JP2004529963A - 細胞傷害性ｃｄ４４抗体免疫コンジュゲート - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体と細胞傷害性化合物との新規なコンジュゲート、前記コンジュゲートを含む医薬組成物及び癌治療におけるそれらの使用に関する。特に、本発明はＣＤ４４に対して特異的な抗体とメイタンシノイド、好ましくはＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）とのコンジュゲートに関する。特に好ましい態様において、抗体／メイタンシノイドコンジュゲートは、式（ＩＩ）（式中、Ｒ1はＨ又はＳＲ4であり、Ｒ4はメチル、エチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環式アルキル、単一又は置換されたアリール又は複素環であり、Ｒ2はＣｌ又はＨであり、Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、ｍは１、２又は３である。）で示されるメイタンシノイドから製造されるだろう。好ましくは、前記式中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2はＣｌであり、Ｒ3はＣＨ3であり、ｍ＝２である。前記式中、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である化合物は、文献においてＤＭ１と呼ばれる。
Description
【０００１】
本発明は、抗体と細胞傷害性化合物との新規なコンジュゲート、前記コンジュゲートを含む医薬組成物及びそれらの腫瘍治療における使用に関する。
【０００２】
抗悪性腫瘍薬の腫瘍への標的化された送達により局所濃度を上昇させるために、当該薬を腫瘍関連抗原に対する抗体へコンジュゲートすることにより、当該薬の効力を改善する試みが多数存在している。これらの試みは限られた成果を達成しており、失敗を説明する幾つかの原因が文献で検討されてきている。化学量論的に作用する抗癌剤、例えばドキソルビジン又はメトトレキセートについては、必要な細胞傷害性を発揮するためには比較的高い細胞内濃度が必要とされる。多くの抗体−薬物コンジュゲートは、下記の理由（ａ）〜（ｄ）により、このような濃度を達成するのが困難であると考えられている。（ａ）多数の一般的な抗癌剤の効力が不十分なこと、（ｂ）抗原標的の細胞表面濃度が低いこと、（ｃ）抗原−抗体複合体の標的細胞への内在化（internalization）が不十分なこと及び（ｄ）標的細胞内部でコンジュゲートから遊離薬物の放出が不十分なこと（Chari等, 1992）。
【０００３】
前記の欠点のうち２つ、すなわち（ａ）及び（ｂ）は、Chari等の研究により取り扱われてきた（Chari等, 1992; Liu等, 1996; 米国特許No. 5,208,020）。彼らは抗体コンジュゲートを開発した。この抗体コンジュゲートでは、抗体がジスルフィド結合を介してメイタンシノイド（maytansinoid）に連結している。メイタンシン（maytansine）はＡｎｓａマクロライド抗生物質のクラスに属し、ノカルジア種（Nocardia sp.）に由来する。細菌発酵により生成するメイタンシン アンサミトシン（ansamitocin）Ｐ−３は、メイタンシノイドＤＭ１を製造するための前駆体分子として使用される。メイタンシン及び誘導体は、ビンクリスチンと同様に抗有糸分裂剤（チューブリンの重合阻害剤）として作用するが、ビンクリスチン及びその他の確立された化学療法剤（ＤＭ１はインビトロにおいて濃度〜１０-10で細胞に対して有毒である）よりも著しく高い効力を有する。遊離のメイタンシノイドの高細胞傷害性とは対照的に、抗体コンジュゲートは、抗原陰性細胞に対しては抗原陽性細胞と比較して数桁低い毒性を有している。ジスルフィド結合による連結は、当該結合が細胞内グルタチオンによって標的細胞内で容易に切断され、高毒性の遊離薬剤を放出させることができるという利点を有している。このアプローチは、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＣ２４２−ＤＭ１コンジュゲート（Liu等, 1996; Lambert等, 1998）及びＨｕＮ９０１−ＤＭ１（Chari等, 2000）等へ適用されてきている。しかしながら、これらのコンジュゲートの適用は、それぞれの標的抗原の制限された発現により制限される。例えば、Ｎ９０１により認識される抗原（ＣＤ５６、Ｎ−ＣＡＭ）は、神経内分泌起源の腫瘍により支配的に発現されている。Ｃ２４２抗原（ＣａｎＡｇ）は、胃腸管由来の腫瘍にほとんど限定される。
【０００４】
しかしながら、有利な抗原発現パターン、標的組織内での高度かつ特異的な細胞表面抗原濃度を有する適切な腫瘍関連抗体並びに抗原複合体化抗体コンジュゲートを細胞へ運搬する効率的な内在化方法を発見することによりこのアプローチを改良することのニーズが依然として存在している。
【０００５】
ＣＤ４４は、多種多様の細胞型の表面上に幾つかの異なるアイソフォームで発現するタンパク質である。最小のアイソフォームである標準ＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ）は、種々の異なる細胞により発現されるものであり、細胞が細胞外マトリックス成分へ付着することを媒介し、リンパ球及び単球の活性化における同時刺激（co-stimulus）を伝達すると考えられている。対照的に、細胞外領域におけるドメインｖ６（ＣＤ４４ｖ６）を含むＣＤ４４のスプライス変異体の発現は、上皮のサブセットに限定されている。ＣＤ４４ｖ６の生理学的役割は今までのところ十分に理解されていない。
【０００６】
ＣＤ４４ｖ６は、その他の変異体エキソン（ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ４４ｖ１０）と同様に、ヒト腫瘍及び正常組織において有利な発現パターンを有する腫瘍関連抗原であることが示されてきており（Heider等, 1995; Heider等, 1996; Dall等, 1996; Beham-Schmid等, 1998; Tempfer等, 1998; Wagner等, 1998）、特定の腫瘍放射免疫療法（ＲＩＴ）における抗体ベースの診断及び治療アプローチに付されてきている（Verel等, 2002; Stromer等, 2000; WO 95/33771; WO 97/21104）。
【０００７】
しかしながら、抗体メイタンシノイドコンジュゲートによって腫瘍細胞を効率的に殺すための必須条件は、標的抗原の十分な内在化である。ＣＤ４４の内在化については、ほんの少数のデータが利用可能である。Bazil et Horejsiは、ＰＭＡを用いた刺激時における白血球ＣＤ４４のダウンレギュレーションは、抗原の内在化よりもむしろ抗原の分断（shedding）により引き起こされることを報告している（Bazil et Horejsi, 1992）。ＣＤ４４の分断は、腫瘍患者及び正常個体の血清中の可溶性ＣＤ４４についての幾つかの報告によっても支持される（Sliutz等, 1995; Guo等, 1994; Martin等, 1997）。Aguiar等による最近の論文において、マトリックス−無傷軟骨細胞上の内在化したＣＤ４４量は４時間で約６％であると決定された（Aguiar等, 1999）。腫瘍細胞における同様の低レベルな内在化ＣＤ４４ｖ６がＢＩＡにより行われた実験において見いだされた。総合すれば、これらのデータはＣＤ４４レセプターは内在化よりも分断に付されやすく、それゆえＣＤ４４特異的抗体はメイタンシノイドコンジュゲートアプローチ用の適切な候補としては考えられないことを示唆している。このことは、ＡｂCD44v6−ＤＭ１が、抗原を欠く細胞と比較して抗原提示細胞に対してわずかに上昇した細胞毒性を示したインビトロ細胞増殖アッセイによって支持されている。
【０００８】
細胞内条件下で切断されるリンカーを介して高度に細胞毒性な薬剤へコンジュゲートしたＣＤ４４特異的抗体が、インビボにおける非常に効果的な腫瘍治療用物質であることが予想外に見いだされた。
本発明は、細胞内条件下で切断されるリンカーを介して高度に細胞毒性な薬剤へコンジュゲートしたＣＤ４４特異的抗体分子からなる新規な化合物を提供する。
特に、本発明は以下の式（Ｉ）で示される化合物を提供する。
Ａ（ＬＢ）n （式（Ｉ））
（式中、
Ａは、ＣＤ４４に特異的な抗体分子であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
Ｂは、細胞に対して有毒な化合物であり、及び
ｎは、１〜１０の１０進数である。）
抗体分子Ａは、ＣＤ４４、好ましくは変異体ＣＤ４４に対して結合特異性を有する。
【０００９】
用語「抗体分子」は、リンパ球により産生され、例えば血清中に存在する完全な免疫グロブリン、ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体、宿主細胞中の組換え発現により産生されかつ免疫グロブリン又はモノクローナル抗体の結合特異性を有するポリペプチド及び前記の免疫グロブリン、モノクローナル抗体又はポリペプチドに由来し、それらの結合特異性を保持しつつ更に加工した分子を包含するだろう。特に、用語「抗体分子」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全な免疫グロブリン、前記免疫グロブリンの断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）2断片（Kreitman等, 1993）、組換えにより生成したポリペプチド、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体（Breitling et Duebel, 1999; Shin等, 1989; Gussow et Seemann, 1991, Winter等, 1994, EP 0 239 400; EP 0 519 596; WO 90/07861 EP 0 368 684; EP 0 438 310; WO 92/07075; WO 92/22653; EP 0 680 040; EP 0 451 216）、一本鎖抗体（scFv, Johnson et Bird, 1991）等を含んでいる。今日、抗体は、実験動物を免疫化することなしに、例えばファージディスプレイ法（Aujame等, 1997; US 5,885,793; US 5,969,108; US 6,300,064; US 6,248,516, US 6,291,158）により生成されるだろう。完全ヒト抗体は、機能性ヒトＩｇ遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して生成されるだろう（EP 0 438 474 ; EP 0 463 151; EP 0 546 073）。前記の参照文献から、当業者は、最新技術の方法、例えばペプチド及び核酸の自動化合成法、実験動物免疫化、ハイブリドーマ技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ベクター及び発現技術、宿主細胞培養及びタンパク質精製方法を使用して、前記の種類の抗体分子をどのようにして生成するかを理解する。以下の記載において、用語「抗体」及び「抗体分子」は互換的に使用される。
【００１０】
「ＣＤ４４に対して特異的」とは、抗体分子がＣＤ４４に存在するエピトープに対して特異的結合親和性を有することを意味する。好ましい態様において、本発明の抗体分子は、ヒトＣＤ４４遺伝子の変異体エキソン（variant exon）ｖ６によりコードされるアミノ酸配列に対して結合特異性を有している。その他の変異体エキソンと同様に変異体エキソンｖ６の配列は当該技術分野において知られている（Screaton等, 1992; Tolg等, 1993; Hofmann等, 1991）。本発明の好ましい抗体分子は、添付する配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその対立変異体（allelic variant）配列を有する又は含むペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子は、前記配列内のエピトープに対する結合特異性を有する。更に好ましくは、本発明の抗体分子は配列番号２に示されるアミノ酸配列、特に好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する。前記の抗体分子は、当該技術分野において既知の方法（WO 95/33771, WO 97/21104）、例えば、前記の配列を有する化学的に合成されたペプチド、例えばハプテンへ結合したものを用いて実験動物を免疫し、又は、前記配列を含む組換えにより生成した融合タンパク質を用いて免疫し、続いて当該技術分野において既知の方法（Harlow 1988; Catty 1988; Koopman等, 1993; Heider等, 1993）にしたがい進めることにより容易に生成されるだろう。
【００１１】
好ましくは、本発明の抗体分子は、１９９４年６月７日にＤＳＭ（Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland/Germany）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４で寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されるマウスモノクローナル抗体（名称ＶＦＦ−１８）である。好ましい抗体分子は、前記モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８のＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）2断片である。別の好ましい態様において、本発明の抗体分子は、ヒト化組換え抗体であって、ＶＦＦ−１８の相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）がヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の各遺伝子へグラフトしている抗体である。
【００１２】
モノクローナル抗体の「相補性決定領域」とは、Chothia 及び Lesk, 1987と関係してKabat等, 1991に従い、特定の抗原結合に関連するモノクローナル抗体のアミノ酸配列であると理解される。
【００１３】
別の好ましい態様において、前記のＣＤＲグラフト抗体の適切なフレームワーク残基は、マウスの残基へと戻されて（revert）、結合親和性を改善する。当該技術分野に関連する方法から、当業者は、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４の前記ハイブリドーマから出発してＶＦＦ−１８のＣＤＲをどのようにして得るか、適切なヒト免疫グロブリン遺伝子をどのようにして選択しかつ入手するか、どのようにして前記ＣＤＲを前記遺伝子へグラフトするか、選択されたフレームワーク残基をどのようにして修飾するか、ＣＤＲ−グラフト抗体を適切な宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でどのように発現させるか、得られた組換え抗体を結合親和性及び特異性についてどのように試験するかを理解する（例えば、前記の文献を参照）。本発明の別の好ましい態様において、本発明の抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体である。好ましくは、前記組換え抗体はヒト化抗体であり、２つの完全な軽鎖及び２つの完全な重鎖から構成される完全免疫グロブリンである。本発明の別の好ましい態様において、抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８と同じイディオタイプを有する組換え抗体である。本発明の別の好ましい態様において、抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８と同じエピトープに結合する組換え抗体である。
【００１４】
特に好ましい態様において、本発明の抗体Ａは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体である。この抗体をＢＩＷＡ４と呼ぶ。これは、前記抗体ＶＦＦ−１８のヒト化バージョンであり、完全ヒトフレームワーク中にマウスモノクローナル抗体ＶＦＦ−１８の相補性決定領域を有し、更にヒト定常領域を有する。それゆえ、前記抗体は、ヒトにおける免疫原性が低く、有利である。しかしながら、前記の抗体は抗原結合を最適化するためのマウスフレームワーク残基を有しないので、親抗体ＶＦＦ−１８のような有意に低い抗原結合親和性を有し、それゆえ、治療剤の良好な候補としては考えられないだろう。予想外に、ＢＩＷＡ４は、結合親和性が低いにも拘わらず、インビボにおいて非常に有利な体内分布及び腫瘍取込を有し、高い結合親和性を有する他のＶＦＦ１８ヒト化バージョンよりも優れたものとしていることが見いだされた。更に好ましい態様において、抗体分子Ａは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体である。この抗体はＢＩＷＡ４よりも高い結合親和性を有し、ＢＩＷＡ８と呼ばれる。
【００１５】
