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物的抗肿瘤效力：在HBCx-19患者衍生出的异种移植物模型中的缀合物1-2(1.79/0.059或5.37/0.177mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物2-1(4.60/0.050或13.45/0.150mg/kg)和缀合物10(14.37/0.150mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。

图10的图显示了B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物的抗肿瘤效力：在HBCx-24患者衍生出的异种移植物模型中的缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物10(14.37/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或0.75/0.050mg/kg)、缀合物1-2(4.56/0.150、2.30/0.076或1.52/0.05mg/kg)、缀合物2-1(13.45/0.150、4.60/0.050或2.30/0.025mg/kg)和XMT-1604(13.80/0mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。

图11的图显示了B7-H4_2F9 STING激动剂药物缀合物的抗肿瘤效力：在MX-1异种移植物小鼠模型中的缀合物17(0.085/0.030或2.84/0.100mg/kg)、缀合物16(0.89/0.030或2.97/0.100mg/kg)、缀合物15(0.85/0.030或2.83/0.100mg/kg)和diABZI IV STING激动剂(5mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。

图12的图显示了在MX-1TNBC异种移植物模型中的B7-H4_2F9STING激动剂药物缀合物的抗肿瘤效力：缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或1.13/0.075mg/kg)、缀合物1-3(4.68/0.150或2.34/0.075mg/kg)和缀合物2-2(13.81/0.150或6.90/0.075mg/kg)(所有剂量都写作抗体/有效负载)。

图13显示了按中位最佳应答(MBR)排序的缀合物1-3的效力，并按TNBC和ER-阳性的乳癌患者衍生的异种移植物模型的未选择系列的受体状态进行划分。Y轴显示了通过每种模型实现的MBR，且X轴鉴定模型ID。

图14显示了通过TPS评分评价的来自实施例44的TNBC和ER-阳性的乳癌患者衍生的异种移植物模型的子集上的蛋白表达。

具体实施方式

本发明提供了呈可溶形式的或膜结合的(即，当在细胞表面上表达时)特异性地结合人B7-H4的单克隆抗体。本发明进一步提供了特异性地结合B7-H4的单克隆抗体。这些抗体在本文中共同地被称作“B7-H4”抗体。

定义

为本文描述的本公开内容的中间体化合物和/或化合物提供的化学名称可以指这样的化合物的互变异构表示中的任何一种(在一些情况下，这样的替代名称通过实验提供)。应当理解，对命名的化合物(本公开内容的中间体化合物或化合物)或用结构描绘的化合物(本公开内容的中间体化合物或化合物)的任何提及意图涵盖所有互变异构形式，包括这样的化合物的两性离子形式及其任何混合物。

应当理解，术语“在一些实施方案中”、“在本公开内容的一些实施方案中”和“在本公开内容的化合物的一些实施方案中”在适当的情况下可以互换使用。

当与数值结合使用时，术语“约”、“大约”或“接近”是指包括数值的集合或范围。在一些实施方案中，“约X”包括作为X的±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％、±0.5％、±0.2％或±0.1％的值的范围，其中X是数值。在一些实施方案中，术语“约”表示比指定值大或小5％的值的范围。在一些实施方案中，术语“约”表示比指定值大或小2％的值的范围。在一些实施方案中，术语“约”表示比指定值大或小1％的值的范围。

除非在本文中另外指出，值的范围的列举仅仅意图充当对落入所述范围内的每个单独值个别地提及的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。除非另外指出，否则在本文中使用的范围包括所述范围的两个极限。在一些实施方案中，表述“x是1至6之间的整数”和“x是1至6的整数”都是指“x是1、2、3、4、5或6”，即，术语“在X和Y之间”和“从X至Y的范围”包括X和Y以及在二者之间的整数。

如根据本公开内容使用的，除非另有说明，否则下面的术语应当理解为具有下述含义：

本文中使用的术语“抗-B7-H4抗体”、“B7-H4抗体”和“结合B7-H4的抗体”表示能够以足够的亲和力结合B7-H4的抗体，使得所述抗体可用作靶向B7-H4的诊断剂和/或治疗剂。

本文中使用的术语“B7-H4”表示由细胞中的B7-H4前体蛋白的加工产生的任何天然的、成熟的B7-H4。除非另外指出，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的B7-H4，所述脊椎动物包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语也包括B7-H4的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。

术语“B7-H4-阳性癌症”表示包含在其表面上表达B7-H4的细胞的癌症。在一些实施方案中，例如通过在诸如免疫组织化学、FACS等方法中使用针对B7-H4的抗体，确定B7-H4在细胞表面上的表达。

可替换地，B7-H4 mRNA表达被认为与细胞表面上的B7-H4表达相关，并且可以通过选自原位杂交和RT-PCR(包括定量RT-PCR)的方法来确定。

术语“B7-H4-阳性的细胞”表示在其表面上表达B7-H4的细胞。

本文中使用的术语“抗体”在最宽的含义上使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性。用于对抗体的氨基酸序列进行编号和鉴定互补决定区的多种方法是本领域已知的。例如，Kabat编号系统(参见Kabat,E.A.，等人,Sequences ofProtein of immunological interest，第五版,USDepartment of Health and HumanServices,US Government Printing Office(1991))或IMGT编号系统(参见国际ImMunoGeneTics/> 可在线得到:http://www.imgt.org/)。IMGT编号系统被常规使用并被认为是本领域中可靠且准确的系统，用于确定编码序列中的氨基酸位置、等位基因的比对，以及容易地对比免疫球蛋白(IG)和来自所有脊椎动物物种的T细胞受体(TR)中的序列。IMGT数据的准确性和一致性是基于IMGT-ONTOLOGY，这是第一个且迄今为止唯一的免疫遗传学和免疫信息学的本体(参见Lefranc.M.P.等人,Biomolecules,2014年12月；4(4),1102-1139)。IMGT工具和数据库针对从大型序列存储库构建的IMGT参考目录运行。在IMGT系统中，考虑外显子界定(只要适当)来划分IG V-结构域和IG C-结构域。因此，由于更多序列可用于IMGT数据库，本领域技术人员可以并且“使用”IMGT外显子编号系统来可靠地确定编码序列中的氨基酸位置并用于等位基因的比对。此外，IMGT唯一编号与其它编号(即，Kabat)之间的对应关系可在IMGT科学图表中找到(参见Lefranc.M.P.等人,Biomolecules,2014年12月；4(4),1102-1139)。

术语“抗体片段”表示除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分并且结合所述完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于：Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；直链抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。

本文中使用的术语“与参比抗体结合相同表位的抗体”表示在竞争测定中使参比抗体与它的抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，所述参比抗体在竞争测定中使所述抗体与它的抗原的结合阻断50％或更多。本文提供了一种示例性的竞争测定。

术语抗体的“类别”表示其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要的抗体类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG₄、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。

本文中使用的术语“单克隆抗体”表示得自基本上均质抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰词“单克隆的”指示从基本上同质的抗体群体中获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。

术语“裸抗体”表示未缀合至异源部分(例如，细胞毒性部分或STING激动剂药物部分)的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

术语“天然抗体”表示具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由二硫键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-端至C-端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称为可变重结构域或重链可变结构域，然后是三个恒定结构域(CHI、CH2和CH3)。类似地，从N-端至C-端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称为可变轻结构域或轻链可变结构域，然后是一个恒定轻结构域(CL)。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归入两种类型(称为κ和λ)中的一种。

“分离的抗体”是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所确定的。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。

术语“表位”表示在抗原分子上的被抗体结合的特定位点。

术语抗体的“人源化抗体”表示衍生自非人抗体(例如，鼠)的抗体，其保留或基本上保留所述亲本抗体的抗原结合性能，但在人类中具有更低免疫原性。本文中使用的人源化意图包括去免疫的抗体。

术语抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”表示已经经历人源化的抗体。

当在本文中在两种或更多种抗体的上下文中使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示，所述两种或更多种抗体竞争对B7-H4的结合，例如，竞争B7-H4结合。如果一种抗体与一种或多种其它抗体竞争25％或更多，则所述抗体“阻断”或“交叉阻断”一种或多种其它抗体与B7-H4的结合，其中25％-74％代表“部分阻断”并且75％-400％代表“完全阻断”。除非另外定义或被上下文否定，否则术语“与……竞争”、“与……交叉竞争”、“阻断”或“交叉阻断”当在本文中使用时也意在涵盖这样的抗体对。

本文中使用的“特异性地结合人B7-H4”的抗体意图表示以1x l0^-7 M或更小、更一般而言5x 10^-8M或更小、更一般而言3x 10^-8M或更小、更一般而言1x 10^-9M或更小、甚至更一般而言5x 10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4的抗体。

本文中使用的术语“基本上不结合”蛋白或细胞是指不结合或不以高亲和力结合所述蛋白或细胞，即以1x 10^-8M或更大、更优选1x 10^-5M或更大、更优选1x 10^-4M或更大、更优选1x 10^-3M或更大、甚至更优选1x 10^-2M或更大的K_D结合所述蛋白或细胞。

术语“细胞毒性剂”或“细胞毒性药物部分”表示主要通过直接干扰细胞的功能或者抑制或干扰细胞有丝分裂(cell myosis)而造成细胞死亡的化合物，包括但不限于烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、微管蛋白抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。

本文中使用的术语“STING激动剂”表示能够与STING相互作用的化合物或部分，例如，通过结合STING和/或诱导下游信号转导(例如，其特征在于与STING功能相关的分子的活化)。这包括STING、IRF3和/或NF-kB的直接磷酸化，并且还可能包括STAT6。在一些实施方案中，STING途径活化导致增加的1型干扰素(主要是IFN-a和IFN-b)的产生和/或干扰素刺激的基因的表达。

本文中使用的术语“STING激动剂药物部分”表示衍生自STING激动剂并且能够与STING相互作用的部分。在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是经修饰以允许所述部分连接至本公开内容的缀合物的其余部分的STING激动剂。

术语“糖”表示单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。术语“糖衍生物”表示单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的例子包括但不限于氨基糖和糖酸。糖衍生物的例子还包括被表示为S’(F’)_X1的化合物，其中S’是糖或糖衍生物，F’是官能团，且x₁指示官能团的数目。

本文中使用的术语“核心-GlcNAc部分”表示包含连接至抗体(例如，经由GlcNAc的C1位置)的GlcNAc(例如，核心-GlcNAc)的单糖、多糖或寡糖部分。在一些实施方案中，所述GlcNAc经由与抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子的N-糖苷键连接至所述抗体。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分存在于抗体的天然糖基化位点处或被引入到抗体上的不同位点上。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分是单糖(例如，所述核心-GlcNAc部分也是末端-GlcNAc部分)。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖，例如，所述核心-GlcNAc部分是二糖核心-GlcNAc-(α1-6-Fuc)部分(其可以被称作GlcNAc(Fuc))。因此，当抗体包含核心-GlcNAc部分时，所述抗体可以包含单糖或二糖核心-GlcNAc部分，并且所述核心-GlcNAc部分可以进一步包含岩藻糖(例如，二糖核心-GlcNAc(Fuc)部分)。如果所述核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖，则所述岩藻糖可以α-1,6连接至核心-GlcNAc部分的O-6。进一步包含岩藻糖的核心-GlcNAc部分可以被称作核心-GlcNAc(Fuc)。

术语“核心-GlcNAc”表示作为多糖或寡糖的一部分的内部GlcNAc，其中所述多糖或寡糖经由内部GlcNAc连接至抗体。

本文中使用的术语“末端-GlcNAc部分”表示包含连接至抗体的GlcNAc的部分，并且具有可用于进一步修饰(例如，用P”-S”-A”的化合物)的末端官能团。在一些实施方案中，所述末端-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。在一些实施方案中，通过使糖蛋白(例如，抗体聚糖)的核心-GlcNAc部分与内切糖苷酶反应而形成所述末端-GlcNAc部分。

术语“核苷酸”以其正常的科学含义使用，并表示由核碱基、一个五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)以及一个、两个或三个磷酸酯基团组成的分子。在没有磷酸酯基团的情况下，核碱基和糖组成核苷。因此，核苷酸也可以被称作核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。所述核碱基可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。

术语“蛋白”以其正常的科学含义使用，并包括包含约10个或更多个氨基酸的多肽。蛋白可以包含天然的或非天然的氨基酸。

术语“糖蛋白”在本文中以其正常的科学含义使用，并表示包含与蛋白共价键合的一个或多个单糖或寡糖链(“聚糖”)的蛋白。聚糖可以连接至蛋白上的羟基基团(O-连接的-聚糖)、蛋白上的酰胺官能团(N-糖蛋白)或蛋白上的碳(C-糖蛋白)。糖蛋白可以包含超过一种聚糖，可以包含一种或多种单糖和一种或多种寡糖聚糖的组合，并且可以包含N-连接的、O-连接的和C-连接的聚糖的组合。据估测，所有蛋白中的超过50％具有某种形式的糖基化，并因此有资格作为糖蛋白。

术语“聚糖”在本文中以其正常的科学含义使用，并表示连接至蛋白的单糖或寡糖链。因此，聚糖表示糖蛋白的碳水化合物部分。所述聚糖通过一个糖的C-1碳连接至蛋白，所述糖可以没有进一步取代(单糖)或者可以在其一个或多个羟基基团处进一步被取代(寡糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。但是，当较长的糖链连接至蛋白时，所述糖链也被认为是聚糖。糖蛋白的聚糖可以是单糖。聚糖也可以是寡糖。糖蛋白的寡糖链可以是直链的或支链的。在寡糖中，直接连接至蛋白的糖被称为核心糖。在寡糖中，不直接连接至蛋白而是连接到至少两个其它糖的糖被称为内部糖。在寡糖中，不直接连接至蛋白而是连接到单个其它糖(即在其一个或多个其它羟基基团处不携带其它糖取代基)的糖被称为末端糖。为了避免疑惑，在糖蛋白的寡糖中可以存在多个末端糖，但只有一个核心糖。聚糖可以是O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在脱连接的聚糖中，单糖或寡糖聚糖键合至蛋白的氨基酸中的C-原子。

术语“糖基转移酶”表示参与在糖蛋白和糖脂上存在的复合糖的合成的酶的超家族。

术语“N-乙酰基半乳糖氨基转移酶”(GalNAc-T)是催化N-乙酰基-D-半乳糖胺向蛋白的添加的N-乙酰基-D-半乳糖胺转移酶。

本文使用的术语“PEG单元”表示具有式的聚乙二醇亚基。在一些实施方案中，所述PEG单元包含多个PEG亚基。

本文中使用的术语“烷基”代表具有指定数目的碳原子的饱和直链或支链烃基。术语“C₁-C₆烷基”或“C_1-6烷基”表示甲基部分或包含2至6个碳原子的直链或支链烷基部分。

示例性的烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。

本文中使用的术语“卤代(烷基)”代表具有指定数目(n)的碳原子和一个或多个(至多2n+l个)卤素原子的饱和直链或支链烃基。“卤代(C_1-4烷基)”基团的例子包括但不限于-CF₃(三氟甲基)、-CCl₃(三氯甲基)、1,1-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基和六氟异丙基。

本文中使用的术语“烯基”表示具有指定数目的碳原子和至少1个且至多3个碳-碳双键的直链或支链烃基。例子包括乙烯基和丙烯基。

本文中使用的术语“炔基”表示具有指定数目的碳原子和至少1个且至多3个碳-碳三键的直链或支链烃基。例子包括乙炔基和丙炔基。

本文中使用的术语“烷氧基-”或“(烷基)氧基-”表示包含通过氧连接原子连接的具有指定数目的碳原子的烷基部分的“烷基-氧基-”基团。示例性的“C_1-4烷氧基-”或“(C_1-4烷基)氧基-”基团包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。

本文中使用的术语“卤代(烷氧基)-”代表通过氧连接原子连接的、具有指定数目(n)的碳原子和一个或多个(至多2n+l个)卤素原子的饱和直链或支链烃基。示例性的“卤代(C_1-4烷氧基)-”基团包括但不限于-OCHF₂(二氟甲氧基)、-OCF₃(三氟甲氧基)、-OCH₂CF₃(三氟乙氧基)和-OCH(CF₃)₂(六氟异丙氧基)。

本文中使用的术语“氨基”表示包含至少一个氮原子的取代基。具体地，-NH₂、-NH(C_1-4烷基)、烷基氨基或(C_1-4烷基)氨基-或(C_1-4烷基)(C_1-4烷基)氨基-或二烷基氨基、酰胺-、尿素-、脲和磺酰胺取代基被包括在术语“氨基”中。

本文中使用的术语“碳环基团或部分”表示其中环成员是碳原子的环状基团或部分，其可以是饱和的、部分不饱和的(非芳族的)或完全不饱和的(芳族的)。

本文中使用的术语“环烷基”表示在环中包含指定数目的碳原子的非芳族饱和烃环基团。例如，术语“C_3-6环烷基”表示具有三至六个环碳原子的环状基团。示例性的“C_3-6环烷基”基团包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

本文中使用的术语“芳基”表示具有芳香性的基团，包括具有一个或多个芳族环的“缀合”或多环系统，其在环结构中不含任何杂原子。术语芳基包括单价物质和二价物质。芳基基团的例子包括但不限于苯基、联苯基、萘基等。在一些实施方案中，芳基是苯基。

本文中使用的术语“杂环基团或部分”表示具有至少两种不同元素的原子作为环成员的环状基团或部分，所述环状基团或部分可以是饱和的、部分不饱和的(非芳族的)或完全不饱和的(芳族的)。

本文中使用的术语“杂原子”表示氮、硫或氧原子，例如氮原子或氧原子。

本文中使用的术语“杂环烷基”表示包含3-10个环原子并且包含一个或多个(通常一个或两个)独立地选自氧、硫和氮的杂原子环成员的非芳族、单环或二环基团。杂环烷基基团的连接点可以是任何合适的碳或氮原子。

本文中使用的术语“杂芳基”表示包含5至10个环原子(包括1至4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子)的芳族单环的或二环基团，其中所述基团的至少一部分是芳族的。例如，该术语涵盖二环杂环芳基基团，其包含与杂环部分稠合的苯基环或与碳环部分稠合的杂芳基环部分。杂芳基基团的连接点可以是通过任何合适的碳或氮原子。

本文中使用的术语“卤素”和“卤代”表示卤素残基，例如，氟、氯、溴或碘取代基。

本文中使用的术语“氧代”表示双键氧部分；例如，如果直接连接至碳原子则形成羰基部分(C＝O)。

本文中使用的术语“羟基”意指残基-OH。

本文中使用的术语“氰基”表示腈基-C≡N。

本文中使用的术语“任选地被取代”指示，基团(诸如烷基、环烷基、烷氧基、杂环烷基、芳基或杂芳基基团)或环或部分可以是未被取代的，或基团、环或部分可以被一个或多个取代基取代。在可以从许多替代基团中选择基团的情况下，所选择的基团可以相同或不同。合适的取代基可以包括例如烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷基碳酰氧基、芳基碳酰氧基、烷氧基碳酰氧基、芳氧基碳酰氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、磷酸根合(phosphonato)、次膦酸根合(phosphinato)、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代甲酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酸根合(sulfonato)、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或芳族或杂芳族部分。

本文中使用的术语“独立地”是指，当超过一个取代基选自许多可能的取代基时，那些取代基可以相同或不同。

本文中使用的术语“药学上可接受的”表示这样的化合物、缀合物、物质、组合物和剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，没有过度的毒性、刺激或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

本文中使用的术语“治疗”或“处理”描述了为了对抗疾病、病症或病症的目的而对患者的管理和护理，并且包括施用本公开内容的化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂化物，以减轻疾病、病症或病症的症状或并发症，或消除疾病、病症或病症。术语“治疗”还可以包括体外细胞或动物模型的处理。

本文中使用的术语“预防”、“阻止”或“保护免于”描述了减少或消除这样的疾病、病症或病症的症状或并发症的发作。

术语“受试者”表示已成为治疗、观察或实验的对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。

术语“治疗有效量”表示活性化合物或药学试剂(包括本公开内容的缀合物)的量，该量在组织系统、动物或人中引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师正在寻求的生物学或医学应答，其包括所治疗的疾病、综合症、病症或病症的症状的减轻或部分减轻。

治疗上“有效的量”意指，如本文中所定义的，当施用给需要这种治疗的患者时，足以有效治疗或预防的缀合物的量。将与这样的量对应的给定缀合物的量将根据诸如特定缀合物(例如，特定缀合物的效能(pIC50)、效力(EC₅₀)和生物半衰期)、疾病状况和它的严重程度、需要治疗的患者的身份(例如，年龄、大小和重量)等因素而变化，但仍然可以由本领域技术人员常规地确定。同样，所述缀合物的治疗持续时间和施用的时间段(剂量之间的时间段和剂量的时机，例如，饭前/随饭/饭后)将根据需要治疗的哺乳动物的身份(例如，重量)、特定缀合物及其性质(例如，药代动力学性质)、疾病或病症及其严重程度以及所使用的具体组合物和方法而变化，但仍然可以由本领域技术人员确定。

术语“组合物”表示包括治疗有效量的特定成分的产品，以及由特定量的特定成分的组合直接地或间接地产生的任何产品。

本文中使用的术语“药学上可接受的赋形剂”是指可用于制备药物组合物的赋形剂，所述药物组合物通常是安全的、无毒的并且在生物学上或其它方面都不是不希望的，并且包括对于兽医学应用以及人药物应用而言可接受的赋形剂。如在本说明书和权利要求书中使用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和超过一种这样的赋形剂。

在一些实施方案中，本公开内容的缀合物或其对映异构体、非对映异构体、溶剂化物或药学上可接受的盐形式可用于治疗或改善疾病、综合征、病症或病症诸如黑素瘤、结肠癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、纤维肉瘤和乙型肝炎。

本文中使用的术语“本公开内容的缀合物”是指任何形式的如本文所定义的缀合物，即，任何互变异构形式、任何异构形式、任何盐或非盐形式(例如，作为游离酸或碱形式，或作为盐，特别是其药学上可接受的盐)及其任何物理形式(例如，包括非固体形式(例如，液体或半固体形式)和固体形式(例如，无定形或结晶形式、特定多晶型形式、溶剂化物形式，包括水合物形式(例如，一水合物、二水合物和半水合物))以及各种形式的混合物。

因此，在本公开内容中包括本文公开的缀合物，其呈任何盐或非盐形式及其任何物理形式，以及各种形式的混合物。虽然这些都被包括在本公开内容内，但是应当理解，呈任何盐或非盐形式以及呈其任何物理形式的本公开内容的缀合物为了配制目的可以具有不同水平的活性、不同的生物利用度和不同的处理性能。

本文中使用的表述“A、B或C中的一个或多个”、“一个或多个A、B或C”、“A、B和C中的一个或多个”、“一个或多个A、B和C”、“选自由以下成员组成的集合：A、B和C”、“选自A、B和C”等互换使用，并且都表示由A、B和/或C组成的集合中的一个选项，即，一个或多个A、一个或多个B、一个或多个C或它们的任何组合，除非另外指出。

应当理解，贯穿本说明书，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，考虑到，组合物也基本上由所列举的组分组成或由所列举的组分组成。类似地，在方法或过程被描述为具有、包括或包含特定过程步骤的情况下，所述过程也基本上由列举的加工步骤组成或者由列举的加工步骤组成。此外，应当理解，步骤的次序或执行某些动作的次序并不重要，只要本发明保持可工作即可。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

除非另有说明，否则本文中使用的所有百分比和比率均按重量计。本公开内容的其它特征和优点从不同的实施例中显而易见。所提供的实施例解释了可用于实践本公开内容的不同组分和方法。所述实施例不限制要求保护的公开内容。基于本公开内容，熟练的技术人员可以识别和采用对于实践本公开内容有用的其它组分和方法。

本文中引用的所有出版物和专利文献通过引用并入本文，如同明确地且单独地指出每篇这样的出版物或文件通过引用并入本文。出版物和专利文献的引用无意承认任一篇是有关的现有技术，也不构成关于其内容或日期的任何承认。现在已经通过书面描述描述了本发明，本领域技术人员会认识到，本发明可以以多种实施方案实践，并且前述描述和下面的实施例用于举例说明且不是限制随后的权利要求的目的。

当在本文中在两种或更多种抗体的上下文中使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”指示，所述两种或更多种抗体竞争对B7-H4的结合，例如，在实施例5或8所描述的测定中竞争B7-H4结合。如果一种抗体与一种或多种其它抗体竞争25％或更多，则所述抗体“阻断”或“交叉阻断”一种或多种其它抗体与B7-H4的结合，其中25％-74％代表“部分阻断”并且75％-400％代表“完全阻断”，优选地使用实施例5和8的测定来确定。对于某些抗体对，仅当将一种抗体包被在平板上并且将另一种抗体用于竞争时才观察到实施例5或8的测定中的竞争或阻断，并且反之则不然。除非另外定义或被上下文否定，否则术语“与……竞争”、“与……交叉竞争”、“阻断”或“交叉阻断”当在本文中使用时也意在涵盖这样的抗体对。

抗体-药物缀合物和支架

在一些方面，本公开内容提供了一种B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述B7-H4抗体-药物缀合物具有位点特异性。在一些实施方案中，所述B7-H4抗体-药物缀合物没有位点特异性。在一些实施方案中，所述B7-H4抗体-药物缀合物是可生物降解的和生物相容的，和/或表现出高药物载荷和与靶抗原的强结合。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种B7-H4抗体-药物缀合物，其包含B7-H4靶向部分(例如，抗体)和一个或多个接头-药物部分，其中所述靶向部分共价地连接至所述一个或多个接头-药物部分。

在一些实施方案中，所述B7-H4靶向部分是抗体、半胱氨酸工程改造的抗体或经修饰的抗体。

在一些实施方案中，所述B7-H4靶向部分是B7-H4抗体、半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体或经修饰的B7-H4抗体。

在一些实施方案中，所述B7-H4靶向部分是B7-H4抗体。

在一些实施方案中，所述B7-H4靶向部分是半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体。

在一些实施方案中，所述B7-H4靶向部分是经修饰的B7-H4抗体。

在一些方面，本公开内容提供了一种B7-H4抗体-药物缀合物，其包含B7-H4靶向部分(例如，抗体)和共价地连接至所述靶向部分的一个或多个接头-药物部分，其中：

每个接头-药物部分包含一个多功能接头，该接头通过每个药物单元的可释放组装单元的中间体将所述靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一种或多种治疗剂(D))，并将一个亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；

所述可释放组装单元能够在所述靶向部分所靶向的靶位点附近释放游离药物；且

所述多功能接头包含在所述靶向部分和所述亲水基团之间的肽部分，其中所述肽部分包含至少两个氨基酸。

每个接头-药物部分包含一个多功能接头，该接头通过每个药物单元的可释放组装单元的中间体将所述B7-H4靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一种或多种治疗剂(D))，并将一个亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；且

所述可释放组装单元能够在所述靶向部分所靶向的靶位点附近释放游离药物。

在一些方面，本公开内容提供了式(I’)的B7-H4抗体-药物缀合物：

其中

a₂是1至3的整数；

a₃是0至1的整数；

a₄是1至约5的整数；

a₅是1至3的整数；

d₁₃是1至约12的整数；

抗体是B7-H4抗体、半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体或经修饰的B7-H4抗体；

L^P’是将经修饰的抗体连接至M^P的二价接头部分；其对应的单价部分L^P包含能够与所述抗体的反应性部分形成共价键的官能团W^P；

M^P是延伸单元；

L^M是键或三价或四价接头，且当L^M是键时，a₂是1，当L^M是三价接头时，a₂是2，或当L^M是四价接头时，a₂是3；

L³当存在时是含羰基的部分；

M^A包含含有至少两个氨基酸的肽部分；

T¹包含亲水基团且在T¹和M^A之间的表示T¹和M^A的直接或间接连接；

D的每次出现独立地是具有≤约5kDa的分子量的治疗剂；且

L^D的每次出现独立地是将D连接至M^A的二价接头部分并包含至少一个可切割的键，使得当所述键断裂时，D以活性形式释放以实现其预期的治疗效果。

在一些实施方案中，D是细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分。

在一些实施方案中，D是细胞毒性药物部分。

在一些实施方案中，D是STING激动剂药物部分。

在一些实施方案中，所述抗体-药物缀合物具有式(II’)或(III’)：

在一些方面，本公开内容提供了一种B7-H4抗体支架，其包含B7-H4靶向部分(例如，抗体)和共价地连接至所述B7-H4靶向部分的一个或多个接头部分。

在一些实施方案中，本公开内容提供了式(II)-(V)中的任一个的B7-H4抗体支架：

其中：

a₂是1至3的整数；

a₃当存在时是0至1的整数；

a₄是1至约5的整数；

a₅是1至3的整数；

d₁₃是1至约12的整数；

L^P’是将所述抗体连接至M^P的二价接头部分；其对应的单价部分L^P包含能够与所述抗体的官能团形成共价键的官能团W^P；

M^P是延伸单元；

L^M当存在时是键或三价或四价接头，且当L^M是键时，a₂是1，当L^M是三价接头时，a₂是2，或当L^M是四价接头时，a₂是3；

L³当存在时是含羰基的部分；

M^A包含含有至少两个氨基酸的肽部分；

T¹包含亲水基团且在T¹和M^A之间的表示T¹和M^A的直接或间接连接；当存在时，W^D的每次出现独立地是这样的官能团：其能够与具有≤约5kDa的分子量的治疗剂(“D”)的官能团形成共价键；且

L^D的每次出现独立地是将W^D或D连接至M^A的二价接头部分，且L^D包含至少一个可切割的键，使得当所述键断裂时，D以活性形式释放以实现其预期的治疗效果。

本公开内容的缀合物和支架可以包括下述特征中的一个或多个(当适用时)。在一些实施方案中，d₁₃是2至12、2至10、2至8、2至6、2至4、1至2、4至10、4至8、4至6、6至12、6至10、6至8、8至14、8至12，或8至10的整数。

在一些实施方案中，d₁₃是在1至2范围内的整数(例如，d₁₃是1或2)。在一些实施方案中，d₁₃是在2至4范围内的整数(例如，d₁₃是2、3或4)。在一些实施方案中，d₁₃是在4至6范围内的整数(例如，d₁₃是4、5或6)。在一些实施方案中，d₁₃是在6至8范围内的整数(例如，d₁₃是6、7或8)。在一些实施方案中，d₁₃是在6至10范围内的整数(例如，d₁₃是6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，d₁₃是6。在一些实施方案中，d₁₃是7。

在一些实施方案中，d₁₃是8。在一些实施方案中，d₁₃是1或2。在一些实施方案中，d₁₃是1。在一些实施方案中，d₁₃是2。

在一些实施方案中，L³不存在。

在一些实施方案中，每个L³当存在时独立地是*-C_1-12烷基-C(O)-**、*-NH-C_1-12烷基-C(O)-**或*-C_1-12烷基-C(O)-NH-C_1-12烷基-C(O)-**，其中*指示与另一个L³(当存在时)或与L^M的连接；且**指示与另一个L³(当存在时)或与M^A的连接。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-CH₂CH₂-C(O)-**或是*-NH-CH₂CH₂-C(O)-**，其中*指示与另一个L³(当存在时)或与L^M的连接；且**指示与另一个L³(当存在时)或与M^A的连接。

在一些实施方案中，a₃是2或更大，至少一个L³是*-C_1-12烷基-C(O)-**，且至少一个L³是*-NH-C_1-12烷基-C(O)-**。

在一些实施方案中，每个L³是*-CH₂CH₂-C(O)-NH-CH₂CH₂-C(O)-**或*NH-CH₂CH₂-C(O)-CH₂CH₂-C(O)-**，其中*指示与L^M的连接；且**指示与M^A的连接。

在一些实施方案中，a₄是1。在一些实施方案中，a₄是2。在一些实施方案中，a₄是3。

用于缀合至B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的可变的L^P和L^P’

在一些实施方案中，L^P’是二价接头部分。在一些实施方案中，L^P’是将B7-H4抗体的半胱氨酸或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体连接至M^P的二价接头部分。在一些实施方案中，L^P’是将B7-H4抗体的半胱氨酸连接至M^P的二价接头部分。在一些实施方案中，L^P’是将半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体连接至M^P的二价接头部分。

在一些实施方案中，L^P是对应的单价部分。在一些实施方案中，L^P是L^P’当未连接至B7-H4抗体的半胱氨酸或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的半胱氨酸时对应的单价部分。在一些实施方案中，L^P是L^P’当未连接至B7-H4抗体的半胱氨酸时对应的单价部分。在一些实施方案中，L^P是L^P’当未连接至半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的半胱氨酸时对应的单价部分。

