TW202120558A - 新型抗cldn18.2抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明在此提供抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段、編碼上述抗體或其抗原結合片段之分離之聚核苷酸、包含上述抗體或其抗原結合片段之藥物組合物及其用途。
Description
本發明總體上係關於與人CLDN18.2特異性結合之新型抗CLDN18.2抗體。
Claudin-18 (CLDN18)分子(Genbank登錄號:剪接變異體1 (CLDN18A1或CLDN18.1):NP_057453、NM_016369及剪接變異體2(CLDN18A2或CLDN18.2):NM_001002026、NP_001002026)為具有分子量約為27.9/27.72kD之整合跨膜蛋白。CLDN18蛋白位於上皮及內皮之緊密連接內,其在相鄰細胞之間組織膜內顆粒互連鏈之網狀物。CLDN18及閉合蛋白為緊密連接中最突出之跨膜蛋白成分。由於其緊密之細胞間黏附特性,此等緊密連接蛋白質可形成主要屏障,以防止及控制溶質之細胞旁轉運,且限制膜脂及蛋白質之橫向擴散,以維持細胞極性。因此,其在組織上皮組織結構中起關鍵作用。
CLDN18為四跨膜蛋白家族之成員,具有4個疏水區。CLDN18顯示了幾種不同之構象,可藉由抗體選擇性地對其進行處理(參見Sahin U, Koslowski M, Dhaene K等人, Claudin-18 splice variant 2 is a pan-cancer target suitable for therapeutic antibody development[J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(23): 7624-7634)。如針對絕大多數CLDN家族成員所述,CLDN18-構象-1之所有四個疏水區域均作為跨膜結構域(TM),且形成兩個細胞外環(由疏水區1及疏水區2包圍之第1環;由疏水區3及4包圍之第2環)。第二構象(CLDN18-構象-2)意謂,如針對PMP22所述,第二及第三疏水區未完全穿過質膜,因此第一及第四跨膜結構域之間的部分(D3環)位於細胞外。第三構象(CLDN18-構象-3)顯示了具有兩個內部疏水區之很大的胞外結構域,其由第一及第四疏水區包圍。由於D3環中具有典型的N-糖基化位點,因此CLDN-18拓樸變異體CLDN18拓樸-2及CLDN18拓樸-3包含額外之細胞外N-糖基化位點。
CLDN18具有兩種不同之剪接變異體,其在小鼠及人中均存在。剪接變異體CLDN18.1及CLDN18.2在包含第一個TM及第1環之N端處的前21個胺基酸不同,而C端之蛋白序列相同(參見Niimi T, Nagashima K, Ward J M等人,Claudin-18, a novel downstream target gene for the T/EBP/NKX2. 1 homeodomain transcription factor, encodes lung-and stomach-specific isoforms through alternative splicing[J]. Molecular and cellular biology, 2001, 21(21): 7380-7390)。
CLDN18.1在正常之肺及胃之上皮細胞上選擇性表現,而CLDN18.2僅在胃細胞上表現。最重要的是,CLDN18.2之表現僅限於胃上皮細胞之分化後之短壽細胞中,但不在胃部幹細胞區域表現。使用靈敏的RT-PCR,在任何其他正常人體器官中均無法偵測到此兩種變異體。但其在幾種癌症類型中(包括胃癌、食道癌、胰臟癌及肺癌以及人癌細胞株)高表現(參見Matsuda Y, Semba S, Ueda J等人,Gastric and intestinal claudin expression at the invasive front of gastric carcinoma[J]. Cancer science, 2007, 98(7): 1014-1019)。
迫切需要可用於治療CLDN18.2表現呈陽性之疾病(例如癌症)之新型抗CLDN18.2抗體。
本發明全文中之冠詞「一種(a)」、「一個(an)」及「上述(the)」在此用於指代一個或多於一個(即,至少一個)該冠詞之語法對象。舉例而言,「一種抗體」指一種抗體或多於一種抗體。
本發明尤其提供了新型單株抗CLDN18.2抗體,編碼該抗體之核苷酸序列,以及其用途。
在一個態樣中,本發明提供了分離之針對人CLDN18.2之抗體或其抗原結合片段,其能夠與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列中D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基。
在某些實施方式中,上述抗原決定基包含在E56位處之胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基不包含至少一個以下殘基:A42或N45。在某些實施方式中,上述抗原決定基包含在W30、L49、W50、R55及E56位處之胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基亦包含T41、N45、Y46、R51、F60、E62及R80中之一或多個胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基進一步包含D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79中之一或多個胺基酸殘基。
在一個態樣中,本發明提供了分離之抗體或其抗原結合片段,其能夠與人CLDN18.2特異性結合且具有至少一個以下特徵:
a) 如藉由KinExA分析所測定,以不超過2.5nM (或不超過2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 nM)之Kd值與表現人CLDN18.2之細胞結合;
b) 如藉由流式細胞術所測定,以不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 μg/ml)之EC50值與表現人CLDN18.2之細胞結合;
c) 如藉由細胞毒性分析所測定,以不超過1 μg/ml (或不超過0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導補體依賴之細胞毒性(CDC);
d) 如藉由ADCC報導基因分析所測定,以不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導抗體依賴之細胞毒性(ADCC)。
在某些實施方式中,上述細胞包含NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞、或與其相當的細胞,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞或KATOIII細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。
在某些實施方式中,上述細胞包含人CLDN18.2高表現細胞、人CLDN18.2中等表現細胞或人CLDN18.2低表現細胞。
在某些實施方式中,上述人CLDN18.2高表現細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以免疫組織化學(IHC)中至少40% (例如,至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、40-90%、50-90%、60-90%、70-90%、80-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-80%、50-70%、50-60%、60-80%、60-70%、或70-80%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2中等表現細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30% (或至少35%)但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2低表現細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30% (例如5%、10%、15%、20%、25%、5-25%、10-25%、15-25%、20-25%、5-20%、5-15%、5-10 %、10-20%、或10-15%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2。
在某些實施方式中,與NUGC4細胞結合之EC50值不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10 μg/ml)。
在某些實施方式中,如藉由ADCC報導基因分析所測定,上述NUGC4細胞上之ADCC之EC50值不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)。
在一個態樣中,本發明提供了一種分離之抗體或其抗原結合片段,其能夠與人CLDN18.2特異性結合且具有至少一個以下特徵:
a) 如藉由KinExA分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%之Kd值與人CLDN18.2結合;
b) 如藉由流式細胞術分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或10%之EC50值與表現人或小鼠CLDN18.2之細胞結合;
c) 如藉由細胞毒性分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導補體依賴之細胞毒性(CDC);以及
d) 如藉由ADCC報導基因分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導抗體依賴之細胞毒性(ADCC);
其中IMAB362為包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體,上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:72所示之胺基酸序列,上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:73所示之胺基酸序列。
在某些實施方式中,上述細胞包含NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞、或細胞株,上述細胞株具有與NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。在某些實施方式中,上述細胞包含人CLDN18.2高表現細胞、人CLDN18.2中等表現細胞、或人CLDN18.2低表現細胞。
在某些實施方式中,上述人CLDN18.2高表現細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以IHC中至少40% (例如,至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、40-90%、50-90%、60-90%、70-90%、80-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-80%、50-70%、50-60%、60-80%、60-70%、或70-80%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2中等表現細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30% (或至少35%)但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2低表現細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30% (例如5%、10%、15%、20%、25%、5-25%、10-25%、15-25%、20-25%、5-20%、5-15%、5-10 %、10-20%、或10-15%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2。
在某些實施方式中,上述分離之抗體或其抗原結合片段能夠與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含如SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列中D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基包含在E56位處之胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基不含有至少一個以下殘基:A42或N45。在某些實施方式中,上述抗原決定基包含在W30、L49、W50、R55及E56位處之胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基進一步包含T41、N45、Y46、R51、F60、E62及R80中之一或多個胺基酸殘基。在某些實施方式中,上述抗原決定基進一步包含D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79中之一或多個胺基酸殘基。
在一個態樣中,本發明提供了一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3及/或輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3序列,其中:
上述HCDR1序列包含GYNMN (SEQ ID NO:1)或TYFIGVG
(SEQ ID NO:13),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
上述HCDR2序列包含X1
IDPYYX2
X3
TX4
YNQKFX5
G
(SEQ ID NO:32)或HIWWNDNKYYNTALKS (SEQ ID NO:15),或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列;
上述HCDR3序列包含X6
X7
X8
GNAFDY
(SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY (SEQ ID NO:17),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
上述LCDR1序列包含KSSQX9
LX10
NX11
GNX12
KNYLT
(SEQ ID NO:34),或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列;
上述LCDR2序列包含WASTRX13
S
(SEQ ID NO:35),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
上述LCDR3序列包含QNDYX14
X15
PX16
T
(SEQ ID NO:36),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
其中X1
為N或Y或H,X2
為G或V,X3
為A或G或T,X4
為R或T或S,X5
為K或R,X6
為S或M,X7
為Y或F,X8
為Y或H,X9
為S或N,X10
為L或F,X11
為S或N,X12
為Q或L,X13
為E或K,X14
為S或Y,X15
為F或Y,且X16
為F或L。
在一個態樣中,本發明提供了一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區包含:
a) HCDR1包含選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13之序列,
b) HCDR2包含選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:22之序列,以及
c) HCDR3包含選自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:21之序列,
及/或
輕鏈可變區包含:
d) LCDR1包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:20所示之序列,
e) LCDR2包含如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:16所示之序列,以及
f) LCDR3包含選自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:18之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區選自下群:
a) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;
b) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;
c) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列;
d) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列;
e) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;以及
f) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中上述輕鏈可變區選自下群:
a) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
b) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列;
c) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
d) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列;
e) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列;
f) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中:
a) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
b) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列;
c) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
d) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列;
e) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列;或者
f) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
在某些實施方式中,其中上述重鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47,及與上述序列具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性但仍保留與CLDN18.2之特異性結合親和力之同源序列。
在某些實施方式中,其中上述輕鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46及SEQ ID NO:48,及與上述序列具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性但仍保留與CLDN18.2之特異性結合親和力之同源序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中,
a) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:23所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:24所示之序列;
b) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:25所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:26所示之序列;
c) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:27所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:28所示之序列;
d) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:29所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:26或28所示之序列;
e) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:37所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:38所示之序列;
f) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:39所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:40所示之序列;
g) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:41所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:42所示之序列;
h) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:43所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:44所示之序列;
i) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:45所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:46所示之序列;或者
j) 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:47所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:48所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段進一步包含一或多個重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4,及/或一或多個輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4,其中:
上述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17
FT
(SEQ ID NO:54)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述HFR2包含WVX18
QAPGQGLEWX19
G
(SEQ ID NO:55)或與其具有至少80% (或至少90%)序列同一性之同源序列,
上述HFR3序列包含RVTX20
TIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR
(SEQ ID NO:56)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述HFR4包含WGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:57)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列,
上述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21
NC
(SEQ ID NO:58)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY
(SEQ ID NO:59)或與其具有至少80% (或至少85%、90%)序列同一性之同源序列,
上述LFR3包含GVPDRFX22
GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(SEQ ID NO:60)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,以及
上述LFR4包含FGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:61)或與其具有至少80% (或至少90%)序列同一性之同源序列,
其中X17
為T或S,X18
為R或K,X19
為M或I,X20
為M或L,X21
為I或M,且X22
為S或T。
在某些實施方式中,
上述HFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:62及63,
上述HFR2包含選自下群之序列:SEQ ID NO:64及65,
上述HFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:66及67,
上述HFR4包含如SEQ ID NO:57所示之序列,
上述LFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:68及69,
上述LFR2包含如SEQ ID NO:59所示之序列,
上述LFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:70及71,以及
上述LFR4包含如SEQ ID NO:61所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其進一步包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾但仍保留與CLDN18.2之特異性結合親和力。在某些實施方式中,至少一個上述取代或修飾係在一或多個CDR序列中,及/或在一或多個上述VH或VL序列之非CDR區域中。
在某些實施方式中,上述抗體與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含具有如SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列之人CLDN18.2之D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段包含免疫球蛋白恆定區,可選地人Ig之恆定區,或可選地人IgG之恆定區。在某些實施方式中,上述恆定區包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之恆定區。在某些實施方式中,上述人IgG1之恆定區包含SEQ ID NO:49或與其具有至少80% (例如至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列。
在某些實施方式中,上述恆定區包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾,上述胺基酸殘基取代或修飾導致了相對於野生型恆定區增加之CDC或ADCC。在某些實施方式中,上述恆定區包含針對SEQ ID NO:49中之一或多個胺基酸殘基取代,上述取代選自下群:L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L或其任何組合。在某些實施方式中,上述恆定區包含如SEQ ID NO:51所示之序列。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段為非岩藻糖基化的。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段為人源化的。在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段為駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、雙功能抗體(diabody)、scFv、scFv二聚體、BsFv、dsFv、(dsFv)2
、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2
、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds diabody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段為雙特異性的。在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段能夠與CLDN18.2上之第一抗原決定基特異性結合,以及能夠與CLDN18.2或不同於CLDN18.2之第二個抗原上之第二抗原決定基特異性結合。在某些實施方式中,上述第二抗原為免疫相關靶標,其可選地選自下群:PD-L1、PD-L2、PD-1、CLTA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、ICOS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-15、CD3、CD16及CD83。
在某些實施方式中,上述第二抗原包含腫瘤抗原。在某些實施方式中,上述腫瘤抗原存在於表現CLDN18.2之細胞中。
在某些實施方式中,上述腫瘤抗原包含CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、蛙皮素樣肽(bombesin-like peptides)、PSA、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR3)、雌激素受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、運鐵蛋白受體、IL-2R或CO17-1A。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段能夠與小鼠CLDN18.2特異性結合。在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段不與人CLDN18.1結合。
在某些實施方式中,上述抗體或其抗原結合片段與一或多個綴合部分連接。在某些實施方式中,上述綴合部分包含清除修飾劑(clearance-modifying agent)、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑或其他抗癌藥物。
在一個態樣中,本發明提供了一種抗體或其抗原結合片段,其與本文提供之上述抗體或其抗原結合片段競爭以結合CLDN18.2。
在一個態樣中,本發明提供了一種藥物組合物,其包含本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,以及一或多種藥學上可接受之載體。
在一個態樣中,本發明提供了一種分離之聚核苷酸,其編碼本文提供之上述抗體或其抗原結合片段。在一個態樣中,本發明提供了一種載體,其包含本文提供之上述分離之聚核苷酸。在一個態樣中,本發明提供了一種宿主細胞,其包含本文提供之上述載體。
在一個態樣中,本發明提供了表現本文提供之上述之抗體或其抗原結合片段之方法,其包括在表現本文提供之上述載體之條件下培養本文提供之上述宿主細胞。
在一個態樣中,本發明提供了在將自CLDN18.2活性之調節中受益之受試者中治療疾病或病況之方法,上述方法包括向上述受試者施用治療有效量之本文提供之上述抗體或其抗原結合片段及/或本文提供之上述藥物組合物。在某些實施方式中,上述疾病或病況為CLDN18.2相關之疾病或病況。在某些實施方式中,上述疾病或病況為癌症,可選地為表現CLDN18.2之癌症。在某些實施方式中,上述受試者被鑑定為具有表現CLDN18.2之癌細胞。在某些實施方式中,上述受試者被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞或CLDN18.2低表現癌細胞。在某些實施方式中,上述CLDN18.2高表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以IHC中至少40% (例如,至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、40-90%、50-90%、60-90%、70-90%、80-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-80%、50-70%、50-60%、60-80%、60-70%、或70-80%)之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;上述CLDN18.2中等表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30% (或至少35%)但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;且上述CLDN18.2低表現癌細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30% (例如5%、10%、15%、20%、25%、5-25%、10-25%、15-25%、20-25%、5-20%、5-15%、5-10 %、10-20%、或10-15%)之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2。
在某些實施方式中,上述方法進一步包括施用治療有效量之第二治療劑。在某些實施方式中,上述疾病或病況為CLDN18.2相關之疾病或病況。在某些實施方式中,上述疾病或病況為癌症,可選地為表現CLDN18.2之癌症。
在某些實施方式中,上述受試者為人。
在某些實施方式中,上述施用為經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內施用。
在某些實施方式中,上述方法進一步包括施用治療有效量之第二治療劑。在某些實施方式中,上述第二治療劑選自化療劑、抗癌藥、放射治療、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑或細胞因子。
在一個態樣中,本發明提供了一種套組,其包含本文提供之抗體或其抗原結合片段,以及第二治療劑。
在一個態樣中,本發明提供了在表現CLDN18.2之細胞中調節CLDN18.2活性之方法,上述方法包括將上述表現CLDN18.2之細胞暴露於本文提供之上述抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中,本發明提供了偵測樣品中CLDN18.2之存在或含量之方法,上述方法包括將上述樣品與本文提供之上述抗體或其抗原結合片段接觸,以及確定上述樣品中CLDN18.2之存在或含量。
在一個態樣中,本發明提供了在受試者中診斷CLDN18.2相關之疾病或病況之方法,上述方法包括:a)將從上述受試者獲得之樣品與本文提供之上述抗體或其抗原結合片段接觸;b)測定上述樣品中CLDN18.2之存在或含量;以及c)將上述CLDN18.2之存在或含量與上述受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之存在或狀態相關聯。
在一個態樣中,本發明提供了本文提供之上述抗體或其抗原結合片段在製備用於治療受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之藥物中之用途。
在一個態樣中,本發明提供了本文提供之上述抗體或其抗原結合片段在製備用於診斷CLDN18.2相關疾病或病況之診斷試劑中之用途。
在一個態樣中,本發明提供了一種用於偵測CLDN18.2之套組,其包括本文提供之上述抗體或其抗原結合片段。
在一個態樣中,本發明提供了一種嵌合抗原受體(CAR),其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號傳導區及TCR信號傳導結構域,其中上述抗原結合結構域與CLDN18.2特異性結合且包含本文提供之其抗原結合片段。
在某些實施方式中,上述抗原結合片段為Fab或scFv。
在某些實施方式中,上述CAR為雙特異性的。在某些實施方式中,上述CAR能與CLDN18.2上之第一抗原決定基,及第二抗原決定基特異性結合。在某些實施方式中,上述第二抗原決定基在CLDN18.2上。在某些實施方式中,上述第二抗原決定基在不同於CLDN18.2之第二個抗原上。在某些實施方式中,上述第二抗原包含腫瘤抗原。
在一個態樣中,本發明提供了一種核酸序列,其編碼本文提供之上述嵌合抗原受體(CAR)。在一個態樣中,本發明提供了一種細胞,其包含本文提供之上述核酸序列。在一個態樣中,本發明提供了一種經基因修飾之細胞以表現上述CAR。
在一個態樣中,本發明提供了一種載體,其包含本文提供之上述核酸序列。
在一個態樣中,本發明提供了在哺乳動物中刺激T細胞介導之對表現CLDN18.2之細胞或組織之免疫應答之方法,上述方法包括向上述哺乳動物施用有效量之經基因修飾之細胞以表現本文提供之上述CAR。
在一個態樣中,本發明提供了治療具有CLDN18.2相關疾病或病況之哺乳動物之方法,上述方法包括向上述哺乳動物施用有效量本文提供之上述細胞,從而治療上述哺乳動物。
在某些實施方式中,上述細胞為自體T細胞。在某些實施方式中,上述CLDN18.2相關疾病或病況為癌症。在某些實施方式中,上述哺乳動物為人受試者。在某些實施方式中,上述哺乳動物被鑑定為具有表現CLDN18.2之癌細胞,可選地,上述哺乳動物被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞或CLDN18.2低表現癌細胞。
本發明之以下描述僅為說明本發明之各種實施方式。因此,所論述之特定修改方式不應理解為對揭示範圍之限制。在不偏離本發明範圍之情況下,作出各種等同方式、變化及修改對熟習此項技術者而言為顯而易見的,且應當理解,此類型之等同實施方式包括在本文之範圍內。在本發明中引用之所有參考文獻,包括公開出版物、專利及專利申請均藉由引用之方式全文併入。
定義
如本文使用的,本發明上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)所使用之術語「一種(a)」、「一個(an)」、「上述(the)」及類似術語,除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾,否則應被解釋為涵蓋單數形式及複數形式。
本發明中之術語「抗體」包括任何可結合某特定抗原之免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物之重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ,每條重鏈由一個可變區(VH)以及第一、第二及第三恆定區(分別為CH1
、CH2
、CH3
)組成;哺乳動物之輕鏈可分為λ或κ,而每條輕鏈由一個可變區(VL)以及一個恆定區組成。抗體呈「Y」型,「Y」型結構之莖部由藉由二硫鍵結合之兩條重鏈之第二及第三恆定區組成。「Y」型結構之每條臂包括與單條輕鏈之可變區及恆定區結合之單條重鏈之可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈之可變區決定抗原之結合。每條鏈之可變區通常含有三個高變區,稱互補決定區(CDR)(輕鏈CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,重鏈CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭示之抗體及抗原結合結構域之CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、AbM、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M.,J. Mol. Biol.
, 273(4), 927 (1997); Chothia, C. 等人,J Mol Biol.
Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C.及Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); N. R. Whitelegg等人,Protein Engineering, v13(12), 819-824 (2000); Chothia, C. 等人,Nature
. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. 等人,National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc等人,Developmental and Comparative Immunology
, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc等人,Immunome Research
, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (第二版), 第26章, 481-514, (2015))。三個CDR由被稱為框架區(FR)之側翼部分間隔開,框架區比CDR更加高度保守,且形成一個支架支撐高變環。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關,但具有多種效應功能。抗體依據其重鏈恆定區之胺基酸序列可以分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈,抗體可分別分為五個主要之分類或同種型:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要之抗體分類亦可分為亞類,如IgG1 (γ1重鏈)、IgG2 (γ2重鏈)、IgG3 (γ3重鏈)、IgG4 (γ4重鏈)、IgA1 (α1重鏈)或IgA2 (α2重鏈)等。在某些實施方式中,本文提供之上述抗體包含其任何抗原結合片段。
如本文使用的,術語「抗原結合片段」係指由含有一或多個CDR之抗體之片段形成之抗體片段,或者與抗原結合但不具有完整之天然抗體結構之任何其他抗體部分。抗原結合片段之例子包括,但不限於,如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2
、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)2
、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價的雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體(bivalent domain antibody)。抗原結合片段能夠與親本抗體結合相同之抗原。在某些實施方式中,抗原結合片段可包含來自特定人抗體之一或多個CDR。
關於抗體之「Fab」係指抗體之單價抗原結合片段,其由單條輕鏈(包含可變區及恆定區)與單條重鏈之可變區及第一恆定區經二硫鍵結合起來組成的。「Fab」可在鉸鏈區之重鏈之間二硫鍵之N-末端附近之殘基處,藉由對抗體進行木瓜蛋白酶消化來獲得。
「Fab'」係指包含部分鉸鏈區之Fab片段,其可在鉸鏈區重鏈之間二硫鍵C-末端附近之殘基處藉由對抗體進行胃蛋白酶消化而獲得,因此其鉸鏈區之少量殘基(包含一或多個半胱胺酸)不同於Fab。
「F(ab')2
」係指Fab'之二聚體,其包含兩條輕鏈及兩條重鏈之一部分。
關於抗體之「Fc」係指由第一重鏈之第二及第三恆定區經由二硫鍵與第二重鏈之第二及第三恆定區結合組成之抗體之一部分。IgG及IgM Fc區包含三個重鏈恆定區(每條鏈中之第二、第三及第四重鏈恆定區)。其可藉由木瓜蛋白酶消化抗體而獲得。抗體之Fc部分負責各種效應子功能,例如ADCC、ADCP及CDC,但在抗原結合中不起作用。
關於抗體之「Fv」係指攜帶完整抗原結合位點之抗體之最小片段。Fv片段由單條輕鏈之可變區與單條重鏈之可變區結合組成。「dsFv」係指二硫鍵穩定之Fv片段,其中單個輕鏈之可變區及單個重鏈之可變區之間的連接為二硫鍵。
「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由直接或藉由肽接頭序列相互連接之輕鏈可變區與重鏈可變區組成之工程化抗體(Huston JS等人,Proc Natl Acad Sci USA
, 85:5879 (1988))。「scFv二聚體」係指包含具有接頭之兩個重鏈可變區及兩個輕鏈可變區之單鏈。在某些實施方式中,「scFv二聚體」為雙價的雙功能抗體或雙價ScFv(BsFv),其包含與另一個VH
-VL
部分二聚化之VH
-VL
(藉由肽接頭連接),使得一個部分之VH
與另一部分之VL
配位且形成兩個結合位點,其可以靶向相同之抗原(或抗原決定基)或不同之抗原(或抗原決定基)。在其他實施方式中,「scFv二聚體」為雙特異性雙功能抗體,其包含VH1
-VL2
(藉由肽接頭連接)與VL1
-VH2
(亦藉由肽接頭連接)相結合,使得VH1
及VL1
配位且VH2
及VL2
配位且每個配位對具有不同之抗原特異性。
「單鏈Fv-Fc抗體」或「scFv-Fc」係指由與抗體之Fc區連接之scFv組成之工程化抗體。
「駱駝化單域抗體」、「重鏈抗體」、「奈米抗體」或「HCAb」係指包含兩個VH
結構域且無輕鏈之抗體(Riechmann L.及Muyldermans S.,J Immunol Methods.
Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S.,J Biotechnol.
Jun;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; U.S.專利號6,005,079)。重鏈抗體最初來自駱駝科(駱駝、單峰駱駝及美洲駝)。儘管沒有輕鏈,但駱駝抗體具有真正之抗原結合庫(authentic antigen-binding repertoire)(Hamers-Casterman C. 等人,Nature.
Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. 等人, 「Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation,」 Immunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. 等人,Immunology.
May;109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體之可變結構域(VHH結構域)代表由適應性免疫應答產生之最小之已知抗原結合單元(Koch-Nolte F. 等人,FASEB J.
