SK15582003A3 - Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie Download PDF

Info

Publication number
SK15582003A3
SK15582003A3 SK1558-2003A SK15582003A SK15582003A3 SK 15582003 A3 SK15582003 A3 SK 15582003A3 SK 15582003 A SK15582003 A SK 15582003A SK 15582003 A3 SK15582003 A3 SK 15582003A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
antibody
cytotoxic
antibody molecule
adenocarcinoma
maytansinoid
Prior art date
Application number
SK1558-2003A
Other languages
English (en)
Inventor
G�Nther Adolf
Karl-Heinz Heider
Erik Patzelt
Marlies Sproll
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Publication of SK15582003A3 publication Critical patent/SK15582003A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových konjugátov protilátok s cytotoxickými zlúčeninami, farmaceutických prostriedkov obsahujúcich tieto zlúčeniny a ich použitia na nádorovú terapiu.
Doterajší stav techniky
Bolo množstvo pokusov zlepšiť účinnosť antineoplastických liekov prostredníctvom ich konjugácie s protilátkami proti antigénom asociovaným s tumormi, aby sa zvýšila lokálna koncentrácia lieku prostredníctvom cieleného dodávania do nádoru. Mnohé z týchto prístupov sa stretli s obmedzeným úspechom a v literatúre bolo diskutovaných niekoľko dôvodov na vysvetlenie tohto zlyhania. Pre protirakovinové lieky, ktoré účinkujú stechiometricky, ako napríklad doxorubicín alebo metotrexát, sú nevyhnutné relatívne vysoké vnútrobunkové koncentrácie, aby vykazovali požadovanú cytotoxicitu. Tieto koncentrácie sú považované za ťažko dosiahnuteľné s mnohými konjugátmi protilátka-liečivo, kvôli (a) nedostatočnému účinku mnohých bežných protirakovinových liekov, (b) nízkej bunkovej povrchovej koncentrácii antigénových cieľov, (c) neúčinnej internalizácii komplexov antigénprotilátka do cieľovej bunky a (d) neúčinnému vylučovaniu voľného liečiva z konjugátu vo vnútri cieľovej bunky (Chari a ďalší, 1992).
Dve z vyššie uvedených nevýhod, konkrétne (a) a (d) riešil Chari so spolupracovníkmi (Chari a ďalší, 1992; Liu a ďalší, 1996; US patent č. 5208020). Vyvinuli protilátkové konjugáty, v ktorých je protilátka spojená s maytanzinoidom prostredníctvom disulfidovej väzby. Maytanzíny patria do triedy Ansa makrolidových antibiotík, izolovaných zNocardia sp.. Maytanzín anazamitocín P-3, produkovaný bakteriálnou fermentáciou, sa používa ako prekurzorová molekula na výrobu maytanzinoidu DM1. Maytanzín a deriváty fungujú ako antimitotické látky (inhibítory tubilínovej polymerizácie), podobne ako vicristín, alebo so značne vyššou účinnosťou ako vinkristín alebo iné zavedené chemoterapeutiká (DM1 je toxický pre
-2bunky in vitro v koncentrácii približne 1O'10 M). Na rozdiel od vysokej cytotoxicity voľného maytanzinoidu, protilátkový konjugát má toxicitu, ktorá je o niekoľko rádov nižšia v antigén negatívnych bunkách v porovnaní s antigén pozitívnymi bunkami. Spojenie disulfidovou väzbou má tú výhodu, že tieto väzby sú ľahko rozštiepiteľné vo vnútri cieľových buniek vnútrobunkovým glutatiónom, čo uvoľňuje vysoko toxické voľné liečivo. Tento prístup bol aplikovaný na protilátky proti antigénom asociovaným s tumorom, napríklad C424-DM1 konjugát (Liu a ďalší, 1996; Lambert a ďalší, 1998) a HuN901-DM1 (Chari a ďalší, 2000). Avšak použitie týchto konjugátov je obmedzené kvôli limitovanej expresii príslušných cieľových antigénov. Napríklad antigén rozoznávaný s N901 (CD56, N-CAM) je predominantne exprimovaný nádormi neuroendokriného pôvodu, expresia C424 antigénu (CanAg) je v prevažnej miere obmedzená na nádory odvodené z Gl traktu.
Avšak stále existuje potreba zlepšiť tento prístup nájdením vhodných protilátok asociovaných s tumorom s výhodným antigénovým expresným vzorom, vysokou a špecifickou koncentráciou bunkového povrchového antigénu v cieľovom tkanive a s účinným internalizačným procesom transportujúcim komplex antigénprotilátka do buniek.
CD44 je proteín, ktorý sa exprimuje v niekoľkých rozličných izoformách na povrchu širokého rozsahu bukových typov. Najmenšia izoforma, štandardný CD44 (CD44s), ktorá je exprimovaná rôznymi odlišnými bunkami, je považovaná za sprostredkovateľa bunkového pripojenia na extracelulárne matricové komponenty, a považuje sa za izoformu, ktorá môže prenášať ko-stimuly pri lymfocytovej a monocytovej aktivácii. Naopak, expresia zostrihových variantov CD44, ktoré obsahujú doménu v6 (CD44v6) v extracelulárnej oblasti, je obmedzená na podsadu epitelu. Fyziologická úloha CD44v6 ešte nie je úplne pochopená.
Ukázalo sa, že CD44v6, ako aj iné variantové exóny (CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44v10) sú antigény asociované s tumorom s výhodným expresným vzorom v ľudských nádoroch a v normálnych tkanivách (Heider a ďalší, 1995; Heider a ďalší, 1996; Dali a ďalší, 1996; Beham-Schmid a ďalší, 1998; Tempfer a ďalší, 1998; Wager a ďalší, 1998) a podrobili sa diagnostickým a terapeutickým prístupom založeným a protilátke, najmä rádioimunoterapii (RIT) tumorov (Verel a ďalší, 2002; Stromer a ďalší, 2000; WO 95/33771; WO 97/21104).
-3Avšak nevyhnutným predpokladom na účinné usmrcovanie nádorových buniek protilátkovými maytanzinoidovými konjugátmi je dostatočná internalizácia cieľového antigénu. Dostupných je len málo údajov o internalizácii CD44. Bažil a Horejsi publikovali, že znížená regulácia CD44 na leukocytoch po stimulácii s PMA je spôsobená roztratením antigénu a nie internalizáciou (Bažil a Horejsi, 1992). Roztrácanie CD44 je podporené aj niekoľkými publikáciami o rozpustnom CD44 v sére pacientov s národom a normálnych jedincov (Sliutz a ďalší, 1995; Guo a ďalší, 1994; Martin a ďalší, 1997). V najnovšej publikácii od Aguaira a ďalších sa množstvo internalizovaného CD44 na chondrocytoch s intaktnou matricou determinovalo ako približne 6 % po 4 hodinách (Aguiar a ďalší, 1999). Podobné nízke hladiny internalizovaného CD44v6 na nádorových bunkách sa zistili v experimentoch uskutočňovaných prostredníctvom BIA. Možno zhrnúť, že tieto údaje naznačujú, že CD44 receptory sú pravdepodobnejšie predmetom roztrácania ako internalizácie, takže CD44 špecifické protilátky nie sú považované za vhodných kandidátov na prístup konjugovania s maytanzinoidom. Toto bolo podporené in vitro bunkovými proliferačnými testami, pri ktorých sa ukázalo, že AbCD44v6-DM1 má len miere zvýšenú cytotoxicitu oproti antigén-prezentujúcim bunkách, v porovnaní s bunkami bez antigénu.
Teraz sa neočakávane zistilo, že CD44 špecifické protilátky konjugované s vysoko cytotoxickými liekmi prostredníctvom spojovníka, ktorý sa štiepi v intraceulárnych podmienkach, sú veľmi účinnými nádorovými terapeutikami in vivo.
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje nové zlúčeniny pozostávajúce z CD44 špecifickej protilátkovej molekuly konjugovanej s vysoko cytotoxickým liečivom prostredníctvom spojovníka, ktorý je štiepený v intracelulárnych podmienkach.
Podstatou vynálezu je teda zlúčenina všeobecného vzorca I kde
A(LB)n
O)
-4A znamená protilátkovú molekulu, ktorá je špecifická pre CD44;
L znamená spojovníkovú skupinu:
B znamená zlúčeninu, ktorá je toxická pre bunky; a n je desiatkové číslo od 1 do 10.
Protilátková molekula A má väzobnú špecificitu pre CD44, výhodne pre variant CD44.
Výraz „protilátková molekula“ má zahŕňať kompletné imunoglobulíny, ako sú produkované lymfocytmi a ako sú prítomné napríklad v krvnom sére, monoklonálne protilátky vylučované hybridómovými bunkovými líniami, polypeptidy produkované rekombinantnou expresiou v hostiteľských bunkách, ktoré majú väzobnú špecificitu imunoglobulínov alebo monoklonálnych protilátok, a molekuly, ktoré boli odvodené od takýchto imunoglobulínov, monoklonálnych protilátok alebo polypeptidov ďalším spracovaním, pričom si zachovávajú svoju väzobnú špecificitu. Výraz „protilátková molekula“ zahŕňa kompletné imunoglobulíny obsahujúce dva ťažké reťazce a dva ľahké reťazce, fragmenty takýchto imunoglobulínov, ako Fab, Fab' alebo F(ab)2 fragmenty (Kreitman a ďalší, 1993), rekombinantne produkované polypeptidy, ako chimerické, humanizované alebo kompletné ľudské protilátky (Breitling a Duebel, 1999; Shin a ďalší, 1989; Gussow a Seeman, 1991; Winter a ďalší, 1994, EP 0239400; EP 0519596; WO 90/07861, EP0368684; EP0438310; WO 92/07075; WO 92/22653; EP0680040; EP 0451216), jednoreťazcové protilátky (svFv, Johnson a Bird, 1991) a podobne. Dnes je možné protilátky produkovať bez imunizácie laboratórnych zvierat, napr. metódami fágového displeja (Aujame a ďalší, 1997; US5885793; US5969108; US6300064; US6248516, US6291158). Kompletné ľudské protilátky môžu byť produkované použitím transgénnych myší nesúcich funkčné ľudské Ig gény (EP0438474; EP0463151; EP0546073). Z vyššie uvedených citácií literatúry bude odborník vedieť ako vyrobiť tieto typy protilátkových molekúl, využijúc metódy stavu techniky, ako sú automatizovaná syntéza peptidov a nukleových kyselín, imunizácia laboratórnych zvierat, hybridómové technológie, polymerázová reťazová reakcia (PCR), vektorové a expresné technológie, hostiteľské bunkové kultúry a proteínové purifikačné metódy. V nasledujúcom texte sú výrazy „protilátka“ a „protilátková molekula“ používané zameniteľné.