在一些实施方案中，当未连接至B7-H4抗体的半胱氨酸或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的半胱氨酸时，每个L^P包含末端基团W^P。

在一些实施方案中，L^P包含末端基团W^P，其中每个W^P独立地是：

其中

环B是环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基；

R^1K是离去基团；

R^1A是硫保护基团；

R^2J是氢、脂族、芳基、杂脂族或碳环部分；且

R^3J是C_1-6烷基且Z₁、Z₂、Z₃和Z₇中的每一个独立地是碳或氮原子。

在一些实施方案中，每个R^1K是卤素或RC(O)O-，其中R是氢、脂族、杂脂族、碳环或杂环烷基部分。

在一些实施方案中，每个R^1A独立地是其中r是1或2且R^s1、R^s2和R^s3中的每一个独立地是氢、脂族、杂脂族、碳环或杂环烷基部分。/>

在一些实施方案中，W^P是在一些实施方案中，W^P是/>

在一些实施方案中，当W^P是时，其中L^P’包含/>

用于缀合至经修饰的B7-H4抗体的可变的L^P和L^P’

在一些实施方案中，通过L^P的官能团(例如，W^P)和经修饰的抗体的反应性部分(例如，*-GlcNAc-S”-A”的经修饰的-GlcNAc部分)之间的反应而形成L^P’。

在一些实施方案中，L^P’包含在L^P的官能团(例如，W^P)和经修饰的抗体的反应性部分(例如，*-GlcNAc-S”-A”的经修饰的-GlcNAc部分)之间形成的三唑基。

在一些实施方案中，当未连接至经修饰的B7-H4抗体时，每个L^P包含末端基团W^P。

在一些实施方案中，至少一个W^P是

其中

R^8j是氢、卤素、C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)，

其中所述C_1-24烷基任选地被一个或多个O、N或S中断，且其中所述C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)任选地被一个或多个C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、C₃-C₁₂环烷基、-O(C₁-C₁₂烷基)、-O(C₂-C₁₂烯基)、-O(C₂-C₁₂炔基)、-O(C₃-C₁₂环烷基)、卤素、氨基、氧代或甲硅烷基取代，

其中所述C₁-C₁₂烷基、C₂-C₁₂烯基、C₂-C₁₂炔基、C₃-C₁₂环烷基、-O(C₁-C₁₂烷基)、-O(C₂-C₁₂烯基)、-O(C₂-C₁₂炔基)、-O(C₃-C₁₂环烷基)任选地被取代，且其中所述C₁-C₁₂烷基、C₃-C₁₂环烷基、-O(C₁-C₁₂烷基)或-O(C₃-C₁₂环烷基)任选地被一个或多个O、N或S中断；

R^10j是氢、卤素、C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)，

其中所述C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)是任选地被取代的；

每个R^11j独立地是氢、C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)；

每个R^12j独立地是卤素、-OR^10j、-NO₂、-CN、-S(O)₂R^10j、C_1-24烷基(例如，C_1-6烷基)、C_6-24环烷基、6-24元杂环烷基、C_6-24芳基、6-24元杂芳基、-(C_1-24烷基)-(C_6-24环烷基)、-(C_1-24烷基)-(6-24元杂环烷基)、-(C_1-24烷基)-(C_6-24芳基)或-(C_1-24烷基)-(6-24元杂芳基)；且

u₂是在0至8范围内的整数。

在一些实施方案中，至少一个W^P是

在一些实施方案中，每个R^11j是氢。在一些实施方案中，u₂是0。在一些实施方案中，R^8j是氢。

在一些实施方案中，至少一个W^P是/>

在一些实施方案中，至少一个W^P是

在一些实施方案中，至少一个R^12j是吸电子基团(例如，Hammett取代基常数σ为正值的基团)。在一些实施方案中，合适的吸电子基团是本领域已知的。

在一些实施方案中，至少一个R^12j是卤素(例如，F或Cl)、-OR^10j、-NO₂、-CN、-S(O)₂R^7j、被取代的C₁-C₁₂烷基或被取代的C₆-C₁₂芳基，其中所述取代基中的至少一个是吸电子基团。在一些实施方案中，至少一个R^12j是氟代的C₁-C₁₂烷基(例如，-CF₃)、氟代的C₅-C₁₂芳基(例如，-C₆F₅)或卤代烷基化的C₅-C₁₂芳基(例如，-[3,5-(CF₃)₂(C₆H₃)])。

在一些实施方案中，至少一个W^P是

在一些实施方案中，至少一个W^P是或/>

在一些实施方案中，每个R^11j是氢。在一些实施方案中，u₂是0。

在一些实施方案中，至少一个W^P是

在一些实施方案中，每个W^P当存在时独立地是：(a)或(b)

在一些实施方案中，每个W^P是

在一些实施方案中，当连接至B7-H4修饰的抗体时，每个L^P’包含连接基团W^P’。

在一些实施方案中，至少一个W^P’是

/>

在一些实施方案中，至少一个W^P’是

延伸单元M^p

在一些实施方案中，M^P是(1)

/>

其中*表示与L^P’或L^P的连接且**表示与L^M或M^A的连接；

每个R₆₆独立地是NH或O；

每个R₃独立地是-C(O)-NR₅-或-NR₅-C(O)-；

每个R₅独立地是氢、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_3-8环烷基、COOH或COO-C_1-6烷基；

R₄是键或-NR₅-(CR₂₀R₂₁)-C(O)-；

每个R₂₀和R₂₁独立地是氢、C_1-6烷基、C_6-10芳基、羟基化的C_6-10芳基、多羟基化的C_6-10芳基、5至12元杂环、C_3-8环烷基、羟基化的C_3-8环烷基、多羟基化的C_3-8环烷基或天然的或非天然的氨基酸的侧链；

每个R⁷独立地是-O-、-NR⁸、-(C₁-C₁₀烷基)-、-(C₃-C₈环烷基)-、-芳基-、-O-(C₁-C₈烷基)-、-(C₁-C₁₀烷基)-芳基-、-芳基-(C₁-C₁₀烷基)-、-(C₁-C₁₀烷基)-(C₃-C₈环烷基)-、-(C₃-C₈环烷基)-(C₁-C₁₀烷基)-、-(3-8元杂环烷基)-、-(5-8元杂芳基)-、-(C₁-C₁₀烷基)-(3-8元杂环烷基)-、-(C₁-C₁₀烷基)-(5-8元杂芳基)-、-(3-8元杂环烷基)-(C₁-C₁₀烷基)-、-(5-8元杂芳基)-(C₁-C₁₀烷基)-、-O-C(O)-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)₂-、_-(CH₂CH₂O)_r-或-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)₂-；

每个b₁独立地是在0至6范围内的整数；

每个e₁独立地是在0至8范围内的整数；

每个f₁独立地是在1至6范围内的整数；

每个f₂独立地是在1至12范围内的整数；且

每个g₂独立地是在1至4范围内的整数。

在一些实施方案中，b₁是0。在一些实施方案中，b₁是1。

在一些实施方案中，每个f₁独立地是1或2。在一些实施方案中，f₁是1。在一些实施方案中，f₁是2。

在一些实施方案中，g₂是1或2。在一些实施方案中，g₂是1。在一些实施方案中，g₂是2。

在一些实施方案中，f₂是在4至6范围内的整数。

在一些实施方案中，R⁷是-(C₁-C₁₀烷基)-、-O-(C₁-C₈烷基)-、-(CH₂CH₂O)_r-、-O-C(O)-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)₂-或-(CH₂CH₂O)_r-(CH₂)₂-。

在一些实施方案中，R⁷是-O-、-NH、-N(CH₃)、-CH₂-、-(CH₂)₂-、-(CH₂)₅-、-O-C(O)-(CH₂CH₂O)₆-(CH₂)₂-、-(CH₂CH₂O)-(CH₂)₂-、-(CH₂CH₂O)₂-(CH₂)₂-、-(CH₂CH₂O)₄-(CH₂)₂-或-(CH₂CH₂O)₆-(CH₂)₂-。

应当理解，对于M^P的实施方案，*表示与L^P’或L^P的连接且**表示与L^M或M^A的连接。

在一些实施方案中，M^P是：

/>

在一些实施方案中，M^P是：

在一些实施方案中，M^P是：/>

在一些实施方案中，M^P是：

可变的L^M

在一些实施方案中，L^M是键(例如，二价接头或具有2个臂)或多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)，其中每个臂可以相同或不同。

在一些实施方案中，L^M是键(例如，二价接头或具有2个臂)或多臂接头(例如，四价或具有4个臂；三价或具有3个臂)，其中每个臂可以相同或不同。应当理解，本文中使用的术语“臂”表示L^M的一部分，其(1)连接至M^P(当存在时)，或(2)连接至L³(当存在时)或连接至M^A(当L³不存在时)。

在一些实施方案中，L^M是键(例如，二价接头或具有2个臂)。

在一些实施方案中，L^M是多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)，其中每个臂可以相同或不同。在一些实施方案中，L^M是多臂接头(例如，三价或四价或具有3或4个臂)。

在一些实施方案中，L^M是具有3个臂的三价接头，其中每个臂可以相同或不同。在一些实施方案中，L^M是具有3个臂的三价接头，其中每个臂可以相同。在一些实施方案中，L^M是具有3个臂的三价接头，其中每个臂可以不同。

在一些实施方案中，L^M是具有4个臂的四价接头，其中每个臂可以相同或不同。在一些实施方案中，L^M是具有4个臂的四价接头，其中每个臂可以相同。在一些实施方案中，L^M是具有4个臂的四价接头，其中每个臂可以不同。

在一些实施方案中，a₂是2且L^M是

其中：

表示与M^P(当存在时)的连接，或与L^P或L^P’的连接(当M^P不存在时)；

Y₁表示与L³(当存在时)的连接，或与M^A的连接(当L³不存在时)；

R₂和R′₂各自独立地是氢、任选地被取代的C_1-6烷基、任选地被取代的C_2-6烯基、任选地被取代的C_2-6炔基、任选地被取代的C_3-19支链烷基、任选地被取代的C_3-8环烷基、任选地被取代的C_6-10芳基、任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的C_1-6杂烷基、C_1-6烷氧基、芳氧基、C_1-6杂烷氧基、C_2-6烷酰基、任选地被取代的芳基羰基、C_2-6烷氧基羰基、C_2-6烷酰氧基、芳基碳酰氧基、任选地被取代的C_2-6烷酰基、任选地被取代的C_2-6烷酰氧基、任选地被取代的C_2-6取代的烷酰氧基、-COOH或-COO-C_1-6烷基；

c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈中的每个当存在时独立地是在0至10范围内的整数；且

d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇中的每个当存在时独立地是在0至10范围内的整数。

在一些实施方案中，a₂是2且L^M是

其中：

表示与M^P的连接；

在一些实施方案中，a₂是2且L^M是

在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈当存在时各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是0或1。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是0、1或2。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是0。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是1。在一些实施方案中，c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₇和c₈各自独立地是2。

在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇当存在时各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是0或1。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是1、2、3或4。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是1。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是2。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是3。在一些实施方案中，d₁、d₂、d₃、d₄、d₅和d₇各自独立地是4。

在一些实施方案中，R₂和R′₂各自独立地是氢、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_3-8环烷基、-COOH或-COO-C_1-6烷基。在一些实施方案中，R₂和R′2各自独立地是氢或C_1-6烷基。在一些实施方案中，R₂和R′2各自独立地是氢。在一些实施方案中，R₂和R′₂各自独立地是C_1-6烷基。

在一些实施方案中，L^M是：

/>

在一些实施方案中，a₂是3且L^M是

其中：

表示与M^P(当存在时)的连接，或与L^P或L^P’的连接(当M^P不存在时)；/>

c₁、c₂、c₃、c₄、c₅、c₆、c₇和c₈中的每个独立地是在0至10范围内的整数；d₁、d₂、d₃、d₄、d₅、d₆、d₇和d₈中的每个独立地是在0至10范围内的整数；且

e₁、e₂、e₃、e₄、e₅、e₆、e₇和e₈中的每个独立地是在0至10范围内的整数。

在一些实施方案中，a₂是3且L^M是

/>

其中：

表示与M^P的连接；

在一些实施方案中，a₂是3且L^M是

在一些实施方案中，a₂是3且L^M是/>

在一些实施方案中，-L^M-(L³)_a2-是：

在一些实施方案中，其中一个氨基酸单元具有两个连接位点(即，一个末端药物单元)，上面所示的连接位点之一可以被例如H、OH或C_1-3未被取代的烷基基团替换。

在一些实施方案中，当L^M是多臂接头且还未连接至延伸单元M^P时，W^M是L^M的末端且W^M的每次出现独立地是氢、保护基团、离去基团，或能够通过形成共价键将L^M连接至M^P的官能团。

在一些实施方案中，W^M是胺保护基团。在一些实施方案中，W^M是BOC。

在一些实施方案中，W^M是胺保护基团且L^M是

在一些实施方案中，W^M是BOC，且L^M是

在一些实施方案中，W^M包含胺基团。在一些实施方案中，W^M包含-C(O)-(CH₂)_w-NH₂，其中w是1至6的整数。在一些实施方案中，W^M是-C(O)-CH₂-NH₂。

在一些实施方案中，W^M是-C(O)-CH₂-NH₂且L^M是/>

在一些实施方案中，W^M是-C(O)-CH₂-NH₂且L^M是

在一些实施方案中，W^M是H。

可变的L³

在一些实施方案中，每个L³不存在。在一些实施方案中，每个L³是含羰基的部分。

应当理解，对于L³的实施方案，*指示与另一个L³(当存在时)或与L^M的连接；且**指示与另一个L³(当存在时)或与M^A的连接。

在一些实施方案中，每个L³当存在时独立地是*-C_1-12烷基-C(O)-**、*-NH-C_1-12烷基-C(O)-**或*-C_1-12烷基-C(O)-NH-C_1-12烷基-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-C_1-12烷基-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，L³是*-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，(L³)_a3是*-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-NH-C_1-12烷基-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，L³是*-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，(L³)_a3是*-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-C_1-12烷基-C(O)-NH-C_1-12烷基-C(O)-**。

在一些实施方案中，至少一个L³是*-CH₂CH₂-C(O)-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，L³是*-CH₂CH₂-C(O)-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，(L³)_a3是*-CH₂CH₂-C(O)-NH-CH₂CH₂-C(O)-**。

在一些实施方案中，(L³)_a3是*NH-CH₂CH₂-C(O)-CH₂CH₂-C(O)-**。

可变的M^A

在一些实施方案中，M^A是能够将一种或多种药物和一种或多种亲水基团连接至L^P或L^P’的接头部分。在一些实施方案中，M^A包含至少两个氨基酸的肽部分。在一些实施方案中，氨基酸在本文中被称作“AA”且多个氨基酸在本文中被称作“AA’s”。

在一些实施方案中，所述肽部分是能够与-L^D-D单元形成共价键并允许连接多个药物的部分。在一些实施方案中，所述肽部分包含单个AA单元或具有两各或更多个AA单元(例如，2至10个，2至6个，或2、3、4、5或6个)，其中所述AA单元各自独立地是天然的或非天然的氨基酸、氨基醇、氨基醛、二胺、多胺或它们的组合。在一些实施方案中，为了具有所需数目的连接，至少一个AA单元将具有官能化的侧链以提供-L^D-D单元的连接。在一些实施方案中，示例性的官能化的AA单元(例如，氨基酸、氨基醇或氨基醛)包括例如叠氮基或炔烃官能化的AA单元(例如，被修饰成具有叠氮基或炔烃基的氨基酸、氨基醇或氨基醛)。在一些实施方案中，所述叠氮基或炔烃基用于使用点击化学进行连接。

在一些实施方案中，所述肽部分具有2至12个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有2至10个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有2至6个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有2、3、4、5或6个AA单元。

在一些实施方案中，所述肽部分具有2个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有3个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有4个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有5个AA单元。在一些实施方案中，所述肽部分具有6个AA单元。

在一些实施方案中，在所述肽部分内的连接或与所述缀合物、其中间体或支架的其它组分的连接可以是例如通过氨基、羧基或其它官能团。在一些实施方案中，所述肽部分的每个氨基酸可以独立地是含巯基的氨基酸的D或L异构体。在一些实施方案中，所述肽部分的每个氨基酸可以独立地是含巯基的氨基酸的D异构体。在一些实施方案中，所述肽部分的每个氨基酸可以独立地是含巯基的氨基酸的L异构体。在一些实施方案中，所述含巯基的氨基酸可以是例如半胱氨酸、高半胱氨酸或青霉胺。

在一些实施方案中，构成所述肽部分的每个氨基酸可以独立地是下述氨基酸的L或D异构体：丙氨酸(包括β-丙氨酸)、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基链炔酸、氨基烷烃二元酸、杂环-甲酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸、其立体异构体或其衍生物。

在一些实施方案中，构成所述肽部分的每个氨基酸独立地是半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸或其立体异构体。

在一些实施方案中，所述肽部分包含单肽、二肽、三肽、四肽或五肽。在一些实施方案中，所述肽部分包含五肽。

在一些实施方案中，所述肽部分包含至少约5个氨基酸(例如，5、6、7、8、9或10个氨基酸)。在一些实施方案中，所述肽部分包含至多约10个氨基酸。

在一些实施方案中，构成所述肽部分的每个氨基酸独立地是甘氨酸、丝氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述肽部分包含至少4个甘氨酸和至少一个丝氨酸，例如，(甘氨酸)₄和丝氨酸，其中所述丝氨酸是在沿着所述肽链的任何位置处，例如，(丝氨酸)-(甘氨酸)₄；(甘氨酸)-(丝氨酸)-(甘氨酸)₃；(甘氨酸)₂-(丝氨酸)-(甘氨酸)₂；(甘氨酸)₃-(丝氨酸)-(甘氨酸)；或(甘氨酸)₄-(丝氨酸)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)₄-(丝氨酸)或(丝氨酸)-(甘氨酸)₄。在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)₄-(丝氨酸)。在一些实施方案中，所述肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)₄。

在一些实施方案中，所述肽部分包含至少4个甘氨酸和至少一个谷氨酸例如，(甘氨酸)₄和谷氨酸，其中所述谷氨酸是在沿着所述肽链的任何位置处。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)₄或(甘氨酸)₄-(谷氨酸)。在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)₄-(丝氨酸)，其中所述丝氨酸是在沿着所述肽链的任何位置处。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)₄-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中所述丝氨酸是在沿着所述肽链的任何位置处。在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)₄-(丝氨酸)-(谷氨酸)，其中所述丝氨酸是在沿着所述肽链的任何位置处。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)_1-4-(丝氨酸)，其中所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述丝氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)_1-4，其中所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

应当理解，对于所述肽部分的实施方案，*指示与L³(当存在时)或与L^M(当L³不存在时)的连接。在一些实施方案中，**指示与T¹(当存在时)或-OH(当T¹不存在时)的连接。在一些实施方案中，***指示与L^D(当存在时)或氢(当L^D不存在时)的连接。

在一些实施方案中，所述肽部分包含在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)-(丝氨酸)，其中所述肽部分经由所述甘氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述丝氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)-(丝氨酸)，其中所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)₄-(丝氨酸)，其中所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述丝氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含在一些实施方案中，所述肽部分包含(丝氨酸)-(甘氨酸)₄，其中所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。/>

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)_1-4-(丝氨酸)，其中所述肽部分经由所述β-丙氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述丝氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)₄-(丝氨酸)，其中：所述肽部分经由所述β-丙氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述丝氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述丝氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)_1-4-(谷氨酸)，其中所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)_1-4-(谷氨酸，其中：所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：所述肽部分经由所述甘氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含/>

在一些实施方案中，所述肽部分包含(甘氨酸)₄-(谷氨酸)，其中：所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)_1-4，其中：所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)₄，其中：所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(谷氨酸)-(甘氨酸)，其中：

所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述甘氨酸之一连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)_1-4-(谷氨酸)，其中：所述肽部分经由所述β-丙氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)₄-(谷氨酸)，其中：所述肽部分经由所述β-丙氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

应当理解，对于M^A的实施方案，*指示与L³(当存在时)或与L^M(当L³不存在时)的连接，**指示与T¹的连接，且***指示与L^D的连接。

在一些实施方案中，所述肽部分包含(β-丙氨酸)-(甘氨酸)-(谷氨酸)，其中：所述肽部分经由所述β-丙氨酸连接至L³(当存在时)或连接至L^M(当L³不存在时)；所述肽部分经由所述谷氨酸连接至T¹(当存在时)；且所述肽部分经由所述谷氨酸连接至L^D(当存在时)。

在一些实施方案中，所述肽部分包含

可变的L^D

在一些实施方案中，每个L^D独立地是将D连接至M^A的二价接头部分。在一些实施方案中，每个L^D包含至少一个可切割的键，使得当所述键被切割时，D以活性形式释放以实现其预期的治疗效果。

在一些实施方案中，L^D包含一个可切割的键。在一些实施方案中，L^D包含多个切割位点或键。

应当理解，每个L^D在连接至D之前独立地对应于单价部分L^D’。

在一些实施方案中，L^D’包含能够形成可切割的键的官能团。能够形成可切割的键的官能团可以包括，例如，形成二硫键的巯基，形成腙键的醛、酮或肼基团，形成肟键的羟胺基团，形成肽键的羧基或氨基基团，形成酯键的羧基或羟基基团，和形成糖苷键的糖。

在一些实施方案中，每个L^D包含可通过二硫键交换而切割的二硫键、在酸性pH下可切割的酸不稳定键和/或可被水解酶切割的键。在一些实施方案中，L^D包含氨基甲酸酯键(即，-O-C(O)-NR-，其中R是氢或烷基等)。

在一些实施方案中，在L^D中的可切割键的结构和序列可以使得所述键通过在靶位点处存在的酶的作用而切割。在一些实施方案中，所述可切割的键可以通过其它机制而切割。

在一些实施方案中，在L^D中的多个可切割键的结构和序列可以使得所述多个键通过在靶位点处存在的酶的作用而切割。在一些实施方案中，所述多个可切割的键可以通过其它机制而切割。

在一些实施方案中，所述可切割的键可以被一种或多种酶(包括肿瘤相关的蛋白酶)酶促切割以释放药物单元或D，其中本公开内容的缀合物或其中间体或支架在释放后在体内质子化以提供药物单元或D。

在一些实施方案中，每个L^D独立地是其中：

L^E当存在时是-NH-[(CH₂CH₂O)_p-(CH₂)_0-2]_q-C(O)-、-NH-(C₁-C₆烷基)-O-C(O)-或-NH-[(CH₂CH₂O)_p-(CH₂)_0-2]_q-C(O)-NH-(C₁-C₆烷基)-O-C(O)-，其中p是在约1至约20范围内的整数，且q是在约1至约10范围内的整数；

每个W独立地是天然的或非天然的氨基酸单元；

w是在约0至约12范围内的整数；

***表示与M^A的连接；且

****表示与D的连接。

在一些实施方案中，每个L^D独立地是

在一些实施方案中，L^E包含至少一个PEG单元。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少1个亚基、至少2个亚基、至少3个亚基、至少4个亚基、至少5个亚基或至少6个亚基。在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少4个亚基、至少3个亚基、至少2个亚基或至少1个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少1个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少2个亚基。

在一些实施方案中，p是在约1至约15、约1至约10、约1至约9、约1至约8、约1至约7、约1至约6，或约1至约5范围内的整数。

在一些实施方案中，p是在约1至约6范围内的整数。在一些实施方案中，p是在约1至约4范围内的整数。在一些实施方案中，p是在约1至约2范围内的整数。

在一些实施方案中，p是2。

在一些实施方案中，q是在约1至约15、约1至约10、约1至约9、约1至约8、约1至约7、约1至约6，或约1至约5范围内的整数。

在一些实施方案中，q是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，q是2。

在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)_1-4-(CH₂)₂-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)₂-(CH₂)₂-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)_0-2-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)₃-(CH₂)₂-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(CH₂CH₂O)-(CH₂)_0-2-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-CH₂CH₂O-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-(C₁-C₆烷基)-O-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-CH₂-CH(CH₃)-O-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-[(CH₂CH₂O)_1-4-(CH₂)₂-C(O)-NH-(C₁-C₆烷基)-O-C(O)-。在一些实施方案中，L^E当存在时是-NH-CH₂CH₂O-(CH₂)₂-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-C(O)-。

在一些实施方案中，w是在约1至约12范围内的整数(例如，1至6，或1至4，或1至3，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。

在一些实施方案中，w是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，w是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，w是1。在一些实施方案中，w是2。在一些实施方案中，w是3。

在一些实施方案中，每个W独立地是天然的或非天然的氨基酸和/或D或L异构体。

在一些实施方案中，每个W独立地是天然的或非天然的α、β或γ氨基酸。在一些实施方案中，至少一个W是天然的氨基酸。在一些实施方案中，至少一个W是非天然的氨基酸。

在一些实施方案中，W_w不包含天然的氨基酸。在一些实施方案中，W_w不包含非天然的氨基酸。

在一些实施方案中，W_w包含与非天然氨基酸连接的天然氨基酸。

在一些实施方案中，W_w包含与天然氨基酸的D-异构体连接的天然氨基酸。

在一些实施方案中，W_w是二肽，例如，-Val-Cit-、-Phe-Lys-、-Val-Ala-或Glu-Ala。

在一些实施方案中，W_w是单肽、二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽单元。

在一些实施方案中，W_w是肽(例如，1至12个氨基酸的肽)，其直接缀合至D。在一些实施方案中，所述肽是单个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽是二肽。在一些实施方案中，所述肽是三肽。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基链烷酸、氨基链炔酸、氨基烷烃二元酸、氨基苯甲酸、氨基-杂环-链烷酸、杂环-甲酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸及其衍生物。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、瓜氨酸及其衍生物。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自蛋白形成氨基酸和非蛋白形成氨基酸。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自下述氨基酸的L或D异构体：丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、青霉胺、氨基链炔酸、氨基烷烃二元酸、杂环-羧酸、瓜氨酸、抑胃酶氨酸、二氨基链烷酸、缬氨酸、瓜氨酸及其衍生物。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地是半胱氨酸、高半胱氨酸、青霉胺、鸟氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、硒代半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、瓜氨酸或丙氨酸。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自下述氨基酸的L-异构体:丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸独立地选自下述氨基酸的D-异构体:丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、色氨酸、瓜氨酸和缬氨酸。

在一些实施方案中，在W_w中的每个氨基酸是丙氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异谷氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸瓜氨酸或天冬氨酸。

在一些实施方案中，W_w包含β-丙氨酸。在一些实施方案中，W_w包含(β-丙氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，W_w包含(β-丙氨酸)和任选的谷氨酸、谷氨酰胺、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含(β-丙氨酸)-(谷氨酰胺)。

在一些实施方案中，W_w包含(β-丙氨酸)-(谷氨酰胺))-(丙氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含谷氨酸和任选的丙氨酸、甘氨酸、异谷氨酸、天冬氨酸、异天冬氨酸、缬氨酸、(缬氨酸)-(丙氨酸)、(丙氨酸)-(丙氨酸)或(缬氨酸)-(瓜氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，W_w包含(R)-2,3-二氨基丙酸。在一些实施方案中，W_w包含谷氨酸。在一些实施方案中，W_w包含(谷氨酸)-(丙氨酸)。在一些实施方案中，W_w包含(谷氨酸)-(甘氨酸)-(丙氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含L-谷氨酸、D-谷氨酸、(L-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(L-丙氨酸)、(D-谷氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)、D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)、(L-谷氨酸)-(甘氨酸)-(D-丙氨酸)或(D-谷氨酸)-(甘氨酸)-(L-丙氨酸)。

在一些实施方案中，W_w包含除了一个或多个氨基酸以外的氨基甲酸酯键。

在一些实施方案中，L^D(例如，W_w)是酶切割选择性的(例如，被特定酶切割)。

在一些实施方案中，所述特定酶是肿瘤相关的蛋白酶。

在一些实施方案中，L^D(例如，W_w)包含其切割由组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶催化的键。

在一些实施方案中，L^D包含糖切割位点。

在一些实施方案中，L^D包含通过氧糖苷键连接至自降解基团的糖部分(Su)。

在一些实施方案中，“自降解基团”可以是三官能团化学部分，其能够将三个隔开的化学部分(即，糖部分(经由糖苷键)、药物单元(直接地或间接地)和当M^A存在时的M^A(直接地或间接地)或当M^A不存在时的A¹)共价地连接在一起。

在一些实施方案中，所述糖苷键可以在靶位点处被切割以引发导致药物释放的自降解反应序列。

在一些实施方案中，每个L^D当存在时独立地是：

/>

其中：***表示与M^A的连接；且****表示与D的连接。在一些实施方案中，每个L^D当存在时独立地是：

/>

其中：

***表示与M^A的连接；且

****表示与D的连接。

在一些实施方案中，每个L^D当存在时独立地是：

治疗剂、药物单元或可变的D

在一些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性药物部分。在一些实施方案中，所述治疗剂是STING激动剂药物部分。

在一些实施方案中，所述细胞毒性药物部分是小分子。

在一些实施方案中，所述治疗剂具有≤约5kDa的分子量(例如，具有≤约4kDa、≤约3kDa、≤约1.5kDa或≤约1kDa的分子量)。

在一些实施方案中，所述治疗剂具有约小于1nM的IC₅₀。在一些实施方案中，所述细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分具有小于1nM的IC₅₀。

在一些实施方案中，所述治疗剂具有约大于1nM的IC₅₀(例如，所述细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分具有约1至50nM的IC₅₀)。在一些实施方案中，所述治疗剂具有约大于1nM的IC₅₀。在一些实施方案中，所述治疗剂具有大于1nM的IC₅₀(例如，所述细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分具有1至50nM的IC₅₀)。在一些实施方案中，所述治疗剂具有大于1nM的IC₅₀。

在一些实施方案中，具有大于约1nM的IC₅₀的治疗剂(例如，“效力较低的药物”)不适合用于使用本领域公知的缀合技术与抗体缀合。不希望受理论约束，这样的治疗剂(即，细胞毒性剂药物部分或STING激动剂药物部分)具有不足以用在使用常规技术的靶向抗体-药物缀合物中的效能，因为使用本领域公知的技术不可缀合药物的足够拷贝(即，超过8个)而不导致降低的所述的缀合物的药代动力学和生理化学性质。在一些实施方案中，使用本文描述的缀合策略可以实现这些效力较低的药物的足够高的负载，从而导致所述治疗剂的高负载，同时维持合乎需要的药代动力学和生理化学性质。在一些实施方案中，本公开内容涉及包括一种抗体、一种支架和至少八种治疗剂(即，细胞毒性剂、药物部分或STING激动剂药物部分)的抗体-药物缀合物，其中所述治疗剂具有大于约1nM的IC₅₀。

细胞毒性药物部分(可变的D)

在一些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性药物部分。在一些实施方案中，所述细胞毒性药物部分是以下物质的衍生物：(a)澳瑞他汀化合物；(b)卡利奇霉素化合物；(c)多卡米星化合物；(d)SN38，(e)吡咯并苯并二氮杂环庚三烯；(f)长春药属化合物；(g)tubulysin化合物；(h)非天然的喜树碱化合物；(i)拟美坦辛(maytansinoid)化合物；(j)DNA结合药物；(k)激酶抑制剂；(l)MEK抑制剂；(m)KSP抑制剂；(n)拓扑异构酶抑制剂；(o)DNA-烷基化药物；(p)RNA聚合酶；(q)PARP抑制剂；(r)NAMPT抑制剂；(s)拓扑异构酶抑制剂；(t)蛋白合成抑制剂；(u)DNA结合药物；(v)DNA嵌入药物；或(w)免疫调节性的化合物，如在US2018/0154018中所述，其内容特此通过引用整体并入。

在一些实施方案中，所述细胞毒性药物部分是澳瑞他汀F-羟基丙基酰胺-L-丙氨酸。

在一些实施方案中，所述澳瑞他汀是式(X)的化合物：

其中：

R₃₁和R₃₂中的每个独立地是氢或C_1-8烷基且R₃₁和R₃₂中的至多一个是H；

R₃₃是氢、C_1-8烷基、C_3-8碳环、C_6-10芳基、C_1-8烷基-C_6-10芳基、X¹-(C₃-₈碳环)、C_3-8杂环或X¹-(C_3-8杂环)；