Nov;21(13):3490-8. Epub 2007年1月15日 (2007))。「雙功能抗體」包含具有兩個抗原結合位點之小抗體片段,其中上述片段包含在單個多肽鏈中連接至VL
結構域之VH
結構域(VH
-VL
或VL
-VH
)(參見例如,Holliger P. 等人,Proc Natl Acad Sci U S A
. Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161)。由於接頭過短,同一條鏈上之兩個結構域無法配對,因此,此等結構域被迫與另一條鏈之互補結構域配對,從而創建了兩個抗原結合位點。抗原結合位點可靶向相同或不同抗原(或抗原決定基)。
「域抗體」係指僅包含重鏈之可變區或輕鏈之可變區之抗體片段。在某些實施方式中,兩個或更多個VH
結構域與肽接頭共價連接以形成雙價或多價結構域抗體。雙價結構域抗體之兩個VH
結構域可靶向相同或不同的抗原。
在某些實施方式中,「(dsFv)2
」包含三個肽鏈:藉由肽接頭連接且藉由二硫鍵與兩個VL
部分結合之兩個VH
部分。
在某些實施方式中,「雙特異性ds雙功能抗體」包含經由VH1
及VL1
之間的二硫鍵與VL1
-VH2
(藉由肽接頭連接)結合之VH1
-VL2
(亦藉由肽接頭連接)。
在某些實施方式中,「雙特異性dsFv」或「dsFv-dsFv'」包含三個肽鏈:VH1
-VH2
部分,其中重鏈由肽接頭(例如,長的柔性接頭)結合且藉由二硫鍵分別與VL1
及VL2
部分配對。每個二硫鍵配對的重鏈及輕鏈具有不同的抗原特異性。
如本文所使用,術語「人源化的」係指抗體或抗原結合片段,其包含源於非人動物之CDR、源於人之FR區、以及在適用的情況下,源於人之恆定區。在某些實施方式中,人源化CLDN18.2抗體之可變區框架之胺基酸殘基經取代以進行序列最佳化。在某些實施方式中,人源化CLDN18.2抗體鏈之可變區框架序列與相應之人可變區框架序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。
如本文所使用,術語「嵌合」係指抗體或抗原結合片段,其重鏈及/或輕鏈之一部分源於一個物種,而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源於不同的物種。在說明性實例中,嵌合抗體可包含源於人之恆定區及源於非人物種(例如,小鼠)之可變區。
術語「種系序列」係指編碼可變區胺基酸序列或子序列之核酸序列,與由種系免疫球蛋白可變區序列編碼之所有其他已知的可變區胺基酸序列相比,其與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高確定之胺基酸序列同一性。與所有其他評估之可變區胺基酸序列相比,種系序列亦可指與參考可變區胺基酸序列或子序列具有最高胺基酸序列同一性之可變區胺基酸序列或子序列。種系序列可僅為框架區、僅為互補決定區、框架及互補決定區、可變區段(如上所定義),或包含可變區之序列或子序列之其他組合。序列同一性可使用本文描述之方法來確定,例如,使用BLAST、ALIGN或此項技術中已知的另一種比對演算法比對兩個序列。種系核酸或胺基酸序列可與參考可變區核酸或胺基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列同一性。種系序列可例如藉由公開可獲得之國際ImMunoGeneTics資料庫(IMGT)及V-base確定。
如本文所使用,「抗CLDN18.2抗體」或「針對CLDN18.2之抗體」係指能夠以足夠之親和力與CLDN18.2 (例如,人或非人CLDN18.2)特異性結合之抗體,例如以提供診斷及/或治療用途。
如本文所使用,術語「親和力」係指免疫球蛋白分子(即抗體)或其片段及抗原之間的非共價相互作用之強度。
如本文所使用,術語「特異性結合」或「特異性地結合」係指兩個分子之間,例如抗體及抗原之間的非隨機結合反應。在某些實施方式中,本文提供之抗體或抗原結合片段以≤10-6
M (例如,≤5×10-7
M、≤2×10-7
M、≤10-7
M、≤5×10-8
M、≤2×10-8
M、≤10-8
M、≤5×10-9
M、≤4×10-9
M、≤3×10-9
M、≤2×10-9
M、或≤10-9
M之結合親和力(KD
))與人及/或非人CLDN18.2特異性結合。本文所使用之KD
係指解離率與結合率之比率(koff
/kon
),其可藉由使用此項技術中已知的任何習知方法來確定,包括但不限於表面電漿共振法、微尺度熱泳法、HPLC-MS法及流式細胞術(例如FACS)法。在某些實施方式中,可藉由使用流式細胞術法適當地確定KD
值。可使用多種免疫分析形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應之抗體。例如,習知地使用固相ELISA免疫分析來選擇與蛋白質特異性免疫反應之抗體(參見,例如Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), 可用於確定特異性免疫反應性之免疫分析形式及條件之描述)。通常,特異性或選擇性結合反應產生之信號為背景信號之至少兩倍,更通常為背景信號之至少10至100倍。
關於胺基酸序列(或核酸序列)之「序列同一性百分比(%)」定義為在比對序列且(若需要)引入缺口以實現最大對應性後,候選序列中與參考序列中胺基酸(或核酸)殘基相同之胺基酸(或核酸)殘基之百分比。例如,可使用公開可獲得之工具如BLASTN、BLASTp (可在美國國家生物技術資訊中心(NCBI)之網站上獲得,亦參見Altschul S.F. 等人, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. 等人, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)),ClustalW2 (可在歐洲生物資訊學研究所之網站上獲得,亦參見Higgins D.G. 等人, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. 等人, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體,來實現用於確定胺基酸(或核酸)序列同一性百分比之比對。熟習此項技術者可使用工具提供之預設參數,或者可例如藉由選擇合適的算法來自定義適合比對之參數。在某些實施方式中,不完全相同之殘基位置可藉由保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係指其中胺基酸殘基由具有相似化學性質(例如,電荷或疏水性)之側鏈(R基團)之另一個胺基酸殘基取代。通常,保守之胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能特性。若兩個或更多個胺基酸序列之間由於保守取代而彼此不同,可向上調整相似性之百分比或程度以校正取代之保守性。進行此調整之手段為熟習此項技術者公知的(參見,例如Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331),其藉由引用併入本文。
如本文所使用,「同源序列」及「同源性序列」可互換使用,且係指當可選地比對時,與另一序列具有至少80% (例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之聚核苷酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列。
「分離的」物質已從自然狀態被人為改變。若自然界出現了「分離的」成分或物質,則說明其已自其原始環境中被更改或移除,或兩者均有。例如,天然存在於活體動物中之聚核苷酸或多肽不為「分離的」,然而若已自天然狀態之共存材料中充分分離以使其以基本純淨之狀態存在,則該聚核苷酸或多肽為「分離的」。分離的「核酸」或「聚核苷酸」可互換使用,且係指分離的核酸分子之序列。在某些實施方式中,「分離的抗體或其抗原結合片段」係指藉由電泳方法(例如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)或層析方法(例如離子交換層析或反相HPLC)測定之純度至少為60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之抗體或抗原結合片段。
如本文所使用,「阻斷結合」或「競爭相同抗原決定基」之能力係指抗體或抗原結合片段以任何可偵測之程度抑制兩個分子之間(例如人CLDN18.2及抗CLDN18.2抗體)之結合作用之能力。在某些實施方式中,阻斷兩個分子之間結合之抗體或抗原結合片段將兩個分子之間的結合作用抑制至少50%。在某些實施方式中,該抑制可大於60%、大於70%、大於80%或大於90%。
如本文所使用,術語「抗體藥物綴合物」係指抗體或其抗原結合片段與另一種試劑(例如化療劑、毒素、免疫治療劑、成像探針等)之連接。連接可為共價鍵,亦可為非共價相互作用(例如藉由靜電力)。為形成抗體藥物綴合物,可使用此項技術中已知的各種接頭。另外,抗體藥物綴合物可以融合蛋白之形式提供,上述融合蛋白可自編碼綴合物之聚核苷酸表現而來。如本文所使用,「融合蛋白」係指藉由兩個或更多個最初編碼單獨蛋白質(包含肽及多肽)之基因或基因片段之連接而產生之蛋白質。融合基因之轉譯產生具有源於每個原始蛋白質之功能特性之單個蛋白質。
術語「受試者」包括人及非人動物。非人動物包括所有脊椎動物,例如哺乳動物及非哺乳動物,例如非人靈長類、小鼠、大鼠、貓、兔、羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除另有說明外,術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
術語「抗腫瘤活性」係指腫瘤細胞增殖、生存力或轉移活性之降低。例如,抗腫瘤活性可藉由在治療期間出現之異常細胞生長速率之下降,或腫瘤尺寸穩定或減少,或由於治療引起之與未進行治療之對照相比更長之生存期來表明。可使用可接受之體外或體內腫瘤模型,包括但不限於異種移植模型、同種異體移植模型、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)模型及此項技術中已知的研究抗腫瘤活性之其他模型,來評估此活性。
如本文所使用,「效應子功能」或「抗體效應子功能」係指可歸因於抗體之Fc區與其效應子(例如C1複合物及Fc受體)結合之生物學活性。例示性效應子功能包括:藉由抗體及C1複合物上之C1q相互作用誘導之補體依賴性細胞毒性(CDC);藉由抗體之Fc區與效應細胞上之Fc受體結合而誘導之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP),其中表現FcγRs之非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上結合之抗體,隨後引起靶細胞之吞噬作用。效應子功能包括在結合抗原之後起作用之功能及獨立於抗原結合而起作用之功能。
本文所使用之病況之「治療(treating)」或「治療(treatment)」包括預防或減輕病況,減緩病況之發作或發展速度,降低發展病況之風險,預防或延遲與病況相關之症狀之發展,減輕或消除與病況有關之症狀,使病況完全或部分消退,治癒病況或其一些組合。
如本文所使用,術語「載體」係指可將遺傳因子可操作地插入其中以引起該遺傳因子之表現(例如產生由該遺傳因子編碼之蛋白質、RNA或DNA)或複製遺傳因子之載體。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞,以使遺傳因子在攜帶其之宿主細胞內表現。載體之實例包括質粒、噬菌粒、黏粒、人工染色體(例如,酵母菌人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、或P1來源之人工染色體(PAC))、噬菌體(諸如λ噬菌體或M13噬菌體)及動物病毒。載體可包含多種用於控制表現之因子,包含啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇因子及報導基因。另外,載體可包含複製起點。載體亦可包括有助於其進入細胞之材料,包含但不限於病毒顆粒、脂質體或蛋白質衣殼。載體可為表現載體或選殖載體。本發明提供載體(例如表現載體),其包含編碼抗體或其抗原結合片段之本文提供之核酸序列,與該核酸序列可操作地連接之至少一個啟動子(例如SV40、CMV,EF-1α),及至少一個選擇標記。
如本文所使用,「宿主細胞」係指已向其中引入外源聚核苷酸及/或載體之細胞。
術語「CLDN18.2」係指源於哺乳動物例如靈長類動物(例如人、猴)及嚙齒動物(例如小鼠)之Claudin-18剪接變異體2。在某些實施方式中,CLDN18.2為人CLDN18.2。人CLDN18.2之例示性序列包含人CLDN18.2蛋白(NCBI參考序列號NP_001002026.1,或SEQ ID NO:30)。CLDN18.2之例示性序列包含小家鼠(小鼠)(Mus musculus (mouse))CLDN18.2蛋白(NCBI參考序列號NP_001181852.1)、食蟹猴(食蟹獼猴)(Macaca fascicularis (crab-eating macaque))CLDN18.2蛋白(NCBI參考序列號XP_015300615.1)。CLDN18.2在癌細胞中表現。在一個實施方式中,上述CLDN18.2在癌細胞表面上表現。
術語「CLDN18.1」係指源於哺乳動物例如靈長類動物(例如人、猴)及嚙齒動物(例如小鼠)之Claudin-18剪接變異體1。在某些實施方式中,CLDN18.1為人CLDN18.1。人CLDN18.1之例示性序列包含人CLDN18.1蛋白(NCBI參考序列號NP_057453.1或SEQ ID NO:31)、小家鼠(小鼠)CLDN18.2蛋白(NCBI參考序列號NP_001181851.1)、食蟹猴(食蟹獼猴)CLDN18.2蛋白(NCBI Ref Seq No. XP_005545920.1)。
本文所使用之「CLDN18.2相關的」疾病或病況係指由CLDN18.2之表現或活性之增加或降低引起、加劇或與其相關聯之任何疾病或病況。在一些實施方式中,CLDN18.2相關病況為例如癌症。
如本文所使用,「癌症」係指以惡性細胞生長或腫瘤、異常增殖、浸潤或轉移為特徵之任何醫學病況,且包含實體瘤及非實體癌(例如血液系統惡性腫瘤),例如白血病。如本文所使用,「實體瘤」係指腫瘤及/或惡性細胞之實體塊。術語「藥學上可接受的」表示指定之載體、載劑、稀釋劑、賦形劑及/或鹽通常與構成該製劑之其他成分在化學及/或物理上相容,且與其接受者在生理上相容。
在本文中對「約」值或參數之引用包括(且描述)針對該值或參數本身之實施方式。例如,提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍包括定義範圍之數值。一般而言,術語「約」係指變量之指定值,以及在指定值之實驗誤差範圍內(例如,平均值之95%置信區間內)或指定值之10%以內(以較大者為凖)之變量之所有值。在時間段(年、月、週、天等)之上下文中使用術語「約」時,術語「約」係指該時間段加上或減去下一個子時間段之一個量(例如,約1年表示11至13個月;約6個月表示6個月加或減1週;約1週表示6至8天;以此類推),或者在指定值之10%以內,以較大者為凖。
抗 CLDN18.2 抗體
本發明提供抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段。本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段能夠與CLDN18.2 (例如,人CLDN18.2)或表現CLDN18.2之細胞特異性結合。如本文所使用,「特異性結合」係指≤10-6
M (例如,≤5×10-7
M、≤2×10-7
M、≤10-7
M、≤5×10-8
M、≤2×10-8
M、≤10-8
M、≤5×10-9
M、≤4×10-9
M、≤3×10-9
M、≤2×10-9
M、或≤10-9
M)之結合親和力(例如,KD
)。
i. 結合親和力
本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段之結合親和力可用KD
值表示,其表示當抗原及抗原結合分子之間的結合達到平衡時解離率與結合率之比率(koff
/kon
)。低親和力抗體通常會緩慢地結合抗原且傾向於容易解離,而高親和力抗體通常會更快地結合抗原且傾向於保持更長之結合時間。抗原結合親和力(例如KD
)可使用此項技術中已知的任何合適方法適當地確定,包括例如動力學排斥分析(KinExA)或流式細胞術。
在某些實施方式中,根據本發明之「Kd」或「Kd值」在藉由KinExA分析測定之實施方式中,如以下分析上述之用抗CLDN18.2抗體及CLDN18.2進行測定,上述以下分析量測抗CLDN18.2抗體之溶液結合親和力。通常,KinExA之工作原理為使恆定量之一個結合伴侶(binding partner)(CBP)與不同濃度之另一個結合伴侶(滴定劑)平衡,接著在較短之接觸時間內藉由螢光標記之第二抗體捕獲一部分游離CBP,上述接觸時間比解離預先形成之CBP-滴定劑複合物所需之時間短。由捕獲之CBP生成之螢光信號與平衡樣品中游離CBP之濃度直接成正比,且在一系列量測時用於生成結合曲線(游離CBP百分比相對於總滴定劑濃度)。可自Schreiber, G., Fersht, A.R. Nature Structural Biology. 1996, 3(5), 427-431獲得更多詳細資訊。當抗CLDN18.2抗體用作具有恆定量之CBP時,則CLDN18.2表現細胞可用作滴定劑,反之亦然。藉由KinExA,可使用CLDN18.2或表現CLDN18.2之細胞量測Kd。在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之Kd根據本發明之實施例10之第3節中描述之方法確定。
在適用的情況下亦可使用其他適合於Kd測定之方法,例如,放射性標記之抗原結合分析(參見,例如Chen等人,(1999) J. Mol Biol 293:865-881),或表面電漿共振分析,例如BIAcore,其使用固定之CLDN18.2 CM5晶片在適當之回應單元(RU)進行。
在某些實施方式中,藉由流式細胞術量測抗CLDN18.2抗體之結合親和力。通常,將表現CLDN18.2之細胞與一定濃度範圍之抗CLDN18.2抗體孵育,接著與螢光標記之二抗孵育,接著分析螢光信號強度。在某些實施方式中,根據本發明實施例5中上述之方法來確定抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之結合親和力。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段如藉由KinExA分析所測定,以不超過2.5 nM (或不超過2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 nM)之KD
值特異性結合人CLDN18.2 (或表現人CLDN18.2之細胞)。
或者,本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段對人CLDN18.2之結合親和力亦可用「半最大有效濃度」(EC50
)值表示,其係指觀測到其最大作用(例如結合)之50%時之抗體濃度。可藉由此項技術中已知的方法例如,夾心分析法(例如ELISA)、西方墨點法、流式細胞術分析法及其他結合分析法來測定EC50
值。在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段如藉由流式細胞術所測定,以不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 μg/ml)之EC50
值與人CLDN18.2 (例如,表現人CLDN18.2之細胞)特異性結合。
可針對重組CLDN18.2或表現CLDN18.2之細胞株測定結合親和力。本文提供之抗體及抗原結合片段能夠結合表現不同水準之人CLDN18.2之細胞,尤其表現相對中等或較低水準之人CLDN18.2之細胞。
在某些實施方式中,用表現人CLDN18.2之細胞,例如NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞、或與其相當的細胞來測定結合親和力,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞或KATOIII細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。
NUGC4細胞係自癌症患者之胃旁淋巴結建立之細胞株(參見Akiyama S等人, Jpn J Surg. 1988年7月;18(4):438-46)。NUGC4細胞株可自JCRB細胞庫獲得,其登錄號為JCRB0834。
SNU-601細胞及SNU-620細胞均係人胃癌細胞株,由首爾國立大學(SNU)自癌症患者之腹水建立(KU JL等人,Cancer Res Treat. 2005年2月; 37(1): 1-19; Park等人, Int J Cancer. 1997年2月7日; 70(4):443-449)。SNU-601細胞及SNU-620細胞可自韓國細胞株庫獲得,其登錄號分別為00601及00620。
KATO III細胞為源於胃癌患者轉移部位之細胞株(參見,Sekiguchi M, 等人,Jpn. J. Exp. Med. 48: 61-68, 1978)。KATO III細胞株可自ATCC獲得,其登錄號為ATCC HTB-103。
重組表現人CLDN18.2蛋白之細胞株亦可例如藉由在諸如中國倉鼠卵巢(CHO)、HEK細胞或MKN45細胞株(國家細胞株資源基礎設施,目錄號3111C0001CCC000229)等細胞株中轉染且表現編碼人CLDN18.2之DNA來建立。
在某些實施方式中,用人CLDN18.2高表現細胞、人CLDN18.2中等表現細胞或人CLDN18.2低表現細胞測定結合親和力。
人CLDN18.2蛋白之表現量在不同細胞株中可有所變化。細胞中CLDN18.2蛋白之表現量可藉由此項技術中已知的任何合適方法來測定,例如,藉由定量螢光細胞術或免疫組織化學(IHC)。在某些實施方式中,根據IHC確定人CLDN18.2蛋白在給定細胞上之表現量。IHC涉及藉由抗原-抗體相互作用使抗原可視化,從而偵測細胞或組織中之抗原(例如CLDN18.2)。通常,用針對抗原之一抗來偵測抗原。可標記一抗,以直接偵測抗原。可替代地,一抗可為未標記的,且進一步與綴合有可偵測標記之二抗接觸,以允許間接偵測抗原。一抗可為能夠與人CLDN18.2特異性結合之任何抗體,例如但不限於本文提供之任何抗CLDN18.2抗體,或此項技術中已知的任何抗CLDN18.2抗體。在某些實施方式中,細胞或組織可例如使用多聚甲醛固定。
如本文所使用,關於表現人CLDN18.2細胞之術語「高表現」旨在表示以如藉由IHC所測定之至少2+
之強度及以IHC中至少40% (例如,至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、40-90%、50- 90%、60-90%、70-90%、80-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-80%、50-70%、50-60%、60-80%、60-70%或70-80%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2之細胞。類似地,如本文所使用,術語「中等表現」表示以如藉由IHC測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30% (或至少35%)但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2之細胞。此外,如本文所使用,術語「低表現」表示以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30% (例如,5%、10%、15%、20%、25%、5-25%、10-25%、15-25%、20-25%、5-20%、5-15%、5-10%、10-20%、或10-15%)之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2之細胞。該定義亦顯示在下表A中。
表A. 表現細胞之類別
類別 | 強度 | 陽性細胞% | 細胞之實例 |
高表現 | 至少2+ | 至少40% | MKN45-CLDN18.2-高; HEK293-CLDN18.2 |
中等表現 | 低於2+、至少1+ | 低於40%、至少30% | NUGC4 |
低表現 | 低於1+、高於0 | 低於30%、高於0 | SNU-601; SNU-620; KATO III; MKN45-CLDN18.2-中 |
在某些實施方式中,如實施例15之第6節及第7節所述,藉由IHC測定人CLDN18.2之表現量。簡而言之,將表現人CLDN18.2之細胞固定在石蠟中,且使用抗人CLDN18.2抗體經由IHC進行偵測,接著測定陽性染色細胞之相對比例及細胞膜上之染色強度。在某些實施方式中,在IHC過程中用生物素化之抗CLDN18.2抗體GC182對細胞進行染色。抗體GC182具有如SEQ ID NO:74所示之重鏈可變區序列及如SEQ ID NO:75所示之輕鏈可變區序列(亦參見WO2013167259)。
基於本文提供之免疫組織化學(IHC)測定結果(表13),NUGC4細胞可表徵為人CLDN18.2中等表現細胞株,而SNU-620、SNU-601及KATOIII細胞可表徵為低表現細胞株。另外,可製備重組細胞株以高表現人CLDN18.2。高表現細胞之實例包括但不限於如本文實施例1之第3節所述之MKN45-CLDN18.2-高細胞株及HEK293-CLDN18.2細胞株。
發明人驚訝地發現,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段對人CLDN18.2中等表現細胞株(例如NUGC4細胞)、低表現細胞株(例如SNU-620、SNU-601及KATOIII細胞)具有高親和力。此與現有之抗體(例如IMAB362)不同,現有抗體無法顯示與人CLDN18.2低表現細胞特異性或相當的結合。嵌合IgG1抗體IMAB362為由Ganymed Pharmaceuticals AG開發之抗人CLDN18.2抗體,其具有美國專利申請US2009169547A1中揭示之胺基酸序列(IMB362之重鏈及輕鏈可變區序列包括在本文中,分別為SEQ ID NO:72及SEQ ID NO:73)及CAS號1496553-00-4。IMAB362識別CLDN18.2之第一胞外結構域(ECD1),且不與任何其他Claudin家族成員(包含緊密相關之Claudin 18剪接變異體1(CLDN18.1))結合。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段如藉由KinExA分析所測定,以不超過2.5 nM (或不超過2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 nM)之KD
值與表現人CLDN18.2之細胞(例如,NUGC4細胞株或KATOIII細胞株)特異性結合。在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段如藉由KinExA分析所測定,以不高於IMAB362 Kd值之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%之Kd值與表現人CLDN18.2之細胞特異性結合。在某些實施方式中,用NUGC4細胞、KATOIII細胞、SNU-601細胞、SNU-620細胞、或與其相當的細胞來測定KD
值,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞、KATOIII細胞、SNU-601細胞、或SNU-620細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。在某些實施方式中,用人CLDN18.2高表現細胞株或人CLDN18.2中等表現細胞株來測定KD
值。
在某些實施方式中,本文提供之抗體及抗原結合片段如藉由流式細胞術分析所測定,具有不高於70 μg/ml (或不高於65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 μg/ml)之EC50
值以與表現人CLDN18.2 (或小鼠CLDN18.2)之細胞結合。在某些實施方式中,本文提供之抗體及抗原結合片段如藉由流式細胞術分析所測定,以不超過IMAB362 EC50
值之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、1%或0.1%之EC50
值與表現人CLDN18.2之細胞特異性結合。在某些實施方式中,用NUGC4細胞株、KATOIII細胞株、SNU-601細胞株、SNU-620細胞株、或與其相當的細胞測定EC50
,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞株、KATOIII細胞株、SNU-601細胞株、或SNU-620細胞株(例如人CLDN18.2低表現細胞株或人CLDN18.2中等表現細胞株)相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。在某些實施方式中,用人CLDN18.2高表現細胞株測定EC50
。
在某些實施方式中,本文提供之抗體及抗原結合片段具有不超過5、4、3或2 μg/ml之EC50
值以與人CLDN18.2高表現細胞株或人CLDN18.2中等表現細胞株結合。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段如藉由流式細胞術分析所測定,具有不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 μg/ml)之EC50
值以與NUGC4細胞結合。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段不與CLDN18.1 (例如,人CLDN18.1或小鼠CLDN18.1)結合。
在某些實施方式中,上述抗體及其抗原結合片段如藉由流式細胞術所測定,能夠以不超過1.5 μg/ml之EC50
值與小鼠CLDN18.2 (例如,表現小鼠CLDN18.2之細胞)特異性結合。在某些實施方式中,上述抗體及其抗原結合片段,如藉由流式細胞術所測定,以0.1 μg/ml-1.5 μg/ml (例如,0.1 μg/ml-1.2 μg/ml、0.2 μg/ml-1 μg/ml、0.5 μg/ml-1 μg/ml、0.6 μg/ml-1 μg/ml、0.6 μg/ml-0.8 μg/ml或0.67 μg/ml)之EC50
與小鼠CLDN18.2結合。
1. ADCC 及 CDC 活性
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段能夠在表現不同水準之人CLDN18.2之細胞中誘導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性及/或CDC活性。
如本文所使用,「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指細胞介導之反應,其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如,天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞及巨噬細胞)識別靶細胞上結合之抗體,隨後引起靶細胞之溶解。靶細胞之溶解為細胞外的,需要直接的細胞間接觸,且不涉及補體。ADCC可視為直接誘導可變程度之即時腫瘤破壞之機制,該機制導致抗原呈遞及誘導腫瘤定向T細胞應答。據信體內ADCC之誘導導致腫瘤定向T細胞應答及源於宿主之抗體應答。
用於進行ADCC之方法為此項技術中已知的。通常,將靶細胞(例如,表現CLDN18.2之細胞)與一定濃度範圍之抗CLDN18.2抗體孵育,洗滌後,添加效應細胞(例如,表現Fc受體之細胞)以允許ADCC發生。在靶細胞與效應細胞混合後數小時之一個時間點測定細胞毒性或細胞存活率,以定量ADCC之水準。可藉由自溶解之靶細胞釋放之標記物(例如,放射性受質、螢光染料或天然細胞內蛋白如乳酸脫氫酶(LDH))來偵測細胞毒性。在另一個實施方式中,使用螢光素酶報導基因,藉由代謝活性細胞之指標(例如ATP)測定細胞存活率(參見,例如Crouch, S.P. 等人,(1993) J. Immunol. Methods 160, 81-8),上述螢光素酶報導基因產生與培養中活細胞數量成比例之發光信號(即ADCC報導基因分析)。效應細胞之實例為NK細胞、PBMC或表現FcγRIII之細胞。在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之ADCC活性係根據實施例7第2節中描述之方法測定的。
「補體依賴之細胞毒性」或「CDC」為另一種細胞殺傷方法,其可在補體存在下由抗體指引溶解靶標。IgM為補體激活最有效之同種型。IgG1及IgG3在藉由經典補體激活途徑指引CDC方面亦非常有效。在此級聯反應中,抗原-抗體複合物之形成導致在參與抗體分子(例如,與同源抗原複合之IgG分子)之CH2結構域上緊密相鄰之多個Clq結合位點之暴露(Clq為補體C1之三個子成分之一)。此等暴露之Clq結合位點將先前低親和力之Clq-IgG相互作用轉換為高親和力之相互作用,從而觸發涉及一系列其他補體蛋白之級聯事件,且導致效應細胞趨化/激活劑C3a及C5a之蛋白水解釋放。補體級聯終止於膜攻擊複合物(MAC)之形成,其會在細胞膜上形成孔,促進水及溶質自由進出細胞。
如上所述,CDC活性可藉由類似於ADCC活性之方法來測定,除了不使用效應細胞以外,需要源於人血清之補體存在。簡而言之,將抗體樣品在測定培養基中連續稀釋,且在人血清補體存在下與表現CLDN18.2之靶細胞一起孵育。在孵育後,藉由自溶解之靶細胞中釋放之標記,或藉由代謝活性細胞之指標(例如ATP)來測定細胞毒性或細胞存活率。可使用測定代謝活性細胞中ATP之CellTiter-Glo試劑,且可藉由使用適當的讀取器量測發光強度來量化細胞溶解之程度。在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之CDC活性係根據實施例7之第1節中所述之方法測定的。
在某些實施方式中,經由本文提供之抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段之ADCC或CDC誘導之細胞死亡可藉由膜完整性之喪失來確定,如相較於未處理之細胞,評估碘化丙啶(PI)、錐蟲藍(參見Moore等人,Cytotechnology 17:1-11 (1995))或7AAD之攝取。
發明人驚奇地發現,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段能夠誘導對人CLDN18.2中等表現細胞株(例如,NUGC4細胞)或人CLDN18.2低表現細胞株(例如SNU-620、SNU-601細胞及KATOIII細胞)之ADCC及/或CDC。此不同於現有之抗體,例如IMAB362,其不能誘導對該人CLDN18.2中等表現或低表現細胞株之ADCC或CDC。
在某些實施方式中,如藉由細胞毒性分析所測定,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段能夠以不超過1 μg/ml (或不超過0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導補體依賴之細胞毒性(CDC)。在某些實施方式中,如藉由細胞毒性分析所測定,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其片段能夠以不超過IMAB362 EC50值80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導CDC。在某些實施方式中,用人CLDN18.2中等表現細胞株或人CLDN18.2高表現細胞株來測定CDC。
在某些實施方式中,如藉由ADCC報導基因分析所測定,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段能夠以不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導抗體依賴之細胞毒性(ADCC)。在某些實施方式中,如藉由ADCC報導基因分析所測定,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段以不超過IMAB362 EC50值之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%之EC50值,或以至少為IMAB362 ADCC總容量之120%、150%、180%或200%之ADCC總容量(例如,表示為抗體濃度相對於ADCC活性水準之圖中觀測到之ADCC活性之最高水準)在表現人CLDN18.2之細胞上誘導ADCC。在某些實施方式中,用NUGC4細胞株、KATOIII細胞株、SNU-601細胞株、SNU-620細胞株、或與其相當的細胞來測定ADCC,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞株、KATOIII細胞株、SNU-601細胞株、或SNU-620細胞株(例如,人CLDN18.2中等表現細胞株或人CLDN18.2低表現細胞株)相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。
在某些實施方式中,如藉由ADCC報導基因分析所測定,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段能夠以不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)之EC50值在NUGC4細胞上誘導ADCC。
抗原決定基
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含具有SEQ ID NO:30之胺基酸序列之人CLDN18.2之D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一或多個(例如,一個、兩個、三個或更多個)胺基酸殘基。
如本文所使用,術語「抗原決定基」係指抗體結合之抗原上之原子或胺基酸之特定基團。抗原決定基可包括直接接觸抗體之特定胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基。熟習此項技術者將認識到,可藉由確定二者是否競爭結合CLDN18.2抗原多肽,無需過多實驗即可確定抗體是否結合與本發明之抗體(例如本文提供之雜交瘤/嵌合或人源化抗體7C12、11F12、26G6、59A9、18B10及其任何嵌合及人源化之變異體)相同、重疊或相鄰之抗原決定基。
如本文所使用,關於兩種抗原結合蛋白(例如抗體)之術語「競爭結合」,係指藉由競爭結合分析確定,一種抗原結合蛋白阻斷或減少另一種抗原結合蛋白與抗原(例如,人/小鼠CLDN18.2)之結合。競爭結合分析為此項技術中所公知的,包括例如直接或間接放射免疫分析(RIA)、直接或間接酶免疫分析(EIA)及夾心競爭分析(參見,例如,Stahli等人,1983,Methods in Enzymology
9:242-253)。通常,此類分析涉及使用結合至固體表面上之純化抗原或帶有抗原之細胞,未標記之測試抗體及標記之參考抗體。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記物之含量來量測競爭抑制。通常,測試抗體過量存在。若兩種抗體競爭結合CLDN18.2,則此兩種抗體與相同或重疊之抗原決定基結合,或者與另一種抗體結合之抗原決定基足夠近之相鄰抗原決定基結合,以產生空間位阻(steric hindrance)。通常,當競爭性抗體過量存在時,其將抑制(例如,減少)至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%、75-80%、80-85%、85-90%或更多的測試抗體與共同抗原之特異性結合。
在某些實施方式中,可藉由使抗原(即,CLDN18.2)中之特定殘基突變來確定抗體結合之抗原決定基或抗原決定基中之胺基酸殘基。若抗體以相對於與野生型CLDN18.2結合顯著降低之水準,與具有突變之胺基酸殘基(例如,丙胺酸)之突變CLDN18.2結合,則此表明該突變殘基直接參與抗體與CLDN18.2抗原之結合,或者當抗體與抗原結合時緊鄰抗體。此類突變殘基被認為在抗原決定基內,且該抗體被認為與包含該殘基之抗原決定基特異性結合。如本文所使用,結合水準之顯著降低係指相對於抗體及野生型CLDN18.2之間的結合,抗體與突變CLDN18.2之間的結合親和力(例如EC50、Kd或結合能力)降低了大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高。可使用此項技術中已知的及本文揭示之任何合適的方法進行此類結合量測,例如但不限於KinExA分析及流式細胞術。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段對突變CLDN18.2表現出明顯更低的結合,其中野生型CLDN18.2中之殘基經丙胺酸取代,上述殘基選自下群:人CLDN18.2之D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80。在某些實施方式中,殘基為E56。在某些實施方式中,殘基選自下群:W30、L49、W50、R55及E56。在某些實施方式中,殘基選自下群:T41、N45、Y46、R51、F60、E62及R80。在某些實施方式中,殘基選自下群:D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79。
在某些實施方式中,相對於抗體及野生型CLDN18.2之間的結合,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段顯示出,與包含人CLDN18.2 E56A之突變CLDN18.2之結合降低了至少80%、90%、95%或99%或更多。
在某些實施方式中,相對於抗體及野生型CLDN18.2之間的結合,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段顯示出,與包含一或多個突變殘基之突變CLDN18.2之結合降低了至少50%、60%、70%、80%或90%,上述一或多個突變殘基選自下群:人CLDN18.2之W30A、L49A、W50A、R55A及E56A。
在某些實施方式中,相對於抗體及野生型CLDN18.2之間的結合,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段顯示出,與包含一或多個突變殘基之突變CLDN18.2之結合降低了至少30%、35%、40%、45%或50%,上述一或多個突變殘基選自下群:人CLDN18.2之D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79。
在某些實施方式中,相對於抗體及野生型CLDN18.2之間的結合,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段顯示出,與包含一或多個突變殘基之突變CLDN18.2之結合降低了至少10%、15%、20%、25%或30%,上述一或多個突變殘基選自下群:人CLDN18.2之T41A、N45A、Y46A、R51A、F60A、E62A及R80A。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段不與A42及/或N45結合。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段能夠與本文提供之抗原決定基結合,且在人CLDN18.2中等表現細胞株或人CLDN18.2低表現細胞株中誘導ADCC或CDC活性。
抗體序列
在另一個態樣中,本發明提供了一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3及/或輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3序列,其中:
上述HCDR1序列包含GYNMN (SEQ ID NO:1)或TYFIGVG
(SEQ ID NO:13),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
上述HCDR2序列包含X1
IDPYYX2
X3
TX4
YNQKFX5
G
(SEQ ID NO:32)或HIWWNDNKYYNTALKS (SEQ ID NO:15),或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列;