-5„Špecifický pre CD44“ znamená, že protilátková molekula má špecifickú väzobnú afinitu pre epitop prítomný v CD44. Vo výhodnom uskutočnení má protilátková molekula podľa vynálezu väzobnú špecificitu pre aminokyselinovú sekvenciu kódovanú variantovým exónom v6 ľudského CD44 génu. Sekvencia variantového exónu v6, ako aj sekvencia iných variantových exónov, je v oblasti známa (Screaton a ďalší, 1992; Tôlg a ďalší, 1993; Hofmann a ďalší, 1991). Výhodná protilátková molekula podľa vynálezu špecificky viaže peptidy alebo polypeptidy majúce alebo obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu č. 1 z priloženého zoznamu sekvencií, alebo alelický variant uvedenej sekvencie. Výhodne má protilátková molekula väzobnú špecificitu pre epitop vo vnútri uvedenej sekvencie. Výhodnejšie sa protilátková molekula špecificky viaže na peptid majúci aminokyselinovú sekvenciu č. 2, ešte výhodnejšie majúci aminokyselinovú sekvenciu č. 3. Takéto protilátkové molekuly môžu byť jednoducho produkované spôsobmi známymi v oblasti (WO 95/33771, WO 97/21104), napr. imunizovaním laboratórnych zvierat s chemicky syntetizovanými peptidmi, ktoré majú vyššie uvedené sekvencie, napr. naviazanými na haptén, alebo imunizáciou s rekombinantne produkovaným fúzovaným proteínom zahŕňajúcim uvedené sekvencie a postupovaním v súlade s metódami známymi v oblasti (Harlow 1988; Catty 1988; Koopman a ďalší, 1993; Heider a ďalší, 1993).
Výhodne je protilátkovou molekulou podľa vynálezu myšacia monoklonálna protilátka s označením VFF-18, ktorá je produkovaná hybridómovou bunkovou líniou, ktorá bola uložená 7. júna 1994 pod prístupovým číslom DSM ACC2174 v DSM-Deutsche Sammlug fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Macheroder Weg 1b, D-38124 Brunschweig, Nemecko. Výhodné sú aj Fab, Fab' alebo F(ab)2 fragmenty uvedenej monoklonálnej protilátky VFF-18. Vínom výhodnom uskutočnení je protilátkovou molekulou humanizovaná rekombinantná protilátka, pričom sú komplementaritu determinujúce oblasti (CDR's) VFF-18 zaštepené do príslušných génov ľudských imunoglobulínových ťažkých a ľahkých reťazcov.
Pod „komplementaritu determinujúcimi oblasťami“ monoklonálnej protilátky sa rozumejú tie aminokyselinové sekvencie, ktoré sa podieľajú na špecifickom
-6antigénovom viazaní podľa Kabáta a ďalších, 1991, v spojitosti s Chothia a Lesk, 1987.
V inom výhodnom uskutočnení sa vhodné kostrové zvyšky takejto CDRzaštepenej protilátky revertujú na myšacie zvyšky, aby sa zlepšila väzobná afinita. Na základe relevantných známych spôsobov odborníci vedia ako získať CDR's VFF-18, vychádzajúc z vyššie uvedeného hybridómu s prístupovým číslom DSM ACC2174, aby zvolili a získali vhodné ľudské imunoglobulínové gény na zaštepenie CDR's týchto génov, aby sa modifikovali vybrané kostrové zvyšky, aby sa exprimovala CDR-zaštepená protilátka v príslušných hostiteľských bunkách, napr. vo vaječníkových bunkách čínskeho škrečka (CHO), a na testovanie výsledných rekombinantných protilátok na väzobnú afinitu a špecificitu (pozri napr. citácie literatúry vyššie). V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátkovou molekulou rekombinantná protilátka majúca CDR's protilátky VFF-18. Výhode je takouto rekombinantnou protilátkou humanizovaná protilátka a je kompletným imunoglobulínom pozostávajúcim z dvoch kompletných ľahkých a dvoch kompletných ťažkých reťazcov. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátkovou molekulou rekombinantná protilátka majúca rovnaký idiotyp ako protilátka VFF-18. V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je protilátkovou molekulou rekombinantná protilátka viažuca sa na rovnaký epitop ako protilátka VFF-18.
Vo výnimočne výhodnom uskutočnení je protilátkovou molekulou A protilátka obsahujúca ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6. Táto protilátka sa označuje BIWA 4. Je humanizovanou verziou protilátky VFF-18 uvedenej vyššie, pričom má komplementaritu determinujúce oblasti myšacej monoklonálnej protilátky VFF-18 v kompletnej humánnej kostre a humánne konštantné oblasti. Je preto protilátkou s veľmi nízkou imunogénnosťou u človeka, čo je výhodnou črtou. Avšak, keďže neobsahuje myšacie kostrové zvyšky na optimalizáciu antigénového viazania, má významne nižšiu antigénovú väzobnú afinitu ako jej rodičovská protilátka VFF-18, a preto by nemohla byť považovaná za dobrého kandidáta na terapeutické liečivo. Neočakávane sa zistilo, že BIWA 4, napriek jej slabej väzobnej afinite, má veľmi výhodnú biodistribúciu a nádorový príjem in vivo, čo ju robí vynikajúcou oproti iným humanizovaným verziám VFF-18 s vyššou väzobnou afinitou (Verel a ďalší, 2002).
-7V ďalšom výhodnom uskutočnení je protilátkovou molekulou A protilátka obsahujúca ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 8 a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6. Táto protilátka má vyššiu väzobnú afinitu ako BIWA 4 a označuje sa BIWA 8.
Tieto protilátky môžu byť produkované nasledovne. Nukleokyselinové molekuly kódujúce ľahký reťazec a ťažký reťazec môžu byť syntetizované chemicky a enzymaticky štandardnými metódami. Najprv sa môžu syntetizovať vhodné oligonukleotidy metódami známymi v oblasti (napr. Gait, 1984), ktoré sa môžu použiť na produkciu syntetického génu. Spôsoby na generovanie syntetických génov z oligonukleotidov sú v oblasti známe (napr. Stemmer a ďalší, 1995; Ye a ďalší, 1992; Hayden a Mandecki 1988; Frank a ďalší 1987). Výhodne má nukleokyselinové molekula kódujúca ľahký reťazec BIWA 4 nukleotidovú sekvenciu č. 5 a nukleokyselinová molekula kódujúca ťažký reťazec BIWA 4 má nukleotidovú sekvenciu č. 7. Tieto sekvencie zahŕňajú sekvencie kódujúce vedúce peptidy, ktoré sú štiepené hostiteľskou bunkou (sekv. č. 5: prvých 60 nukleotidov; sekv. č. 7: prvých 57 nukleotidov). V ďalšom uskutočnení má nukleokyselinová molekula kódujúca ľahký reťazec protilátkovej molekuly podľa vynálezu nukleotidovú sekvenciu č. 9 a nukleokyselinová molekula kódujúca ťažký reťazec protilátkovej molekuly podľa vynálezu má sekvenciu č. 7. Tieto nukleokyselinové molekuly kódujúce protilátkové ťažké a ľahké reťazce sa potom môžu klonovať do expresného vektora (buď oba reťazce v jednej vektorovej molekule, alebo každý reťazec v separátnej vektorovej molekule), ktorý sa potom zavedie do hostiteľskej bunky. Expresné vektory vhodné na imunoglobulínovú expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách a spôsoby zavádzania vektorov do hostiteľských buniek sú dobre známe v oblasti. Vo všeobecnosti je v ňom imunoglobulínový gén funkčne spojený s vhodným promótorom, ako napríklad s ľudským cytomegalovírusovým (CMV) promótorom, škrečkovým ubikvitínovým promótorom (WO 97/15664) alebo promótorom s opičieho vírusu SV40, ktorý je lokalizovaný upstream od Ig génu. Na termináciu transkripcie môže byť použité vhodné terminačné/polyadenylačné miesto ako miesto zbovinného rastového hormónu alebo z SV40. Okrem toho môže byť zahrnutá zosilňujúca sekvencia, ako napríklad CMV alebo SV40 zosiľovač. Zvyčajne expresný vektor obsahuje aj selekčné
-8markerové gény ako dihydrofolát reduktázový (DHFR), glutamín syntetázový, adenozín deaminázový, adenylát deaminázový gén alebo gény neomycínovej, bleomycínovej alebo puromycínovej rezistencie. Rôzne expresné vektory sú komerčne dostupné od spoločností, ako napríklad Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, Wl alebo BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Na expresiu môžu byť použité napríklad expresné vektory pADCMV1 (CBI GenBank prístupové č. A32111) alebo pAD-CMV19 (NCBI GenBank prístupové č. A32110). Hostiteľskou bunkou je výhode cicavčia hostiteľská bunka, napr. COS, CHO alebo BHK bunka, výhodnejšie vaječníková bunka čínskeho škrečka (CHO), napr. CHO-DUKX (Urlaub a Chasin, 1980), CHO-DG44 (Urlaub a ďalší, 1983) alebo CHO-K1 (ATCC CCL-61) bunka. Hostiteľská bunka sa potom kultivuje vo vhodnom kultivačnom médiu v podmienkach, v ktorých sa produkujú protilátky, a protilátka sa potom izoluje z kultúry podľa štandardných procedúr. Postupy na produkciu protilátok z rekombinantnej DNA v hostiteľských bunkách a príslušné expresné vektory sú známe v oblasti (pozri napr. WO 94/11523, WO 97/9351, EP0481790, EP 0669986).
Na pripojenie protilátkovej molekuly A k zlúčenine B, ktorá je pre bunky toxická, sa používa spojovacia skupina L. V najjednoduchšom prípade je spojovacou skupinou L chemická väzba, výhodne kovalentné väzba, ktorá sa štiepi v intracelulárnych podmienkach. V jednom uskutočnení podľa vynálezu je väzba medzi sírovým atómom prítomným v protilátkovej molekule, napr. v bočnom reťazci cysteínového zvyšku, a druhým sírovým atómom nachádzajúcim sa v toxickej skupine. V inom uskutočnení spojovacia skupina L pozostáva z jedného alebo viacerých atómov alebo chemických skupín. Vhodné spojovacie skupiny sú dobre známe v oblasti a zahŕňajú disulfidové skupiny, tioéterové skupiny, kyslé labilné skupiny, fotolabilné skupiny, peptidázové labilné skupiny a esterázové labilné skupiny. Výhodné sú disulfidové skupiny a tioéterové skupiny.
Konjugáty protilátkových molekúl podľa vynálezu a toxickej zlúčeniny môžu byť vytvorené použitím ktorejkoľvek z techník v súčasnosti známej v oblasti alebo techník, ktoré budú vyvinuté neskôr. Toxická zlúčenina môže byť modifikovaná, aby sa získala voľná aminoskupina a potom sa môže pripojiť na protilátkovú molekulu prostredníctvom spojovníka labilného v kyslom prostredí alebo fotolabilného
-9spojovníka. Toxická zlúčenina môže byť kondenzovaná s peptidom a následne spojená s protilátkovou molekulou, aby sa vytvoril spojovník citlivý na peptidázu. Toxická zlúčenina sa môže ošetriť, aby sa získala primárna hydroxylová skupina, ktorá môže byť sukcinylovaná a spojená s protilátkovou molekulou, aby sa vytvoril konjugát, ktorý môže byť štiepený intracelulárnymi esterázami, aby sa uvoľnilo voľné liečivo. Najvýhodnejšie je toxická zlúčenina ošetrená tak, aby sa vytvorila voľná alebo chránená tiolová skupina a potom sa jedna alebo viaceré disulfid alebo tiol-obsahujúce toxické zlúčeniny kovalentne naviažu na protilátkovú molekulu prostredníctvom disulfidovej väzby (väzieb).