R₃₄是氢、C_1-8烷基、C_3-8碳环、C_6-10芳基、X¹-C_6-10芳基、X¹-(C_3-8碳环)、C_3-8杂环或X¹-(C_3-8杂环)；

R₃₅是氢或甲基；

或R₃₄和R₃₅与它们所连接的碳原子一起形成具有式-(CR₅₅R₄₁)_b-的碳环，其中R₅₅和R₄₁中的每个独立地是氢或C_1-8烷基且b是3至7的整数；

R₃₆是氢或C_1-8烷基；

R₃₇是氢、C_1-8烷基、C_3-8碳环、C_6-10芳基、-X¹-C_6-10芳基、-X¹-(C_3-8碳环)、C_3-8杂环或-X¹-(C_3-8杂环)；

每个R₃₈独立地是氢、OH、C_1-8烷基、C_3-8碳环或O-(C_1-8烷基)；

R₅₃是：或R₅₄；/>

R₃₉是氢、C_1-8烷基、C_6-10芳基、-X¹-C_6-10芳基、C_3-8碳环、C_3-8杂环、-X¹-C_3-8杂环、-C_1-8亚烷基-NH₂或(CH₂)₂SCH₃；

每个X¹独立地是C_1-10亚烷基或C_3-10亚环烷基；

R₄₄是氢或C_1-8烷基；

R₄₅是X³-R₄₂或NH-R₁₉；

X³是O或S；

R₁₉是氢、OH、氨基基团、C_1-8烷基氨基或-[C(R₂₀R₂₁)]_a-R₂₂；

R₄₂是氨基基团、C_1-6烷基氨基或-[C(R₂₀R₂₁)]_a-R₂₂；

R₂₀和R₂₁中的每个独立地是氢、C_1-6烷基、C_6-10芳基、羟基化的C_6-10芳基、多羟基化的C_6-10芳基、5至12元杂环、C_3-8环烷基、羟基化的C_3-8环烷基、多羟基化的C_3-8环烷基或天然的或非天然的氨基酸的侧链；

R₂₂是-OH、-NHR₂₃、-COOH、-R₈₂-C(O)(CH₂)_c-C(H)(R₂₃)-N(H)(R₂₃)、-R₈₂-C(O)(CH₂)_d-(O CH₂-CH₂)_f-N(H)(R₂₃)或-R₈₂-(C(O)-CH(X²)-NH)_d-R₇₇；

每个R₂₃独立地是氢、C_1-6烷基、C_6-10芳基、C_3-8环烷基、-COOH或-COO-C_1-6烷基；

X²是天然的或非天然的氨基酸的侧链；

R₇₇是氢或X²和NR₇₇形成含氮的环状化合物；

R₈₂是-NR₂₃或氧；

R₅₄是-C(R₅₆)₂--C(R₅₆)₂-C_6-10芳基、-C(R₅₆)₂--C(R₅₆)₂-C_3-8杂环或-C(R₅₆)₂--C(R₅₆)₂-C_3-8碳环；

R₅₆独立地是H、OH、C_1-8烷基、C_3-8碳环、-O-C_1-8烷基、-O-C(O)-R₂₉或-O-R₂₃-O-C_1-6烷基-NH₂；

R₂₉是氨基基团、5至12元杂环烷基、-R₂₈-C_1-6烷基-R₂₂、R₂₈-C_5-12杂环烷基-C_1-6烷基-R₂₂、-[C(R₂₀R₂₁)]_a-R₂₂或-R₂₈-C_1-6烷基-C_6-12芳基-C_1-6烷基-R₂₂；或R₂₉是如本文中所定义的R₄₇；

R₂₈不存在，或者是NR₂₃或氧；

a是1至6的整数；c是0至3的整数；d是1至3的整数；且f是1至12的整数。

在一些实施方案中，在式(X)的澳瑞他汀化合物中：

R₃₉是苄基或且R₄₄是氢。

在一些实施方案中，所述澳瑞他汀是式(Xa)的化合物：

其中：

R₃₃至R₃₈和R₄₄如本文中所定义，

R₃₁和R₃₂之一是氢或C_1-8烷基且另一个是：

其中：

R₈₃是氢或CH₃；

R₈₄是C_1-6烷基或C_6-10芳基；

每个R₁₂’独立地是卤素、-C_1-8烷基、-O-C_1-8烷基、硝基或氰基；

h是0至4的整数；

u是整数0或1；

R₅₃是：或R₅₄

R₃₉是氢、C_1-8烷基、C_6-10芳基、-X¹-C_6-10芳基、C_3-8碳环、C_3-8杂环、-X¹-C_3-8杂环、-C_1-8亚烷基-NH₂或(CH₂)₂SCH₃，

每个X¹独立地是C_1-10亚烷基或C_3-10亚环烷基；

R₄₅是X³-R₄₂或NH-R₁₉；

X³是O或S；

R₄₂是氢、氨基基团、C_1-6烷基氨基或-[C(R₂₀R₂₁)]_a-R₂₂；

R₂₂是-OH、-NHR₂₃、-COOH、-R₈₂-C(O)(CH₂)_c-C(H)(R₂₃)-N(H)(R₂₃)、-R₈₂-C(O)(CH₂)_d-(O-CH₂-CH₂)_f-N(H)(R₂₃)或-R₈₂-(C(O)-CH(X²)-NH)_d-R₇₇；

X²是天然的或非天然的氨基酸的侧链；

R₇₇是氢或X²和NR₇₇形成含氮的环状化合物；

R₈₂是-NR₂₃或氧；

R₅₆独立地是氢、OH、C_1-8烷基、C_3-8碳环、-O-C_1-8烷基、-O-C(O)-R₂₉或-O-R₂₃-O-C_1-6烷基-NH₂；

R₂₈不存在，或者是NR₂₃或氧；

在一些实施方案中，式(Xa)的澳瑞他汀化合物是式(XIa)或式(XIb)的化合物：

其中：

R₉₂是：且

R₈₃是氢或CH₃。

在一些实施方案中，式(X)的澳瑞他汀是式(XI)、式(XII)或式(XIII)的化合物：

其中式(XI)的化合物是：

其中R₃₁是氢或CH₃且R₄₂是-CH₃或以下结构中的任一种:

/>

其中：

a是1至6的整数；c是0至3的整数；且g是2至6的整数；

其中式(XII)的化合物是：

其中R₃₁是氢或CH₃且R₄₀是氢、-OH、-NH₂或以下结构中的任一种:

/>

其中：

a是1至6的整数；g是2至6的整数；且c是0至3的整数；

其中式(XIII)的化合物是：

其中：

R₃₁是氢或CH₃；

R₂₉是氨基基团、5至12元杂环烷基、-R₂₈-C_1-6烷基-R₂₂、R₂₈-C_5-12杂环烷基-C_1-6烷基-R₂₂、-R₂₈-[C(R₂₀R₂₁)]_a-R₂₂或-R₂₈-C_1-6烷基-C_6-12芳基-C_1-6烷基-R₂₂；或R₂₉是如本文中所定义的R₄₇；

X²是天然的或非天然的氨基酸的侧链；

R₇₇是氢或X²和NR₇₇形成含氮的环状化合物；

R₈₂是-NR₂₃或氧；

R₂₈不存在，或者是NR₂₃或氧；

在式(XII)的某些实施方案中，R₄₀是

在一些实施方案中，式(XII)的化合物是式(XIIa)、(XIIb)、(XIIc)、(XIId)、(XIIe)、(XIIf)、(XIIg)或(XIIh)的化合物：

/>

在式(XIII)的化合物的某些实施方案中，R₂₉是-NH₂、5元杂环烷基、-R₂₈-C_1-6烷基-R₂₂、R₂₈-C_5-12杂环烷基-C_1-6烷基-R₂₂或-R₂₈-C_1-6烷基-C_6-12芳基-C_1-6烷基-R₂₂；或R₂₉是如本文中所定义的R₄₇；

R₂₈不存在，或者是NR₂₃或氧；

X²是天然的或非天然的氨基酸的侧链；

R₇₇是氢或X²和NR₇₇形成含氮的环状化合物；

R₈₂是-NR₂₃或氧；

c是0至3的整数；d是1至3的整数；且f是1至12的整数。

在一些实施方案中，R₂₉是：

/>

其中：

a是1至6的整数；c是0至3的整数；且g是2至6的整数。

其中R₄₂是H、-CH₃(m/z＝760)、

其中R₄₀是H、 />

其中-C(O)-R₂₉是

在一些实施方案中，所述细胞毒性药物部分(D)是：

STING激动剂药物部分(可变的D)

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分(D)是式(A)的化合物：

或其前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或互变异构体，其中：

Y₁、Y₂、Z₁和Z₂各自独立地是O、S、C或N；

X₁、X₂、W₁和W₂各自独立地是C或N；

X₃和X₄各自独立地是S或NR^f；

X₅是N或CR^A2；

X₆是N或CR^A1；

X₇是N或CR⁴；

R³和R⁵各自独立地是-CON(R^d)(R^f)、-CH₂N(R^d)(R^f)、-N(R^d)(R^f)、-N(R^d)CO(R^f)、-CH₂N(R^d)CO(R^f)或R³和R⁵之一是-CON(R^d)(R^f)、-CH₂N(R^d)(R^f)、-N(R^d)(R^f)、-N(R^d)CO(R^f)或-CH₂N(R^d)CO(R^f)，且R³和R⁵中的另一个是H、-COOH或-CO₂(R^C)；

R^c是C_1-4烷基；

R^A2、R^A1和R⁴各自独立地是H、卤素、羟基、氨基、氨基(C_1-4烷基)-、任选地被取代的(C_1-6烷基)或任选地被取代的(C_1-6烷基)氧基-，其中所述任选地被取代的(C_1-6烷基)或任选地被取代的(C_1-6烷基)氧基-的C_1-6烷基任选地被1-4个取代基取代，所述取代基各自独立地选自羟基、C_1-4烷氧基、-N(R^e)(R^f)、-CO₂(R^f)、-CON(R^e)(R^f)和-COOH；

每个R^d独立地是H、羟基或C_1-4烷基；

R^e选自H、(C_1-4烷基)、-CO(C_1-4烷基)、-OCO(C_1-4烷基)和-CO₂(C_1-4烷基)；每个R^f独立地是H、羟基或(C_1-4烷基)；

R¹⁴和R^C2各自独立地不存在或者是C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地被选自以下的取代基取代：卤素、-OR^c、-NR^cR^d、-CO₂R^c、-CONR^cR^d、-SO₂NR^cR^d和-OCONR^cR^d；

R¹⁶和R^C1各自独立地不存在或者是H或C_1-4烷基；且

R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸或R¹⁹各自独立地不存在或者是H或C_1-4烷基，其中C_1-4烷基任选地被选自以下的取代基取代：卤素、-OR^c、-NR^cR^d、-CO₂R^c、-CONR^cR^d、-SO₂NR^cR^d和-OCONR^cR^d；

其中：(i)R^A2和R^A1中的至少一个存在，且其中R^A2和R^A1中的至少一个经由R^A2和/或R^A1的至少一个官能团直接地或间接地连接至L^C(当L^C存在时)或连接至A¹(当L^C不存在时)；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团直接地或间接地连接至L^C(当L^C存在时)或连接至A¹(当L^C不存在时)。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分(D)是式(A’)的化合物：

或其前药、溶剂化物、药学上可接受的盐或互变异构体，其中Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、W₁、W₂、X₃、X₄、X₅、X₆、R³、R⁵、R^c、R^A1、R^A2、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是式(A-a)的化合物：

Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、W₁、W₂、X₃、X₄、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

R^A2是卤素、羟基、任选地被取代的(C_1-6烷基)、被取代的(C_1-6烷基)氧基-、任选地被取代的(C_1-6烷基)氨基-或任选地被取代的(C_1-6烷基)(C_1-4烷基)氨基-，其中所述任选地被取代的(C_1-6烷基)或被取代的(C_1-6烷基)氧基-的C_1-6烷基任选地被1-4个取代基取代，所述取代基各自独立地选自羟基、C_1-4烷氧基、-N(R^e)(R^f)、-CO₂(R^f)、-CON(R^e)(R^f)和-COOH；

其中：(i)R^A2经由R^A2的一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-b)的化合物：

Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、W₁、W₂、X₄、X₅、X₆、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；

其中：(i)R^A2和R^A1中的至少一个存在，且其中R^A2和R^A1中的至少一个经由R^A2和/或R^A1的至少一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-c)的化合物：

Y₂、Z₂、X₂、W₂、X₃、X₄、X₅、X₆、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；

其中W₁、X₁、Y₁和Z₁之一是N且W₁、X₁、Y₁和Z₁中的另一个是O、S或C；

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-d)的化合物：

Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、W₁、W₂、X₃、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^A2、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-e)的化合物：

Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、X₃、W₁、W₂、R^A1、R3、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；

X₆是CR^A1；且

其中：(i)R^A1经由R^A1的一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f)的化合物：

X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、W₂、Y₂、Z₂ R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R^d、R^e、R^f、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R^C2和R^C1、如在式(A)中所定义，且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f1)的化合物：

X₂、X₃、X₄、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁶、R^A2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R^C2和R^C1、如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f2)的化合物：

X₂、X₄、X₅、X₆、X₇、W₂、Y₂、Z₂ R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R⁴、R^d、R^e、R^C1、R^C2、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R^f如在式(A)中所定义；

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f3)的化合物：

X₂、X₄、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁶、R^A2、R^C2、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f4)的化合物：

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f5)的化合物：

X₂、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁶、R^A2、R^C2、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f6)的化合物：

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-f7)的化合物：

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g)的化合物：

X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R⁴、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R^d、R^e、R^f、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

Y₂和Z₂各自独立地是O、S、C或N；

X₂和W₂各自独立地是C或N；

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g1)的化合物：

X₂、W₂、Y₂、Z₂、X₃、X₄、X₅、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R^A2、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；其中：(i)R^A2经由R^A2的一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g2)的化合物：

X₂、X₄、X₅、X₆、X₇、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R⁴、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R^d、R^e、R^f、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g3)的化合物：

X₂、X₄、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

其中：(i)R^A2经由R^A2的一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D；且

任选地，其中R^A2经由R^A2的一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g4)的化合物：

X₂、X₄、W₂、Y₂、Z₂ R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R^A2、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g5)的化合物：

X₂、W₂、Y₂、Z₂、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R^A2、R^C2、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-g6)的化合物：

X₅是CR^A2；且

任选地，其中R^A2经由R^A2的一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-h)的化合物：

X₁、W₁、Y₁、Z₁、X₃、X₄、X₅、X₆、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；其中：(i)R^A2和R^A1中的至少一个存在，且其中R^A2和R^A1中的至少一个经由R^A2和/或R^A1的至少一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-h1)的化合物：

X₁、X₃、W₁、Y₁、Z₁、X₅、X₆、R³、R⁵、R^c、R^A2、R^A1、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分是具有式(A-h2)的化合物：

X₁、X₃、W₁、Y₁、Z₁、R³、R⁵、R^c、R^d、R^e、R^f、R^A2、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁸、R¹⁹、R¹⁶和R^C1如在式(A)中所定义；

X₅是CR^A2；且

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物部分(D)是式(A)的化合物，其中所述化合物具有式(A-i)：

Y₁、Y₂、Z₁、Z₂、X₁、X₂、X₃、X₆、X₇、W₁、W₂、R^A1、R^A2、R⁴、R^c、R^d、R^e、R^f、R¹⁴、R^C2、R¹⁶、R^C1、R¹⁵、R¹⁷、R¹⁸和R¹⁹如在式(A)中所定义；且其中：(i)R^A2和R^A1中的至少一个存在，且其中R^A2和R^A1中的至少一个经由R^A2和/或R^A1的至少一个官能团连接至L^D；或(ii)R^C2和R^C1中的至少一个存在，且其中R^C2和R^C1中的至少一个经由R^C2和/或R^C1的至少一个官能团连接至L^D。

在一些实施方案中，每个STING激动剂药物部分(D)独立地是：

/>

其中：

R²不存在或者是-O-或-NR⁴-；R⁴是H或C_1-3烷基；且表示与L^D的连接。

在一些实施方案中，每个STING激动剂药物部分(D)独立地是：

/>

其中：

在一些实施方案中，每个STING激动剂药物部分(D)独立地是：

/>

其中：

在一些实施方案中，每个STING激动剂药物部分(D)独立地是：

/>

其中：

在一些实施方案中，每个STING激动剂药物部分(D)独立地是：

其中：

亲水基团(可变的T¹)

在一些实施方案中，在本公开内容的缀合物或支架中包括的亲水基团是水溶性的且基本上非抗原性的聚合物。所述亲水基团的例子包括但不限于多元醇、聚醚、聚阴离子、聚阳离子、聚磷酸、多胺、多糖、多羟基化合物、聚赖氨酸及其衍生物。在一些实施方案中，所述亲水基团的一个末端可以被官能化，使得它可以借助于不可切割的键或经由可切割的键共价地连接至M^A接头(例如，连接至M^A接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，官能化可以是例如经由胺、硫醇、NHS酯、马来酰亚胺、炔烃、叠氮化物、羰基或其它官能团。在一些实施方案中，所述亲水基团的另一个末端(或多个末端)将是自由的且不受束缚的。在一些实施方案中，“不受束缚”意指所述亲水基团将不连接至另一个部分，诸如D或药物单元，或本公开内容的缀合物或支架的其它组分。在一些实施方案中，所述亲水基团的自由且不受束缚的末端可以包括甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团。在一些实施方案中，所述甲氧基、羧酸、醇或其它合适的官能团充当所述亲水基团的一个或多个末端的帽。

在一些实施方案中，可切割的键表示这样的键：其当在血浆中循环时对切割基本上不敏感，但在细胞内或肿瘤内环境中对切割敏感。在一些实施方案中，不可切割的键是在任何生物环境中对切割基本上不敏感的键。在一些实施方案中，腙的化学水解、二硫化物的还原以及肽键或糖苷键的酶切割是可切割的键的例子。在一些实施方案中，所述亲水基团的示例性连接是经由酰胺键、醚键、酯键、腙键、肟键、二硫键、肽键或三唑键。在一些实施方案中，所述亲水基团与M^A接头(例如，与M^A接头中的氨基酸)的连接是经由酰胺键。

在其中本公开内容的缀合物或支架包含超过一个亲水基团的某些实施方案中，所述多个亲水基团可以是相同或不同的化学部分(例如，不同分子量、亚基数目或化学结构的亲水基团)。在一些实施方案中，所述多个亲水基团可以在单个连接位点或不同位点处连接至M^A接头。

在一些实施方案中，所述亲水基团的添加可能对所得缀合物的药代动力学具有两种潜在影响。在一些实施方案中，期望的影响是清除率的降低(以及随后暴露的增加)，其起因于由药物或药物-接头的暴露的疏水元件诱导的非特异性相互作用的减少。在一些实施方案中，所述不期望的影响是可能因缀合物分子量的增加而引起的体积和分布速率的降低。在一些实施方案中，增加所述亲水基团的分子量会增加缀合物的流体动力学半径，从而导致降低的扩散系数，这可能降低所述缀合物渗透到肿瘤中的能力。由于这两种相互竞争的药代动力学效应，可能合乎需要的是，使用足够大的亲水基团以降低所述缀合物清除率从而增加血浆暴露，但又不能大到大大降低其扩散系数，这可能降低所述缀合物的到达预期的目标细胞群的能力。

在一些实施方案中，所述亲水基团包括但不限于糖醇(也被称作多元醇(polyalcohol)、多元醇(polyhydric alcohol)、多羟糖醇或葡萄糖醇，诸如肌醇、甘油、赤藓醇、苏糖醇、阿糖醇、木糖醇、核糖醇、半乳糖醇、甘露醇、山梨醇等)或其衍生物(例如，氨基多元醇)、碳水化合物(例如，糖)、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物(例如，葡聚糖)、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧烷烃和/或其共聚物。

在一些实施方案中，T¹包含多个羟基(“-OH”)基团，诸如包含单糖、寡糖、多糖等的部分。

在一些实施方案中，T¹包含多个-(CR₅₈OH)-基团，其中R₅₈是-H或C_1-8烷基。

在一些实施方案中，T¹是-OH或其中：/>

n₁是0至约6的整数；

每个R₅₈独立地是-H或C_1-8烷基；

R₆₀是键、C_1-6烷基接头或-CHR₅₉-，其中R₅₉是-H、C_1-8烷基、环烷基或芳基烷基；

R₆₁是CH₂OR₆₂、COOR₆₂、-(CH₂)_n2COOR₆₂或被一个或多个羟基取代的杂环烷基；

R₆₂是-H或C_1-8烷基；且

n₂是1至约5的整数。

在一些实施方案中，T¹是-OH。

在一些实施方案中，T¹是

在一些实施方案中，R₅₈是-H；R₆₀是键或C_1-6烷基接头；n₁是1至约6的整数；且R₆₁是CH₂OH或COOH。

在一些实施方案中，R₅₈是-H；R₆₀是-CHR₅₉-；n₁是0；且R₆₁是被一个或多个羟基取代的杂环烷基，例如，单糖。

在一些实施方案中，T¹包含葡萄糖基胺、二胺或三胺。

在一些实施方案中，T¹包含下述片段中的一种或多种或其立体异构体:

/>

其中：

5R₅₉是-H、C_1-8烷基、环烷基或芳基烷基；

n₁是1至约6的整数；

n₂是1至约5的整数；且

n₃是约1至约3的整数。

应当理解，本文考虑了所述亲水基团的所有立体化学形式。例如，在上式中，所述亲水基团可以衍生自核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其它糖并且保留存在于那些分子上的侧羟基和烷基基团的立体化学排列。

应当理解，在前述式中，还考虑了各种脱氧化合物。示例性地，当适用时，为所述亲水基团考虑下述特征中的一个或多个。

在一些实施方案中，n₃是2或3。

在一些实施方案中，n₁是1、2或3。

在一些实施方案中，n₂是1。

在一些实施方案中，R₅₉是氢。

在一些实施方案中，T¹是在一些实施方案中，T¹是

在一些实施方案中，T¹是

在一些实施方案中，T¹是其中

n₄是1至约25的整数；

每个R₆₃独立地是-H或C_1-8烷基；

R₆₄是键或C_1-8烷基接头；

R₆₅是-H、C_1-8烷基、-(CH₂)_n2COOR₆₂或-(CH₂)_n2COR₆₆；

R₆₂是H或C_1-8烷基；

R₆₆是H、/>且

n₂是1至约5的整数。

在一些实施方案中，T¹是：

其中R₆₇是：(1)OH

其中n₄是约2至约20、约4至约16、约6至约12、约8至约12的整数。

在一些实施方案中，T¹是

在一些实施方案中，n₄是约2至约20、约4至约16、约6至约12、约8至约12的整数。

在一些实施方案中，n₄是6、7、8、9、10、11或12。

在一些实施方案中，n₄是8或12。

在一些实施方案中，T¹是其中n₄是约2至约24、约4至约16、约6至约12、约8至约12的整数。

在一些实施方案中，n₄是6、7、8、9、10、11或12。

在一些实施方案中，n₄是8。在一些实施方案中，n₄是12。

在一些实施方案中，T¹是其中n₄是8。

在一些实施方案中，T¹包含聚醚，例如，聚亚烷基二醇(PAO)。PAO包括但不限于低级环氧烷烃的聚合物，特别是环氧乙烷的聚合物，诸如、例如，环氧丙烷、聚丙二醇、聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯化的多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物。

在一些实施方案中，所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG)，包括但不限于多分散PEG、单分散PEG和离散PEG。多分散PEG是大小和分子量的异质混合物，而单分散PEG通常从异质混合物中纯化，并因此提供单一链长和分子量。在一些实施方案中，所述PEG单元是离散PEG，其提供具有限定和指定的链长度的单一分子。在一些实施方案中，所述聚乙二醇是mPEG。

在一些实施方案中，T¹包含PEG单元，其包含一条或多条PEG链。所述PEG链可以连接在一起，例如，以直链、支链或星形构型。所述PEG单元除了包含重复的PEG亚基之外，还可以包含非PEG物质(例如，以促进多个PEG链彼此偶联或促进与氨基酸的偶联)。非PEG物质表示在PEG链中不属于重复-CH₂CH₂O-亚基的一部分的原子。在一些实施方案中，所述PEG链可以包含通过非PEG元件彼此连接的两个单体PEG链。在一些实施方案中，所述PEG单元可以包含连接至中央核心的两条直链PEG链，所述中央核心连接至氨基酸(即，PEG单元本身是支化的)。

所述PEG单元可以经由反应性基团共价地结合至M^A接头(例如，结合至M^A接头中的氨基酸)。反应性基团是可以被活化的PEG分子结合的那些(例如，游离氨基或羧基基团)。在一些实施方案中，N-端氨基酸和赖氨酸(K)具有一个游离氨基基团；且C-端氨基酸残基具有一个游离羧基基团。巯基(例如，如在半胱氨酸残基上发现的)也可以用作用于连接PEG的反应性基团。在一些实施方案中，所述PEG单元可以通过使用具有不同反应性部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)连接至M^A接头(例如，连接至M^A接头中的氨基酸)，包括但不限于琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、mPEG-亚氨酸酯、对硝基苯基碳酸酯(NPC)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和氰尿酰氯。mPEG的例子包括但不限于mPEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG₂-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG₂-SS)、mPEG-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG₂-琥珀酰亚胺基碳酸酯(mPEG₂-SC)、mPEG-亚氨酸酯、mPEG-对硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-亚氨酸酯、mPEG₂-对硝基苯基碳酸酯(mPEG₂-NPC)、mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG₂-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG₂-SPA)、mPEG-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG-NHS)、mPEG₂-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG₂-NHS)、mPEG-氰尿酰氯、mPEG₂-氰尿酰氯、mPEG₂-赖氨醇-NPC和mPEG₂-Lys-NHS。可以使用多个PEG种类，并且可以使用基本上任何合适的反应性PEG试剂。在一些实施方案中，所述反应性PEG试剂在连接至多功能接头或M^A接头(例如，连接至M^A接头中的氨基酸)后将导致氨基甲酸酯或酰胺键的形成。所述反应性PEG试剂包括但不限于mPEG₂-N-羟基-琥珀酰亚胺(mPEG₂-NHS)、双功能的PEG丙醛(mPEG₂-ALD)、多臂PEG、含有马来酰亚胺的PEG(mPEG(MAL)₂、mPEG₂(MAL))、mPEG-NH₂、mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、mPEG丁酸的琥珀酰亚胺(mPEG-SBA)、mPEG-硫代酸酯、mPEG-双酯、mPEG-BTC、mPEG-丁缩醛D、mPEG-乙醛二乙基缩醛(mPEG-ACET)、异功能PEG(例如，NH₂-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-乙烯基砜(NHS-PEG-VS)或NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE^TM系列的多臂PEG(包括通过本领域技术人员选择的化学法活化的基于甘油的PEG)、任何SUNBRITE活化的PEG(包括但不限于羧基-PEG、p-NP-PEG、三氟乙磺酰基-PEG、醛PEG、缩醛-PEG、氨基-PEG、硫醇-PEG、马来酰亚胺基-PEG、羟基-PEG-胺、氨基-PEG-COOK羟基-PEG-醛、羧酸酸酐型-PEG、官能化的PEG-磷脂和其它类似的和/或合适的反应性PEG。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基、至少12个亚基、至少13个亚基、至少14个亚基、至少15个亚基、至少16个亚基、至少17个亚基、至少18个亚基、至少19个亚基、至少20个亚基、至少21个亚基、至少22个亚基、至少23个亚基或至少24个亚基。在某些这样的实施方案中，所述PEG单元包含不超过约72个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基、至少12个亚基、至少13个亚基、至少14个亚基、至少15个亚基、至少16个亚基、至少17个亚基、至少18个亚基、至少19个亚基或至少20个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基、至少12个亚基、至少13个亚基、至少14个亚基、至少15个亚基、至少16个亚基、至少17个亚基或至少18个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基、至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基或至少12个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少8个亚基、至少9个亚基、至少10个亚基、至少11个亚基或至少12个亚基。

在一些实施方案中，所述PEG单元包含至少6个亚基、至少7个亚基或至少8个亚基。

在一些实施方案中，直链PEG单元是：

其中；

指示与M^A接头(例如，与M^A接头中的氨基酸)的连接点；

Y₇₁是PEG连接单元；

Y₇₂是PEG加帽单元；

Y₇₃是PEG偶联单元(即，用于将多个PEG亚基链偶联在一起)；

d₉是2至72的整数；

每个d₁₀独立地是1至72的整数；且

d₁₁是2至5的整数。

在一些实施方案中，d₉是2至24的整数。在一些实施方案中，d₉是4至24的整数。在一些实施方案中，d₉是6至24、8至24、10至24，或12至24的整数。

在一些实施方案中，在所述PEG单元中存在至少6个PEG亚基。在一些实施方案中，在所述PEG单元中存在至少8个PEG亚基。在一些实施方案中，在所述PEG单元中存在至少10个PEG亚基。在一些实施方案中，在所述PEG单元中存在至少12个PEG亚基。

在一些实施方案中，d₉是8或约8、12或约12、24或约24。

在一些实施方案中，每个Y₇₂独立地是-C_1-10烷基、-C_2-10烷基-CO₂H、-C_2-10烷基-OH、-C_2-10烷基-NH₂、-C_2-10烷基-NH(C_1-3烷基)或C_2-10烷基-N(C_1-3烷基)₂。

在一些实施方案中，Y₇₂是-C_1-10烷基、-C_2-10烷基-CO₂H、-C_2-10烷基-OH或-C_2-10烷基-NH₂。

在一些实施方案中，所述PEG偶联单元是所述PEG单元的一部分，并且是用于连接重复CH₂CH₂O-亚基的两个或更多个链的非PEG物质。在一些实施方案中，所述PEG偶联单元Y₇₃是-C_2-10烷基-C(O)-NH-、-C_2-10烷基-NH-C(O)-、-C_2-10烷基-NH-、-C_2-10烷基-C(O)-、-C_2-10烷基-O-或-C_2-10烷基-S-。

在一些实施方案中，每个Y₇₃独立地是-C_1-10烷基-C(O)-NH-、-C_1-10烷基-NH-C(O)-、-C_2-10烷基-NH-、-C_2-10烷基-O-、-C_1-10烷基-S-或-C_1-10烷基-NH-。

在一些实施方案中，所述PEG连接单元是所述PEG单元的一部分，并且用于将所述PEG单元连接至M^A接头(例如，连接至在M^A接头中的氨基酸)。在一些实施方案中，所述氨基酸具有与所述PEG单元形成键的官能团。在一些实施方案中，用于将所述PEG单元连接至氨基酸的官能团包括形成二硫键或硫醚键的巯基，形成腙键的醛、酮或肼基团，形成肟键的羟胺，形成肽键的羧基或氨基基团，形成酯键的羧基或羟基基团，形成磺酰胺键的磺酸，形成氨基甲酸酯键的醇，和形成磺酰胺键或氨基甲酸酯键或酰胺键的胺。在一些实施方案中，所述PEG单元可以连接至氨基酸，例如，经由二硫化物、硫醚、腙、肟、肽、酯、磺酰胺、氨基甲酸酯或酰胺键。在一些实施方案中，用于连接PEG单元的反应可以是环加成、加成、添加/消除或取代反应或其组合(当适用时)。

直链PEG单元的例子包括：

/>

其中指示与多功能接头或M^A接头(例如，与在M^A接头中的氨基酸)的连接点，且每个d₉独立地是4至24、6至24、8至24、10至24、12至24、14至24，或16至24的整数。

在一些实施方案中，d₉是约8、约12或约24。

在一些实施方案中，d₉是约8。

在一些实施方案中，所述PEG单元是约300Da至约5kDa；约300Da至约4kDa；约300Da至约3kDa；约300Da至约2kDa；或约300Da至约1kDa。在一些实施方案中，所述PEG单元具有至少6个亚基或至少8、10或12个亚基。在一些实施方案中，所述PEG单元具有至少6个亚基或至少8、10或12个亚基，但是不超过24个亚基。

在一些实施方案中，合适的聚乙二醇可以在所述聚合物分子的每一个末端处具有一个游离羟基基团，或可以具有用低级烷基(例如，甲基基团)醚化的一个羟基基团。在一些实施方案中，合适的聚乙二醇是具有可酯化的羧基基团的聚乙二醇的衍生物。在一些实施方案中，聚乙二醇可以在商业名称PEG下商购获得，通常作为通过平均分子量表征的聚合物的混合物。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约300至约5000的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇具有约600至约1000的平均分子量。