これらの抗体は下記にしたがい生成できるだろう。軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、標準方法により化学的又は酵素的に合成されるだろう。最初に、適切なオリゴヌクレオチドを、合成遺伝子を生成するために使用することができる当該技術分野において既知の方法（例えば、Gait, 1984）を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成する方法は当該技術分野において既知である（例えば、Stemmer等 1995; Ye等 1992; Hayden et Mandecki 1988; Frank等 1987）。好ましくは、ＢＩＷＡ４の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号５及び配列番号７で示される核酸配列を有している。これらの配列は、宿主細胞によって切断されるリーダーペプチドをコードする配列（配列番号５：最初の６０ヌクレオチド、配列番号７：最初の５７ヌクレオチド）を含んでいる。更なる態様において、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、配列番号９及び７に示されるヌクレオチド配列を有している。抗体の重鎖及び軽鎖をコードするこれらの核酸分子を、発現ベクターへクローニング（両方の鎖を１つのベクター分子へ、又は、各鎖を別々のベクター分子へクローニング）し、次いで宿主細胞へ導入する。原核生物又は真核生物宿主細胞における免疫グロブリンの発現に適切な発現ベクター及びベクターの宿主細胞への導入方法は当該技術分野において周知である。一般的に、発現ベクターにおいて、免疫グロブリン遺伝子は、Ｉｇ遺伝子の上流に位置する適切なプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ハムスターユビキチンプロモーター（WO 97/15664）又はシミアンウイルスＳＶ４０プロモーターと機能的に結合している。転写の終結のために、適切な終結部位／ポリアデニル化部位、例えばウシ成長ホルモン又はＳＶ４０の該当部位が用いられるだろう。更に、ＣＭＶ又はＳＶ４０エンハンサー等のエンハンサー配列を含めてもよい。通常、発現ベクターは選択マーカー遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アデニル酸デアミナーゼ遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子若しくはピューロマイシン耐性遺伝子を更に含んでいる。種々の発現ベクターが、会社、例えば、Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI 又は BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAから商業的に入手できる。例えば、発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１（NCBI GenBank 寄託番号 A32111）又はｐＡＤ−ＣＭＶ１９（NCBI GenBank 寄託番号 A32110）を発現のために使用できるだろう。宿主細胞は、好ましくは哺乳類宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ又はＢＨＫ細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ−ＤＵＫＸ（Urlaub 及び Chasin, 1980）、ＣＨＯ−ＤＧ４４（Urlaub等, 1983）又はＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL-61）細胞である。次いで、宿主細胞を、抗体を産生する条件下、適切な培地中で培養し、標準手順にしたがい培地から抗体を単離する。宿主細胞及び各発現ベクター中で組換えＤＮＡから抗体を生成する手順は当該技術分野において周知である（WO 94/11523, WO 97/9351, EP 0 481 790, EP 0 669 986を参照）。
【００１６】
細胞に対して毒性のある化合物Ｂへ抗体分子Ａを連結するために、連結部分（linking moiety）Ｌを使用する。最もシンプルな場合、連結部分Ｌは化学結合、好ましくは細胞内条件下で切断される共有結合である。本発明の一つの態様において、結合は、抗体分子に存在する硫黄原子、例えばシステイン残基の側鎖に存在する硫黄原子と有毒化合物に存在する別の硫黄原子との間の結合である。別の態様において、連結部分Ｌは１以上の原子又は化学基から構成される。適切な連結基は当該技術分野において周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基及びエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましいのはジスルフィド基及びチオエーテル基である。
【００１７】
本発明の抗体分子と有毒化合物とのコンジュゲートは、既知又は今後開発されるあらゆる技術を使用して形成することができる。有毒化合物を修飾して遊離のアミノ基を与え、酸不安定性リンカー又は光不安定性リンカーを介して抗体分子へ連結することができる。有毒化合物をペプチドと凝縮（condense）し、続いて抗体分子と連結してペプチダーゼ不安定性リンカーを生成することができる。有毒化合物を処理して一級（primary）ヒドロキシル基を与え、スクシニル化し、抗体分子へ連結し、細胞内エステラーゼにより切断され遊離薬剤を遊離するコンジュゲートを生成することができる。最も好ましくは、有毒化合物を処理して遊離又は保護されたチオール基を作成し、次いで１つ又は多数のジスルフィド又はチオールを含有する有毒化合物を、ジスルフィド結合を介して抗体分子へ連結する。
【００１８】
例えば、抗体分子を架橋試薬（例えば、N-スクシニミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルエン(SMPT)、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-ブチラート（butyrate）(SDPB)、N-スクシニミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシニミジル-5-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート、2-イミノチオラン又は無水アセチルコハク酸（acetylsuccinic anhydride）を用いて既知の方法により修飾することができる。Carlsson等, 1978、Blattler等 1985、Lambert等, 1983、Klotz等, 1962、Liu等, 1979、Blakey 及び Thorpe, 1988、Worrell等, 1986を参照のこと。好ましい態様において、リンカー部分はＳＰＰ由来の４−チオペンタノエート又は５−チオペンタノエートである。誘導体化された遊離又は保護されたチオール基を含む抗体分子を、ジスルフィド又はチオールを含む有毒化合物と反応させてコンジュゲートを生成する。コンジュゲートはＨＰＬＣ又はゲル濾過により精製することができる。
【００１９】
「有毒」とは、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を引き起こす化合物のことである。カップリングに使用する有毒化合物は細胞分裂停止性又は細胞傷害性に作用し、細胞周期の停止又は細胞死を導くだろう。これらの化合物は、例えば核酸合成に干渉し、核酸を不活性化し又はチューブリンに結合することにより、細胞周期の間の異なるステージで作用してもよい。
【００２０】
好ましい態様において、細胞に対して有毒である化合物Ｂはメイタンシノイド、すなわちメイタンシン（CAS 35846538）の誘導体である。好ましい態様において、化合物ＢはメイタンシノールのＣ−３エステルである。前記メイタンシノイドの製造及び抗体分子への連結を含む癌治療に使用するための抗体へのコンジュゲートに適切なメイタンシノイドは、Chari等の文献に記載されている（Chari等, 1992; Liu等, 1996; 米国特許 No. 5,208,020）。これらのメイタンシノイドを本発明に使用してもよい。好ましい態様において、有毒化合物はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（CAS 番号 139504-50-0）（ＤＭ１とも呼ばれる）である。好ましくは、前記メイタンシノイドは、メイタンシノールのＣ−３部位でジスルフィド架橋を介して抗体分子へ連結したメイタンシノール誘導体である。特に好ましい態様において、抗体／メイタンシノイドコンジュゲートは式（ＩＩ）で示されるメイタンシノイドから製造される。
式（II）：
【００２１】
【化１】
【００２２】
（式中、
Ｒ1はＨ又はＳＲ4であり、Ｒ4はメチル、エチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環式アルキル、単一（simple）又は置換されたアリール又は複素環であり、
Ｒ2はＣｌ又はＨであり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、及び、
ｍは１、２又は３である。）
好ましくは、Ｒ1はＨ、ＣＨ3又はＳＣＨ3であり、Ｒ2はＣｌであり、Ｒ3はＣＨ3であり、ｍ＝２である。
Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である化合物は、文献においてＤＭ１と呼ばれる。
好ましい態様において、本発明の化合物は式（III）で示される。
【００２３】
【化２】
【００２４】
（式中、
Ａは、ＣＤ４４に対して特異的、好ましくは変異体エキソンｖ６に対して特異的、好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して特異的な抗体分子であり、
（Ｌ’）は、任意のリンカー部分であり、
ｐは１〜１０の１０進数である。）
好ましくは、ｐは３〜４、より好ましくは約３．５である。
【００２５】
前記のメイタンシノイドを製造する方法は当該技術分野において既知である（特に、US 5,208,020, Example 1を参照のこと）。好都合なことに、最初の工程において、メイタンシノイドＣ−３エステル アンサミトシン（ansamitocin）Ｐ３は、ノカルディア（Nocardia）又はアクチノシネマ（Actinosynnema）属に属する微生物、例えばＡＴＣＣ ３１５６５、ＡＴＣＣ ３１２８１（US 4,356,265; US 4,450,234; WO 01/77360）の細菌発酵により生成するだろう。アンサミトシンＰ３は、酢酸エチル又はトルエン等の有機溶媒を使用して培養から抽出され、更に、例えばシリカゲルを使用した吸着クロマトグラフィーにより精製してもよい。ＬｉＡｌＨ4（US 4,360,462）又は、つい最近提案されたＬｉＡｌ（ＯＭｅ）3Ｈ若しくはその他のＬｉＡｌ又はＮａＡｌヒドリド（WO 02/16368）を使用してメイタンシノールへ還元してもよい。次いでメイタンシノールを、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び触媒量の塩化亜鉛を使用して、Ｃ−３部位においてＮ−メチル−Ｌ−アラニン又はＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体でエステル化して、ジスルフィド含有メイタンシノイドを得てもよい（US 5,208,020; US 5,416,064; US 6,333,410）。好ましい態様では、メイタンシノールを、下記式の化合物Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニンでエステル化して、式（II）で示されるメイタンシノイド（式中、Ｒ1＝ＳＲ4、Ｒ4＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である）を得る。
【００２６】
【化３】
【００２７】
遊離のチオール基を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いたジスルフィド結合の切断により遊離させ、例えばＤＭ１を得てもよい。
細胞内切断が起こると、遊離の有毒化合物がコンジュゲートＡ（ＬＢ）nから遊離する。化合物Ａ（ＬＢ）nから遊離した遊離薬剤は、式：Ｂ−Ｘ（式中、Ｘは、切断反応に依存して原子又は化学基である）を有しているだろう。好ましくは、Ｘは水素原子、例えばリンカー部分が単なる２つの硫黄原子間の共有結合であるとき、又は、ヒドロキシル基である。リンカー部分が化学基である場合、切断部位はリンカー部分の内部にあってもよく、この場合、切断時に式Ｂ−Ｌ’’Ｘ（式中、Ｘは、切断反応の性質に依存して原子又は化学基である。）で示される遊離薬剤を生成する。好ましくは、Ｘは水素原子又はヒドロキシル基である。
【００２８】
好ましい態様において、式（Ｉ）で示される化合物は、細胞内切断時に遊離する有毒化合物Ｂ、Ｂ−Ｘ又はＢ−Ｌ’’Ｘよりも毒性が低い。インビトロで毒性を試験する方法は当該技術分野において既知である（Goldmacher等, 1985; Goldmacher等, 1986; US 5,208,020, Example 2も参照のこと）。好ましくは、化合物（Ｉ）は、切断時に遊離する遊離薬剤よりも１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、更に好ましくは１０００倍以上毒性が低い。
【００２９】
好ましくは、抗体分子／メイタンシノイドコンジュゲートは、前記のようにジスルフィド結合を介して連結しており、メイタンシノイド分子を送達することができるものである。前記の細胞結合コンジュゲートは、既知の方法、例えば、モノクローナル抗体をスクシニミジル ピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）又はスクシニミジル ピリジル−ペンタノエート（ＳＰＰ）で修飾することにより製造される（Carlsson 等, 1978）。得られたチオピリジル基を、チオール含有メイタンシノイドを用いた処理により置換し、ジスルフィド連結コンジュゲートを生成する。代わりに、アリールジチオメイタンシノイドの場合、抗体コンジュゲートの形成は、抗体分子へ予め導入したスルフヒドリル基によるメイタンシノイドのアリール−チオールの直接置換によって達成される。ジスルフィド架橋を介して連結した１〜１０のメイタンシノイド薬剤を含むコンジュゲートは、いずれかの方法により容易に製造される。これに関連して、式Ａ（ＬＢ）nの１０進数ｎは、与えられた製造品の全てのコンジュゲート分子が、抗体分子へと付着した同一整数値のＬＢ残基を有しているとは限らない平均値であることが理解される。
【００３０】
より詳細には、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、濃度が１ｍｇ／ｍｌのジチオピリジル修飾抗体溶液を、チオール含有メイタンシノイド（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）で処理する。修飾抗体からのピリジン−２−チオン（thione）の遊離を、３４３ｎｍで分光光度的にモニターし、約３０分間で完了する。セファデックス（Sephadex）G-25カラムを通したゲル濾過により、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを精製し、未反応薬剤及びその他の低分子量物質を含まないようにする。１つの抗体分子に結合したメイタンシノイドの数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比を測定することにより決定することができる。抗体分子あたり平均１〜１０メイタンシノイド分子は、この方法によりジスルフィド結合を介して連結することができる。
【００３１】
更なる側面において、本発明はＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲートに関する。本明細書において、「ＣＤ４４ｖ６特異的」とは、抗体がＣＤ４４、好ましくはヒトＣＤ４４の変異体エキソンｖ６によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチドに存在するエピトープに対して特異的結合親和性を有することを意味する。本発明の好ましい抗体分子は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体を有する又は含むペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子は前記アミノ酸配列内のエピトープに対して結合特異性を有する。より好ましくは、抗体分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、より好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する。
【００３２】
好ましくは、本発明のコンジュゲートにおける抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８（ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４）又はＶＦＦ−１８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する組換え抗体である。より好ましくは、本発明の抗体は配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。
メイタンシノイドは、好ましくはジスルフィド部分により抗体へ連結し、式（ＩＶ）で示される。
【００３３】
【化４】
【００３４】
（式中、抗体への連結は、式ＩＶに示される硫黄原子から抗体分子に存在する第二の硫黄原子を介している）前記の結合に利用可能な硫黄原子を作成するために、前述の適切なリンカーの導入により抗体分子を修飾してもよい。好ましくは、メイタンシノイドは、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−又は−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−基を介して抗体分子へ連結する。前記のリンカー基中の硫黄原子はメイタンシノイドと共にジスルフィド結合を形成するが、カルボニル基は抗体分子のアミノ酸残基の側鎖に存在するアミノ基と結合してもよい。
そのように、１以上のメイタンシノイド残基を抗体分子へ連結してもよい。好ましくは、３〜４のメイタンシノイド残基を抗体分子へ連結する。
【００３５】
最も好ましいのは、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲートであって、抗体が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み、メイタンシノイドは式（ＩＶ）：
【００３６】
【化５】
【００３７】
で示され、
ジスルフィド結合を介して抗体分子へ連結しているものである。好ましくは、連結基は−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−又は−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−であり、抗体分子あたりの結合メイタンシノイド残基の数は３〜４である。
【００３８】
更なる態様において、本発明は式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）遊離又は保護されたチオール基を、ＣＤ４４に特異的な抗体分子へ導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体分子と細胞に対して有毒な化合物とを反応させる工程であって、該化合物が１以上のジスルフィド基又はチオール基を有している工程、及び
（ｃ）得られたコンジュゲートを回収する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３９】
好ましくは、抗体はＣＤ４４ｖ６に特異的であり、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列に特異的である。細胞に対して有毒な化合物は、好ましくはメイタンシノイド、より好ましくは式（ＩＩ）で示される化合物、最も好ましくは式（ＩＩ）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である化合物である。更に好ましい態様において、抗体分子は、配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。
【００４０】