Napríklad protilátkové molekuly môžu byť modifikované so zosieťovacími reakčnými činidlami, ako napríklad s /V-sukcínimidyl-3-(2-pyridylditio)propionátom (SPDP), 4-sukcínimidyl-oxykarbonyl-a-metyl-a-(2-pyridyltitio)-toluénom (SMPT), Nsukcínimidyl-3-(2-pyridylditio)-butyrátom (SDPB), A/-sukcínimidyl-4-(2-pyridylditio)pentanoátom (SPP), /V-sukcínimidyl-5-(2-pyridylditio)petanoátom, 2-iminotiolanom alebo anhydridom kyseliny acetyljantárovej, známymi spôsobmi. Pozri Carlsson a ďalší, 1978; Blattler a ďalší 1985; Lambert a ďalší, 1983; Klotz a ďalší, 1962; Liu a ďalší, 1979; Blakey a Thorpe, 1988; Worrell a ďalší, 1986. Vo výhodnom uskutočnení je spojovníkovou časťou 4-tiopentanoát odvodený od SPP alebo 5-tiopetanoát. Takto odvodená protilátková molekula obsahujúca voľnú alebo chránenú tiolovú skupinu potom reaguje s disulfid- alebo tiol-obsahujúcou toxickou zlúčeninou, čim sa produkujú konjugáty. Konjugáty sa môžu purifikovať prostredníctvom HPLC alebo gélovou filtráciou.
„Toxická“ je zlúčenina, ktorá inhibuje alebo zabraňuje funkcii buniek a/alebo spôsobuje bunkovú deštrukciu. Toxické zlúčeniny používané na párovanie môžu fungovať buď ako cytostatiká, alebo cytotoxicky a vedú k zastaveniu bunkového cyklu alebo k bunkovej smrti. Tieto zlúčeniny môžu účinkovať v rôznych štádiách počas bunkového cyklu, napr. prostredníctvom interferencie s nukleokyselinovou syntézou, prostredníctvom inaktivácie nukleových kyselín alebo viazaním na tubulín.
Vo výhodnom uskutočnení zlúčeninou B, ktorá je toxická pre bunky, je maytanzinoid, tzn. derivát maytanzínu (CAS 35846538). Vo výhodnom uskutočnení je to C-3 ester maytanzinolu. Maytanzinoidy vhodné na konjugáciu s protilátkami na použitie pri rakovinovej terapii, vrátane prípravy uvedených maytanzinoidov a ich
-10pripojenia na protilátkové molekuly, bola opísaná v Chari a spolupracovníci (Chari a ďalší, 1992; Liu a ďalší, 1996; US patet č. 5208020). Tieto maytanzinoidy môžu byť použité pre predložený vynález. Vo výhodnom uskutočnení je toxickou zlúčeninou N2'-deacetyl-N2,-(3-merkapto-1-oxopropyl)-maytanzín (CAS číslo 139504-50-0), označovaný aj ako DM1. Výhode je maytanzinoidom maytanzinolový derivát spojený s protilátkovou molekulou prostredníctvom disulfidového mostíka v C-3 polohe maytanzinolu. Vo výnimočne výhodnom uskutočnení sa protilátka/maytanzinoidový konjugát môže pripraviť z maytanzinoidu všeobecného vzorca II
R3 O
(CH2)mSR1 (N) kde
R1 znamená H alebo SR4, kde R4 znamená metyl, etyl, lineárny alkyl, rozvetvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý alebo substituovaný aryl alebo heterocyklickú zlúčeninu;
R2 znamená Cl alebo H;
R3 znamená H alebo CH3; a m znamená 1,2 alebo 3.
Výhodne R1 znamená H, CH3 alebo SCH3, R2 znamená Cl, R3 znamená CH3 a m = 2.
V literatúre je ako DM1 označená zlúčenina, v ktorej R1 = H, R2 = Cl, R3 = CH3 a m = 2.
-11 Vo výhodnom uskutočnení má zlúčenina podľa vynálezu všeobecný vzorec III
kde
A znamená protilátkovú molekulu, ktorá je špecifická pre CD44, výhodne špecifická pre variantový exón v6, výhodne špecifická pre aminokyselinovú sekvenciu č. 3;
(Ľ) znamená voliteľnú spojovníkovú časť;
p je desiatkové číslo od 1 do 10.
Výhodne p je 3 až 4, výhodnejšie približne 3,5.
Spôsoby prípravy takýchto maytanzinoidov sú v oblasti známe (pozri najmä US5208020, príklad 1). Prakticky, v prvom kroku môže byť maytanzinoidový C-3 ester anzamitocíu P3 produkovaný bakteriálnou fermentáciou mikroorganizmov patriacich do rodu Nocardia alebo Actinosynnemma, napr. ATCC 31565, ATCC 31281 (US 4356265; US 4450234; WO 01/77360). Ansamitocín P3 sa môže extrahovať z kultúry použitím organických rozpúšťadiel, ako napríklad etylacetátu alebo toluénu, a ďalej sa môže purifikovať prostredníctvom adsorpčnej chromatografie použitím napr. silikagélu. Potom sa môže redukovať na maytazinol použitím LiAIH4 (US 4360462) alebo, ako je modernejšie navrhované, použitím LiAI(Ome)3H alebo iných LiAl alebo NaAI hydridov (WO 02/16368). Maytanzinol potom môže byť esterifikovaný v C-3 polohe s A/-metyl-L-alanínom alebo /V-metyl-L-cysteínovými derivátmi, aby sa získal disulfid obsahujúci maytanzioid (US 5208020; US 5416064;
-12US 6333410), napríklad použitím dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a katalytických množstiev chloridu zinočnatého (US 4137230; US 4260609). Vo výhodnom uskutočnení je maytanziol esterifikovaný so zlúčeninou /\/-metyl-/V-(3-metylditiopropanoyl)-L-alanínom vzorca
HO
aby vznikol maytanzinoid všeobecného vzorca II, kde R1 = SR4, R4 = CH3, R2 = Cl, R3 = CH3 a m = 2.
Voľná tiolová skupina sa potom môže uvoľniť prostredníctvom štiepenia disulfidovej väzby s ditiotreitolom (DTT), aby vznikol napr. DM1.
Pri intracelulárnom štiepení sa uvoľňuje voľná toxická zlúčenina z konjugátu A(LB)n. Voľné liečivo uvoľnené zo zlúčeniny A(LB)n môže mať vzorec B-X, kde X znamená atóm alebo chemickú skupinu, v závislosti na povahe štiepiacej reakcie. Výhodne X znamená vodíkový atóm, ako napríklad v prípade, keď je spojovníkovou skupinou len kovalentná väzba medzi dvoma atómami síry, alebo hydroxylovú skupinu. Štiepne miesto môže byť aj vo vnútri spojovníkovej skupiny, ak je spojovníkovou skupinou chemická skupina, pričom sa generuje voľné liečivo všeobecného vzorca B-L-X po štiepení, kde X znamená atóm alebo chemickú skupinu v závislosti na povahe štiepiacej reakcie. Výhodne X znamená vodíkový atóm alebo hydroxylovú skupinu.
Vo výhodnom uskutočnení je zlúčenina všeobecného vzorca I menej toxická ako toxická zlúčenia B, B-X alebo B-Ľ'-X uvoľňovaná po intracelulárnom štiepení. Spôsoby testovania cytotoxicity in vitro sú v oblasti známe (Goldmacher a ďalší, 1985; Goldmacher a ďalší, 1986; pozri aj US 5208020, príklad 2). Výhodne je zlúčenina I 10 násobne alebo viac, výhodnejšie 100 násobne alebo aj 1000 násobne alebo viac, menej toxická ako voľné liečivo uvoľňované po štiepení.
Výhodné konjugáty protilátková molekula/maytanzinoid sú tie, ktoré sú spojené disulfidovou väzbou, ako bolo diskutované vyššie, ktoré sú schopné dodávať maytanzinoidové molekuly. Takéto bunkové väzobné konjugáty sa
-13pripravujú známymi metódami, ako napríklad modifikovaním monoklonálnych protilátok so sukcinimidyl-pyridyl-ditiopropionátom (SPDP) alebo pentanoátom (SPP) (Carlsson a ďalší, 1978). Výsledná tiopyridylová skupina sa potom nahradí ošetrením s tiol-obsahujúcimi maytanzinoidmi, aby sa vyprodukovali disulfidové spojené konjugáty. Alternatíve, v prípade arylditiomaytanzinoidov, sa vytváranie protilátkového konjugátu uskutočňuje priamym nahradením aryl-tiolu maytanzinoidu sulfhydrylovými skupinami, ktoré boli predtým zavedené do protilátkových molekúl. Konjugáty obsahujúce 1 až 10 maytanzinoidových liečiv spojených disulfidovým mostíkom sa jednoducho pripravujú akoukoľvek metódou. V tomto kontexte je desiatkovým číslom n vo vzorci A(LB)n priemerné číslo a nie všetky konjugátové molekuly daného prípravku môžu mať identické celé číslo LB zvyškov pripojených na protilátkovú molekulu.
Konkrétnejšie, roztok ditiopyridylovej modifikovanej protilátky v koncentrácii 1 mg/ml v 0,1 M tlmivom roztoku fosforečnanu draselného, pri pH 7,0, obsahujúci 1 mM EDTA sa ošetrí s tiol-obsahujúcim maytanzinoidom (1,25 molový ekvivalent/ditiopyridylovú skupinu). Uvoľňovanie pyridín-2-tiónu zmodifikovanej protilátky sa monitoruje spektrofotometricky pri 343 nm a ukončuje sa približne za 30 minút. Konjugát protilátka-maytanzinoid sa purifikuje a zbavuje sa nezreagovaného liečiva a iného materiálu s nízkou molekulovou hmotnosťou gólovou filtráciou cez kolónu Sephadex G-25. Počet maytanzinoidov naviazaných na jednu protilátkovú molekulu sa môže determinovať meraním pomeru absorbancie pri 252 nm a 280 nm. Týmto spôsobom je možné disulfidovými väzbami pripojiť priemerne 1 až 10 maytazinoidových molekúl na protilátkovú molekulu.
Ďalší predmet predloženého vynálezu sa týka konjugátu CD44v6 špecifickej protilátkovej molekuly a maytanzinoidu. „CD44v6 špecifický“ tu znamená, že protilátka má špecifickú väzobnú afinitu voči epitopu, ktorý sa nachádza v peptide majúcom aminokyselinovú sekvenciu kódovanú variantovým exónom v6 CD44, výhodne ľudského CD44. Výhodná protilátkové molekula podľa vynálezu sa špecificky viaže na peptidy alebo polypeptidy majúce alebo obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu č. 1 v priloženom zozname sekvencií alebo alelický variant uvedenej sekvencie. Výhodne má uvedená protilátkové molekula väzobnú špecificitu pre epitop vo vnútri uvedenej sekvencie. Výhodnejšie sa protilátkové
-14molekula špecificky viaže na peptid majúci aminokyselinovú sekvenciu č. 2, ešte výhodnejšie majúci aminokyselinovú sekvenciu č. 3.
Výhodne je protilátkovou molekulou uvedeného konjugátu monoklonálna protilátka VFF-18 (DSM ACC2174) alebo rekombinantná protilátka majúca komplementaritu determinujúce oblasti (CDRs) VFF-18. Výhodnejšie uvedená protilátka obsahuje ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4, alebo alternatívne, sekvenciu č. 8, a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6.
Maytanzinoid je výhodne spojený s protilátkou prostredníctvom disulfidovej skupiny a má vzorec IV
kde väzba na protilátku je prostredníctvom atómu síry znázorneného vo vzorci IV a druhého atómu síry nachádzajúceho sa v protilátkovej molekule. Na vytvorenie takéhoto atómu síry vhodného na viazanie, sa môže protilátková molekula modifikovať zavedením vhodného spojovníka, ako je načrtnuté vyššie. Výhodne je maytanzinoid spojený s protilátkovou molekulou cez S-CH2-CH2-CO-, S-CH2CH2CH2CH2-CO- alebo S-CH(CH3)CH2CH2-CO- skupinu. Atóm síry v takejto spojovníkovej skupine tvorí disulfidovú väzbu s maytanzinoidom, pričom karbonylová funkčná skupina môže byť naviazaná na amino funkčnú skupinu nachádzajúcu sa na bočnom reťazci aminokyselinového zvyšku protilátkovej molekuly.