在一些实施方案中，适用于本文公开的缀合物、支架和方法的亲水基团的例子可以参见例如US 8,367,065第13列、US 8524696第6列、WO2015/057699和WO 2014/062697，其各自的内容特此通过引用整体并入。

抗体

在一些实施方案中，包含核心-N-乙酰基葡糖胺取代基(核心-GlcNAc部分)的糖蛋白是包含核心-N-乙酰基葡糖胺取代基(核心-GlcNAc部分)的抗体。在一些实施方案中，所述糖蛋白是单克隆抗体(mAb)IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述抗体是lgG1抗体。在一些实施方案中，当所述抗体是完整抗体时，所述抗体在每条重链上包含一个或多个(例如，一个)核心-GlcNAc部分，所述核心-GlcNAc部分任选地被岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述完整抗体包含两个或更多个(例如，两个)任选地岩藻糖基化的核心-GlcNAc部分。在一些实施方案中，当所述抗体是单链抗体或抗体片段(例如Fab或Fc片段)时，所述抗体包含一个或多个核心-GlcNAc部分，其任选地被岩藻糖基化。在所述抗体包含核心-GlcNAc部分的某些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分可以位于所述抗体上的任何地方，前提条件是，所述取代基不阻碍所述抗体的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分存在于所述抗体的天然N-糖基化位点处。在一些实施方案中，所述抗体包含或被工程改造成包含、至少一个化学反应性基团或化学反应性的氨基酸部分或侧链。

在一些实施方案中，所述抗体能够将所述缀合物引导至特定组织、细胞或细胞中的位置。在一些实施方案中，所述抗体能够在培养物或整个生物体或两者中引导所述缀合物。在一些实施方案中，所述抗体包含其以有效的特异性、亲和力和亲合力结合的存在于靶细胞的细胞表面上的配体。在一些实施方案中，所述抗体将所述缀合物引导至肝脏以外的组织。在一些实施方案中，所述抗体将所述缀合物引导至特定组织诸如肝、肾、肺或胰腺。在一些实施方案中，所述抗体将所述缀合物引导至靶细胞(例如，癌细胞)、在细胞(例如，癌细胞)上表达的受体、基质组织或与癌症相关的蛋白(例如，肿瘤抗原)。在一些实施方案中，可以靶向包含肿瘤脉管系统的细胞。在一些实施方案中，所述抗体能够将所述缀合物引导至特定类型的细胞，例如，特异性地靶向肝脏中的肝细胞而不是库普弗细胞。在一些实施方案中，所述抗体能够将所述缀合物引导至网状内皮或淋巴系统的细胞，或引导至专职吞噬细胞诸如巨噬细胞或嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，所述缀合物本身是有效的递送系统，而不需要特异性靶向。

在一些实施方案中，所述抗体能够将所述缀合物引导至细胞内的位置(例如，细胞核、细胞质或胞内体)。在一些实施方案中，所述抗体增强细胞与受体的结合，或向细胞核的细胞质转运以及核进入或从胞内体或其它细胞内囊泡的释放。

在一些实施方案中，所述缀合物包含本公开内容的B7-H4抗体或经修饰的B7-H4抗体。

B7-H4抗体

本公开内容提供了分离的结合B7-H4的抗体，所述B7-H4是I型跨膜蛋白，例如，存在于抗原呈递细胞(APC)的表面上。所述B7-H4抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、小鼠抗体、人抗体和包含本文中讨论的重链和/或CDR的轻链抗体。

在一些实施方案中，本公开内容的B7-H4抗体特异性地结合包含以下氨基酸序列的全长人B7-H4蛋白的表位：

在一些实施方案中，B7-H4抗体是人抗体。在一些实施方案中，B7-H4抗体调节B7-H4活性。在一些实施方案中，所述抗体是在接受所述抗体的受试者中诱导ADCC应答的抗体。在一些实施方案中，B7-H4抗体不抑制B7-H4的T细胞遏制活性。本公开内容的B7-H4抗体可以是例如全长抗体。可替换地，所述抗体可以是抗体片段，诸如Fab、Fab'或Fab'2片段或单链抗体(例如，scFv)。在一些实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。

在一些实施方案中，B7-H4抗体包含重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，B7-H4抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，B7-H4抗体包含两条重链，其中每条重链包含重链可变区和重链恒定区的至少一部分；和两条轻链，其中每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区的至少一部分。

在一些实施方案中，人B7-H4抗体包含一个或多个人恒定区。在一些实施方案中，所述人重链恒定区属于选自IgA、IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)和IgD的同种型。在一些实施方案中，所述人轻链恒定区属于选自κ(kappa)和λ(lambda)的同种型。在一些实施方案中，本文描述的人抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文描述的人抗体包含人IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，本文描述的人抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。在一些实施方案中，当需要效应子功能时，选择包含人IgGl重链恒定区或人IgG3重链恒定区的人B7-H4抗体。在一些实施方案中，当不需要效应子功能时，选择包含人IgG4或IgG2重链恒定区的人B7-H4抗体。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体的特征在于所述抗体的特定功能特征或性质。例如，所述抗体特异性地结合人B7-H4。通常，本公开内容的抗体以高亲和力结合B7-H4，例如以1x10^-7M或更小的K_D。本公开内容的抗-B7-H4抗体通常表现出以下特征中的一种或多种：

(a)以1x10^-7M或更小的K_D结合人B7-H4；和/或

(b)结合用B7-H4(例如人B7-H4)转染的人CHO细胞。

在一些实施方案中，所述抗体以5x10^-8M或更小的K_D结合人B7-H4、以2x10^-8M或更小的K_D结合人B7-H4、以5x10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4、以4x10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4、以3x10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4、以2x10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4或以1x10^-9M或更小的K_D结合人B7-H4。

评价所述抗体对B7-H4的结合能力的标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞计量术分析。通过本领域已知的标准测定，诸如通过ELISA、Scatchard和系统分析，也可以评估所述抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)。

潜在的治疗性mAb不仅必须与其靶标结合，而且还必须不存在“可开发性问题”诸如稳定性差或高聚集水平。我们描述了被认为与可开发性差有关的五个指标的指导值：互补性决定区(CDR)的总长度、表面疏水性的程度和量级、在CDR中的正电荷和负电荷以及在净重链和轻链表面电荷方面的不对称性。每种性质的指导截止值源自在CST中看到的值，并且提出了一种标记系统来鉴定不合格的候选物。

本公开内容的一种示例性的B7-H4抗体包括B7-H4_2F9(在本文中也被称作“B7-H4_2F9亲本抗体”、“2F9亲本抗体“或“亲本抗体”)，其公开于美国专利号8,609,816中，其内容特此通过引用整体并入。

潜在的治疗性mAb不仅必须与其靶标结合，而且还必须不存在“可开发性问题”诸如稳定性差、高聚集水平、低水平表达、低溶解度、共价完整性、构象和胶体不稳定性、高多特异性和高免疫原性。

根据B7-H4_2F9亲本抗体序列，分析了被认为与可开发性差有关的指标，例如，互补性决定区(CDR)的总长度、表面疏水性的程度和量级、在CDR中的正电荷和负电荷、在净重链和轻链表面电荷方面的不对称以及翻译后修饰(PTM)。B7-H4_2F9亲本抗体序列的这种可开发性分析揭示了三种潜在的序列倾向。具体地，B7-H4_2F9亲本抗体序列具有未配对的半胱氨酸残基、天冬氨酸异构化序列和甲硫氨酸氧化位点。这三种序列倾向中的每一种都可以创造潜在的开发，诸如抗体的稳定性、效能和同质性，并可以导致在下游开发中的复杂工艺。

为了解决B7-H4_2F9亲本抗体的潜在序列倾向，设计并生成了二十(20)种B7-H4_2F9变体，其解决了这些潜在的可开发性问题。这些变体抗体包括B7-H4_2F9V1、B7-H4_2F9V2、B7-H4_2F9V3、B7-H4_2F9V4、B7-H4_2F9V5、B7-H4_2F9V6、B7-H4_2F9V7、B7-H4_2F9V8、B7-H4_2F9V9、B7-H4_2F9V10、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V12、B7-H4_2F9V13、B7-H4_2F9V14、B7-H4_2F9V15、B7-H4_2F9V16、B7-H4_2F9V17、B7-H4_2F9V18、B7-H4_2F9V19和B7-H4_2F9V20。对20种变体中的每一种都进行了B7-H4结合、多特异性和其它性能的表征。

下面提供了本公开内容的单克隆B7-H4抗体的核酸和氨基酸序列。重链和轻链的互补性决定区(CDR)在下面呈现的氨基酸序列中带有下划线。如下所示的涵盖互补性决定区(CDR)的氨基酸根据IMGT编号系统进行定义(参见国际ImMunoGeneTics可在线得到:http://www.imgt.org/)。

B7-H4 2F9可变区

所有二十种B7-H4 2F9亲本变体(即，B7-H4_2F9V1至B7-H4_2F9V20)共享共同的轻链可变区(在本文中被称作B7-H4_2F9 V_L)。

在一些实施方案中，本公开内容的所有抗体包含轻链可变区，该区域包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列或由其组成。

B7-H4_2F9_V_L的V_L链(SEQ ID NO:50)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9_亲本的VH链(SEQ ID NO:1)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V1的VH链(SEQ ID NO:5)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V2的VH链(SEQ ID NO:8)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V3的VH链(SEQ ID NO:11)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V4的VH链(SEQ ID NO:14)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V5的VH链(SEQ ID NO:17)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V6的VH链(SEQ ID NO:20)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V7的VH链(SEQ ID NO:22)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V7可变重链在本文中也被称作XMT-1603可变重链。

B7-H4_2F9V8的VH链(SEQ ID NO:24)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V9的VH链(SEQ ID NO:26)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V10的VH链(SEQ ID NO:28)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V11的VH链(SEQ ID NO:30)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V12的VH链(SEQ ID NO:32)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V13的VH链(SEQ ID NO:34)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V14的VH链(SEQ ID NO:36)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V15的VH链(SEQ ID NO:38)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V16的VH链(SEQ ID NO:40)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V17的VH链(SEQ ID NO:42)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V18的VH链(SEQ ID NO:44)(在本文中也被称作XMT-1604VH)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V18可变重链在本文中也被称作XMT-1604可变重链。

B7-H4_2F9V19的VH链(SEQ ID NO:46)包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4_2F9V20的VH链(SEQ ID NO:48)包含以下氨基酸序列或由其组成：

CDR

下面表I总结了本公开内容的B7-H4抗体的CDR。

表I：重链和轻链的互补决定区的氨基酸序列.

本领域众所周知，独立于CDR1和/或CDR2结构域的CDR3结构域单独可以决定B7-H4抗体对同源抗原的结合特异性，并且可以基于共同的CDR3序列可预测地产生具有相同结合特异性的多种抗体。

在一些实施方案中，所述抗体包含来自非人抗体(诸如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中所述单克隆抗体能够特异性地结合B7-H4。在一些实施方案中，包含来自非人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的这样的创造性抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与对应的亲本非人抗体类似的结合亲和力。在一些实施方案中，所述单克隆抗体包含来自第一种人抗体(诸如、例如，从非人动物得到的人抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中所述第一种人抗体能够特异性地结合B7-H4且其中来自所述第一种人抗体的CDR3结构域替换对B7-H4缺乏结合特异性的人抗体中的CDR3结构域以产生能够特异性地结合B7-H4的第二种人抗体。在一些实施方案中，包含来自第一种人抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特征；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有与对应的亲本第一种人抗体类似的结合亲和力。

B7-H4 2F9恒定区

本公开内容的B7-H4 2F9亲本抗体和20种变体具有轻链恒定区，该区域包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4 2F9轻链恒定区(SEQ ID NO:51)在本文中也被称作B7-H4 2F9 LC。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体包含轻链，其包含轻链可变区氨基酸序列和轻链恒定区氨基酸序列或由其组成。本公开内容的抗体轻链(可变区和恒定区)包含SEQID NO:52的氨基酸序列或由其组成。

本公开内容的B7-H4 2F9亲本抗体和20种变体具有IgG1重链恒定区，该区域包含以下氨基酸序列或由其组成：

B7-H4 2F9IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:6)在本文中也被称作B7-H4 2F9 HC。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:6或由其组成的IgG1重链恒定区进一步在N-端或C-端处包含一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，所述IgG1重链恒定区包含C-端赖氨酸。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体包含重链，所述重链包含重链可变区氨基酸序列和重链恒定区氨基酸序列或由其组成。本公开内容的抗体重链(可变区和恒定区)描述于表II和与本文一起提交的序列表中。

在一些实施方案中，本公开内容的抗体可以包含IgG2重链恒定区，其包含以下氨基酸序列或由其组成：

在一些实施方案中，本公开内容的抗体可以包含IgG4重链恒定区，其包含以下氨基酸序列或由其组成：

表II.抗体重链氨基酸序列(重链可变区+IgG1重链恒定区)

具体实施方案在又另一个实施方案中，本公开内容的B7-H4抗体包含重链和轻链可变区，所述重链和轻链可变区包含与本文描述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本公开内容的抗-B7-H4抗体的所需功能性能。例如，本公开内容提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)所述重链可变区包含与选自SEQ ID NO:44、22、30、40和42的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(b)所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)所述抗体以1x10^-7M或更小的K_D结合人B7-H4；且

(d)所述抗体结合用B7-H4转染的人CHO细胞。

在各种实施方案中，所述抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在其它实施方案中，所述VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。包含与上述序列的VH和VL区域具有高(即80％或更大)同源性的VH和VL区域的B7-H4抗体可以如下得到：诱变(例如，定位或PCR介导的诱变)编码在SEQ ID NO:44、22、30、40和42中所示的氨基酸序列的核酸分子，然后使用本文描述的功能测定试验所编码的改变的抗体的保留功能(即，上文(c)和(d)中所示的功能)。在一个优选的实施方案中，所述重链可变区CDR2序列包含特定氨基酸序列，其选自SEQ ID NO:44、22、30、40和42的氨基酸序列及其保守修饰；且所述轻链可变区CDR2序列包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守修饰。在另一个优选的实施方案中，所述重链可变区CDRl序列包含特定氨基酸序列，其选自SEQ ID NO:44、22、30、40和42的氨基酸序列及其保守修饰；且所述轻链可变区CDRl序列包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守修饰。

在一些实施方案中，所述抗体与本公开内容的任何B7-H4单克隆抗体(即，具有与本公开内容的任何单克隆抗体交叉竞争对B7-H4的结合的能力的抗体)结合在人B7-H4上的相同表位。

因此，本公开内容的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含含有分别选自SEQ ID NO:44、22、30、40和42的氨基酸序列的CDRl、CDR₂和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别含有SEQID NO:53、54和55的氨基酸序列的CDRl、CDR₂和CDR3序列。

因此，在另一个实施方案中，本公开内容提供了分离的抗-B7-H4单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，该区域包含：(a)VH CDRl区域，其包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:2相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区域，其包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:3相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区域，其包含选自SEQ IDNO:16、10或4的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:16、10或4相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有重链和轻链，所述重链的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:45、23、31、41或43的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性，所述轻链的氨基酸序列与选自SEQID No:52的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有重链和轻链氨基酸序列的组合，其选自：(i)与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列；(ii)与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列；(iii)与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列；(iv)与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列；和(v)与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有与SEQ ID NO:43的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有重链和轻链，所述重链具有选自SEQID NO:45、23、31、41或43的氨基酸序列，所述轻链具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有重链和轻链氨基酸序列的组合，其选自：(i)SEQ ID NO:45的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；(ii)SEQ IDNO:23的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；(iii)SEQ ID NO:31的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO:41的重链氨基酸序列和SEQID NO:52的轻链氨基酸序列；和(v)SEQ ID NO:43的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:45的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:23的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:31的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:41的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:43的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:52的轻链氨基酸序列。

本文公开的抗体含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:44、22、30、40或42的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性，所述轻链可变区的氨基酸序列与由SEQ ID NO:50组成的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性。

在一些实施方案中，本文公开的抗体的三个重链CDR包括：重链互补性决定区1(CDRH1)，其包括与包含SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；重链互补性决定区2(CDRH2)，其包括与包含SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和重链互补性决定区3(CDRH3)，其包括与选自SEQ ID NO:16、10或4的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和与SEQ ID NO:45、23、31、41或43的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列。

本文公开的抗体的三个轻链CDR包括：轻链互补性决定区1(CDRL1)，其包括与包含SEQ ID NO.53的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；轻链互补性决定区2(CDRL2)，其包括与包含SEQ ID NO:54的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和轻链互补性决定区3(CDRL3)，其包括与包含SEQ ID NO:55的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。

所述抗体包括重链CDR和轻链CDR序列的组合，其包括：CDRH1，其包括与包含SEQID NO:2的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRH2，其包括与包含SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRH3，其包括与选自SEQ ID NO:16、10或4的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRL1，其包括与选自SEQ ID NO:53的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；CDRL2，其包括与SEQ ID NO:54的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和CDRL3，其包括与SEQ ID NO:55的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的氨基酸序列；和与SEQ ID NO:45、23、31、41或43的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％98％、99％或更多同一性的重链氨基酸序列。

本文公开的抗体的三个重链CDR包括：CDRH1，其包括选自SEQ ID NO:2的氨基酸序列；CDRH2，其包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；和CDRH3，其包括选自SEQ ID NO:10或16的氨基酸序列；和选自SEQ ID NO:45或23的重链氨基酸序列。

本文公开的抗体的三个轻链CDR包括：CDRL1，其具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列；CDRL2，其具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列；和CDRL3，其具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列。本文公开的抗体包括重链CDR和轻链CDR序列的组合，其包括：CDHR1，其包括包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列；CDRH2，其包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；CDRH3，其包括包含SEQID NO:10或16的氨基酸序列；CDRL1，其具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列；CDRL2，其具有SEQID NO:54的氨基酸序列；和CDRL3，其具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列；和SEQ ID NO:45或23的重链氨基酸序列。本文公开的抗体含有重链互补性决定区和轻链互补性决定区氨基酸序列的组合，其选自：(i)SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:16的CDRH3的氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2的氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ ID NO:45的重链氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:10的CDRH3的氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2的氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ ID NO:23的重链氨基酸序列；(iii)SEQ IDNO:2的CDRH1的氨基酸序列、SEQ ID NO:3的CDRH2的氨基酸序列、SEQ ID NO:4的CDRH3的氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2的氨基酸序列、SEQ IDNO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ ID NO:31的重链氨基酸序列；(iv)SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQ ID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:4的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2的氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ ID NO:41的重链氨基酸序列和(v)SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQ IDNO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:10的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2的氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ IDNO:43的重链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:3的CDRH2的氨基酸序列、SEQ ID NO:16的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQID NO:45的重链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:10的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2氨基酸序列、SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列和SEQ IDNO:23的重链氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:4的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文中公开的抗体含有SEQ ID NO:2的CDRH1氨基酸序列、SEQID NO:3的CDRH2氨基酸序列、SEQ ID NO:10的CDRH3氨基酸序列、SEQ ID NO:53的CDRL1氨基酸序列、SEQ ID NO:54的CDRL2氨基酸序列和SEQ ID NO:55的CDRL3氨基酸序列。

本文中公开的优选抗体包括，例如，B7-H4-2F9V7(在本文中也被称作XMT 1603抗体)和B7-H4-2F9V18(在本文中也被称作XMT 1604抗体)。这些抗体显示出对人B7-H4的特异性，并且它们已经被证明在体外抑制B7-H4的功能活性。

B7-H4抗体的生产

例如，使用本文提供的实施例中描述的方法，产生B7-H4抗体。可替换地或另外，本领域已知的各种程序可以用于产生针对B7-H4或针对其衍生物、片段、类似物同系物或直系同源物的单克隆抗体。(参见，例如，Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E，和LaneD,1988,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Kozbor，等人,1983Immunol Today 4:72)；Cole，等人,1985，见：MONOCLONAL ANTIBODIES _AND C_ANCERT_HERAPY,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页；Cote，等人,1983.Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030；Cole，等人,1985，见：M_ONOCLONAL A_NTIBODIES _AND C_ANCER T_HERAPY,Alan R.Liss,Inc.，第77-96页；它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。

本文中公开的单克隆抗体包括全人抗体或人源化抗体。这些抗体适合施用给人类，而不引起人针对所施用的免疫球蛋白的免疫应答。例如，使用仅含有人序列的抗体使用噬菌体展示方法，开发人源化的或全人的B7-H4抗体。这样的方案是本领域众所周知的，例如，在WO92/01047和美国专利号6,521,404中，它们特此通过引用并入。

通过众所周知的技术，诸如使用蛋白A或蛋白G的亲和色谱法(其主要提供免疫血清的IgG级分)，纯化抗体。随后，或可替换地，可以将作为所寻求的免疫球蛋白的靶标的具体抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和色谱法纯化免疫特异性抗体。例如D.Wilkinson(The Scientist，出版商为The Scientist,Inc.,Philadelphia PA，第14卷，第8期(2000年4月17日)，第25-28页；通过引用并入本文)讨论了免疫球蛋白的纯化。

本发明还包括F_v、F_ab、F_ab’和F_(ab’)2抗-B7-H4片段或抗-B7-H4片段、单链抗-B7-H4抗体、其中至少一个臂结合B7-H4的多特异性抗体和异源缀合物抗-B7-H4抗体。

双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。在该情况下，结合特异性之一是针对B7-H4。第二结合靶标是任何其它抗原，包括细胞-表面蛋白或受体或受体个亚基。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537-539(1983))。

可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’)₂双特异性抗体)。在文献中已经描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。

考虑了具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)。

示例性的双特异性抗体可以结合两个不同的表位，其中至少一个表位源自本文公开的蛋白抗原。可替换地，免疫球蛋白分子的抗-抗原臂可以与特定臂组合，所述特定臂结合在白细胞上的触发分子诸如T细胞受体分子(例如，CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，从而将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂引导至表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂和结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。另一种感兴趣的双特异性抗体结合本文描述的蛋白抗原并进一步结合组织因子(TF)。

异源缀合抗体也在本发明范围内。异源缀合抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出这样的抗体将免疫系统细胞靶向不希望的细胞(参见美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。考虑到，使用合成蛋白化学中的已知方法(包括涉及交联剂的那些方法)，可以在体外制备所述抗体。例如，使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键，可以构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁亚氨酸甲酯以及例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。

可能需要在效应子功能方面修饰本文公开的抗体，从而增强例如抗体在治疗与异常的B7-H4表达和/或活性相关的疾病和病症中的有效性。例如，可以将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许在该区域形成链间二硫键。由此产生的同源二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人,J.Exp Med.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992))。可替换地，可以工程改造具有双Fc区的抗体，并从而可以具有增强的补体裂解和ADCC能力(参见Stevenson等人,Anti-Cancer Drug Design,3:219-230(1989))。

半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体

在一些实施方案中，所述半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体将包含肽接头的缀合物引导至特定组织、细胞或细胞中的位置。在一些实施方案中，所述半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体包含经工程改造的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述B7-H4半胱氨酸工程改造的抗体或抗体片段是B7-H4抗体或抗体片段，其中对应的亲本抗体或抗体片段(例如，对应的野生型B7-H4抗体或抗体片段)的一个或多个氨基酸被半胱氨酸(例如，经工程改造的半胱氨酸)置换。在一些实施方案中，所述亲本B7-H4抗体或抗体片段是本文描述的那些。

在一些实施方案中，将所述B7-H4抗体工程改造以形成所述半胱氨酸工程改造的抗体。在一些实施方案中，所述半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体或抗体片段保留其对应的野生型B7-H4抗体或抗体片段的抗原结合能力。在一些实施方案中，所述半胱氨酸工程改造的抗体或抗体片段能够结合其对应的野生型B7-H4抗体或抗体片段的一种或多种抗原。

在一些实施方案中，所述经工程改造的半胱氨酸不是链内或链间二硫键单元的一部分。在一些实施方案中，所述经工程改造的半胱氨酸含有可与亲电子官能团反应的游离硫醇基团。在一些实施方案中，在B7-H4抗体或抗体片段表面上的经工程改造的半胱氨酸(例如，其游离硫醇基团)可以允许B7-H4抗体或抗体片段与包含硫醇-反应性基团(例如，马来酰亚胺或卤代乙酰基)的接头-药物部分缀合。

应当理解，用半胱氨酸置换在B7-H4抗体或抗体片段中的一个或多个非半胱氨酸氨基酸可以产生一个或多个经工程改造的半胱氨酸作为缀合可用位点。在一些实施方案中，通过用半胱氨酸置换在B7-H4抗体或抗体片段中的非半胱氨酸氨基酸，反应性硫醇基团被定位为所述抗体或抗体片段的可及位点并且可以用于将所述抗体或抗体片段缀合至其它部分(例如，药物部分或接头-药物部分)，并产生本公开内容的缀合物。在一些实施方案中，用半胱氨酸置换在亲本B7-H4抗体或抗体片段的轻链的V205(Kabat或EU编号)或重链的A118或S442(EU编号)处的氨基酸。在一些实施方案中，可以如例如美国专利号7,521,541中所述产生半胱氨酸工程改造的抗体。

在一些实施方案中，通过经由工程改造的半胱氨酸的巯基和接头-药物部分的官能团形成共价键，将半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体缀合至接头-药物部分。

经修饰的B7-H4抗体

在一些实施方案中，所述B7-H4抗体是经修饰的B7-H4抗体。

在经修饰的B7-H4抗体的某些实施方案中，*表示与经修饰的B7-H4抗体的其余部分的直接或间接连接。在一些实施方案中，S”是糖或衍生化的糖。在一些实施方案中，A”是能够与接头-药物部分的官能团形成共价键的官能团。在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体在缀合之前包含^＊-S"-A"的糖-衍生物部分。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体在区域290-305中(例如，在N297处；EU编号)包含天冬酰胺基团。在一些实施方案中，所述糖-衍生物部分直接地或间接地连接至天冬酰胺基团(例如，在N297处)。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体在缀合之前包含经修饰的-GlcNAc部分,^＊*GlcNAcS"-A"其中GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺。

在一些实施方案中，所述经修饰的-GlcNAc部分经由GlcNAc的C1位置连接至经修饰的B7-H4抗体的其余部分。在一些实施方案中，所述经修饰的-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。

在一些实施方案中，所述经修饰的-GlcNAc部分直接地或间接地连接至天冬酰胺基团(例如，在N297处)。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体经由在A”和接头-药物部分的官能团之间形成的共价键缀合至接头-药物部分。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的B7-H4抗体通过包含以下步骤的方法得到：

(a)使包含B7-H4抗体和核心-GlcNAc部分的糖蛋白(例如，B7-H4抗体聚糖)与内切糖苷酶接触，由此形成包含所述抗体和末端-GlcNAc部分的中间体抗体，且任选地，所述末端-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖；和

(b)在有糖基转移酶存在下，使所述中间体抗体与具有P"-S"-A"的结构的化合物接触，由此形成包含所述抗体和经修饰的-GlcNAc部分^＊-GlcNAc-S"-A"的经修饰的B7-H4抗体，且任选地，所述经修饰的-GlcNAc部分经由GlcNAc的C1位置连接至经修饰的B7-H4抗体的其余部分；其中

GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；

S”是糖或衍生化的糖；

A”是叠氮基、酮或炔基；且

P”是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)或胞苷二磷酸(CDP)。

在一些实施方案中，依次进行步骤(a)和(b)。在一些实施方案中，并行地进行步骤(a)和(b)。

在一些实施方案中，所述抗体聚糖包含糖型G0、Gl、G2、G0F、GIF、G2F和M5的混合物(例如，在图1中所示的糖型)。

在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体(mAb)。

在一些实施方案中，所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体，例如，IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgGl抗体。

在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体，且所述抗体聚糖包含一个或多个核心-GlcNAc部分。

在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体，且所述抗体聚糖包含连接至所述抗体的每条重链的一个或多个核心-GlcNAc部分。

在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分进一步包含岩藻糖。

在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体，且所述抗体聚糖包含连接至所述全长抗体的两个或更多个核心-GlcNAc部分。

在一些实施方案中，所述抗体是全长抗体，且所述抗体聚糖包含连接至所述全长抗体的两个核心-GlcNAc部分。

在一些实施方案中，所述两个或更多个核心-GlcNAc部分中的至少一个进一步包含岩藻糖。

在一些实施方案中，所述两个或更多个核心-GlcNAc部分中的每个进一步包含岩藻糖。

在一些实施方案中，所述抗体是单链抗体或B7-H4抗体片段(例如，Fab或Fc片段)，所述抗体聚糖包含连接至所述抗体的一个或多个核心-GlcNAc部分(其任选地进一步包含岩藻糖)。

在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分连接至所述抗体的一个位置，其中所述核心-GlcNAc部分基本上不阻碍所述抗体的抗原结合位点。

在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分连接至所述抗体的Fc片段。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分连接至CH结构域。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分连接至所述抗体的Fab或Fc片段。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分经由与所述抗体的天冬酰胺氨基酸的侧链中的酰胺氮原子的N-糖苷键连接至所述抗体。在一些实施方案中，所述核心-GlcNAc部分连接至所述抗体的天然N-糖基化位点。

在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体，且所述核心-GlcNAc部分连接至IgG的天然N-糖基化位点。

在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体，且所述核心-GlcNAc部分连接至IgG的天然N-糖基化位点(例如，IgG的N297 N-糖基化位点)。在一些实施方案中，所述N297 N-糖基化位点存在于IgG抗体的重链的保守Fc区中在区域290-305中的天冬酰胺处(例如，在N297处)。

在一些实施方案中，所述中间体抗体具有式(XXII)：

其中：

Ab是B7-H4抗体；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；Fuc是岩藻糖；u₃是0或1；且u₄是在1至16范围内的整数。

在一些实施方案中，u₄是在1至10范围内的整数。在一些实施方案中，u₄是1、2、3、4、5、6、7或8。在一些实施方案中，u₄是1、2、3、4、5或6。在一些实施方案中，u₄是1、2、3或4。在一些实施方案中，u₄是2或4。在一些实施方案中，u₄是1或2。在一些实施方案中，u₄是1。在一些实施方案中，u₄是2。

在一些实施方案中，所述抗体包含一个核心-GlcNAc部分(例如，u₄是1)。在一些实施方案中，所述抗体包含两个核心-GlcNAc部分(例如，u₄是2)。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体通过在方案1中所述的方法得到。如下面证实的，在有糖基转移酶存在下使包含一个末端-GlcNAc部分的式(XXIII)的中间体抗体与具有P″-S″-A″的结构的化合物接触，会提供包含一个经修饰的-GlcNAc部分的经修饰的B7-H4抗体(例如，式(XXIIIa)的经修饰的B7-H4抗体)。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体如下得到：在有糖基转移酶存在下使包含两个末端-GlcNAc部分的式(XXIV)的中间体抗体与具有P″-S″-A″的结构的化合物接触，提供包含两个经修饰的-GlcNAc部分的经修饰的B7-H4抗体(例如，式(XXIVa)的经修饰的B7-H4抗体)。

方案1

其中u₃、Ab、S”、A”和P”如本文中所定义。

在一些实施方案中，要在根据本公开内容的方法中修饰的抗体聚糖包含聚糖，所述聚糖包含核心-GlcNAc部分，即，存在于聚糖的非还原端处的GlcNAc部分。在一些实施方案中，所述聚糖包含一个或多个糖部分且可以是直链或支链。

在一些实施方案中，在与内切糖苷酶反应后，可以形成所述中间体抗体，其包含末端GlcNAc部分(例如，式(XXIII)或(XXIV)的中间体抗体)。

在一些实施方案中，所述方法的步骤(a)(去糖基化或修剪)如在图2中所示，其中将抗体糖型G2F、GIF、G0F、G2、Gl、G0和M5(例如，参见图1)和可能的另外糖型(例如，三天线聚糖)的混合物转化成包含末端GlcNAc部分的中间体抗体，所述末端GlcNAc部分任选地包含岩藻糖(例如，u₃是0或1)。在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是内切糖苷酶Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或它们的组合。

在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49或它们的组合。

在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo S或Endo SH或它们的组合。

在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo SH。

在一些实施方案中，所述方法的步骤(b)(经修饰的B7-H4抗体的形成)如在图3中所示，其中所述中间体抗体包含一个单克隆抗体(mAb)和在所述单克隆抗体(mAb)的每条重链上的一个末端GlcNAc部分(其任选地包含岩藻糖(例如，u₃是0或1))。在一些实施方案中，在步骤(b)中，将所述末端-GlcNAc部分转化成经修饰的-GlcNAc部分。在一些实施方案中，所述转化可以通过在有糖基转移酶存在下末端GlcNAc部分与P"S"-A'的化合物的反应来实现。