上述HCDR3序列包含X6
X7
X8
GNAFDY
(SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY (SEQ ID NO:17),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
上述LCDR1序列包含KSSQX9
LX10
NX11
GNX12
KNYLT
(SEQ ID NO:34),或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列;
上述LCDR2序列包含WASTRX13
S
(SEQ ID NO:35),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;且
上述LCDR3序列包含QNDYX14
X15
PX16
T
(SEQ ID NO:36),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列;
其中X1
為N或Y或H,X2
為G或V,X3
為A或G或T,X4
為R或T或S,X5
為K或R,X6
為S或M,X7
為Y或F,X8
為Y或H,X9
為S或N,X10
為L或F,X11
為S或N,X12
為Q或L,X13
為E或K,X14
為S或Y,X15
為F或Y,且X16
為F或L。
在一個態樣中,本發明提供了一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區包含:
a) HCDR1包含選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13之序列,
b) HCDR2包含選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:22之序列,以及
c) HCDR3包含選自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:21之序列,及/或
輕鏈可變區包含:
d) LCDR1包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:20所示之序列,
e) LCDR2包含如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:16所示之序列,以及
f) LCDR3包含選自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:18之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區選自下群:
a) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;
b) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;
c) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列;
d) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列;
e) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;以及
f) 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中上述輕鏈可變區選自下群:
a) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
b) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列;
c) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
d) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列;
e) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列;
f) 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段,其中
a) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
b) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列;
c) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列;
d) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列;
e) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列;或者
f) 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體包含CLDN18.2抗體7C12、11F12、26G6、59A9、18B10及12E9之一或多個(例如1、2、3、4、5或6)CDR序列。
如本文所使用,「7C12」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:37所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:38所示之輕鏈可變區。
如本文所使用,「11F12」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:39所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:40所示之輕鏈可變區。
如本文所使用,「26G6」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:41所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:42所示之輕鏈可變區。
如本文所使用,「59A9」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:43所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:44所示之輕鏈可變區。
如本文所使用,「18B10」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:45所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:46所示之輕鏈可變區。
如本文所使用,「12E9」係指小鼠抗體,其具有如SEQ ID NO:47所示之重鏈可變區及如SEQ ID NO:48所示之輕鏈可變區。
表1示出了此等CLDN18.2抗體之CDR序列。下表2亦提供了重鏈及輕鏈可變區序列。表 1. CLDN18.2 抗體 CDR 區之序列
表 2. 小鼠 / 嵌合抗體 VH/VL 之序列
抗體 | 區 | CDR1 | CDR2 | CDR3 |
7C12 | HCDR | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 3 | SEQ ID NO: 5 |
GYNMN | NIDPYYGATRYNQKFKG | SYYGNAFDY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 6 | |
KSSQSLLNSGNQKNYLT | WASTRES | QNDYSFPFT | ||
11F12 | HCDR | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 7 | SEQ ID NO: 5 |
GYNMN | YIDPYYGGTRYNQKFKG | SYYGNAFDY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 8 | |
KSSQSLLNSGNQKNYLT | WASTRES | QNDYSYPFT | ||
26G6 | HCDR | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 9 | SEQ ID NO: 11 |
GYNMN | HIDPYYVTTTYNQKFRG | SFYGNAFDY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 10 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 6 | |
KSSQSLFNSGNQKNYLT | WASTRES | QNDYSFPFT | ||
59A9 | HCDR | SEQ ID NO: 13 | SEQ ID NO: 15 | SEQ ID NO: 17 |
TYFIGVG | HIWWNDNKYYNTALKS | MGSGAWFTY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 2 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 12 | |
KSSQSLLNSGNQKNYLT | WASTRES | QNDYYYPLT | ||
18B10 | HCDR | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 19 | SEQ ID NO: 21 |
GYNMN | NIDPYYGGTSYNQKFKG | MYHGNAFDY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 14 | SEQ ID NO: 16 | SEQ ID NO: 18 | |
KSSQSLLNSGNLKNYLT | WASTRKS | QNDYSYPLT | ||
12E9 | HCDR | SEQ ID NO: 1 | SEQ ID NO: 22 | SEQ ID NO: 5 |
GYNMN | NIDPYYGGTRYNQKFKG | SYYGNAFDY | ||
LCDR | SEQ ID NO: 20 | SEQ ID NO: 4 | SEQ ID NO: 6 | |
KSSQNLLNNGNQKNYLT | WASTRES | QNDYSFPFT |
VH | VL | |
7C12 | SEQ ID NO: 37 | SEQ ID NO: 38 |
EFQLQQSGPELEKPGASVRISCKTSGYSFTGYNMNWVKQSNGESLEWIGNIDPYYGATRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARSYYGNAFDYWGQGTTLTVSS | DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSFPFTFGSGTKLEIK | |
11F12 | SEQ ID NO: 39 | SEQ ID NO: 40 |
EFQLQQSGPELEKPGASVRISCKTSGYSFTGYNMNWVKQSNGESLEWIGYIDPYYGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARSYYGNAFDYWGQGTTLTVSS | DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIK | |
26G6 | SEQ ID NO:41 | SEQ ID NO: 42 |
EFQLQQSGPELEKPGASVKISCKTSGYSFTGYNMNWVKQSNGQSLEWIGHIDPYYVTTTYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARSFYGNAFDYWGQGTTLTVSS | DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSFPFTFGSGTKLEIK | |
59A9 | SEQ ID NO:43 | SEQ ID NO: 44 |
QITQKESGPGILQPSQTLSLTCSLSGFSLSTYFIGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWNDNKYYNTALKSRLTISKDTSNNQVFLKIASVDTADTATYYCARMGSGAWFTYWGQGTLVTVSA | DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYYYPLTFGSGTKLEIK | |
18B10 | SEQ ID NO:45 | SEQ ID NO: 46 |
EFQLQQSGPELEKPGASVRISCKTSGYSFTGYNMNWVKQSNGESLEWIGNIDPYYGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTLTVSS | DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNLKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTLSSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLELK | |
12E9 | SEQ ID NO:47 EFQLQQSGPELEKPGASVRISCKTSGYSFTGYNMNWVKQSNGESLEWIGNIDPYYGGTRYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARSYYGNAFDYWGQGTTLTVSS | SEQ ID NO: 48 DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQNLLNNGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISSVQAEDLAVYYCQNDYSFPFTFGAGTKLELK |
本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段可為單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、標記抗體、雙價抗體或抗獨特型抗體。重組抗體係在體外而非在動物中使用重組方法製備之抗體。
已知CDR負責抗原結合,然而,發現並非所有6個CDR均係必不可少或不可改變的。換言之,可替換或更改或修飾抗CLDN18.2抗體7C12、11F12、26G6、59A9、18B10或12E9中之1個、2個或3個CDR(對應於SEQ ID NO:1-22中之任何一個),但實質上保留與CLDN18.2之特異性結合親和力。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段包含抗CLDN18.2抗體7C12、11F12、26G6、59A9、18B10或12E9中之一個之重鏈CDR3序列。在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段包含如SEQ ID NO:5、11、17及21所示之重鏈CDR3序列。重鏈CDR3區位於抗原結合位點之中心,因此被認為與抗原接觸最多,且為抗體對抗原之親和力提供了最大之自由能。亦據信,藉由多種多樣化機制(Tonegawa S. Nature. 302:575-81)就長度、胺基酸組成及構象而言,重鏈CDR3為抗原結合位點迄今為止最多樣化之CDR。重鏈CDR3之多樣性足以產生大多數抗體特異性(Xu JL, Davis MM. Immunity. 13:37-45)以及所需之抗原結合親和力(Schier R等,J Mol Biol. 263:551-67)。
在一些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段包含全部或部分之重鏈可變結構域及/或全部或部分之輕鏈可變結構域。在一個實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段為單域抗體,其由本文提供之全部或部分重鏈可變結構域組成。此項技術中可獲得此種單域抗體之更多資訊(參見,例如,美國專利號6,248,516)。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體及其抗原結合片段包含合適的框架區(FR)序列,只要上述抗體及其抗原結合片段可與CLDN18.2特異性結合即可。表1中提供之CDR序列獲取自小鼠抗體,然而可使用此項技術中已知的合適方法(例如,重組技術),將其嫁接至任何合適物種(例如,小鼠、人、大鼠、兔等)之任何合適FR序列上。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體及其抗原結合片段為人源化的。由於人源化抗體或抗原結合片段在人中免疫原性降低,因此為理想的。因為將非人CDR序列嫁接至人或基本人之FR序列上,所以人源化抗體在其可變區中為嵌合的。抗體或抗原結合片段之人源化實質上可藉由用非人(例如鼠)CDR基因替換人免疫球蛋白基因中之相應人CDR基因來進行(參見,例如,Jones等人,(1986) Nature 321:522-525; Riechmann等人, (1988) Nature 332:323-327;Verhoeyen等人,(1988) Science 239:1534-1536)。
使用此項技術中已知的方法,可選擇合適的人重鏈及輕鏈可變結構域以實現該目的。在說明性實例中,可使用「最適合(best-fit)」方法,其中針對已知的人可變結構域種系序列之資料庫篩選或BLAST非人(例如,嚙齒動物)抗體之可變結構域序列,且鑑定最接近非人查詢序列之人序列,且將其用作嫁接非人CDR序列之人支架(human scaffold)(參見,例如,Sims等人,(1993) J. Immunol. 151:2296;Chothia等人, (1987) J. Mot. Biol. 196:901)。或者,可使用源於所有人抗體之共有序列之框架區來嫁接非人CDR (參見,例如,Carter等人,(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285;Presta等人,(1993) J. Immunol.,151:2623)。
在某些實施方式中,本文提供之上述人源化抗體或抗原結合片段實質上由除非人CDR序列以外所有的人序列組成。在一些實施方式中,可變區FR及恆定區(若存在)全部或實質上來自人免疫球蛋白序列。人FR序列及人恆定區序列可衍生自不同的人免疫球蛋白基因,例如,FR序列源於一種人抗體而恆定區源於另一種人抗體。在一些實施方式中,上述人源化抗體或抗原結合片段包含人重鏈/輕鏈FR1-4。
在一些實施方式中,源於人之FR區可包含與源於其之人免疫球蛋白相同之胺基酸序列。在一些實施方式中,人FR之一或多個胺基酸殘基經來自親本非人抗體之相應殘基取代。在某些實施方式中,此可能為所期望的,以使人源化抗體或其片段緊密接近非人親本抗體結構,從而減少或避免免疫原性及/或改良或保持結合活性或結合親和力。
在某些實施方式中,本文提供之上述人源化抗體或抗原結合片段在每個人FR序列中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代,或在重鏈或輕鏈可變結構域之所有FR中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施方式中,胺基酸殘基之此類改變可僅存在於重鏈FR區中、僅存在於輕鏈FR區中、或存在於兩條鏈中。在某些實施方式中,將一或多個胺基酸殘基突變,例如,突變回CDR序列源自之非人親本抗體中(例如,在小鼠框架區中)發現之相應殘基。熟習此項技術者可按照此項技術中已知的原理選擇合適的突變位置。例如,可選擇用於突變之位置,其中:1)人種系序列框架中之殘基很少(例如,在人可變區序列中少於20%或少於10%);2)因為該位置可能與CDR中之殘基相互作用,所以其與人種系鏈一級序列中3個CDR之一或多個緊鄰;或3)該位置在3維模型中靠近CDR,因此與CDR中之胺基酸相互作用之可能性很高。所選位置上之殘基可突變回親本抗體中之相應殘基,或突變為既不為人種系序列亦不為親本抗體中之相應殘基,而為人序列之典型殘基,即在與人種系序列屬於同一亞組之已知人序列中,其更頻繁地發生在該位置上(參見美國專利號5,693,762)。
在某些實施方式中,本發明之上述人源化輕鏈及重鏈在人中實質上為無免疫原性的,且與針對CLDN18.2之親本抗體相比保留了實質上相同或甚至更高之親和力。
在某些實施方式中,本文提供之上述人源化抗體及其抗原結合片段包含人種系框架序列VK/4-1之一或多個輕鏈FR序列,及/或人種系框架序列VH/1-46之一或多個重鏈FR序列,有或無反向突變。若需要,可將反向突變引入人種系框架序列中。在某些實施方式中,人源化抗體18B10可在重鏈框架序列VH/1-46中包含選自下群之一或多個反向突變:R71I、T73K、T28S、M69L、R38K及M48I (全部基於Kabat編號)。人源化抗體18B10可在輕鏈框架序列VK/4-1中包含選自下群之一或多個反向突變:S63T及I21M (全部基於Kabat編號)。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區,上述重鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47,及與上述序列具有至少80% (例如,至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)序列同一性但仍保留與CLDN18.2 (尤其人CLDN18.2)之特異性結合親和力之同源序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區,上述輕鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48,及與上述序列具有至少80% (例如,至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)序列同一性但仍保留與CLDN18.2 (尤其人CLDN18.2)之特異性結合親和力之同源序列。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其包含,
包含如SEQ ID NO:25所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:26所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:27所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:28所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:29所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:26或28所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:37所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:38所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:39所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:40所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:41所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:42所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:43所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:44所示序列之輕鏈可變區;
包含如SEQ ID NO:45所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:46所示序列之輕鏈可變區;或者
包含如SEQ ID NO:47所示序列之重鏈可變區,及包含如SEQ ID NO:48所示序列之輕鏈可變區。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段進一步包含一或多個重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4,及/或一或多個輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4,其中:
上述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17
FT
(SEQ ID NO:54)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述HFR2包含WVX18
QAPGQGLEWX19
G
(SEQ ID NO:55)或與其具有至少80% (或至少90%)序列同一性之同源序列,
上述HFR3序列包含RVTX20
TIDKSTSTVYMELSS LRSEDTAVYYCAR
(SEQ ID NO:56)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述HFR4包含WGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:57)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列,
上述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21
NC
(SEQ ID NO:58)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,
上述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY
(SEQ ID NO:59)或與其具有至少80% (或至少85%、90%)序列同一性之同源序列,
上述LFR3包含GVPDRFX22
GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
(SEQ ID NO:60)或與其具有至少80% (或至少85%、90%、95%)序列同一性之同源序列,以及
上述LFR4包含FGGGTKVEIK
(SEQ ID NO:61)或與其具有至少80% (或至少90%)序列同一性之同源序列,
其中X17
為T或S,X18
為R或K,X19
為M或I,X20
為M或L,X21
為I或M,且X22
為S或T。
在某些實施方式中,上述HFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:62及63,上述HFR2包含選自下群之序列:SEQ ID NO:64及65,上述HFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:66及67,上述HFR4包含如SEQ ID NO:57所示之序列,上述LFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:68及69,上述LFR2包含如SEQ ID NO:59所示之序列,上述LFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:70及71,以及上述LFR4包含如SEQ ID NO:61所示之序列。表 3-1. 人源化 CLDN18.2 抗體 18B10 之框架 (FR) 序列
抗體鏈 | FR1 | FR2 | FR3 | FR4 |
Hu18B10-Ha | SEQ ID NO: 62 | SEQ ID NO: 64 | SEQ ID NO: 66 | SEQ ID NO: 57 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT | WVRQAPGQGLEWMG | RVTMTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR | WGQGTTVTVSS | |
Hu18B10-Hb | SEQ ID NO: 63 | SEQ ID NO: 64 | SEQ ID NO: 67 | SEQ ID NO: 57 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT | WVRQAPGQGLEWMG | RVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR | WGQGTTVTVSS | |
Hu18B10-Hc | SEQ ID NO:63 | SEQ ID NO: 65 | SEQ ID NO: 67 | SEQ ID NO: 57 |
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT | WVKQAPGQGLEWIG | RVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR | WGQGTTVTVSS | |
Hu18B10_La | SEQ ID NO: 68 | SEQ ID NO: 59 | SEQ ID NO: 70 | SEQ ID NO: 61 |
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC | WYQQKPGQPPKLLIY | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC | FGGGTKVEIK | |
Hu18B10_Lb | SEQ ID NO: 69 | SEQ ID NO: 59 | SEQ ID NO: 71 | SEQ ID NO: 61 |
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNC | WYQQKPGQPPKLLIY | GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC | FGGGTKVEIK |
表3-2示出了人源化18B10抗體之可變區序列。表 3-2. 人源化 18B10 之序列
抗體鏈 | 序列 |
18B10 HC 種系 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR( SEQ ID NO: 23 ) |
Hu18B10-Ha | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTMTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS( SEQ ID NO: 25 ) |
Hu18B10-Hb | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS( SEQ ID NO: 27 ) |
Hu18B10-Hc | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVKQAPGQGLEWIGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTLTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO: 29) |
18B10-LC 種系 | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP( SEQ ID NO: 24 ) |
Hu18B10_La | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNLKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGGGTKVEIK( SEQ ID NO: 26) |
Hu18B10_Lb | DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQSLLNSGNLKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGGGTKVEIK( SEQ ID NO: 28 ) |
在某些實施方式中,本文提供之上述人源化抗體可包含與人IgG1同種型之恆定區融合之重鏈可變區及與人κ鏈之恆定區融合之輕鏈可變區。
本文提供之上述人源化抗CLDN18.2抗體保留了與表現CLDN18.2細胞之特異性結合親和力,且在該態樣至少與親本抗體相當或甚至更佳。本文提供之上述人源化抗體亦可保留其與表現CLDN18.2細胞(例如NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞或KATOIII細胞)之功能性相互作用,其中所有抗體均可介導ADCC、CDC及凋亡誘導產生之細胞殺傷作用,上述凋亡藉由腫瘤細胞表面靶標之交聯及直接抑制增殖所誘導。在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其片段進一步包含免疫球蛋白恆定區,可選地人Ig之恆定區,或可選地人IgG之恆定區。在一些實施方式中,免疫球蛋白恆定區包含重鏈及/或輕鏈恆定區。重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區。在某些實施方式中,重鏈恆定區包含Fc區。在某些實施方式中,輕鏈恆定區包含Cκ或Cλ。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗體及其片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之恆定區。在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段包含IgG1同種型之恆定區。在某些實施方式中,人IgG1之恆定區包含如SEQ ID NO:49所示之序列,或與其具有至少80% (例如,至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)序列同一性之同源序列。
IgG1同種型之恆定區可誘導效應子功能,例如ADCC或CDC。本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段之效應子功能可對表現CLDN18.2之細胞產生細胞毒性。可使用各種分析法,例如Fc受體結合分析、C1q結合分析及細胞溶解分析,以及上述用於確定ADCC或CDC之任何分析來評估效應子功能。
抗體變異體
本文提供之抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段亦涵蓋本文提供之抗體序列之各種類型之變異體。
在某些實施方式中,變異體在表1提供之1、2或3個CDR序列中,在一或多個FR序列中,在本文提供之上述重鏈或輕鏈可變區序列中,及/或在恆定區(例如,Fc區)中,包含一或多個修飾或取代。此類抗體變異體保留了其親本抗體對CLDN18.2之特異性結合親和力,然而具有修飾或取代所賦予之一或多種期望之性質。例如,僅舉幾例,抗體變異體可具有改良之抗原結合親和力、改良之糖基化模式、降低之糖基化風險、減少之脫胺基、減少之或增加之效應子功能、改良之FcRn受體結合、增加之藥代動力學半衰期、pH敏感性及/或與綴合物之相容性(例如,一或多個引入之半胱胺酸殘基)。
可使用此項技術中已知的方法,例如「丙胺酸掃描誘變」,篩選親本抗體序列以鑑定合適的或較佳的殘基來進行修飾或取代(參見,例如,Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085)。簡而言之,可鑑定靶標殘基(例如帶電荷之殘基,如Arg、Asp、His、Lys及Glu),且用中性或帶負電荷之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)替換,從而產生修飾之抗體且篩選感興趣之性質。若在特定胺基酸位置之取代顯示出令人感興趣之功能變化,則可將該位置鑑定為用於修飾或取代之潛在殘基。可藉由用不同類型之殘基(例如,半胱胺酸殘基、帶正電之殘基等)取代來進一步評估潛在之殘基。
1. 親和力變異體
親和力變異體保留了其親本抗體與CLDN18.2之特異性結合親和力,或甚至具有相比於親本抗體改良之CLDN18.2特異性結合親和力。可使用此項技術中已知的各種方法來實現該目的。例如,可使用噬菌體展示技術來產生及表現抗體變異體(例如Fab或scFv變異體)之文庫,接著篩選與人CLDN18.2之結合親和力。再例如,電腦軟體可用於虛擬模擬抗體與人CLDN18.2之結合,且鑑定抗體上形成結合界面之胺基酸殘基。可在取代中避免此類殘基以防止結合親和力降低,或靶向取代此類殘基以提供更強之結合。
在某些實施方式中,CDR序列、FR序列或可變區序列中之至少一個(或全部)取代包含保守取代。關於胺基酸序列之「保守取代」係指用具有相似理化性質之側鏈之不同胺基酸殘基替換胺基酸殘基。例如,可在具有疏水性側鏈之胺基酸殘基(例如,Met、Ala、Val、Leu及Ile)中,在具有中性親水性側鏈之殘基(例如,Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)中,在具有酸性側鏈之殘基(例如,Asp、Glu)中,在具有鹼性側鏈之胺基酸(例如,His、Lys及Arg)中,或在具有芳族側鏈之殘基(例如,Trp、Tyr及Phe)中進行保守取代。如此項技術中已知的,保守取代通常不會引起蛋白質構象結構之顯著變化,因此可保留蛋白質之生物學活性。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或抗原結合片段在一或多個CDR序列中和/或一或多個FR序列中包含一或多個胺基酸殘基取代。在某些實施方式中,親和力變異體在一或多個CDR序列及/或FR序列中總共包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段包含1、2或3個CDR序列,上述CDR序列具有與表1中所列之一或多種序列至少80% (例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性,同時保留了與其親本抗體相似或甚至更高水準之CLDN18.2結合親和力。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段包含一或多個可變區序列,上述可變區序列具有與如SEQ ID NO:23-29及37-48所示之一或多種序列至少80% (例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性,同時保留了與其親本抗體相似或甚至更高水準之CLDN18.2結合親和力。在一些實施方式中,在選自SEQ ID NO:25-29及37-48之序列中,總共1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施方式中,取代、插入或缺失發生在CDR以外之區域(即,FR中)。
2. 糖基化變異體
本文提供之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段亦包含糖基化變異體,可獲得其以增加或降低抗體或抗原結合片段之糖基化程度。如本文所使用,術語「糖基化」係指將聚糖例如岩藻糖、木糖、甘露糖或GlcNAc磷酸絲胺酸聚糖連接至蛋白質、脂質或其他有機分子上之酶促過程。根據與聚糖連接之碳,糖基化可分為五類,其包括:N-聯糖基化、O-聯糖基化、二氧磷基-糖基化、C-聯糖基化及糖基磷脂醯肌醇化。
抗體之糖基化通常為N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基(例如,三肽序列中之天冬醯胺殘基,例如天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸,其中X為脯胺酸以外的任何胺基酸)側鏈之連接。O-聯糖基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一個與羥基胺基酸之連接,最通常與絲胺酸或蘇胺酸之連接。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段包含具有改良之效應子功能之糖基化變異體,例如ADCC或CDC。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗體或其抗原結合片段為非岩藻糖基化的。術語「非岩藻糖基化」或「非岩藻糖基化的」係指減少或移除與抗體連接之N-聚糖上之核心岩藻糖。人IgG抗體之大多數聚糖稱為G0、G1及G2,其為複雜的雙四分體分子(biantennary molecules),其核心岩藻糖殘基帶有零個、一個或兩個末端半乳糖。
非岩藻糖基化之抗體變異體可使用此項技術中已知的方法來製備,例如,如在US2003/0157108、WO2000/61739、WO2001/29246、US2003/0115614、US2002/0164328、US2004/0093621、US2004/0132140、US2004/0110704、US2004/0110282、US2004/0109865、WO2003/085119、WO2003/084570、WO2005/035586、WO2005/035778、WO2005/053742、WO2002/031140、Okazaki等人, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)、Yamane-Ohnuki等人, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)所描述的。
在某些實施方式中,抗體糖基化變異體在抗體Fc中CH2區之Asn297位點為非岩藻糖基化的。Asn297係指位於Fc區中約297位(Fc區殘基之EU編號)之天冬醯胺殘基。然而,由於抗體中之微小序列變化,Asn297亦可位於297位上游或下游約±3個胺基酸,即在294及300位之間。
在某些實施方式中,抗體糖基化變異體可藉由例如移除天然糖基化位點(例如,藉由N297A取代)獲得,以使得在抗體或Fc序列中不再存在N-連接之糖基化位點之三肽序列或O-連接之糖基化位點之絲胺酸或蘇胺酸殘基。備選地,在某些實施方式中,可藉由在宿主細胞株中產生抗體來獲得抗體糖基化變異體,上述宿主細胞株在將所選糖基添加至抗體之成熟核心碳水化合物結構中為有缺陷的。
3. 半胱胺酸工程化之變異體
本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段亦涵蓋半胱胺酸工程化之變異體,其包含一或多個引入之游離半胱胺酸胺基酸殘基。
游離之半胱胺酸殘基為不屬於二硫鍵橋聯之部分。半胱胺酸工程化之變異體可用於在工程化半胱胺酸之位點藉由例如馬來醯亞胺或鹵代乙醯基與例如細胞毒性及/或成像化合物,標記或放射性同位素綴合。工程化抗體或抗原結合片段以引入游離半胱胺酸殘基之方法為此項技術中已知的,參見例如WO2006/034488。
4. Fc 變異體