-15Týmto spôsobom môže byť na protilátkovú molekulu pripojený jeden alebo viacero maytanzinoidových zvyškov. Výhode sú na protilátkovú molekulu pripojené 3 až 4 zvyšky.
Najvýhodnejší je konjugát CD44v6 špecifickej protilátkovej molekuly a maytanzinoidu, v ktorom protilátka obsahuje ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6, a v ktorom má maytanzinoid vzorec
a je spojený s protilátkou disulfidovou väzbou. Výhodne je spojovacou skupinou -SCH2CH2CH2CH2-CO- alebo -S-CH(CH3)CH2CH2-CO-, a počet maytanzinoidových zvyškov naviazaných na protilátku je 3 až 4.
V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu výroby zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktorý zahŕňa tieto kroky:
(a) zavedenie voľných alebo chránených tiolových skupín do protilátkovej molekuly, ktorá je špecifická pre CD44;
(b) reagovanie protilátkovej molekuly kroku (a) so zlúčeninou, ktorá je toxická pre bunky, pričom táto zlúčenina má jednu alebo viacero disulfidových alebo tiolových skupín; a (c) izoláciu výsledného konjugátu.
- 16Výhodne je protilátková molekula špecifická pre CD44v6, výhodnejšie špecifická pre aminokyselinovú sekvenciu č. 3. Zlúčenina, ktorá je toxická pre bunky, je výhodne maytanzinoid, výhodnejšie maytanzinoid všeobecného vzorca II, najvýhodnejšie s R1=H, R2=CI, R3=CH3 a m=2. V ďalšom výhodnom uskutočnení protilátka obsahuje ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 alebo sekvenciu č. 8 a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6.
Vo výhodných uskutočneniach takéhoto spôsobu sa na začlenenie voľných alebo chránených tiolových skupín do protilátkovej molekuly môže použiť Nhydroxysukcínimidester kyseliny (2-pyridyl)-3-ditiopropánovej (/V-sukcínimidyl-3-(2pyridylditio)propionát), A/-hydroxy-sukcínimidester kyseliny (2-pyridyl)-3-ditiopentánovej (/V-sukcínimidyl-4-(2-pyridyl-ditio)pentanoát) alebo /V-hydroxysukcínimidester kyseliny (2-pyridyl)-5-ditiopentánovej (A/-sukcínimidyl-5-(2-pyridylditio)pentanoát). Vynález sa týka aj zlúčenín získaných opísaným spôsobom.
V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho zlúčeninu všeobecného vzorca I alebo konjugát, ako je opísaný, výhodne spolu s farmaceutický prijateľným nosičom, excipientom alebo riedidlom.
Vhodné farmaceutický prijateľné nosiče, riedidlá a excipienty sú dobre známe a priemerný odborník v oblasti ich je schopný určiť podľa klinickej situácie. Príklady vhodných nosičov, riedidiel a/alebo excipientov zahŕňajú: (1) Dulbeccov fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, pH približne 7,4, obsahujúci približne 1 mg/ml až 25 mg/ml ľudského sérového albumínu, (2) 0,9% fyziologický roztok (0,9% hmotnosť/objem NaCl) a (3) 5% (hmotnosť/objem) dextróza.
Výhodnejšie je protilátkovou molekulou nachádzajúcou sa vo farmaceutickom prostriedku monoklonálna protilátka VFF-18 alebo rekombinantná protilátka majúca CDR's protilátky VFF-18, výhodne v humánnej kostre. V ďalšom výhodnom uskutočnení protilátka obsahuje ľahké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 alebo č. 8, a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6. Výhodne je toxickou zlúčeninou maytanzinoid všeobecného vzorca II.
Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť použité pre všetky typy klinických a neklinických aplikácií, v ktorých má byť toxická zlúčenina nasmerovaná proti bunkám exprimujúcim CD44, výhodne CD44c6, na bunkovom povrchu.
- 17Konjugát môže byť napríklad klinicky používaný ex vivo na odstránenie nádorových buniek z kostnej drene pred autológnou transplantáciou pri liečbe rakoviny. Liečenie sa môže uskutočňovať nasledovne. Kostná dreň sa izoluje od pacienta alebo iného jedinca a potom sa inkubuje v médiu obsahujúcom sérum, do ktorého sa pridá zlúčenina vzorca I podľa vynálezu v koncentráciách od približne 10 μΜ do 1 pM, na približne 30 minút až približne 48 hodín, pri približne 37 °C. Priemerný odborník v oblasti môže jednoducho determinovať presné koncentračné a časové podmienky inkubovania (= dávka). Po inkubovaní sa bunky kostnej drene premyjú s médiom obsahujúcim sérum a vrátia sa pacientovi i.v. infúziou podľa známych metód. V situáciách, keď pacient podstupuje inú liečbu, ako napríklad kurz ablatívnej chemoterapie alebo ožarovanie celého tela, v čase medzi odobratím drene a reinfúzou ošetrených buniek sa ošetrené dreňové bunky uskladňujú zmrazené v kvapalnom dusíku použitím štandardného medicínskeho vybavenia.
V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu liečenia rakoviny, ktorý zahŕňa aplikovanie farmaceutického prostriedku, ako je opísaný vyššie, pacientovi. Konkrétne sa tento aspekt vynálezu týka spôsobu liečenia rakoviny u pacienta, ktorý to potrebuje, pričom tento spôsob zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny, ako je opísaná vyššie, alebo farmaceutického prostriedku, ako je opísaný vyššie, pacientovi. Výhodne je rakovinou karcinóm skvamóznych buniek (SCC) hlavy a krku, ezofagiálny SCC, pľúcny SCC, kožný SCC, prsníkový adenokarcinóm (AC), pľúcny AC, cervikálny SCC, pankreasový AC, AC hrubého čreva alebo žalúdka.
Na klinické liečenie rakoviny sa zlúčenina všeobecného vzorca I podľa vynálezu bude dodávať ako roztoky, ktoré sa testujú na sterilitu a na hladinu endotoxínov. Príklady vhodných protokolov podávania konjugátu sú nasledovné. Konjugáty sa môžu podávať týždenne 1 až 6 týždňov buď ako i.v. bolus, alebo ako kontinuálna infúzia počas 5 dní. Bolusové dávky sa môžu podávať v 50 až 100 ml normálneho fyziologického roztoku, do ktorého sa pridalo 5 až 10 ml ľudského sérového albumínu. Kontinuálne infúzie sa môžu podávať v 250 až 500 ml normálneho fyziologického roztoku, do ktorého sa pridalo 25 až 50 ml ľudského sérového albumínu, počas 24 hodín. Dávky budú vo všeobecnosti 10 mg až 400 mg/m2 telesného povrchu na aplikáciu. Dávka aplikovaná pacientovi podávaním
- 18musí byť dostatočne vysoká na to, aby bola účinná, ale musí byť pod úrovňou dávky limitovanej toxicitou (DLT). Vo všeobecnosti bude dostatočne tolerovaná dávka pod DLT považovaná za maximálnu tolerovanú dávku (MTD). Odborník vie ako determinovať MTD (Lambert a ďalší, 1998). Na týždenné podávania sa môže očakávať MTD v rozsahu 100 až 20 mg/m2. Alternatívne môžu byť intervaly medzi aplikáciami dlhšie, napr. dva až štyri týždne, výhodne tri týždne. V tomto prípade sa MTD môže očakávať v rozsahu 200 až 300 mg/m2. Alternatívne môže byť aplikácia v 5 denných dávkach, po ktorých nasleduje niekoľko týždňová prestáva, po ktorej sa liečba môže opakovať. V takom prípade je očakávaná MTD na podanie nižšia ako 100 mg/m2. Napríklad konjugáty sa môžu podávať ako jediná i.v. infúzia rýchlosťou 3 mg/min každých 21 dní. Aplikuje sa maximálne 7 cyklov liečenia. Je zrejmé, že aplikované dávky môžu byť mimo rozsahov uvedených vyššie, ak to vyžaduje klinická situácia. Napríklad ak sa zistí, že MTD je vyššia, ako je uvedené, jedno podanie môže byť vo vyššej dávke ako 400 mg/m2, alebo týždenné môže byť vyššie ako 200 mg/m2.
Dávka, spôsob podávania, aplikačná schéma, opakovanie a trvanie liečenia bude vo všeobecnosti závisieť na povahe ochorenia (typ, stupeň a štádium nádoru, atď.) a na pacientovi (konštitúcia, vek, pohlavie atď.) a budú stanovené lekárom zodpovedným za liečenie. Okrem liečenia tuhých nádorov, môže byť terapeutická aplikácia podľa vynálezu výnimočne výhodná ako podporná pri chirurgickom zákroku, aby sa liečilo minimálne reziduálne ochorenie.
V ďalšom uskutočnení sa vynález týka použitia zlúčeniny vzorca I na prípravu farmaceutického prostriedku na liečenie rakoviny. Výhodnejšie je protilátkovou molekulou nachádzajúcou sa vo farmaceutickom prostriedku monoklonálna protilátka VFF-18 alebo rekombinantné protilátka majúca CDR's protilátky VFF-18, výhodne v ľudskej kostre. Najvýhodnejšia je protilátková molekula obsahujúca ľahký reťazec majúci sekvenciu č. 4 alebo sekvenciu č. 8 a ťažký reťazec majúci sekvenciu č. 6. Výhodne má toxická zlúčenina vzorec II. Výhodne je rakovinou karcinóm skvamóznych buniek (SCC) hlavy a krku, ezofagiálny SCC, pľúcny SCC, kožný SCC, prsnikový adenokarcinóm (AC), pľúcny AC, cervikálny SCC, pankreasový AC, AC hrubého čreva alebo žalúdka.
- 19Stručný prehľad obrázkov
Obrázok 1: In vitro cytotoxicita BIWI 1. Použili sa antigén-pozitívne bunkové línie A431 a FaDu a antigén-negatívna bunková línia A549.
Obrázok 2: Účinnosť BIWI 1 liečenia u nahých myší s xenoštepenými A431 nádormi. Znázornené sú priemerné objemy nádoru na skupinu so štandardnými odchýlkami, uvedené sú liečebné skupiny. Šípka označuje začiatok liečenia (deň 1).
Obrázok 3: Účinnosť BIWI 1 liečenia u nahých myší s xenoštepenými FaDu nádormi. Znázornené sú priemerné objemy nádoru na skupinu so štandardnými odchýlkami, uvedené sú liečebné skupiny. Šípka označuje začiatok liečenia (deň 1).
Obrázok 4: Tolerovateľnosť BIWI 1 liečenia. Znázornená je priemerná zmena telesnej hmotnosti u všetkých liečených skupín v 2 skúmaných modeloch. Deň 1: začiatok liečenia.
Obrázok 5: Účinnosť BIWI 1 liečenia u nahých myší s xenoštepenými MDAMB 453 nádormi. Znázornené sú priemerné objemy nádoru na skupinu so štandardnými odchýlkami, uvedené sú liečebné skupiny. Šípka označuje začiatok liečenia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
1. Materiál a metódy
1.1 In vitro test bunkovej proliferácie
Na určenie životaschopných buniek sa použil Celí Titer 96® AQueOus neradioaktívny bunkový proliferačný test (Promega). 5000 buniek na jamku sa vysialo na 96-jamkové platne v 90 μΙ média bez fenolovej červene. Bunky sa nechali 1 až 3 hodiny usadiť a potom sa pridali seriálne riedenia imunokonjugátu v 10 μΙ PBS. Bunky bez imunokonjugátu slúžili ako negatívna kontrola. Bunky sa inkubovali 4 dni pri 37 °C vo zvlhčenej 5% CO2 atmosfére a potom sa pridalo 20 μΙ MTS/PMS v súlade s odporúčaním výrobcu. Po ďalšej 1 až 4 hodinovej inkubácii pri 37 °C sa zaznamenávala absorbancia pri 490 nm použitím ELISA platňového snímača.