本発明の方法の好ましい態様において、（２−ピリジル）−３−ジチオプロパン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）、（２−ピリジル）−４−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタノエート）又は（２−ピリジル）−５−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−５−（２−ピリジルジチオ）−ペンタノエート）を使用して、遊離又は保護されたチオール基を抗体分子へ導入する。更に本発明は前記方法により得られる化合物に関する。
【００４１】
更なる態様において、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物、又は前述のコンジュゲートを、好ましくは医薬的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む医薬組成物に関する。
【００４２】
適切な医薬的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤は周知であり、臨床状態の根拠（clinical situation warrant）として当業者により決定することができる。適切な担体、賦形剤及び／又は希釈剤には、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）及び（３）５％（ｗ／ｖ）グルコースが含まれる。
【００４３】
より好ましくは、医薬組成物中に存在する抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８又は抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体、好ましくはヒトフレームワークにおけるものである。更に好ましい態様において、抗体は、配列番号４又は８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。好ましくは、有毒化合物は式（ＩＩ）で示されるメイタンシノイドである。
【００４４】
本発明の化合物は、あらゆる種類の臨床又は非臨床用途であって、有毒化合物がＣＤ４４、好ましくはＣＤ４４ｖ６を細胞表面で発現する細胞を標的とする用途に使用することができるだろう。
【００４５】
例えば、コンジュゲートは生体外（ex vivo）で臨床的に用いられて、癌治療における自家移植前に骨髄から腫瘍細胞を除去するだろう。処理は下記の通り行うことができる。骨髄を患者又はその他の個体から収集し、本発明の式（Ｉ）で示される化合物を濃度範囲約１０μＭ〜１ｐＭを添加した血清含有培地中で約３０分間〜約４８時間、約３７℃でインキュベートする。インキュベーションの濃度及び時間の正確な条件（＝用量）は、当業者によって容易に決定することができる。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、既知の方法にしたがい静脈内注入により患者へ戻す。患者が骨髄収集と処理細胞の再注入との間にその他の治療、例えば切除化学療法（ablative chemotherapy）又は全身照射を受ける状況では、処理骨髄細胞を標準医療機器を用いて液体窒素中で凍結保存する。
【００４６】
更なる態様において、本発明は癌の治療方法であって、前記の医薬組成物を患者へ適用する工程を含むことを特徴とする方法に関する。特に、本発明のこの側面は癌治療を必要とする患者へ、前記の化合物又は医薬組成物の治療学的有効量を投与する工程を含むことを特徴とする方法に関する。好ましくは、癌は頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、食道ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚ＳＣＣ、乳腺癌（ＡＣ）、肺ＡＣ、頸部ＡＣ、膵臓ＡＣ、大腸ＡＣ又は胃ＡＣである。
【００４７】
癌の臨床治療について、本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、無菌性及び内毒素レベルについて試験する溶液として供給されるだろう。コンジュゲート投与の適切なプロトコルの例は以下の通りである。コンジュゲートを、静脈内大量瞬時投与又は５日間の連続注入として、１〜６週間の間、毎週与えてもよい。大量瞬時投与は、５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加した５０〜１００ｍｌの正常生理的食塩水において与えることができる。連続注入は、２４時間につき、２５〜５０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加した２５０〜５００ｍｌの正常生理的食塩水において与えることができる。用量は、一般的に１回の投与につき１０〜４００ｍｌ／ｍ2体表面積であろう。１回の投与につき患者へ適用される用量は、十分に効果的であるが、毒性限界投与量（dose limiting toxicity）（ＤＬＴ）未満でなければならない。一般的に、ＤＬＴ未満の十分に許容的な用量が最大許容投与量（ＭＴＤ）であろう。当業者はＭＴＤをどのように決定するかを知っている（Lambert等, 1998）。毎週の投与について、ＭＴＤは１００〜２００ｍｇ／ｍ2の範囲であることが予想できる。代わりに、投与間の間隔は、長くてもよく、例えば２〜４週間、好ましくは３週間であってもよい。この場合、ＭＴＤは２００〜３００ｍｇ／ｍ2の範囲であることが予想できる。代わりに、投与は５日間用量であり、数週間の中断に続き、その後処理を繰り返してもよい。この場合、１回の投与あたりのＭＴＤは１００ｍｇ／ｍ2よりも低いことが予想できる。例えば、コンジュゲートを、速度３ｍｇ／分の単一の静脈内注入として２１日ごとに投与することができる。７サイクルまでの治療が適用された。適用される用量は、臨床状況が要求する場合、前記の範囲外であってもよいことが理解されるべきである。例えば、ＭＴＤが示されるよりも高いことが見いだされる場合、単一投与は４００ｍｌ／ｍ2よりも高く、又は毎週２００ｍｇ／ｍ2よりも高くてもよいだろう。
【００４８】
用量、投与経路、適用スキーム、治療の反復及び期間は、一般的に病気の性質（腫瘍の型、グレード及びステージ等）及び患者の性質（体質、年齢、性別等）に依存し、治療の責任を負う医療専門家により決定されるだろう。固形腫瘍の治療の他に、本発明にしたがう治療適用は、微小残存病変を治療するための外科的処置のアジュバントとして特に有利であろう。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、癌治療用医薬組成物の製造における式（Ｉ）で示される化合物の使用に関する。より好ましくは、医薬組成物中に存在する抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８又は抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体、好ましくはヒトフレームワークにおけるものである。最も好ましくは、抗体は、配列番号４又は８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。好ましくは、有毒化合物は式（ＩＩ）で示されるものである。好ましくは、癌は頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、食道ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚ＳＣＣ、乳腺癌（ＡＣ）、肺ＡＣ、頸部ＡＣ、膵臓ＡＣ、大腸ＡＣ又は胃ＡＣである。
【００５０】
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【００５３】
実施例
１．材料及び方法
１．１．インビトロ細胞増殖アッセイ
生存細胞を決定するために、Cell Titer 96（登録商標）AQueous非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用した。１ウェルにつき５０００個の細胞を９６ウェルプレートのフェノールレッドを含まない９０μｌ培地へ播いた。細胞を１〜３時間落ち着かせ（settle down）、１０μｌ ＰＢＳ中の免疫コンジュゲートの連続希釈物を添加した。免疫コンジュゲートなしの細胞はネガティブコントロールとして役立った。細胞を、加湿５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で４日間インキュベートし、次いで２０μｌ ＭＴＳ／ＰＭＳを製造者の勧めにしたがい添加した。更に３７℃で１〜４時間インキュベートした後、４９０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して記録した。各細胞系につき、三重に分析した。生存細胞フラクションの百分率及びＩＣ５０値をGraphPad Prism（登録商標）（バージョン３．０）ソフトウェアを使用して計算した。
【００５４】
１．２．ＢＩＷＩ１の製造
以下に示すようにして、配列番号１内のエピトープに対して結合特異性を有するヒト化組換え抗体ＢＩＷＡ４及びＢＩＷＡ８を、メイタンシノイドＤＭ１へ連結した。ＢＩＷＡ４とＤＭ１とのコンジュゲートをＢＩＷＩ１と表す。
安定してトランスフェクトする細胞系の生成。ＢＩＷＡ４の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子、配列番号５及び配列番号７を発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１（WO92/01055; NCBI GenBank Accession No. A32111）又はｐＡＤ−ＣＭＶ１９（NCBI GenBank Accession No. A32110）へ連結した。第二の抗体ＢＩＷＡ８において、軽鎖は配列番号９で示される配列を有する遺伝子によりコードされた。一方、重鎖はＢＩＷＡ４と同一であった。安定してトランスフェクトする細胞系を以下に示すようエレクトロポレーションにより生成した。ＣＨＯ ＤＵＸ／５７ｓｓ（無血清懸濁培養に適合した、チャイニーズハムスター卵巣細胞のｄｈｆｒネガティブ変異体）を使用した。トリプシニセーション（trypsinisation）及びＲＰＭＩ−１０（９０％ ＲＰＭＩ１６４０，１０％熱不活性化ウシ胎仔血清）を用いたトリプシンの不活性化の後、細胞をＲＰＭＩ−０（血清を含まないＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄し、１×１０7個の細胞を０．８ｍｌ ＲＰＭＩ−０中に再懸濁した。線状化ＤＮＡ（プラスミドあたり２０μｇ，軽鎖及び重鎖をコードするベクターの同時トランスフェクション）の添加後、細胞を以下の条件下でHoefer Electroporatorを使用したエレクトロポレーションに付した。１０８０μＦ，３２０Ｖ，１０００ｍｓｅｃ，１パルス。細胞を５分間静置し、α−ＭＥＭ １０ｄ（リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まない９０％ ＭＥＭ−α（GIBCO BRL）、１０％熱不活性化透析ウシ胎仔血清）中、１２５００細胞／ｍｌ及び２５００細胞／ｍｌまで希釈した。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート（２００μｌ／ウェル，それぞれ２５００及び５００細胞／ウェルに対応する）へ播いた。１０日後にクローンが現れた。５００細胞／ウェルのプレートのみを追跡した（３〜６クローン／ウェル）。１４〜１５日後、各ウェルからの上清をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験した。５３クローンを１２ウェルプレートのα−ＭＥＭ１０ｄへ播いた。３〜６日（細胞の集密度に依存する）後、上清をκ／γ ＥＬＩＳＡ（連続希釈）において再度試験し、ヒトＩｇＧ１標準を使用して定量化した。細胞を凍結し、液体窒素中で保存した。５３クローンのＩｇＧ含量は１２〜４１７ｎｇ／ｍｌの範囲であった。最高の発現レベルを有する１０のクローンを選択し、以下の通りサブクローニングした。各クローンの細胞を、１００μｌ／ウェル α−ＭＥＭ１０ｄ中５細胞／ウェルの密度（各クローン及び各密度につき１プレート）で９６ウェルマイクロタイタープレートへ播いた。８日後、上清を１：２に希釈し、１００μｌの希釈物をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験し、ＢＩＷＡ４調製物を標準として用いて定量化した。各クローンにつき５つのサブクローンを１２ウェルプレートへ移した。ＩｇＧ含量は１．３〜９０８ｎｇ／ｍｌの範囲であった。最高の発現レベル（３８４〜９０８ｎｇ／ｍｌ）を有する１４のクローンを、以下に示すようにメトトレキセートと一緒の増幅に使用した。始めにクローンを、α−ＭＥＭ１０ｄを２０、５０及び１００ｎＭのメトトレキセートと共に含む２５ｃｍ2フラスコ中で培養した。クローンの増殖後、上清をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験した。次ラウンドの増幅において、メトトレキセート濃度を２０００ｎＭまで上昇させた。最初に、最高の発現レベルは１０．５〜１４．８μｇ／ｍｌ（クローンＡ３１／１００，１００ｎＭメトトレキセート）であった。濃度５００ｎＭのメトトレキセートを用いた更なる増幅は１９〜２０μｇ／ｍｌの発現を与えた（Ａ３１／５００）。
【００５５】
抗体の精製。抗体を、以下に示すようにして細胞培養上清から精製した。抗体含有組織培養上清を、５ｍｌプロテインＡセファロースカラムへ、４℃下、流速８０〜９０ｍｌ／ｈで適用した。５０ｍｌの結合緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム ｐＨ７．５）で洗浄した後、Ｉｇフラクションを溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．７）で溶離させた。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。
【００５６】
ＳＰＰを用いたＢＩＷＡ４の修飾によるＢＩＷＡ４−ＳＳ−Ｐｙの形成。ＢＩＷＡ４をＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ製剤中、濃度５ｍｇ／ｍｌの液体形態で供給した。ＤＭ１をＭＡｂに結合する前に、Ｔｗｅｅｎ２０を除去した。ＭＡｂ溶液（４０ｍｌ）を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６）（ＭＥＳ緩衝液）で１５倍に希釈し、次いでＭＥＳ緩衝液中で平衡化したセファロースＳカラム（１２．５ｍｌ）へロードした。カラムを１０カラム用量のＭＥＳ緩衝液で洗浄した。抗体を４００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＭＥＳ緩衝液で溶離した。抗体溶液を、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）に対して透析した。ＢＩＷＡ４抗体をＳＰＰ（（２−ピリジル）−５−ジチオペンタン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）で修飾してジチオピリジル基を導入した。緩衝液Ａ中のＭＡｂ（１８５ｍｇ、８ｍｇ／ｍｌ）を、７倍をこえるモル量のＳＰＰでＥｔＯＨ中（ＭＡｂ溶液の５％ｖ／ｖ）で修飾した。周囲温度下で反応を９０分間進めた。次いで反応混合物を、緩衝液Ａで平衡化したセファデックスＧ２５Ｆ（２．６×３１．５ｃｍカラム、１６７ｍｌ）を通してゲル濾過クロマトグラフィーに付した。ＭＡｂ含有フラクションをプールし、修飾の程度を２８０ｎｍにおける吸光度及びＤＴＴ添加による２−メルカプトピリジンの遊離により引き起こされる３４３ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより決定した。遊離した２−メルカプトピリジンの濃度を、８０８０Ｍ-1ｃｍ-1のε343nmを用いて計算し、ＭＡｂの濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度を２−メルカプトピリジンからの寄与について補正した後、２２４，０００Ｍ-1ｃｍ-1のε280nmを使用して計算した（２−メルカプトピリジン Ａ280nm＝Ａ343nm×５１００／８０８０）。１ＭＡｂ分子につき５．５の遊離可能な２−メルカプトピリジンが連結したＭＡｂの回収は９９．６％であった。
【００５７】
ＢＩＷＡ４−ＳＳ−ＰｙとＤＭ１とのコンジュゲーション。緩衝液Ａ中の前記修飾ＭＡｂ（１８４ｍｇ）を、２．５ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌで、遊離可能な２−メルカプトピリジン基に対して１．７倍をこえるモル量のＤＭ１を使用してコンジュゲートした。ＤＭ１をＤＭＡ中に添加（ＭＡｂ溶液の３％ｖ／ｖ）し、反応混合物を周囲温度下で２９時間インキュベートした。次いでコンジュゲートを、ＰＢＳ中で平衡化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ３００ ＨＲのカラム（５×５０ｃｍカラム、９８０ｍＬ、流速１０ｃｍ／ｈｒ）中のゲル濾過クロマトグラフィーにより単離した。コンジュゲートは、初期に溶離する少量のタンパク質を伴って、単量体ＭＡｂの位置にある単一ピークとして溶離した。フラクションを、ＭＡｂ分子あたりに連結したＤＭ１分子数についてアッセイした。（連結したＤＭ１分子は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。）結果に基づいて、カラム容量の６３〜７７％に相当するフラクションをプールした。プールした溶液中のＤＭ１／ＭＡｂ比は３．１であることが見いだされ、コンジュゲートしたＢＩＷＡ４の収率は出発ＭＡｂに基づくと７５％であった。コンジュゲートＢＩＷＩ１を非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、少量の二量体コンジュゲート（＜５％）を伴って主に単量体種（＞９５％）から構成されることが見いだされた。
【００５８】
ＢＩＷＩ１のインビトロ結合の分析。ＢＩＷＡ４抗体及びＢＩＷＩ１コンジュゲートの抗原陽性ＦａＤｕ細胞への結合を決定した。細胞（１〜２×１０-5）を、抗体又はコンジュゲート濃度を変化させた９６ウェルプレート中、氷中で１時間インキュベートした。試験物品をプレートから洗い出し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧを添加し、氷中でのインキュベーションを暗闇中で１時間続けた。洗浄後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。ＢＩＷＡ４抗体は見かけＫD値１×１０-9Ｍで結合し、ＢＩＷＩ１は見かけのＫD値１．８×１０-9Ｍで結合した。従って、ＤＭ１とのコンジュゲートは抗体のみの結合親和性をたとえあったとしてもわずかに変化させるものである。
【００５９】
１．３．ヌードマウスにおける有効性の研究