本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段亦涵蓋Fc變異體,其在其Fc區及/或鉸鏈區包含一或多個胺基酸殘基修飾或取代。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段包含恆定區,該恆定區包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾,此導致相對於野生型恆定區增加之CDC或ADCC。可取代Fc區之CH2結構域中之某些胺基酸殘基以例如藉由增強Fc結構域與FcγRIIIA之親和力來提供增強之ADCC活性。藉由抗體工程改變ADCC活性之方法已經在此項技術中有所描述,參見例如,Shields RL. 等人, J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604;Idusogie EE. 等人, J Immunol. 2000.164(8):4178-84;Steurer W. 等人, J Immunol. 1995, 155(3): 1165- 74;Idusogie EE. 等人, J Immunol. 2001, 166(4): 2571-5;Lazar GA. 等人, PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010;Ryan MC. 等人, Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 3009-3018;Richards JO,. 等人, Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27;Shields R. L. 等人,J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740;Shinkawa T. 等人,J. Biol. Chem, 2003, 278: 3466-3473。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段包含一或多個胺基酸取代,其例如藉由改良或減少C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)來改變補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見,例如WO99/51642、Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)、美國專利號5,648,260、美國專利號5,624,821、及關於Fc區變異體其他實例之WO94/29351)。
在某些實施方式中,本文提供之抗體或其抗原結合片段之恆定區包含相對於SEQ ID NO:49 (即野生型序列)之一或多個胺基酸殘基取代,上述取代選自下群:L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L或其任何組合。在某些實施方式中,上述恆定區包含如SEQ ID NO:51所示之序列。
在某些實施方式中,抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段包含一或多個胺基酸取代,其改良對新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合。此類變異體可具有延長之藥代動力學半衰期,因為其在酸性pH下與FcRn結合,從而使其能夠逃離溶酶體中之降解,接著被轉運且釋放至細胞外。工程化抗體及其抗原結合片段以改良與FcRn之結合親和力之方法為此項技術中公知的,參見例如Vaughn, D. 等人,Structure, 6(1): 63-73, 1998;Kontermann, R. 等人,Antibody Engineering, 第1卷, 第27章: Engineering of the Fc region for improved PK, published by Springer, 2010;Yeung, Y. 等人,Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010);及Hinton, P. 等人,J. Immunology, 176:346-356 (2006)。
抗原結合片段
本文亦提供抗CLDN18.2抗原結合片段。各種類型之抗原結合片段為此項技術中已知的,且可基於本文提供之上述抗CLDN18.2抗體進行開發,包括例如CDR序列如表1所示之例示性抗體,以及其不同變異體(例如親和性變異體、糖基化變異體、Fc變異體、半胱胺酸工程化之變異體等)。
在某些實施方式中,本文提供之抗CLDN18.2抗原結合片段為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2
、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)2
、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價之雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。
各種技術可用於產生此類抗原結合片段。說明性方法包括完整抗體之酶消化(參見,例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);及Brennan等人, Science, 229:81 (1985)),藉由宿主細胞(例如大腸桿菌)重組表現(例如,對於Fab、Fv及ScFv抗體片段),如上所述從噬菌體展示文庫進行篩選(例如,對於ScFv)以及將兩個Fab'-SH片段化學偶聯以形成F(ab')2
片段(Carter等人, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。產生抗體片段之其他技術對於熟練之從業者將為顯而易見的。
在某些實施方式中,上述抗原結合片段為scFv。scFv之產生描述於例如WO93/16185、美國專利號5,571,894及5,587,458。scFv可在胺基或羧基末端與效應蛋白融合以提供融合蛋白(參見,例如,Antibody Engineering, ed. Borrebaeck)。
在某些實施方式中,本文提供之上述抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段為雙價、四價、六價或多價的。如本文所使用,術語「價」係指在給定分子中存在指定數目的抗原結合位點。因此,術語「雙價」、「四價」及「六價」分別表示在抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。任何大於雙價之分子被認為係多價的,涵蓋例如三價、四價、六價等。
若兩個結合位點均對結合相同之抗原或相同之抗原決定基為特異性的,則雙價分子可為單特異性的。在某些實施方式中,此提供比單價對應物更強之與抗原或抗原決定基之結合。類似地,多價分子亦可為單特異性的。在某些實施方式中,在雙價或多價抗原結合部分中,結合位點之第一價及結合位點之第二價在結構上相同(即具有相同之序列),或在結構上不同(即,儘管具有相同之特異性但具有不同之序列)。
若兩個結合位點對不同之抗原或抗原決定基為特異性的,則雙價亦可為雙特異性的。此亦適用於多價分子。例如,當兩個結合位點對第一抗原(或抗原決定基)單特異性且第三結合位點對第二抗原(或抗原決定基)特異性時,三價分子可為雙特異性的。
雙特異性抗體
在某些實施方式中,本文提供之抗體及其抗原結合片段為雙特異性的。如本文所使用,術語「雙特異性」涵蓋具有兩個特異性之分子及具有兩個以上特異性(即,多特異性)之分子。在某些實施方式中,本文提供之上述雙特異性抗體及其抗原結合片段能夠與CLDN18.2之第一及第二抗原決定基特異性結合,或者能夠與CLDN18.2及第二抗原特異性結合。在某些實施方式中,CLDN18.2之第一抗原決定基及第二抗原決定基彼此不同或不重疊。在某些實施方式中,雙特異性抗體及其抗原結合片段可同時與第一抗原決定基及第二抗原決定基結合。在某些實施方式中,第二抗原不同於CLDN18.2。
在某些實施方式中,上述第二抗原為免疫相關靶標。在一些實施方式中,上述雙特異性抗體及其抗原結合片段與CLDN18.2及免疫相關靶標特異性結合,且能夠將免疫細胞靶向表現CLDN18.2之細胞(例如,表現CLDN18.2之腫瘤細胞)及/或激活對表現CLDN18.2之靶細胞之CLDN18.2特異性免疫應答。如本文所使用之免疫相關靶標,涵蓋與免疫應答(可選地,細胞免疫應答)之產生或調節有關之生物分子。免疫相關靶標之一個實例為免疫檢查點分子及細胞溶解性免疫細胞(例如,T細胞或自然殺傷(NK)細胞)之表面分子。
免疫檢查點分子可介導共刺激信號以增強免疫應答,或可介導共抑制信號以抑制免疫應答。免疫檢查點分子之實例包括,例如,PD-L1、PD-L2、PD-1、CLTA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、ICOS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-15、CD3、CD16及CD83。
細胞溶解性免疫細胞可由其表面分子觸發,以攻擊及介導目標細胞(例如,腫瘤細胞)之溶解。在某些實施方式中,第二抗原為T細胞表面抗原。T細胞表面抗原之實例包括但不限於選自下群之抗原:CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L及/或CD44,較佳為CD3。在某些實施方式中,上述第二抗原為CD3之ε鏈。在某些實施方式中,上述雙特異性抗體與T細胞上之CD3結合導致了上述T細胞之增殖及/或活化,此誘導細胞毒性因子(例如,穿孔素及顆粒酶)之釋放以及靶細胞之細胞溶解及凋亡。在某些實施方式中,上述第二抗原為NK細胞表面抗原,例如CD16(FcγRIII)或CD56。在某些實施方式中,雙特異性抗體與NK細胞上之CD16結合導致了NK細胞脫粒及靶細胞之穿孔素依賴性靶細胞裂解(ADCC)。
在某些實施方式中,上述第二抗原包含腫瘤抗原。如本文所使用,「腫瘤抗原」係指腫瘤特異性抗原(例如,腫瘤細胞所特有之抗原,通常在非腫瘤細胞上不存在),腫瘤相關抗原(例如,在腫瘤及非腫瘤細胞中均存在但在腫瘤細胞中表現不同)及腫瘤新抗原(例如,由於體細胞突變而在癌細胞中表現之抗原,上述突變改變了蛋白質序列或在兩個不相關序列之間產生融合蛋白)。
腫瘤抗原之實例包括但不限於EpCAM、HER2/neu、HER3/neu、C250、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、EGFR、αVβ3-整聯蛋白、HLA、HLA-DR、ASC、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD13、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD40、CD41、CD47、CD52、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、神經節苷脂GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4、Trp2、gp100(Pmel 17)、酪胺酸酶、Muc-1、端粒酶、存活蛋白、G250、p53、CA125 MUC、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、MCSP、EpHA2及細胞表面靶標GC1 82、GT468或GT512、PD-L1、樹狀病毒E蛋白抗原決定基、神經膠質瘤相關抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、蛋白酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、前列腺素、PSMA、存活蛋白及端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性彈性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰島素生長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-1受體及間皮素、ART-1/MelanA(MART-1)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2及腫瘤特異性多譜系抗原,例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5; Ras,由於染色體易位而產生之獨特腫瘤抗原;如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR;及病毒抗原,例如愛潑斯坦巴爾病毒抗原EBVA及人乳頭瘤病毒(HPV)抗原E6及E7;基於蛋白質之抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl 85erbB2、pl 80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環素、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4(791Tgp72)、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\I、CO-029、FGF-5、G250、Ga733VEpCAM、HTgp-175、M344、MA -50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白、親環蛋白C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP及TPS。
在某些實施方式中,腫瘤抗原與胃癌、食道癌、胰臟癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、肝癌、頭頸癌、膽囊癌及其轉移有關。此類腫瘤抗原之實例包括但不限於CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、蛙皮素樣肽、PSA、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌症相關黏蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR3)、雌激素受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、轉鐵蛋白受體、IL-2R或CO17-1A、CA19-9及CA72-4。在某些實施方式中,上述腫瘤抗原存在於表現CLDN18.2之細胞(例如,表現CLDN18.2之癌細胞)中。
本文提供之雙特異性抗體及其抗原結合片段可為此項技術中已知的合適形式。例如,例示性雙特異性形式可為雙特異性雙抗體、基於scFv之雙特異性形式、IgG-scFv融合、雙可變結構域(DVD)-Ig、Quadroma、knobs-into-holes、共同輕鏈(例如,帶有knobs-into-holes之普通輕鏈等)、BiTE、CrossMab、CrossFab、Duobody、SEEDbody、白胺酸拉鏈、雙作用Fab (DAF)-IgG及Mab2
雙特異性形式(參見,例如Brinkmann等人,2017, Mabs, 9(2): 182-212)。雙特異性分子可以為對稱或不對稱的結構。
本文提供之上述雙特異性抗體及抗原結合片段可藉由此項技術中已知的任何合適方法來製備。
在一個實施方式中,將具有不同抗原特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對在宿主細胞中共表現,以重組方式產生雙特異性抗體(參見,例如Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)),接著藉由親和力層析純化。
在另一個實施方式中,將編碼具有兩種特異性之抗體重鏈可變結構域之序列分別與免疫球蛋白恆定結構域序列融合,接著插入一或多個表現載體中,上述一或多個表現載體與用於輕鏈序列之表現載體共轉染至合適的宿主細胞中,以重組表現雙特異性抗體。(參見,例如,WO 94/04690;Suresh等人, Methods in Enzymology, 121:210 (1986))。類似地,scFv二聚體亦可自宿主細胞重組構建且表現。(參見,例如,Gruber等人, J. Immunol., 152:5368 (1994))。
在另一種方法中,可藉由基因融合將來自Fos及Jun蛋白之白胺酸拉鏈肽連接至兩種不同抗體之Fab'部分。所連接之抗體在鉸鏈區被還原成四個半抗體(即單體),接著再氧化形成異二聚體(Kostelny等人, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))。
兩個抗原結合結構域亦可綴合或交聯以形成雙特異性抗體或抗原結合片段。例如,一種抗體可與生物素偶聯,而另一種抗體與抗生物素蛋白偶聯,生物素與抗生物素蛋白之間的強結合將兩種抗體複合在一起形成雙特異性抗體(參見,例如,美國專利號4,676,980;WO91/00360、WO92/00373及EP 03089)。以另一個實施例為例,兩種抗體或抗原結合片段可藉由此項技術中已知的習知方法交聯,例如,如美國專利號4,676,980中所揭示的。
雙特異性抗原結合片段可自雙特異性抗體例如,藉由蛋白水解切割或藉由化學連接產生。例如,可以製備抗體之抗原結合片段(例如,Fab')且將其轉化為Fab'-硫醇衍生物,接著與具有不同抗原特異性之另一種轉化之Fab'衍生物混合且反應,以形成雙特異性抗原-結合片段(參見,例如,Brennan等人, Science, 229: 81 (1985))。
在某些實施方式中,本文提供之上述雙特異性抗體或其抗原結合片段可在界面上被工程化,從而可形成杵臼結構(knob-into-hole)之結合以促進兩個不同抗原結合位點之異二聚化。這可以使從重組細胞培養物中回收之異二聚體之百分比最大化。如本文所使用,「杵臼結構」係指兩個多肽(例如Fc)之間的相互作用,其中一個多肽由於存在具有大側鏈之胺基酸殘基而具有突起(即「杵」)(例如酪胺酸或色胺酸),另一個多肽具有一個空腔(即「臼」),小側鏈胺基酸殘基位於其中(例如丙胺酸或蘇胺酸),且該突起在該空腔中可定位,從而促進兩個多肽中之相互作用以形成異二聚體或複合物。產生具有杵臼結構之多肽之方法在此項技術中為已知的,例如,如美國專利號5,731,168所述。
綴合物
在一些實施方式中,抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段與一或多個綴合部分連接。綴合物為可附著於抗體或其抗原結合片段之部分。預期各種綴合物可與本文提供之抗體或抗原結合片段連接(參見,例如,「Conjugate Vaccines」, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (編), Carger Press, New York, (1989))。此等共軛物可藉由共價結合、親和力結合、嵌入、配位結合、複合、締合、摻合或添加等方法與抗體或抗原結合片段連接。在某些實施方式中,抗體或其抗原結合片段藉由接頭與一或多種綴合物連接。在某些實施方式中,接頭為腙接頭(hydrazone linker)、二硫接頭、雙功能接頭、二肽接頭、葡糖醛酸苷接頭、硫醚接頭。
在某些實施方式中,本文揭示之抗CLDN18.2抗體及抗原結合片段可經工程化為在抗原決定基結合部分之外包含可用於結合一或多種綴合物之特異性位點。例如,此類位點可包括一或多個反應性胺基酸殘基(例如,半胱胺酸或組胺酸殘基),以促進與綴合物之共價連接。
綴合物可為清除修飾劑、治療劑(例如化療劑)、毒素、放射性同位素、可偵測標記(例如,鑭系元素、發光標記、螢光標記或酶受質標記),藥代動力學修飾部分,DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑,其他抗癌藥物或純化部分(例如磁珠或奈米顆粒)。
可偵測標記之實例可包括螢光標記(例如,螢光素、若丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶受質標記(例如,辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素、其他鑭系元素、發光標記、發色部分、洋地黃毒苷、生物素/親和素、DNA分子或用於偵測之金。
放射性同位素之實例可包括123
I、124
I、125
I、131
I、35
S、3
H、111
In、112
In、14
C、64
Cu、67
Cu、86
Y、88
Y、90
Y、177
Lu、211
At、186
Re、188
Re、153
Sm、212
Bi及32
P。放射性同位素標記之抗體可用於受體靶向成像實驗。
在某些實施方式中,綴合物可為有助於增加抗體半衰期之藥代動力學修飾部分,例如PEG。其他合適的聚合物包括例如羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇之共聚物等。
在某些實施方式中,綴合物可為純化部分(例如磁珠或奈米顆粒)。
抗體 - 藥物綴合物
在某些實施方式中,本發明提供抗體-藥物綴合物(ADC),其包含與細胞毒性劑綴合之任何上述抗CLDN18.2抗體或抗原結合片段。
ADC可用於局部遞送細胞毒性劑,例如在癌症治療中。此允許將細胞毒性劑靶向遞送至腫瘤且在其中進行細胞內積累,此在以下態樣尤其有用:全身施用此等未綴合之細胞毒性劑可能導致對正常細胞以及尋求消除之腫瘤細胞之不可接受水準之毒性(Baldwin等人, (1986) Lancet pp. (1986年3月15日):603-05;Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等人(編), 第475-506頁;Syrigos及Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614;Niculescu-Duvaz及Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;美國專利號4,975,278)。
在某些實施方式中,細胞毒性劑可為對細胞有害或可損害或殺死細胞之任何試劑。在某些實施方式中,細胞毒性劑可選地為毒素、化療劑(例如DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、生長抑制劑或其他抗癌藥物)或放射性同位素。
毒素之實例包括細菌毒素及植物毒素,例如白喉毒素、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白、阿布林、莫德黴素、α帚曲毒蛋白、擬南芥(Aleurites fordii)蛋白、石黃素蛋白、美洲疫黴蛋白(PARI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、薑黃素、巴豆菌素、皂角抑制劑(sapaonaria officinalis inhibitor)、多花白樹毒蛋白、限制酶,苯黴素,依諾黴素及單端孢黴毒素(參見WO 93/21232)。可使用此項技術中已知的方法將此類大分子毒素與本文提供之上述抗體或抗原結合片段綴合,例如,如在Vitetta等人,(1987) Science, 238:1098所描述的。
細胞毒性劑亦可為小分子毒素及化療劑,例如格爾德黴素(Mandler等人,(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandler等人, (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、美登素及美登木素生物鹼((EP 1391213; Liu等人, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623;美國專利第5,208,020號)、加利車黴素(Lode等人, (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinman等人, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)、紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替諾泊苷、長春新鹼、長春花鹼、長春地辛、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-脫氫睾丸激素、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶脫羧𠯤)、烷基化劑(例如氮芥、噻菌靈苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類藥物(例如柔紅黴素(先前為道諾黴素)及阿黴素)、抗生素類藥物(例如放線菌素(dactinomycin)(先前為放線菌素(actinomycin))、博來黴素、神黴素及蒽黴素(AMC))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春花鹼)、加利車黴素、美登木素生物鹼、多拉司他汀、耳他汀,例如MMAE及MMAF (美國專利號5,635,483、5,780,588)、多洛他汀、單端孢黴毒素及CC1065,及其具有細胞毒性活性之衍生物。
細胞毒性劑亦可為高放射性同位素。實例包括At211
、I131
、I125
、Y90
、Re186
、Sm153
、Bi212
、P32
、Pb212
及Lu之放射性同位素。放射性同位素與抗體之綴合方法在此項技術中為已知的,例如,藉由合適的配位體試劑(參見,例如,WO94/11026;Current Protocols in Immunology, 第1及2卷, Coligen等人編, Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991))。配位體試劑具有可以結合、螯合或複合放射性同位素金屬之螯合配位體,且亦具有與抗體或抗原結合片段之半胱胺酸之巰基反應之官能基。例示性之螯合配位體包括DOTA、DOTP、DOTMA、DTPA及TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.)。
細胞毒性劑可藉由此項技術中已知的任何合適的接頭與抗體或抗原結合片段連接,參見例如美國專利號5,208,020、6,441,163或歐洲專利0425235B1、Chari等人, Cancer Research 52:127-131 (1992)及US2005/0169933A1,其揭示內容藉由引用明確地併入本文。
在某些實施方式中,接頭在特定之生理環境下為可裂解的,從而促進細胞毒性藥物在細胞中之釋放。例如,接頭可為酸不穩定之接頭、對肽酶敏感之接頭、光不穩定之接頭、二甲基接頭或含二硫鍵之接頭、硫醚接頭及酯酶不穩定之接頭(Chari等人, Cancer Research 52:127-131 (1992)、美國專利號5,208,020)。在一些實施方式中,接頭可包含胺基酸殘基,例如二肽、三肽、四肽或五肽。連接子中之胺基酸殘基可為天然或非天然存在之胺基酸殘基。此類接頭之實例包括:纈胺酸-瓜胺酸(ve或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)、甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-yal-cit)、甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)、纈胺酸-瓜胺酸-對胺基苄氧基氧醯基(「vc-PAB」)。可設計及最佳化胺基酸接頭成分之選擇性,以藉由特定的酶(例如,腫瘤相關之蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶)進行酶促裂解。
在某些實施方式中,細胞毒性劑可藉由雙功能接頭試劑與本文提供之抗體或其抗原結合片段連接,上述雙功能接頭試劑包括例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(例如己二酸二甲酯HCl)、活性酯(如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯)、醛(如戊二醛)、雙疊氮基化合物(如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鎓衍生物(如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)、雙活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPRH、SBAP、SIA、SIAB、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB及SVSG (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)。此等接頭試劑為可商購的(例如,自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A,參見第467-498頁, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog)。
在某些實施方式中,在本文提供之ADC中,抗體(或其抗原結合片段)在抗體處與一或多種細胞毒性劑綴合:試劑比率為約1至約20、約1至約6、約2至約6、約3至約6、約2至約5、約2至約4、或約3至約4。
本文提供之ADC可藉由此項技術中已知的任何合適的方法來製備。在某些實施方式中,首先使抗體(或其抗原結合片段)之親核基團與雙功能接頭試劑反應,接著與細胞毒性劑連接,或者相反,即首先使細胞毒性劑之親核試劑與雙功能接頭反應,接著與抗體連接。
在某些實施方式中,細胞毒性劑可包含(或修飾為包含)可與本文提供之抗體或抗原結合片段之游離半胱胺酸之半胱胺酸硫醇反應之硫醇反應性官能基團。例示性硫醇反應性官能基團包括例如馬來醯亞胺、碘乙醯胺、吡啶基二硫化物、鹵代乙醯基、琥珀醯亞胺酯(例如,NHS、N-羥基琥珀醯亞胺)、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三𠯤基、五氟苯基酯或亞磷醯胺(Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.;Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2;Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London;Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2;Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, 第40-55頁, 643-671)。
細胞毒性劑或抗體在綴合形成ADC之前可與連接劑反應。例如,可進行、分離、純化及/或表徵細胞毒性劑之N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS),或者可原位形成且與抗體之親核基團反應。通常,綴合物之羧基形式為藉由與以下試劑之組合反應來活化:碳二亞胺試劑,例如二環己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺,或鈾試劑,例如TsTu (O-(N-琥珀醯亞胺基)-N,N,N',N'-四甲基鈾鎓四氟硼酸酯、HBTU (O-苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基尿銨六氟磷酸鹽)或HATU (O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基尿銨六氟磷酸鹽),活化劑,例如1-羥基苯并三唑(HOBt)及N-羥基琥珀醯亞胺,以得到NHS酯。在某些情況下,細胞毒性劑及抗體可藉由原位活化及反應連接在一起,從而一步形成ADC。其他活化及連接試劑包括TBTU (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿銨六氟磷酸鹽)、TFFH (N,N',N'',N'''-四甲基尿銨2-氟-六氟磷酸鹽)、PyBOP (苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯啶基-六氟磷酸膦)、EEDQ (2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫-喹啉)、DCC (二環己基碳二亞胺)、DIPCDI (二異丙基碳二亞胺)、MSNT (1-(均三甲苯-2-磺醯基)-3-硝基-1H-1,2,4-三唑及芳基磺醯鹵,例如三異丙基苯磺醯氯。在另一個實例中,抗體或抗原結合片段可與生物素綴合,接著間接與第二綴合物綴合,上述第二綴合物與抗生物素蛋白綴合。
嵌合抗原受體 (CAR) 組合物
本發明亦提供嵌合抗原受體(CAR),其包含如本文提供之抗CLDN18.2抗原結合結構域及T細胞活化結構域。嵌合抗原受體(CAR)為工程化之嵌合受體,其將抗體之抗原結合結構域與一或多個信號傳導結構域結合以用於T細胞活化。可對T細胞及自然殺傷(NK)細胞等免疫細胞進行基因工程改造以表現CAR。表現CAR之T細胞被稱為CAR-T細胞。CAR可介導T細胞中之抗原特異性細胞免疫活性,使CAR-T細胞能夠消除表現目標抗原之細胞(例如腫瘤細胞)。在一個實施方式中,本文提供之CAR-T細胞與在諸如癌細胞之細胞上表現之CLDN18.2之結合導致上述CAR-T細胞之增殖及/或活化,其中上述活化之CAR-T細胞可釋放細胞毒性因子,例如穿孔素、顆粒酶及顆粒溶素,且啟動癌細胞之細胞溶解及/或凋亡。
在一些實施方式中,CAR之T細胞活化結構域包含共刺激性信號傳導結構域及TCR信號傳導結構域,其可隨機或以指定順序彼此連接,視情況與具有例如2至10個胺基酸之間的長度之短肽接頭(例如,甘胺酸-絲胺酸雙聯體接頭)連接。
在一些實施方式中,CAR進一步包含跨膜結構域。當在細胞中表現時,抗CLDN18.2抗原結合結構域在細胞外,而T細胞活化結構域在細胞內。
在某些實施方式中,CAR包含抗CLDN18.2抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號傳導區及TCR信號傳導結構域,其中上述抗原結合結構域與CLDN18.2特異性結合,且包含本文提供之抗體之抗原結合片段。
1. 抗原結合結構域
在一些實施方式中,CAR之抗CLDN18.2抗原結合結構域包含本文提供之一或多個CDR序列、本文提供之一或多個重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域、或一或多種源於本文提供之任何抗CLDN18.2抗體之抗原結合片段。
在一些實施方式中,源於相同物種對於抗原結合結構域為有益的,其中CAR將最終用於該相同物種。例如,用於人時,使CAR中使用之抗原結合結構域源於人抗體或人源化抗體可能為有益的。在一些實施方式中,抗原結合結構域包含單鏈可變片段(scFv)。在一些實施方式中,抗原結合結構域可以多種其他形式存在,其包括例如Fv、Fab及(Fab')2
,以及雙功能(即雙特異性)雜交抗體片段(例如,Lanzavecchia等人,Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。在某些實施方式中,抗原結合結構域包含Fab或scFv。
2. 跨膜結構域
在某些實施方式中,CAR包含與CAR之細胞外抗原結合結構域融合之跨膜結構域。在一個實施方式中,可以選擇跨膜結構域,使得其與CAR中之一個結構域自然締合。在一些情況下,可選擇或修飾跨膜結構域以避免與T細胞受體複合物之其他成員之跨膜結構域結合。
本文提供之CAR之跨膜結構域可源於任何天然膜結合或跨膜蛋白之跨膜結構域,例如T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一些實施方式中,CAR之跨膜結構域亦可使用多種人鉸鏈,例如人Ig (免疫球蛋白)鉸鏈。
替代地,本文提供之CAR之跨膜結構域可為合成的,例如,主要包含疏水性殘基(例如,白胺酸及纈胺酸)。在一個實施方式中,在合成之跨膜結構域之每個末端包括苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。可選地,長度在2至10個胺基酸之間的短寡肽接頭或多肽接頭可形成CAR之跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域之間的連接。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供尤其合適的接頭。
3. TCR 信號傳導結構域
本文提供之CAR之T細胞活化結構域包括TCR信號傳導結構域。TCR信號傳導結構域可激活表現CAR之T細胞,以發揮T細胞之至少一種正常TCR效應子功能,例如,細胞溶解活性或包括細胞因子分泌之輔助活性。TCR信號傳導結構域可為全長之天然細胞內信號轉導結構域,或為其足以轉導TCR效應子功能信號之片段。
可用於本文提供之CAR之例示性胞內信號傳導結構域包括T細胞受體(TCR)及共受體之細胞質序列,以及此等序列之任何衍生物或變異體及具有相同功能能力之任何合成序列,上述共受體在抗原受體參與後共同啟動信號轉導。
以刺激方式起作用之TCR信號傳導結構域可包含信號傳導基序,上述信號傳導基序被稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。可用於本文提供之CAR中之包含TCR信號傳導結構域之ITAM之實例包括源於TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之ITAM。在某些實施方式中,TCR信號傳導結構域包含源於CD3-ζ之細胞質信號傳導序列。
4. 共刺激信號傳導區
本文提供之CAR之T細胞活化結構域進一步包含共刺激信號傳導區。共刺激信號傳導區以抗原非依賴性方式起作用以介導TCR激活,且可源於淋巴細胞對抗原之有效應答所需之共刺激分子。例示性之共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體等。
5. 雙特異性 CAR
在某些實施方式中,CAR為雙特異性的。在某些實施方式中,本文提供之雙特異性CAR與CLDN18.2之第一及第二抗原決定基特異性結合,或能夠與CLDN18.2及第二抗原特異性結合。
在一個實施方式中,上述CAR與活細胞表面上存在之CLDN18.2之天然抗原決定基結合。
6. 編碼 CAR 之聚核苷酸序列
在一個態樣中,本發明進一步提供了編碼本文提供之CAR之核酸序列,其包含編碼本文提供之CAR之抗原結合結構域之第一聚核苷酸序列,及可選地編碼本文提供之跨膜結構域及T細胞活化結構域之第二聚核苷酸序列。在一些實施方式中,編碼抗原結合結構域之序列與編碼跨膜結構域及T細胞活化結構域之序列可操作地連接。可使用此項技術中已知的重組方法來獲得編碼所需分子之核酸序列,例如,藉由自表現該基因之細胞中篩選文庫,藉由自已知包括該基因之載體中獲得該基因,或者藉由使用標準技術直接自含有該基因之細胞及組織中分離出來。替代地,目標基因可藉由合成製備,而非選殖。
在一個態樣中,本發明提供了包含編碼本文提供之CAR之核酸序列之載體。在一些實施方式中,載體為表現可直接轉導至細胞中之如本發明之CAR之逆轉錄病毒及慢病毒載體構建體,或者為可直接轉染至細胞中之RNA構建體。
在一個態樣中,本發明提供了分離之細胞,其包含編碼本文提供之CAR及/或表現本文提供之CAR之核酸序列。
在某些實施方案中,包含編碼CAR或表現CAR之核酸之細胞選自T細胞、NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)及調節性T細胞。在一個實施方式中,當CAR之抗原結合結構域與其相應抗原結合時,包含編碼CAR或表現CAR之核酸之細胞表現出抗腫瘤免疫。儘管可使用異源細胞或同種異體細胞,然而細胞毒性淋巴細胞較佳為自體細胞。如本文所使用,「自體」係指源於同一個體之任何材料,之後將其重新引入該個體。
在一個態樣中,本發明進一步提供了用於在受試者中對表現CLDN18.2之細胞或組織刺激T細胞介導之免疫應答之方法,上述方法包括向受試者施用有效量之經遺傳修飾以表現本文提供之CAR之細胞。
在一個態樣中,本發明進一步提供了用於治療患有與CLDN18.2之表現升高相關之疾病、病症或病況之哺乳動物之方法,其包括向上述哺乳動物施用有效量之經遺傳修飾以表現本文提供之CAR之細胞,從而治療哺乳動物。在某些實施方式中,上述細胞為自體T細胞。在某些實施方式中,已經診斷出哺乳動物患有與CLDN18.2表現升高有關之疾病、病症或病況。
聚核苷酸及重組方法
本發明提供了編碼抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段之分離之聚核苷酸。本文所使用之術語「核酸」或「聚核苷酸」係指單鏈或雙鏈形式之脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有說明,否則特定的聚核苷酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指出之序列。特定來說,簡併之密碼子取代可藉由生成序列來實現,其中一或多個選定(或全部)密碼子之第三位被混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代(參見Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
使用習知程序(例如,藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)容易地分離及定序編碼單株抗體之DNA。編碼DNA亦可藉由合成方法來獲得。
本發明提供了包含本文提供之分離之聚核苷酸之載體(例如,表現載體)。在某些實施方式中,本文提供之表現載體包含編碼本文提供之抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸,與該聚核苷酸序列可操作連接之至少一種啟動子(例如,SV40、CMV、EF-1α),以及至少一種選擇標記。載體之實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳腺病毒(例如,SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質粒,例如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-Gseu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可將包含編碼抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸序列之載體導入宿主細胞以進行選殖或基因表現。用於在本文之載體中選殖或表現DNA之合適的宿主細胞為上述之原核生物、酵母或更高等之真核細胞。用於該目的之合適的原核生物包括真細菌,例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物,例如腸桿菌科、例如大腸桿菌、腸桿菌、歐文氏菌、克雷伯菌、變形桿菌、沙門氏菌(例如,鼠傷寒沙門氏菌)、沙雷氏菌(例如,黏質沙雷氏菌)及志賀氏菌,以及枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌等芽孢桿菌,銅綠假單胞菌等假單胞菌及鏈黴菌。
除原核生物外,真核微生物如絲狀真菌或酵母菌亦為抗CLDN18.2抗體編碼載體之合適選殖或表現宿主。釀酒酵母或普通之麵包酵母為低等真核宿主微生物中最常用的。然而,許多其他屬、種及菌株在本文中通常為可獲得的及有用的,例如粟酒裂殖酵母;克魯維酵母宿主例如乳酸克氏菌(K. lactis
)、脆弱之克氏菌(K. fragilis
)(ATCC 12,424)、保加利亞克氏菌(ATCC 16,045)、柳條克氏菌(ATCC 24,178)、沃氏克氏菌(ATCC 56,500)、果蠅克氏菌(ATCC 36,906)、耐高溫克氏菌及馬克斯克氏菌、耶氏酵母(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(EP 183,070);念珠菌;里氏木黴(EP 244,234);克氏神經孢菌;許旺酵母(Schwanniomyces
),例如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis
);及絲狀真菌,例如神經孢菌、青黴、彎頸黴(Tolypocladium
)及麴黴宿主,例如構巢麴黴及黑麴黴。
用於表現本文提供之糖基化抗體或抗原片段之合適的宿主細胞源於多細胞生物,例如無脊椎動物細胞,例如植物及昆蟲細胞。已鑑定出來自宿主之許多桿狀病毒株及變異體以及相應的允許之昆蟲宿主細胞,此等宿主如Spodoptera frugiperda
(毛蟲)、Aedes aegypti
(蚊)、Aedes albopictus
(蚊)、Drosophila melanogaster
(果蠅)及家蠶。用於轉染之多種病毒株為可公開獲得之,例如,苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica
NPV)之L-1變異體及家蠶核多角體病毒(Bombyx mori
NPV)之Bm-5株;且根據本發明,此類病毒可用作本文之病毒,尤其為用於轉染貪食斜紋夜蛾(Spodoptera frugiperda
)細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