-20Každá bunková línia sa analyzovala trojmo. Použitím GraphPad Prism® (Verzia 3.0) softwaru sa vypočítalo percento prežívajúcej bunkovej frakcie a IC50 hodnota.
1.2 Výroba BIWI 1
Humanizované rekombinantné protilátky BIWA 4 a BIWA 8, ktoré majú väzobnú špecificitu pre epitop vo vnútri sekv. č. 1 sa spojili s maytanzinoidom DM1, ako je opísané nižšie. Konjugát BIWA 4 s DM1 bol označený BIWI 1.
Generovanie stabilne transfekovaných bunkových línií
Gény kódujúce ľahký a ťažký reťazec BIWA 4, sekv. č. 5 a sekv. č. 7, sa ligovali do expresného vektora Pad-cmv1 (W092/01055; NCBI GeBank prístupové č. A32111) alebo Pad-cmv19 (NCBI GenBank prístupové č. A32110). V sekundárnej protilátke BIWA 8 bol ľahký reťazec kódovaný génom majúcim sekv. č. 9, zatiaľ čo ťažký reťazec bol rovnaký ako v BIWA 4. Stabilne transfekované bunkové línie sa generovali elektroporáciou nasledovne. Použili sa CHO DUX/57ss (dhfr negatívny mutant vaječníkových buniek čínskeho škrečka, adaptovaný na bezsérovú suspenznú kultúru). Po trypsinizácii a inaktivácii trypsínu sRPMl-10 (90% RPMI 1640, 10% teplom inaktivované fetálne teľacie sérum) sa bunky raz premyli s RPMI-0 (RPMI 1640 bez séra) a 1x107 buniek sa resuspendovalo v 0,8 ml RPMI-0. Po pridaní linearizovanej DNA (20 pg na plazmid; kotransfekcia vektormi kódujúcimi ľahký a ťažký reťazec) sa bunky elektroporovali použitím Hoefer Elektroporátora v nasledujúcich podmienkach: 1080 μΕ, 320 V, 1000 msec, 1 pulz. Bunky sa nechali stáť 5 minút a potom sa nariedili na 12500 buniek/ml a 2500 buniek/ml v alfa-MEM 10d (90% MEM alfa bez ribonukleozidov a bez deoxyribonukleozidov (GIBCO BRL), 10% teplom inaktivované dialyzované fetálne teľacie sérum). Bunky sa vysiali na 96-jamkové mikrotitračné platne (200 μΙ/jamku, v koncentrácii zodpovedajúcej 2500, respektíve 500 buniek/jamku). Klony sa objavili po 10 dňoch. Len platne s 500 bunkami/jamku sa sledovali (3 až 6 klonov na jamku). Po 14 až 15 dňoch sa supernatanty z každej jamky testovali v κ/γ ELISA. 53 klonov sa vysialo na 12-jamkové platne v alfa-MEM 10d. Po 3 až 6 dňoch (v závislosti na tom, ako rýchlo bunky vytvorili súvislú vrstvu) sa supernatanty testovali znova v κ/γ ELISA (seriálne riedenia) a kvantifikovali sa použitím ľudského lgG1
-21 štandardu. Bunky sa zmrazili a uskladnili sa v kvapalnom dusíku. IgG obsahy 53 klonov boli v rozsahu od 12 do 417 ng/ml. 10 klonov s najvyššou úrovňou expresie sa vybralo a subklonovalo nasledovne: Bunky každého klonu sa vysiali na 96jamkové mikrotitračné platne s hustotami 1 a 5 buniek/jamku v 100 μΙ/jamku alfaMEM 10d (1 platňa pre každý kloň a každú hustotu). 0 8 dní neskôr sa supernatanty nariedili v pomere 1:2 a 100 μΙ tohto riedenia sa testovalo v κ/γ ELISA a kvantifikovalo sa použitím BIWA4 prípravku ako štandardu. 5 subklonov z každého klonu sa prenieslo na 12-jamkové platne. Obsah IgG bol v rozsahu od
1,3 do 908 ng/mi. 14 klonov s najvyššou úrovňou expresie (384-908 ng/ml) sa použilo na amplifikáciu s metotrexátom nasledovne: Klony sa najprv kultivovali v25cm2 fľašiach obsahujúcich alfa-MEM 10d s 20, 50 a 100 nM metotrexátu. Po prerastení klonov sa supernatanty testovali v κ/γ ELISA. V následných kolách amplifikácie sa koncentrácia metotrexátu zvýšila až na 2000 nM. Na začiatku bola najvyššia expresná hladia v rozsahu od 10,5 do 14,8 μg/ml (kloň A31/100, 100 nM metotrexátu). Ďalšia amilifikácia s metotrexátovou koncentráciou 500 nM poskytla expresiu 19 až 20 pg/ml (A31/500).
Purifikácia protilátky
Protilátka sa purifikovala z bunkového kultivačného supernatantu nasledovne. Supernatant z tkanivovej kultúry obsahujúcej protilátku sa naniesol na 5ml protein A sepharose kolónu s rýchlosťou prietoku 80-90 ml/h pri 4 °C. Po premytí s 50 ml väzobného tlmivého roztoku (0,1 M fosforečnan sodný pH 7,5) sa Ig frakcia eluovala s elučným tlmivým roztokom (0,1 M glycín-HCI pH 2,7). Monitorovala sa absorpcia pri 280 nm.
Modifikácia BIWA 4 s SPP, aby sa vytvoril BIWA 4-SS-Py
BIWA 4 sa dodala v kvapalnej forme v koncentrácii 5 mg/ml v PBS formulácii obsahujúcej Tween 20. Pred pripojením DM1 na MAb sa odstránil Tween 20. MAb roztok (40 ml) sa nariedil 15-násobne s 25 mM MES tlmivého roztoku, pH 5,6, obsahujúceho 50 mM NaCl (MES tlmivý roztok) a potom sa naniesol na kolónu (12,5 ml) Sepharose S ekvilibrovanú v MES tlmivom roztoku (prietoková rýchlosť:
-22100 cm/hodinu). Kolóna sa premyla s 10 kolónovými objemami MES tlmivého roztoku. Protilátka sa eluovala s MES tlmivým roztokom obsahujúcim 400 mM NaCl. Protilátkový roztok sa dialyzoval oproti 50 mM draselného fosforečnanového tlmivého roztoku, pH 6,5, obsahujúceho 50 mM NaCl a 2 mM EDTA (tlmivý roztok A). BIWA 4 protilátka sa modifikovala použitím SPP (A/-hydroxysukcínimidester kyseliny (2-pyridyl)-5-ditiopentánovej), aby sa zaviedli ditiopyridylové skupiny. MAb tlmivý roztok A (185 mg, 8 mg/ml) sa modifikoval so 7-násobným molárnym nadbytkom SPP v EtOH (5% v/v MAb roztoku). Reakcia pokračovala 90 minút pri teplote okolia. Reakčná zmes sa potom podrobila gélovej filtračnej chromatografii cez Sephadex G25F (2,6 x 31,5 cm kolóna, 167 ml) ekvilibrovanej v tlmivom roztoku A. MAb-obsahujúce frakcie sa spojili a determinoval sa stupeň modifikácie meraním absorbancie pri 280 nm a zmeny v absorbancii pri 343 nm spôsobenej uvoľnením 2-merkaptopyridínu prostredníctvom pridania DTT. Koncentrácia uvoľňovaného 2-merkaptopyridínu sa vypočítala použitím £343mm 8080 M'1cm'1 a koncentrácia MAb sa vypočítala použitím E280nm 224000 M‘1cm1 po absorbancii pri 280 nm bola upravená na podiel z 2-merkaptopyridínu. (2-Merkaptopyridín A280nm = A343nm x 5100/8080). Izolácia MAb bola 99,6% s 5,5 uvolnených 2-mekaptopyridínových skupín pripojených na MAb molekulu.
Konjugácia BIWA 4-SS-Py s DM1
Vyššie uvedená modifikovaná MAb (184 mg) v tlmivom roztoku A sa konjugovala v koncentrácii 2,5 mg MAb/ml použitím 1,7-molárneho nadbytku DM1 oproti uvoľniteľným 2-merkaptopyridínovým skupinám. DM1 sa pridávala v DMA (3% v/v MAb roztok) a reakčná zmes sa inkubovala pri teplote okolia 29 hodín. Konjugát sa potom izoloval gólovou filtračnou chromatografiou na Sephacryl S300 HR kolóne ekvilibrovanej v PBS (5x50 cm kolóna, 980 ml, prietoková rýchlosť 10 cm/hodinu). Konjugát eluoval ako jediný vrchol v pozícii monomérnej MAb s malým množstvom proteínu eluovaným skôr. Frakcie sa testovali na počet DM1 molekúl pripojených na jednu MAb molekulu. (Pripojené DM1 molekuly sa stanovovali meraním absorbancie tak pri 252 nm, ako a pri 280 nm). Na základe týchto výsledkov sa frakcie reprezentujúce 63 až 77 % kolónového objemu spojili. Zistilo sa, že DM1/MAb pomer v spojenom roztoku je 3,1 a výťažok konjugátu BIWA 4 bol
-2375 % vzhľadom na východiskovú MAb. Konjugát BIWI 1 sa hodnotil prostredníctvom SDS-PAGE uskutočňovanej v neredukujúcich podmienkach, a zistilo sa, že je zložený primáre s monomérnych druhov (> 95%) s minoritným množstvom (<5%) dimérneho konjugátu.
Analýza in vitro viazania BIW11
Determinovalo sa viazanie BIWA 4 protilátky a BIWI 1 konjugátu na antigénpozitívne FaDu bunky. Bunky (1-2x10'5) sa inkubovali v 96-jamkových platniach s rôznymi koncentráciami protilátky alebo konjugátu, na ľade, 1 hodinu. Testovací materiál sa z platne odmyl a pridal sa FITC-značený anti-humánny IgG a inkubovanie na ľade pokračovalo v tme 1 hodinu. Po premytí sa bunky fixovali s 1 % paraformaldehydom a analyzovali sa na fluorescenciou aktivovanom bunkovom triediči (FACS). BIWA 4 protilátka sa viaže so zdanlivou KS 1x10'9 M a BIWI 1 sa viaže so zdanlivou Kd 1,8x10‘9 M. Takže konjugácia s DM1 mení väzobnú afinitu protilátky len mierne, ak vôbec.
1.3 Testy účinnosti na nahých myšiach
In vivo protinádorová účinnosť BIWI 1 sa testovala na dvoch modeloch nahých myšacích xenoštepov používajúcich antigén-pozitívne ľudské tumory, ktoré sa líšia v pôvode nádoru, rozsahu a homogenite CD44v6 expresie: A431 (ATCC # CRL 1555; epidermoidný karcinóm vulvy), FaDu (ATCC # CRL 43; skvamózny bunkový karcinóm hltana). Nádorové bunkové línie A431 a FaDu boli obdržané z ATCC a kultivovali sa v RPMI1640 médiu obsahujúcom 10% fetálne teľacie sérum a dodatky.