在一些实施方案中，所述P"-S"A"的化合物是GalNAz-UDP(例如，4-AzGalNAc-UDP)。在一些实施方案中，所述末端-GlcNAc部分是*-GlcNAc-GalNAz或*-GlcNAc(Fuc)-GalNAz，其中*表示与经修饰的B7-H4抗体的其余部分的连接。

在一些实施方案中，依次进行去糖基化/修剪的步骤和经修饰的B7-H4抗体的形成的步骤。

在一些实施方案中，同时进行去糖基化/修剪的步骤和经修饰的B7-H4抗体的形成的步骤。

在一些实施方案中，在合适的缓冲溶液例如缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水、Tris缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、Tris和甘氨酸中执行用于制备经修饰的B7-H4抗体的方法。在一些实施方案中，所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Tris缓冲盐水。在一些实施方案中，所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在一些实施方案中，在约4至约50℃范围内的温度执行所述方法。在一些实施方案中，在约10至约45℃范围内的温度执行所述方法。在一些实施方案中，在约20至约40℃范围内的温度执行所述方法。在一些实施方案中，在约30至约37℃范围内的温度执行所述方法。在一些实施方案中，在约30℃的温度执行所述方法。在一些实施方案中，在30℃的温度执行所述方法。

在一些实施方案中，在约5至约9(例如，约5.5至约8.5、约6至约8，或约7至约8)范围内的pH值执行所述方法。在一些实施方案中，在约7.4的pH值执行所述方法。

在一些实施方案中，用于制备经修饰的B7-H4抗体的方法如在图4中所示。在一些实施方案中，用于制备经修饰的B7-H4抗体的方法包含：

(a)使包含B7-H4抗体和连接至所述抗体的位点N297的核心-GlcNAc部分的糖蛋白(例如，B7-H4抗体聚糖)与内切糖苷酶Endo SH接触，由此形成包含末端GlcNAc部分的中间体抗体；和

(b)在有β-(l,4)-GalNAcT酶存在下使所述中间体抗体与4-AzGalNAc-UDP接触，由此形成包含经修饰的-GlcNAc部分的经修饰的B7-H4抗体；

其中并行地进行步骤(a)和(b)。

在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo SH，即两种内切糖苷酶Endo S和EndoH之间的融合体，二者通过包含内部6xHis标签的富含Gly的间隔物连接，从而产生139kDa的总分子量。

在一些实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶包含N-端6xHis标签且具有45.7kDa的总分子量。在一些实施方案中，含有N-端6xHis标签的β-(l,4)-GalNAcT酶衍生自粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)。

在一些实施方案中，在PBS缓冲液中在约7.4的pH值和在约30℃的温度进行所述方法。

内切糖苷酶

内切糖苷酶是能够切割聚糖结构中的内部糖苷键从而改造或修剪所述聚糖结构的酶。例如，当内切糖苷酶在保守的聚糖区域内的可预测位点处切割时，内切糖苷酶可以用于轻松地匀浆化异质聚糖群体。一类内切糖苷酶包含内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(EC3.2.1.96，通常称为Endo S或ENG酶)，这是一类通过水解Ν,Ν'-二乙酰基壳二糖核心中的β-l,4-糖苷键而从糖蛋白中除去N-聚糖从而留下单个核心N-连接的GlcNAc残基的水解酶(描述于Wong等人.Chem.Rev.2011,111,4259，其通过引用整体并入本文)。内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶广泛存在于自然界中，具有常见的化学酶变体，包括：Endo D，其对少甘露糖具有特异性；Endo A和Endo H，其对高甘露糖具有特异性；Endo F亚型，其范围从高甘露糖到双天线复合物；和Endo M，其可以切割除岩藻糖基化的聚糖之外的大多数N-聚糖结构(高甘露糖/复杂型/杂合型)，并且对高甘露糖型寡糖的水解活性显著高于对复杂型和杂合型寡糖的水解活性。在一些实施方案中，这些ENG酶显示出对远端N-聚糖结构而非展示它的蛋白的特异性，这使得它们可用于在天然条件下从糖蛋白切割大多数N-连接的聚糖。

在一些实施方案中，内切糖苷酶Fl、F2和F3适合用于天然蛋白的去糖基化。EndoFl、F2和F3的键特异性提示蛋白的去糖基化的一般策略，其可以除去所有类别的N-连接的寡糖而不使蛋白变性。在一些实施方案中，双天线和三天线结构可以分别被内切糖苷酶F2和F3立即除去。在一些实施方案中，寡甘露糖和杂合结构可以被Endo F1除去。

Endo S是一种来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的分泌型内切糖苷酶，并且也属于糖苷水解酶家族18，如Collin等人(EMBO J.,2001,20,3046)所公开的，其通过引用整体并入本文。与上述ENG酶相比，Endo S具有更明确的特异性，并且仅特异性地切割人IgG的Fc结构域中的保守N-聚糖(迄今为止尚未鉴定出其它底物)，从而提示，酶和IgG之间的蛋白-蛋白相互作用提供了这种特异性。

Endo S49(也被称作Endo S2，描述于WO 2013/037824中，通过引用整体并入本文)分离自酿脓链球菌NZ131，并且是Endo S的同系物。Endo S49对天然IgG具有特异性内切糖苷酶活性，并且与Endo S相比切割更多种类的Fc聚糖。

Endo SH是通过富含Gly的间隔物连接的两种内切糖苷酶Endo S和Endo H之间的融合体。Endo SH特异性地切割在聚糖链的核心区域中的两个N-乙酰基葡糖胺(GluNAc)部分之间的N-连接的聚糖。

在一些实施方案中，用于将所述抗体去糖基化的内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3、Endo H、Endo M、Endo A或它们的组合。在一些实施方案中，用于将所述抗体去糖基化的内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3、Endo H或它们的组合。在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2或Endo S49。

在一些实施方案中，当要修剪的聚糖是复杂型的二天线结构时，所述内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或它们的组合。

在一些实施方案中，当所述糖蛋白是B7-H4抗体且要修剪的寡糖是复杂型的二天线结构并且存在于在N297处的IgG保守N-糖基化位点时，所述内切糖苷酶是Endo S、EndoSH、Endo S2、Endo S49、Endo Fl、Endo F2、Endo F3或它们的组合。在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo S、Endo SH、Endo S2、Endo S49或它们的组合。

在一些实施方案中，当所述糖蛋白是B7-H4抗体且要修剪的聚糖是复杂型的二天线结构并且不存在于在N297处的IgG保守N-糖基化位点时，所述内切糖苷酶是Endo Fl、Endo F2、Endo F3或它们的组合。

在一些实施方案中，当要修剪的聚糖是高甘露糖时，所述内切糖苷酶是Endo H、Endo M、Endo A、Endo F1或它们的组合。

在一些实施方案中，当所述糖蛋白是B7-H4抗体且要修剪的寡糖是高甘露糖并且复杂型的二天线结构存在于在N297处的IgG保守N-糖基化位点时，所述内切糖苷酶是EndoS、Endo SH、Endo S2、Endo S49或它们的组合。在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是EndoS或Endo SH。在一些实施方案中，所述内切糖苷酶是Endo SH。

在一些实施方案中，如本文中所定义的内切糖苷酶包含编码标签的序列以便于纯化。在一些实施方案中，所述标签包括但不限于FLAG-标签、聚(His)-标签、HA-标签、Myc-标签、SUMO-标签、GST-标签、MBP-标签或CBP-标签。在一些实施方案中，所述标签是6xHis标签。在一些实施方案中，所述标签在所述酶的C-端处或在内部残基处共价地连接至所述内切糖苷酶。在一些实施方案中，所述标签在所述酶的N-端处共价地连接至所述内切糖苷酶。在一些实施方案中，所述Endo SH是两种内切糖苷酶Endo S和Endo H之间的融合体，二者通过包含内部6xHis标签的富含Gly的间隔物连接，从而产生139kDa的总分子量。

糖基转移酶

形成经修饰的B7-H4抗体的方法包含在有糖基转移酶存在下用式S”(A”)-P”的化合物处理具有任选地岩藻糖基化的末端N-乙酰基葡糖胺(Gal-NAc)部分的去糖基化的/修剪的抗体，以形成经修饰的B7-H4抗体，其具有经由β-1,4-O-糖苷键在GalNAc部分的C1处键合至所述抗体的GlcNAc-S”(A”)取代基。

在一些实施方案中，所述糖基转移酶是β-l,4-半乳糖基转移酶(4Gal-T)、β-(1,4)-乙酰基半乳糖氨基转移酶(β-(l,4)-GalNAcT或GalNAcT)或其突变体。已经在许多生物中鉴定出β-(1,4)-乙酰基半乳糖氨基转移酶(β-(l,4)-GalNAcTs或GalNAcTs)，所述生物包括人类、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(Kawar等人,J.Biol.Chem.2002,277,34924，通过引用整体并入本文)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(Hoskins等人.Science 2007,316,1625，通过引用整体并入本文)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(Vadaie等人,J.Biol.Chem.2004,279,33501，通过引用整体并入本文)。

β-(l,4)-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶(β-(l,4)-GalNAcTs)是本领域已知的。在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT是催化N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)从尿苷二磷酸-GalNAc(UDP-GalNAc，也被称作GalNAc-UDP)向糖蛋白聚糖的末端GlcNAc部分转移的酶，其中GalNAc部分的C1经由β-1,4-O-糖苷键连接至所述抗体。在一些实施方案中，所述末端GlcNAc部分被岩藻糖基化。

在一些实施方案中，在本发明的方法中使用的β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自无脊椎动物β-(l,4)-GalNAcT酶，诸如、例如，是或衍生自起源于无脊椎动物物种的β-(l,4)-GalNAcT。所述β-(1,4)-GalNAcT酶可以是或可以衍生自本领域技术人员已知的任何无脊椎动物β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自这样的β-(l,4)-GalNAcT酶：其起源于线虫门(Nematoda)，诸如、例如，色矛纲(Chromadorea)或胞管肾纲(Secernentea)，或节肢动物门(Arthropoda)，诸如、例如，昆虫纲(Insecta)。在一些实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自这样的β-(l,4)-GalNAcT酶：其起源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、Caenorhabditis remanei、Caenorhabditisbriggsae、猪蛔虫(Ascaris suum)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、罗阿丝虫(Loa loa)、毕氏粗角猛蚁(Cerapachys biroi)、内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)、佛罗里达弓背蚁(Camponotus floridanus)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)或黑脉金斑蝶(Danausplexippus)(例如，来自秀丽隐杆线虫、猪蛔虫、粉纹夜蛾或黑腹果蝇)。在一些实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自起源于秀丽隐杆线虫、猪蛔虫或粉纹夜蛾的β-(l,4)-GalNAcT酶。在其它实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶是或衍生自起源于粉纹夜蛾的β-(l,4)-GalNAcT酶。

术语“衍生自”包含例如截短的酶、突变体酶、包含易于纯化的标签的酶或这些修饰的组合。因此衍生自是指通过分别置换、插入、删除或添加一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20个或更多个)氨基酸而具有从天然存在的β-(l,4)-GalNAcT酶改变的氨基酸序列。衍生自β-(l,4)-GalNAcT酶的β-(l,4)-GalNAcT酶在本文中也被称作衍生的β-(1,4)-GalNAcT酶或经修饰的β-(l,4)-GalNAcT酶或β-(l,4)-GalNAcT突变体酶。

在一些实施方案中，通过添加另外的N-或C-末端氨基酸或化学部分或者通过删除N-或C-末端氨基酸来修饰衍生的β-(l,4)-GalNAcT酶以增加稳定性、溶解度、活性和/或易于纯化。

在一些实施方案中，对所述β-(l,4)-GalNAcT酶通过删除N-端细胞质结构域和跨膜结构域进行修饰，被称作截短的酶。

其中一个或多个氨基酸已经被置换、添加或删除的β-(l,4)-GalNAcT酶在本文中也被称作突变体β-(l,4)-GalNAcT酶或衍生的β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，对所述β-(l,4)-GalNAcT酶通过删除N-端细胞质结构域和跨膜结构域进行修饰，并通过置换一个或多个氨基酸进行突变。一个或多个氨基酸的置换在本文中也被称作突变。包含一个或多个置换的氨基酸的酶也被称作突变体酶。

在一些实施方案中，当所述糖基转移酶是β-(l,4)-GalNAcT酶或截短的β-(l,4)-GalNAcT酶时，所述酶进一步包含一种或多种突变。在一些实施方案中，这些突变包括但不限于亮氨酸(Leu，也被称作L)、甲硫氨酸(Met，也被称作M)或丙氨酸(Ala，也被称作A)对在位置257处的异亮氨酸(He，也被称作I)的置换。在一些实施方案中，也包括组氨酸(His，也被称作H)对在位置312处的甲硫氨酸(Met，也被称作M)的置换。应当指出，本文中氨基酸位置的编号是基于野生型β-(l,4)-GalNAcT酶中的氨基酸位置的编号。当β-(l,4)-GalNAcT酶是例如截短的酶时，本文中用于指示氨基酸置换的位置的数字对应于在对应的野生型β-(l,4)-GalNAcT酶中的氨基酸位置的编号。

在一些实施方案中，所述糖基转移酶是包含突变体催化结构域的β(l,4)-GalT酶。

催化结构域可以具有在野生型酶中发现的氨基酸序列或具有与野生型序列不同的氨基酸序列。具有不同于野生型序列的氨基酸序列的催化结构域在本文中被称作突变体催化结构域。在一些实施方案中，所述突变可以包含单个氨基酸改变(例如，点突变)，或多个氨基酸改变(例如，1至10，或1至6，或1、2、3或4，或1或2个氨基酸)，或一个或多个氨基酸(例如，1至10，或1至6，或1、2、3或4，或1或2个氨基酸)的缺失或插入。在一些实施方案中，所述突变体催化结构域可以存在于全长酶例如β(l,4)-半乳糖基转移酶或α(l,3)-N-半乳糖基转移酶中，但是也可以存在于包含所述突变体催化结构域的多肽片段或重组多肽中，任选地与另外的氨基酸连接。

β(l,4)-半乳糖基转移酶I在本文中被称作GalT。这样的突变体GalT催化结构域公开于例如WO 2004/063344中，其通过引用整体并入本文。WO 2004/063344也公开了GalT的Tyr-289突变体和它们的制备方法。这些突变体被称作Y289L、Y289N或Y289I。

在一些实施方案中，所述GalT突变体催化结构域是Y289L、Y289N、Y289I、Y284L或R228K。在一些实施方案中，所述GalT突变体催化结构域是Y289L。在一些实施方案中，通过定位诱变方法可以产生GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalT Y289I、GalT Y289A、GalT Y289N和GalT Y289L突变体，所述定位诱变方法描述在例如WO2004063344、Qasba等人,Prot.Expr.Pur.2003,30,219和Qasba等人,J.Biol.Chem.2002,277,20833(都通过引用整体并入本文)中。在GalT Y289F中，在位置289处的酪氨酸氨基酸(Y)被苯基丙氨酸(F)氨基酸替换，在GalT Y289M中，所述酪氨酸被甲硫氨酸(M)氨基酸替换，在GalT Y289V中被缬氨酸(V)氨基酸替换，在GalT Y289G中被甘氨酸(G)氨基酸替换，在GalT Y289I中被异亮氨酸(I)氨基酸替换，和在Y289A中被丙氨酸(A)氨基酸替换。

在一些实施方案中，所述β-(l,4)-GalNAcT酶包含编码标签的序列以便于纯化。在一些实施方案中，所述标签包括但不限于FLAG-标签、聚(His)-标签、HA-标签、Myc-标签、SUMO-标签、GST-标签、MBP-标签或CBP-标签。在其它实施方案中，所述标签是6xHis标签。在一些实施方案中，所述标签在所述酶的C-端处共价地连接至所述β-(l,4)-GalNAcT酶。在一些实施方案中，所述标签在所述酶的N-端处共价地连接至所述β-(l,4)-GalNAcT酶。

在一些实施方案中，β-(l,4)-GalNAcT酶包含N-端6xHis标签且具有45.7kDa的总分子量。在一些实施方案中，所述含有N-端6xHis标签的β-(l,4)-GalNAcT酶衍生自粉纹夜蛾。

P”-S”-A”的分子

在一些实施方案中，用在制备本公开内容的经修饰的B7-H4抗体的方法中的P”-S”-A”分子可以是作为合适的半乳糖基转移酶催化剂的底物的任何糖衍生物核苷酸。

在一些实施方案中，S”-A”是糖衍生物部分，其中：

S”是糖或衍生化的糖；且A”是能够与接头-药物部分的官能团形成共价键的官能团。

在一些实施方案中，A”是叠氮基、酮或炔基部分。在一些实施方案中，A”是叠氮基或酮部分。在一些实施方案中，A”是叠氮基部分。在一些实施方案中，A”是-N³。在一些实施方案中，A”是酮部分。

在一些实施方案中，A”是-[C(R^8k)₂]_x2C(O)R^9k，其中：

R^9k是甲基或任选地被取代的C_2-24烷基；

每个R^8k独立地是氢、卤素或R^9k；且

x₂是在0至24范围内的整数。

在一些实施方案中，x₂是在0至10范围内的整数。在一些实施方案中，x₂是0、1、2、3、4、5或6。

在一些实施方案中，每个R^8k是氢。

在一些实施方案中，A”是炔基部分。在一些实施方案中，A”是末端炔基、环炔基或杂环炔基部分。在一些实施方案中，A”是末端炔基部分。在一些实施方案中，A”是环炔基部分。在一些实施方案中，A”是杂环炔基部分。

在一些实施方案中，A”是-[C(R^8k)₂]_x2-C≡C-R^8k基团，其中R^8k和x₂如本文中所定义。在一些实施方案中，A”是-[CH₂]_x2-C≡CH。

在一些实施方案中，S”-A”衍生自糖或衍生化的糖，例如，氨基糖或以其它方式衍生化的糖。在一些实施方案中，糖和衍生化的糖的例子包括但不限于半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、葡糖醛酸(Gcu)和岩藻糖(Fuc)。应当理解，氨基糖是其中羟基(OH)基团被胺基团替换的糖。氨基糖的例子包括但不限于N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。以其它方式衍生化的糖的例子包括但不限于葡糖醛酸(Gcu)和N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)。

在一些实施方案中，S”-A”衍生自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(Gcu)、岩藻糖(Fuc)或N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GlcNAc、Glc、Gal或GalNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GlcNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Glc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Gal或GalNAc。在一些实施方案中，S”-A”衍生自Gal。在一些实施方案中，S”-A”衍生自GalNAc。

在一些实施方案中，所述官能团A”可以以各种方式连接至S”。

在一些实施方案中，A”直接连接至在S”的糖或衍生化的糖的C2、C3、C4或C6位置处的碳原子(例如，而不是在对应位置处的羟基)。

在一些实施方案中，S”是岩藻糖或衍生化的岩藻糖，其缺少任何羟基C6位置。在一些实施方案中，当A”连接至岩藻糖或衍生化的岩藻糖的C6位置时，A”直接连接至在C6位置处的碳原子。

在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，且A”连接至S”的糖或衍生化的糖的C2、C4或C6位置。

在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，且A”直接连接至在S”的糖或衍生化的糖的C2、C3、C4或C6位置处的碳原子(例如，而不是在对应位置处的羟基)。在一些实施方案中，S”-A”是6-叠氮基岩藻糖(6-AzFuc)。在一些实施方案中，A”是叠氮基部分，且A”连接至氨基糖或衍生化的氨基糖的N-乙酰基部分(例如，通过用叠氮基乙酰基部分替换乙酰基部分)。在一些实施方案中，S”-A”是2-叠氮基乙酰氨基半乳糖(GalNAz)、6-叠氮基-6-脱氧半乳糖(6-AzGal)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖(6-AzGalNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰氨基半乳糖(4-AzGalNAc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰氨基半乳糖(6-AzGalNAz)、2-叠氮基乙酰氨基葡萄糖(GlcNAz)、6-叠氮基-6-脱氧葡萄糖(6-AzGlc)、6-叠氮基-6-脱氧-2-乙酰氨基葡萄糖(6-AzGlcNAc)、4-叠氮基-4-脱氧-2-乙酰氨基葡萄糖(4-AzGlcNAc)或6-叠氮基-6-脱氧-2-叠氮基乙酰氨基葡萄糖(6-AzGlcNAz)。在一些实施方案中，S”-A”是GalNAz、4-AzGalNAc、GlcNAz或6-AzGlcNAc。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)、(XXXIVc)或(XXIVd)的化合物或其盐。

在一些实施方案中，A”是酮，且A”直接连接至在S”的糖或衍生化的糖的C2位置处的碳原子(例如，而不是在对应位置处的羟基)。

在一些实施方案中，A”连接至氨基糖或衍生化的氨基糖的氮原子，例如，C2-衍生化的氨基糖。在一些实施方案中，所述衍生化的氨基糖包含-NC(O)-R^9k的一部分，其中R^9k是甲基或任选地被取代的C_2-24烷基(例如，乙基)。

在一些实施方案中，R^9k是乙基。

在一些实施方案中，S”-A”是2-脱氧-(2-氧代丙基)-半乳糖(2-酮-Gal)、2-N-丙酰基-半乳糖胺(2-N-丙酰基Gal-NAc)、2-N-(4-氧代戊酰基)-半乳糖胺(2-N-Lev-Gal)或2-N-丁酰基-半乳糖胺(2-N-丁酰基-GalNAc)。在一些实施方案中，S”-A”是2-ketoGalNAc或2-N-丙酰基-GalNAc。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVe)或(XXIVf)的化合物或其盐。

在一些实施方案中，A”是末端炔基、环炔基或杂环炔基。在一些实施方案中，A”连接至S”的C2-衍生化的氨基糖。

在一些实施方案中，S”-A”是2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVg)的化合物或其盐。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVd)的化合物或其盐。

在一些实施方案中，根据本领域已知的各种方法可以合成P”-S”-A”的化合物。

在一些实施方案中，通过将核苷单磷酸或核苷二磷酸P”连接至糖衍生物S"-A"来合成所述化合物，例如，如在以下文献中所公开：Wang等人(Chem.Eur.J.16:13343-13345(2010))，Piller等人(ACS Chem.Biol.7:753(2012))，Piller等人(Bioorg.Med.Chem.Lett.15:5459-5462(2005)，和PCT申请公开号WO/2009/102820，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，P”是核苷单磷酸或核苷二磷酸。在一些实施方案中，P”是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)或胞苷单磷酸(CMP)。在一些实施方案中，P”是尿苷二磷酸(UDP)。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)、(XXIVc)、(XXIVd)、(XXIVe)、(XXIVf)或(XXIVg)的化合物：

或其盐，其中：R^9k是C_2-24烷基基团。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是GalNAz-UDP(例如，式(XXIVb))、6-AzGal-UDP(例如，式(XXIVc))、6-AzGalNAc-UDP(例如，式(XXIVd))、4-AzGalNAz-UDP、6-AzGalNAz-UDP、6-AzGlc-UDP、6-AzGlcNAz-UDP、2-酮Gal-UDP(例如，式(XXIVe))、2-N-丙酰基GalNAc-UDP(例如，式(XXIVf)，其中R^9k是乙基)或2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP(例如，式(XXIVg))。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是GalNAz-UDP或4-AzGalNAc-UDP。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVb)或(XXIVd)的化合物。GalNAz-UDP(例如，式(XXIVb))和6-AzGalNAc-UDP(例如，式(XXIVd))的合成公开在Piller等人(Bioorg.Med.Chem.Lett.15:5459-5462(2005))和Wang等人(Chem.Eur.J.16:13343-13345(2010))中，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，P”-S”-A”是4-AzGalNAc-UDP。在一些实施方案中，P”-S”-A”是式(XXIVd)的化合物或其盐。2-酮Gal-UDP(XXIVe)的合成公开在Qasba等人(J.Am.Chem.Soc.125:16162(2003))及其支持信息中，它们二者通过引用整体并入本文。

2-(丁-3-炔酸酰氨基)-2-脱氧-半乳糖-UDP的合成公开在PCT申请公开号WO/2009/102820中，其通过引用整体并入本文。

可变的d₁₃

在一些实施方案中，d₁₃是在约2至约14、约2至约12、约2至约10、约2至约8、约2至约6、约2至约4、约4至约10、约4至约8、约4至约6、约6至约14、约6至约12、约6至约10、约6至约8、约8至约14、约8至约12，或约8至约10范围内的整数。

在一些实施方案中，d₁₃是在约2至约8范围内的整数。

在一些实施方案中，d₁₃是2、4、6或8。在一些实施方案中，d₁₃是2、6或8。在一些实施方案中，d₁₃是8。在一些实施方案中，d₁₃是6。在一些实施方案中，d₁₃是2。

B7-H4抗体-药物缀合物

在一些实施方案中，本公开内容的缀合物包含出现一次或多次的D，其中D是细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分，其中所述出现一次或多次的D可以相同或不同。

在一些实施方案中，出现一次或多次的B7-H4抗体或B7-H4修饰的抗体连接至接头-药物部分，其中所述出现一次或多次的B7-H4抗体或B7-H4修饰的抗体可以相同或不同。在一些实施方案中，包含出现一次或多次的D的一个或多个接头-药物部分连接至一个B7-H4抗体或B7-H4修饰的抗体。

在一些实施方案中，B7-H4抗体是B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体。

在一些实施方案中，可以将本文描述的靶向配体、接头和药物或前药片段组装进本公开内容的缀合物或支架中，例如根据公开的技术和方法。下面描述本公开内容的治疗性和靶向缀合物以及生产它们的方法作为非限制性实施例。

在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是10或更小(例如，8、6、4或2)。

在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是8或更小。

在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是8。在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是6。在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数或所述半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体(或连接点的总数)是5。在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是4。在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是3。在一些实施方案中，在接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间形成的硫键的总数(或连接点的总数)是2。

在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体之间的比率是在约1:1至约8:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间的比率是在约1:1至约6:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体之间的比率是在约1:1至约4:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间的比率是在约2:1至约2:1之间。

在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间的比率是在约6:1至约8:1之间。

在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体之间的比率是约8:1。

在一些实施方案中，接头-药物部分与B7-H4抗体之间的比率是约6:1。

在一些实施方案中，本公开内容也涉及一种接头-药物部分，其包含半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体和至少两个部分，其中每个部分能够缀合至B7-H4抗体中的硫醇基团从而形成蛋白-接头-药物缀合物。

在一些实施方案中，通过还原蛋白来产生B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的一个或多个硫醇基团。B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的一个或多个硫醇基团然后可以与一个或多个接头-药物部分反应，所述一个或多个接头-药物部分能够用所述接头-药物部分缀合至来自B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的硫醇基团。在一些实施方案中，连接至B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体的至少两个部分是马来酰亚胺基团。在这些实施方案中，D是细胞毒性药物部分或STING激动剂药物部分。

在一些实施方案中，通过用还原剂诸如DTT(Cleland氏试剂、二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)处理，可以活化所述抗体用于与接头-药物部分缀合。在一些实施方案中，可以用过量的TCEP还原全长单克隆抗体以还原二硫键(例如，在存在于对应的亲本抗体或半胱氨酸工程改造的抗体中的半胱氨酸之间)，从而产生所述抗体的还原形式。新引入的且未配对的半胱氨酸仍然可用于与接头-药物部分反应以形成本公开内容的抗体缀合物。在一些实施方案中，添加过量的接头-药物部分以实现缀合并形成抗体-药物缀合物，并且纯化所述缀合混合物以除去过量的接头-药物中间体和其它杂质。

在一些实施方案中，B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4与接头-药物部分的比率是在约1:1至约1:8之间；在约1:1至约1:6之间；在约1:1至约1:5之间；在约1:1至约1:4之间；在约1:1至约1:3之间；或在约1:1至约1:2之间。

本文公开的缀合物可以通过广泛渗滤来纯化(即，以除去任何起始材料)。如果必要的话，可以通过尺寸排阻色谱法进行额外的纯化以除去任何聚集的缀合物。一般而言，纯化后的缀合物通常含有小于5％(例如，<2％w/w)聚集的缀合物，如通过SEC测定的；小于0.5％(例如，<0.1％w/w)游离的(未缀合的)药物，如通过RP-HPLC测定的；小于1％携带药物的含肽支架，如通过SEC测定的；和小于2％(例如，<1％w/w)未缀合的B7-H4抗体，如通过HIC-HPLC测定的。

在一些实施方案中，缀合至STING激动剂药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4选自在表A1和表A2中描述的缀合物。

表A1

/>

其中d₁₃、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷、R¹⁸、R¹⁹、R^C1、R^C2、R⁴、X₃、X4、X₆、X₇、X₁、W₁、Y₁、Z₁、X₂、W₂、Y₂、Z₂如本文中所定义，且抗体是B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体。

在一些实施方案中，对于表A1中的缀合物，d₁₃是6至8的整数。

在一些实施方案中，对于表A1中的缀合物，d₁₃是8。在一些实施方案中，对于表A1中的缀合物，d₁₃是7。在一些实施方案中，对于表A1中的缀合物，d₁₃是6。

在一些实施方案中，对于表A1中的缀合物，d₁₃是8。

表A2

/>

其中d₁₃如本文中所定义，且抗体是B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体。

在一些实施方案中，对于表A2中的缀合物，d₁₃是6至8的整数。

在一些实施方案中，对于表A2中的缀合物，d₁₃是8。在一些实施方案中，对于表A2中的缀合物，d₁₃是7。在一些实施方案中，对于表A2中的缀合物，d₁₃是6。

在一些实施方案中，对于表A2中的缀合物，d₁₃是8。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物缀合物是：

/>

其中d₁₃是8，且抗体是B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体，

其中所述B7-H4抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ IDNO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。

在一些实施方案中，所述STING激动剂药物缀合物是：

其中d₁₃是8且抗体是B7-H4抗体，或d₁₃是2且抗体是半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体，

其中所述B7-H4抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ IDNO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4选自在表B1中描述的缀合物。

表B1

/>

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXX)的缀合物：

其中每个R_A是：

/>

其中：d₁₃是2、4、6或8。

在其它实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXX)]的缀合物

其中每个R_A是

/>

其中：

d₁₃是2、4、6或8。

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXX)的缀合物，其中每个R_A是：

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXI-1)、(XXXI-2)、(XXXI-3)或(XXXI-4)的缀合物：

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXII)的缀合物：

/>

其中每个R_B是：

/>

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXI-1)、(XXXI-2)、(XXXI-3)、(XXXI-4)或(XXXII)的缀合物，其中可变的-L^D-D是：

/>

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXXIII-3)的缀合物：

其中每个R_A是：

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXXIII-8)的缀合物：

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXIII-5)的缀合物：

其中d₁₃如本文中所定义。

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体是式(XXXIII-8)的缀合物：

其中d₁₃如本文中所定义。

经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物可以通过使经本公开内容的经修饰的B7-H4抗体与包含官能团(例如，W^P)的接头-药物部分反应而得到，所述官能团能够与经修饰的B7-H4抗体中的经修饰的-GlcNAc部分＊-GlcNAc-S"-A"的官能团A”形成共价键。

在一些实施方案中，W^P包含炔基例如，环炔基、杂环炔基或末端炔基。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体的官能团A”是叠氮基、酮或炔基。在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体的官能团A”是叠氮基。在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体的叠氮基官能团A”与接头-药物部分的W^P的炔基(例如，环炔基、杂环炔基或末端炔基)反应以形成三唑部分(例如，经由环加成反应)。叠氮基基团和炔基基团的环加成反应在本领域中被称为“点击化学”。

在一些实施方案中，所述接头-药物部分的W^P包含末端炔基，并且所述环加成反应可以在有催化剂(例如，Cu(I)催化剂)存在下进行。

在一些实施方案中，所述接头-药物部分的W^P包含环炔基或杂环炔基(例如，应变环炔基或杂环炔基)。

在一些实施方案中，所述接头-药物部分的W^P包含应变环炔基或杂环炔基，且所述环加成反应可以在有或没有催化剂存在下进行。在一些实施方案中，所述环加成反应可以通过被称为应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)的反应自发发生，该反应在本领域中被称为“无金属点击化学”。在一些实施方案中，所述应变环炔基或杂环炔基如本文所描述。