ＢＩＷＩ１のインビボ抗腫瘍の有効性を、抗原陽性ヒト腫瘍を適用した２種のヌードマウス異種移植モデル（腫瘍の起源、ＣＤ４４ｖ６発現の程度及び均一性で異なるＡ４３１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５；外陰の類表皮癌）及びＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ４３；咽頭の扁平上皮癌））において試験した。腫瘍細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕをＡＴＣＣから受領し、１０％ウシ胎仔血清及びサプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
マウスを以下の処理グループ（処理／初期平均腫瘍体積／腫瘍体積範囲／マウスの数）へ無作為化した。
Ａ４３１
グループ1 対照(PBS)/185±217mm3/19〜424mm3/5匹
グループ2 BIWA4(21mg/kg/d)/133±115mm3/42〜302mm3/5匹
グループ3 BIWI1(2.1mg/kg/d)/107±63mm3/42〜205mm3/5匹
グループ4 BIWI1(7mg/kg/d)/132±73mm3/42〜205mm3/5匹
グループ5 BIWI1(21mg/kg/d)/107±63mm3/42〜205mm3/5匹
ＦａＤｕ
グループ1 対照(PBS)/142±82mm3/34〜268mm3/8匹
グループ2 BIWA4(21mg/kg/d)/134±86mm3/42〜268mm3/6匹
グループ3 BIWI1(2.1mg/kg/d)/149±96mm3/50〜268mm3/6匹
グループ4 BIWI1(7mg/kg/d)/132±97mm3/42〜268mm3/6匹
グループ5 BIWI1(21mg/kg/d)/129±74mm3/50〜231mm3/6匹
【００６０】
１×１０6個の腫瘍細胞を、６週齢の雌ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウスの右側へ皮下移植した。腫瘍が１０７〜１８５ｍｍ3の平均サイズに達したときに処理を開始した。処理は、第１日から開始して５日連続のＢＩＷＩ１の静脈内注入から構成された。ＢＩＷＩ１の３つの異なる用量（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は３０μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する。７ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は１００μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する。２１ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は３００μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する）を平行して試験した。対照動物は未処理（ＰＢＳ）又は非コンジュゲート抗体（対照抗体、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）処理であった。腫瘍の増殖は腫瘍の大きさを測定することによりモニターした。処理開始後のいずれかの時点で腫瘍が完全に消失したとき、腫瘍寛解を完全寛解として評価した。寛解は、処理後に腫瘍体積は減少したがその後再成長を開始たとき、寛解を部分寛解として評価した。処理の耐容性は、全観察期間の間マウス体重を測定することによりモニターした。
【００６１】
２．結果と考察
２．１．ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性
ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性を、抗原陽性細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕ並びに抗原陰性細胞系Ａ４５９を使用して評価した。細胞を異なる濃度のＢＩＷＩへ４日間暴露し、次いでＭＴＳ／ＰＭＳで染色し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでアッセイした。細胞の生存フラクションをGraphPad Prism（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して計算した。結果を図１に示す。ＢＩＷＩ１は、約７．６×１０-8ＭのＩＣ50で抗原陽性Ａ４３１細胞の殺傷に有効であり、約２．４×１０-8ＭのＩＣ50で第二の抗原陽性細胞系ＦａＤｕの殺傷に有効であった。抗原陰性細胞系Ａ５４９は、約１．３×１０-7ＭのＩＣ50でコンジュゲートによる影響を受け、試験したＢＩＷＩ１の最高濃度（５×１０-7Ｍ）で生存フラクションの５０％が生存した。これらの結果はＢＩＷＩ１はインビトロにおいて抗原陰性細胞よりも抗原陽性細胞に対してわずかに細胞傷害性が高いことを示している。比較として、別のＤＭ１抗体コンジュゲートは、抗原陰性細胞と比較して抗原陽性細胞に対して少なくとも１０００倍高いの細胞傷害性を示した（Chari等, 1992）。
【００６２】
２．２．Ａ４３１異種移植ヌードマウスにおける有効性
５匹のマウスからなるグループを、２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１及び２１ｍｇ／ｋｇ／ｄの対照抗体でそれぞれ処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ１８５±２１７ｍｍ3（ＰＢＳ）、１３３±１１５ｍｍ3（対照抗体）、１０７±６３ｍｍ3（２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）、１３２±７３ｍｍ3（７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）及び１０７±６３ｍｍ3（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図２に示す。対照抗体で処理した腫瘍は未処理腫瘍と同様に成長を示し、腫瘍体積倍加時間は約５日であった。７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１又は２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１のいずれかで処理した動物において、約１７日で全ての腫瘍は完全寛解し、消失した。観察期間の終了（１３４日）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理した腫瘍は３／５のケースで完全寛解し、１３４日まで腫瘍は再成長しなかった。残りの２つの腫瘍は部分寛解を示したが、最終的には再成長した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１はＡ４３１異種移植ヌードマウスにおいて、２．１〜２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で完全寛解及び持続的な寛解をもたらす用量依存的抗腫瘍反応を誘導することを示している。非コンジュゲート対照抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。
図２参照
【００６３】
２．２．ＦａＤｕ異種移植ヌードマウスにおける有効性
６匹のマウスからなるグループを、２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１及び２１ｍｇ／ｋｇ／ｄの対照抗体でそれぞれ処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ１４２±８２ｍｍ3（ＰＢＳ）、１３４±８６ｍｍ3（対照抗体）、１２９±７４ｍｍ3（２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）、１３２±９７ｍｍ3（７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）及び１４９±９６ｍｍ3（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図３に示す。対照抗体及び２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理した腫瘍は未処理腫瘍と同様の成長を示し、腫瘍体積倍加時間は約５日であった。２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理した動物において、約２４日で全ての腫瘍が完全寛解し、消失した。観察期間の終了（１０７日）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。７ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理した腫瘍は１／６のケースで完全寛解を示し、３／６の腫瘍は部分寛解を示した。残りの２つの腫瘍は未処理対照腫瘍と同様の成長を示した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１はＦａＤｕ異種移植ヌードマウスにおいて、７〜２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で完全寛解及び持続的な寛解をもたらす用量依存的抗腫瘍反応を誘導することを示している。非コンジュゲート対照抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。
図３参照。
【００６４】
２．４．ヌードマウスにおける耐容性
ＢＩＷＩ１処理の耐容性を、２モデルの実験の全期間の間マウス体重をモニターすることにより決定した。観察された１グループあたりの平均体重の最大減少は、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理したＦａＤｕ異種移植マウスにおける５％であった（図４）。体重減少は処理３日目ごろから始まり１０日目まで続き、その後、動物は体重を回復し、対照動物と同様の挙動を示した。その他の用量グループにおいて、体重減少はビヒクル対照（ＰＢＳ）と同様であった。全ての処理グループにおける５％以下の平均体重減少は、ヌードマウスにおいて与えられた用量でのＢＩＷＩ１処理の良好な耐容性を示している。ＢＩＷＩ１はマウスＣＤ４４ｖ６と交差反応しないので、本実験では遊離のＤＭ１により引き起こされる毒性などの抗原−非依存性作用のみをモニターすることができる。
【００６５】
３．ＭＤＡ−ＭＢ４５３におけるインビボでの抗腫瘍有効性
３．１．材料及び方法
ＢＩＷＩ１のインビボでの抗腫瘍有効性を、抗原陽性ヒト腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３１、乳癌）を適用するヌードマウス異種移植モデルにおいて試験した。細胞をＡＴＣＣから受領し、１０％ウシ胎仔血清及びサプリペントを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。１×１０6個の腫瘍細胞を、６週齢の雌ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウスの右側へ皮下移植した。治療実験のために、腫瘍フラグメントの継代を通して腫瘍を維持した。腫瘍が１８８〜２４６ｍｍ3の平均サイズに達したときに処理を開始した。処理は、週１回で４週間のＢＩＷＩ１の静脈内注入から構成された。ＢＩＷＩ１の３つの異なる用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は１００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する。１２．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は２００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する。２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は４００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する）を平行して試験した。ＰＢＳ処理動物は腫瘍成長の対照として役立った。腫瘍の増殖は腫瘍の大きさを測定することによりモニターした。処理開始後のいずれかの時点で腫瘍が完全に消失したとき、腫瘍寛解を完全寛解として評価した。
【００６６】
３．２．結果及び検討
６匹のマウスからなるグループを、６．２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１、１２．５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１及び２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１でそれぞれ週に１回で４週間処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ２４６±７９ｍｍ3（ＰＢＳ）、２１６±８５ｍｍ3（６．２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）、１８８±７９ｍｍ3（１２．５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）及び２０７±９６ｍｍ3（２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図５に示す。対照腫瘍の初期の腫瘍体積倍加時間は約５日であった。２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１で処理した動物において、処理開始後約２２日で全ての腫瘍が完全寛解し、消失した。観察期間の終了（６４日目）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。１２．５ｍｇ／ｋｇ又は６．２５ｍｇ／ｋｇで処理した腫瘍は各グループの５／６のケースで完全寛解を示し、各グループの４匹は実験の終了まで無腫瘍を維持した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３異種移植ヌードマウスにおいて、６．２５〜２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１で週に１回で４週間投与したとき、完全寛解及び持続的な寛解をもたらす、優れた抗腫瘍反応を誘導することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性を示す。抗原陽性細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕ並びに抗原陰性細胞系Ａ５４９を使用した。
【図２】図２は、Ａ４３１腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理の開始（１日目）を示す。
【図３】図３は、ＦａＤｕ腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理の開始（１日目）を示す。
【図４】図４は、ＢＩＷＩ１処理の耐容性を示す。２つの独立したモデルにおける全処理グループの平均体重の変化を示す。１日目に処理を開始した。
【図５】図５は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理日を示す。
本発明は、抗体と細胞傷害性化合物との新規なコンジュゲート、前記コンジュゲートを含む医薬組成物及びそれらの腫瘍治療における使用に関する。
【０００２】
抗悪性腫瘍薬の腫瘍への標的化された送達により局所濃度を上昇させるために、当該薬を腫瘍関連抗原に対する抗体へコンジュゲートすることにより、当該薬の効力を改善する試みが多数存在している。これらの試みは限られた成果を達成しており、失敗を説明する幾つかの原因が文献で検討されてきている。化学量論的に作用する抗癌剤、例えばドキソルビジン又はメトトレキセートについては、必要な細胞傷害性を発揮するためには比較的高い細胞内濃度が必要とされる。多くの抗体−薬物コンジュゲートは、下記の理由（ａ）〜（ｄ）により、このような濃度を達成するのが困難であると考えられている。（ａ）多数の一般的な抗癌剤の効力が不十分なこと、（ｂ）抗原標的の細胞表面濃度が低いこと、（ｃ）抗原−抗体複合体の標的細胞への内在化（internalization）が不十分なこと及び（ｄ）標的細胞内部でコンジュゲートから遊離薬物の放出が不十分なこと（Chari等, 1992）。
【０００３】
前記の欠点のうち２つ、すなわち（ａ）及び（ｂ）は、Chari等の研究により取り扱われてきた（Chari等, 1992; Liu等, 1996; 米国特許No. 5,208,020）。彼らは抗体コンジュゲートを開発した。この抗体コンジュゲートでは、抗体がジスルフィド結合を介してメイタンシノイド（maytansinoid）に連結している。メイタンシン（maytansine）はＡｎｓａマクロライド抗生物質のクラスに属し、ノカルジア種（Nocardia sp.）に由来する。細菌発酵により生成するメイタンシン アンサミトシン（ansamitocin）Ｐ−３は、メイタンシノイドＤＭ１を製造するための前駆体分子として使用される。メイタンシン及び誘導体は、ビンクリスチンと同様に抗有糸分裂剤（チューブリンの重合阻害剤）として作用するが、ビンクリスチン及びその他の確立された化学療法剤（ＤＭ１はインビトロにおいて濃度〜１０-10で細胞に対して有毒である）よりも著しく高い効力を有する。遊離のメイタンシノイドの高細胞傷害性とは対照的に、抗体コンジュゲートは、抗原陰性細胞に対しては抗原陽性細胞と比較して数桁低い毒性を有している。ジスルフィド結合による連結は、当該結合が細胞内グルタチオンによって標的細胞内で容易に切断され、高毒性の遊離薬剤を放出させることができるという利点を有している。このアプローチは、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＣ２４２−ＤＭ１コンジュゲート（Liu等, 1996; Lambert等, 1998）及びＨｕＮ９０１−ＤＭ１（Chari等, 2000）等へ適用されてきている。しかしながら、これらのコンジュゲートの適用は、それぞれの標的抗原の制限された発現により制限される。例えば、Ｎ９０１により認識される抗原（ＣＤ５６、Ｎ−ＣＡＭ）は、神経内分泌起源の腫瘍により支配的に発現されている。Ｃ２４２抗原（ＣａｎＡｇ）は、胃腸管由来の腫瘍にほとんど限定される。
【０００４】
しかしながら、有利な抗原発現パターン、標的組織内での高度かつ特異的な細胞表面抗原濃度を有する適切な腫瘍関連抗体並びに抗原複合体化抗体コンジュゲートを細胞へ運搬する効率的な内在化方法を発見することによりこのアプローチを改良することのニーズが依然として存在している。