Myši sa náhodne rozdelili do nasledujúcich liečebných skupín (liečenie/ počiatočný priemerný objem nádoru/ rozsah objemu nádor/ počet myší):
A431
Skupina 1: Kontrola (PBS)/185±217 mm3/19-424 mm3/ 5 myší
Skupina 2: BIWA 4 (21 mg/kg/d)/133±115 mm3/ 42-302 mm3/ 5 myší
Skupina 3: BIWI 1 (2,1 mg/kg/d)/107±63 mm3/ 42-205 mm3/ 5 myší
Skupina 4: BIWI 1 (7 mg/kg/d)/132±73 mm3/ 42-205 mm3/ 5 myší
-24Skupina 5: BIWI 1 (21 mg/kg/d)/107±63 mm3/ 42-205 mm3/ 5 myší
FaDu
Skupina 1: Kontrola (PBS)/142±82 mm3/ 34-268 mm3/ 5 myší
Skupina 2: BIWA 4 (21 mg/kg/d)/134±86 mm3/ 42-268 mm3/ 5 myší
Skupina 3: BIWI 1 (2,1 mg/kg/d)/149±96 mm3/ 50-268 mm3/ 5 myší
Skupina 4: BIWI 1 (7 mg/kg/d)/132±97 mm3/ 42-268 mm3/ 5 myší
Skupina 5: BIWI 1 (21 mg/kg/d)/129±74 mm3/ 50-231 mm3/ 5 myší
1x106 nádorových buniek sa subkutánne transplantovalo do pravého boku 6týždňových samičiek NMRI-nu/nu myší. Liečba sa začala, keď nádory dosiahli priemernú veľkosť 107 až 185 mm3. Liečenie pozostávalo z i.v. injekcii BIWI 1 podávaných počas piatich po sebe idúcich dňoch, začínajúc dňom 1. Tri odlišné dávky BIWI 1 sa testovali paralelne: 2,1 mg/kg/d BIWI 1 zodpovedajúca 30 pg/kg/d DM1, 7 mg/kg/d BIWI 1 zodpovedajúca 100 pg/kg/d DM1 a 21 mg/kg/d BIWI 1 zodpovedajúca 300 pg/kg/d DM1. Kontrolné zvieratá sa buď neliečili (PBS), alebo sa liečili s nekonjugovanou protilátkou (kontrolná protilátka, 21 mg/kg/d). Rast nádora sa monitoroval meraním veľkosti nádora. Odpoveď nádora sa hodnotila ako kompletná odpoveď, keď nádor úplne zmizol kedykoľvek po začiatku liečenia. Odpoveď sa hodnotila ako čiastočná odpoveď, keď sa objem nádora znížil po liečení, ale potom začal znova rásť. Tolerovateľnosť liečenia sa monitorovala meraním hmotnosti myší počas celej pozorovacej periódy.
2. Výsledky a diskusia
2.1 In vitro cytotoxicita BIWI 1
In vitro cytotoxicita BIWI 1 sa hodnotila použitím antigén-pozitívnych bunkových línií A431 a FaDu a antigén-negatívnej bunkovej línie A459. Bunky sa vystavili rôznym koncentráciám BIWI 1 počas 4 dní, potom sa farbili s MTS/PMS a testovali sa na ELISA platňovom snímači. Prežívajúce frakcie buniek sa potom vypočítali použitím GraphPad Prism® softwarového balíka. Výsledky sú znázornené
-25na obrázku 1. BIWI 1 je účinný na zabíjanie antigén pozitívnych A431 buniek s IC50 približne 7,6x10'8 M a druhej antigén-pozitívnej bunkovej línie, FaDu, s IC5o približne 2,4x10'8 M. Antigén-negatívna bunková línia, A549, bola ovplyvňovaná konjugátom s IC50 približne 1,3x107 M s prežívajúcou frakciou 50 % v najvyššej testovanej BIWI 1 koncentrácii (5x10'7 M). Tieto výsledky ukazujú, že BIWI 1 je len mierne cytotoxickejšia voči antigén-pozitívnym bunkách ako voči antigén-negatívym bunkám in vitro. Na porovnanie, ukázalo sa, že iný DM1-protilátkový konjugát je najmenej 1000-násobne cytotoxickejší voči antigén-pozitívnej bunke, v porovnaní s antigén-negatívnymi bunkami (Chari a ďalší, 1992).
2.2 Účinnosť u myší s A431 xenoštepmi
Skupiny 5 myší sa liečili s 2,1 mg/kg/d BIWI 1, 7 mg/kg/d BIWI 1, 21 mg/kg/d
BIWI 1, respektíve 21 mg/kg/d kontrolnej protilátky. Priemerná veľkosť nádoru na začiatku liečenia bola 185±217 mm3 (PBS), 133+115 mm3 (kontrolná protilátka), 107 ± 63 mm3 (21 mg/kg/d BIWI 1), 132 + 73 mm3 (7 mg/kg/d BIWI 1), respektíve 107 ± 63 mm3 (2,1 mg/kg/d BIWI 1). Priemerný objem nádoru v každej skupine v priebehu pozorovacej periódy je znázornený na obrázku 2. Nádory liečené s kontrolnou protilátkou vykazovali podobný rast ako neliečené nádory, čas za ktorý sa nádor zdvojnásobil bol približne 5 dní. U zvierat liečených buď so 7 mg/kg/d BIWI 1, alebo s 21 mg/kg/d BIWI 1, všetky nádory odpovedali kompletne a zmizli približne na 17. deň. Žiadny opätovný rast nádoru sa nepozoroval do konca pozorovacej periódy (deň 134). Nádory liečené s 2,1 mg/kg/d odpovedali komplete v 3/5 prípadov bez opätovného rastu nádoru na 134. deň. Zvyšné 2 nádory vykazovali čiastočnú odpoveď, ale nakoniec znova rástli. Tieto výsledky ukazujú, že BIWI 1 indukuje na dávke závislú protinádorovú reakciu u A431 nahých myší s xenoštepom, s kompletnými a dlhotrvajúcimi odpoveďami od 2,1 mg/kg/d BIWI 1 do 21 mg/kg/d BIWI 1. Nekonjugovaná kontrolná protilátka nevykazovala žiadny protinádorový účinok. Pozri obrázok 2.
2.2 Účinnosť u nahých myší s FaDu xenoštepom
Skupiny 6 myší sa liečili s 2,1 mg/kg/d BIWI 1, 7 mg/kg/d BIWI 1, 21 mg/kg/d
BIWI 1, respektíve 21 mg/kg/d kontrolnej protilátky. Priemerná veľkosť nádora na
-26začiatku liečenia bola 142±82 mm3 (PBS), 134±86 mm3 (kontrolná protilátka), 129 ± 74 mm3 (21 mg/kg/d BIWI 1), 132 ± 97 mm3 (7 mg/kg/d BIWI 1), respektíve 149 ± 96 mm3 (2,1 mg/kg/d BIWI 1). Priemerný objem nádoru v každej skupine v priebehu pozorovacej periódy je znázornený na obrázku 3, Nádory liečené s kontrolnou protilátkou a s 2,1 mg/kg/d BIWI 1 vykazovali podobný rast ako neliečené nádory, čas za ktorý sa nádor zdvojnásobil bol približne 5 dní. U zvierat liečených s 21 mg/kg/d BIWI 1, všetky nádory odpovedali kompletne a zmizli približne na 24. deň. Žiadny opätovný rast nádoru sa nepozoroval do konca pozorovacej periódy (deň 107). Nádory liečené so 7 mg/kg/d odpovedali komplete v 1/6 prípadov, 3/6 nádorov vykazovali čiastočné odpovede. Zvyšné 2 nádory rástli podobne ako neliečené kontrolné nádory. Tieto výsledky ukazujú, že BIWI 1 indukuje na dávke závislú protinádorovú reakciu u nahých myší s FaDu xenoštepom, s kompletnými a dlhotrvajúcimi odpoveďami od 7 mg/kg/d BIWI 1 do 21 mg/kg/d BIWI 1. Nekonjugovaná kontrolná protilátka nevykazovala žiadny protinádorový účinok. Pozri obrázok 3.
2.4 Tolerovateľnosť u nahých myší
Tolerovateľnosť BIWI 1 liečenia sa determinovala monitorovaním hmotnosti myší počas celého trvania experimentu na 2 modeloch. Maximálna pozorovaná priemerná strata hmotnosti na skupinu bola 5% u myší s FaDu xenoštepom liečených 21 mg/kg/d BIWI 1 (obrázok 4). Úbytok hmotnosti začal približne na 3. deň liečenia a trval do 10. dňa, potom zvieratá znova získali svoju hmotnosť a správali sa podobne ako kontrolné zvieratá. Vo všetkých iných dávkových skupinách bola strata hmotnosti podobná vehikulovej kontrolnej skupine (PBS). Z priemernej 5% straty hmotnosti alebo nižšej, vo všetkých ošetrovaných skupinách vyplýva dobrá tolerovateľnosť BIWI 1 liečby v daných dávkach u nahých myší. Keďže BIWI 1 krížovo nereaguje s myšacou CD44v6, v tomto experimente je možné monitorovať len antigén-nezávislé účinky, ako napríklad toxicitu spôsobenú voľným DM1.
3. In vivo protinádorový účinok v MDA-MB 453
3.1. Materiál a metódy
-27 In vivo protinádorový účinok BIWI 1 sa testoval na xenoštepovom modeli nahých myší, ktorým bol aplikovaný antigén-pozitívny ľudský nádor MDA-MB 453 (ATCC # ΗΤΒ-13Τ, karcinóm prsníka). Bunky sa získali z ATCC a kultivovali sa vRPMI1640 médiu obsahujúcom 10% fetálne teľacie sérum a dodatky. 1x106 nádorových buniek sa transplantovalo subkutáne do pravého boku 6 týždňových samičiek NMRI-nu/nu myší. Na terapeutické experimenty sa nádory udržiavali pasážovaním fragmentov nádorov. Liečenie začalo, keď nádory dosiahli priemernú veľkosť 188 až 246 mm3. Liečenie pozostávalo z i.v. injekcií BIWI 1 podávaných týždenne štyri týždne. 3 rozličné dávky BIWI 1 sa testovali paralelne; 6,25 mg/kg BIWI 1 zodpovedajúca 100 pg/kg DM1, 12,5 mg/kg BIWI 1 zodpovedajúca 200 pg/kg DM1 a 25 mg/kg BIWI 1 zodpovedajúca 400 pg/kg DM1. Zvieratá liečené s PBS slúžili ako kontrola rastu nádoru. Rast nádoru sa monitoroval meraním veľkosti nádoru. Odpoveď nádoru sa hodnotila ako kompletná odpoveď, ked nádor úplne zmizol kedykoľvek po začiatku liečenia.
3.2 Výsledky a diskusia
Skupiny 6 myší sa liečili s 6,25 mg/kg BIWI 1, 12,5 mg/kg BIWI 1, respektíve 25 mg/kg BIWI 1, raz týždenne štyri týždne. Priemerná veľkosť nádoru na začiatku liečenia bola 246±79 mm3 (PBS), 216±85 mm3 (6,25 mg/kg BIWI 1), 188 ± 79 mm3 (12,5 mg/kg BIWI 1), respektíve 207 ± 96 mm3 (25 mg/kg/ BIWI 1). Priemerný objem nádoru v každej skupine v priebehu pozorovacej periódy je znázornený na obrázku 5. Čas, za ktorý sa počiatočný nádor zdvojnásobil bol približne 5 dní u kontrolných nádorov. U zvierat liečených s 25 mg/kg BIWI 1 všetky nádory odpovedali kompletne a zmizli približne na 22. deň po začiatku liečenia. Žiadny opätovný rast nádoru sa nepozoroval do konca pozorovacej periódy (deň 64). Nádory liečené s 12,5 mg/kg alebo 6,25 mg/kg odpovedali komplete v 5/6 prípadov v každej skupine a 4 zvieratá v každej skupine ostali bez nádoru až do konca experimentu. Tieto výsledky ukazujú, že BIWI 1 indukuje vynikajúce protinádorové odpovede v MDA-MB 453 xenoštepených nahých myšiach, keď sa im raz týždenne počas štyroch týždňov podáva 6,25 mg/kg BIWI 1 až 25 mg/kg BIWI 1, s kompletnými a dlhotrvajúcimi odpoveďami.