在一些实施方案中，在缀合后，经修饰的B7-H4抗体的官能团A”和接头-药物部分的W^P形成三唑部分。

在一些实施方案中，在缀合后，经修饰的B7-H4抗体的官能团A”和接头-药物部分的W^P形成式(XXXV)的三唑部分：

其中*表示与经修饰的B7-H4抗体的其余部分的直接或间接连接；且**指示与M^p(当存在时)或与L^M或M^A的连接。

在一些实施方案中，当本公开内容的叠氮化物-修饰的B7-H4抗体经由环加成反应与包含炔基基团的接头-药物部分反应以形成抗体-药物缀合物时，在抗体-药物缀合物中的形成的三唑部分可以耐受水解和/或其它降解途径。

在一些实施方案中，当本公开内容的醛或酮-修饰的B7-H4抗体与包含羟胺或肼的接头-药物部分反应时，在经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物中的得到的肟或腙部分在中性条件下可以是相对惰性的。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物可以具有高稳定性。

在一些实施方案中，可以通过实用的合成途径合成本公开内容的经修饰的B7-H4抗体和经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物，因为将官能团A”(例如，叠氮基、酮或炔基)引入到抗体中的方法是简单且普遍适用的。

在一些实施方案中，本公开内容的位点特异性的B7-H4抗体-药物缀合物通过包含使经修饰的B7-H4抗体与接头-药物部分反应的方法得到，其中：所述接头-药物部分包含环炔基或杂环炔基，

所述经修饰的B7-H4抗体在缀合之前包含B7-H4抗体和经由GlcNAc的C1位置连接至B7-H4抗体的＊*-GlcNAc-S"-A"的经修饰的GlcNAc部分；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；S”是糖或衍生化的糖；且A”是叠氮基。

在一些实施方案中，A”是环炔基或杂环炔基。在一些实施方案中，A”是环炔基。在一些实施方案中，A”是杂环炔基。

在一些实施方案中，A”是应变环炔基或杂环炔基。在一些实施方案中，A”是应变环炔基。在一些实施方案中，A”是应变杂环炔基。

在一些实施方案中，本公开内容的位点特异性的B7-H4抗体-药物缀合物通过包含以下步骤的方法得到：

(a)在有半乳糖基转移酶存在下，使式(XXII)的中间体抗体其中：

Ab是B7-H4抗体；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺；Fuc是岩藻糖；u₃是0或1；且d₁₃是在1至12范围内的整数；

与化合物P"-S"-A"接触，其中：

S”是糖或衍生化的糖；A”是叠氮基；且P是尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)或胞苷二磷酸(CDP)；

由此形成包含经修饰的-GlcNAc部分＊-GcNAc-S"-A"(任选地，所述经修饰的-GlcNAc部分经由GlcNAc的C1位置连接至所述经修饰的抗体的其余部分)的经修饰的B7-H4抗体；和

(b)使所述经修饰的B7-H4抗体与包含应变环炔基或杂环炔基的接头-药物部分反应，由此形成所述抗体-药物缀合物。

在一些实施方案中，用于制备位点特异性的B7-H4抗体-药物缀合物的方法描绘在图5中。

在一些实施方案中，在所述抗体的每个氨基酸N297处包含叠氮基的经修饰的B7-H4抗体通过无金属点击化学与包含应变环炔基或杂环炔基的接头-药物部分缀合以形成本公开内容的位点特异性抗体-药物缀合物。

在一些实施方案中，当经修饰的B7-H4抗体包含至少一个叠氮基部分且接头-药物部分包含应变环炔基时，铜催化剂的存在对于经修饰的抗体中的叠氮基与接头-药物部分的应变环炔基或杂环炔基之间的环加成反应不是必需的。在一些实施方案中，所述环加成反应在不存在铜催化剂的情况下进行，这可以减轻在所述方法中使用铜催化剂的几个可能的缺点。

在一些实施方案中，所述抗体的叠氮基部分与末端炔烃部分的环加成通常需要Cu(I)催化剂。在一些实施方案中，可能需要对条件进行广泛的优化和微调来找到有效转化的最佳参数。尽管如此，即使在这样的条件下，也并非总能完全避免伴随的活性氧物质的形成，这又可能诱导抗体/蛋白的氧化性损伤(例如，甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸或二硫键的氧化)。其它方案已经采用Cu(I)源(诸如CuBr)来标记固定的细胞和合成糖蛋白。在这些情况下，Cu(I)在空气中的不稳定性要求大量过量的Cu(例如，大于4mm)和配体才能进行有效反应，这也可能增加抗体/蛋白损伤或沉淀的风险，另外在纯化后存在残留的金属。因此，在有铜催化剂存在下含叠氮基的抗体与末端炔烃的缀合可以通过不希望的氨基酸氧化而导致大量副产物形成。

在一些实施方案中，使包含叠氮基(例如，在所述抗体的每个氨基酸N297处)的经修饰的B7-H4抗体与包含应变环炔基或杂环炔基的接头-药物部分缀合(例如，通过无金属点击化学)。

在一些实施方案中，在缀合后，经修饰的B7-H4抗体的叠氮基部分和接头-药物部分的应变环炔基或杂环炔基形成式(XXXV)的三唑部分：其中*表示与所述经修饰的抗体的其余部分的直接或间接连接；且**指示与M^p(当存在时)或与L^M或M^A的连接。

在一些实施方案中，本公开内容的B7-H4抗体-药物缀合物包含出现一次或多次的D，其中每个D独立地是治疗剂(例如，细胞毒性药物部分)，其中所述出现一次或多次的D可以相同或不同。

在一些实施方案中，所述B7-H4抗体的一个或多个特定位点连接至接头-药物部分，其中连接至一个或多个特定位点的接头-药物部分可以相同或不同。在一些实施方案中，包含出现一次或多次的D(即细胞毒性药物部分)的一个或多个接头-药物部分连接至一个B7-H4抗体。

在一些实施方案中，D是细胞毒性药物部分，其中所述细胞毒性药物部分是(a)澳瑞他汀化合物；(b)卡利奇霉素化合物；(c)多卡米星化合物；(d)SN38,(e)吡咯并苯并二氮杂环庚三烯；(f)长春药属化合物；(g)tubulysin化合物；(h)非天然的喜树碱化合物；(i)拟美坦辛(maytansinoid)化合物；(j)DNA结合药物；(k)激酶抑制剂；(l)MEK抑制剂；(m)KSP抑制剂；(n)拓扑异构酶抑制剂；(o)DNA-烷基化药物；(p)RNA聚合酶；(q)PARP抑制剂；(r)NAMPT抑制剂；(s)拓扑异构酶抑制剂；(t)蛋白合成抑制剂；(u)DNA结合药物；(v)DNA嵌入药物；或(w)免疫调节性的化合物。

在一些实施方案中，D(细胞毒性药物部分)是(a)澳瑞他汀化合物；(b)卡利奇霉素化合物；(c)多卡米星化合物；(d)喜树碱化合物，(e)吡咯并苯并二氮杂环庚三烯化合物；(f)长春药属化合物；或其类似物。

在一些实施方案中，所述澳瑞他汀化合物是澳瑞他汀、多拉司他汀、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)、澳瑞他汀F、AF-HPA、MMAF-HPA或苯二胺(AFP)。

在一些实施方案中，所述多卡米星或其类似物是多卡米星A、多卡米星B1、多卡米星B2、多卡米星C1、多卡米星C2、多卡米星D、多卡米星SA、CC-1065、阿多来新、比泽来新或卡泽来新。

在一些实施方案中，所述喜树碱化合物是喜树碱、CPT-11(伊立替康)、SN-38或托泊替康。

在一些实施方案中，所述吡咯并苯并二氮杂环庚三烯化合物是吡咯并苯并二氮杂环庚三烯单体、对称的吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体或非对称的吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体在氨基酸N297处被修饰。

在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是12或更小。在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是10或更小。在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是8或更小。在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是6或更小。在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是4或更小。在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是2或更小。

在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的特定键的总数(或连接点的总数)是2。

在一些实施方案中，根据本领域已知的各种技术和方法，可以将本文描述的经修饰的B7-H4抗体、接头或治疗剂组装进本公开内容的缀合物或支架中。本文描述了本公开内容的缀合物和生产所述缀合物的方法(例如，通过非限制性的实施方案和实施例)。

在一些实施方案中，在接头-药物部分和经修饰的B7-H4抗体之间形成的键的总数(或连接点的总数)是12或更小。

在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率大于1:1且小于或等于12:1。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约12:1、约11:1、约10；1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是在2:1至10:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1或约2:1。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是在约2:1至约4:1之间。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约4:1、约3:1或约2:1。在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约2:1或1:1。

在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约6:1、约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约6:1、约5:1、约4:1或约3:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是1:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约3:1、约2:1或约1:1。

在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约8:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约6:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约5:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约4:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约3:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约2:1。在一些实施方案中，a₂是3，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是2:1，且治疗剂(D)与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约1:1。

在一些实施方案中，接头-药物部分与经修饰的B7-H4抗体之间的比率是约2:1。

在一些实施方案中，所述抗体包含在连接至糖-衍生物部分(其包含官能团A”)的区域290-305中的天冬酰胺基团(例如，在N297处)；且所述经修饰的B7-H4抗体通过在A”和接头-药物部分的官能团之间形成的共价键缀合至所述接头-药物部分。

在一些实施方案中，所述接头-药物部分包含至少两个官能团，它们中的每一个能够与经修饰的B7-H4抗体的糖-衍生物部分的官能团A”(例如，在所述抗体的氨基酸N297处)形成共价键，以形成抗体-药物缀合物。

在一些实施方案中，经修饰的B7-H4抗体与接头-药物部分之间的比率是在约1:1至约1:2之间。

在一些实施方案中，本公开内容的经修饰的B7-H4抗体药物缀合物和支架可以通过广泛渗滤来纯化(例如，以除去任何起始材料)。如果必要的话，可以通过尺寸排阻色谱法进行额外的纯化以除去任何聚集的缀合物。在一些实施方案中，所述纯化的缀合物或支架包含小于5％w/w(例如，<2％w/w)聚集的缀合物，如通过SEC测定的；小于0.5％w/w(例如，<0.1％w/w)游离的(未缀合的)药物，如通过RP-HPLC测定的；小于1％w/w携带药物的含肽支架，如通过SEC测定的；和/或小于2％w/w(例如，<1％w/w)未缀合的抗体，如通过HIC-HPLC测定的。

在一些实施方案中，缀合至细胞毒性药物部分的经修饰的B7-H4抗体药物选自在表B2中描述的缀合物。

表B2

/>

其中：

抗体是经修饰的B7-H4抗体；

■是GlcNAc；△是Fuc；□是GalNAc；且d₁₃如本文中所定义。

应当理解，在本公开内容中，除非另外说明，否则■的符号表示GlcNAc。

应当理解，在本公开内容中，除非另外说明，否则△的符号表示岩藻糖。应当理解，在本公开内容中，除非另外说明，否则□的符号表示GalNAc。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV)：

其中：

每个R_A是

d₁₃是2；且所述一个或多个接头-药物部分连接至在所述抗体的N297处的天冬酰胺基团。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV)，

其中每个R_A是：

/>

其中d₁₃是2；且所述经修饰的B7-H4抗体包含在N297处的一个或多个天冬酰胺基团，其连接至所述缀合物的其余部分。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV)，其中每个R_A是

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV)，其中每个R_A是：

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV-1)、(XXXIV-2)、(XXXIV-3)或(XXXIV-4)：

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXV)：

其中每个R_B是：

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXIV-1)、(XXXIV-2)、(XXXIV-3)、(XXXIV-4)或(XXXV)，其中-L^D-D的部分是：

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物具有式(XXXVI)：

其中每个R_A是

/>

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物是式(XXXVI)的缀合物，其中每个R_A是

其中，所述经修饰的B7-H4抗体包含在N297处的一个或多个天冬酰胺基团，其连接至所述缀合物的其余部分。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物是式(XXXVII)的缀合物：

/>

其中

d₁₃是2；

抗体是B7-H4抗体，其含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ IDNO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。

所述接头-药物部分连接至在所述B7-H4抗体的N297处的天冬酰胺基团；

■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

在一些实施方案中，所述经修饰的B7-H4抗体-药物缀合物是式(XXXVIII)的缀合物：

其中

d₁₃是整数2；

所述接头-药物部分连接至在所述抗体的N297处的天冬酰胺基团；

■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

使用方法

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用治疗有效量的本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用治疗有效量的本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物。在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中治疗B7-H4-阳性癌症的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物用于在有此需要的受试者中治疗癌症的用途。在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物用于在有此需要的受试者中治疗B7-H4-阳性表达癌症的用途。

在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病症。

在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症。

在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗癌症。在一些实施方案中，本公开内容提供了本文公开的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗B7-H4-阳性表达癌症。

在一些实施方案中，本公开内容提供了缀合物用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的用途。

在一些实施方案中，本公开内容提供了缀合物用于在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的用途。

在一些实施方案中，本公开内容提供了缀合物用于在有此需要的受试者中治疗癌症的用途，其包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物。在一些实施方案中，本公开内容提供了缀合物用于在有此需要的受试者中治疗B7-H4-阳性表达癌症的用途，其包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本公开内容的至少一种缀合物；其中所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。在一些实施方案中，本公开内容提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本公开内容的至少一种缀合物；其中所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。

在一些实施方案中，所述疾病是癌症。

在一些实施方案中，本公开内容提供了包含给所述受试者施用治疗有效量的本文中公开的B7-H4抗体-药物缀合物的方法。

在一些实施方案中，本公开内容提供了包含给所述受试者施用本文中公开的B7-H4抗体-药物缀合物的方法。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种抑制B7-H4-阳性细胞的增殖的方法，所述方法包含在允许B7-H4抗体-药物缀合物结合在所述细胞的表面上的B7-H4并随后内化的条件下将所述细胞暴露于B7-H4抗体-药物缀合物，由此抑制所述细胞的增殖。在某些实施方案中，所述方法是体外或体内方法。在其它实施方案中，所述细胞是乳房、卵巢或子宫内膜细胞。

使用可从Promega(Madison,Wis.)商购获得的CellTiter-Glo^TM发光细胞生存力测定，可以测定体外细胞增殖的抑制。该测定基于存在的ATP的定量来确定培养物中活细胞的数目，所述ATP是代谢活跃细胞的指标。参见Crouch等人.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88，美国专利号6,602,677。该测定可以以96孔或384孔格式进行，使其适合自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等人.(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。测定程序包括将单一试剂(CellTiter-试剂)直接加给培养的细胞。这导致细胞裂解和由萤光素酶反应产生的发光信号的。所述发光信号与存在的ATP的量成正比，所述ATP的量又与在培养物中存在的活细胞的数目成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置记录数据。将发光输出表示为相对光单位(RLU)。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于用作药物的B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，提供了用于用在治疗方法中的B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，提供了用于治疗B7-H4-阳性癌症的B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，本发明提供了用于用在治疗具有B7-H4-阳性癌症的个体的方法中的B7-H4抗体-药物缀合物，所述方法包含给所述个体施用有效量的B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包含给所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。

在一些实施方案中，本公开内容提供了B7-H4抗体-药物缀合物在药物的制造或制备中的用途。在一些实施方案中，所述药物用于治疗B7-H4-阳性癌症。在一些实施方案中，所述药物用于用在治疗B7-H4-阳性癌症的方法中，所述方法包含给具有B7-H4-阳性癌症的个体施用有效量的药物。在一些实施方案中，所述方法进一步包含给所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。

在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗B7-H4-阳性癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包含给具有这样的B7-H4-阳性癌症的个体施用有效量的B7-H4抗体-药物缀合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包含给所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。

在一些实施方案中，所述B7-H4-阳性癌症是例如乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(例如，鳞状细胞癌)、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、膀胱癌(例如，泌尿道上皮细胞癌)、结肠癌、头颈癌、小细胞肺癌、胃癌、黑素瘤、胆管癌、子宫癌和胆管上皮癌。

在一些实施方案中，所述B7-H4-阳性癌症是例如乳癌子宫内膜癌、卵巢癌或胆管上皮癌。

在一些实施方案中，所述B7-H4-阳性的乳癌是三重阴性的乳癌、激素受体阳性的/HER2(-)(HR+/HER2(-))乳癌或导管癌。

在一些实施方案中，所述B7-H4-阳性的卵巢癌是浆液性腺癌卵巢癌。

在一些实施方案中，所述B7-H4-阳性的卵巢癌是高等级浆液性卵巢癌。在一些实施方案中，所述高等级浆液性卵巢癌是输卵管或原发性腹膜癌。在一些实施方案中，所述输卵管或原发性腹膜癌是转移性的。在一些实施方案中，所述输卵管或原发性腹膜癌是复发性的。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中治疗三重阴性的乳癌的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物或其药物组合物。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中治疗HR+/HER2(-)乳癌的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物或其药物组合物。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种在有此需要的受试者中治疗子宫内膜癌的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物或其药物组合物。

在一些实施方案中，所述三重阴性的乳癌受试者已经接受先前治疗，其使用拓扑异构酶抑制剂或其ADC，诸如、例如戈沙妥珠单抗；化学治疗剂，诸如、例如，多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨和顺铂；抗肿瘤剂，诸如、例如阿特朱单抗；AKT抑制剂，诸如、例如，帕他色替；PARP抑制剂，诸如、例如，奥拉帕尼(Lynparza)、芦卡帕尼(Rubraca)、他拉唑帕尼和尼拉帕尼(Zejula)或它们的组合。

在一些实施方案中，所述HR+/HER2(-)乳癌受试者已经接受先前治疗，其使用细胞周期蛋白依赖性的激酶4和6(CDK4/6)抑制剂，诸如、例如，哌柏西利、瑞波西利和阿贝西利；化学治疗剂，诸如、例如，多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨和顺铂；血管生成抑制剂，诸如、例如，贝伐珠单抗(安维汀)；雌激素受体拮抗剂，诸如、例如，氟维司群(Faslodex)；mTOR抑制剂，诸如、例如，依维莫司；PI3K抑制剂，诸如、例如，阿培利司；或它们的组合。

在一些实施方案中，所述卵巢癌受试者已经接受先前治疗，其使用化学治疗剂，诸如、例如，多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨和顺铂；血管生成抑制剂，诸如、例如，贝伐珠单抗(安维汀)；PARP抑制剂，诸如、例如，尼拉帕尼(Zejula)、奥拉帕尼(Lynparza)和维利帕尼；与贝伐珠单抗组合的奥拉帕尼(Lynparza)；或它们的组合。

在一些实施方案中，所述子宫内膜癌受试者已经接受先前治疗，其使用化学治疗剂，诸如、例如，多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨和顺铂；孕激素(progestin)，诸如、例如，醋酸甲羟孕酮和乙酸甲地孕酮(梅格施)；抗雌激素药物，诸如、例如，他莫昔芬；黄体生成素-释放激素激动剂(LHRH激动剂)，诸如、例如，戈舍瑞林(诺雷德)和亮丙瑞林(醋酸亮丙瑞林)；芳香酶抑制剂，诸如、例如，来曲唑(弗隆)、阿那曲唑(瑞宁得)和依西美坦(阿诺新)；激酶抑制剂，诸如、例如，乐伐替尼；血管生成抑制剂，诸如、例如，贝伐珠单抗(安维汀)；mTOR抑制剂，诸如、例如，依维莫司(Afinitor)；PD-1抗体，诸如、例如，纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、替雷利珠单抗(BGB-A317)和斯巴达珠单抗(NPVPDR001、NVS240118、PDR001)；或它们的组合。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种治疗作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的癌症受试者的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物或其药物组合物。

作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的癌症受试者可能在之前对PD-1/PD-L1抑制剂有应答，但可能已经变得对PD-1/PD-L1抑制剂应答减弱，或所述癌症可能从未对PD-1/PD-L1抑制剂产生应答。对PD-1/PD-L1抑制剂的不充分应答是指，在使用标准剂量的PD-1/PD-L1抑制剂后预期会改善的癌症方面并未改善，和/或仅在施用大于标准剂量的剂量时才会出现改善。在一些实施方案中，作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的患有癌症的受试者在接受标准剂量至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或至少12周之后已经经历或正在经历对PD-1/PD-L1抑制剂的不充分应答。“标准”剂量由医疗专业人员确定，并且可能取决于受试者的年龄、体重、健康史、疾病的严重程度、施用频率等。在一些实施方案中，作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的患有癌症的受试者已经经历或正在经历对抗-PD-1抗体和/或抗-PD-L1抗体的不充分应答。在一些实施方案中，作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的患有癌症的受试者已经经历或正在经历对AMP-224的不充分应答。在一些实施方案中，作为PD-1/PD-L1抑制剂不充分应答者的患有癌症的受试者已经经历或正在经历对选自纳武单抗、派姆单抗和阿特朱单抗的PD-1/PD-L1抑制剂的不充分应答。

在一些实施方案中，本公开内容涉及一种治疗表达低水平的PD-L1的癌症的方法，所述方法包含给所述受试者施用有效量的本文公开的缀合物或其药物组合物。在一些实施方案中，表达“低水平的PD-L1”或“在低水平表达PD-L1”的癌症表示，PD-L1的水平低于被指示用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗的癌症的表达水平，其中基于PD-L1表达水平选择受试者进行治疗。在一些实施方案中，“低水平的PD-L1”是其中在肿瘤中的小于1％的细胞具有膜染色的水平。在一些实施方案中，关于PD-L1的“低水平”是小于1％染色，例如，0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％的肿瘤细胞被染色。

在一些实施方案中，通过产色IHC或免疫荧光IHC(Aqua评分)可以测量PD-L1表达水平。在某些实施方案中，5％或更小(包括肿瘤和/或免疫细胞)的PD-L1染色可以指示，样品表达“低水平的PD-L1”。在某些实施方案中，10％或更小(包括肿瘤和/或免疫细胞)的PD-L1染色可以指示，样品表达“低水平的PD-L1”。除非在本文中另外指出，否则在本文中使用5％阈值(即，5％或更小指示“低水平的PD-L1”)。

在一些实施方案中，将本文中公开的缀合物或其药物组合物施用给诊断出癌症的受试者以增加患者中T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。在另一个实施方案中，将本文公开的缀合物或其药物组合物施用给诊断出癌症的受试者以增加受试者中的干扰素-γ(IFNγ)产生。在另一个实施方案中，将本文公开的缀合物或其药物组合物施用给诊断出癌症的受试者以阻断B7-H4对受试者中的T细胞的抑制活性。在另一个实施方案中，将本文公开的缀合物或其药物组合物施用给诊断出癌症的受试者以耗竭受试者中表达B7-H4的癌细胞。

在一些实施方案中，将本文公开的缀合物或其药物组合物施用给如上面所提供的受试者，并进一步与另外的治疗剂组合，例如，PD-1拮抗剂；PD-L1拮抗剂；拓扑异构酶抑制剂或其ADC，诸如、例如戈沙妥珠单抗；化学治疗剂，诸如、例如，多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨和顺铂；抗肿瘤剂，诸如、例如，阿特朱单抗；血管生成抑制剂，诸如、例如，贝伐珠单抗(安维汀)；AKT抑制剂，诸如、例如，帕他色替；PARP抑制剂，诸如、例如，奥拉帕尼(Lynparza)、芦卡帕尼(Rubraca)、他拉唑帕尼和尼拉帕尼(Zejula)；细胞周期蛋白依赖性的激酶4和6(CDK4/6)抑制剂，诸如、例如，哌柏西利、瑞波西利和阿贝西利；选择性的雌激素受体拮抗剂，诸如、例如，氟维司群(Faslodex)；mTOR抑制剂，诸如，例如，依维莫司(Afinitor)；PI3K抑制剂，诸如、例如，阿培利司；或它们的组合。

在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是PD-1拮抗剂，诸如拮抗性PD-1抗体。合适的PD-1抗体包括，例如，纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、替雷利珠单抗(BGB-A317)或斯巴达珠单抗(NPVPDR001、NVS240118、PDR001)。所述另外的治疗剂也可以包括皮地利珠单抗(CT-011)。由PD-L2的细胞外结构域(B7-DC)与IgG1的Fc部分融合而组成的重组蛋白(被称为AMP-224)也可以用于拮抗PD-1受体。

在一些实施方案中，所述PD-L1拮抗剂是拮抗性PD-L1抗体。合适的PD-L1抗体包括，例如，阿特朱单抗(TECENTRIQ)、度伐单抗(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)、阿维鲁单抗(WO2013/79174)或rHigM12B7。

在一些实施方案中，例如，当所述癌症是Her2癌症时，另外的治疗剂是曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗培妥珠单抗/>酪氨酸激酶抑制剂，诸如、例如，拉帕替尼和图卡替尼。

上面指出的这样的联合疗法包括组合施用(其中将两种或更多种治疗剂包括在相同制剂或单独制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的抗体或抗体-药物缀合物的施用可以发生在施用另外的治疗剂和/或辅助剂之前、同时和/或之后。本发明的B7-H4抗体-药物缀合物还可以与辐射疗法联合使用。

确定活性剂的精确量是在本领域技术人员的水平之内，所述活性剂包括要施用给受试者的B7-H4抗体-药物缀合物。例如，用于治疗癌症和实体瘤的这样的药剂和用途是本领域众所周知的。因此，可以基于该药剂在给定施用途径下的标准定量施用方案来选择这样的药剂的剂量。

应当理解，治疗的精确剂量和持续时间随所治疗的组织或肿瘤而变化，并且可以凭经验使用已知的试验方案或通过从体内或体外试验数据推断来确定，和/或可以从特定药剂的已知定量施用方案来确定。应当指出，浓度和剂量值也可以随治疗的个体的年龄、个体的体重、施用途径和/或疾病的程度或严重性以及在熟练的医学从业人员的水平内需要考虑的其它因素而变化。通常，选择剂量方案以限制毒性。应当指出，主治医师会知道由于毒性，或骨髓、肝脏或肾脏或其它组织功能障碍如何以及何时终止、中断或调整治疗以降低剂量。相反，如果临床应答不充分(排除有毒的副作用)，主治医师也会知道如何以及何时将治疗调整至更高水平。进一步应当理解，对于任何特定受试者，具体剂量方案应根据个体需要和施用或监督制剂施用的人的专业判断随时间调整，并且本文列出的浓度范围仅仅是示例性的并且无意限制其范围。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在本说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。尽管与本文描述的那些类似或等效的方法和材料都可以用于实践或试验本发明，但是下面描述了适合的方法和材料。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅仅是示例性的，且无意是限制性的。

贯穿本说明书，在化合物、支架和组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，考虑到，组合物也基本上由所列举的组分组成或由所列举的组分组成。类似地，在方法或过程被描述为具有、包括或包含特定过程步骤的情况下，所述过程也基本上由列举的加工步骤组成或者由列举的加工步骤组成。此外，应当理解，步骤的次序或执行某些动作的次序并不重要，只要本发明保持可工作即可。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。可以以任何合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。本文中提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的应用仅仅意图更好地举例说明本发明，且不应解释为对权利要求的范围的限制，除非另外明确地声明。在说明书中的语言都不应解释为指示任何未声明的要素是要求保护的方案所必需的。

实施例

以下工作实施例说明了接头、药物分子和抗体或抗体片段及其制备方法。这些无意是限制性的并且本领域技术人员将容易地理解可以利用其它试剂或方法。

缩写

以下缩写用在随后的反应方案和合成实施例中。该列表无意成为在本申请中使用的缩写的穷尽性列表，作为另外的标准缩写，它们容易被有机合成领域的技术人员理解，还可以用在合成方案和实施例中。

缩写：

ACN乙腈

AF澳瑞他汀F

AF-HPA澳瑞他汀F羟丙基酰胺

aq 水性的

CE 毛细管电泳

CR 完全消退

DAD二极管阵列检测器

DAR药物与抗体比率

DMEM Dulbecco氏改良的伊格尔培养基

ELISA酶联免疫吸附测定

Endo SH内切糖苷酶SH

FBS 胎牛血清

Fuc 岩藻糖

GalNAcT 糖基转移酶

HIC 疏水相互作用色谱法

HRP辣根过氧化物酶

IV 静脉内的

LC 液相色谱法

MS 质谱法

MTV中位肿瘤体积

NMR核磁共振

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PBST 含有吐温的磷酸盐缓冲盐水

PR 部分消退

RP-HPLC反相高效液相色谱法

SEC尺寸排阻色谱法

TFS 无肿瘤存活

TGI 肿瘤生长抑制

TCEP三[2-羧基乙基]膦

TEAA三乙基乙酸铵

TMB四甲基联苯胺

UDP尿苷二磷酸

UF/DF超滤/渗滤

WCX弱阳离子交换色谱法

一般信息

除非另外说明，否则所有试剂均购自相关供应商。

B7-H4_2F9亲本抗体(抗-B7-H4抗体)和2A7公开于US2011/0085970 Al中。1D11抗体公开于US20160159910A1中。如在PCT申请WO 2017137459中所述制备Endo SH，其整个内容通过引用并入本文。如在US 9,988,662中所述制备UDP-叠氮基糖和GalNAcT，其整个内容通过引用并入本文。

如在Ramanjulu等人(Nature,564(7736):439-443(2018))中所述制备diABZISTING激动剂。

将肿瘤生长抑制(％TGI)定义为处理组和对照组之间中位肿瘤体积(MTV)的差异百分比。在每个效力研究中测量肿瘤尺寸以确定肿瘤生长抑制(TGI)。

当适用时，通过分光光度计法测定缀合物的药物含量，否则通过RP-HPLC或LC/MS，如关于药物含量的定量测定所进行的。

通过分光光度计法或通过ELISA测定抗体-药物缀合物的蛋白质含量。

根据需要通过广泛渗滤、CHT色谱法或HIC纯化抗体-药物缀合物、携带药物的支架或抗体支架(即，除去残留的未反应的药物、未缀合的抗体、酶或起始材料)。如果必要的话，可以通过SEC或HIC进行另外的纯化，以除去聚集的抗体-药物缀合物。一般而言，纯化后的抗体-药物缀合物含有<5％(w/w)(例如，<2％(w/w))聚集的抗体-药物缀合物，如通过SEC所测定的；<0.5％(w/w)(例如，<0.1％(w/w))游离的(未缀合的)药物，如通过RP-HPLC和/或LC-MS/MS所测定的；<1％(w/w)的游离药物缀合物，如通过SEC和/或RP-HPLC所测定的；和<10％(w/w)(例如，<1％(w/w))未缀合的抗体或抗体片段，如通过HIC-HPLC和/或RP-HPLC所测定的。使用在文献中描述的程序制备还原的或部分地还原的抗体，参见，例如，Francisco等人,Blood 102(4):1458-1465(2003)。通过紫外-可见光分光光度法或RP-HPLC测定总药物(缀合的和未缀合的)浓度。

为了测定生物样品中游离AF-HPA药物的浓度，将酸化的样品用ACN处理。萃取游离药物并分析ACN上清液。为了测定非临床样品中缀合的AF-HPA的浓度，使用抗-IgG1抗体包被的磁珠对样品进行免疫捕获，然后进行彻底的碱性水解。通过LC-MS/MS分析含有释放的AF-HPA药物的ACN上清液。在使用抗-IgG1抗体免疫捕获后，通过在胰蛋白酶消化之后检测抗体独有的肽序列，通过LC-MS/MS测量非临床样品中的总抗体浓度。对于临床样品，可以遵循相同的程序，但是使用抗-独特型抗体进行免疫捕获以避免内源性抗体的干扰。

使用C4柱、ACN梯度和紫外检测，通过RP-HPLC进行游离AF和AF-HPA的分析。将峰面积积分并与AF和AF-HPA标准品进行对比。该方法可定量血浆和组织匀浆物中的AF和AF-HPA，并且在0.1ng/mL至150ng/mL的浓度范围内为线性。在相同的条件下测量用NaOH(水溶液)水解后释放的总药物(AF-HPA)，动态范围从1ng/mL至5,000ng/mL。总抗体标准品范围为0.1μg/mL至100μg/mL。

通过HIC-HPLC在配备DAD的Shimadzu Prominence HPLC系统上测定抗体-药物缀合物的疏水性。将TSK凝胶丁基-NPR柱(2.5μm颗粒尺寸)保持在35℃进行这些分析。流动相A为1.5M硫酸铵、25mM磷酸钠和pH 7.0，且流动相B为25mM磷酸钠、10％异丙醇和pH 7.0。使用流动相B的0-100％线性梯度历时25分钟进行分离。流速为1mL/min。样品注射范围为约10μg至100μg。

通过使抗体-药物缀合物经历彻底的碱水解来测定包含细胞毒性剂药物部分的缀合物的药物与抗体比率(DAR)。然后使用RP-HPLC从标准曲线定量释放的AF-HPA。将测得的AF-HPA浓度与抗体含量相关联以确定DAR。