【０００５】
ＣＤ４４は、多種多様の細胞型の表面上に幾つかの異なるアイソフォームで発現するタンパク質である。最小のアイソフォームである標準ＣＤ４４（ＣＤ４４ｓ）は、種々の異なる細胞により発現されるものであり、細胞が細胞外マトリックス成分へ付着することを媒介し、リンパ球及び単球の活性化における同時刺激（co-stimulus）を伝達すると考えられている。対照的に、細胞外領域におけるドメインｖ６（ＣＤ４４ｖ６）を含むＣＤ４４のスプライス変異体の発現は、上皮のサブセットに限定されている。ＣＤ４４ｖ６の生理学的役割は今までのところ十分に理解されていない。
【０００６】
ＣＤ４４ｖ６は、その他の変異体エキソン（ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ５、ＣＤ４４ｖ７／ｖ８、ＣＤ４４ｖ１０）と同様に、ヒト腫瘍及び正常組織において有利な発現パターンを有する腫瘍関連抗原であることが示されてきており（Heider等, 1995; Heider等, 1996; Dall等, 1996; Beham-Schmid等, 1998; Tempfer等, 1998; Wagner等, 1998）、特定の腫瘍放射免疫療法（ＲＩＴ）における抗体ベースの診断及び治療アプローチに付されてきている（Verel等, 2002; Stromer等, 2000; WO 95/33771; WO 97/21104）。
【０００７】
しかしながら、抗体メイタンシノイドコンジュゲートによって腫瘍細胞を効率的に殺すための必須条件は、標的抗原の十分な内在化である。ＣＤ４４の内在化については、ほんの少数のデータが利用可能である。Bazil et Horejsiは、ＰＭＡを用いた刺激時における白血球ＣＤ４４のダウンレギュレーションは、抗原の内在化よりもむしろ抗原の分断（shedding）により引き起こされることを報告している（Bazil et Horejsi, 1992）。ＣＤ４４の分断は、腫瘍患者及び正常個体の血清中の可溶性ＣＤ４４についての幾つかの報告によっても支持される（Sliutz等, 1995; Guo等, 1994; Martin等, 1997）。Aguiar等による最近の論文において、マトリックス−無傷軟骨細胞上の内在化したＣＤ４４量は４時間で約６％であると決定された（Aguiar等, 1999）。腫瘍細胞における同様の低レベルな内在化ＣＤ４４ｖ６がＢＩＡにより行われた実験において見いだされた。総合すれば、これらのデータはＣＤ４４レセプターは内在化よりも分断に付されやすく、それゆえＣＤ４４特異的抗体はメイタンシノイドコンジュゲートアプローチ用の適切な候補としては考えられないことを示唆している。このことは、ＡｂCD44v6−ＤＭ１が、抗原を欠く細胞と比較して抗原提示細胞に対してわずかに上昇した細胞毒性を示したインビトロ細胞増殖アッセイによって支持されている。
【０００８】
細胞内条件下で切断されるリンカーを介して高度に細胞毒性な薬剤へコンジュゲートしたＣＤ４４特異的抗体が、インビボにおける非常に効果的な腫瘍治療用物質であることが予想外に見いだされた。
本発明は、細胞内条件下で切断されるリンカーを介して高度に細胞毒性な薬剤へコンジュゲートしたＣＤ４４特異的抗体分子からなる新規な化合物を提供する。
特に、本発明は以下の式（Ｉ）で示される化合物を提供する。
Ａ（ＬＢ）n （式（Ｉ））
（式中、
Ａは、ＣＤ４４に特異的な抗体分子であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
Ｂは、細胞に対して有毒な化合物であり、及び
ｎは、１〜１０の１０進数である。）
抗体分子Ａは、ＣＤ４４、好ましくは変異体ＣＤ４４に対して結合特異性を有する。
【０００９】
用語「抗体分子」は、リンパ球により産生され、例えば血清中に存在する完全な免疫グロブリン、ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体、宿主細胞中の組換え発現により産生されかつ免疫グロブリン又はモノクローナル抗体の結合特異性を有するポリペプチド及び前記の免疫グロブリン、モノクローナル抗体又はポリペプチドに由来し、それらの結合特異性を保持しつつ更に加工した分子を包含するだろう。特に、用語「抗体分子」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全な免疫グロブリン、前記免疫グロブリンの断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）2断片（Kreitman等, 1993）、組換えにより生成したポリペプチド、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体（Breitling et Duebel, 1999; Shin等, 1989; Gussow et Seemann, 1991, Winter等, 1994, EP 0 239 400; EP 0 519 596; WO 90/07861 EP 0 368 684; EP 0 438 310; WO 92/07075; WO 92/22653; EP 0 680 040; EP 0 451 216）、一本鎖抗体（scFv, Johnson et Bird, 1991）等を含んでいる。今日、抗体は、実験動物を免疫化することなしに、例えばファージディスプレイ法（Aujame等, 1997; US 5,885,793; US 5,969,108; US 6,300,064; US 6,248,516, US 6,291,158）により生成されるだろう。完全ヒト抗体は、機能性ヒトＩｇ遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを使用して生成されるだろう（EP 0 438 474 ; EP 0 463 151; EP 0 546 073）。前記の参照文献から、当業者は、最新技術の方法、例えばペプチド及び核酸の自動化合成法、実験動物免疫化、ハイブリドーマ技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ベクター及び発現技術、宿主細胞培養及びタンパク質精製方法を使用して、前記の種類の抗体分子をどのようにして生成するかを理解する。以下の記載において、用語「抗体」及び「抗体分子」は互換的に使用される。
【００１０】
「ＣＤ４４に対して特異的」とは、抗体分子がＣＤ４４に存在するエピトープに対して特異的結合親和性を有することを意味する。好ましい態様において、本発明の抗体分子は、ヒトＣＤ４４遺伝子の変異体エキソン（variant exon）ｖ６によりコードされるアミノ酸配列に対して結合特異性を有している。その他の変異体エキソンと同様に変異体エキソンｖ６の配列は当該技術分野において知られている（Screaton等, 1992; Tolg等, 1993; Hofmann等, 1991）。本発明の好ましい抗体分子は、添付する配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又はその対立変異体（allelic variant）配列を有する又は含むペプチド又はポリペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子は、前記配列内のエピトープに対する結合特異性を有する。更に好ましくは、本発明の抗体分子は配列番号２に示されるアミノ酸配列、特に好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する。前記の抗体分子は、当該技術分野において既知の方法（WO 95/33771, WO 97/21104）、例えば、前記の配列を有する化学的に合成されたペプチド、例えばハプテンへ結合したものを用いて実験動物を免疫し、又は、前記配列を含む組換えにより生成した融合タンパク質を用いて免疫し、続いて当該技術分野において既知の方法（Harlow 1988; Catty 1988; Koopman等, 1993; Heider等, 1993）にしたがい進めることにより容易に生成されるだろう。
【００１１】
好ましくは、本発明の抗体分子は、１９９４年６月７日にＤＳＭ（Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland/Germany）に寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４で寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されるマウスモノクローナル抗体（名称ＶＦＦ−１８）である。好ましい抗体分子は、前記モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８のＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ）2断片である。別の好ましい態様において、本発明の抗体分子は、ヒト化組換え抗体であって、ＶＦＦ−１８の相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）がヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の各遺伝子へグラフトしている抗体である。
【００１２】
モノクローナル抗体の「相補性決定領域」とは、Chothia 及び Lesk, 1987と関係してKabat等, 1991に従い、特定の抗原結合に関連するモノクローナル抗体のアミノ酸配列であると理解される。
【００１３】
別の好ましい態様において、前記のＣＤＲグラフト抗体の適切なフレームワーク残基は、マウスの残基へと戻されて（revert）、結合親和性を改善する。当該技術分野に関連する方法から、当業者は、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４の前記ハイブリドーマから出発してＶＦＦ−１８のＣＤＲをどのようにして得るか、適切なヒト免疫グロブリン遺伝子をどのようにして選択しかつ入手するか、どのようにして前記ＣＤＲを前記遺伝子へグラフトするか、選択されたフレームワーク残基をどのようにして修飾するか、ＣＤＲ−グラフト抗体を適切な宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中でどのように発現させるか、得られた組換え抗体を結合親和性及び特異性についてどのように試験するかを理解する（例えば、前記の文献を参照）。本発明の別の好ましい態様において、本発明の抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体である。好ましくは、前記組換え抗体はヒト化抗体であり、２つの完全な軽鎖及び２つの完全な重鎖から構成される完全免疫グロブリンである。本発明の別の好ましい態様において、抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８と同じイディオタイプを有する組換え抗体である。本発明の別の好ましい態様において、抗体分子は、抗体ＶＦＦ−１８と同じエピトープに結合する組換え抗体である。
【００１４】
特に好ましい態様において、本発明の抗体Ａは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体である。この抗体をＢＩＷＡ４と呼ぶ。これは、前記抗体ＶＦＦ−１８のヒト化バージョンであり、完全ヒトフレームワーク中にマウスモノクローナル抗体ＶＦＦ−１８の相補性決定領域を有し、更にヒト定常領域を有する。それゆえ、前記抗体は、ヒトにおける免疫原性が低く、有利である。しかしながら、前記の抗体は抗原結合を最適化するためのマウスフレームワーク残基を有しないので、親抗体ＶＦＦ−１８のような有意に低い抗原結合親和性を有し、それゆえ、治療剤の良好な候補としては考えられないだろう。予想外に、ＢＩＷＡ４は、結合親和性が低いにも拘わらず、インビボにおいて非常に有利な体内分布及び腫瘍取込を有し、高い結合親和性を有する他のＶＦＦ１８ヒト化バージョンよりも優れたものとしていることが見いだされた。更に好ましい態様において、抗体分子Ａは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖からなる抗体である。この抗体はＢＩＷＡ４よりも高い結合親和性を有し、ＢＩＷＡ８と呼ばれる。
【００１５】
これらの抗体は下記にしたがい生成できるだろう。軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、標準方法により化学的又は酵素的に合成されるだろう。最初に、適切なオリゴヌクレオチドを、合成遺伝子を生成するために使用することができる当該技術分野において既知の方法（例えば、Gait, 1984）を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成する方法は当該技術分野において既知である（例えば、Stemmer等 1995; Ye等 1992; Hayden et Mandecki 1988; Frank等 1987）。好ましくは、ＢＩＷＡ４の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号５及び配列番号７で示される核酸配列を有している。これらの配列は、宿主細胞によって切断されるリーダーペプチドをコードする配列（配列番号５：最初の６０ヌクレオチド、配列番号７：最初の５７ヌクレオチド）を含んでいる。更なる態様において、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子は、それぞれ、配列番号９及び７に示されるヌクレオチド配列を有している。抗体の重鎖及び軽鎖をコードするこれらの核酸分子を、発現ベクターへクローニング（両方の鎖を１つのベクター分子へ、又は、各鎖を別々のベクター分子へクローニング）し、次いで宿主細胞へ導入する。原核生物又は真核生物宿主細胞における免疫グロブリンの発現に適切な発現ベクター及びベクターの宿主細胞への導入方法は当該技術分野において周知である。一般的に、発現ベクターにおいて、免疫グロブリン遺伝子は、Ｉｇ遺伝子の上流に位置する適切なプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ハムスターユビキチンプロモーター（WO 97/15664）又はシミアンウイルスＳＶ４０プロモーターと機能的に結合している。転写の終結のために、適切な終結部位／ポリアデニル化部位、例えばウシ成長ホルモン又はＳＶ４０の該当部位が用いられるだろう。更に、ＣＭＶ又はＳＶ４０エンハンサー等のエンハンサー配列を含めてもよい。通常、発現ベクターは選択マーカー遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、グルタミン合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アデニル酸デアミナーゼ遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子若しくはピューロマイシン耐性遺伝子を更に含んでいる。種々の発現ベクターが、会社、例えば、Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WI 又は BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAから商業的に入手できる。例えば、発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１（NCBI GenBank 寄託番号 A32111）又はｐＡＤ−ＣＭＶ１９（NCBI GenBank 寄託番号 A32110）を発現のために使用できるだろう。宿主細胞は、好ましくは哺乳類宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ又はＢＨＫ細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ−ＤＵＫＸ（Urlaub 及び Chasin, 1980）、ＣＨＯ−ＤＧ４４（Urlaub等, 1983）又はＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL-61）細胞である。次いで、宿主細胞を、抗体を産生する条件下、適切な培地中で培養し、標準手順にしたがい培地から抗体を単離する。宿主細胞及び各発現ベクター中で組換えＤＮＡから抗体を生成する手順は当該技術分野において周知である（WO 94/11523, WO 97/9351, EP 0 481 790, EP 0 669 986を参照）。
【００１６】
細胞に対して毒性のある化合物Ｂへ抗体分子Ａを連結するために、連結部分（linking moiety）Ｌを使用する。最もシンプルな場合、連結部分Ｌは化学結合、好ましくは細胞内条件下で切断される共有結合である。本発明の一つの態様において、結合は、抗体分子に存在する硫黄原子、例えばシステイン残基の側鎖に存在する硫黄原子と有毒化合物に存在する別の硫黄原子との間の結合である。別の態様において、連結部分Ｌは１以上の原子又は化学基から構成される。適切な連結基は当該技術分野において周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基及びエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましいのはジスルフィド基及びチオエーテル基である。
【００１７】
本発明の抗体分子と有毒化合物とのコンジュゲートは、既知又は今後開発されるあらゆる技術を使用して形成することができる。有毒化合物を修飾して遊離のアミノ基を与え、酸不安定性リンカー又は光不安定性リンカーを介して抗体分子へ連結することができる。有毒化合物をペプチドと凝縮（condense）し、続いて抗体分子と連結してペプチダーゼ不安定性リンカーを生成することができる。有毒化合物を処理して一級（primary）ヒドロキシル基を与え、スクシニル化し、抗体分子へ連結し、細胞内エステラーゼにより切断され遊離薬剤を遊離するコンジュゲートを生成することができる。最も好ましくは、有毒化合物を処理して遊離又は保護されたチオール基を作成し、次いで１つ又は多数のジスルフィド又はチオールを含有する有毒化合物を、ジスルフィド結合を介して抗体分子へ連結する。
【００１８】
例えば、抗体分子を架橋試薬（例えば、N-スクシニミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、4-スクシニミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)-トルエン(SMPT)、N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-ブチラート（butyrate）(SDPB)、N-スクシニミジル-4-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート(SPP)、N-スクシニミジル-5-(2-ピリジルジチオ)ペンタノエート、2-イミノチオラン又は無水アセチルコハク酸（acetylsuccinic anhydride）を用いて既知の方法により修飾することができる。Carlsson等, 1978、Blattler等 1985、Lambert等, 1983、Klotz等, 1962、Liu等, 1979、Blakey 及び Thorpe, 1988、Worrell等, 1986を参照のこと。好ましい態様において、リンカー部分はＳＰＰ由来の４−チオペンタノエート又は５−チオペンタノエートである。誘導体化された遊離又は保護されたチオール基を含む抗体分子を、ジスルフィド又はチオールを含む有毒化合物と反応させてコンジュゲートを生成する。コンジュゲートはＨＰＬＣ又はゲル濾過により精製することができる。