然而,對脊椎動物細胞之興趣最大,且在培養(組織培養)中繁殖脊椎動物細胞已成為習知程序。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40 (COS-7、ATCC CRL 1651)轉化之猴腎CV1細胞株;人胚胎腎細胞株(在懸浮培養中亞選殖生長之293或293細胞,Graham等人,J. Gen Virol.
36:59 (1977));嬰兒倉鼠腎細胞(BHK、ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4216 (1980));小鼠睾丸支持細胞(TM4,Mather, Biol. Reprod.
23:243-251 (1980));猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);水牛大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人肝細胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51); TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci.
383:44-68 (1982));MRC 5細胞;FS4細胞;及人類肝癌細胞株(Hep G2)。在一些較佳的實施方式中,宿主細胞為哺乳動物培養之細胞株,例如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。
用於製備抗CLDN18.2抗體之上述表現或選殖載體轉化宿主細胞,且在經適當修飾之習知營養培養基中培養,以誘導啟動子,選擇轉化子或擴增編碼所需序列之基因。在另一個實施方式中,可藉由此項技術中已知的同源重組法製備抗體。
用於製備本文提供之抗體或抗原結合片段之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham's F10 (Sigma),基本必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及Dulbecco修飾之Eagle's培養基(DMEM)(Sigma)等市售培養基均適於培養宿主細胞。此外,Ham等人,Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等人, Anal. Biochem. 102:255 (1980)、美國專利號4,767,704; 4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;或美國專利Re. 30,985中描述之任何培養基可用作宿主細胞之培養基。此等培養基中之任何一種均可根據需要補充激素及/或其他生長因子(例如,胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如,氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(例如,HEPES)、核苷酸(例如,腺苷及胸苷)、抗生素(例如,GENTAMYCINTM
藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍之終濃度存在之無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可以熟習此項技術者已知的適當濃度包括任何其他必需之補充劑。培養條件(例如,溫度、pH等),為先前選擇用於表現之宿主細胞所使用之培養條件,且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
當使用重組技術時,抗體可在細胞內、周質空間中產生,或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生,則第一步,例如藉由離心或超濾除去宿主細胞或溶解片段之顆粒碎片。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述了分離分泌至大腸桿菌周質空間之抗體之方法。簡而言之,將細胞糊狀物在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA、及苯甲基磺醯氟(PMSF)之存在下解凍約30分鐘。可藉由離心移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情況下,通常首先使用可商購之蛋白質濃縮過濾器(例如,Amicon或Millipore Pellicon超濾單元),濃縮來自此類表現系統之上清液。蛋白酶抑制劑(例如,PMSF)可包括在上述任何步驟中,以抑制蛋白水解作用,且抗生素可包含在內,以防止不定污染物之生長。
由細胞製備之抗CLDN18.2抗體及其抗原結合片段可使用例如,羥基磷灰石層析、凝膠電泳、滲析、DEAE-纖維素離子交換層析、硫酸銨沈澱、鹽析及親和層析進行純化,其中親和層析為較佳的純化技術。
在某些實施方式中,固定在固相上之蛋白A用於抗體及其抗原結合片段之免疫親和純化。蛋白A作為親和配位體之適用性取決於抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc結構域之種屬及同種型。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白質G被推薦用於所有小鼠同種型及人類γ3 (Guss等人, EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。親和配位體附著之基質通常為瓊脂糖,但亦可使用其他基質。機械穩定之基質(例如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)比瓊脂糖具有更快之流速及更短之處理時間。若抗體包含CH3結構域,則Bakerbond ABX.TM.樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)可用於純化。根據要回收之抗體,亦可使用其他蛋白質純化技術,例如在離子交換柱上分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、肝素層析、陰離子或陽離子交換樹脂上之SEPHAROSETM
層析(例如,聚天冬胺酸柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後,可使用在約2.5-4.5之pH下之溶離緩衝液,對包含感興趣之抗體及污染物之混合物進行低pH疏水相互作用層析,較佳在低鹽濃度下(例如,約0-0.25 M之鹽)進行。
組合物
另一態樣,本發明提供了包含抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之組合物。
在另一個態樣中,本發明提供了包含非岩藻糖基化之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之組合物。在某些實施方式中,根據EU編號系統,上述組合物中之上述抗CLDN18.2抗體在Asn297處具有寡糖(糖)總量60%或更少(例如,少於55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)之量之岩藻糖。相對於與Asn 297相連之所有糖結構之總及(例如複雜、雜合及高甘露糖結構),可藉由計算Asn297處之糖鏈中岩藻糖之平均含量來確定連接至Fc區CH2結構域之岩藻糖之含量。岩藻糖之含量可藉由此項技術中已知的方法(例如,藉由質譜法)來量測。在一個例示性之實施方式中,用N-糖苷酶(PNGaseF)處理抗體以水解來自抗體之N-糖鏈寡糖。水解之寡糖用螢光標記RapiFluor-MS試劑標記,且藉由超高效液相親水相互作用層析法進行分離,且藉由螢光偵測器(UPLC-HILIC-FLR)進行偵測。面積歸一化法用於計算各種低聚糖之比例。在另一個說明性實施例中,如在WO 2008/077546中上述,岩藻糖之含量可藉由MALDI-TOF質譜法量測。
藥物組合物
本發明進一步提供了藥物組合物,其包含抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段(可選地非岩藻糖基化的)及一或多種藥學上可接受之載體。
用於本文揭示之藥物組合物中之藥學上可接受之載體可包括例如藥學上可接受之液體、凝膠或固體載體、水性介質、非水介質、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、掩蔽劑或螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒輔助物質、此項技術中已知的其他組分或其各種組合。
合適的組分可包括例如抗氧化劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑(例如,糖及環糊精)。合適的抗氧化劑可包括例如甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羥基黃苯酚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本文所揭示的,在包含如本文所提供之抗體或抗原結合片段及綴合物之組合物中加入一或多種抗氧化劑(例如,蛋胺酸),減少了抗體或抗原結合片段之氧化。此類氧化之減少防止或減少了結合親和力之損失,從而改良了抗體之穩定性且使保質期最大化。因此,在某些實施方式中,提供了包含本文揭示之一或多種抗體或抗原結合片段及一或多種抗氧化劑(例如,蛋胺酸)之組合物。本文進一步提供了方法,上述方法藉由將抗體或抗原結合片段與一或多種抗氧化劑(例如,蛋胺酸)混合來防止本文所提供之抗體或抗原結合片段之氧化,延長其貨架壽命及/或改良其功效。
為了進一步說明,藥學上可接受之載體可包括例如水性介質(例如,氯化鈉注射劑、林格氏注射劑、等滲右旋糖注射劑、無菌水注射劑或右旋糖及乳酸林格氏注射劑)、非水介質(例如,植物來源之非揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抑菌或抑真菌濃度下之抗微生物劑、等滲劑(例如,氯化鈉或右旋糖)、緩衝劑(例如,磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑)、抗氧化劑(例如,硫酸氫鈉)、局部麻醉劑(例如鹽酸普魯卡因)、懸浮劑及分散劑(例如,羧甲基纖維素鈉,羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮)、乳化劑(例如,聚山梨酯80 (TWEEN-80))、掩蔽劑或螯合劑(例如,EDTA (乙二胺四乙酸)或EGTA (乙二醇四乙酸)、乙醇,聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。可用作載體之抗微生物劑可添加至在多劑量容器中之藥物組合物中,上述多劑量容器包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨及苄索氯銨。合適的賦形劑可包括例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。合適的無毒輔助物質可包括,例如,潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑或諸如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精之試劑。
藥物組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊劑、片劑、緩釋製劑或粉劑。口服製劑可包括標準載體,例如藥用級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施方式中,藥物組合物被調配成可注射之組合物。可以任何習知形式製備可注射藥物組合物,例如液體溶液、懸浮液、乳劑或適於產生液體溶液、懸浮液或乳劑之固體形式。注射製劑可包括準備用於注射之無菌及/或無熱源溶液、無菌乾燥可溶性產品,如準備在使用前與溶劑混合之凍乾粉,包括皮下注射用片劑,準備用於注射之無菌懸浮液、準備在使用前與溶媒結合之無菌乾燥之不溶性產品,以及無菌及/或無熱源乳液。溶液可以為水性或非水性的。
在某些實施方式中,單位劑量腸胃外製劑包裝在安瓿、小瓶或帶針注射器中。如此項技術中已知及實踐的,用於腸胃外施用之所有製劑應為無菌的且無熱源的。
在某些實施方式中,藉由將如本文揭示之抗體或抗原結合片段溶解在合適的溶劑中來製備無菌之凍乾粉。溶劑可包含賦形劑,其可改良由粉末製備之粉末或重構溶液之穩定性或其他藥理學成分。可使用之賦形劑包括但不限於水、右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適的試劑。在一個實施方式中,溶劑可含有約中性pH下之緩衝劑,例如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀、或熟習此項技術者已知的其他此類緩衝劑。隨後對溶液進行無菌過濾,接著在熟習此項技術者已知的標準條件下凍乾,此提供了理想之製劑。在一個實施方式中,將所得溶液分配至小瓶中以凍乾。每個小瓶可包含單劑量或多劑量之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段或其組合物。可接受超出一個劑量或一組劑量所需量之少量過量(例如,約10%)灌裝樣品瓶,以利於準確抽取樣品及準確給藥。凍乾粉末可在適當之條件下,例如在約4℃至室溫下儲存。
用注射用水重構凍乾粉提供了用於腸胃外給藥之製劑。在一個實施方式中,為了重構,將無菌及/或無熱源水或其他液體狀合適載體添加至凍乾粉末中。精確之劑量取決於所選擇之治療方法,且可憑經驗確定。
使用方法
本發明亦提供了治療方法,其包括:向有需要之受試者施用治療有效量之本文提供之抗體或抗原結合片段(可選地非岩藻糖基化的)及/或本文提供之藥物組合物,從而治療或預防CLDN18.2相關疾病或病況。
在另一個態樣中,本文提供了治療將自CLDN18.2活性調節中受益之受試者之疾病或病況之方法,上述方法包括向有需要之受試者施用治療有效量之本文提供之抗體或抗原結合片段(可選地非岩藻糖基化的)及/或本文提供之藥物組合物。在某些實施方式中,上述疾病或病況為CLDN18.2相關之疾病或病況。在一些實施方案中,CLDN18.2相關之疾病或病症為癌症。
在某些實施方式中,上述癌症選自胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、胃癌、陰道癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤及腺癌。
癌症之實例包括但不限於非小細胞肺癌(鱗狀/非鱗狀)、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底性乳腺癌、導管癌、及小葉乳腺癌)、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胸腺癌、黑素瘤、骨髓瘤、黴菌性真菌病、默克爾細胞癌、肝細胞癌(HCC)、纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤及其他肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴樣惡性腫瘤、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺乳頭狀癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、延髓喉癌、支氣管癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、威爾姆氏腫瘤、子宮頸癌、睾丸癌、精原細胞瘤、經典霍奇金淋巴瘤(CHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、T細胞/富含組織細胞之B細胞細胞淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病(acute myelocytic leukemia)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia)、慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia)(粒細胞性白血病)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia)、慢性淋巴細胞性白血病、真性紅細胞增多症、肥大細胞源性腫瘤、EBV-陽性及-陰性PTLD以及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、漿母細胞淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤、鼻咽癌、HHV8相關原發性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、華登斯特羅姆巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常症候群、毛細胞白血病及骨髓增生異常、原發性中樞神經系統淋巴瘤、脊髓軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質細胞瘤、血管瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及成視網膜細胞瘤。
在某些實施方式中,上述癌症為表現CLDN18.2之癌症。如本文所使用,「表現CLDN18.2之癌症」係指涉及表現CLDN18.2之癌細胞之任何癌症或腫瘤。
在某些實施方式中,上述受試者被鑑定為具有表現CLDN18.2之癌細胞。可藉由此項技術中已知的各種方法確定癌細胞上CLDN18.2之存在及/或表現量。可自受試者獲得含有或懷疑含有癌細胞之生物樣品。在一些實施方式中,生物樣品可源於癌細胞或癌組織或腫瘤浸潤之免疫細胞。在某些實施方式中,可進一步處理生物樣品以例如分離分析物,例如核酸或蛋白質。CLDN18.2之存在及/或表現量可藉由例如定量螢光細胞計數法、免疫組織化學(IHC)、或基於核酸之方法來確定。例如,可將來自受試者之生物樣品暴露於抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其結合且偵測表現之CLDN18.2蛋白。替代地,亦可使用諸如qPCR、逆轉錄酶PCR、微陣列、SAGE、FISH等方法在核酸表現量上偵測CLDN18.2。
在某些實施方式中,藉由IHC確定或量測生物樣品或癌細胞中CLDN18.2之表現。在某些實施方式中,人CLDN18.2蛋白在受試者之癌細胞上之表現量可根據本文提供之實施例15之第6節及第7節中描述之方法確定。
在某些實施方式中,上述受試者被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞、或CLDN18.2低表現癌細胞。在某些實施方式中,上述CLDN18.2高表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以IHC中至少40% (例如,至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、40-90%、50-90%、60-90%、70-90%、80-90%、40-80%、40-70%、40-60%、40-50%、50-80%、50-70%、50-60%、60-80%、60-70%、或70-80%)之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;上述CLDN18.2中等表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30% (或至少35%)但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;上述CLDN18.2低表現癌細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30% (例如5%、10%、15%、20%、25%、5-25%、10-25%、15-25%、20-25%、5-20%、5-15%、5-10 %、10-20%、或10-15%)之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2。
表現CLDN18.2之癌症之實例包括但不限於胃癌、食道癌、胰臟癌、肺癌(例如非小細胞肺癌(NSCLC)及小細胞肺癌(SCLC))、卵巢癌、結腸癌、結直腸癌、胃腸道間質瘤(GIST)、胃腸道類癌、直腸癌、肛門癌、膽管癌、小腸癌、闌尾癌、前列腺癌、腎癌(例如,腎細胞癌)、肝癌、頭頸癌及膽囊癌及其轉移(例如,胃癌轉移(例如,克魯肯伯格腫瘤)、腹膜轉移及淋巴結轉移)。
在某些實施方式中,表現CLDN18.2之癌症可為腺癌,例如晚期腺癌。在某些實施方式中,上述癌症選自胃、食道、胰管、膽管、肺及卵巢之腺癌。在某些實施方式中,表現CLDN18.2之癌症包括胃癌、食道癌(尤其為下食道癌)、食道-胃交界癌及胃食管癌。
不希望受任何理論束縛,據信CLDN18之分子及功能特性使其成為基於抗體之癌症治療之高度感興趣之靶標。此等包括(i)大多數毒性相關之正常組織中均不存在CLDN18,(ii)CLDN18.2變異體僅在非必需之細胞群表現(如分化之胃細胞,可由胃之靶標為陰性之幹細胞補充),(iii)正常細胞與腫瘤細胞之間潛在的糖基化差異,以及(iv)存在不同之構象拓樸。
已發現CLDN18蛋白之分子量在腫瘤及鄰近之正常組織之間為不同的。在健康組織中觀測到較高分子量之CLDN18蛋白,可藉由用去糖基化化合物PNGase F處理正常組織溶解物將其降低至與在腫瘤中觀測到之相同分子量。此表明與其正常組織相比,CLDN18在腫瘤中之N-糖基化程度較低。典型之N-糖基化基序在CLDN18分子之環D3結構域內之胺基酸殘基116中。分子量差異及推斷之結構差異可能代表用於抗體結合之抗原決定基改變。
此外,CLDN18作為緊密連接蛋白亦可能有助於形成良好之治療窗口。由於腫瘤細胞表現CLDN,但通常不像正常上皮組織一般藉由CLDN之同型及異型締合形成典型之緊密連接,因此其可能具有相當數量之游離CLDN,其適用於細胞外抗體結合及免疫療法。健康上皮細胞中CLDN之結合抗原決定基有可能在緊密連接中被屏蔽,以阻止抗體結合。
本文提供之抗體或抗原結合片段之治療有效量將取決於此項技術中已知的各種因素,例如體重、年齡、既往病史、當前用藥、受試者之健康狀況以及潛在之交叉反應、過敏、敏感性及不良副作用,以及給藥途徑及疾病發展程度。如此等及其他情況或要求所示,一般熟習此項技術者(例如醫師或獸醫)可按比例減少或增加劑量。
在某些實施方式中,本文提供之抗體或抗原結合片段可以約0.01 mg/kg至約100 mg/kg之治療有效劑量施用。在某些實施方案中,施用劑量可在治療過程中改變。在某些實施方式中,取決於受試者之反應,給藥劑量可在治療過程中變化。
可調整劑量方案以提供最佳之期望反應(例如,治療反應)。例如,可施用單一劑量,或者可隨時間施用數個分開之劑量。
本文揭示之抗體及抗原結合片段可藉由此項技術中已知的任何途徑施用,例如腸胃外(例如皮下、腹腔內、靜脈內,包括靜脈內輸注、肌肉內或皮內注射)或非腸胃外(例如,口服、鼻內、眼內、舌下、直腸或局部)途徑。
在一些實施方式中,本文揭示之抗體或抗原結合片段可單獨施用或與一或多種其他治療手段或試劑組合施用。例如,本文揭示之抗體或抗原結合片段可與第二治療劑(例如,化療劑、抗癌藥、放射治療、免疫治療、抗血管生成劑、靶向治療、細胞治療、基因治療、激素治療、姑息治療),用於癌症治療之手術(例如,腫瘤切除術),或一或多種止吐藥或其他用於化療引起之併發症之治療聯合施用。
如本文所使用,術語「免疫療法」係指刺激免疫系統對抗疾病如癌症或以一般方式增強免疫系統之一種類型。免疫療法包括被動免疫療法,即藉由遞送具有確定之腫瘤免疫反應性之藥物(例如,效應細胞)來進行被動免疫療法,上述藥物可直接或間接介導抗腫瘤作用,而不必依賴完整之宿主免疫系統(例如,抗體療法或CAR-T細胞療法)。免疫療法可進一步包括主動免疫療法,其中治療依賴於內源宿主免疫系統之體內刺激,以藉由施用免疫應答調節劑來對抗患病細胞。
免疫療法之實例包括但不限於檢查點調節劑、過繼性細胞轉移、細胞因子、溶瘤病毒及治療性疫苗。
檢查點調節劑可干擾癌細胞避免免疫系統攻擊之能力,且幫助免疫系統對腫瘤做出更強烈之應答。免疫檢查點分子可介導共刺激信號以增強免疫應答,或可介導共抑制信號以抑制免疫應答。檢查點調節劑之實例包括但不限於PD-1、PD-L1、PD-L2、CLTA-4、TIM-3、LAG3、A2AR、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD122、ICAM-1、IDO、NKG2C、SLAMF7、SIGLEC7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、ICOS、4-1BB、GITR、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-15、CD3、CD16及CD83之調節劑。
過繼性細胞轉移,其為一種試圖增強T細胞抵抗癌症之天然能力之治療方法。在此類治療中,自患者體內獲取T細胞,且在體外擴增及激活。在某些實施方式中,T細胞在體外經修飾成CAR-T細胞。將對癌症最具活性之T細胞或CAR-T細胞在體外大量培養2至8週。在此期間,患者將接受諸如化療及放射療法之治療,以降低人體之免疫力。經此等治療後,將體外培養之T細胞或CAR-T細胞輸還給患者。在某些實施方式中,免疫療法為CAR-T療法。
細胞因子療法亦可用於增強向免疫系統之腫瘤抗原提呈。用於治療癌症之兩種主要細胞因子為干擾素及白介素。細胞因子療法之實例包括但不限於干擾素(例如,干擾素-α、干擾素-β、及干擾素-γ)、集落刺激因子(例如,巨噬細胞CSF、粒細胞巨噬細胞CSF、及粒細胞CSF)、胰島素生長因子(IGF-1)、血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、白介素(例如,IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11及IL-12)、腫瘤壞死因子(例如,TNF-α及TNF-β)、或其任意組合。
溶瘤病毒為可殺死癌細胞之基因修飾病毒。溶瘤病毒可特異性感染腫瘤細胞,從而導致腫瘤細胞溶解,隨後釋放大量腫瘤抗原,從而觸發免疫系統靶向且消除具有此類腫瘤抗原之癌細胞。溶瘤病毒之實例包括但不限於他莫替丁拉赫帕氏菌(talimogene laherparepvec)。
治療性疫苗藉由增強免疫系統對癌細胞之應答來抵抗癌症。治療性疫苗可包含非致病性微生物(例如,牛分枝桿菌芽孢桿菌卡介特-卡倫菌(Mycobacterium bovis
Bacillus Calmette-Guérin,BCG)),靶向腫瘤細胞之基因修飾病毒或一或多種免疫原性成分。例如,BCG可藉由導管直接插入膀胱,且可引起針對膀胱癌細胞之免疫應答。
抗血管生成劑可阻斷支持腫瘤生長之血管之生長。一些抗血管生成劑靶向VEGF或其受體VEGFR。抗血管生成劑之實例包括但不限於阿昔替尼、貝伐單抗、卡博替尼、依維莫司、來那度胺、甲磺酸來那替尼、帕唑帕尼、拉莫昔單抗、雷戈拉非尼、索拉非尼、舒尼替尼、沙利度胺、凡德他尼及齊夫-阿非貝西普。
「靶向療法」為一種作用於與癌症相關之特定分子之療法,例如存在於癌細胞中但不存在於正常細胞中或在癌細胞中含量更高之特定蛋白質,或癌症微環境中有助於癌症生長及存活之靶分子。靶向療法將治療劑靶向腫瘤,從而使正常組織免受治療劑之影響。
靶向療法可靶向例如酪胺酸激酶受體及核受體。此類受體之實例包括erbB1 (EGFR或HER1)、erbB2 (HER2)、erbB3、erbB4、FGFR,源於血小板之生長因子受體(PDGFR)及胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、雌激素受體(ER)、核受體(NR)及PR。
靶向療法可靶向酪胺酸激酶或核受體信號級聯反應中之分子,例如Erk及PI3K/Akt、AP-2α,AP-2β,AP-2γ、促分裂原激活之蛋白激酶(MAPK)、PTEN、p53、p19ARF、Rb、Apaf-1、CD-95/Fas、TRAIL-R1/R2、Caspase-8、Forkhead、Box 03A、MDM2、IAP、NF-kB、Myc、P13K、Ras、FLIP、調蛋白(HRG)(亦稱為gp30)、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bak、Bad、Bok、Bik、Blk、Hrk、BNIP3、BimL、Bid及EGL-1。
靶向療法亦可靶向與腫瘤相關之配位體,例如雌激素(estrogen)、雌二醇(E2)、孕酮、雌激素(oestrogen)、雄激素、糖皮質激素、催乳激素、甲狀腺激素、胰島素、P70 S6激酶蛋白(PS6)、存活蛋白、成纖維細胞生長因子(FGF)、EGF、Neu分化因子(NDF)、轉化生長因子α (TGF-α)、IL-1A、TGF-β、IGF-1、IGF-II、IGFBP、IGFBP蛋白酶及IL-10。
在此等實施方式中之某些實施方式中,與一或多種另外之治療劑組合施用之本文揭示之抗體或抗原結合片段可與一或多種另外之治療劑同時施用,且在此等實施方式之某些實施方式中,抗體或抗原結合片段及另外之治療劑可作為相同藥物組合物之一部分施用。然而,與另一種治療劑「組合」施用之抗體或抗原結合片段不必與該藥劑同時或以相同之組合物施用。即使抗體或抗原結合片段及第二藥劑為藉由不同途徑施用,然而在另一種藥劑之前或之後施用之抗體或抗原結合片段被認為係本文所用之片語與該藥劑「組合」施用。在可能的情況下,可根據另外之治療劑產品資訊表中列出之時間表,或根據Physicians's Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 第57版; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版(2002年11月))或此項技術中公知的方案,施用與本文揭示之抗體或抗原結合片段組合施用之另外之治療劑。
本發明進一步提供了使用抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段之方法。在一些實施方式中,本發明提供了體內或體外抑制表現CLDN18.2之細胞生長之方法,上述方法包括:使表現CLDN18.2之細胞與本文提供之抗體或其抗原結合片段接觸。在一些實施方式中,本發明提供了在表現CLDN18.2之細胞中調節CLDN18.2活性之方法,上述方法包括將表現CLDN18.2之細胞暴露於本文提供之抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中,本發明提供了偵測源於受試者之樣品中CLDN18.2之存在或含量之方法,上述方法包括使樣品與抗體或其抗原結合片段接觸,且確定樣本中之CLDN18.2之存在或含量。在某些實施方式中,生物樣品包含癌細胞。
在一些實施方式中,本發明提供了在受試者中診斷與CLDN18.2相關之疾病或病況之方法,上述方法包括:a)將從上述受試者獲得之樣品與本文提供之抗體或其抗原結合片段接觸;b)測定在上述樣品中CLDN18.2之存在或含量;以及c)將上述CLDN18.2之存在或含量與上述受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之存在或狀態相關聯。在某些實施方式中,生物樣品包含癌細胞。在一些實施方式中,癌細胞中CLDN18.2之表現量藉由IHC測定(例如,根據本文提供之實施例15之第6節及第7節中描述之方法)。在一些實施方式中,受試者被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞、或CLDN18.2低表現癌細胞。
在一些實施方式中,該方法進一步包括向受試者施用治療有效量之本文提供之抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中,受試者具有CLDN18.2中等表現癌細胞、或CLDN18.2之低表現癌細胞。
在一些實施方式中,本發明提供了套組,上述套組包括本文提供之抗體或其抗原結合片段,其可選地與可偵測部分綴合。該套組可用於偵測生物樣品中CLDN18.2之存在或含量,或可用於本文提供之診斷方法。
在一些實施方式中,本發明提供了套組,上述套組包括本文提供之抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。該套組可用於治療、預防及/或改良CLDN18.2相關疾病。
在一些實施方式中,本發明亦提供了本文提供之抗體或其抗原結合片段在製備用於治療受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之藥物中之用途。
實施例
雖然參考特定實施方式(其中一些為較佳實施方式)已特別地示出及描述了本發明,然而熟習此項技術者應當理解,在不脫離在本發明之主旨及範圍之條件下,可在形式及細節上做多種改變。
實施例 1 : CLDN18.2 或 CLDN18.1 表現細胞株之製備 1. HEK293- 人 CLDN18.2 、 HEK293- 人 CLDN18.1 及 HEK293- 小鼠 CLDN18.2 細胞株之生成
由邁博斯生物醫藥(蘇州)有限公司構建HEK293-人CLDN18.2細胞(以下稱為HEK293-CLDN18.2)及HEK293-小鼠CLDN18.2細胞(以下稱為HEK293-mCLDN18.2)。簡而言之,用pcDNA3.1/hCLDN18.2或pcDNA3.1/mCLDN18.2質粒轉染HEK293細胞(上海生物科學研究院,目錄號GNhu43),且用G418選擇以獲得穩定表現之細胞株HEK293-CLDN18.2或HEK293-mCLDN18.2。使用可與人及小鼠CLDN18.2結合之IMAB362抗體偵測了hCLDN18.2或mCLDN18.2之表現量。IMAB362根據US2009169547A1中揭示之序列進行表現。選擇具有最高信號之單細胞選殖且擴增以用於細胞儲存。
IMAB362之重鏈可變區(SEQ ID NO:72)
IMAB362之輕鏈可變區(SEQ ID NO:73)
亦如上所述構建HEK293-人CLDN18.1細胞(以下稱為HEK293-CLDN18.1)。用識別CLDN18.1及CLDN18.2之抗-CLDN18抗體(Abcam,目錄號ab222513)偵測CLDN18.1之表現。
2. CHO-CLDN18.2 瞬時表現細胞之產生
按照如下構建CHO-CLDN18.2表現細胞:用不含選擇試劑之pcDNA3.1/CLDN18.2瞬時轉染CHO細胞。使用Mem-PERTM
Plus膜蛋白提取套組提取細胞膜蛋白,且將細胞膜蛋白用於動物免疫增強。
3. MKN45-CLDN18.2 瞬時表現細胞之產生
MKN45-CLDN18.2細胞由邁博斯生物醫藥(蘇州)有限公司構建。簡而言之,用pcDNA3.1/CLDN18.2質粒轉染MKN45細胞(國家細胞株資源目錄,目錄號3111C0001CCC000229),且用G418選擇以獲得穩定表現之細胞株MKN45-CLDN18.2。採用FACS方法藉由IMAB362抗體偵測CLDN18.2之表現量。選擇具有最高、中等及低信號之單株細胞,且將其擴增以用於細胞儲存。
以上所述細胞株用於以下之實驗中。
實施例 2 :抗體之產生 1. 免疫接種
製備DNA及細胞免疫原以進行免疫接種。將6-8週齡之不同品系之小鼠分為兩組。一組之初始免疫及增強免疫為藉由靜脈注射100 µg/小鼠pVAC2-mcs/CLDN18.2質粒及100 µg/小鼠CpG進行的。另一組為藉由肌肉注射相同之DNA及CpG進行的。兩組均在第1天及第10天注射,且在第18天藉由FACS結合HEK293-CLDN18.2細胞偵測抗體滴度。將100 µl/孔稀釋之小鼠血清添加至含有HEK293-CLDN18.2或胃癌NUGC4細胞(JCRB,目錄號JCRBB0834)之孔板中,接著在4℃孵育30分鐘。用緩衝液清洗後,加入100 μl/孔之山羊抗-mIgG-FITC (1:500稀釋),在4℃下再孵育30分鐘。隨後用FACS清洗緩衝液清洗,藉由流式細胞術分析細胞。選擇具有更高結合信號及滴度之小鼠用於以下融合步驟。
2. 融合
在融合前之四天,每隻小鼠腹膜內注射5×107
HEK293-CLDN18.2細胞。在融合當天,無菌移除脾臟,接著將其加工成單一之細胞懸液。將活的對數期骨髓瘤細胞(SP2/0)與鼠脾細胞在融合培養基中以1:1之比例混合,接著電融合1分鐘。將細胞重懸且在37℃、5% CO2
之培養箱中,以200 µl/孔在96孔培養板中進行培養。培養7天後,將生長培養基更換為新鮮的生長培養基,接著在2-3天後篩選雜交瘤上清液。
實施例 3 :抗體篩選 1. 藉由 FACS 試驗篩選人 CLDN18.2 陽性結合物
將表現CLDN18.2之HEK293-CLDN18.2對數期細胞以每孔105
/100 μl之密度重懸於PBS中。使用FACS清洗緩衝液(PBS + 2%FBS)洗滌細胞3次後,將100 μl/孔雜交瘤細胞上清液添加至每個孔中,在4℃下孵育30分鐘。再次,使用FACS清洗緩衝液洗滌細胞3次,接著與100 μl/孔之山羊抗-mIgG-FITC (1:400稀釋)在4℃下再孵育30分鐘。使用FACS清洗緩衝液進行3次最終洗滌後,藉由流式細胞術分析細胞。
2. 藉由 FACS 試驗篩選人 CLDN18.1 陰性結合物
將表現CLDN18.1之HEK293-CLDN18.1對數期細胞以每孔105
/100 μl之密度重懸於PBS中。使用FACS清洗緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌細胞3次後,將100 μl/孔雜交瘤細胞上清液添加至每個孔中,在4℃下孵育30分鐘。再次,使用FACS清洗緩衝液洗滌細胞3次,接著與100 μl/孔之山羊抗-mIgG-FITC (1:400稀釋)在4℃下再孵育30分鐘。使用FACS清洗緩衝液進行3次最終洗滌後,藉由流式細胞術分析細胞。
選擇具有高CLDN18.2結合信號但沒有CLDN18.1結合信號之選殖用於隨後之亞選殖以產生單株,包括7C12、11F12、12E9、26G6、59A9、18B10及12C12。
實施例 4 :陽性雜交瘤選殖之亞選殖及小規模抗體製備 1. 陽性雜交瘤選殖之亞選殖
選擇來自FACS陽性雜交瘤孔之具有所需結合特徵之細胞在96孔板中進行有限稀釋。使此等細胞生長7天。當達到足夠之細胞量時,收集每個孔之上清液,且使用細胞結合試驗進行重新篩選(參見實施例3)。
從每個96孔板中,將具有最高細胞結合活性之選殖擴增到每孔含200μl雜交瘤生長培養基之96孔板中進行第二輪有限稀釋。7天後,藉由FACS試驗分析來自96孔板之細胞之上清液。亞選殖進行了2次以上,直到超過90/96孔顯示出陽性結合信號。鑑定具有最高結合活性之選殖,並進一步擴增及培養以產生抗體。使用標準方法確定同種型。
2. 小規模抗體製備
接種雜交瘤細胞並培養14天。使用蛋白質A層析柱(蛋白質A高效能(Bio-Rad))藉由親合層析法自雜交瘤細胞培養物中純化CLDN18.2單株抗體(mAb)。
純化後,使用10,000 MWCO膜(Pierce Slide-A-Lyzer或透析管)藉由透析在PBS中調配CLDN18.2 mAb,接著進行過濾步驟。
實施例 5 :純化之 CLDN18.2 雜交瘤抗體之細胞結合分析
將對數期之HEK293-CLDN18.2及NUGC4細胞在PBS中重懸。使用FACS清洗緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌細胞3次後,將100 μl/孔稀釋之400 nM至0.002 nM範圍之雜交瘤抗體加入每個孔中於4℃孵育30分鐘。再次,使用FACS清洗緩衝液洗滌細胞3次,接著與100 μl/孔之山羊抗-mIgG-FITC (1:400稀釋)在4℃下再孵育30分鐘。使用FACS洗滌緩衝液進行3次最終洗滌後,藉由流式細胞術分析細胞。
大多數雜交瘤抗體顯示出與HEK293-CLDN18.2細胞之高親和結合力,但與NUGC4細胞之結合力卻較低。結合差異可能係由於此兩種細胞株中CLDN18.2蛋白之不同表現密度,構象及/或糖基化狀態。有趣的是,7C12、11F12、59A9及18B10具有與HEK293-CLDN18.2及NUGC4細胞相當的結合親和力(圖1A-1D,表4)。選擇此等雜交瘤抗體用於基因選殖及嵌合抗體表現,以用於進一步之功能性ADCC/CDC表徵。表 4
在FACS 結合中獲得之CLDN18.2 特異性抗體之EC50 值(μg/ml) | |
雜交瘤抗體 | HEK293-CLDN18.2 細胞 |
7C12 | 1.08 |
11F12 | 0.82 |
12E9 | 0.52 |
26G6 | 0.76 |
18B10 | 0.81 |
59A9 | 0.51 |
實施例 6 :嵌合抗體之產生
藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增自候選雜交瘤細胞株中獲得小鼠抗人CLDN18.2抗體輕鏈及重鏈可變區之序列。經定序分析且確認後,將包括與人IgG kappa恆定區融合之輕鏈可變區(VL)序列及與人IgG1恆定區融合之重鏈可變區(VH)序列之上述可變區基因選殖至重組表現載體pcDNA3.1(+)中,用於抗體產生及純化。
使用具有來自重鏈載體及輕鏈載體之等量DNA之ExpiCHO轉染套組轉染ExpiCHO細胞。將轉染之細胞在搖瓶中以125 rpm之速度於8% CO2
及37℃之培養箱中進行培養。在第10天收集細胞培養物,且使用親和層析純化收集之抗體。使用SDS-PAGE及空間排阻層析(TSKgel G3000SWXL,TOSOH)分析所得抗體以確定純度水準。嵌合抗體命名為:7C12-C、11F12-C、12E9-C、26G6-C、59A9-C、18B10-C及12C12-C。
實施例 7 :純化之嵌合 CLDN18.2 抗體之表徵 1. 對 HEK293-CLDN18.2 細胞之結合及細胞毒性作用
按照實施例5上述之方法偵測嵌合抗體之細胞結合。
如圖2A所示,具有非常相似之CDR (僅2-3個胺基酸不同)之7C12-C、11F12-C及12E9-C以約0.6 μg/ml之EC50與HEK293-CLDN18.2細胞結合。26G6-C之EC50為1.1 μg/ml。59A9-C及18B10-C為後續產生的,因此分別對其進行測試。如圖2C所示,具有不同種系及CDR之59A9-C之EC50 (1.3 μg/ml)比18B10-C (1.0 μg/ml)稍高。
CDC (補體依賴之細胞毒性)為免疫保護之重要機制。因此,此處將CDC試驗用於評估抗體之生物效價。簡而言之,將對數期之HEK293-CLDN18.2細胞重懸於含10%FBS之RPMI1640中。將此等細胞以每孔8×103
/100 μl鋪板。使用含有20 mM HEPES及40%人血清之60% RPMI1640稀釋抗CLDN18.2嵌合抗體及對照抗體IMAB362,接著以10至0.0012 μg/ml之最終濃度,100 μl/孔,加入細胞板中。將板在37℃下孵育80分鐘。接著,使細胞培養板平衡至室溫,持續30分鐘。藉由酶標儀(Thermo VARIOSKAN FLASH 3001),在室溫下,用CellTiter-Glo發光細胞活力測定套組進行細胞活力分析。
如圖2B及2D所示,與IMAB362相比,所有6種CLDN18.2嵌合抗體均以較低之濃度誘導CDC效應。4種抗體(7C12-C、11F12-C、12E9-C及26G6-C)之效價比IMAB362提高了2倍以上。與IMAB362相比,59A9-C及18B10-C之效價提高了3倍以上。
2. 對 MKN45-CLDN18.2 細胞之結合及細胞毒性作用
MKN45為低分化胃腺癌,適合於評估體內抗腫瘤功效。然而,除非轉染,否則MKN45細胞不表現人類CLDN18.2。吾人發現在MKN45細胞上,人CLDN18.2之不同表現量賦予CLDN18.2抗體不同之敏感性。接著,選擇較高及中等CLDN18.2表現之MKN45細胞(見圖21)進行以下研究。
使用較高及中等CLDN18.2表現之MKN45細胞,如實施例5中所述,進行嵌合抗體之細胞結合測定。如圖3A(高)及3C(中)所示,18B10-C以比IMAB362顯著更高之親和力與較高及中等表現hCLDN18.2之細胞結合。在MKN45-CLDN18.2-高細胞中,18B10-C之效價比IMAB362提高了約2倍。在MKN45-CLDN18.2-中細胞中發現更為顯著之差異,18B10-C顯示EC50為0.96 μg/ml,而IMAB362未結合。
使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176細胞作為效應細胞及MKN45-CLDN18.2細胞作為靶細胞來評估ADCC活性。Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176細胞由邁博斯生物醫藥(蘇州)有限公司構建。簡而言之,用pGL4.30-luc/NFAT-RE/Hygro質粒轉染Jurkat細胞(上海生物科學研究所,目錄號SCSP-513),且用潮黴素進行選擇以獲得穩定表現之細胞株Jurkat-NFAT-luc。用pcDNA3.1-FcγRIIIA-V176質粒進一步轉染Jurkat-NFAT-luc細胞株,且用抗生素G418選擇以獲得穩定表現之細胞株Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176。