通过测量缀合物的吸收来测定包含STING激动剂药物部分的缀合物的药物与抗体比率(DAR)。使用抗体和STING激动剂有效负载的适当摩尔消光系数计算DAR值。

使用数字测径器每周2次测量肿瘤，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝(宽度²x长度)/2。第一周每天记录体重，此后每周2次。继续研究动物直至单个肿瘤体积达到≥1000mm³、≥1500mm³或如所指示的。使用以下公式计算体重的变化百分比：体重变化(％)＝((重量^{研究第X天}-重量^{研究第1天})/重量^{研究第1天})*100。将肿瘤体积报告为平均值±平均值标准误差(SEM)。将肿瘤生长抑制(％TGI)定义为处理组和对照组之间平均肿瘤体积(MTV)的差异百分比。在每个效力研究中测量肿瘤尺寸以确定肿瘤生长抑制(TGI)。使用以下公式计算肿瘤消退百分比：％消退＝(1-(平均肿瘤体积^最终)/(平均肿瘤体积^第1天))*100。

对于异种移植研究，将个体动物的消退应答分为几类。将部分应答(PR)定义为连续三次测得第1天体积的50％或更小的肿瘤体积，并且这三次测量中的至少一次等于或大于13.5mm³。将完全应答(CR)定义为连续三次测得小于13.5mm³的肿瘤体积。将无肿瘤存活者(TFS)归类为在研究结束时具有CR。在研究期间仅对动物的PR或CR事件进行一次评分，并且如果同时满足PR和CR标准则仅对动物进行CR评分。在研究结束时具有CR应答的动物另外被分类为无肿瘤存活者(TFS)。

对于PDX研究，将个体动物的消退应答分为以下几类：

TS(肿瘤稳定)＝在几次连续测量中呈现恒定肿瘤尺寸的小鼠的数目。

PR(部分消退)＝在几次连续测量中呈现小于初始肿瘤尺寸的肿瘤尺寸的小鼠的数目。

CR(完全消退)＝在几次连续测量中呈现0至13mm³肿瘤尺寸的小鼠的数目。

TFS(无肿瘤存活者)＝截至组日结束时记录的完全消退的数目。

实施例1：XMT-1604(B7-H4_2F9V18)细胞毒性的药物缀合物1的合成

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其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

步骤1.叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体向在50mM Tris-HCl(pH 7.6)中的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(12.71mg,0.088μmol)中按下述顺序加入：Endo SH(0.127mg，1重量％)，GalNAcT(0.64mg，5重量％)，UDP-叠氮基糖(1.34mg，2.12μmol)，和MnCl₂(1.18mg，9.4μmol)，以达到13.5g/L的最终抗体浓度。将反应物在30℃在30rpm搅拌17小时。将粗制的叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体通过蛋白A色谱法和透析进行纯化以产生叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(10.53mg,83％收率)。

步骤2.XMT-1604(B7-H4_2F9V18)药物缀合物1

将在PBS(pH 7.2)中的叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(10.03mg,0.070μmol)和在水中的支架1A(4.25mg,0.67μmol，如在US17/144,378中所述制备)轻轻混合，然后在没有晃动或摇动下在30℃放置20小时。将粗产物通过UF/DF和HIC纯化以产生缀合物1-1(5.85mg,58％收率)，其具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

下面给出了缀合物1-1、1-2和1-3的细节。

实施例2：XMT-1604(B7-H4_2F9V18)细胞毒性的药物缀合物2，DAR 2.0的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物2，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(50mg,0.346μmol)和支架2A(7.12mg,3.34μmol)替代支架1A。纯化的缀合物2(30.1mg,60％收率)具有2.0的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。下面给出了缀合物2-1和2-2的细节。

缀合物	DAR
		2-1	2.0
2-2	2.0

实施例3：XMT-1603(K+)(B7-H4_2F9V7)细胞毒性的药物缀合物3，DAR 5.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物3，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的XMT-1603(K+)(B7-H4_2F9V7)抗体(13.7mg,0.095μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物3(8.8mg,64％收率)具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例4：XMT-1603(B7-H4_2F9V7)细胞毒性的药物缀合物4，DAR 5.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物4，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的XMT-1603(B7-H4_2F9V7)抗体(22mg,0.153μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物4(13.8mg,63％收率)具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例5：XMT-1603(B7-H4_2F9V7)细胞毒性的药物缀合物5，DAR 1.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例2中所述合成缀合物5，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的XMT-1603(B7-H4_2F9V7)抗体(50mg,0.347μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物5(30.5mg,61％收率)具有1.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例6：B7-H4_2F9V11(K+)细胞毒性的药物缀合物6，DAR 5.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物6，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的B7-H4_2F9V11(K+)抗体(16.66mg,0.116μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物6(10.75mg,65％收率)具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例7：B7-H4_2F9V17(K+)细胞毒性的药物缀合物7，DAR 5.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物7，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的B7-H4_2F9V17(K+)抗体(13.62mg,0.094μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物7(8.1mg,59％收率)具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例8：1D11细胞毒性的药物缀合物8，DAR 5.8的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物8，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的1D11抗体(15mg,1.04μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604()B7-H4_2F9V18抗体。在下表中给出了纯化的缀合物8-1和8-2的细节。

缀合物	DAR
		8-1	5.9
8-2	6.0

实施例9：利妥昔单抗细胞毒性的药物缀合物9,DAR 5.7的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物9，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的利妥昔单抗抗体(131.4mg,0.91μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。在下表中给出了纯化的缀合物9-1和9-2的细节。

缀合物	DAR
		9-1	5.7
9-2	5.9

实施例10：利妥昔单抗细胞毒性的药物缀合物10,DAR 1.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例2中所述合成缀合物10，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的利妥昔单抗抗体(35mg,0.242μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物10(24mg,69％收率)具有1.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例11：B7-H4_2F9细胞毒性的药物缀合物11，DAR 5.9的合成

其中：■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

如在实施例1中所述合成缀合物11，但是在步骤2中使用叠氮基修饰的B7-H4_2F9抗体(21.2mg,0.147μmol，如在实施例1、步骤1中所述制备)替代叠氮基修饰的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物11(11.2mg,53％收率)具有5.9的DAR，如通过还原RP-HPLC所测定的。

实施例12：XMT-1604(B7-H4_2F9V18)细胞毒性的药物缀合物12,DAR 11.9的合成

在搅拌的同时向XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(20mg,0.139μmol)在TEAA缓冲液pH 7(4mL)中的溶液中加入TCEP(0.0993mg,0.347μmol)的溶液。将混合物在室温温育1.5h。然后将部分地还原的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体加入剧烈搅拌的支架12A(18mg,1.807μmol，如在US 9,849,191中所述制备)在TEAA缓冲液pH 6(1.8mL)中的溶液中。在室温继续搅拌1h。用半胱氨酸(0.421mg,3.47μmol)在TEAA缓冲液pH 7(0.084mL)中的水溶液淬灭反应。在环境温度在pH 7.0搅拌30分钟以后，将反应混合物酸化至pH 5.8。将粗产物通过WCX纯化以产生缀合物12(10mg,50％收率)，其具有11.9的DAR，如通过水解和随后的RP-HPLC所测定的。

实施例13：XMT-1603(B7-H4_2F9V7)细胞毒性的药物缀合物13，DAR 11.8的合成

如在实施例12中所述合成缀合物13，但是使用XMT-1603(B7-H4_2F9V7)抗体(20mg,6.99μmol)替代XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物13(11.5mg,58％收率)具有11.8的DAR，如通过水解和随后的RP-HPLC所测定的。

实施例14：利妥昔单抗细胞毒性的药物缀合物14，DAR 10.8的合成

如在实施例12中所述合成缀合物14，但是使用利妥昔单抗抗体(100mg,6.99μmol)替代XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物14(62.6mg,63％收率)具有10.8的DAR，如通过水解和随后的RP-HPLC所测定的。

实施例15：XMT-1604(B7-H4_2F9V18)STING激动剂药物缀合物15，DAR 6.8的合成

在搅拌的同时向XMT-1604(B7-H4_2F9V18)(8mg,0.055μmol)在50mM HEPES、1mMEDTA缓冲液pH 7.0(1.53mL)中的溶液中加入TCEP(8mg,0.055μmol)在50mM HEPES、1mMEDTA缓冲液pH 7.0(0.075mL)中的溶液。将混合物在37℃温育1.5h。然后在搅拌的同时将还原的XMT-1604(B7-H4_2F9V18)加入支架15A(如在US17/221,341中所述制备，1.18mg,0.5μmol)在DMA(0.16mL)中的溶液中。在37℃继续搅拌1h。用半胱氨酸(0.1mg,0.83μmol)在50mMHEPES、1mM EDTA缓冲液pH 7(0.02mL)中的水溶液淬灭反应。在环境温度在pH 7搅拌45分钟以后，将粗产物通过CHT色谱法纯化以产生缀合物15(7.6mg,95％收率)，其具有6.8的DAR，如通过UV-Vis所测定的。以类似的方式合成缀合物15-1和15-2，并且将对应的纯化的缀合物的细节提供在下表中。

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实施例16：1D11 STING激动剂缀合物16，DAR 6.5的合成

如在实施例15中所述合成缀合物16，但是使用1D11抗体(8mg,0.055μmol)替代XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物16(7mg,87.5％收率)具有6.5的DAR，如通过UV-Vis所测定的。

实施例17：帕利珠单抗STING激动剂缀合物17，DAR 6.8的合成

如在实施例15中所述合成缀合物17，但是使用帕利珠单抗替代XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体。纯化的缀合物17(7mg,87.5％收率)具有6.8的DAR，如通过UV-Vis所测定的。

实施例18：1D11 STING激动剂缀合物18，DAR 6.9的合成

在搅拌的同时向1D11(15.9mg,0.109μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH 7.0(3.105mL)中的溶液中加入TCEP(0.125mg,0.436μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH7.0(0.075mL)中的溶液。将混合物在37℃温育1.5h。然后在搅拌的同时将还原的1D11加入支架18A(如在US 17/221,341中所述制备，2.084mg,0.872μmol)在DMA(0.31mL)中的溶液中。在37℃继续搅拌1h。用半胱氨酸(0.198mg,1.635μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH 7(0.04mL)中的水溶液淬灭反应。在环境温度在pH 7搅拌45分钟以后，将粗产物通过CHT色谱法纯化以产生缀合物18(10.8mg,68％收率)，其具有6.9的DAR，如通过UV-Vis所测定的。

实施例19：1D11 STING激动剂缀合物19,DAR 6.5的合成

在搅拌的同时向1D11(10mg,0.069μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH 7.0(1.921mL)中的溶液中加入TCEP(0.079mg,0.276μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH7.0(0.079mL)中的溶液。将混合物在37℃温育1.5h。然后在搅拌的同时将还原的1D11加入支架20A(如在US 17/221,341中所述制备，0.606mg,0.552μmol)在DMA(0.2mL)中的溶液中。在37℃继续搅拌1h。用半胱氨酸(0.125mg,1.035μmol)在50mM HEPES、1mM EDTA缓冲液pH 7(0.013mL)中的水溶液淬灭反应。在环境温度在pH 7搅拌45分钟以后，将粗产物通过CHT色谱法纯化以产生缀合物19(8.2mg,82％收率)，其具有6.5的DAR，如通过UV-Vis所测定的。

实施例20：B7-H4_2F9V18 STING激动剂缀合物21,DAR 6.9的合成

如在实施例19中所述合成缀合物20，但是使用XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体(10mg,0.069μmol)替代1D11抗体。纯化的缀合物20(6.2mg,62％收率)具有6.9的DAR，如通过UV-Vis所测定的。

实施例21：支架24的合成

步骤1.化合物22

将化合物21(250mg,0.124mmol，使用在US15/819,650中描述的程序制备，其整个内容通过引用并入本文)、水(5.9mL)、NMP(1.5mL)、EDC(166mg,0.868mmol)和HOAt(0.041mg,0.298mmol)在冰浴中搅拌，并用1N NaHCO₃(水溶液)将pH调至约6.5。加入化合物2(631mg,0.558mmol)，随后将pH调至约6.5。将得到的混合物搅拌冷却3h。加入另外的EDC、HOAt和化合物2(198mg,0.164mmol)并继续搅拌过夜。将反应混合物使用10％至60％的ACN/H₂O至100％v/v ACN/H₂O的不连续梯度在C18筒(100g)上纯化。将期望的级分低压冻干以产生作为白色无定形固体的化合物22(275mg,53％收率)。MS:2083.64(2⁺),1389.43(3⁺),1042.35(4⁺)。

步骤2.化合物23

向化合物22(375mg,0.09mmol)、EtOH(1.5mL)和水(1.5mL)在玻璃Parr瓶中的混合物中，用氩气在混合物中鼓泡，随后加入Pd/C(9.5mg,0.009mmol)。将瓶子连接至氢化设备，然后接连地抽真空，用氩气填充，然后用氢气(0.762mg,0.378mmol)填充至30psi，并将混合物剧烈搅拌过夜。将反应混合物穿过硅胶塞过滤并浓缩成油。将所述油溶解在ACN/H₂O中并低压冻干以得到作为白色无定形固体的化合物23(220mg,63％收率)。MS:1926.60(2⁺),1284.74(3⁺),963.80(4⁺)。

步骤3.支架24

向冰冷的化合物23(150mg,0.039mmol)在ACN(1.04mL)和DMF(0.500mL)中的溶液中加入1-((1R,8S,9s)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基)-3-氧代-2,7,10-三氧杂-4-氮杂十三烷-13-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(35mg,0.078mmol)和DIPEA(0.027mL,0.156mmol)，最终的pH为约8-9。将混合物在室温搅拌2h，然后浓缩并使用ACN/H₂O(0.1％TFA)作为流动相在制备型HPLC上纯化。将期望的级分低压冻干以产生作为白色无定形固体的支架24(93.1mg,57％收率)。MS:2094.23(2⁺),1396.43(3⁺),1047.62(4⁺)838.30(5⁺)。

实施例22:对B7-H4_2F9的翻译后修饰风险的鉴定和B7-H4变体的产生.

对B7-H4_2F9和B7-H4_2A7(公开在US20110085970A1中)的VH和VL区域的分析鉴定出了潜在的翻译后修饰(PTM)倾向，由于对抗体可开发性的潜在风险而被认为是不希望的。如下面证实的，该分析的结果鉴定出了B4-H4_2F9的VH链中的潜在风险。按照理论风险降序排列，这些包括非规范半胱氨酸残基、潜在的Asp异构化位点和B7-H4_2F9的潜在Met氧化位点，如下所示。

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为了消除潜在的PTM危害，同时保留期望的抗体性能，产生了抗体B4-H4_2F9的变体，如表1中所示。产生的每种变体抗体含有四种变化之一以消除非规范半胱氨酸风险(DC变为YY、DY、DA或DS)。变体单独包含这些突变(B7-H4_2F9V1、B7-H4_2F9V6、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V16)，或与其它突变组合，包括四种变体，它们除了解决非规范半胱氨酸风险外还具有除去潜在Asp异构化位点的突变(DG变为DA)：B7-H4_2F9V2、B7-H4_2F9V7、B7-H4_2F9V12、B7-H4_2F9V17。四种变体具有这些突变，加上一个额外的突变来解决潜在的甲硫氨酸氧化危险(MDV变为LDV；B7-H4_2F9V3、B7-H4_2F9V8、B7-H4_2F9V13、B7-H4_2F9V18)，从而解决所有三种潜在的PTM倾向。设计了四种变体，通过添加2A7 HCDR3区域替代B4-H4_2F9HCDR3区域(B7-H4_2F9V4、B7-H4_2F9V9、B7-H4_2F9V14、B7-H4_2F9V19)来消除Asp异构化序列，此外还包含突变来解决非规范半胱氨酸风险。其余四种变体包含突变来解决非规范半胱氨酸风险，通过包含2A7HCDR3区域来解决Asp异构化风险，以及包含MDV至LDV突变来解决甲硫氨酸氧化风险(B7-H4_2F9V5、B7-H4_2F9V10、B7-H4_2F9V15、B7-H4_2F9V20)。表1总结了B4-H4_2F9抗体序列变异和解决的PTM倾向。

表1

实施例23：通过ELISA测量的B7-H4_F9亲本抗体及其20种B7-H4_2F9抗体变体向人B7-H4蛋白的结合

通过与所述肽(1μg/mL在PBS中)一起在4℃温育过夜，将重组人B7-H4蛋白(R&DSystems#6576-B7-050)包被在96-孔平板的每个孔的表面上。然后通过与BSA(5％在PBS中，含有0.1％吐温20(PBST))一起在室温温育1小时来封闭所述孔。然后将试验物质(B7-H4_2F9和20种B7-H4_2F9抗体变体)的一系列稀释液(0.0061nM至100nM；在3％的BSA在PBS中的溶液中的4倍系列稀释液)加入每个孔中，并将平板在轻轻摇动下在室温温育1小时。通过用PBST(3x)洗涤来除去未结合的试验物质。将与HRP缀合的第二级抗-人IgG(0.16μg/mL在PBST中)在每个孔中温育1小时。通过用PBST(3x)洗涤除去未结合的二级抗体。将HRP底物TMB加入每个孔中并温育直至可见蓝色。通过添加硫酸(0.2N,100μL)来淬灭反应。在平板读数器(Molecular Devices，Spectramax M5)中测量在450nm的吸光度。使用GraphPad Prism软件绘制所述值。通过四参数曲线拟合确定EC₅₀值。表2总结了结合值(EC₅₀)。

表2

如在表2中所示，B7-H4_2F9亲本抗体以1.46nM的EC₅₀值结合人B7-H4蛋白，并且B4-H4_2F9变体以0.94nM至>100nM之间的EC₅₀值结合人B7-H4蛋白。大多数变体以与B4-H4_2F9类似的EC₅₀值(在三倍以内)结合，但B7-H4_2F9V1、B7-H4_2F9V4、B7-H4_2F9V6、B7-H4_2F9V11和B7-H4_2F9V14(它们以在4.40至11.67nM之间的EC₅₀值结合B7-H4)和B7-H4_2F9V12(其在该测定中没有可测量的结合)除外。

实施例24：通过FACS测量的20种B7-H42F9抗体变体的细胞结合

使用MACSQuant流式细胞计(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach，德国)评价B7-H4_2F9变体抗体和工具B7-H4抗体1D11向培养的MX-1和HCC1569细胞的细胞表面结合。使MX-1细胞在含有10％FBS(Life Technologies)和1％青霉素/链霉素(LifeTechnologies)的DMEM:F12K(Life Technologies)中生长。使HCC1569细胞在含有10％FBS(Life Technologies)和1％青霉素/链霉素(Life Technologies)的RPMI(ATCC)中生长。为了染色，通过使用Accutase细胞脱离溶液(Innovative Cell Technologies)处理来脱离细胞。将脱离的细胞在培养基中研磨，并以在培养基(75μL)中50,000个细胞的密度铺板于96孔U-底平板中。将细胞与各种浓度(100nM至0.0128nM；3倍系列稀释液)的试验物质一起在总体积为100μl的含有6％山羊血清的培养基中在冰上温育3小时。将所述细胞用冰冷的PBS(3x)洗涤，在每个洗涤步骤之间以1,000×RCF沉淀，并重新悬浮于含有2％山羊血清(100μL)和荧光地标记的第二抗体Alexa 647-标记的山羊抗-人IgG(5μg/mL,LifeTechnologies)的RPMI-1640中在冰上保持1小时。将细胞用冰冷的PBS(3x)洗涤并重新悬浮在含有1％低聚甲醛的冰冷的PBS(100μL)中。通过在流式细胞计上分析每次处理的5,000个细胞来确定每个细胞的荧光。绘制每次处理的中位荧光值，并使用Graphpad Prism软件通过四参数曲线拟合计算EC₅₀值。

表3总结了20种B7-H4_2F9抗体变体抗体与指定细胞系结合的EC₅₀值。

表3

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如在表3中所示，与MX-1细胞表面的结合的EC₅₀值是在0.9至4.43nM的范围内，与此相比，对于B4-H4_2F9而言为1.58nM。大多数B7-H4_2F9变体与MX-1细胞的结合的EC₅₀值与B4-H4_2F9非常相似(在两倍以内)，但B7-H4_2F9V2除外，其为4.43nM。1D11抗体与MX-1细胞的结合的EC₅₀值为4.9nM。B4-H4_2F9变体与HCC1569细胞的表面的结合的EC₅₀值是在0.52至2.28nM的范围内，与此相比，对于B4-H4_2F9而言为1.26nM。大多数变体与HCC1569细胞的结合的EC₅₀值与B4-H4_2F9非常相似，但B7-H4_2F9V15除外，其为0.52nM。1D11抗体与HCC1569细胞的表面的结合的EC₅₀值为3.44nM。

实施例25：通过ELISA评估20种B7-H4_2F9抗体变体的多反应性通过杆状病毒颗粒(BVP)ELISA评估20种B7-H4_2F9抗体变体和对照的多反应性。将平板用在碳酸盐缓冲液pH9.6中的1％BVP提取物在4℃包被过夜。对150、50、16.7和5.6μg/mL的试验抗体一式三份地进行试验。使用阳性对照抗体(人IgG1多特异性对照抗体；MEDNA目录号H1308)和阴性对照抗体(人IgG1同种型对照MEDNA目录号1301；小鼠IgG同种型对照(Invitrogen目录号31903)，按照标准ELISA方案进行测定。基于150μg/ml浓度的试验抗体的ELISA信号与背景信号(仅二级抗体)的比值一式三份地计算BVP评分。表4总结了所述抗体的平均BVP评分。

表4

如在表4中所示，B7-H4_2F9的BVP评分(10.7)与1D11抗体的BVP评分相似。结果显示，相对于B4-H4_2F9抗体，变体中的微小序列变化导致了广泛的BVP评分。变体B7-H4_2F9V6、XMT-1603(+K)B7-H4_2F9V7、B7-H4_2F9V8、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V16、B7-H4_2F9V17和XMT-1604(+K)B7-H4_2F9V18的BVP评分都低于B7-H4_2F9和1D11抗体的BVP评分，表明期望的多反应性的降低。其余变体的BVP评分大于B7-H4_2F9抗体、1D11抗体和阳性对照(包括B7-H4_2F9V3、B7-H4_2F9V5、B7-H4_2F9V9、B7-H4_2F9V10、B7-H4_2F9V15、B7-H4_2F9V19和B7-H4_2F9V20抗体)的BVP评分。具有最低BVP评分的5种变体(XMT-1603(+K)B7-H4_2F9V7、B7-H4_2F9V8、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V17和XMT-1604(+K)B7-H4_2F9V18)显示期望的多反应性的降低。序列变化和得到的BVP评分尚无法预测。

实施例26：通过Octet测定B7-H4_2F9抗体变体向人B7-H4蛋白的结合亲和力

通过Biolayer干扰量度法(BLI；Octet；ForteBio)确定B4-H4_2F9、工具抗体1D11和5种B7-H4变体抗体(XMT-1603(+K)(B7-H4_2F9V7)、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V16、B7-H4_2F9V17和XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)的结合动力学，并使用标准的Octet程序(ForteBio)确定亲和力值。将抗体固定化至在1x Kinetics缓冲液中的抗-人Fc生物传感器上。然后将递增浓度的重组人B7-H4蛋白(R&D Systems#6576-B7-050)与在1 x kinetics缓冲液中的固定化的肽结合。表5总结了试验抗体在25℃的K_d(平衡解离常数)、k_on(结合速率)和k_off(解离速率)。

表5

如在表5中所示，B7-H4_2F9抗体和试验的B7-H4_2F9抗体变体XMT-1603(+K)(B7-H4_2F9V7)、B7-H4_2F9V11、B7-H4_2F9V16、B7-H4_2F9V17和XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)关于与人B7-H4的结合具有相当的亲和力值。B4-H4_2F9变体的K_d值是在1.10E-08至2.23E-08M的范围内，而B4-H4_2F9的K_d值为1.39E-08M。B4-H4_2F9变体的k_on值是在7.39E+04至1.84E+05(M^-1s^-1)的范围内，而B4-H4_2F9的k_on值为1.59E+05(M^-1s^-1)。B4-H4_2F9变体的k_off值是在1.61E-03至2.67E-03s^-1,的范围内，而B4-H4_2F9的k_off值为2.21E-03s^-1。工具抗体1D11的K_d值比B4-H4_2F9的K_d值低100倍以上。1D11抗体的k_on值与B4-H4_2F9和变体抗体的值非常相似(在两倍以内)，但比B7-H4_2F9及变体低100倍以上。

实施例27：评估XMT-1604(B7-H4_2F9V18)抗体的T细胞遏制

将野生型HEK-293细胞(HEK-293-WT)或被工程改造成表达B7-H4的HEK293细胞(HEK-293-B7-H4)在96-孔平板中以50,000个细胞的密度在补充了10％FBS和5％青霉素/链霉素的Eagle氏最低基础培养基中铺板并培养，并允许在37℃在5％CO₂的控湿气氛中粘附过夜。第二天，除去培养基并更换为T细胞培养基(含有10％FBS和5％青霉素/链霉素的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基)。将细胞与50nM终浓度的1D11工具抗体XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)抗体或非结合对照抗体帕利珠单抗一起在37℃温育2小时，然后添加如下制备的CD3+T细胞。将冷冻的人PBMC(2.5x10⁷个细胞)融合，并使用Easy step^TM人T细胞分离试剂盒(StemCell Technologies)富集CD3+T细胞。将CD3+T细胞用CellTrace^TM Violet细胞增殖试剂盒(CTV；ThermoFisher Scientific)标记并调至2x10⁶个细胞/mL。将CTV-标记的T细胞(1x10⁵)加入试验物质处理过的HEK-293-WT或HEK-293-B7-H4细胞中，用Immunocult^TM人CD3/CD28 T细胞活化剂(StemCell Technologies)刺激，并在37℃在5％CO₂中温育。将HEK-293-WT或HEK-293-B7-H4与CTV-标记的T细胞一起共培养4天以后，使用流式细胞计量术通过稀释CTV-标记的T细胞来评估T细胞增殖。将来自每个组的共培养的细胞(CTV-标记的T细胞和HEK-293-WT/HEK-293-B7-H4细胞)转移至U-底96-孔平板，用PBS洗涤，用活/死Fixable Aqua死细胞染色染料(ThermoFisher Scientific)染色，并然后另外用荧光团缀合的靶标特异性或同种型对照抗体(FITC抗-人CD45、PE/Cy7抗-人CD4、PE抗-人CD8)染色。将细胞固定并通过在MACSQuant流式细胞计上的流式细胞计量术分析来确定目标蛋白的表面表达。通过FlowJo软件使用下述分级流进行数据分析：1)单门，2)活细胞，3)CD45+细胞，和4)稀释的CTV(与未刺激的T细胞相比)。分别使用与稀释的CTV组合的CD4+和与稀释的CTV组合的CD8+计算增殖的CD4+或CD8+T细胞的百分比。数据代表每种试验物质的一式三份孔的平均值(±标准差)。表6给出了在每种条件下活细胞、CD45+、增殖的CD4+T细胞和增殖的CD8+T细胞的群体(％)。

表6

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^a对单个细胞进行门控；^b对活细胞进行门控；c对单个/活细胞/CD45+进行门控

如在表6中所示，与在对照组(帕利珠单抗)中的HEK-293-WT细胞相比，当将T细胞与HEK-293-B7-H4细胞一起培养时，增殖的CD4+细胞和增殖的CD8+T细胞的比例显著下降(student氏t-检验；分别P≤0.001和P≤0.05)。用1D11 B7-H4_或1604(+K)(B7-H4_2F9V18)抗体处理没有显著恢复CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。因此，XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)不会抑制HEK-293-B7-H4细胞对共培养的CD4+或CD8+T细胞的抗增殖作用。

实施例28：通过ELISA测量变体B7-H4细胞毒性的药物抗体-药物缀合物与B7-H4蛋白的结合如在实施例23中所述通过ELISA测量从B4-H4_2F9变体XMT-1603(+K)、缀合物3)、B7-H4_2F9V11、缀合物6、B7-H4_2F9V17、缀合物7、XMT-1604(+K)、缀合物1-1和缀合物8-1、对应的未缀合的抗体非结合对照ADC缀合物9-1和非结合对照mAb(帕利珠单抗)产生的ADCDAR 6种缀合物向B7-H4蛋白的结合，例外是，将所述孔通过与封闭缓冲液(4％BSA在PBS中)一起温育进行封闭，并使用B7-H4试验物质和非结合对照的一系列稀释液(0.0013nM至100nM；在1％BSA的PBS溶液中的5倍系列稀释液)。表7总结了结合值(EC₅₀)。

表7

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如在表7中所示，用B4-H4_2F9变体抗体XMT-1603(+K)(B7-H4_2F9V7)、B7-H4_2F9V11和XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)以及1D11制备的抗体-药物缀合物的EC₅₀值具有对应的未缀合的抗体的相似结合值(在2.5倍以内)。证实了缀合物7的结合强度比其未缀合的抗体B7-H4_2F9V17低4倍以上。观察到的对照抗体与其相应ADC的结合的缺乏指示B7-H4靶向抗体和ADC的结合特异性。

实施例29：通过ELISA测量XMT-1603(B7-H4_2F9V7)和XMT-1604(B7-H4_2F9V18)细胞毒性药物缀合物向人B7-H4蛋白的结合

如在实施例23中所述通过ELISA试验XMT-1603(+K)(B7-H4_2F9V7)、XMT-1604(+K)(B7-H4_2F9V18)和它们的对应的细胞毒性药物缀合物向人B7-H4蛋白的结合，但是使用试验物质的一系列稀释液(0.0013nM至100nM；在1％BSA的PBS溶液中的5倍系列稀释液)。试验物质是缀合物5、缀合物4、缀合物13、缀合物2-1、缀合物1-2和缀合物12。在该研究中使用的对照包括非结合抗体和非结合对照ADC缀合物10、缀合物9-2和缀合物14(DolaflexinDAR10.9)。表8总结了结合值(EC₅₀)。

表8

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如在表8中所示，用B4-H4_2F9变体抗体XMT-1603B7-H4_2F9V7和XMT-1604B7-H4_2F9V18制备的缀合物的EC₅₀值与其未缀合的抗体的EC₅₀值相似(在两倍内)。用对照抗体观察到的结合的缺乏指示B7-H4靶向抗体和ADC的结合特异性。

实施例30：通过ELISA测量XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和细胞毒性药物缀合物向来自人、猴、大鼠和小鼠的B7-H4蛋白的结合

如在实施例23中所述通过ELISA试验了XMT-1604(B7H4_2F9V18)和对应的细胞毒性药物缀合物向来自人、猴、大鼠和小鼠B7-H4的B7-H4蛋白的结合。在这些研究中使用的蛋白是：人B7-H4(R&D Systems；6576-B7-050)、猴B7-H4(Creative Biomart；VTCN1-1519R)、大鼠(R&D Systems 10085-B7)和小鼠(Creative Biomart；VTCN1-1519R)。试验物质是缀合物2-1、缀合物1-2和缀合物12。在该研究中使用的对照包括非结合hu-IgG1抗体和非结合对照ADC缀合物10、缀合物9-2和缀合物14。表9总结了人、猴、大鼠和小鼠B7-H4的结合值(EC₅₀)。结果是两个研究的平均值。

表9

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如在表9中所示，XMT-1604(B7H4_2F9V18)和对应的细胞毒性药物缀合物缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1的结合值在试验的四个物种中彼此相似。EC₅₀值的范围是在0.20至0.30nM之间(关于结合人B7-H4蛋白)，0.17至0.24nM之间(关于猴蛋白)，0.13至0.18nM之间(关于大鼠蛋白)，和0.30至0.52nM之间(关于小鼠蛋白)。对照细胞毒性药物缀合物和抗体没有显示与B7-H4蛋白的结合。

实施例31：通过Octet测量XMT-1604B7-H4_2F9V18和细胞毒性药物缀合物向人B7-H4蛋白的结合亲和力如在实施例23中所述通过Biolayer干扰量度法(Octet)评价了两个批次向人B7-H4的结合动力学：XMT-1604B7-H4_2F9V18-批次1和它的XMT细胞毒性药物缀合物缀合物2-1、缀合物1-2和缀合物12，以及XMT-1604B7-H4_2F9V18-批次2和它的细胞毒性药物缀合物和缀合物2-2、缀合物1-3。表10总结了人、猴、大鼠和小鼠B7-H4的结果。XMT-1604B7H4_2F9V18-批次1、缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1的结果是三个研究的平均值，并且分析了XMT-1604B7-H4_2F9V18-批次2、缀合物2-2和缀合物1-3一次。