【００１９】
「有毒」とは、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を引き起こす化合物のことである。カップリングに使用する有毒化合物は細胞分裂停止性又は細胞傷害性に作用し、細胞周期の停止又は細胞死を導くだろう。これらの化合物は、例えば核酸合成に干渉し、核酸を不活性化し又はチューブリンに結合することにより、細胞周期の間の異なるステージで作用してもよい。
【００２０】
好ましい態様において、細胞に対して有毒である化合物Ｂはメイタンシノイド、すなわちメイタンシン（CAS 35846538）の誘導体である。好ましい態様において、化合物ＢはメイタンシノールのＣ−３エステルである。前記メイタンシノイドの製造及び抗体分子への連結を含む癌治療に使用するための抗体へのコンジュゲートに適切なメイタンシノイドは、Chari等の文献に記載されている（Chari等, 1992; Liu等, 1996; 米国特許 No. 5,208,020）。これらのメイタンシノイドを本発明に使用してもよい。好ましい態様において、有毒化合物はＮ2'−デアセチル−Ｎ2'−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（CAS 番号 139504-50-0）（ＤＭ１とも呼ばれる）である。好ましくは、前記メイタンシノイドは、メイタンシノールのＣ−３部位でジスルフィド架橋を介して抗体分子へ連結したメイタンシノール誘導体である。特に好ましい態様において、抗体／メイタンシノイドコンジュゲートは式（ＩＩ）で示されるメイタンシノイドから製造される。
式（II）：
【００２１】
【化１】
（式中、
Ｒ1はＨ又はＳＲ4であり、Ｒ4はメチル、エチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環式アルキル、単一（simple）又は置換されたアリール又は複素環であり、
Ｒ2はＣｌ又はＨであり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、及び、
ｍは１、２又は３である。）
好ましくは、Ｒ1はＨ、ＣＨ3又はＳＣＨ3であり、Ｒ2はＣｌであり、Ｒ3はＣＨ3であり、ｍ＝２である。
Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である化合物は、文献においてＤＭ１と呼ばれる。
好ましい態様において、本発明の化合物は式（III）で示される。
【００２３】
【化２】
（式中、
Ａは、ＣＤ４４に対して特異的、好ましくは変異体エキソンｖ６に対して特異的、好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して特異的な抗体分子であり、
（Ｌ’）は、任意のリンカー部分であり、
ｐは１〜１０の１０進数である。）
好ましくは、ｐは３〜４、より好ましくは約３．５である。
【００２５】
前記のメイタンシノイドを製造する方法は当該技術分野において既知である（特に、US 5,208,020, Example 1を参照のこと）。好都合なことに、最初の工程において、メイタンシノイドＣ−３エステル アンサミトシン（ansamitocin）Ｐ３は、ノカルディア（Nocardia）又はアクチノシネマ（Actinosynnema）属に属する微生物、例えばＡＴＣＣ ３１５６５、ＡＴＣＣ ３１２８１（US 4,356,265; US 4,450,234; WO 01/77360）の細菌発酵により生成するだろう。アンサミトシンＰ３は、酢酸エチル又はトルエン等の有機溶媒を使用して培養から抽出され、更に、例えばシリカゲルを使用した吸着クロマトグラフィーにより精製してもよい。ＬｉＡｌＨ4（US 4,360,462）又は、つい最近提案されたＬｉＡｌ（ＯＭｅ）3Ｈ若しくはその他のＬｉＡｌ又はＮａＡｌヒドリド（WO 02/16368）を使用してメイタンシノールへ還元してもよい。次いでメイタンシノールを、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び触媒量の塩化亜鉛を使用して、Ｃ−３部位においてＮ−メチル−Ｌ−アラニン又はＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体でエステル化して、ジスルフィド含有メイタンシノイドを得てもよい（US 5,208,020; US 5,416,064; US 6,333,410）。好ましい態様では、メイタンシノールを、下記式の化合物Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオプロパノイル）−Ｌ−アラニンでエステル化して、式（II）で示されるメイタンシノイド（式中、Ｒ1＝ＳＲ4、Ｒ4＝ＣＨ3、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である）を得る。
【００２６】
【化３】
遊離のチオール基を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いたジスルフィド結合の切断により遊離させ、例えばＤＭ１を得てもよい。
細胞内切断が起こると、遊離の有毒化合物がコンジュゲートＡ（ＬＢ）nから遊離する。化合物Ａ（ＬＢ）nから遊離した遊離薬剤は、式：Ｂ−Ｘ（式中、Ｘは、切断反応に依存して原子又は化学基である）を有しているだろう。好ましくは、Ｘは水素原子、例えばリンカー部分が単なる２つの硫黄原子間の共有結合であるとき、又は、ヒドロキシル基である。リンカー部分が化学基である場合、切断部位はリンカー部分の内部にあってもよく、この場合、切断時に式Ｂ−Ｌ’’Ｘ（式中、Ｘは、切断反応の性質に依存して原子又は化学基である。）で示される遊離薬剤を生成する。好ましくは、Ｘは水素原子又はヒドロキシル基である。
【００２８】
好ましい態様において、式（Ｉ）で示される化合物は、細胞内切断時に遊離する有毒化合物Ｂ、Ｂ−Ｘ又はＢ−Ｌ’’Ｘよりも毒性が低い。インビトロで毒性を試験する方法は当該技術分野において既知である（Goldmacher等, 1985; Goldmacher等, 1986; US 5,208,020, Example 2も参照のこと）。好ましくは、化合物（Ｉ）は、切断時に遊離する遊離薬剤よりも１０倍以上、より好ましくは１００倍以上、更に好ましくは１０００倍以上毒性が低い。
【００２９】
好ましくは、抗体分子／メイタンシノイドコンジュゲートは、前記のようにジスルフィド結合を介して連結しており、メイタンシノイド分子を送達することができるものである。前記の細胞結合コンジュゲートは、既知の方法、例えば、モノクローナル抗体をスクシニミジル ピリジル−ジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）又はスクシニミジル ピリジル−ペンタノエート（ＳＰＰ）で修飾することにより製造される（Carlsson 等, 1978）。得られたチオピリジル基を、チオール含有メイタンシノイドを用いた処理により置換し、ジスルフィド連結コンジュゲートを生成する。代わりに、アリールジチオメイタンシノイドの場合、抗体コンジュゲートの形成は、抗体分子へ予め導入したスルフヒドリル基によるメイタンシノイドのアリール−チオールの直接置換によって達成される。ジスルフィド架橋を介して連結した１〜１０のメイタンシノイド薬剤を含むコンジュゲートは、いずれかの方法により容易に製造される。これに関連して、式Ａ（ＬＢ）nの１０進数ｎは、与えられた製造品の全てのコンジュゲート分子が、抗体分子へと付着した同一整数値のＬＢ残基を有しているとは限らない平均値であることが理解される。
【００３０】
より詳細には、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、濃度が１ｍｇ／ｍｌのジチオピリジル修飾抗体溶液を、チオール含有メイタンシノイド（１．２５モル当量／ジチオピリジル基）で処理する。修飾抗体からのピリジン−２−チオン（thione）の遊離を、３４３ｎｍで分光光度的にモニターし、約３０分間で完了する。セファデックス（Sephadex）G-25カラムを通したゲル濾過により、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを精製し、未反応薬剤及びその他の低分子量物質を含まないようにする。１つの抗体分子に結合したメイタンシノイドの数は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比を測定することにより決定することができる。抗体分子あたり平均１〜１０メイタンシノイド分子は、この方法によりジスルフィド結合を介して連結することができる。
【００３１】
更なる側面において、本発明はＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲートに関する。本明細書において、「ＣＤ４４ｖ６特異的」とは、抗体がＣＤ４４、好ましくはヒトＣＤ４４の変異体エキソンｖ６によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチドに存在するエピトープに対して特異的結合親和性を有することを意味する。本発明の好ましい抗体分子は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体を有する又は含むペプチドに特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子は前記アミノ酸配列内のエピトープに対して結合特異性を有する。より好ましくは、抗体分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、より好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する。
【００３２】
好ましくは、本発明のコンジュゲートにおける抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８（ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４）又はＶＦＦ−１８の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する組換え抗体である。より好ましくは、本発明の抗体は配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。
メイタンシノイドは、好ましくはジスルフィド部分により抗体へ連結し、式（ＩＶ）で示される。
【００３３】
【化４】
（式中、抗体への連結は、式ＩＶに示される硫黄原子から抗体分子に存在する第二の硫黄原子を介している）前記の結合に利用可能な硫黄原子を作成するために、前述の適切なリンカーの導入により抗体分子を修飾してもよい。好ましくは、メイタンシノイドは、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−又は−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−基を介して抗体分子へ連結する。前記のリンカー基中の硫黄原子はメイタンシノイドと共にジスルフィド結合を形成するが、カルボニル基は抗体分子のアミノ酸残基の側鎖に存在するアミノ基と結合してもよい。
そのように、１以上のメイタンシノイド残基を抗体分子へ連結してもよい。好ましくは、３〜４のメイタンシノイド残基を抗体分子へ連結する。
【００３５】
最も好ましいのは、ＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲートであって、抗体が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み、メイタンシノイドは式（ＩＶ）：
【００３６】
【化５】
で示され、
ジスルフィド結合を介して抗体分子へ連結しているものである。好ましくは、連結基は−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−又は−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−であり、抗体分子あたりの結合メイタンシノイド残基の数は３〜４である。
【００３８】
更なる態様において、本発明は式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、
（ａ）遊離又は保護されたチオール基を、ＣＤ４４に特異的な抗体分子へ導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体分子と細胞に対して有毒な化合物とを反応させる工程であって、該化合物が１以上のジスルフィド基又はチオール基を有している工程、及び
（ｃ）得られたコンジュゲートを回収する工程
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３９】
好ましくは、抗体はＣＤ４４ｖ６に特異的であり、より好ましくは配列番号３で示されるアミノ酸配列に特異的である。細胞に対して有毒な化合物は、好ましくはメイタンシノイド、より好ましくは式（ＩＩ）で示される化合物、最も好ましくは式（ＩＩ）において、Ｒ1＝Ｈ、Ｒ2＝Ｃｌ、Ｒ3＝ＣＨ3及びｍ＝２である化合物である。更に好ましい態様において、抗体分子は、配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。
【００４０】
本発明の方法の好ましい態様において、（２−ピリジル）−３−ジチオプロパン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）、（２−ピリジル）−４−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタノエート）又は（２−ピリジル）−５−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（Ｎ−スクシニミジル−５−（２−ピリジルジチオ）−ペンタノエート）を使用して、遊離又は保護されたチオール基を抗体分子へ導入する。更に本発明は前記方法により得られる化合物に関する。
【００４１】
更なる態様において、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物、又は前述のコンジュゲートを、好ましくは医薬的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む医薬組成物に関する。
【００４２】
適切な医薬的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤は周知であり、臨床状態の根拠（clinical situation warrant）として当業者により決定することができる。適切な担体、賦形剤及び／又は希釈剤には、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約７．４）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）及び（３）５％（ｗ／ｖ）グルコースが含まれる。
【００４３】
より好ましくは、医薬組成物中に存在する抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８又は抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体、好ましくはヒトフレームワークにおけるものである。更に好ましい態様において、抗体は、配列番号４又は８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。好ましくは、有毒化合物は式（ＩＩ）で示されるメイタンシノイドである。
【００４４】
本発明の化合物は、あらゆる種類の臨床又は非臨床用途であって、有毒化合物がＣＤ４４、好ましくはＣＤ４４ｖ６を細胞表面で発現する細胞を標的とする用途に使用することができるだろう。
【００４５】
例えば、コンジュゲートは生体外（ex vivo）で臨床的に用いられて、癌治療における自家移植前に骨髄から腫瘍細胞を除去するだろう。処理は下記の通り行うことができる。骨髄を患者又はその他の個体から収集し、本発明の式（Ｉ）で示される化合物を濃度範囲約１０μＭ〜１ｐＭを添加した血清含有培地中で約３０分間〜約４８時間、約３７℃でインキュベートする。インキュベーションの濃度及び時間の正確な条件（＝用量）は、当業者によって容易に決定することができる。インキュベーション後、骨髄細胞を血清含有培地で洗浄し、既知の方法にしたがい静脈内注入により患者へ戻す。患者が骨髄収集と処理細胞の再注入との間にその他の治療、例えば切除化学療法（ablative chemotherapy）又は全身照射を受ける状況では、処理骨髄細胞を標準医療機器を用いて液体窒素中で凍結保存する。
【００４６】
更なる態様において、本発明は癌の治療方法であって、前記の医薬組成物を患者へ適用する工程を含むことを特徴とする方法に関する。特に、本発明のこの側面は癌治療を必要とする患者へ、前記の化合物又は医薬組成物の治療学的有効量を投与する工程を含むことを特徴とする方法に関する。好ましくは、癌は頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、食道ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚ＳＣＣ、乳腺癌（ＡＣ）、肺ＡＣ、頸部ＡＣ、膵臓ＡＣ、大腸ＡＣ又は胃ＡＣである。
【００４７】