接著,將對數期靶細胞重懸於具有10% FBS之RPMI1640中,接著以每孔1×104
個細胞鋪板,在37℃下孵育30分鐘。藉由使用含有10% FBS之RPMI1640稀釋抗-hCLDN18.2嵌合抗體及對照抗體IMAB362,接著以100至0.0017 μg/ml之最終濃度將其加入靶細胞板中。將對數期之Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176細胞以每孔6×104
個細胞添加至上述板中。將板在37℃下孵育6小時。接著,將細胞培養板平衡至室溫,持續30分鐘。使用酶標儀(Thermo VARIOSKAN FLASH 3001),在室溫下用Cell Titer-Glo發光細胞活力測定套組進行細胞活力分析。
基於報導基因之讀出曲線,可計算EC50且將其用於評估ADCC效應。如使用MKN45-CLDN18.2-高細胞之圖3B所示,儘管IMAB362可計算EC50之點較少,但兩條曲線表明18B10-C具有比IMAB362更好的ADCC活性。如圖3D所示,在MKN45-CLDN18.2中細胞中,如藉由EC50所量測的,18B10-C之ADCC效價比IMAB362高50倍以上。此等結果表明,具有CLDN18.2中等表現之細胞可能比高表現細胞更好地將18B10-C抗體與IMAB362區分開。在MKN45-hCLDN18.2細胞上未觀測到CDC活性(資料未顯示)。
3. 對 NUGC4 細胞之結合及細胞毒性作用
NUGC4代表具有與來自胃癌患者類似之hCLDN18.2表現量之胃細胞株。
按照上述相同之方法(參見本實施例之第2節)進行細胞結合試驗及ADCC報導基因分析。如圖4A及4C所示,除26G6-C及59A9-C以外,6種嵌合抗體中之5種以大約10 μg/ml之EC50與NUGC4細胞結合(參見表5)。26G6-C以較高之EC50 (67 μg/ml)與NUGC4結合,表明了較低之親和力。59A9-C顯示更高之EC50 (19μg/ml)及更低之最大信號。另外,圖4B及4D顯示了針對NUGC4細胞,其ADCC活性之相似趨勢。由於兩個單獨的實驗,EC50及最大信號可能會在圖4B及圖4D之間不同。重要的是,所有測試之嵌合抗體均顯示出比IMAB362更好的ADCC活性,尤其為18B10-C比IMAB362高40倍以上。在NUGC4細胞上未觀測到CDC活性(資料未顯示)。
表5總結了所有嵌合抗體及IMAB362對HEK293-CLDN18.2及NUGC4細胞之FACS結合資料。表 5
FACS 結合(EC50,ug/ml) | HEK293-CLDN18.2 | NUGC4 | |
7C12-C | 0.63 | 12.97 | |
11F12-C | 0.61 | 10.02 | |
12E9-C | 0.65 | 9.37 | |
26G6-C | 1.10 | 67.11 | |
IMAB362 | 0.42 | >100 | |
59A9-C | 1.35 | 19.08 | |
18B10-C | 0.96 | 7.80 | |
4. 嵌合 CLDN18.2 抗體之特異性
CLDN18.2僅有幾種胺基酸與存在於許多正常組織及器官中之CLDN18.1不同。對CLDN18.2之抗體結合特異性為非常重要的。細胞結合試驗與上述相同(參見本實施例之第1節)。圖5顯示了18B10-C及IMAB362與表現CLDN18.2或CLDN18.1之HEK293細胞之結合。兩種抗體僅結合表現CLDN18.2之細胞,而不結合表現CLDN18.1之細胞。其他嵌合抗體亦具有相似之良好選擇性(資料未顯示)。
實施例 8 :抗原決定基結合 雜交瘤抗體與基準抗體競爭結合表現 CLDN18.2 之細胞
將對數期MKN45-CLDN18.2-高細胞重懸於FACS清洗緩衝液(具有2% BSA之PBS)中,接著以每孔1×105
個細胞之密度加入96孔V底板中。將稀釋之雜交瘤抗體或IMAB362-mIgG2a(終濃度:100至0.01 μg/ml)添加至培養板中。將板在4℃下孵育1小時以使抗體完全佔據細胞表面上之抗原。將細胞用FACS清洗緩衝液洗滌2次,接著將10 μg/ml IMAB362或5 μg/ml 18B10-C添加至細胞中,在4℃下進一步孵育1小時。接著將細胞洗滌3次,且與山羊抗-hIgG(H + L)-FITC(1:200稀釋)一起孵育。最後,使用FACS清洗緩衝液洗滌細胞3次,且藉由流式細胞術進行分析。
如圖6A及6B所示,雜交瘤抗體18B10可完全阻斷IMAB362與MKN45-CLDN18.2細胞之結合,此表明18B10可能比IMAB362具有更高之結合親和力,但依賴於相似或附近之胺基酸(表6)。表 6
√
:完全阻斷;部分:部分阻斷; - :未偵測到
被競爭者 | ||||||
競爭者 | IMAB362 | 7C12-C | 11F12-C | 12E9-C | 26G6-C | 18B10-C |
IMAB362-mIgG2a | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 |
7C12 | √ | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | - |
11F12 | √ | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | - |
12E9 | √ | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | - |
26G6 | √ | 部分 | 部分 | 部分 | 部分 | - |
18B10 | √ | - | - | - | - | 部分 |
實施例 9 :在與 CLDN18.1 不同之 CLDN18.2 胺基酸上藉由定點誘變對選定之抗體進行抗原決定基鑑定 1. 人 CLDN18.2-mRFP 及人 CLDN18.1-mRFP 構建體之產生
編碼人CLDN18.1 (胺基酸1-261,SEQ ID NO:31)-mRFP1 (胺基酸1-225)及人CLDN18.2 (胺基酸1-261,SEQ ID NO:30)-mRFP1 (胺基酸1-225)之cDNA係在體外合成的(SEQ ID NO:52及SEQ ID NO:53分別為胺基酸序列)。接著按照製造商之說明使用Syno組裝混合試劑(Synbio),藉由同源重組之方法將PCR產物選殖至pcDNA3.1(+)載體中。使用QIAGEN Plasmid Mega套組(QIAGEN)純化質粒。
根據人CLDN18.1及CLDN18.2之序列(Genbank登錄號:剪接變異體1 (CLDN18.1):NP_057453,NM_016369及剪接變異體2 (CLDN18.2):NM_001002026,NP_001002026),8種不同之胺基酸位於28-70之間,此可能係與人CLDN18.2特異性結合而不與CLDN18.1特異性結合之決定因素。使用上述產生之野生型人CLDN18.2-mRFP質粒作為模板,用引子產生了一個整合序列之兩個片段。在人CLDN18.2-mRFP之指定位置上具有單個胺基酸改變之變異體係藉由使用引子之重疊PCR進行擴增的。特異性突變在Q29M、N37D、A42S、N45Q、Q47E、E56Q、G65P及L69I上。在人CLDN18.1-mRFP之指定位置上具有單個胺基酸改變之變異體係藉由使用引子之重疊PCR進行擴增的。特定突變在M29Q、D37N、S42A、Q45N、E47Q、Q56E、P65G、I69L上。接著藉由同源重組之方法將PCR產物選殖至pcDNA3.1(+)載體中。藉由對單個陽性選殖進行定序來鑑定且確認人CLDN18.2-mRFP變異體。
隨後,將此等突變異體及野生型人CLDN18.2-mRFP或人CLDN18.1-mRFP之質粒轉染至HEK293細胞株中。首先,將5×106
個HEK293細胞以60%~80%之比例接種至60 mm培養皿中進行轉染。將400 μl 1×HBS中之10 μg DNA及10 μl 25 kDa線性PEI轉染試劑(溶於1×HBS中,1 mg/ml儲備液)混合,以達到1:2.5之DNA/PEI比。接著,將混合物逐滴加入HEK293細胞培養物中。6-8小時後,將轉染之細胞培養液更換為完全DMEM,隔夜。轉染後24小時,收集細胞,使用嵌合抗體進行FACS分析。人 CLDN18.1 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 31) 人 CLDN18.1-mRFP1 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 52) 人 CLDN18.2 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 30) 人 CLDN18.2-mRFP1 之胺基酸序列 (SEQ ID NO: 53)
2. CLDN18.2 嵌合抗體與位點突變之 HEK293-CLDN18.2 或 HEK293-CLDN18.1 細胞之結合
將轉染之HEK293-CLDN18.2或HEK293-CLDN18.1細胞以105
/孔之密度、100 μl/孔重懸於含2% BSA之PBS中。用FACS清洗緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌細胞3次,且與100 μl/孔、10 μg/ml之嵌合抗體及IMAB362在4℃下孵育30分鐘。接著,將細胞用FACS清洗緩衝液洗滌3次,且與100 μl/孔之山羊抗hIgG(H + L)-FITC (1:200稀釋)在4℃下再孵育30分鐘。最後,使用FACS清洗緩衝液洗滌細胞3次,且藉由流式細胞術進行分析。為了分析與CLDN18.2轉染細胞之結合,將RFP陽性細胞用於對照門控。
表7計算且總結此等嵌合抗體與突變之CLDN18.2變異體之結合信號相比於與野生型之結合信號之百分比。如圖7A-7B所示,當E56突變為Q時,18B10-C之結合完全消失。此類變化亦適用於IMAB362及其他嵌合抗體,但59A9-C除外。此外,吾人發現其他胺基酸(例如A42、N45)亦在一定程度上參與了IMAB362及其他抗體之結合,但此種情況不適用於18B10-C。表 7
相比於野生型CLDN18.2 ,突變之人CLDN18.2 之結合百分比(%) | |||||||
CLDN18.2 上之突變 | IMAB362 | 7C12-C | 11F12-C | 12E9-C | 26G6-C | 59A9-C | 18B10-C |
野生型 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 | 100.00 |
Q29M | 113.89 | 83.52 | 107.78 | 106.33 | 106.53 | 90.37 | 83.50 |
N37D | 121.11 | 80.20 | 102.19 | 102.71 | 117.72 | 92.66 | 105.63 |
A42S | 15.76 | 38.69 | 56.86 | 55.10 | 82.23 | 90.02 | 69.23 |
N45Q | 18.87 | 52.10 | 57.38 | 50.77 | 88.69 | 65.04 | 91.97 |
Q47E | 108.17 | 74.74 | 86.13 | 89.07 | 116.12 | 87.47 | 109.00 |
E56Q | 0.83 | 0.48 | 0.27 | 0.35 | 0.34 | 52.74 | 6.57 |
G65P | 119.26 | 79.44 | 92.67 | 96.73 | 118.87 | 85.55 | 118.11 |
L69I | 89.27 | 90.38 | 74.28 | 58.10 | 79.74 | 105.74 | 111.70 |
實施例 10 :人源化抗體之產生及表徵 1. 人源化抗體 18B10 之產生、表現及純化
用於輕鏈之人種系框架序列VK/4-1及用於重鏈之VH/1-46分別用於CDR移植。
藉由將三個CDR直接移植至種系序列(18B10 HC種系,SEQ ID NO:23),且分別對於HC變異體1 (Hu18B10_Ha,SEQ ID NO:25)進行R71I、T73K反向突變,對於HC變異體2 (Hu18B10_Hb,SEQ ID NO:27)進行R71I、T73K、T28S、M69L反向突變以及對於HC變異體3 (Hu18B10_Hc,SEQ ID NO:29)進行R71I、T73K、T28S、M69L、R38K、M48I反向突變來獲得重鏈(HC)變異體1、2及3。
(1)18B10HC之種系序列:
VH/1-46 (18B10-種系, SEQ ID NO: 23):
VH/1-46變異體1 (Hu18B10_Ha, SEQ ID NO: 25):
VH/1-46變異體2 (Hu18B10_Hb, SEQ ID NO: 27):
VH/1-46變異體3 (Hu18B10_Hc, SEQ ID NO: 29):
藉由將三個CDR直接移植至種系序列(18B10 LC種系,SEQ ID NO:24),且變異體1 (Hu18B10_La,SEQ ID NO:26)不進行反向突變,及對LC變異體2 (Hu18B10_Lb,SEQ ID NO:28)進行S63T、I21M反向突變來獲得輕鏈(LC)變異體1及2。
(2)18B10 LC之種系序列:
VK/4-1 (18B10 LC種系, SEQ ID NO: 24)
VK/4-1變異體1 (Hu18B10_La, SEQ ID NO: 26)
VK/4-1變異體2 (Hu18B10_Lb, SEQ ID NO: 28)
以上所述之重鏈可變區及輕鏈可變區組合形成了以下之人源化18B10抗體:18B10-HaLa (具有SEQ ID NO: 25之VH及SEQ ID NO: 26之VL), 18B10-HbLa (具有SEQ ID NO: 27之VH及SEQ ID NO: 26之VL), 18B10-HcLa (具有SEQ ID NO: 29 之VH及SEQ ID NO: 26之VL), 18B10-HaLb (具有SEQ ID NO: 25之VH及SEQ ID NO: 28之VL), 18B10-HbLb (具有SEQ ID NO: 27之VH及SEQ ID NO: 28之VL), 18B10-HcLb (具有SEQ ID NO: 29之VH及SEQ ID NO: 28之VL)。
如下所示,18B10之重鏈及輕鏈之人源化變異體與人IgG1重鏈恆定區及kappa輕鏈恆定區相連接:
人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO: 49):
人Kappa輕鏈恆定區(SEQ ID NO: 50):
合成上述重鏈及輕鏈cDNA之可變區,且與人IgG1及人kappa之恆定區融合。將所選抗體基因之重鏈及輕鏈選殖至表現載體中,且使用來自Qiagen之Plasmid Maxiprep System大規模地製備DNA。按照生產商之操作說明,使用Invitrogen之ExpiFectamine™CHO試劑進行轉染。當細胞活力為約60%時收集上清液。將細胞培養上清液藉由0.22 um濾膜過濾以除去細胞碎片。將上清液加到預先平衡之蛋白質A親合柱上。接著,用平衡緩衝液(PBS)洗滌柱內之Protein A樹脂,且使用25 mM檸檬酸鹽(pH 3.5)溶離抗體。用1 M Tris-鹼(pH 9.0)將pH調節至約6.0-7.0。內毒素控制在1 EU/mg以下。接著藉由SDS-PAGE及SEC-HPLC表徵純化之抗體。
2. 與人及小鼠 CLDN18.2 之結合
按照與實施例5中上述之相同之方法測試人源化抗體之結合。
如圖8A所示,所有人源化變異體均與嵌合變異體進行了頭對頭測試,以篩選出最佳變異體。所有變異體均完全保留了其結合。接著,測試僅具有一個反向突變之18B10-HaLa與HEK293-小鼠CLDN18.2細胞之結合(圖8B)。18B10-HaLa可以比IMAB362更好的效價及更高的MFI與小鼠CLDN18.2很好地結合,此表明18B10-HaLa對小鼠具有良好之交叉反應性。
3. 藉由 KinExA 進行之人源化 CLDN18.2 抗體之親合性分析
藉由KinExA頭對頭評估18B10-HaLa及IMAB362與表現CLDN18.2之細胞之結合親合力。按照KinExA 4000 (Sapidyne Instruments Inc.)之說明,用30 μg山羊抗人IgG Fc抗體將200 mg PMMA硬珠(Sapidyne,#440176)包被2 h,接著用10 mg/ml BSA封閉1 h。在對數期收集兩個胃細胞株NUGC4及KATOIII (ATCC,目錄號HTB-103),且與0.2 nM 18B10-HaLa或IMAB362混合。用0.2 nM 18B10-HaLa或IMAB362將細胞-抗體混合物稀釋2倍,且在室溫下孵育3小時。游離抗體之數量隨著稀釋而增加。用山羊抗人IgG Fc包被之珠子捕獲此等游離抗體,接著用1 μg/ml Alexa Fluor 647抗人IgG標記以讀取結果。
每種抗體之結合親合力總結在表8中。18B10-HaLa與NUGC4細胞及KATOIII結合之Kd約為0.3 nM,比IMAB362高8倍以上。這與上述之FACS結合結果相一致。表 8. CLDN18.2 抗體對胃細胞株之 Kd
Kd (nM) | 18B10-HaLa | IMAB362 |
NUGC4 | 0.303 | 2.58 |
KATOIII | 0.315 | ND |
4. HEK293-CLDN18.2 細胞上之 CDC 試驗
與上述方法(參見實施例7之第1節)相似,在CDC活性測定中,用IMAB362對18B10-HaLa進行了頭對頭測試。如圖9所示,18B10-HaLa之CDC活性比IMAB362高20倍以上。在濃度為0.3 μg/ml之情況下,依賴18B10-HaLa之特異性細胞殺傷百分比達到86%,而IMAB362在相同濃度下沒有細胞殺傷力。
5. 對 MKN45-CLDN18.2 細胞之結合及細胞毒性作用
細胞結合測定與上述相同。如圖10A所示,所有18B10之人源化變異體結合具有與嵌合18B10相當的親合力之細胞。選擇僅具有一個反向突變之18B10-HaLa進行進一步之ADCC活性研究。
使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176細胞作為效應細胞及MKN45-CLDN18.2細胞作為靶細胞來測試ADCC活性。試驗方案與上述相同(參見實施例7之第2節)。如圖10B中所示,18B10-HaLa之EC50 (0.05 μg/ml)比IMAB362低得多,此與嵌合的18B10一致。
6. 對 NUGC4 細胞之結合及細胞毒性作用
細胞結合及ADCC試驗與上述相同。圖11A顯示了18B10-HaLa與NUGC4細胞之結合親合力結果。圖11B顯示了與IMAB362相比,18B10-HaLa (EC50~0.59 μg/ml)更好的ADCC效價。
7. 使用 NUGC4 作為靶細胞且 PBMC 作為效應細胞之 ADCC 試驗
將對數期NUGC4細胞重懸於具有10% FBS之RPMI1640中。將細胞以每孔1×104
個細胞預接種至96孔U底板中。將抗CLDN18.2抗體及IMAB362在含10% FBS之RPMI1640中進行梯度稀釋,且以200至0.2 μg/ml之終濃度加至上述板中,且在37℃下孵育30分鐘。從液氮中移出來自苗舜(上海)生物技術有限公司之冷凍PBMC,且立即放入37℃水浴中。離心後,將細胞重懸於添加了10% FBS之RPMI1640中,且以每孔40×104
個細胞接種至上述96孔U底板中。接著將板在37℃之培養箱中放置5小時。
孵育後,將板平衡至22℃。使用Promega CytoTox-ONE均質膜完整性測定套組(G7892)或CytoTox96®非放射性細胞毒性試驗(G1780)偵測LDH。在按照生產商之說明添加裂解液、試劑及終止液後,在激發波長560 nm及發射波長590 nm (G7892)或490 nm或492 nm之吸光度(G1780)下量測螢光。
圖12顯示了使用PBMC作為效應細胞之代表性資料。18B10-HaLa顯示出比IMAB362更好的ADCC效價。由於不符合回歸曲線,因此可能無法準確計算EC50。
8. 使用人 CLDN18.2 上之定點誘變對所選抗體進行抗原決定基鑑定
使用與實施例9相同之方法及人CLDN18.2-mRFP質粒,將如下所列之人CLDN18.2 28-80之間的42個胺基酸替換為丙胺酸,每次替換一個。使用引子藉由重疊PCR擴增此等變異體。特定突變為Q28A,Q29A,W30A,S31A,T32A,Q33A,D34A,L35A,Y36A,N37A,N38A,V40A,T41A,V43A,F44A,N45A,Y46A,Q47A,L49A,W50A,R51A,S52A,V54A,R55A,E56A,E56A,S57A,S58A,F60A,T61A,E62A,R64A,Y66A,F67A,T68A,L69A,L70A,L72A,M75A,L76A,Q77A,V79A,R80A。接著按照生產商之說明,使用Syno組裝混合試劑(Synbio),藉由同源重組之方法將PCR產物選殖至pcDNA3.1(+)載體中。使用QIAGEN Plasmid Mega Kit (QIAGEN)純化質粒。
隨後,將此等突變異體及野生型CLDN18.2-mRFP之質粒轉染至HEK293細胞中。如實施例9,轉染後24小時藉由流式細胞術分析細胞。
如圖13A所示,當W30、L49、W50、E56突變為A時,18B10-HaLa之結合完全喪失(結合百分比<10%),此表明了這4種胺基酸對於其與人CLDN18.2之結合至關重要。特別地,E56為構成結合抗原決定基中最重要的一個。除了此等4個關鍵胺基酸外,其他幾種胺基酸經丙胺酸替代(如R51、F60、E62、R80)後亦會影響結合(結合百分比介於10%及25%之間)。圖13B顯示了59A9-C與位點突變之CLDN18.2之結合,其僅部分地依賴於E56 (結合百分比為約22%)。表9總結了與野生型相比,突變之CLDN18.2與抗體之結合百分比。表 9
與野生型CLDN18.2 相比,突變之CLDN18.2 之結合百分比(%) | ||
CLDN18.2 上之突變 | 18B10-HaLa | 59A9-C |
野生型 | 100.00 | 100.00 |
Q28A | 28.47 | 46.38 |
Q29A | 82.85 | 54.83 |
W30A | 0.38 | 3.20 |
S31A | 92.24 | 76.85 |
T32A | 91.56 | 85.59 |
Q33A | 57.11 | 59.78 |
D34A | 97.47 | 96.29 |
L35A | 89.80 | 75.44 |
Y36A | 79.92 | 78.03 |
N37A | 61.20 | 60.72 |
N38A | 66.62 | 57.63 |
V40A | 103.48 | 128.07 |
T41A | 60.27 | 41.63 |
V43A | 36.83 | 59.41 |
F44A | 59.86 | 70.03 |
N45A | 36.19 | 35.16 |
Y46A | 51.55 | 14.98 |
Q47A | 105.11 | 57.45 |
L49A | 1.20 | 2.32 |
W50A | 0.86 | 5.05 |
R51A | 39.39 | 22.12 |
S52A | 86.58 | 98.97 |
V54A | 84.22 | 87.24 |
R55A | 49.94 | 49.69 |
E56A | 0.27 | 21.92 |
S57A | 112.14 | 77.16 |
S58A | 62.08 | 39.38 |
F60A | 26.32 | 64.43 |
T61A | 84.08 | 51.64 |
E62A | 8.42 | 23.13 |
R64A | 87.70 | 51.00 |
Y66A | 53.19 | 52.45 |
F67A | 76.37 | 79.89 |
T68A | 70.92 | 71.30 |
L69A | 88.60 | 54.83 |
L70A | 75.64 | 82.08 |
L72A | 56.61 | 53.03 |
M75A | 75.98 | 73.58 |
L76A | 43.12 | 52.06 |
Q77A | 80.06 | 63.42 |
V79A | 43.72 | 39.11 |
R80A | 27.27 | 13.64 |
實施例 11 :抗體藥物綴合物 (ADC) 內化及細胞毒性
使用MC-vc-PAB-MMAE KIT (Levena Biopharma,Cat#SET0201)將18B10-HaLa及對照hIgG1與vcMMAE綴合。嵌合之18B10-HaLa之藥物抗體比(DAR)為4.05,而IMAB362及對照hIgG1之藥物抗體比分別為2.9及4.96。使用偵測細胞代謝活性之比色測定法評估18B10-HaLa-vcMMAE對細胞活力之作用。
將對數期之HEK293-CLDN18.2,NUGC4或MKN45-CLDN18.2-高細胞重懸於其相應之培養基中,接著以每孔1×104
個細胞,50 μl/孔添加至細胞培養板中,且在37℃下孵育隔夜。接著,將抗體-vcMMAE,對照hIgG1-vcMMAE及抗體進行梯度稀釋,且以50 μl/孔添加至每個孔中。最終濃度為4.75 nM之vcMMAE用作細胞毒性之陽性對照。72小時後,在室溫下將100 μl/孔之來自CellTiter-Glo發光細胞活性測定套組之偵測試劑添加至每個孔中,孵育10分鐘,接著使用酶標儀讀數。
如圖14A所示,18B10-HaLa-vcMMAE及IMAB362-vcMMAE在HEK293-CLDN18.2細胞上誘導了細胞毒性,但對照hIgG1-vcMMAE並非如此,此表明該細胞毒性為hCLDN18.2特異性的。儘管單獨的18B10-HaLa及IMAB362對靶細胞不具有細胞毒性(資料未顯示),此表明觀測到的細胞毒性係vcMMAE介導的。圖14B顯示了對胃癌細胞NUGC4之細胞毒性作用。18B10-HaLa-vcMMAE表現出劑量依賴性之細胞生長抑制作用,起始濃度為0.03 μg/ml。相反,IMAB362-vcMMAE僅以10 μg/ml(更高之濃度)抑制細胞生長。在另一個用CLDN18.2(高表現)轉染之胃癌細胞MKN-45中,18B10-HaLa-vcMMAE達到的最大細胞殺傷率為86%,亦高於IMAB362 (60%)(如圖14C所示)。
眾所周知,ADC藉由抗原結合及內化進入靶細胞而發揮作用。與抗體綴合之藥物僅在內化且轉移至用於降解之溶酶體後才能釋放且殺死細胞。吾人用此試驗作為對18B10-HaLa內化特徵之初步估計。結果表明,其具有潛在之內化活性,可開發為ADC治療藥物。
實施例 12 :人源化 CLDN18.2 抗體在 MKN45-CLDN18.2- 高異種移植模型中之體內功效評估 1. 使用裸鼠在 MKN45-CLDN18.2- 高異種移植模型上之抗腫瘤功效
體外研究(實施例10)顯示,人源化之CLDN18.2抗體可誘導對MKN45-CLDN18.2-高細胞之ADCC作用(實施例1)。因此,建立了體內模型且將其用於抗腫瘤活性評估。簡而言之,每隻雌性Balb/c裸鼠經右側腹腔皮下接種具有50%基質膠(BD)之5×106
個MKN45-CLDN18.2-高細胞。接種後12天,選擇24隻腫瘤大小在70 mm3
左右之小鼠且隨機分為3組(n = 8)。接著,以0.3 mg/kg之劑量用同種型對照或人源化CLDN18.2抗體,經腹腔注射治療小鼠,每週兩次,持續3週。在研究結束時,使用吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且表示為平均值±S.E.M。
如圖15所示,如藉由腫瘤大小及TGI所量測的,18B10-HaLa顯示出比IMAB362稍微更優之抗腫瘤活性,而兩者均顯著優於同種型對照(表10)。表 10. MKN45-CLDN18.2- 高異種移植模型中 18B10-HaLa 及 IMAB362 之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M. , n = 8)
處理方式 | 腫瘤大小(mm3 ) 第28天 | TGI (%) 第28天 | P值vs.同種型對照 |
同種型對照 | 541.16±48.39 | / | / |
IMAB362 | 423.11±27.87 | -21.82 | 0.0529 |
18B10-HaLa | 260.31±20.30 | 51.90 | 0.0001 |
2. 使用 NOD-SCID 小鼠測試 MKN45-CLDN18.2- 高及 hPBMC 共接種異種移植模型上之抗腫瘤功效
自Allcells獲取人PBMC細胞。將24隻SPF級NOD-SCID雌性小鼠隨機分為3組(n = 8),經右側腹腔皮下注射,用5×106
個MKN45-CLDN18.2-高細胞及50%基質膠(BD)對6隻小鼠進行接種,並作為模型組(無PBMC),用5×106
個MKN45-CLDN18.2-高細胞及5×106
人PBMC細胞(含50%基質膠(BD))對18隻小鼠進行接種,且作為治療組。接種後4小時,用10 mg/kg同種型對照,3 mg/kg及10 mg/kg 18B10-HaLa藉由腹腔注射處理小鼠,每週兩次,持續4週。在研究結束時,使用吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且表示為平均值±S.E.M。
如圖16所示,在治療期間18B10-HaLa組之腫瘤生長被完全抑制。治療後,3 mg/kg組之腫瘤在20天後開始長大,而10 mg/kg組並未如此。不具有PBMC之組及具有PBMC之PBS組之間不存在顯著差異,表明在不存在抗體之情況下PBMC單獨作為效應細胞不能抑制腫瘤生長。表11中總結了腫瘤生長抑制作用(TGI)。18B10-HaLa對動物體重無影響(資料未顯示)。表 11. 在 MKN45-CLDN18.2- 高及 hPBMC 共接種之異種移植腫瘤模型中 18B10-HaLa 之腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M. , n = 6)
處理方式 | 腫瘤大小(mm3 ) 第29天 | TGI (%) 第29天 | p值vs.同種型對照 |
模型組 | 797.59±98.07 | / | / |
同種型對照 | 926.27±175.36 | / | / |
18B10-HaLa 3 mg/kg | 273.62±41.16 | 70.46 | 0.0047 |
18B10-HaLa 10 mg/kg | 85.40±10.35 | 90.78 | 0.0007 |
3. 18B10-HaLa 劑量依賴性之抑制裸鼠中 MKN45-CLDN18.2- 高異種移植之腫瘤生長
經右側腹腔皮下注射,用具有50%基質膠(BD)之5×106
個細胞對每隻雌性Balb/c裸鼠進行接種。接種後9天,選擇32隻腫瘤大小在100 mm3
左右之小鼠且隨機分為4組(n = 8)。接著,藉由腹腔注射,用同種型對照,0.1 mg/kg,0.3 mg/kg及1 mg/kg 18B10-HaLa處理小鼠,每週兩次,持續3週。在研究結束時,使用吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且表示為平均值±S.E.M。
如圖17所示,18B10-HaLa之抗腫瘤活性為劑量依賴性的。1 mg/kg組顯示出最佳的腫瘤生長抑制活性(表12)。表 12. 在 MKN45-CLDN18.2- 高異種移植腫瘤模型中 18B10-HaLa 之劑量依賴性腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M. , n = 8)
處理方式 | 腫瘤大小(mm3 ) 第13天 | TGI (%) 第13天 | p值vs.同種型對照 |
同種型對照 | 584.37±32.32 | / | / |
0.1 mg/kg 18B10-HaLa | 409.75±44.46 | 29.88 | 0.0067 |
0.3 mg/kg 18B10-HaLa | 369.84±19.14 | 36.71 | 5.38*10^-5 |
1 mg/kg 18B10-HaLa | 275.57±23.41 | 52.84 | 2.02*10^-6 |
實施例 13 :具有增強之 ADCC 效應之 18B10-HaLa-VLPYLL 突變異體之產生、表現、純化及表徵 1. 18B10-HaLa-VLPYLL 突變異體之產生
根據Futa Mimoto等人之研究,L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L突變對FcγRIIIA結合親和力可增加10倍,而對FcγRIIB (抑制性FcγR同工型)卻不存在任何改變。為了驗證該假設,構建且產生了18B10-HaLa-L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L (18B10-HaLa-VLPYLL)突變異體以增強其ADCC效應。按照與實施例12之第1節相同之方法,短暫轉染該Fc變異體,且進行表現及純化。
據報導,Fc中之五個突變L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L可增加與人CD16A (FcγRIIIA)之兩個等位基因之結合親合力,而對FcγRIIB (抑制性FcγR同工型)沒有任何改變。(Futa Mimoto等人, Novel asymmetrically engineered antibody Fc variant with superior FcγR binding affinity and specificity compared with afucosylated Fc variant[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2013, 5(2): 229-236)。為了驗證該假設,藉由使用重疊延伸PCR將此等突變引入Hu18B10_Ha_hIgG1,且將新構建體命名為Hu18B10_Ha_hIgG1_L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L。使用瓊脂糖凝膠電泳表徵最終之PCR產物。從凝膠中提取正確大小之片段,且將其選殖至表現載體中。接著藉由定序分析確認了Hu18B10_Ha_hIgG1_P330S之正確構建體。使用來自Qiagen之Plasmid Maxi-prep System製備Hu18B10_Ha_hIgG1_L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L及Hu18B10_La_hKappa之質粒。接著如上述一樣,按照與實施例10之第1節相同之方法,將重鏈及輕鏈質粒共轉染至Expi-CHO細胞中進行表現及純化。
工程化之Fc L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L (SEQ ID NO: 51)之序列:
2. 與 Fcγ 受體之結合
Futa Mimoto等人將VLPYLL Fc突變異體與野生型進行了比較,發現該突變可增加其與FcγRIIIA F176(63倍)及FcγRIIIA V176(33倍)之結合親和力,而不會影響其他FcgR。為了證實此發現,測試抗體與此等FcγR之間的ELISA結合。簡而言之,以1 μg/ml之濃度將18B10-HaLa-VLPYLL或18B10-HaLa-wt抗體包被在板上。封閉且洗滌後,加入用His-標籤標記之系列稀釋(5 μg/ml~0.02 μg/ml)之FcγR,且孵育1小時。接著加入抗His-HRP及TMB以在OD450 nm下偵測FcγR之結合。
如圖18A及18B所示,在與人FcγRI或FcγRIIB之結合上,18B10-HaLa_VLPYLL及18B10-HaLa-wt之間不存在顯著差異。然而,與野生型(wt)相比,18B10-HaLa_VLPYLL顯示出與人FcγRIIIA (F176)及FcγRIIIA (V176)之結合增加了10倍(圖18C及18D)。在小鼠FcγR及食蟹猴FcγR上顯示出相似之結果(圖18E至18I)。
3. 與 FcRn 及 C1q 之結合
藉由ELISA方法評估FcRn結合。簡而言之,將18B10-HaLa_VLPYLL或wt固定在板上。將生物素化之FcRn在pH 6.0稀釋緩衝液中連續稀釋(1 μg/ml~0.0002 μg/ml),接著加入且孵育1小時。接著,加入鏈黴親和素-HRP及TMB以在OD450 nm下偵測結合。
C1q結合試驗採用以下方法。將兩種抗體固定在板上。加入系列稀釋之C1q (20 μg/ml~0.31 μg/ml)孵育1小時。接著加入抗C1q-HRP及TMB以在OD450 nm下進行偵測。
如圖19A所示,18B10-HaLa_VLPYLL及wt之間在FcRn結合上不存在顯著差異,此表明VLPYLL突變對FcRn結合不存在影響。圖19B顯示18B10-HaLa_VLPYLL在比wt低之C1q濃度下達到相同之結合信號,此可能導致CDC效價增加。
4. 使用 Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176 作為效應細胞在 NUGC4 細胞上之 ADCC 試驗
按照與上述相同之方法進行ADCC報導基因試驗(參見實施例7之第2節)。如圖20A所示,與wt (EC50~0.032 μg/ml)相比,18B10-HaLa_VLPYLL之ADCC效價(EC50~0.0097 μg/ml)增加了3倍。
5. 使用人 PBMC 作為效應細胞在 NUGC4 細胞上之 ADCC 試驗
按照上述方法,使用人PBMC進行ADCC試驗(參見實施例10之第7節)。如圖20B所示,儘管18B10-HaLa_VLPYLL及wt之最高細胞毒性相似(~45%),但與wt相比,18B10-HaLa_VLPYLL之ADCC效價亦增加了3倍。與IMAB362相比,18B10-HaLa_VLPYLL之效價增加了100倍。
6. 一組胃癌細胞株中 CLDN18.2 表現之 MESF
Quantum™ MESF (等效可溶性螢光染料分子)微球套組可實現螢光強度單位之標準化,以用於定量螢光細胞計數法。使用30 μg/ml 18B10-HaLa及山羊抗人IgG-FITC對一組胃癌細胞(GC)進行染色。在具有固定螢光裝置之流式細胞儀上,使用Quantum™ MESF珠偵測細胞。簡而言之,將一滴參考空白「B」滴加至400 µL懸浮液中,接著將每個螢光強度種群之1滴合併至400 µL相同之緩衝液中進行分析。在流式細胞儀上分析微球。使用下載之Bangs Laboratories之定量分析模板,QuickCal® v. 2. 3進行資料分析,其使用校準曲線及回歸係數(r2)值。對於準確之MESF分配,可確保儀器線性,且達到回歸係數≥0.9995。另外,進行了適當之平行對照(例如,未染色之細胞、同種型對照)。
如圖21所示,兩個轉染之細胞株HEK293-CLDN18.2及MKN45-CLDN18.2-高具有比其他細胞株高得多的CLDN18.2表現量,此可能並不代表來自GC患者之腫瘤細胞。在GC細胞株中,NUGC4之CLDN18.2表現最高。SNU-601 (Cobioer,目錄號CBP60507)及SNU-620 (Cobioer,目錄號CBP60508)具有中等水準,而KATOIII及OCUM-1 (Cobioer,目錄號CBP60494)具有較低之表現。因此,CLDN18.2在胃癌細胞中具有不同的表現量。
7. 在一組胃癌細胞株中 CLDN18.2 表現之 IHC 偵測
在對數生長期收集胃癌細胞株,且分別用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌後,在室溫下於4%中性緩衝之多聚甲醛(PFA)中固定30分鐘。離心後,將細胞以約2-5×107
之密度重懸於PBS中,隨後與200 μl熔融瓊脂混合,接著在梯度酒精中脫水,在二甲苯中澄清,接著包埋在石蠟中用於切片。使用3 μg/ml GC182-生物素,藉由免疫組織化學(IHC)偵測此等細胞之CLDN18.2表現量,上述GC182-生物素為由邁博斯生物醫藥根據WO2013167259中之序列產生且在實驗室內進行生物素化,此係用於CLDN18.2 IHC偵測之可用之單株抗體。藉由陽性細胞之相對比例及細胞膜上之染色強度評估IHC結果。根據IMAB362在臨床試驗中之評分指南,對此等細胞株進行打分及評估(表13)。僅在至少40%之腫瘤細胞中具有中度(2+)及強(3+)染色之患者才有資格納入IMAB362之FAST研究。因此,NUGC4,MKN45-CLDN18.2-高及HEK293-CLDN18.2符合標準。此等結果與實施例13第6節(QuantumTM
MESF方法)一致。
GC182之重鏈可變區(SEQ ID NO:74):
GC182之輕鏈可變區(SEQ ID NO:75): 表 13. 使用 IHC 方法分析胃癌細胞株之 CLDN18.2 表現
細胞株 | 陽性細胞% | 強度 |
HEK293-CLDN18.2 | 100 | 3+ |
MKN45-CLDN18.2-高 | 40~50 | 2+ |
MKN45-CLDN18.2-中 | <5 | 0~1+ |
NUGC4 | 30~40 | 1+~2+ |
SNU-601 | 5~10 | 1+ |
KATOIII | <1 | 0~1+ |
SNU-620 | <1 | 0~1+ |
OCUM-1 | 0 | 0 |
8. 使用人 PBMC 作為效應細胞,在具有不同 CLDN18.2 表現量之胃癌 (GC) 細胞株上之 ADCC 分析
為了進一步檢驗CLDN18.2抗體之ADCC活性受GC細胞上CLDN18.2表現量調控之假設,按照上述相同方法(實施例10第7節),使用人PBMC作為效應細胞進行ADCC試驗。將具有不同CLDN18.2表現量之4種胃細胞株用作靶細胞。如圖22A-22D所示,在所有CLDN18.2抗體中,NUGC4細胞誘導了最高之ADCC活性(最大細胞毒性~40%)。在三種測試之抗體中,18B10-HaLa-VLPYLL顯示了比18B10-HaLa-wt及IMAB362更好的效價。SNU-601及SNU-620細胞誘導中等之ADCC活性(最大細胞毒性分別為30%及15%),而OCUM-1細胞具有最低之細胞毒性(低於10%)。此等結果表明,ADCC活性與此等細胞株上之CLDN18.2表現量相關。
實施例 14 : 18B10-HaLa 之工藝最佳化及 ADCC 效應之表徵
1. 18B10-HaLa之工藝最佳化
眾所周知,非岩藻糖基化或去岩藻糖基化選擇性地及顯著地增加對FcγRIII之結合親合力且導致ADCC功能增強。以下描述了減少岩藻糖及增強ADCC之工藝最佳化。
簡而言之,收穫細胞庫之種子且在CD-CHO培養基(Gibco)中培養3天後,將細胞在基礎培養基(Hyclone,ActiPro + 4mM Gln +1╳HT)中擴增6天。接著將0 (作為參考樣品)或50 μM之2F-O-F(2-脫氧-2-氟-L-岩藻糖)添加至生物反應器中,且將DO (溶解氧)控制在40%左右。添加飼養培養基1/2 (Hyclone,Cell Boost 7a,Cell Boost 7b),且當VCD (可變細胞密度)低於80%或在第13天時收集細胞懸液。
收集細胞懸浮液後,使用HPLC量測參考樣品及50 μM 2F-O-F樣品之抗體滴度。在第13天,50 μM 2F-O-F樣品之滴度為4.73 g/L,甚至高於參考樣品,此表明其不受2F-O-F之影響。
純化後藉由HPLC量測抗體質量,且50 μM之2F-O-F樣品(98.3%)具有與參照樣品(98.2%)相似之純度。2F-O-F對抗體質量沒有顯著影響。
同時藉由HPLC分析N-聚糖,結果示於表14中。與參考樣品相比,2F-O-F之添加降低了G0F (FA2)(自61.6%降至1.9%)及岩藻糖(自87.7%降至13.7%)之百分比,但增加了G0(A2)之百分比(自8.1%增加至69.8%)。因此,50 μM之2F-O-F足以將岩藻糖控制在15%以下,此可能導致ADCC效應增強。將該工藝下之產物(含50 μM 2F-O-F)命名為18B10-HaLa低岩藻糖。
表14. 18B10-HaLa樣品之N-聚糖之分析
樣品 | G0F(FA2)% | G0(A2)% | Man5% | G1F% | M% | F% | S% |
參考 | 61.616 | 8.112 | 2.013 | 20.621 | 2.013 | 87.708 | 0.761 |
50 μM 2F-O-F | 1.919 | 69.795 | 10.954 | 1.065 | 10.954 | 13.684 | 2.154 |
為了證明18B10-HaLa低岩藻糖增強了有效FcγIIIa受體之親合性,同時保持了對FcRn之親合性,吾人藉由Fortebio系統之生物層干涉法(BLI)技術比較了18B10-HaLa低岩藻糖及IMAB362-類似物之親合性。將具有人IgG1同種型及正常糖基化之IMAB362-類似物作為對照。