-28Zoznam sekvencií <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty <130>
<140>
<141>
<160> 7 <170 Patentln Ver. 2.1 <210 1 <211>42 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Opis umelej sekvencie: ľudská CD44 exónová v6 sekvencia č. 1 <400 1
Gin 1 Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu 15
5 10
Gin Trp Phe Gly 20 Asn Arg Trp His Glu 25 Gly Tyr Arg Gin Thr 30 Pro Arg
Glu Asp Ser 35 His Ser Thr Thr Gly 40 Thr Ala
<210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Opis umelej sekvencie: sekvencia č. 2 <400>2
Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 15 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens
-29<223> Opis umelej sekvencie: sekvencia č. 3 <400 3
Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg 1 5 10 <210>4 <211> 213 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: ľahký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA 4, sekvencia č. 4 <400> 4
Glu 1 íle Val Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser íle Asn 30 Tyr íle
Tyr Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Gin Ala Pro Arg Leu 45 Leu íle Tyr
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ala Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly 65 Ser Gly Thr Asp Phe 70 Thr Leu Thr íle Ser 75 Ser Leu Glu Pro Glu 80
Asp Phe Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Leu Gin Trp 90 Ser Ser Asn Pro Leu 95 Thr
Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Val Glu íle 105 Lys Arg Thr Val Ala 110 Ala Pro
Ser Val Phe 115 íle Phe Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr
Ala Ser 130 Val Val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Arg Glu Ala Lys
Val 145 Gin Trp Lys Val Asp 150 Asn Ala Leu Gin Ser 155 Gly Asn Ser Gin Glu 160
Ser Val Thr Glu Gin 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser
Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val 190 Tyr Ala
Cys Glu Val 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe
Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 5 <211> 702 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie; ľahký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA4, sekvencia č. 5 <400> 5 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120 ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 180 caggctccta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300 gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360 accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702 <210> 6 <211> 444 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: ťažký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA4, sekvencia č. 6 <400> 6
Glu 1 Val Gin Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Gly
Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr
Asp Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val
Ser Thr 50 íle Ser Ser Gly Gly 55 Ser Tyr Thr Tyr Tyr 60 Leu Asp Ser íle
Lys 65 Gly Arg Phe Thr íle 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn Ser Leu Tyr 80
Leu Gin Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Gin Gly 100 Leu Asp Tyr Trp Gly Arg 105 Gly Thr Leu Val 110 Thr Val
Ser Ser Ala 115 Ser Thr Lys Gly Pro 120 Ser Val Phe Pro Leu 125 Ala Pro Ser
Ser Lys 130 Ser Thr Ser Gly Gly 135 Thr Ala Ala Leu Gly 140 Cys Leu Val Lys
Asp 145 Tyr Phe Pro Glu Pro 150 Val Thr Val Ser Trp 155 Asn Ser Gly Ala Leu 160
Thr Ser Gly Val His 165 Thr Phe Pro Ala Val 170 Leu Gin Ser Ser Gly 175 Leu
Tyr Ser Leu Ser 180 Ser Val Val Thr Val 185 Pro Ser Ser Ser Leu 190 Gly Thr
Gin Thr Tyr 195 íle Cys Asn Val Asn 200 His Lys Pro Ser Asn 205 Thr Lys Val
Asp Lys 210 Lys Val Glu Pro Lys 215 Ser Cys Asp Lys Thr 220 His Thr Cys Pro
Pro 225 Cys Pro Ala Pro Glu 230 Leu Leu Gly Gly Pro 235 Ser Val Phe Leu Phe 240
Pro Pro Lys Pro Lys 245 Asp Thr Leu Met íle 250 Ser Arg Thr Pro Glu 255 Val
Thr Cys Val Val 260 Val Asp Val Ser His 265 Glu Asp Pro Glu Val 270 Lys Phe
Asn Trp Tyr 275 Val Asp Gly Val Glu 280 Val His Asn Ala Lys 285 Thr Lys Pro
Arg Glu 290 Glu Gin Tyr Asn Ser 295 Thr Tyr Arg Val Val 300 Ser Val Leu Thr
Val 305 Leu His Gin Asp Trp 310 Leu Asn Gly Lys Glu 315 Tyr Lys Cys Lys Val 320
Ser Asn Lys Ala Leu 325 Pro Ala Pro íle Glu 330 Lys Thr íle Ser Lys 335 Ala
Lys Gly Gin Pro 340 Arg Glu Pro Gin Val 345 Tyr Thr Leu Pro Pro 350 Ser Arg
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 7 <211>1392 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: ťažký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA 4, sekvencia č. 7 <400> 7 atggagtttg gtgcagctgg tgtgcagcct gggaaggggc gacagtataa caaatgaaca gactactggg gtcttccccc ctggtcaagg agcggcgtgc gtggtgaccg aagcccagca acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct aagactctcc 120 ctggattcac tttcagtagc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180 tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcta 240 agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cctgtacctg 300 gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag acaggggttg 360 gtcgaggaac cttagtcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 420 tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ga 1392
-33<210>8 <211> 213 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: ľahký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA 8, sekvencia č. 8 <400> 8
Glu 1 íle Val Leu Thr 5 Gin Ser í?ro Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro 15 Gly
Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser íle Asn 30 Tyr íle
Tyr Trp Leu 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Gin Ala Pro Arg íle 45 Leu íle Tyr
Leu Thr 50 Ser Asn Leu Ala Ser 55 Gly Val Pro Ala Arg 60 Phe Ser Gly Ser
Gly 65 Ser Gly Thr Asp Phe 70 Thr Leu Thr íle Ser 75 Ser Leu Glu Pro Glu 80
Asp Phe Ala Val Tyr 85 Tyr Cys Leu Gin Trp 90 Ser Ser Asn Pro Leu 95 Thr
Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Val Glu íle 105 Lys Arg Thr Val Ala 110 Ala Pro
Ser Val Phe 115 íle Phe Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr
Ala Ser 130 Val Val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Arg Glu Ala Lys
Val 145 Gin Trp Lys Val Asp 150 Asn Ala Leu Gin Ser 155 Gly Asn Ser Gin Glu 160
Ser Val Thr Glu Gin 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser
Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val 190 Tyr Ala
Cys Glu Val 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe
Asn Arg Gly Glu Cys
210
-34<210> 9 <211> 702 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: ľahký reťazec humanizovanej myšacej protilátky BIWA 8, sekvencia č. 9

Claims (35)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty všeobecného vzorca I
    A(LB)n (I) kde
    A znamená protilátkovú molekulu, ktorá je špecifická pre CD44,
    L znamená spojovníkovú skupinu,
    B znamená zlúčeninu, ktorá je toxická pre bunky a n je desiatkové číslo od 1 do 10.
  2. 2. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nároku 1, kde spojovníková skupina má chemickú väzbu, ktorá môže byť štiepená vo vnútri bunky.
  3. 3. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nároku 2, kde chemickou väzbou je disulfidová väzba.
  4. 4. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 3, kde protilátkové molekula je špecifická pre exón v6 ľudskej CD44.
  5. 5. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 4, kde protilátkové molekula je špecifická pre epitop vo vnútri aminokyselinovej sekvencie č. 3.
  6. 6. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 5, kde protilátkovou molekulou je monoklonálna protilátka VFF-18 (DSM ACC2174) alebo rekombinantné protilátka majúca komplementárnu determinujúce oblasti (CDRs) z VFF-18.
  7. 7. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 6, kde protilátkové molekula obsahuje ľahké reťazce, majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 alebo sekvenciu č.
  8. 8, a ťažké reťazce, majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6.
    -368. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 7, kde toxickou zlúčeninou B je maytanzinoid.
  9. 9. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nároku 8, kde maytanzinoid má všeobecný vzorec II (CH2)mSR1 (H) kde
    R1 znamená H alebo SR4, kde R4 znamená metyl, etyl, lineárny alkyl, rozvetvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý alebo substituovaný aryl alebo heterocyklickú zlúčeninu,
    R2 znamená Cl alebo H,
    R3 znamená H alebo CH3 a m znamená 1, 2 alebo 3.
  10. 10. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nároku 9, kde R1 znamená CH3, R2 znamená Cl, R3 znamená CH3 a m = 2.
  11. 11. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 10, všeobecného vzorca III (III) kde
    A znamená protilátkovú molekulu, ktorá je špecifická pre CD44, (Ľ) je voliteľnou spojovacou skupinou, p je desiatkové číslo od 1 do 10.
  12. 12. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nárokov 1 až 11, kde p je 3 až 4.
  13. 13. Cytotoxický CD44 protilátkový imunokonjugát podľa nároku 1, ktorým je konjugát CD44v6 špecifickej protilátkovej molekuly a maytanzinoidu.
  14. 14. Konjugát podľa nároku 13, kde protilátkové molekula je špecifická pre epitop vo vnútri aminokyselinovej sekvencie č. 3.
  15. 15. Konjugát podľa nároku 14, kde protilátkovou molekulou je monoklonálna protilátka VFF-18 (DSM ACC2174) alebo rekombinantná protilátka majúca komplementaritu determinujúce oblasti (CDRs) z VFF-18.
  16. 16. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 15, kde protilátkové molekula obsahuje ľahké reťazce, majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4 alebo sekvenciu č. 8, a ťažké reťazce majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6.
    -3817. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 16, kde je maytanzinoid spojený s protilátkovou molekulou disulfidovou skupinou.
  17. 18. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 17, kde maytanzinoid má vzorec IV
  18. 19. Konjugát CD44v6 špecifickej protilátkovej molekuly a maytanzinoidu, kde protilátka obsahuje ľahké reťazce, majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 4, a ťažké reťazce, majúce aminokyselinovú sekvenciu č. 6, a kde maytanzinoid má vzorec IV
    -39a je spojený s protilátkou disulfidovou väzbou.
  19. 20. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 19, kde je na protilátkovú molekulu pripojený jeden alebo viacero maytanzinoidových zvyškov.
  20. 21. Konjugát podľa nároku 20, kde sú na protilátkovú molekulu pripojené 3 až 4 maytanzinoidové zvyšky.
  21. 22. Konjugát podľa ktoréhokoľvek z nárokov 13 až 21, kde maytanzinoid je spojený s protilátkovou molekulou cez -S-CH2CH2-CO-, -S-CH2CH2CH2CH2-COalebo -S-CH(CH3)CH2CH2-CO- skupinu.
  22. 23. Spôsob výroby cytotoxických CD44 protilátkových imunokonjugátov vzorca A(LB)n podľa nárokov 1 až 12 alebo konjugátov podľa nárokov 13 až 22, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:
    (a) zavedenie jednej alebo viacerých voľných alebo chránených tiolových skupín do protilátkovej molekuly, ktorá je špecifická pre CD44, (b) reakciu protilátkovej molekuly z kroku (a) so zlúčeninou, ktorá je toxická pre bunky, pričom táto zlúčenina má jednu alebo viaceré disulfidové alebo tiolové skupiny, a (c) izoláciu výsledného konjugátu.