癌の臨床治療について、本発明の式（Ｉ）で示される化合物は、無菌性及び内毒素レベルについて試験する溶液として供給されるだろう。コンジュゲート投与の適切なプロトコルの例は以下の通りである。コンジュゲートを、静脈内大量瞬時投与又は５日間の連続注入として、１〜６週間の間、毎週与えてもよい。大量瞬時投与は、５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加した５０〜１００ｍｌの正常生理的食塩水において与えることができる。連続注入は、２４時間につき、２５〜５０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加した２５０〜５００ｍｌの正常生理的食塩水において与えることができる。用量は、一般的に１回の投与につき１０〜４００ｍｌ／ｍ2体表面積であろう。１回の投与につき患者へ適用される用量は、十分に効果的であるが、毒性限界投与量（dose limiting toxicity）（ＤＬＴ）未満でなければならない。一般的に、ＤＬＴ未満の十分に許容的な用量が最大許容投与量（ＭＴＤ）であろう。当業者はＭＴＤをどのように決定するかを知っている（Lambert等, 1998）。毎週の投与について、ＭＴＤは１００〜２００ｍｇ／ｍ2の範囲であることが予想できる。代わりに、投与間の間隔は、長くてもよく、例えば２〜４週間、好ましくは３週間であってもよい。この場合、ＭＴＤは２００〜３００ｍｇ／ｍ2の範囲であることが予想できる。代わりに、投与は５日間用量であり、数週間の中断に続き、その後処理を繰り返してもよい。この場合、１回の投与あたりのＭＴＤは１００ｍｇ／ｍ2よりも低いことが予想できる。例えば、コンジュゲートを、速度３ｍｇ／分の単一の静脈内注入として２１日ごとに投与することができる。７サイクルまでの治療が適用された。適用される用量は、臨床状況が要求する場合、前記の範囲外であってもよいことが理解されるべきである。例えば、ＭＴＤが示されるよりも高いことが見いだされる場合、単一投与は４００ｍｌ／ｍ2よりも高く、又は毎週２００ｍｇ／ｍ2よりも高くてもよいだろう。
【００４８】
用量、投与経路、適用スキーム、治療の反復及び期間は、一般的に病気の性質（腫瘍の型、グレード及びステージ等）及び患者の性質（体質、年齢、性別等）に依存し、治療の責任を負う医療専門家により決定されるだろう。固形腫瘍の治療の他に、本発明にしたがう治療適用は、微小残存病変を治療するための外科的処置のアジュバントとして特に有利であろう。
【００４９】
更なる態様において、本発明は、癌治療用医薬組成物の製造における式（Ｉ）で示される化合物の使用に関する。より好ましくは、医薬組成物中に存在する抗体分子は、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８又は抗体ＶＦＦ−１８のＣＤＲを有する組換え抗体、好ましくはヒトフレームワークにおけるものである。最も好ましくは、抗体は、配列番号４又は８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる。好ましくは、有毒化合物は式（ＩＩ）で示されるものである。好ましくは、癌は頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）、食道ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、皮膚ＳＣＣ、乳腺癌（ＡＣ）、肺ＡＣ、頸部ＡＣ、膵臓ＡＣ、大腸ＡＣ又は胃ＡＣである。
【００５０】
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【００５３】
実施例
１．材料及び方法
１．１．インビトロ細胞増殖アッセイ
生存細胞を決定するために、Cell Titer 96（登録商標）AQueous非放射性細胞増殖アッセイ（Promega）を使用した。１ウェルにつき５０００個の細胞を９６ウェルプレートのフェノールレッドを含まない９０μｌ培地へ播いた。細胞を１〜３時間落ち着かせ（settle down）、１０μｌ ＰＢＳ中の免疫コンジュゲートの連続希釈物を添加した。免疫コンジュゲートなしの細胞はネガティブコントロールとして役立った。細胞を、加湿５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で４日間インキュベートし、次いで２０μｌ ＭＴＳ／ＰＭＳを製造者の勧めにしたがい添加した。更に３７℃で１〜４時間インキュベートした後、４９０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して記録した。各細胞系につき、三重に分析した。生存細胞フラクションの百分率及びＩＣ５０値をGraphPad Prism（登録商標）（バージョン３．０）ソフトウェアを使用して計算した。
【００５４】
１．２．ＢＩＷＩ１の製造
以下に示すようにして、配列番号１内のエピトープに対して結合特異性を有するヒト化組換え抗体ＢＩＷＡ４及びＢＩＷＡ８を、メイタンシノイドＤＭ１へ連結した。ＢＩＷＡ４とＤＭ１とのコンジュゲートをＢＩＷＩ１と表す。
安定してトランスフェクトする細胞系の生成。ＢＩＷＡ４の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子、配列番号５及び配列番号７を発現ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１（WO92/01055; NCBI GenBank Accession No. A32111）又はｐＡＤ−ＣＭＶ１９（NCBI GenBank Accession No. A32110）へ連結した。第二の抗体ＢＩＷＡ８において、軽鎖は配列番号９で示される配列を有する遺伝子によりコードされた。一方、重鎖はＢＩＷＡ４と同一であった。安定してトランスフェクトする細胞系を以下に示すようエレクトロポレーションにより生成した。ＣＨＯ ＤＵＸ／５７ｓｓ（無血清懸濁培養に適合した、チャイニーズハムスター卵巣細胞のｄｈｆｒネガティブ変異体）を使用した。トリプシニセーション（trypsinisation）及びＲＰＭＩ−１０（９０％ ＲＰＭＩ１６４０，１０％熱不活性化ウシ胎仔血清）を用いたトリプシンの不活性化の後、細胞をＲＰＭＩ−０（血清を含まないＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄し、１×１０7個の細胞を０．８ｍｌ ＲＰＭＩ−０中に再懸濁した。線状化ＤＮＡ（プラスミドあたり２０μｇ，軽鎖及び重鎖をコードするベクターの同時トランスフェクション）の添加後、細胞を以下の条件下でHoefer Electroporatorを使用したエレクトロポレーションに付した。１０８０μＦ，３２０Ｖ，１０００ｍｓｅｃ，１パルス。細胞を５分間静置し、α−ＭＥＭ １０ｄ（リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まない９０％ ＭＥＭ−α（GIBCO BRL）、１０％熱不活性化透析ウシ胎仔血清）中、１２５００細胞／ｍｌ及び２５００細胞／ｍｌまで希釈した。細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート（２００μｌ／ウェル，それぞれ２５００及び５００細胞／ウェルに対応する）へ播いた。１０日後にクローンが現れた。５００細胞／ウェルのプレートのみを追跡した（３〜６クローン／ウェル）。１４〜１５日後、各ウェルからの上清をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験した。５３クローンを１２ウェルプレートのα−ＭＥＭ１０ｄへ播いた。３〜６日（細胞の集密度に依存する）後、上清をκ／γ ＥＬＩＳＡ（連続希釈）において再度試験し、ヒトＩｇＧ１標準を使用して定量化した。細胞を凍結し、液体窒素中で保存した。５３クローンのＩｇＧ含量は１２〜４１７ｎｇ／ｍｌの範囲であった。最高の発現レベルを有する１０のクローンを選択し、以下の通りサブクローニングした。各クローンの細胞を、１００μｌ／ウェル α−ＭＥＭ１０ｄ中５細胞／ウェルの密度（各クローン及び各密度につき１プレート）で９６ウェルマイクロタイタープレートへ播いた。８日後、上清を１：２に希釈し、１００μｌの希釈物をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験し、ＢＩＷＡ４調製物を標準として用いて定量化した。各クローンにつき５つのサブクローンを１２ウェルプレートへ移した。ＩｇＧ含量は１．３〜９０８ｎｇ／ｍｌの範囲であった。最高の発現レベル（３８４〜９０８ｎｇ／ｍｌ）を有する１４のクローンを、以下に示すようにメトトレキセートと一緒の増幅に使用した。始めにクローンを、α−ＭＥＭ１０ｄを２０、５０及び１００ｎＭのメトトレキセートと共に含む２５ｃｍ2フラスコ中で培養した。クローンの増殖後、上清をκ／γ ＥＬＩＳＡにおいて試験した。次ラウンドの増幅において、メトトレキセート濃度を２０００ｎＭまで上昇させた。最初に、最高の発現レベルは１０．５〜１４．８μｇ／ｍｌ（クローンＡ３１／１００，１００ｎＭメトトレキセート）であった。濃度５００ｎＭのメトトレキセートを用いた更なる増幅は１９〜２０μｇ／ｍｌの発現を与えた（Ａ３１／５００）。
【００５５】
抗体の精製。抗体を、以下に示すようにして細胞培養上清から精製した。抗体含有組織培養上清を、５ｍｌプロテインＡセファロースカラムへ、４℃下、流速８０〜９０ｍｌ／ｈで適用した。５０ｍｌの結合緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム ｐＨ７．５）で洗浄した後、Ｉｇフラクションを溶離緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．７）で溶離させた。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。
【００５６】
ＳＰＰを用いたＢＩＷＡ４の修飾によるＢＩＷＡ４−ＳＳ−Ｐｙの形成。ＢＩＷＡ４をＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ製剤中、濃度５ｍｇ／ｍｌの液体形態で供給した。ＤＭ１をＭＡｂに結合する前に、Ｔｗｅｅｎ２０を除去した。ＭＡｂ溶液（４０ｍｌ）を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６）（ＭＥＳ緩衝液）で１５倍に希釈し、次いでＭＥＳ緩衝液中で平衡化したセファロースＳカラム（１２．５ｍｌ）へロードした。カラムを１０カラム用量のＭＥＳ緩衝液で洗浄した。抗体を４００ｍＭ ＮａＣｌを含有するＭＥＳ緩衝液で溶離した。抗体溶液を、５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（緩衝液Ａ）に対して透析した。ＢＩＷＡ４抗体をＳＰＰ（（２−ピリジル）−５−ジチオペンタン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）で修飾してジチオピリジル基を導入した。緩衝液Ａ中のＭＡｂ（１８５ｍｇ、８ｍｇ／ｍｌ）を、７倍をこえるモル量のＳＰＰでＥｔＯＨ中（ＭＡｂ溶液の５％ｖ／ｖ）で修飾した。周囲温度下で反応を９０分間進めた。次いで反応混合物を、緩衝液Ａで平衡化したセファデックスＧ２５Ｆ（２．６×３１．５ｃｍカラム、１６７ｍｌ）を通してゲル濾過クロマトグラフィーに付した。ＭＡｂ含有フラクションをプールし、修飾の程度を２８０ｎｍにおける吸光度及びＤＴＴ添加による２−メルカプトピリジンの遊離により引き起こされる３４３ｎｍにおける吸光度の変化を測定することにより決定した。遊離した２−メルカプトピリジンの濃度を、８０８０Ｍ-1ｃｍ-1のε343nmを用いて計算し、ＭＡｂの濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度を２−メルカプトピリジンからの寄与について補正した後、２２４，０００Ｍ-1ｃｍ-1のε280nmを使用して計算した（２−メルカプトピリジン Ａ280nm＝Ａ343nm×５１００／８０８０）。１ＭＡｂ分子につき５．５の遊離可能な２−メルカプトピリジンが連結したＭＡｂの回収は９９．６％であった。
【００５７】
ＢＩＷＡ４−ＳＳ−ＰｙとＤＭ１とのコンジュゲーション。緩衝液Ａ中の前記修飾ＭＡｂ（１８４ｍｇ）を、２．５ｍｇ ＭＡｂ／ｍｌで、遊離可能な２−メルカプトピリジン基に対して１．７倍をこえるモル量のＤＭ１を使用してコンジュゲートした。ＤＭ１をＤＭＡ中に添加（ＭＡｂ溶液の３％ｖ／ｖ）し、反応混合物を周囲温度下で２９時間インキュベートした。次いでコンジュゲートを、ＰＢＳ中で平衡化したセファクリル（Sephacryl）Ｓ３００ ＨＲのカラム（５×５０ｃｍカラム、９８０ｍＬ、流速１０ｃｍ／ｈｒ）中のゲル濾過クロマトグラフィーにより単離した。コンジュゲートは、初期に溶離する少量のタンパク質を伴って、単量体ＭＡｂの位置にある単一ピークとして溶離した。フラクションを、ＭＡｂ分子あたりに連結したＤＭ１分子数についてアッセイした。（連結したＤＭ１分子は、２５２ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。）結果に基づいて、カラム容量の６３〜７７％に相当するフラクションをプールした。プールした溶液中のＤＭ１／ＭＡｂ比は３．１であることが見いだされ、コンジュゲートしたＢＩＷＡ４の収率は出発ＭＡｂに基づくと７５％であった。コンジュゲートＢＩＷＩ１を非還元条件下で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、少量の二量体コンジュゲート（＜５％）を伴って主に単量体種（＞９５％）から構成されることが見いだされた。
【００５８】
ＢＩＷＩ１のインビトロ結合の分析。ＢＩＷＡ４抗体及びＢＩＷＩ１コンジュゲートの抗原陽性ＦａＤｕ細胞への結合を決定した。細胞（１〜２×１０-5）を、抗体又はコンジュゲート濃度を変化させた９６ウェルプレート中、氷中で１時間インキュベートした。試験物品をプレートから洗い出し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧを添加し、氷中でのインキュベーションを暗闇中で１時間続けた。洗浄後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）で分析した。ＢＩＷＡ４抗体は見かけＫD値１×１０-9Ｍで結合し、ＢＩＷＩ１は見かけのＫD値１．８×１０-9Ｍで結合した。従って、ＤＭ１とのコンジュゲートは抗体のみの結合親和性をたとえあったとしてもわずかに変化させるものである。
【００５９】
１．３．ヌードマウスにおける有効性の研究
ＢＩＷＩ１のインビボ抗腫瘍の有効性を、抗原陽性ヒト腫瘍を適用した２種のヌードマウス異種移植モデル（腫瘍の起源、ＣＤ４４ｖ６発現の程度及び均一性で異なるＡ４３１（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５５５；外陰の類表皮癌）及びＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ４３；咽頭の扁平上皮癌））において試験した。腫瘍細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕをＡＴＣＣから受領し、１０％ウシ胎仔血清及びサプリメントを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
マウスを以下の処理グループ（処理／初期平均腫瘍体積／腫瘍体積範囲／マウスの数）へ無作為化した。
Ａ４３１
グループ1 対照(PBS)/185±217mm3/19〜424mm3/5匹
グループ2 BIWA4(21mg/kg/d)/133±115mm3/42〜302mm3/5匹
グループ3 BIWI1(2.1mg/kg/d)/107±63mm3/42〜205mm3/5匹
グループ4 BIWI1(7mg/kg/d)/132±73mm3/42〜205mm3/5匹
グループ5 BIWI1(21mg/kg/d)/107±63mm3/42〜205mm3/5匹
ＦａＤｕ
グループ1 対照(PBS)/142±82mm3/34〜268mm3/8匹
グループ2 BIWA4(21mg/kg/d)/134±86mm3/42〜268mm3/6匹
グループ3 BIWI1(2.1mg/kg/d)/149±96mm3/50〜268mm3/6匹
グループ4 BIWI1(7mg/kg/d)/132±97mm3/42〜268mm3/6匹
グループ5 BIWI1(21mg/kg/d)/129±74mm3/50〜231mm3/6匹
【００６０】
１×１０6個の腫瘍細胞を、６週齢の雌ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウスの右側へ皮下移植した。腫瘍が１０７〜１８５ｍｍ3の平均サイズに達したときに処理を開始した。処理は、第１日から開始して５日連続のＢＩＷＩ１の静脈内注入から構成された。ＢＩＷＩ１の３つの異なる用量（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は３０μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する。７ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は１００μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する。２１ｍｇ／ｋｇ／ｄ ＢＩＷＩ１は３００μｇ／ｋｇ／ｄ ＤＭ１に相当する）を平行して試験した。対照動物は未処理（ＰＢＳ）又は非コンジュゲート抗体（対照抗体、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）処理であった。腫瘍の増殖は腫瘍の大きさを測定することによりモニターした。処理開始後のいずれかの時点で腫瘍が完全に消失したとき、腫瘍寛解を完全寛解として評価した。寛解は、処理後に腫瘍体積は減少したがその後再成長を開始たとき、寛解を部分寛解として評価した。処理の耐容性は、全観察期間の間マウス体重を測定することによりモニターした。
【００６１】
２．結果と考察
２．１．ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性
ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性を、抗原陽性細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕ並びに抗原陰性細胞系Ａ４５９を使用して評価した。細胞を異なる濃度のＢＩＷＩへ４日間暴露し、次いでＭＴＳ／ＰＭＳで染色し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでアッセイした。細胞の生存フラクションをGraphPad Prism（登録商標）ソフトウェアパッケージを使用して計算した。結果を図１に示す。ＢＩＷＩ１は、約７．６×１０-8ＭのＩＣ50で抗原陽性Ａ４３１細胞の殺傷に有効であり、約２．４×１０-8ＭのＩＣ50で第二の抗原陽性細胞系ＦａＤｕの殺傷に有効であった。抗原陰性細胞系Ａ５４９は、約１．３×１０-7ＭのＩＣ50でコンジュゲートによる影響を受け、試験したＢＩＷＩ１の最高濃度（５×１０-7Ｍ）で生存フラクションの５０％が生存した。これらの結果はＢＩＷＩ１はインビトロにおいて抗原陰性細胞よりも抗原陽性細胞に対してわずかに細胞傷害性が高いことを示している。比較として、別のＤＭ１抗体コンジュゲートは、抗原陰性細胞と比較して抗原陽性細胞に対して少なくとも１０００倍高いの細胞傷害性を示した（Chari等, 1992）。
【００６２】
２．２．Ａ４３１異種移植ヌードマウスにおける有効性