在此項研究中,將FcγRI,FcγRIIa-H167,FcγRIIa-R167,FcγRIIb,FcγRIIIa-V176,FcγRIIIa-F176,FcγRIIIb-NA1,FcγRIIIb-NA2及FcRn加載至生物感測器上且浸入不同濃度之IMAB362及18B10-HaLa低岩藻糖溶液。所有結合資料在30℃下收集。當量測18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362-類似物與C1q之親和力時,將生物素化之抗體加載至生物感測器上,接著與C1q在溶液中孵育。藉由BLI測定抗體對FcRn之親和力時,pH值為6.0,而對於其他Fc受體之結合試驗,pH值為7.4。實驗包括5個步驟:1.基線獲取;2.將人Fcγ受體加載至生物感測器上;3.第二次基線獲取;4.將18B10-HaLa低岩藻糖及IMAB362-類似物締合用於量測kon;及5.抗體解離用於量測koff。18B10-HaLa低岩藻糖及IMAB362-類似物對FcγRI,FcRn或C1q具有相似之親和力,而18B10-HaLa低岩藻糖顯示出對其他受體之親合力比IMAB362-類似物略高。此等結果表明,在臨床試驗中,18B10-HaLa低岩藻糖將表現出增強之ADCC活性,且具有與正常糖基化抗體相似之半衰期。
表15. 藉由ForteBio Octet偵測之18B10-HaLa低岩藻糖及IMAB362-類似物對人Fc受體之親合力資料
配位體 | 分析物 | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | KD (M) |
FcγRI | IMAB362-類似物 | 6.67E+04 | 3.48E-04 | 5.22E-09 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 8.49E+04 | 4.46E-04 | 5.25E-09 | |
FcγRIIa-H167 | IMAB362-類似物 | 1.97E+05 | 3.81E-02 | 1.93E-07 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 3.38E+05 | 2.98E-02 | 8.81E-08 | |
FcγRIIa-R167 | IMAB362-類似物 | 2.55E+05 | 2.97E-02 | 1.17E-07 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 4.04E+05 | 2.03E-02 | 5.02E-08 | |
FcγRIIb | IMAB362-類似物 | 1.60E+05 | 3.67E-02 | 2.30E-07 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 3.54E+05 | 3.29E-02 | 9.30E-08 | |
FcγRIIIa-V176 | IMAB362-類似物 | 1.59E+05 | 9.75E-03 | 6.15E-08 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 3.59E+05 | 9.46E-03 | 2.64E-08 | |
FcγRIIIa-F176 | IMAB362-類似物 | 1.42E+05 | 3.28E-02 | 2.32E-07 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 4.07E+05 | 3.88E-02 | 9.53E-08 | |
FcγRIIIb-NA1 | IMAB362-類似物 | 1.05E+04 | 4.18E-02 | 3.97E-06 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 2.53E+04 | 5.47E-02 | 2.17E-06 | |
FcγRIIIb-NA2 | IMAB362-類似物 | 1.40E+04 | 4.43E-02 | 3.16E-06 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 3.52E+04 | 4.07E-02 | 1.16E-06 | |
FcRn | IMAB362-類似物 | 4.46E+05 | 4.67E-03 | 1.05E-08 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 6.59E+05 | 5.49E-03 | 8.34E-09 | |
IMAB362-類似物 | C1q | 6.87E+06 | 1.48E-01 | 2.15E-08 |
18B10-HaLa低岩藻糖 | 7.96E+06 | 1.37E-01 | 1.72E-08 |
如表15所示,18B10-HaLa低岩藻糖對人FcγRIIIa-V176及人FcγRIIIa-F176蛋白之親和力比IMAB362稍高,此可能係較低程度之岩藻糖基化所致。如表15所示,18B10-HaLa低岩藻糖對人FcRn蛋白之親和力不受較低之岩藻糖基化影響,甚至比IMAB362略高。如表15所示,18B10-HaLa低岩藻糖對人C1q蛋白之親和力與IMAB362之親和力不太相似。
2. 使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞在NUGC4上之ADCC報導基因分析
按照上面相同之方案進行ADCC試驗(參見實施例7之第2節)。如圖23所示,使用添加50 μM 2F-O-F (18B10-HaLa低岩藻糖)之工藝所產生之抗體與使用不添加2F-O-F之工藝所產生之參考樣品相比,ADCC活性提高了30倍以上。短暫表現之18B10-HaLa亦包含在此對比中,且由於工藝最佳化,代表ADCC活性之最大信號亦增加。
3. 使用18B10-HaLa低岩藻糖對不同胃癌細胞株之FACS結合
按照與實施例7之第2節相同之方案進行FACS結合。如圖24A-24C所示,18B10-HaLa低岩藻糖可以比IMAB362更高之效價與此等細胞株結合。18B10-HaLa低岩藻糖之EC50為0.5~1.6 μg/ml,而IMAB362在約1 μg/ml濃度下幾乎沒有結合信號。
4. 使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞在不同胃癌細胞株上之ADCC報導基因分析
按照上述相同之方案進行ADCC試驗(參見實施例7之第2節)。如圖25A-E所示,使用具有不同CLDN18.2表現量之胃癌細胞株,18B10-HaLa低岩藻糖之ADCC活性之EC50為約0.008 μg/ml。與IMAB362相比,18B10-HaLa低岩藻糖之ADCC效價至少高100倍。
5. 使用PBMC作為效應細胞在不同胃癌細胞株上之ADCC報導基因分析
按照與上述相同之方案進行ADCC試驗(參見實施例10之第7節)。如圖26A-26D所示,在不同之胃癌細胞株上,18B10-HaLa低岩藻糖比IMAB362顯著誘導出更高之ADCC作用。IMAB362在低濃度(0.01~0.1 μg/ml)幾乎不誘導任何細胞毒性。然而,在0.1 μg/ml之濃度下,18B10-HaLa低岩藻糖之細胞毒性幾乎飽和。
6. 使用 PBMC 作為效應細胞在 NUGC4 上之最佳化之 ADCC 試驗
開發使用人PBMC作為效應細胞之最佳化之ADCC試驗以用於進一步研究。簡而言之,自液氮中收穫冷凍之PBMC,且用RPMI1640 + 10%FBS以5×106
/ml之密度重懸細胞,且在使用前,於37℃ 5%CO2
培養箱中孵育5 h。按照說明,用CellTrace™ Far Red(Invitrogen,目錄號C34564)標記靶細胞NUGC4細胞。將標記之NUGC4細胞及稀釋之抗體添加至96孔板中,且在37℃ 5% CO2
培養箱中孵育30分鐘。接著將PBMC細胞添加至相應之孔中,且在培養箱中孵育細胞15小時。在培養結束時,加入碘化丙啶(PI)染色液以標記死的NUGC4細胞。藉由流式細胞術分析CellTrace™ Far Red陽性細胞中之PI陽性細胞百分比。藉由減去非特異性殺傷百分比來計算特異性細胞毒性。
如圖27所示,代表性資料,在濃度為1.2 μg/ml時18B10-HaLa低岩藻糖之最大特異性細胞毒性達到60%以上,其EC50為0.014 μg/ml,而在最高濃度(30 µg/ml)時IMAB362-類似物之最大值僅為40%,其EC50為0.54 µg/ml,此為18B10-HaLa低岩藻糖之30倍以上。
實施例 15 : 18B10-HaLa 低岩藻糖體內抗腫瘤活性 1. 使用 NOD-SCID 小鼠測試在 MKN45-CLDN18.2- 高及 hPBMC 共接種異種移植模型上之抗腫瘤功效
自Allcells獲取人PBMC細胞。將60隻SPF級雌性NOD-SCID小鼠隨機分為6組(n = 10),經右側腹腔皮下注射,用5×106
個MKN45-CLDN18.2-高細胞及50%基質膠(BD)對10隻小鼠進行接種,且作為模型組(無PBMC),用5×106
個MKN45-CLDN18.2-高細胞及5×106
人PBMC細胞(含50%基質膠(BD))對50隻小鼠進行接種,且作為治療組。接種後4小時,藉由腹腔內注射10 mg/kg同種型對照,1 mg/kg,3 mg/kg及10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖來處理小鼠,每週兩次,持續5週。在研究結束時,用吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且將結果表示為平均值±S.E.M。
如圖28A所示,18B10-HaLa低岩藻糖以劑量依賴性方式顯著抑制腫瘤之生長。尤其用10 mg/kg之18B10-HaLa低岩藻糖,大多數腫瘤(7/10)在研究結束時消失(圖28B)。18B10-HaLa低岩藻糖之腫瘤生長抑制率亦取決於劑量,且10 mg/kg TGI組達到95.86% (表16)。與IMAB362-類似物相比,1810-HaLa低岩藻糖具有更強的抗腫瘤活性。同時18B10-HaLa低岩藻糖對動物之體重沒有影響(資料未顯示)。表 16. 在第 36 天時, MKN45-CLDN18.2- 高及 hPBMC 共接種異種移植腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M. , n = 10)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
模型組 | 953.02±84.3 | / | / |
同種型對照 10 mg/kg | 932.88±118.05 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖 1 mg/kg | 608.2±102.07 | 35.80 | 0.0520 |
18B10-HaLa低岩藻糖 3 mg/kg | 279.34±78.07 | 70.06 | 0.0002 |
18B10-HaLa低岩藻糖 10 mg/kg | 38.62±24.06 | 95.86 | 7×10^-7 |
IMAB362-類似物 10 mg/kg | 162.78±40.6 | 82.55 | 8×10^-6 |
2. 18B10-HaLa 低岩藻糖與奧沙利鉑及 5-Fu 聯用對裸鼠 MKN45-CLDN18.2- 高腫瘤模型之功效
用具有50%基質膠之混合之5×106
MKN45-CLDN18.2-高細胞對SPF級雌性裸鼠進行接種。當腫瘤大小在90 mm3
左右時,選擇荷瘤小鼠且隨機分為4組(n = 8)。用10 mg/kg同種型對照及賦形劑,10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖,2.5 mg/kg奧沙利鉑,及30 mg/kg 5-FU,以及10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖與2.5 mg/kg奧沙利鉑及30 mg/kg 5-FU聯用對動物進行處理,18B10-HaLa低岩藻糖藉由腹膜內注射進行施用,每週兩次,持續4週,而奧沙利鉑及5-FU係藉由靜脈注射施用,每週一次,持續四週。在二維尺度上,使用卡尺(INSIZE)每週量測兩次或三次腫瘤大小,且使用以下公式以mm3
表示體積:V = 0.5 a×b2
其中a及b分別代表腫瘤之長徑及短徑。使用Prism GraphPad分析結果,且將結果表示為平均值±S.E.M。兩組之間藉由T檢驗進行比較,若p為* <0.05及** <0.01,則認為差異顯著。
如圖29及表17所示,在不存在PBMC之情況下,單一藥劑組18B10-HaLa低岩藻糖及奧沙利鉑+5-FU僅對腫瘤生長有輕度抑制,TGI分別為47%及52%。但其組合具有增強之腫瘤抑制作用69%,與單一藥劑組相比有顯著差異。表 17. 在第 28 天, 18B10-HaLa 低岩藻糖與奧沙利鉑及 5-FU 聯用對 MKN45-CLDN18.2- 高腫瘤模型之腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M. , n = 8)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
10mg/kg同種型對照+賦形劑 | 1617.77±66.37 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 852.28±75.68 | 47.32 | 3×10^-6 |
奧沙利鉑2.5mg/kg + 5-FU 30mg/kg | 770.66±87.38 | 52.36 | 2×10^-6 |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg + (奧沙利鉑2.5mg/kg +5-FU 30mg/kg) | 508.03±77.02 | 68.60 | 3×10^-8 |
3. 18B10-HaLa 低岩藻糖與紫杉醇聯用對裸鼠 MKN45-CLDN18.2- 高腫瘤模型之功效
在37℃,含5% CO2之條件下,將MKN45-CLDN18.2-高細胞在體外作為單層培養物培養在RPMI1640培養基(Thermo Fisher)中,上述培養基補充了10%熱滅活之胎牛血清(ExCell Biology),100 U/ml青黴素及100 ug/ml鏈黴素(Hyclone)。收集處於指數生長期之細胞,且計數用於腫瘤接種。經右側腹腔皮下注射,用具有50%基質膠(BD)之5×106
細胞對每隻雌性Balb/c裸鼠進行接種。接種後8-11天,選擇24隻腫瘤大小在100 mm3
左右之小鼠且隨機分為3組(n = 8)。接著用同種型對照或18B10-HaLa低岩藻糖以10 mg/kg之劑量,藉由腹膜注射處理小鼠,每週兩次,持續3週。靜脈注射5 mg/kg之紫杉醇,每週一次。在研究結束時,藉由吸入二氧化碳之方式處死動物。在二維尺度上使用卡尺(INSIZE)量測腫瘤大小,且使用以下公式以mm3
表現體積:V = 0.5 a×b2
(其中a及b分別代表腫瘤之長度及寬度)。使用以下公式計算腫瘤生長抑制率(TGI%):TGI%=(1-(TVDt(治療組)/TVDt(對照組))×100%。TVDt代表每次後續量測之腫瘤體積。使用Prism GraphPad (均值±SEM)生成直方圖,使用T分析進行統計學分析。p <0.05,表示組間差異顯著;p <0.01,表示組間差異極顯著。
如圖30A所示,與同種型對照相比,自第5天起18B10-HaLa低岩藻糖顯著抑制腫瘤生長,其TGI約為43%。同樣,紫杉醇作為胃癌常用之二線化療藥物,其TGI亦約為45%。然而當將其組合使用時,腫瘤抑制率達到61%,與單一藥劑組相比有顯著差異(圖30B,表18)。然而,在不具有腫瘤接種之人PBMC之情況下,腫瘤體積將明顯大於具有人PBMC之腫瘤體積。在所有組中均未觀測到明顯之體重變化。表 18. 在第 29 天, MKN45-CLDN18.2- 高異種移植腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M , n = 10)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
同種型對照 10 mg/kg | 941.20±122.34 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖 10 mg/kg | 536.99±29.26 | 42.95 | 0.0011 |
紫杉醇 3 mg/kg | 515.47±71.93 | 45.23 | 0.0022 |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg + 紫杉醇 3 mg/kg | 366.55±26.37 | 61.05 | 0.000045 |
4. 在裸鼠 GC02-0004 PDX 腫瘤模型中 18B10-HaLa 低岩藻糖與紫杉醇聯用之功效
源自胃癌患者之異種移植物(PDX)模型之腫瘤組織來自北京癌症醫院之腺癌/胃癌患者(No:GC-02-004),且在裸鼠中傳代6次後進行分析。使用3 μg/ml GC182-生物素藉由免疫組織化學(IHC)偵測CLDN18.2表現,上述GC182-生物素為用於CLDN18.2偵測之公認IHC抗體。由邁博斯生物醫藥根據WO2013167259中之序列生成GC182。在該腫瘤組織中陽性細胞之相對比例在40%至70%之間(圖31A,放大200倍)。亦分別使用兔單株抗體D8F12 (Cell Signaling Technology,Cat#4290)及SP263 (由邁博斯生物醫藥根據WO2016124558之序列製備)藉由IHC偵測HER2及PD-L1之表現。因此,該腫瘤組織均為HER2陰性(圖31B)及PD-L1陰性(圖31C)。
向每隻小鼠皮下接種直徑約3 mm之小腫瘤組織塊,該小腫瘤組織塊係自荷瘤小鼠之整個腫瘤剝離物中切下。接種後2週,選擇腫瘤大小約50 mm3
之動物,隨機分為3組,每組8隻。以10 mg/kg腹腔內注射18B10-HaLa低岩藻糖及對照抗體,每週兩次。靜脈注射5 mg/kg紫杉醇,每週注射一次。首次注射後繼續治療5週。每週量測2-3次腫瘤體積及小鼠體重。在研究結束時,藉由吸入二氧化碳之方式處死動物。在二維尺度上使用卡尺(INSIZE)量測腫瘤大小,且使用以下公式以mm3
表示體積:V = 0.5a×b2
(其中a及b分別代表腫瘤之長度及寬度)。使用以下公式計算腫瘤生長抑制率(TGI%):TGI%=(1-(TVDt(治療組)/TVD
t(對照組))×100%。TVD
t代表每次後續量測之腫瘤體積。使用Prism GraphPad (均值±SEM)生成直方圖,且使用T分析進行統計學分析。p <0.05,表示組間差異顯著;p <0.01,表示組間差異極顯著。
如圖31D所示,18B10-HaLa低岩藻糖導致48%之腫瘤抑制率。同樣,紫杉醇作為胃癌常用之二線化療藥物,其腫瘤抑制率亦僅為45%。然而當將其組合使用時,腫瘤抑制率達到68%,與單一藥劑組相比有顯著差異(表19)。如圖31E所示,5 mg/kg之紫杉醇似乎對小鼠之體重具有輕微之毒性作用,而其他治療則沒有。 表 19. 在第 36 天, GC02-0004 PDX 腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制 ( 平均值 ±S.E.M. , n = 10)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
同種對照10 mg/kg | 1481.05±304.09 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 767.65±105.40 | 48.17 | 0.0510 |
紫杉醇5 mg/kg | 812.71±122.04 | 45.13 | 0.0687 |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg + 紫杉醇5 mg/kg | 474.07±74.58 | 67.99 | 0.0092 |
5. 在 MKN45-CLDN18.2 高異種移植腫瘤模型中與 DC101 之聯用
DC101係與小鼠VEGFR-2 (血管內皮生長因子受體2)反應之單株抗體,亦稱為CD309,KDR及Flk-1。VEGFR-2為酪胺酸蛋白激酶家族之成員。一旦與其配位體VEGF結合,VEGFR-2在血管發展及滲透性中起關鍵作用。事實證明,DC101競爭性阻斷VEGF及VEGFR-2之結合,從而導致腫瘤微血管密度降低及腫瘤生長減緩。由邁博斯生物醫藥(蘇州)有限公司根據US5840301中之序列製備了該抗體。
用與50%基質膠混合之5×106
MKN45-CLDN18.2-高細胞對雌性SPF級裸鼠進行接種。當腫瘤大小在90 mm3
左右時,選擇荷瘤小鼠並隨機分為4組(n = 8)。用10 mg/kg同種型對照,10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖,3 mg/kg DC101及與3 mg/kg DC101組合之10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖處理動物。藉由腹腔內注射施用所有抗體,每週兩次,持續4週。在二維尺度上,使用卡尺(INSIZE)量測腫瘤大小,每週量測兩次或三次,且使用以下公式以mm3
表示體積:V = 0.5a×b2
,其中a及b分別代表腫瘤之長徑及短徑。使用Prism GraphPad分析結果,且將結果表示為平均值±S.E.M。兩組之間藉由T檢驗進行比較,若p為* <0.05及** <0.01,則認為差異顯著。
如圖32及表20所示,在不存在PBMC之情況下,單一藥劑組(18B10-HaLa低岩藻糖或DC101)具有一定程度之腫瘤抑制,TGI分別為47%及35%。當其聯用時,腫瘤生長幾乎停止,抑制率為75%,與單一藥劑組相比有顯著差異。表 20. 在第 22 天, MKN45-CLDN18.2 異種移植模型中抗體之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M., n = 6)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
同種型對照10 mg/kg | 1141.33±70.17 | ||
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 605.40±49.96 | 46.96 | 2×10^-5 |
DC101 3 mg/kg | 741.10±79.96 | 35.07 | 2×10^-3 |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg + DC101 3 mg/kg | 290.57±56.35 | 74.54 | 3×10^-7 |
實施例 18 :體外胰臟癌細胞上之 18B10-HaLa 低岩藻糖抗腫瘤活性 1. MIA PaCa-2-CLDN18.2 及 BxPC-3-CLDN18.2 細胞株之產生
MIA PaCa-2-CLDN18.2及BxPC-3-CLDN18.2細胞株為由邁博斯生物醫藥(蘇州)有限公司構建。簡而言之,用pcDNA3.1/hCLDN18.2質粒轉染MIA PaCa-2細胞(上海生物科學研究所,目錄號SCSP-568)及BxPC-3細胞(上海生物科學研究所,目錄號TCHu12),且用G418進行選擇以獲得穩定表現之細胞株MIA PaCa-2-CLDN18.2及BxPC-3-CLDN18.2。用18B10-HaLa低岩藻糖抗體偵測CLDN18.2之表現量。選擇具有最高信號之單細胞選殖且擴增以用於細胞儲存。
2. 使用 18B10-HaLa 低岩藻糖之與胰臟癌細胞株之 FACS 結合
按照與實施例7之第2節相同之方案進行FACS結合。如圖33A-33B所示,18B10-HaLa低岩藻糖可以比IMAB362更高之效價與兩種細胞株結合。18B10-HaLa低岩藻糖之最大信號顯著高於IMAB362。18B10-HaLa低岩藻糖之EC50約為0.53 μg/ml,其亦顯著低於IMAB362。
3. 使用 Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176 作為效應細胞在胰臟癌細胞株上之 ADCC 報導基因分析
按照上述相同之方案進行ADCC試驗(參見實施例7之第2節)。如圖34A-34B所示,18B10-HaLa低岩藻糖之ADCC活性之EC50為約0.001 μg/ml。與IMAB362相比,18B10-HaLa低岩藻糖之ADCC效價高約4倍。
實施例 19 :在體內胰臟癌細胞上之 18B10-HaLa 低岩藻糖抗腫瘤活性 1. 使用裸鼠在 MIA PaCa-2-CLDN18.2 異種移植模型上之功效
經右側腹腔皮下注射,用具有50%基質膠(BD)之5×106
MIA PaCa-2-CLDN18.2細胞對每隻5-6週齡之雌性Balb/c裸鼠進行接種。接種後12天,選擇24隻腫瘤大小在70 mm3
左右之小鼠,隨機分為4組(n = 6)。接著,藉由腹腔注射,以10 mg/kg之劑量用同種型對照或18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362或同體積之PBS處理小鼠,每週兩次,持續5週。在研究結束時,藉由吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且將其表示為平均值±S.E.M。
如圖35所示,如藉由腫瘤大小及TGI所量測,18B10-HaLa低岩藻糖顯示出比IMAB362更好的抗腫瘤活性,而兩者均顯著優於同種型對照(表21)。在所有組中均未觀測到明顯的體重變化。表 21. 第 36 天 MIA PaCa-2-CLDN18.2 異種移植模型中抗體之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M. , n = 6)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
PBS | 475.95±43.76 | ||
同種型對照10 mg/kg | 694.44±187.73 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 152.22±30.23 | 78.08 | 0.030 |
IMAB362 10 mg/kg | 205.36±60.55 | 70.43 | 0.0544 |
2. 使用裸鼠在 BxPC-3-CLDN18.2 異種移植模型上之功效
按照與MIA PaCa-2-CLDN18.2模型相同之步驟(實施例19之第1節),建立BxPC-3-CLDN18.2異種移植模型,且用抗體進行處理。
如圖36所示,IMAB362完全不能抑制腫瘤生長,而18B10-HaLa低岩藻糖顯示出一定程度之抗腫瘤活性(表22)。在所有組中均未觀測到明顯之體重變化。表 22. 在第 34 天, BxPC-3-CLDN18.2 異種移植模型中抗體之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M. , n = 6)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
PBS | 801.64±259.96 | ||
同種型對照 10 mg/kg | 902.02±181.20 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 621.69±157.93 | 31.08 | 0.3363 |
IMAB362 10 mg/kg | 988.91±169.91 | -9.63 | 0.7681 |
實施例 20 :在體外肺癌細胞上之 18B10-HaLa 低岩藻糖抗腫瘤活性
1.使用 18B10-HaLa 低岩藻糖與肺癌細胞株之 FACS 結合
NCI-H146購自ATCC (Cat#,ATCC®HTB-173)。NCI-H460-CLDN18.2購自Kyinno (Cat#,KC-1450),其係用CLDN18.2穩定轉染的。按照與實施例7之第2節相同之方案進行FACS結合。如圖37A-37B所示,18B10-HaLa低岩藻糖可以劑量依賴之方式與兩種細胞株結合。對於NCI-H460-CLDN18.2細胞上之CLDN18.2表現量比NCI-H146細胞高得多,前一細胞之最大結合信號亦顯著高於後一細胞。
2. 使用 Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176 作為效應細胞在 NCI-H146 上之 ADCC 報導基因分析
按照上述相同之方案進行ADCC測試(參見實施例7之第2節)。如圖38所示,18B10-HaLa低岩藻糖可在NCI-H146細胞上誘導ADCC,EC50約為0.003 μg/ml。與IMAB362相比,18B10-HaLa低岩藻糖之ADCC效價高約150倍。
3. 使用 PBMC 作為效應細胞在 NCI-H460-CLDN18.2 上之 ADCC 試驗
按照上面類似之方案(實施例16之第6節)進行了原代PBMC介導之ADCC試驗。簡而言之,自液氮中收穫冷凍之PBMC,且用RPMI1640 + 10%FBS以5×106
/ml之密度重懸細胞,且在使用前於37℃ 5% CO2培養箱中孵育5 h。按照說明,用CellTrace™ Far Red標記靶細胞NCI-H460-CLDN18.2細胞或NCI-H292細胞。將標記之靶細胞及稀釋之抗體添加至24孔細胞培養板中,且在37℃ 5% CO2培養箱中孵育30分鐘。接著將PBMC細胞以40:1之E:T比加入相應之孔中,且在培養箱中孵育15小時。培養結束時,將每個孔之懸浮細胞及貼壁細胞(用溫及之胰蛋白酶消化)收集到相應之15 mL試管中。離心此等試管以移除上清液。加入含碘化丙啶(PI)染色溶液之PBS以重懸靶細胞且標記死的靶細胞。藉由流式細胞術分析CellTrace™ Far Red陽性細胞中之PI陽性細胞百分比。藉由減去非特異性殺傷百分比來計算特異性細胞毒性。
如圖39所示,18B10-HaLa低岩藻糖僅對NCI-H460-CLDN18.2細胞具有ADCC活性,而對NCL-H292(CLDN18.2陰性之人肺腺癌細胞)沒有ADCC活性。
實施例 21 :在體內肺癌細胞上之 18B10-HaLa 低岩藻糖抗腫瘤活性 1. 使用裸鼠在 NCI-H146 及人 PBMC 共接種腫瘤模型上之功效
按照與MKN45-CLDN18.2-高模型相同之方法(實施例17之第1節),建立NCI-H146及人PBMC共接種腫瘤模型且藉由抗體進行治療。用5×106
NCI-H146 + 1.5×106
人PBMC及50%基質膠對30隻NOD-SCID小鼠進行接種。接種後4小時,將動物隨機分為3組(n=10)。
如圖40A-40B及表23所示,用人PBMC及18B10-HaLa低岩藻糖治療,NCI-H146腫瘤幾乎完全不生長,且組內差異很小。表 23. 在第 32 天, NCI-H146 及 PBMC 共接種模型中抗體之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M. , n = 10)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
模型組 | 329.42±70.14 | ||
同種型對照 10 mg/kg | 275.13±55.10 | / | / |
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 85.91±5.15 | 68.78 | 0.0001 |
2. 使用 NOD-SCID 小鼠測試在 NCI-H460-CLDN18.2 及人 PBMC 共接種腫瘤模型上之功效
人PBMC細胞來自Allcells。將20隻SPF級雌性NOD-SCID小鼠隨機分為2組(n = 10)。經右側腹腔皮下注射,用3×106
NCI-H460-CLDN18.2細胞及具有50%基質膠(BD)之5×106
人PBMC細胞對小鼠進行接種,且作為模型組。接種後4小時,藉由腹膜內注射,用10 mg/kg同種型對照及10 mg/kg 18B10-HaLa低岩藻糖處理小鼠,每週兩次,持續5週。在研究結束時,藉由吸入二氧化碳之方式處死動物。每週量測2-3次腫瘤大小及體積。使用Prism GraphPad分析結果,且將其表示為平均值±S.E.M。
如圖41及表24所示,具有人PBMC之情況下,18B10-HaLa低岩藻糖組之腫瘤生長要慢於同種型對照組(TGI為36%)。表 24. 在第 25 天, NCI-H460-CLDN18.2 腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制 (TGI)( 平均值 ±S.E.M. , n = 10)
處理方式 | 腫瘤大小 (±SEM, mm^3) | TGI (%) | P值vs.同種型對照 |
同種型對照10 mg/kg | 486.54±52.63 | ||
18B10-HaLa低岩藻糖10 mg/kg | 311.35±32.78 | 36.01 | 0.0125 |
實施例 22 :在體外結腸癌細胞上之 18B10-HaLa 低岩藻糖抗腫瘤活性 1. 使用 18B10-HaLa 低岩藻糖與結腸癌細胞株之 FACS 結合
SK-CO-1購自ATCC (Cat#,ATCC®HTB-39)。按照與實施例7之第2節相同之方案進行FACS結合。如圖42所示,18B10-HaLa低岩藻糖可以劑量依賴性方式結合SK-CO-1細胞。EC50約為1.78 μg/ml。
2. 使用 Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176 作為效應細胞在結腸癌細胞株上之 ADCC 報導基因分析
按照上述相同之方案(參見實施例7之第2節)進行ADCC試驗。如圖43所示,18B10-HaLa低岩藻糖可在SK-CO-1細胞上誘導ADCC。與IMAB362相比,18B10-HaLa低岩藻糖具有高得多的ADCC效價。
實施例 23 :使用 ForteBio Octet RED96 18B10-HaLa 低岩藻糖與人 Fc 受體之相互作用分析 1. 與 FcγRIIIa 蛋白之相互作用
將100 nM在1x動力學緩衝液(1xPBS,pH 7.4,0.002% Tween 20)中的,具有His標籤之生物素化之人FcγRIIIa-V176或生物素化之人FcγRIIIa-F176蛋白添加至7個預濕式SA生物感測器(PALL ,ForteBio,目錄號18-5019)上,且與不同濃度之18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362溶液一起孵育。所有結合資料在30℃下收集。實驗包括5個步驟:1. 獲取基線(60 s);2.將生物素化之人FcγRIIIa-V176蛋白或生物素化之人FcγRIIIa-F176蛋白添加至SA生物感測器上(120 s);3. 獲取第二次基線(60 s);4. 締合18K10-HaLa低岩藻糖或IMAB362以用於量測kon (60 s);及5. 解離抗體以用於量測koff(60 s)。使用了7種不同濃度之抗體,包括1000 nM,500 nM,250 nM,125 nM,62.5 nM,31.3 nM及0 nM,且用1×動力學緩衝液稀釋抗體。僅在1×動力學緩衝液中進行基線及解離步驟。koff與kon之比值確定KD。在再生緩衝液(10 mM甘胺酸-HCl,pH 1.5)中將生物感測器再生5 s,接著在中和緩衝液(1xPBS,pH 7.4,0.002% Tween 20)中中和5 s,重複該過程3次。
如表25所示,相比於IMAB362,18B10-HaLa低岩藻糖對人FcγRIIIa-V176及人FcγRIIIa-F176蛋白之親和力略高,此可能係由較低程度之岩藻糖基化所致。表 25. CLDN18.2 抗體與人 FcγRIIIa 蛋白之動力學結合常數
配位體 | 分析物 | kon (1/Ms) | kdis (1/s) | KD (M) |
FcγRIIIa-V176 | 18B10-HaLa低岩藻糖 | 3.59E+05 | 9.46E-03 | 2.64E-08 |
IMAB362 | 1.59E+05 | 9.75E-03 | 6.15E-08 | |
FcγRIIIa-F176 | 18B10-HaLa低岩藻糖 | 4.07E+05 | 3.88E-02 | 9.53E-08 |
IMAB362 | 1.42E+05 | 3.28E-02 | 2.32E-07 |
2. 與 FcRn (FCGRT&B2M) 蛋白之相互作用
將50 nM在FcRn 1×動力學緩衝液(1×PBS,pH 6.0,0.002%Tween 20)中的,具有His標籤之人FcRn (FCGRT&B2M)蛋白添加至7個預濕之Ni-NTA生物感測器上,且與不同濃度之18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362溶液一同孵育。在30℃下收集所有結合資料。實驗包括5個步驟:1. 獲取基線(60 s);2.將人FcγFcRn (FCGRT&B2M)蛋白加載至Ni-NTA生物感測器上(150 s);3. 獲取第二次基線(80 s);4. 締合18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362以用於量測kon(60 s);及5. 解離抗體以用於量測koff(60 s)。使用了7種不同濃度之抗體,包括500 nM,250 nM,125 nM,62.5 nM,31.3 nM,15.6nM及0 nM,且用FcRn動力學緩衝液(pH 6.0)稀釋抗體。僅在1X動力學緩衝液中進行基線步驟,在FcRn動力學緩衝液(pH 6.0)中進行基線2及解離步驟。koff與kon之比值確定KD。在再生緩衝液中將生物感測器再生5 s,接著在中和緩衝液中中和5 s,重複此過程3次。
如表26中所示,18B10-HaLa低岩藻糖與人FcRn蛋白之親和力不受低岩藻糖基化之影響,甚至比IMAB362之親和力略高。表 26. CLDN18.2 抗體與人 FcRn 蛋白之動力學結合常數
配位體 | 分析物 | kon (1/Ms) | kdis (1/s) | KD (M) |
FcRn (FCGRT&B2M) | 18B10-HaLa低岩藻糖 | 6.59E+05 | 5.49E-03 | 8.34E-09 |
IMAB362 | 4.46E+05 | 4.67E-03 | 1.05E-08 |
3. 與人C1q蛋白之相互作用
藉由在DMF中與生物素胺基己酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(Sigma)混合,將18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362生物素化。將100 nM在1x動力學緩衝液中之生物素化之18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362添加至7個預濕之SA生物感測器上,且與不同濃度之人C1q溶液一起孵育。在30℃下收集所有結合資料。實驗包括5個步驟:1. 獲取基線(60 s);2.將生物素化之18B10-HaLa低岩藻糖或IMAB362加載至SA生物感測器上(150 s);3. 獲取第二次基線(60 s);4. 締合人C1q以用於量測kon(30 s);及5. 解離人C1q以用於量測Koff(30 s)。使用了7種不同濃度之抗體,包括50 nM,25 nM,12.5 nM,6.25 nM,3.13 nM,1.56 nM及0 nM,且用1x動力學緩衝液稀釋人C1q。僅在1×動力學緩衝液中進行基線及解離步驟。koff與kon之比值確定KD。僅使用一次生物感測器。
如表27所示,18B10-HaLa低岩藻糖對人C1q蛋白之親和力與IMAB362對人C1q蛋白之親和力不太相似。表 27. CLDN18.2 抗體與人 C1q 蛋白之動力學結合常數
配位體 | 分析物 | kon (1/Ms) | kdis (1/s) | KD (M) |
18B10-HaLa低岩藻糖 | C1q | 7.96E+06 | 1.37E-01 | 1.72E-08 |
IMAB362 | 6.87E+06 | 1.48E-01 | 2.15E-08 |
圖1A為散點圖,其顯示了7C12、11F12、12E9及26G6對表現人CLDN18.2之HEK293-CLDN18.2細胞之結合親和力。圖1B為散點圖,其顯示了59A9、18B10、7C12、12C12及11F12對HEK293-CLDN18.2細胞之結合親和力。圖1C為散點圖,其顯示了7C12、11F12、12E9及26G6對NUGC4細胞之結合親和力。圖1D為散點圖,其顯示了59A9、18B10、7C12、12C12及11F12對NUGC4細胞之結合親和力。除非另有說明,否則在此以及在附圖及實施例中描述之包含「CLDN18.2」細胞株之名稱係指人CLDN18.2。小鼠CLDN18.2之縮寫為「mCLDN18.2」。
圖2A為散點圖,其顯示了嵌合抗體7C12-C、11F12-C、12E9-C以約0.6 μg/ml之EC50與HEK293-CLDN18.2細胞結合,26G6-C以約1 μg/ml之EC50與HEK293-CLDN18.2細胞結合。圖2B為散點圖,其顯示了抗體7C12-C、11F12-C、12E9-C及26G6-C之CDC效價比IMAB362高兩倍以上。圖2C為散點圖,其顯示了59A9-C之EC50 (1.3 μg/ml)比18B10-C (1.0 μg/ml)略高。圖2D為散點圖,其顯示了與IMAB362相比,抗體59A9-C及18B10-C之CDC效價高3倍以上。
圖3A為散點圖,其顯示了18B10-C以比IMAB362明顯更高之親和力與MKN45-CLDN18.2-高表現細胞結合。圖3B為散點圖,其顯示了使用MKN45-CLDN18.2細胞,兩條曲線表明18B10-C具有比IMAB362更佳的ADCC活性。圖3C為散點圖,其顯示了18B10-C以比IMAB362明顯更高之親和力與MKN45-CLDN18.2-中等表現細胞結合。圖3D為散點圖,其顯示了在MKN45-CLDN18.2-中等表現細胞中,藉由EC50測定,18B10-C之ADCC效價比IMAB362高50倍以上。
圖4A為散點圖,其顯示了除26G6-C以外,4種嵌合抗體中之3種以約10 μg/ml之EC50與NUGC4細胞結合。圖4B為散點圖,其顯示了7C12-C、11F12-C、12E9-C及26G6-C嵌合抗體針對NUGC4細胞之ADCC活性。圖4C為散點圖,其顯示了18B10-C嵌合抗體以約10 μg/ml之EC50與NUGC4細胞結合,但不適用於59A9-C。圖4D為散點圖,其顯示了在單獨的實驗中,59A9-C及18B10-C嵌合抗體分別針對NUGC4細胞之ADCC活性。
圖5為柱狀圖,其顯示了18B10-C及IMAB362對表現CLDN18.2或CLDN18.1之HEK293細胞之選擇性結合。
圖6A及6B為散點圖,其分別顯示了當雜交瘤抗體18B10在MKN 45-CLDN18.2-高表現細胞上與10 μg/ml之IMAB362競爭時及在MKN45-CLDN18.2-高等表現細胞上與5 μg/ml之18B10-C競爭時之結合親和力。雜交瘤抗體18B10可完全阻斷IMAB362與MKN45-CLDN18.2-高等表現細胞之結合。
圖7A-B為柱狀圖,其顯示了使用抗原決定基鑑定之嵌合抗體與突變之hCLDN 18.2變異體之結合信號。當E56突變為Q時,18B10-C之結合完全喪失。此變化亦適用於除59A9-C以外之IMAB362及其他嵌合抗體。其他胺基酸(例如A42、N45)亦在一定程度上促進了IMAB362及其他抗體之結合,但對於18B10-C並非如此。
圖8A為散點圖,其顯示了所有人源化抗體變異體及其嵌合對應抗體之結合能力。圖8B為散點圖,其顯示了人源化抗體18B10-HaLa相較於IMAB362及對照hlgG1之結合能力。18B10-HaLa以比IMAB362更佳的效價及更高之MFI與小鼠CLDN18.2良好結合。
圖9為散點圖,其顯示了人源化抗體18B10-HaLa對HEK293-CLDN18.2之CDC作用。18B10-HaLa之CDC活性比IMAB362高20倍以上。
圖10A為散點圖,其顯示了18B10之人源化抗體變異體相較於嵌合18B10對表現中等水準CLDN18.2蛋白之MKN45細胞(MKN45-CLDN18.2-中)之結合親和力。18B10之所有人源化抗體變異體均以與嵌合18B10相當的親和力與MKN45-CLDN18.2-中等表現細胞結合。圖10B為散點圖,其顯示了在MKN45-CLDN-18.2中等表現細胞上之18B10-HaLa及IMAB362之ADCC報導基因分析。18B10-HaLa之EC50 (0.05 μg/ml)比IMAB362低得多,與嵌合18B10一致。