表10

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如在表10中所示，XMT-1604(B7H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物和XMT-1604B7H4_2F9V18抗体的K_d、k_on和k_off值与未缀合的抗体类似。对于XMT-1604B7H4_2F9V18-批次1及其缀合物缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1，K_d值是在1.87E-08至2.56E-08M之间，k_on值是在8.13E+04至1.09E+05M^-1s^-1之间，且k_off值是在1.80E-03至1.94E-03s^-1之间。对于XMT-1604B7H4_2F9V18-批次2和它的细胞毒性药物缀合物缀合物1-3和缀合物2-2，K_d值是在2.15E-08至2.51E-08M之间，k_on值是在8.51E+04至1.06E+05之间，且k_off值是在2.01E-03至2.44E-03之间。

实施例32：通过FACS对XMT-1604(B7-H4_2F9V18)B7-H4细胞毒性的药物-药物缀合物的细胞结合测定

通过流式细胞计量术评价了XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的缀合物缀合物2-1、缀合物1-2和缀合物12向人B7-H4的细胞表面结合。在该研究中使用的对照包括非结合hu-IgG1抗体、帕利珠单抗和ADC缀合物10、缀合物9-2和缀合物14。

如在实施例24中所述使用MACSQuant流式细胞计(Miltenyi Biotec,BergischGladbach，德国)评价了试验物质向用人B7-H4稳定转染的细胞系MX-1和HEK-293细胞以及未转染的HEK-293细胞的结合，例外是，在0.0013nM至100nM的浓度评价试验物质；即在1％BSA的PBS溶液中的5倍系列稀释液。如在实施例24中所述培养MX-1细胞。在EMEM(ATCC)、10％FBS、1％青霉素/链霉素和3μg/ml嘌呤霉素(Life Technologies)中培养HEK-293-B7-H4细胞，并在EMEM、10％FBS、1％青霉素/链霉素中培养未转染的HEK-293细胞。表11总结了试验物质在MX-1、HEK-293-B7-H4和HEK-293细胞的表面上的EC₅₀值。结果是每种试验物质的两个重复实验的平均值。

表11

如在表11中所示，XMT-1604(B7-H4_2F9V18)向MX-1和HEK-293-B7-H4细胞的结合与其细胞毒性药物缀合物缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1的结合非常类似(都在两倍内)。非结合对照抗体和它的细胞毒性药物缀合物没有结合MX-1或HEK-293-B7-H4细胞，并且没有试验物质结合未转染的HEK-293细胞。这些结果指示XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的细胞毒性药物缀合物向细胞表面B7-H4的特异性强效结合。

实施例33：XMT-1604(B7-H4_2F9V18)-细胞毒性药物缀合物的细胞毒性测定

在细胞毒性测定中试验了XMT-1604(B7-H4_2F9V18)细胞毒性药物缀合物的抗增殖活性。试验细胞毒性药物缀合物是缀合物2-1、缀合物1-2、缀合物1-3和缀合物12。在该研究中使用的对照包括非结合对照缀合物缀合物10、缀合物9-2和缀合物14。

使用CellTiter-(Promega Corp)使用HEK-293-B7-H4和未转染的HEK-293细胞进行体外细胞毒性测定。将细胞以2,000个细胞/孔的密度铺板在白色壁(体积)96-孔平板中，并允许在5％CO₂的控湿气氛中在37℃粘附过夜。将细胞与递增浓度的试验物质一起温育。3天后，或对于CAMA-1细胞而言5天后，将CellTiter-/>试剂在室温加入孔中。在10分钟以后使用SpectraMax M5平板读数器(Molecular Devices)测量发光信号。使用Graphpad Prism软件产生剂量-应答曲线。从四参数曲线拟合确定EC₅₀值。表12总结了EC₅₀值。显示的值是每种试验物质的两个重复实验的平均值。

表12

如在表12中所示，对于CAMA-1细胞，缀合物1-3的效力比缀合物9-2强200倍以上。对于HEK-293-B7-H4细胞，缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1显示出类似的细胞毒性效能(在两倍内)，而非结合对照缀合物缀合物9-2、缀合物10和缀合物14的效力低100倍以上。在不表达B7-H4的未转染的HEK-293细胞中，所有缀合物显示出大于100nM的类似EC₅₀值(在两倍内)。这些研究的结果指示B7-H4缀合物对细胞的细胞毒性的特异性强效诱导。

实施例34：通过ELISA测量XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和1D11 STING激动剂缀合物向重组人B7-H4蛋白的结合

如在实施例23中所述通过ELISA测量XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的STING激动剂缀合物缀合物15和缀合物19向重组人B7-H4蛋白的结合，例外是，通过用封闭缓冲液(3％BSA在PBST中的溶液)温育来封闭孔，并且使用0至100nM的试验物质的一系列稀释液(在1％BSA的PBST溶液中的4倍系列稀释液)。在该研究中的其它试验物质是1D11抗体和它的STING激动剂缀合物(缀合物16、缀合物18和缀合物20)、非结合抗体(帕利珠单抗)和它的STING激动剂缀合物缀合物17。表13总结了结合值(EC₅₀)。

表13

如在表13中所示，分别为0.99、1.08、0.76、0.47和1.54nM的缀合物15、缀合物16、缀合物18、缀合物19和缀合物20的EC₅₀值是相当的，而对照抗体和它的缀合物未显示任何结合。这些结果指示XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的缀合物向人B7-H4蛋白的特异性结合。

实施例35：通过FACS对XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和1D11 STING激动剂缀合物的细胞结合测定使用MACSQuant流式细胞计(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach，德国)评估XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的缀合物(缀合物15、缀合物15-1和缀合物20)向MX-1细胞的细胞表面结合。在该研究中使用的对照包括1D11抗体和它的缀合物(缀合物16和缀合物19)和非结合抗体(帕利珠单抗)和它的缀合物缀合物17。如在实施例24中所述进行实验，例外是，将细胞在冰上温育2小时，其中试验物质的浓度范围为0.0122nM至200nM(4倍系列稀释液)，在用6％山羊血清修正的100μl总体积的培养基中。将细胞用冰冷的PBS(2x)洗涤，在每个洗涤步骤之间以1,000×RCF沉淀，并重新悬浮在含有2％山羊血清(100μL)和荧光地标记的第二抗体Alexa 647-标记的山羊抗-人IgG(6μg/mL,Life Technologies)的RPMI-1640中在冰上保持1小时。将细胞用冰冷的PBS(2x)洗涤，并重新悬浮在含有1％低聚甲醛的冰冷的PBS(100μL)中。通过在流式细胞计上分析每次处理的10,000个细胞来测定每个细胞的荧光。表14总结了所述抗体及其相应的STING激动剂缀合物与MX-1细胞结合的EC₅₀值。

表14

如在表14中所示，XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和它的缀合物(缀合物15、缀合物15-1和缀合物20)向MX-1细胞的结合是相当的，并且它们的EC₅₀值大于关于1D11抗体和它的缀合物(缀合物16和缀合物19)所观察到的结果(在2-4倍内)。非结合对照抗体(帕利珠单抗)和它的缀合物缀合物17没有结合MX-1细胞。这些结果表明B7-H4_2F9V18和它的缀合物缀合物15、缀合物15-1和缀合物20向细胞表面B7-H4的低nM特异性结合。

实施例36：使用癌细胞/THP1萤光素酶报道细胞共培养物对XMT-1604(B7-H4_2F9V18)和1D11 STING激动剂缀合物的STING活化体外功能测定通过癌细胞/THP1-IRF3-萤光素酶报道细胞共培养物测定来评价靶向B7-H4的STING激动剂缀合物对免疫细胞中的STING途径的诱导。将MX-1细胞接种在96-孔CellBind表面组织培养板(17,000个细胞/孔)中，并允许在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中附着4小时。将缀合物缀合物15、缀合物16、缀合物19、缀合物20、缀合物15-1、缀合物15-2和缀合物17或游离STING激动剂(如在US11,155,567中所述制备)的一系列稀释液(0.01nM至100nM，基于有效负载；在生长培养基中的4倍系列稀释液)加入每个孔中，并将平板在37℃温育20min。然后将THP1-Dual^TM细胞(InvivoGen)(50,000个细胞)加入每个孔中，并在5％CO₂控湿气氛中在37℃温育24小时。将来自每个温育的样品的细胞培养物上清液(20μL)加入重新悬浮的QUANTI-Luc(InvivoGen)(50μL)中，并立即使用SpectraMax M5平板读数器(MolecularDevices)测量发光信号。从剂量应答曲线确定EC₅₀值。表15提供了与MX-1癌细胞共培养的THP1-Dual细胞中的EC₅₀值。

表15

如在表15中所示，STING激动剂缀合物缀合物15、缀合物16、缀合物19、缀合物20、缀合物15-1、缀合物15-2表现出具有低于1nM的EC₅₀值的类似萤光素酶报告活性，并且分别比非结合抗体(帕利珠单抗)缀合物缀合物17和游离STING激动剂低至少200倍。因而，B7-H4_2F9V18 STING激动剂缀合物表现出靶标特异性和Fc受体介导的递送至免疫细胞(THP1)以实现活性的作用。

实施例37：在MX-1TNBC异种移植物小鼠模型中对B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物的施用的肿瘤生长应答

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠约1mm³)。当肿瘤体积是在63-196mm³之间时(平均值＝119-123mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物9-1(2.46/0.075或4.92/0.150mg/kg)、缀合物11(2.28/0.075或4.56/0.150mg/kg)、缀合物3(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)、缀合物6(2.30/0.075或4.61/0.150mg/kg)、3740(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)或缀合物1-1(2.30/0.075或4.60/0.150mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。没有发现显著的体重减轻或临床观察结果。

图7提供了用以下B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物处理的携带MX-1肿瘤的小鼠的肿瘤体积的结果：缀合物9-1、缀合物11、缀合物3、缀合物6、缀合物7和缀合物1-1。使用缀合物11 2.28/0.075mg/kg的处理产生4例CR。使用缀合物3 2.30/0.075mg/kg的处理产生1例PR和1例CR。使用缀合物6 2.30/0.075mg/kg的处理产生1例PR、2例CR、1例TFS。使用缀合物72.30/0.075mg/kg的处理产生1例PR、3例CR、1例TFS。使用缀合物1-1 2.30/0.075mg/kg的处理产生2例PR、1例CR、1例TFS。使用缀合物11 4.56/0.150mg/kg的处理产生1例PR、9例CR、4例TFS。使用缀合物34.60/0.150mg/kg的处理产生10例CR、6例TFS。使用缀合物6 4.61/0.150mg/kg的处理产生10例CR、10例TFS。使用缀合物7 4.60/0.150mg/kg的处理产生10例CR、8例TFS。使用缀合物1-1 4.60/0.150mg/kg的处理产生10例CR、7例TFS。没有其它处理诱导消退应答。

实施例38：在MX-1TNBC异种移植物小鼠模型中对B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物的施用的肿瘤生长应答

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠约1mm³)。当肿瘤体积是在75-221mm³之间时(平均值＝123.5-126.8mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物10(14.37/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或0.75/0.050mg/kg)、缀合物1-2(5.37/0.177、2.33/0.077或1.79/0.059mg/kg)、缀合物2-1(13.45/0.150、4.60/0.050或2.30/0.025mg/kg)或XMT-1604B7-H4_2F9V18(13.80/0mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。没有发现显著的体重减轻或临床观察结果。

图8提供了用B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物处理的携带MX-1肿瘤的小鼠的肿瘤体积的结果：缀合物14、缀合物9-2、缀合物10、缀合物12、缀合物1-2、缀合物2-1和XMT-1604(B7-H4_2F9V18)。使用缀合物14 2.57/0.150mg/kg的处理产生1例CR、1例TFS。使用缀合物12 2.26/0.150mg/kg的处理产生1例PR。使用缀合物1-2 5.37/0.177mg/kg的处理产生10例CR、8例TFS。使用缀合物1-2 2.33/0.077mg/kg的处理产生1例PR、2例CR、2例TFS。使用缀合物1-2 1.79/0.050mg/kg的处理产生1例CR。没有其它处理诱导消退应答。

实施例39：在HBCx-19患者衍生出的异种移植物模型中对B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物的施用的肿瘤生长应答

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入HBCx-19人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠4x3mm)。当肿瘤体积是在75-221mm³之间时(平均值＝123.5-126.8mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物1-2(1.79/0.059或5.37/0.177mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物2-1(4.60/0.050或13.45/0.150mg/kg)或缀合物10(14.37/0.150mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。没有发现显著的体重减轻或临床观察结果。

图9提供了用以下B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物处理的HBCx-19荷瘤小鼠的肿瘤体积的结果：缀合物9-2、缀合物10、缀合物1-21和缀合物2-1。使用缀合物1-2(5.37/0.177mg/kg)的处理产生7例TFS，表明该缀合物是最有效的。没有其它处理诱导抗肿瘤应答。

实施例40：在HBCx-24患者衍生出的异种移植物模型中对B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物的施用的肿瘤生长应答给雌性无胸腺裸鼠皮下植入HBCx-24人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠

4x3mm)。当肿瘤体积是在62.5-256mm³之间时(平均值＝141.40-149.25mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物10(14.37/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或0.75/0.050mg/kg)、缀合物1-2(4.56/0.150、2.30/0.076或1.52/0.05mg/kg)、缀合物2-1(13.45/0.150、4.60/0.050或2.30/0.025mg/kg)或XMT-1604(B7-H4_2F9V18)(13.80/0mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。没有发现显著的体重减轻或临床观察结果。

图10提供了用以下B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物处理的携带HBCx-24肿瘤的小鼠的肿瘤体积的结果:缀合物14、缀合物9-2、缀合物10、缀合物12、缀合物1-2、缀合物2-1和XMT-1604(B7-H4_2F9V18)。使用缀合物12(2.26/0.150mg/kg)的处理产生3例PR、6例CR、1例TFS。使用缀合物1-2(1.52/0.050mg/kg)的处理产生5例TFS。使用缀合物1-2(2.30/0.076mg/kg)的处理产生3例PR和4例CR。使用缀合物1-2(4.56/0.150mg/kg)的处理产生10例CR和3例TFS。使用缀合物2-1(4.60/0.050mg/kg)的处理产生5例TS。使用缀合物2-1(13.80/0.150mg/kg)的处理产生7例TS。没有其它处理诱导抗肿瘤应答。

实施例41：在施用B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物以后在MX-1肿瘤小鼠中的总药物的血浆暴露

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1肿瘤片段(每组n＝4)。在第1天静脉内地施用缀合物12(2.26/0.150或0.75/0.050mg/kg)、缀合物1-2(5.37/0.177、2.33/0.077或1.79/0.059mg/kg)或缀合物2-1(13.80/0.150、4.60/0.050或2.30/0.025mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。在下述时间点收集剪尾血液样品(0.04mL)：在定量施用以后15分钟、24小时(第2天)、72小时(第4天)、168小时(第8天)、240小时(第11天)和336小时(第15天)。用K₂EDTA抗凝剂将血液处理成血浆用于收集。将样品快速冷冻并在-80℃储存直至装运。

使用MSD-ECL夹心免疫测定测量总抗体。在使用通用抗-人Fc磁珠免疫捕获样品并用氢氧化钠处理以释放缀合的药物以后，通过LC-MS测量缀合的药物。表16和17分别给出了总抗体和缀合的药物的PK参数。

表16

表17

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对于总抗体，缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1似乎具有与剂量成比例的C_max。所有试验物质似乎都表现出随着剂量增加的清除率降低。缀合物1-2在不同的剂量水平具有与缀合物2-1相当的清除率，但由于DAR差异和相等的有效负载定量施用，抗体暴露(AUC)较低。对于抗体缀合的药物，缀合物12、缀合物1-2和缀合物2-1似乎具有与剂量成比例的C_max。观察到与缀合物1-2和缀合物2-1相比，具有0.15mg/kg和0.05mg/kg的有效负载剂量的缀合物12具有更低的暴露和更快的清除。在不同的剂量水平，缀合物1-2具有与缀合物2-1相当的暴露和清除。

实施例42：在施用B7-H4_2F9细胞毒性药物缀合物以后在MX-1肿瘤小鼠中的总药物的血浆暴露

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1肿瘤片段(每组n＝4)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物11(4.56/0.150mg/kg)、缀合物3(4.60/0.150mg/kg)、缀合物6(4.61/0.150mg/kg)、3740(4.60/0.150mg/kg)或缀合物1-1(4.60/0.150mg/kg)(所有剂量都按抗体/有效负载给出)。在下述时间点收集剪尾血液样品(0.04mL):在定量施用以后15分钟、24小时(第2天)、72小时(第4天)、168小时(第8天)、240小时(第11天)和336小时(第15天)。用K₂EDTA抗凝剂将血液处理成血浆用于收集。将样品快速冷冻并在-80℃储存直至装运。使用MSD-ECL夹心免疫测定测量总抗体。在用氢氧化钠直接处理样品以释放缀合的药物以后，通过LC-MS测量总药物。表18和19分别给出了总抗体和总药物的PK参数。

表18

表19

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对于总抗体，所有试验物质具有大致相当的C_max、清除和暴露(表示为AUC∞)。对于缀合的药物，所有试验物质在C_max、清除和暴露(表示为AUC∞)方面具有相当的PK参数。

实施例43：在MX-1异种移植物小鼠模型中对B7-H4_2F9V18和1D11STING激动剂药物缀合物的施用的肿瘤生长应答给雌性CB.17SCID小鼠皮下接种MX-1人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠约1mm³)。当肿瘤体积是在63-108mm³之间时(平均值＝76.8-82mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物17(0.085/0.030或2.84/0.100mg/kg)、缀合物16(0.89/0.030或2.97/0.100mg/kg)、缀合物15(0.85/0.030或2.83/0.100mg/kg)或diABZI IV STING激动剂(5mg/kg)(所有剂量都写作抗体/有效负载)。

图11提供了用以下STING激动剂药物缀合物处理的携带MX-1肿瘤的小鼠的肿瘤体积的结果：缀合物17、缀合物16、缀合物15和diABZI IV STING激动剂。使用缀合物17(2.84/0.100mg/kg)的处理产生1例CR；在研究终止时(第60天)，该动物被分类为无肿瘤存活者。使用缀合物16(0.89/0.030mg/kg)的处理产生1例PR和2例CR；1例TFS。使用缀合物16(2.97/0.100mg/kg)的处理产生8例CR、6例TFS。使用缀合物15(0.85/0.030mg/kg)的处理产生1例CR和1例TFS。使用缀合物15(2.83/0.100mg/kg)的处理产生10例CR、5例TFS。使用diABZI IVSTING激动剂(5mg/kg)的处理产生1例CR。结果表明，缀合物15(2.83/0.100mg/kg)是最有效的。

实施例44：在MX-1TNBC异种移植物模型中对B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物的施用的肿瘤生长应答

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1人乳癌异种移植物肿瘤片段(1mm³每只小鼠)。当肿瘤体积是在75至196mm³之间时(平均值＝125-128mm³/组)，将动物随机分入处理组中(n＝10/组)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物14(2.57/0.150mg/kg)、缀合物9-2(4.56/0.150mg/kg)、缀合物12(2.26/0.150或1.13/0.075mg/kg)、缀合物1-3(4.68/0.150或2.34/0.075mg/kg)或缀合物2-2(13.81/0.150或6.90/0.075mg/kg)(所有剂量都写作抗体/有效负载)。没有发现显著的体重减轻或临床观察结果。

图12提供了用缀合物14、缀合物9-2、缀合物12、缀合物1-3或缀合物2-2处理的携带MX-1肿瘤的小鼠的肿瘤体积的结果。使用缀合物12(2.26/0.150mg/kg)的处理产生1例CR。使用缀合物1-3(4.68/0.150mg/kg)的处理产生10例CR、7例TFS。使用缀合物1-3(2.34/0.075mg/kg)的处理产生2例PR。没有其它处理诱导消退应答。

实施例45：在施用B7-H4_2F9V18细胞毒性药物缀合物以后在小鼠中的血浆暴露

给雌性无胸腺裸鼠皮下植入MX-1人乳癌异种移植物肿瘤片段(每只小鼠约1mm³)。在第1天静脉内地施用媒介物、缀合物1-3(2.32/0.075；4.65/0.15)、缀合物2-2(6.74/0.075；13.5/0.15)或缀合物12(1.13/0.075；2.26/0.15)作为单次剂量(所有剂量都写作抗体/有效负载)。在下述时间点收集剪尾血液样品(0.04mL)：在定量施用以后15分钟、24小时(第2天)、72小时(第4天)、168小时(第8天)、240小时(第11天)和336小时(第15天)。用K₂EDTA抗凝剂将血液处理成血浆用于收集。将样品快速冷冻并在-80℃储存直至装运。使用MSD-ECL夹心免疫测定测量总抗体。在将所述样品用固定化在磁珠上的抗-人IgG1 Fc抗体进行免疫捕获以后，通过LC-MS测量缀合的药物，随后通过水解进行AF-HPA释放。表20和21分别给出了总抗体和缀合的药物的PK参数。

表20

表21

对于总抗体，缀合物1-3、缀合物2-2和缀合物12似乎具有与剂量成比例的C_max。观察到缀合物12具有与缀合物1-2和2-2相比更低的暴露和更快的清除。缀合物1-3在不同的剂量水平具有与缀合物2-2相当的清除，但是具有低抗体暴露(AUC)。

对于抗体缀合的药物，缀合物1-3、缀合物2-2和缀合物12似乎具有与剂量成比例的C_max。观察到缀合物12具有与缀合物1-2和2-2相比更低的暴露和更快的清除。缀合物1-3在不同的剂量水平具有与缀合物2-1相当的暴露和清除。

实施例46：在施用B7-H4细胞毒性药物缀合物研究以后在食蟹猴中的血浆暴露

通过静脉内输注历时45分钟给食蟹猴静脉内地注射媒介物、缀合物1-3(2.81/0.09)或缀合物2-2(8.28/0.09)(每组一只雄性和一只雌性)。在施用前和在输注结束之后1小时、6小时、24小时(第1天)、96小时(第5天)、168小时(第8天)、240小时(第11天)和336小时(第15天)和504小时(第22天)收集血液样品。用K2-EDTA抗凝剂将血液处理成血浆用于收集。将样品在干冰上冷冻并在-80℃储存直至装运。

使用MSD-ECL夹心免疫测定测量总抗体。通过LC-MS测量游离药物。在将所述样品用固定化在磁珠上的抗-人IgG1 Fc抗体进行免疫捕获以后，通过LC-MS测量缀合的药物，随后通过水解进行AF-HPA释放。表22、23和24分别给出了总抗体、缀合的药物和游离药物的PK参数。

表22

表23

表24

对于总抗体，缀合物1-3在不同的剂量水平具有与缀合物2-2相当的清除。对于缀合的药物，缀合物1-3具有与缀合物2-2相当的暴露和清除。缀合物1-3和缀合物2-2都具有低游离AF-HPA水平。

实施例47：在施用B7-H4 STING激动剂药物缀合物研究以后在食蟹猴中的血浆暴露

通过静脉内输注历时45分钟给食蟹猴静脉内地注射缀合物15-2(9.0/0.33)(一只雄性和一只雌性)。在施用前和在输注结束之后1小时、6小时、24小时(第1天)、48小时(第2天)、96小时(第5天)、168小时(第8天)、240小时(第11天)、336小时(第15天)和504小时(第22天)收集血液样品。用K2-EDTA抗凝剂将血液处理成血浆用于收集。将样品在干冰上冷冻并在-80℃储存直至装运。

使用MSD-ECL夹心免疫测定测量总抗体。通过LC-MS测量游离药物。在将所述样品用固定化在磁珠上的抗-人IgG1 Fc抗体进行免疫捕获以后，通过LC-MS测量缀合的药物，随后通过水解释放药物。表25、26和27分别给出了总抗体、缀合的药物和游离药物的PK参数。

表25

表26

表27

实施例48.B7-H4_2F9V18细胞毒性的药物缀合物在人原发性乳癌异种移植物的未选择系列中的效力将一组28位乳癌患者衍生的异种移植物模型(Champions Oncology)(由供应商按先前治疗史注解，并分成TNBC和ER-阳性的亚型)植入无胸腺Nude-Foxn1n小鼠中。当肿瘤达到150-300mm³的平均体积时，在第1天用缀合物1-3(4.71mg/kg/0.15mg/kg，抗体/有效负载)或盐水媒介物的单次静脉内施用处理动物(n＝3)。测量肿瘤体积，直至对照组的平均肿瘤体积为1500mm³的计划终点或第28天。在终点，将异种移植物或肿瘤床(在没有可触知的肿块的情况下)收集为福尔马林固定的石蜡包埋材料。最初为本研究提出的另外两个ER阳性模型，由于出乎意料的快速生长/不明确的肿瘤起源(CTG-3277)或在媒介物动物中非常缓慢的生长(CTG-2611)，被排除在总结分析之外。

图13显示了缀合物1-3的效力，其按中位最佳应答(MBR)排序，按受体状态(TNBC相对于ER-阳性)划分，如供应商所注解的。Y轴显示了通过每种模型实现的MBR且X轴鉴定模型ID。在这项研究中，9/28(32％)的乳腺癌模型在单次剂量的缀合物1-3之后达到了50％的中位最佳应答(在Y轴上显示为-0.5)或更好，并且与ER-阳性的模型3/13(23％)相比，在TNBC模型6/15(40％)中50％或更多的MBR的抗肿瘤作用的频率更高。

实施例49.在小鼠原代异种移植物组织中B7-H4的蛋白和RNA表达

基于来自实施例44的异种移植物组织的可用性，进行RNA和蛋白分析。根据生产商的说明书，使用Qiagen Rneasy FFPE试剂盒从FFPE样品中提取RNA。基于nanodrop读出和使用含exDNA酶的Thermofisher SuperScript IV VILO主混合物产生的cDNA来均衡样品。使用TaqMan Fast Advanced主混合物建立基因表达测定。将ABI测定Hs01552471_g1用于VTCN1。将Hs99999903_m1 ACTB和Hs03929097_g1 GAPDH用作内源对照。将表达数据分析为在每个媒介物处理组(通常n＝3)中的动物的平均值相对于通用RNA对照的ΔΔCt。

对来自每种模型的单独媒介物处理的动物进行IHC以检测B7-H4表达。简而言之，将组织在带正电荷的载玻片上以4μ切片并干燥过夜。使用Leica BOND III平台，将切片烘烤、脱蜡并进行抗原修复(LEICA BOND III ER1+蛋白水解酶K)。以0.2μg/ml的浓度使用第一B7-H4抗体(Abcam ab209242)(在DAKO/Agilent稀释剂S3022中制备)。使用Leica BONDPolymer Refine系统/DAB色原体检测信号。通过光学显微术评价载玻片并使用H-S核心和TPS方法评分。

图14显示了通过TPS评分评价的蛋白表达。似乎存在效力/表达关系。当将TPS评分按受体状态进行网格划分时，在被注解为TNBC的模型中更可能出现更高的表达。将H评分或相对RNA表达值与化合物效力进行对比，发现了类似的模式。

等同方案

在以上所附描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或试验本公开内容，但现在描述方法和材料。本公开内容的其它特征、目的和优点将从说明书和权利要求书显而易见。在说明书和所附权利要求书中，单数形式包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在本说明书中引用的所有专利和出版物通过引用并入。

前述描述仅为了说明的目的而呈现，且无意将本发明限制为所公开的精确形式，而是由所附权利要求书限制。

序列表

<110> 梅尔莎纳医疗公司

<120> 靶向B7H4的抗体-药物缀合物及其使用方法

<130> MRSN-034/001WO (322140-2485)

<150> 63/133,707

<151> 2021-01-04

<150> 63/172,968

<151> 2021-04-09

<160> 59

<170> PatentIn 3.5版

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<213> 智人

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

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<400> 56

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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<210> 57

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人

<400> 57

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Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

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<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 58

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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

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195 200 205

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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 59

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人

<400> 59

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser

20 25 30

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

50 55 60

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val

65 70 75 80

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met

85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

115 120 125

Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

180 185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met

195 200 205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val

225 230 235 240

Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu

260 265 270

Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys

275 280

Claims

1.分离的特异性地结合B7-H4的抗体，所述抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ IDNO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ ID NO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。

2.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变序列。

3.权利要求1所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。

4.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体含有包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变序列。

5.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体含有包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。

6.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是单克隆抗体。

7.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是兔、小鼠、嵌合的、人源化的或全人的单克隆抗体。

8.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是IgG同种型。

9.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体是IgG1同种型。

10.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与特定分离的抗体竞争对人B7-H4的特异性结合，所述特定分离的抗体含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)。

11.前述权利要求中的任一项所述的分离的抗体，其中所述分离的抗体与特定分离的抗体竞争对人B7-H4的特异性结合，所述特定分离的抗体含有包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变序列和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变序列，或者所述特定分离的抗体含有包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链。

12.B7-H4抗体-药物缀合物，其包含前述权利要求中的任一项的分离的抗体。

13.权利要求12的缀合物，所述缀合物包含共价地连接至所述靶向部分的一个或多个接头-药物部分，其中：

每个接头-药物部分包含一个多功能接头，该接头通过每个药物单元的可释放组装单元的中间体将所述靶向部分连接至一个或多个药物单元(例如，一种或多种治疗剂(D))，并将亲水基团连接至每个接头-药物部分的药物单元；所述可释放组装单元能够在所述靶向部分所靶向的靶位点附近释放游离药物；且

14.选自表A1和表A2中的缀合物中的任一种的缀合物。

15.选自表B1和表B2中的缀合物中的任一种的缀合物。

16.权利要求12的缀合物，其为式(XXXVII)：

其中

d₁₃是2；

抗体是B7-H4修饰的抗体，其含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ IDNO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)；

所述接头-药物部分连接至在所述B7-H4抗体的N297处的天冬酰胺基团；且

■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

17.权利要求12的缀合物，其为式(XXXVIII)：

其中

d₁₃是整数2；

抗体是B7-H4抗体，其含有包含氨基酸序列GFIVSRNY(SEQ ID NO:2)的可变重链互补性决定区1(CDRH1)、包含氨基酸序列IYGSGRT(SEQ ID NO:3)的可变重链互补性决定区2(CDRH2)、包含氨基酸序列ARDADYGLDV(SEQ ID NO:16)或氨基酸序列ARDADYGMDV(SEQ IDNO:10)的可变重链互补性决定区3(CDRH3)、包含氨基酸序列QSVSSSY(SEQ ID NO:53)的可变轻链互补性决定区1(CDRL1)、包含氨基酸序列GAS(SEQ ID NO:54)的可变轻链互补性决定区2(CDRL2)、包含氨基酸序列QQYGSSPLYT(SEQ ID NO:55)的可变轻链互补性决定区3(CDRL3)；

所述接头-药物部分连接至在所述抗体的N297处的天冬酰胺基团；且■是GlcNAc；△是Fuc；且□是GalNAc。

18.缀合物，其具有式：

其中d₁₃是8，抗体是B7-H4抗体或半胱氨酸工程改造的B7-H4抗体，

19.在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包含给所述受试者施用权利要求12-18中的任一项的缀合物。

20.用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的权利要求12-18中的任一项的缀合物。

21.权利要求12-18中的任一项的缀合物在药物制备中的用途，所述药物用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症。

22.权利要求12-18中的任一项的缀合物用于在有此需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的用途。

23.权利要求19-22中的任一项所述的方法、缀合物或用途，其中所述缀合物在生物降解后释放一种或多种治疗剂。

24.权利要求19-23中的任一项所述的方法、缀合物或用途，其中所述疾病或病症是癌症。

25.权利要求24所述的方法、缀合物或用途，其中所述癌症是B7-H4阳性的癌症。

26.权利要求25所述的方法、缀合物或用途，其中所述B7-H4阳性的癌症是胆管癌、乳癌、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、子宫癌、甲状腺癌、肾癌、头颈癌、胃癌、黑素瘤、胆管癌、胆管上皮癌、胰腺癌、结肠癌或膀胱癌。

27.权利要求19-26中的任一项所述的方法、缀合物或用途，其中所述受试者是人。

28.权利要求19-27中的任一项所述的方法，进一步包括将治疗剂施用给受试者。