５匹のマウスからなるグループを、２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１及び２１ｍｇ／ｋｇ／ｄの対照抗体でそれぞれ処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ１８５±２１７ｍｍ3（ＰＢＳ）、１３３±１１５ｍｍ3（対照抗体）、１０７±６３ｍｍ3（２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）、１３２±７３ｍｍ3（７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）及び１０７±６３ｍｍ3（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図２に示す。対照抗体で処理した腫瘍は未処理腫瘍と同様に成長を示し、腫瘍体積倍加時間は約５日であった。７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１又は２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１のいずれかで処理した動物において、約１７日で全ての腫瘍は完全寛解し、消失した。観察期間の終了（１３４日）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理した腫瘍は３／５のケースで完全寛解し、１３４日まで腫瘍は再成長しなかった。残りの２つの腫瘍は部分寛解を示したが、最終的には再成長した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１はＡ４３１異種移植ヌードマウスにおいて、２．１〜２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で完全寛解及び持続的な寛解をもたらす用量依存的抗腫瘍反応を誘導することを示している。非コンジュゲート対照抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。
図２参照
【００６３】
２．２．ＦａＤｕ異種移植ヌードマウスにおける有効性
６匹のマウスからなるグループを、２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１及び２１ｍｇ／ｋｇ／ｄの対照抗体でそれぞれ処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ１４２±８２ｍｍ3（ＰＢＳ）、１３４±８６ｍｍ3（対照抗体）、１２９±７４ｍｍ3（２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）、１３２±９７ｍｍ3（７ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）及び１４９±９６ｍｍ3（２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図３に示す。対照抗体及び２．１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理した腫瘍は未処理腫瘍と同様の成長を示し、腫瘍体積倍加時間は約５日であった。２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理した動物において、約２４日で全ての腫瘍が完全寛解し、消失した。観察期間の終了（１０７日）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。７ｍｇ／ｋｇ／ｄで処理した腫瘍は１／６のケースで完全寛解を示し、３／６の腫瘍は部分寛解を示した。残りの２つの腫瘍は未処理対照腫瘍と同様の成長を示した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１はＦａＤｕ異種移植ヌードマウスにおいて、７〜２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で完全寛解及び持続的な寛解をもたらす用量依存的抗腫瘍反応を誘導することを示している。非コンジュゲート対照抗体は抗腫瘍効果を示さなかった。
図３参照。
【００６４】
２．４．ヌードマウスにおける耐容性
ＢＩＷＩ１処理の耐容性を、２モデルの実験の全期間の間マウス体重をモニターすることにより決定した。観察された１グループあたりの平均体重の最大減少は、２１ｍｇ／ｋｇ／ｄのＢＩＷＩ１で処理したＦａＤｕ異種移植マウスにおける５％であった（図４）。体重減少は処理３日目ごろから始まり１０日目まで続き、その後、動物は体重を回復し、対照動物と同様の挙動を示した。その他の用量グループにおいて、体重減少はビヒクル対照（ＰＢＳ）と同様であった。全ての処理グループにおける５％以下の平均体重減少は、ヌードマウスにおいて与えられた用量でのＢＩＷＩ１処理の良好な耐容性を示している。ＢＩＷＩ１はマウスＣＤ４４ｖ６と交差反応しないので、本実験では遊離のＤＭ１により引き起こされる毒性などの抗原−非依存性作用のみをモニターすることができる。
【００６５】
３．ＭＤＡ−ＭＢ４５３におけるインビボでの抗腫瘍有効性
３．１．材料及び方法
ＢＩＷＩ１のインビボでの抗腫瘍有効性を、抗原陽性ヒト腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ４５３（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１３１、乳癌）を適用するヌードマウス異種移植モデルにおいて試験した。細胞をＡＴＣＣから受領し、１０％ウシ胎仔血清及びサプリペントを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。１×１０6個の腫瘍細胞を、６週齢の雌ＮＭＲＩ−ｎｕ／ｎｕマウスの右側へ皮下移植した。治療実験のために、腫瘍フラグメントの継代を通して腫瘍を維持した。腫瘍が１８８〜２４６ｍｍ3の平均サイズに達したときに処理を開始した。処理は、週１回で４週間のＢＩＷＩ１の静脈内注入から構成された。ＢＩＷＩ１の３つの異なる用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は１００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する。１２．５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は２００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する。２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＷＩ１は４００μｇ／ｋｇ ＤＭ１に相当する）を平行して試験した。ＰＢＳ処理動物は腫瘍成長の対照として役立った。腫瘍の増殖は腫瘍の大きさを測定することによりモニターした。処理開始後のいずれかの時点で腫瘍が完全に消失したとき、腫瘍寛解を完全寛解として評価した。
【００６６】
３．２．結果及び検討
６匹のマウスからなるグループを、６．２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１、１２．５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１及び２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１でそれぞれ週に１回で４週間処理した。処理開始時の腫瘍の平均大きさはそれぞれ２４６±７９ｍｍ3（ＰＢＳ）、２１６±８５ｍｍ3（６．２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）、１８８±７９ｍｍ3（１２．５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）及び２０７±９６ｍｍ3（２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１）であった。観察期間中の各グループの平均腫瘍体積を図５に示す。対照腫瘍の初期の腫瘍体積倍加時間は約５日であった。２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１で処理した動物において、処理開始後約２２日で全ての腫瘍が完全寛解し、消失した。観察期間の終了（６４日目）まで腫瘍の再成長は観察されなかった。１２．５ｍｇ／ｋｇ又は６．２５ｍｇ／ｋｇで処理した腫瘍は各グループの５／６のケースで完全寛解を示し、各グループの４匹は実験の終了まで無腫瘍を維持した。これらの結果は、ＢＩＷＩ１は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３異種移植ヌードマウスにおいて、６．２５〜２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＷＩ１で週に１回で４週間投与したとき、完全寛解及び持続的な寛解をもたらす、優れた抗腫瘍反応を誘導することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、ＢＩＷＩ１のインビトロ細胞傷害性を示す。抗原陽性細胞系Ａ４３１及びＦａＤｕ並びに抗原陰性細胞系Ａ５４９を使用した。
【図２】図２は、Ａ４３１腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理の開始（１日目）を示す。
【図３】図３は、ＦａＤｕ腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理の開始（１日目）を示す。
【図４】図４は、ＢＩＷＩ１処理の耐容性を示す。２つの独立したモデルにおける全処理グループの平均体重の変化を示す。１日目に処理を開始した。
【図５】図５は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３腫瘍で異種移植したヌードマウスにおけるＢＩＷＩ１処理の有効性を示す。グループあたりの平均腫瘍体積を標準偏差とともに示す。処理群を示す。矢印は処理日を示す。
Claims (37)
- 式：Ａ（ＬＢ）n
（式中、
Ａは、ＣＤ４４に特異的な抗体分子であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
Ｂは、細胞に対して有毒な化合物であり、及び
ｎは、１〜１０の１０進数である。）
で示される化合物。 - 前記リンカー部分が、細胞内で切断されることができる化学結合を有する、請求項１に記載の化合物。
- 前記化学結合がジスルフィド結合である、請求項２に記載の化合物。
- 前記抗体分子がヒトＣＤ４４のエキソンｖ６に対して特異的である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
- 前記抗体分子が、配列番号３で示されるアミノ酸配列内のエピトープに対して特異的である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
- 前記抗体分子が、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８（ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４）又はＶＦＦ−１８の抗原決定部位（ＣＤＲ）を有する組換え抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
- 前記抗体分子が、配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
- 前記有毒化合物Ｂがメイタンシノイドである、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
- 前記メイタンシノイドが式（ＩＩ）：
Ｒ1はＨ又はＳＲ4であり、Ｒ4はメチル、エチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環式アルキル、単一又は置換されたアリール又は複素環であり、
Ｒ2はＣｌ又はＨであり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、及び、
ｍは１、２又は３である。）
で示される、請求項８に記載の化合物。 - 前記式中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2はＣｌであり、Ｒ3はＣＨ3であり、ｍ＝２である、請求項９に記載の化合物。
- 式（ＩＩＩ）：
- ｐが３〜４である、請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物。
- ＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲート。
- 前記抗体分子が、配列番号３で示されるアミノ酸配列内のエピトープに特異的である、請求項１３に記載のコンジュゲート。
- 前記抗体分子が、モノクローナル抗体ＶＦＦ−１８（ＤＳＭ ＡＣＣ２１７４）又はＶＦＦ−１８の抗原決定部位（ＣＤＲ）を有する組換え抗体である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
- 前記抗体分子が、配列番号４又は８で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含んでいる、請求項１３〜１５のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記メイタンシノイドがジスルフィド部分により抗体分子へ連結している、請求項１３〜１６のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 前記メイタンシノイドが式（ＩＶ）：
- ＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子とメイタンシノイドとのコンジュゲートであって、
該抗体が配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖及び配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含み、
該メイタンシノイドが式（ＩＶ）：
ことを特徴とするコンジュゲート。 - １以上のメイタンシノイド残基が抗体分子へ連結している、請求項１３〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート。
- ３〜４のメイタンシノイド残基が抗体分子へ連結している、請求項２０に記載のコンジュゲート。
- 前記メイタンシノイドが、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−又は−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯ−基を介して抗体分子へ連結する、請求項１３〜２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
- 請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物Ａ（ＬＢ）n又は請求項１３〜２２のいずれかに記載のコンジュゲートの製造方法であって、
（ａ）１以上の遊離又は保護されたチオール基をＣＤ４４に対して特異的な抗体分子へ導入する工程、
（ｂ）工程（ａ）の抗体分子と細胞に対して有毒な化合物とを反応させる工程であって、該化合物が１以上のジスルフィド又はチオール基を有している工程、及び
（ｃ）得られたコンジュゲートを回収する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 前記抗体分子がＣＤ４４ｖ６に特異的である、請求項２３に記載の方法。
- 前記抗体分子が配列番号３で示される配列内のエピトープに特異的である、請求項２４に記載の方法。
- 前記有毒化合物がメイタンシノイドである、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
- 前記メイタンシノイドが式（ＩＩ）：
Ｒ1はＨ又はＳＲ4であり、Ｒ4はメチル、エチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環式アルキル、単一又は置換されたアリール又は複素環であり、
Ｒ2はＣｌ又はＨであり、
Ｒ3はＨ又はＣＨ3であり、及び、
ｍは１、２又は３である。）
で示される、請求項２６に記載の方法。 - 式中、Ｒ1はＨ又はＣＨ3であり、Ｒ2はＣｌであり、Ｒ3はＣＨ3であり、ｍ＝２である、請求項２７に記載の方法。
- （２−ピリジル）−３−ジチオプロパン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、（２−ピリジル）−４−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル又は（２−ピリジル）−５−ジチオペンタン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを使用して、遊離又は保護されたチオール基を前記抗体分子へ導入する、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
- 請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法により得られる化合物。
- 請求項１〜１２又は３０に記載の化合物Ａ（ＬＢ）n又は請求項１３〜２２のいずれかに記載のコンジュゲート、並びに医薬的に許容しうる担体、希釈剤又は賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
- 癌治療用医薬組成物の製造のための、請求項１〜１２又は３０に記載の化合物Ａ（ＬＢ）n又は請求項１３〜２２のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
- 前記癌が頭頸部扁平上皮細胞癌、食道扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚扁平上皮細胞癌、乳腺癌、肺腺癌、頸部腺癌、膵臓腺癌、大腸腺癌又は胃腺癌である、請求項３２に記載の使用。
- 癌治療用のための、請求項１〜１２又は３０に記載の化合物Ａ（ＬＢ）n、請求項１３〜２２のいずれかに記載のコンジュゲート又は請求項３１に記載の医薬組成物の使用。
- 前記癌が頭頸部扁平上皮細胞癌、食道扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚扁平上皮細胞癌、乳腺癌、肺腺癌、頸部腺癌、膵臓腺癌、大腸腺癌又は胃腺癌である、請求項３４に記載の使用。
- 癌治療の必要な患者の癌を治療する方法であって、
請求項１〜１２又は３０に記載の化合物Ａ（ＬＢ）n、請求項１３〜２２のいずれかに記載のコンジュゲート又は請求項３１に記載の医薬組成物の治療学的有効量を該患者へ投与する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 前記癌が頭頸部扁平上皮細胞癌、食道扁平上皮細胞癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚扁平上皮細胞癌、乳腺癌、肺腺癌、頸部腺癌、膵臓腺癌、大腸腺癌又は胃腺癌である、請求項３６に記載の方法。
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