圖11A為散點圖,其顯示了18B10-HaLa對NUGC4細胞之結合親和力之結果。圖11B為散點圖,其顯示了與IMAB362相比18B10-HaLa之ADCC作用。18B10-HaLa具有比IMAB362更佳的ADCC效價。
圖12為散點圖,其顯示了使用PBMC (供體ID:A18Z017017)作為效應細胞之ADCC分析結果。18B10-HaLa顯示了比IMAB362更佳的ADCC效價。
圖13A為柱狀圖,其顯示了18B10-HaLa抗原決定基鑑定之結果(抗體濃度:10 μg/ml)。圖13B為柱狀圖,其顯示了59A9-C抗原決定基鑑定之結果(抗體濃度:10 μg/ml)。
圖14A為散點圖,其顯示了18B10-HaLa-vcMMAE及IMAB362-vcMMAE對HEK293-CLDN18.2細胞之ADC細胞毒性。18B10-HaLa-vcMMAE及IMAB362-vcMMAE均誘導了對HEK293-CLDN18.2細胞之細胞毒性,但對照hIgG1-vcMMAE沒有誘導該毒性。圖14B為散點圖,其顯示了18B10-HaLa-MMAE及IMAB362-MMAE對NUGC-4之ADC細胞毒性作用之結果。18B10-HaLa-vcMMAE顯示劑量依賴性細胞生長抑制作用始於0.03 μg/ml之濃度,而IMAB362-vcMMAE僅在10 μg/ml (濃度高得多)抑制細胞生長。圖14C為散點圖,其顯示了18B10-HaLa-MMAE及IMAB362-MMAE對MKN45-CLDN18.2-高表現細胞之ADC細胞毒性。18B10-HaLa-vcMMAE達到86%之最大細胞殺傷率,亦高於IMAB362 (60%)。
圖15為散點圖,其顯示了同種型對照、IMAB362及18B10-HaLa之腫瘤體積相對於時間之變化。如藉由腫瘤大小及TGI (腫瘤生長抑制)所測定,18B10-HaLa顯示出比IMAB362或同種型對照明顯更佳的抗腫瘤活性。
圖16為散點圖,其分別顯示了模型組(無PBMC)、同種型對照、18B10-HaLa 3 mg/kg (mpk)及18B10-HaLa 10mpk之腫瘤體積相對於時間之變化。相對於同種型對照或PBMC對照,無論3 mpk或10 mpk之18B10-HaLa對腫瘤生長均具有明顯抑制作用。
圖17為散點圖,其分別示出了同種型對照、18B10-HaLa 0.1mpk、18B10-HaLa 0.3mpk及18B10-HaLa 1mpk之腫瘤體積相對於時間之變化。結果表明18B10-HaLa之抗腫瘤活性為劑量依賴性的。
圖18A-I為散點圖,其顯示了18B10-HaLa hIgG1與hFcγRI-his、hFcγRIIB-his、hFcγRIIIA(F176)-his、hFcγRIIIA(V176)-his、小鼠FcγRI-his、小鼠FcγRIIB-his、小鼠FcγRIIIA-his、FcγRIV-his及食蟹猴FcγRIII-his、小鼠FcγRlllA-his、FcγRlV-his及食蟹猴FcγRlll-his結合。18B10-HaLa_VLPYLL及18B10-HaLa-wt在與人FcγRI或FcγRIIB之結合上沒有明顯差異。然而,與野生型(wt)相比,18B10-Hala_VLPYLL顯示與人FcγRIIIA (F176)及FcγRIIIA (V176)之結合提高了10倍。小鼠FcγRs及食蟹猴FcγRs顯示了相似之結果。
圖19A-19B為散點圖,其分別顯示了18B10 HaLa hlgG1對huFcRn-生物素及人C1q之結合親和力。圖19A中之結果表明18B10-HaLa_VLPYLL及18B10-HaLa wt之間在FcRn結合上沒有明顯差異。圖19B中之結果表明,在較低的C1q濃度下,18B10-HaLa_VLPYLL之結合信號略佳於18B10-HaLa wt。
圖20A為散點圖,其顯示了使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞之在NUGC-4(E/T比=6:1)上之18B10-HaLa hlgG1報導基因分析之結果。與18B10-HaLawt (EC50~0.032 μg/ml)相比,18B10-HaLa-VLPYLL之ADCC效價(EC50~0.0097 μg/ml)提高了3倍。圖20B為散點圖,其顯示了使用PBMC (供體ID:A18Z017017)作為效應細胞之NUGC-4 ADCC分析之結果。與18B10-HaLawt相比,18B10-HaLa-VLPYLL之ADCC效價提高了3倍;與IMAB362相比,18B10-HaLa-VLPYLL之ADCC效價提高了100倍。
圖21顯示了在不同胃癌細胞株中CLDN18.2表現量之比較。
圖22A至22D為散點圖,其顯示了具有不同CLDN18.2表現量之不同胃癌細胞株之ADCC分析。
圖23為散點圖,其顯示了NUGC4 (E/T比=6:1)上之ADCC報導基因分析之結果。使用添加50 μM 2F-O-F之工藝所產生之抗體與使用不添加2F-O-F之工藝所產生之參比樣品相比,ADCC活性提高了30倍以上,或者與IMAB362相比,ADCC活性提高了1000倍以上。
圖24A-24C為散點圖,其顯示了使用18B10-HaLa低岩藻糖之不同胃癌細胞株之FACS結合。
圖25A-25E為散點圖,其顯示了使用18B10-HaLa低岩藻糖在不同胃癌細胞株上之ADCC報導基因分析之結果。
圖26A-26D為散點圖,其顯示了使用PBMC (供體ID:A19028011)作為效應細胞及18B10-HaLa之50 μM 2F-O-F樣品,在不同胃癌細胞株上之ADCC分析之結果。
圖27顯示了在NUGC-4細胞上之ADCC分析中18B10-HaLa低岩藻糖之特異性細胞毒性。
圖28A至28B顯示了在MKN45-CLDN18.2-高表現細胞及hPBMC共接種異種移植腫瘤模型中不同劑量之18B10-HaLa低岩藻糖之腫瘤生長抑制。
圖29顯示了在MKN45-CLDN18.2-高表現細胞腫瘤模型上18B10-HaLa低岩藻糖與奧沙利鉑(Oxaliplatin)及5-FU聯用之腫瘤生長抑制。
圖30A及30B顯示了在MKN45-CLDN18.2-高報導基因異種移植腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制。
圖31A、31B及31C顯示了在裸鼠之GC02-0004PDX腫瘤模型中,18B10-HaLa低岩藻糖與紫杉醇(Paclitaxel)聯用之療效。
圖31D及31E顯示了在GC02-0004 PDX腫瘤模型中抗體之腫瘤生長抑制。
圖32顯示了MKN45-CLDN18.2異種移植模型中抗體之腫瘤生長抑制(TGI)。
圖33A及33B顯示了使用18B10-HaLa低岩藻糖之與胰臟癌細胞株之FACS結合。
圖34A及34B顯示了使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞在胰臟癌細胞株上之ADCC報導基因分析。
圖35顯示了在MIA PaCa-2-CLDN18.2異種移植模型中之抗體之腫瘤生長抑制(TGI)。
圖36顯示了在BxPC-3-CLDN18.2異種移植模型中抗體之腫瘤生長抑制(TGI)。
圖37A及37B顯示了使用18B10-HaLa低岩藻糖之與肺癌細胞株之FACS結合。
圖38顯示了使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞在NCI-H146上之ADCC報導基因分析。
圖39顯示了使用PBMC作為效應細胞在NCI-H460-CLDN18.2上之ADCC分析。
圖40A及40B顯示了在NCI-H146及PBMC共接種模型中抗體之腫瘤生長抑制(TGI)。
圖41顯示了在NCI-H460-CLDN18.2腫瘤模型中之抗體之腫瘤生長抑制(TGI)。
圖42顯示了使用18B10-HaLa低岩藻糖之與結腸癌細胞株之FACS結合。
圖43顯示了使用Jurkat-NFAT-luc-FcγRIIIA-V176作為效應細胞在結腸癌細胞株上之ADCC報導基因分析。
Claims (88)
- 一種分離之針對人CLDN18.2之抗體或其抗原結合片段,其能夠與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列中D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基。
- 如請求項1之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗原決定基包含在E56位處之胺基酸殘基。
- 如請求項1或2之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗原決定基不包含至少一個以下殘基:A42或N45。
- 如前述請求項中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗原決定基包含在W30、L49、W50、R55及E56位處之胺基酸殘基。
- 如前述請求項中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗原決定基亦包含T41、N45、Y46、R51、F60、E62及R80中之一或多個胺基酸殘基。
- 如前述請求項中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗原決定基進一步包含D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79中之一或多個胺基酸殘基。
- 一種分離之抗體或其抗原結合片段,其能夠與人CLDN18.2特異性結合且具有至少一個以下特徵: a) 如藉由KinExA分析所測定,以不超過2.5 nM (或不超過2.0、1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4 nM)之Kd值與表現人CLDN18.2之細胞結合; b) 如藉由流式細胞術所測定,以不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 μg/ml)之EC50值與表現人CLDN18.2之細胞結合; c) 如藉由細胞毒性分析所測定,以不超過1 μg/ml (或不超過0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導補體依賴之細胞毒性(CDC); d) 如藉由ADCC報導基因分析所測定,以不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導抗體依賴之細胞毒性(ADCC)。
- 如請求項7之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述細胞包含NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞、或與其相當的細胞,上述與其相當的細胞具有與NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞或KATOIII細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。
- 如請求項7之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述細胞包含人CLDN18.2高表現細胞、人CLDN18.2中等表現細胞或人CLDN18.2低表現細胞,其中上述人CLDN18.2高表現細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以免疫組織化學(IHC)中至少40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2中等表現細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30%但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2低表現細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2。
- 如請求項7之分離之抗體或其抗原結合片段,其中與NUGC4細胞結合之EC50值不超過70 μg/ml (或不超過65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或10 μg/ml)。
- 如請求項7之分離之抗體或其抗原結合片段,其中如藉由ADCC報導基因分析所測定,上述NUGC4細胞上之ADCC之EC50值不超過2 μg/ml (或不超過1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1 μg/ml)。
- 一種分離之抗體或其抗原結合片段,其能夠與人CLDN18.2特異性結合且具有至少一個以下特徵: a) 如藉由KinExA分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%之Kd值與人CLDN18.2結合; b) 如藉由流式細胞術分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%或10%之EC50值與表現人或小鼠CLDN18.2之細胞結合; c) 如藉由細胞毒性分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導補體依賴之細胞毒性(CDC);以及 d) 如藉由ADCC報導基因分析所測定,以不超過IMAB362之80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或1%之EC50值在表現人CLDN18.2之細胞上誘導抗體依賴之細胞毒性(ADCC); 其中IMAB362為包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體,上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:72所示之胺基酸序列,上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:73所示之胺基酸序列。
- 如請求項12之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述細胞包含NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞、或細胞株,上述細胞株具有與NUGC4細胞、SNU-620細胞、SNU-601細胞、KATOIII細胞相當的或不超過上述細胞之人CLDN18.2蛋白表現量。
- 如請求項12之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述細胞包含人CLDN18.2高表現細胞、人CLDN18.2中等表現細胞、或人CLDN18.2低表現細胞,其中上述人CLDN18.2高表現細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以IHC中至少40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;上述人CLDN18.2中表現細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30%但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2;且上述人CLDN18.2低表現細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30%之細胞為陽性染色之水準表現人CLDN18.2。
- 如請求項7至14中任一項之分離之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗體與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含如SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列中D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基,可選地,上述抗原決定基包含在E56位處之胺基酸殘基;可選地,上述抗原決定基不含有至少一個以下殘基:A42或N45;可選地,上述抗原決定基包含在W30、L49、W50、R55及E56位處之胺基酸殘基;可選地,上述抗原決定基進一步包含T41、N45、Y46、R51、F60、E62及R80中之一或多個胺基酸殘基:且,可選地,上述抗原決定基進一步包含D28、V43、N45、Y46、Y66、L72、L76及V79中之一或多個胺基酸殘基。
- 一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其包含重鏈HCDR1、HCDR2及HCDR3及/或輕鏈LCDR1、LCDR2及LCDR3序列,其中: 上述HCDR1序列包含GYNMN (SEQ ID NO:1)或TYFIGVG (SEQ ID NO:13),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 上述HCDR2序列包含X1 IDPYYX2 X3 TX4 YNQKFX5 G (SEQ ID NO:32)或HIWWNDNKYYNTALKS (SEQ ID NO:15),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 上述HCDR3序列包含X6 X7 X8 GNAFDY (SEQ ID NO:33)或MGSGAWFTY (SEQ ID NO:17),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 上述LCDR1序列包含KSSQX9 LX10 NX11 GNX12 KNYLT (SEQ ID NO:34),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 上述LCDR2序列包含WASTRX13 S (SEQ ID NO:35),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 上述LCDR3序列包含QNDYX14 X15 PX16 T (SEQ ID NO:36),或與其具有至少80%序列同一性之同源序列; 其中X1 為N或Y或H,X2 為G或V,X3 為A或G或T,X4 為R或T或S,X5 為K或R,X6 為S或M,X7 為Y或F,X8 為Y或H,X9 為S或N,X10 為L或F,X11 為S或N,X12 為Q或L,X13 為E或K,X14 為S或Y,X15 為F或Y,且X16 為F或L。
- 一種抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區包含: a) HCDR1包含選自SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:13之序列, b) HCDR2包含選自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19及SEQ ID NO:22之序列,以及 c) HCDR3包含選自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:21之序列, 及/或 輕鏈可變區包含: d) LCDR1包含如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:20所示之序列, e) LCDR2包含如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:16所示之序列,以及 f) LCDR3包含選自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:18之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區選自下群: 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列; 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列; 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列; 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列; 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;以及 包含HCDR1、HCDR2及HCDR3之重鏈可變區,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中上述輕鏈可變區選自下群: 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列; 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列; 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列; 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列; 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列; 包含LCDR1、LCDR2及LCDR3之輕鏈可變區,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中: 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:3所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列; 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:7所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:8所示之序列; 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:9所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:11所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:10所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列; 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:13所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:15所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:17所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:2所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:12所示之序列; 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:19所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:21所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:14所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:16所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:18所示之序列;或 上述重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2及HCDR3,上述HCDR1包含如SEQ ID NO:1所示之序列,上述HCDR2包含如SEQ ID NO:22所示之序列,上述HCDR3包含如SEQ ID NO:5所示之序列;且,上述輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2及LCDR3,上述LCDR1包含如SEQ ID NO:20所示之序列,上述LCDR2包含如SEQ ID NO:4所示之序列,上述LCDR3包含如SEQ ID NO:6所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其進一步包含一或多個重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4,及/或一或多個輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4,其中: 上述HFR1包含QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYX17 FT (SEQ ID NO:54)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述HFR2包含WVX18 QAPGQGLEWX19 G (SEQ ID NO:55)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述HFR3序列包含RVTX20 TIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:56)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述HFR4包含WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:57)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述LFR1包含DIVMTQSPDSLAVSLGERATX21 NC (SEQ ID NO:58)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述LFR2包含WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO:59)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 上述LFR3包含GVPDRFX22 GSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO:60)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列,以及 上述LFR4包含FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:61)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列, 其中X17 為T或S,X18 為R或K,X19 為M或I,X20 為M或L,X21 為I或M,且X22 為S或T。
- 如請求項21之抗體或其抗原結合片段,其中: 上述HFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:62及63, 上述HFR2包含選自下群之序列:SEQ ID NO:64及65, 上述HFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:66及67, 上述HFR4包含如SEQ ID NO:57所示之序列, 上述LFR1包含選自下群之序列:SEQ ID NO:68及69, 上述LFR2包含如SEQ ID NO:59所示之序列, 上述LFR3包含選自下群之序列:SEQ ID NO:70及71,以及 上述LFR4包含如SEQ ID NO:61所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中上述重鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45及SEQ ID NO:47,及與上述序列具有至少80%序列同一性但仍保留與CLDN18.2之特異性結合親和力之同源序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中上述輕鏈可變區包含選自下群之序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48,及與上述序列具有至少80%序列同一性但仍保留與CLDN18.2之特異性結合親和力之同源序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其中, 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:23所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:24所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:25所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:26所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:27所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:28所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:29所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:26或28所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:37所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:38所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:39所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:40所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:41所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:42所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:43所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:44所示之序列; 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:45所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:46所示之序列;或者 上述重鏈可變區包含如SEQ ID NO:47所示之序列,且上述輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:48所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其進一步包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾但仍保留與人CLDN18.2之特異性結合親和力。
- 如請求項26之抗體或其抗原結合片段,其中至少一個上述取代或修飾係在一或多個CDR序列中,及/或在一或多個上述VH或VL序列之非CDR區域中。
- 如請求項16至27中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中上述抗體與抗原決定基結合,上述抗原決定基包含具有如SEQ ID NO:30所示之胺基酸序列之人CLDN18.2之D28、W30、V43、N45、Y46、L49、W50、R51、R55、E56、F60、E62、Y66、L72、L76、V79及R80位處之至少一個、兩個或三個胺基酸殘基。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其進一步包含免疫球蛋白恆定區,可選地人Ig之恆定區,或可選地人IgG之恆定區。
- 如請求項29之抗體或其抗原結合片段,其中上述恆定區包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之恆定區。
- 如請求項30之抗體或其抗原結合片段,其中上述人IgG1之恆定區包含SEQ ID NO:49或與其具有至少80%序列同一性之同源序列。
- 如請求項29至31中任一項之抗體或其抗原結合片段,其中上述恆定區包含一或多個胺基酸殘基取代或修飾,上述胺基酸殘基取代或修飾導致了相對於野生型恆定區增加之CDC或ADCC。
- 如請求項32之抗體或其抗原結合片段,其中上述恆定區包含針對SEQ ID NO:49中之一或多個胺基酸殘基取代,上述取代選自下群:L235V、F243L、R292P、Y300L、P396L或其任何組合。
- 如請求項33之抗體或其抗原結合片段,其中上述恆定區包含如SEQ ID NO:51所示之序列。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其為人源化的。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其為非岩藻糖基化的。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定之雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價之雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體或雙價域抗體。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其為雙特異性的。
- 如請求項38之抗體或其抗原結合片段,其能夠與CLDN18.2之第一及第二抗原決定基特異性結合,或能夠與CLDN18.2及第二抗原特異性結合。
- 如請求項39之抗體或其抗原結合片段,其中上述第二抗原為免疫相關靶標,其可選地選自下群:PD-L1、PD-L2、PD-1、CLTA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、ICOS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-15、CD3、CD16及CD83。
- 如請求項39之抗體或其抗原結合片段,其中上述第二抗原包含腫瘤抗原。
- 如請求項41之抗體或其抗原結合片段,其中上述腫瘤抗原存在於表現CLDN18.2之細胞中。
- 如請求項42之抗體或其抗原結合片段,其中上述腫瘤抗原包含CA-125、神經節苷脂G(D2)、G(M2)及G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、蛙皮素樣肽(bombesin-like peptides)、PSA、HER2/neu、表皮生長因子受體(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌相關黏蛋白、VEGF、VEGFR (例如VEGFR3)、雌激素受體、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受體、EGFα、c-Kit受體、運鐵蛋白受體、IL-2R或CO17-1A。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其能夠與小鼠CLDN18.2特異性結合。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其不與人CLDN18.1結合。
- 如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,其與一或多個綴合部分連接。
- 如請求項46之抗體或其抗原結合片段,其中上述綴合部分包含清除修飾劑(clearance-modifying agent)、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素,發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑或其他抗癌藥物。
- 一種抗體或其抗原結合片段,其與如請求項1至6及16至47中任一項之抗體或其抗原結合片段競爭以結合CLDN18.2。
- 一種組合物,其包含如請求項1至48中任一項之抗CLDN18.2抗體或其抗原結合片段,其中上述抗體或其抗原結合片段為非岩藻糖基化的。
- 如請求項49之組合物,其中根據EU編號系統,上述組合物中之上述抗CLDN18.2抗體在Asn297處之岩藻糖含量為寡糖總量之60%或更少(例如,少於55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%)。
- 一種藥物組合物,其包含如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段,以及一或多種藥學上可接受之載體。
- 一種分離之聚核苷酸,其編碼如前述任一請求項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體,其包含如請求項52之分離之聚核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項53之載體。
- 一種表現如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法,其包括在表現如請求項53之載體之條件下培養如請求項54之宿主細胞。
- 一種在將自CLDN18.2活性之調節中受益之受試者中治療疾病或病況之方法,上述方法包括向上述受試者施用治療有效量之如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項51之藥物組合物。
- 如請求項56之方法,其中上述疾病或病況為CLDN18.2相關之疾病或病況。
- 如請求項57之方法,其中上述疾病或病況為癌症,可選地為表現CLDN18.2之癌症。
- 如請求項56至58中任一項之方法,其中上述受試者被鑑定為具有表現CLDN18.2之癌細胞。
- 如請求項59之方法,其中上述受試者被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞或CLDN18.2低表現癌細胞。
- 如請求項60之方法,其中上述CLDN18.2高表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少2+之強度及以IHC中至少40%之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;上述CLDN18.2中等表現癌細胞以如藉由IHC所測定之至少1+且低於2+之強度及以IHC中至少30%但低於40%之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2;且上述CLDN18.2低表現癌細胞以如藉由IHC所測定之高於0但低於1+之強度及以IHC中高於0但低於30%之細胞為陽性染色之水準表現CLDN18.2。
- 如請求項56至61中任一項之方法,其中上述癌症為胃癌(gastric cancer)、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、脊柱癌、腦癌、宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、肛門癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、胃癌(stomach cancer)、陰道癌、甲狀腺癌、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤及腺癌。
- 如請求項56至62中任一項之方法,其中上述受試者為人。
- 如請求項56至63中任一項之方法,其中上述施用為經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內施用。
- 如請求項56至64中任一項之方法,其進一步包括施用治療有效量之第二治療劑。
- 如請求項65之方法,其中上述第二治療劑選自化療劑、抗癌藥、放射治療、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑或細胞因子。
- 一種套組,其包含如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段,以及第二治療劑。
- 一種在表現CLDN18.2之細胞中調節CLDN18.2活性之方法,上述方法包括將上述表現CLDN18.2之細胞暴露於如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種偵測樣品中CLDN18.2之存在或含量之方法,上述方法包括將上述樣品與如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸,以及確定上述樣品中CLDN18.2之存在或含量。
- 一種在受試者中診斷CLDN18.2相關之疾病或病況之方法,上述方法包括:a)將自上述受試者獲得之樣品與如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸;b)測定上述樣品中CLDN18.2之存在或含量;以及c)將上述CLDN18.2之存在或含量與上述受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之存在或狀態相關聯。
- 一種如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段在製備用以治療受試者中CLDN18.2相關疾病或病況之藥物之用途。
- 一種如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段在製備用以診斷CLDN18.2相關疾病或病況之診斷試劑之用途。
- 一種用於偵測CLDN18.2之套組,其包括如請求項1至48中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 一種嵌合抗原受體(CAR),其包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激信號傳導區及TCR信號傳導結構域,其中上述抗原結合結構域與CLDN18.2特異性結合且包含如請求項1至48中任一項之抗原結合片段。
- 如請求項74之CAR,其中上述抗原結合片段為Fab或scFv。
- 如請求項74或75之CAR,其為雙特異性的。
- 如請求項75之CAR,其中上述CAR能夠進一步與CLDN18.2以外之第二抗原或CLDN18.2上之第二抗原決定基特異性結合。
- 如請求項77之CAR,其中上述第二抗原包含腫瘤抗原。
- 一種核酸序列,其編碼如請求項74至78中任一項之嵌合抗原受體(CAR)。
- 一種細胞,其包含如請求項79之核酸序列。
- 一種經基因修飾之細胞,其表現如請求項74至78中任一項之CAR。
- 一種載體,其包含如請求項79之核酸序列。
- 一種在哺乳動物中刺激T細胞介導之對表現CLDN18.2之細胞或組織之免疫應答之方法,上述方法包括向上述哺乳動物施用有效量之經基因修飾之細胞以表現如請求項74至78中任一項之CAR。
- 一種治療具有CLDN18.2相關疾病或病況之哺乳動物之方法,上述方法包括向上述哺乳動物施用有效量之如請求項81之細胞,從而治療上述哺乳動物。
- 如請求項84之方法,其中上述細胞為自體T細胞。
- 如請求項84之方法,其中上述CLDN18.2相關疾病或病況為癌症。
- 如請求項84之方法,其中上述哺乳動物為人受試者。
- 如請求項84之方法,其中上述哺乳動物被鑑定為具有表現CLDN18.2之癌細胞,可選地,上述哺乳動物被鑑定為具有CLDN18.2高表現癌細胞、CLDN18.2中等表現癌細胞或CLDN18.2低表現癌細胞。
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