  23. 24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa t ý m , že protilátková molekula je špecifická pre CD44v6.
  24. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že protilátková molekula je špecifická pre epitop vo vnútri sekvencie č. 3.
  25. 26. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 25, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že toxickou zlúčeninou je maytanzinoid.
    -4027. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že maytanzinoid má všeobecný vzorec II
    CH3 O
    R1 znamená H alebo SR4, kde R4 znamená metyl, etyl, lineárny alkyl, rozvetvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý alebo substituovaný aryl alebo heterocyklickú zlúčeninu,
    R2 znamená Cl alebo H,
    R3 znamená H alebo CH3 a m znamená 1,2 alebo 3.
  26. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že R1 znamená H alebo CH3, R2 znamená Cl, R3 znamená CH3 a m = 2.
  27. 29. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 28, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že na zavedenie voľných alebo chránených tiolových skupín do protilátkovej molekuly sa používa A/-hydroxysukcínimidester kyseliny (2-pyridyl)-3-ditiopropánovej, /V-hydroxysukcínimid ester kyseliny (2-pyridyl)-4-ditiopentánovej alebo /V-hydroxysukcínimid ester kyseliny (2-pyridyl)-5-ditiopentánovej.
  28. 30. Cytotoxický CD44 protilátkový imunokonjugát získateľný spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 23 až 29.
    -41
  29. 31. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje cytotoxický CD44 protilátkový imunokonjugát všeobecného vzorca A(LB)n podľa nárokov 1 až 12 alebo 30 alebo konjugát podľa nárokov 13 až 22, a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo alebo excipient.
  30. 32. Použitie cytotoxického CD44 protilátkového imunokonjugátu všeobecného vzorca A(LB)n podľa nárokov 1 až 12 alebo 30 alebo konjugátu podľa nárokov 13 až 22 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie rakoviny.
  31. 33. Použitie podľa nároku 32, kde rakovinou je karcinóm skvamóznych buniek hlavy a krku, karcinóm ezofagiálnych skvamóznych buniek, karcinóm pľúcnych skvamóznych buniek, karcinóm kožných skvamóznych buniek, karcinóm cervikálnych skvamóznych buniek, adenokarcinóm prsníka, pľúcny adenokarcinóm, adenokarcinóm pankreasu, adenokarcinóm hrubého čreva alebo adenokarcinóm žalúdka.
  32. 34. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty všeobecného vzorca A(LB)n podľa nárokov 1 až 12 alebo 30 alebo konjugáty podľa nárokov 13 až 22 na použitie na liečenie rakoviny.
  33. 35. Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty podľa nároku 34, kde rakovinou je karcinóm skvamóznych buniek hlavy a krku, karcinóm ezofagiálnych skvamóznych buniek, karcinóm pľúcnych skvamóznych buniek, karcinóm kožných skvamóznych buniek, karcinóm cervikálnych skvamóznych buniek, adenokarcinóm prsníka, pľúcny adenokarcinóm, adenokarcinóm pankreasu, adenokarcinóm hrubého čreva alebo adenokarcinóm žalúdka.
  34. 36. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 31 na použitie na liečenie rakoviny u pacienta, ktorý to potrebuje.
  35. 37. Použitie podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že rakovinou je karcinóm skvamóznych buniek hlavy a krku, karcinóm ezofagiálnych skvamóznych
    -42buniek, karcinóm pľúcnych skvamóznych buniek, karcinóm kožných skvamóznych buniek, karcinóm cervikálnych skvamóznych buniek, adenokarcinóm prsníka, pľúcny adenokarcinóm, adenokarcinóm pankreasu, adenokarcinóm hrubého čreva alebo adenokarcinóm žalúdka.
SK1558-2003A 2001-05-18 2002-05-16 Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie SK15582003A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01112227A EP1258255A1 (en) 2001-05-18 2001-05-18 Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid
PCT/EP2002/005413 WO2002094325A2 (en) 2001-05-18 2002-05-16 Cytotoxic cd44 antibody immunoconjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK15582003A3 true SK15582003A3 (sk) 2004-04-06

Family

ID=8177473

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1558-2003A SK15582003A3 (sk) 2001-05-18 2002-05-16 Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP1258255A1 (sk)
JP (1) JP2004529963A (sk)
KR (1) KR20030097883A (sk)
CN (1) CN1509187A (sk)
AR (1) AR035977A1 (sk)
BG (1) BG108366A (sk)
BR (1) BR0209862A (sk)
CA (1) CA2443438A1 (sk)
CO (1) CO5550468A2 (sk)
CZ (1) CZ20033477A3 (sk)
EA (1) EA200301159A1 (sk)
EE (1) EE200300568A (sk)
HR (1) HRP20030932A2 (sk)
HU (1) HUP0400046A3 (sk)
IL (1) IL157965A0 (sk)
MX (1) MXPA03010432A (sk)
NO (1) NO20035108D0 (sk)
NZ (1) NZ530167A (sk)
PE (1) PE20021097A1 (sk)
PL (1) PL365480A1 (sk)
SK (1) SK15582003A3 (sk)
WO (1) WO2002094325A2 (sk)
YU (1) YU91503A (sk)
ZA (1) ZA200307364B (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8071072B2 (en) * 1999-10-08 2011-12-06 Hoffmann-La Roche Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44
US6441163B1 (en) * 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
EP1417974A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-12 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
DE10256083A1 (de) * 2002-11-29 2004-08-12 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen
US7384744B2 (en) 2002-11-29 2008-06-10 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
LT3524611T (lt) * 2003-05-20 2021-04-12 Immunogen, Inc. Patobulinti citotoksiniai agentai, apimantys naujus maitansinoidus
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
JP2007503202A (ja) * 2003-07-21 2007-02-22 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ｃａ６抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法
US20050232919A1 (en) 2004-02-12 2005-10-20 Morphotek, Inc. Monoclonal antibodies that specifically block biological activity of a tumor antigen
EP1819359B1 (en) * 2004-12-09 2015-03-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods of their production and their use
AU2006213662B2 (en) * 2005-02-11 2010-08-05 Immunogen, Inc. Process for preparing stable drug conjugates
AU2006223301B2 (en) 2005-03-10 2010-11-04 Eisai, Inc. Anti-mesothelin antibodies
CN101374545B (zh) * 2005-04-15 2012-03-28 免疫基因公司 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体
EP2172487A1 (en) 2005-04-22 2010-04-07 Morphotek Inc. Antibodies with Immune Effector Activity that Internalize in Folate Receptor Alpha-Positive Cells
BRPI0615049B1 (pt) 2005-08-24 2023-04-25 Immunogen, Inc Processo para a preparação de um conjugado de anticorpo- maitansinóide
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
AR059900A1 (es) * 2006-03-17 2008-05-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados
DK2437790T3 (da) 2009-06-03 2019-05-20 Immunogen Inc Konjugeringsfremgangsmåder
UY32913A (es) * 2009-10-02 2011-04-29 Sanofi Aventis Nuevos maitansinoides y el uso de dichos maitansinoides para preparar conjugados con un anticuero
US8795673B2 (en) 2011-03-29 2014-08-05 Immunogen, Inc. Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
CN102337298B (zh) * 2011-08-19 2013-11-06 黄开红 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用
CN105209592A (zh) 2012-10-04 2015-12-30 伊缪诺金公司 使用pvdf膜纯化细胞结合剂细胞毒性剂缀合物
GB201220899D0 (en) * 2012-11-21 2013-01-02 Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh CD44v6-derived pegylated peptides
GB201220891D0 (en) 2012-11-21 2013-01-02 Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh CD44v6-derived peptides for treating breast cancers
GB201220889D0 (en) * 2012-11-21 2013-01-02 Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh CD44v6-derived peptides for treating metastasizing cancers
GB201220901D0 (en) * 2012-11-21 2013-01-02 Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh CD44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer
EP3038624A1 (en) 2013-08-26 2016-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
GB201421647D0 (en) 2014-12-05 2015-01-21 Amcure Gmbh And Ruprecht-Karls-Universitat And Karlsruher Institut F�R Technologie CD44v6-derived cyclic peptides for treating cancers and angiogenesis related diseases
WO2016150521A1 (en) * 2015-03-26 2016-09-29 Fundación Imdea Nanociencia Functionalised magnetic nanoparticle
CN112105643B (zh) * 2018-02-22 2023-09-26 普众发现医药科技(上海)有限公司 治疗性抗体及其应用
CN114057874B (zh) * 2020-07-31 2023-05-05 北京市神经外科研究所 抗cd44的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2026147C (en) * 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) * 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
UY24389A1 (es) * 1995-12-06 2001-10-25 Karlsruhe Forschzent Composición farmacéutica para el tratamiento de carcinoma de epitelio plano
DE19648209A1 (de) * 1996-11-21 1998-05-28 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen
DE19708713C2 (de) * 1997-03-04 2002-11-28 Boehringer Ingelheim Int Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen
CN100482281C (zh) * 1999-06-25 2009-04-29 基因技术股份有限公司 抗ErbB抗体-类美坦素偶联物在制备药物中的应用
EP2289549A3 (en) * 1999-10-01 2011-06-15 Immunogen, Inc. Immunoconjugates for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
PL365480A1 (en) 2005-01-10
CZ20033477A3 (en) 2004-05-12
EP1395290A2 (en) 2004-03-10
EA200301159A1 (ru) 2004-06-24
HUP0400046A2 (hu) 2004-04-28
MXPA03010432A (es) 2004-04-02
NO20035108L (no) 2003-11-17
EP1258255A1 (en) 2002-11-20
EE200300568A (et) 2004-04-15
BR0209862A (pt) 2004-06-08
PE20021097A1 (es) 2003-02-13
WO2002094325A2 (en) 2002-11-28
YU91503A (sh) 2006-05-25
HRP20030932A2 (en) 2004-04-30
CO5550468A2 (es) 2005-08-31
IL157965A0 (en) 2004-03-28
BG108366A (bg) 2004-09-30
AR035977A1 (es) 2004-07-28
WO2002094325A3 (en) 2003-04-17
NZ530167A (en) 2005-10-28
NO20035108D0 (no) 2003-11-17
CA2443438A1 (en) 2002-11-28
ZA200307364B (en) 2004-04-20
HUP0400046A3 (en) 2006-02-28
JP2004529963A (ja) 2004-09-30
KR20030097883A (ko) 2003-12-31
CN1509187A (zh) 2004-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK15582003A3 (sk) Cytotoxické CD44 protilátkové imunokonjugáty, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
US20040126379A1 (en) Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US20030103985A1 (en) Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates
TW200422050A (en) Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
JP6039751B2 (ja) フォレート受容体１抗体及びそのイムノコンジュゲート及び使用
JP5932672B2 (ja) Ｃｄ３７結合分子及びそのイムノコンジュゲート
AU2018354189A1 (en) Compositions and methods for the depletion of CD117+ cells
US20210379195A1 (en) Methods for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US20210371524A1 (en) Anti-cd45 antibodies and conjugates thereof
CN115151564A (zh) 抗pd-l1抗体和抗体-药物缀合物
US20220062339A1 (en) Use of an anti-cd45 antibody drug conjugate (adc) in cell therapy
US20220267441A1 (en) Anti-cd45 antibodies and conjugates thereof
US20040120949A1 (en) Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
WO2020219964A1 (en) Conditioning methods for gene therapy
US20230390412A1 (en) Compositions and methods for allogeneic transplantation
US20220273811A1 (en) Methods and compositions for treating autoimmune diseases

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application