JP2016501857A - 膵癌を処置するためのcd44v6由来ペプチド - Google Patents
膵癌を処置するためのcd44v6由来ペプチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016501857A JP2016501857A JP2015543431A JP2015543431A JP2016501857A JP 2016501857 A JP2016501857 A JP 2016501857A JP 2015543431 A JP2015543431 A JP 2015543431A JP 2015543431 A JP2015543431 A JP 2015543431A JP 2016501857 A JP2016501857 A JP 2016501857A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- peptide
- amino acids
- amino acid
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物に関する。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物。
(実施例)
細胞株
ラット膵癌細胞株BSp73AS(ASとも表す)およびその形質移入体が説明されており(Orian-Rousseau他、Genes & Development(2002)、16:3074〜3086)、それらを、10%FCS(PAA、ケルベ、ドイツ)を加えたRPMI(Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ)中で増殖させた。ヒト膵癌細胞L3.6pl(Bruns他、Neoplasia (1999)、1、50〜62)を、10%FCS(PAA、ケルベ、ドイツ)、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、L−グルタミンおよびMEMビタミン溶液(Pan Biotech、アイデンバッハ、ドイツ)を補充したDMEM(低グルコース;Invitrogen、カールスルーエ、ドイツ)中で維持した。
CD44v6に対するヒトモノクローナル抗体(VFF18)はBender(eBioscience、キャンパスヴィエナバイオセンター2、A−1030、ヴィエナ、オーストリア)からの贈与であり、抗ERK1(K−23)、c−Met(C−28)およびGFP抗体(sc−101525)はSanta Cruz Biotechnology(ハイデルベルク、ドイツ)からであり、開裂カスパーゼ−8抗体(IMG−5703)はImgenex(サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)からであり、CD31抗体(MEC13.3)はBD Biosciences、ハイデルベルク、ドイツからであり、開裂カスパーゼ−3(Asp175)、ホスホ−Met(Tyr1234/1235)(D26)、Met(25H2)およびホスホ−ERKホスホ−p44/42抗体はCell Signaling Technology(ビバリー、英国)からであった。ラットエクソンv6特異的抗体1.1ASMLが説明されている(Gunthert他、Cell(1991)、65、13〜24)。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された二次抗体はDako(グロストルップ、ドイツ)からであった。Alexa FluorR546ヤギ抗ウサギ二次抗体をLife Technologies(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。HGFをPeprotech(ハンブルク、ドイツ)から購入した。CD44v6ラットペプチドおよびCD44v6ヒトペプチド(14merおよび5mer)が説明されている(Matzke他、Cancer Res. (2005)、65(14)、6105〜6110)。ラット14merの配列はKEKWFENEWQGKNP(配列番号10)であり、ラット5merはNEWQG(配列番号11)に対応する。ヒト14merはKEQWFGNRWHEGYR(配列番号6)に対応し、ヒト5merは以下の配列を有する:NRWHE(配列番号2)。インビボでの撮像実験用に、ラット11mer WFENEWQGKNP(配列番号12)、マウス11mer WFQNGWQGKNP(配列番号13)およびヒト11mer WFGNRWHEGYR(配列番号14)を蛍光色素DY681で標識した。ラット細胞またはラット同系モデルの場合におけるコントロールペプチドとして、特異的ラットv6ペプチドと同一の長さのヒトv6ペプチドを使用した。ヒト腫瘍細胞またはヒト同所性腫瘍モデルの場合、コントロールとしてラットv6ペプチドを使用した。全てのペプチドはBachem(ブーベンドルフ、スイス)またはIntavis(ケルン、ドイツ)により産生された。凍結乾燥ペプチドを1%BSA含有PBS中に1mg/mlのストック濃度まで再懸濁した。PBS中に希釈することにより、最終希釈液を得た。
Metをサイレンシングするために使用するレンチウイルスシステムは既に説明されている(Corso他、Oncogene (2008)、27(5):684〜93)。他に記載されているようにレンチウイルスを産生した(Vigna他、J.Gene Med. (2000)、2(5):308〜16)。手短にいうと、4×106個の293T細胞(p12〜15)を10cmのプレートに播種した。24時間後にパッケージングベクターVSV−G、PMDLおよびRev、TetRならびにレンチウイルス構築物(Met−shRNA構築物またはコントロール−shRNA構築物のどちらか)を混合し、450μlの最終体積までTEを添加した。この混合物に、450μlの2.5M CaCl2溶液を添加した。ボルテックスおよび5分間のインキュベーション後、DNA−TE−CaCl2混合物を全速力でボルテックスしつつ、500μlの2×HBS溶液を滴加した。沈殿物を293T細胞に添加した。16時間後、培地を置き換えて5mM 酪酸ナトリウムを含有する新鮮培地を添加した。24時間後および48時間後に培地を回収した。次いで、8μg/mLのポリブレンの存在下で、ウイルス含有培地を標的細胞BSp73ASs6(70%培養密度)に添加した。感染から24時間後に培地を置き換え、1μg/mlの最終濃度までドキシサイクリン(Doxycylcline)を添加することによりshRNAの産生を誘導した。TetRおよびコントロール−shRNAまたはMet−shRNAを形質導入したBSp73ASs6細胞を72時間にわたりドキシサイクリンで処理した後、動物でのアッセイまたは注射を開始した。
血清飢餓させた細胞(24時間)を、5分にわたり37℃において増殖因子HGF(10ng/mL)で誘導した。示した箇所では、細胞をペプチド(100ng/ml)で処理した後に、10分にわたり37℃で誘導した(100ng/mLのCD44v6ペプチドまたはコントロールペプチド)。HGFによる誘導後、細胞を氷冷リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。活性化されたMetおよびErkを検出するために、細胞をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、即ち100mMジチオスレイトール(DTT)を含有するサンプルバッファーに溶解させ、煮沸し、ホスホ−Metおよびホスホ−ERKに対する抗体を使用するウェスタンブロット分析にかけた。Met抗体またはERK抗体で確かめることにより、ストリッピング(62.5M Tris、pH6.8、2%SDS、0.8%DTT)後の同じブロットに対してローディングコントロールを行なった。増強化学発光システム(Thermo Fisher Scientific、シュヴェーアト、ドイツ)を使用してブロットを染色した。ウェスタンブロット分析におけるバンドをプログラムImage J(National Institutes of Health)で定量化した。
Roche(マンハイム、ドイツ)のQuantikine Human HGF ImmunoassayおよびQuantikine Human VEGF Immunoassayを使用して、L3.6pl細胞の細胞培養培地におけるヒトHGFおよびヒトVEGFの濃度の測定を行なった。この目的のために、指定の各ペプチドの存在下で、15cmのプレート中において5日にわたり3×106個の細胞を培養した。上清(20ml)を遠心分離し(1200rpm)、メーカーの説明書に従ってアッセイを行なった。
雄の胸腺欠損のヌードマウス(NCI−nu)をHarlan(ロスドルフ、ドイツ)から購入した。BD10ラットおよびBDXラットを自家で繁殖させた。Regierungsprasidium Karlsruheにより承認された施設内に動物を収容して特定の病原体フリー条件下で維持した。動物実験に関するドイツの規則に従って全ての動物を取り扱った。Regierungsprasidium Karlsruheから動物実験を承認された(35−9185.817G−192/10)。ゲッティンゲンで撮像実験(図3)を行ない、これはRegierungsprasidiumから認可された(35−9185.817G−106/09)。
既に説明されているように(Napp他、Int J Cancer(2010)、127:1958〜1974)、近赤外蛍光(NIRF)撮像システムOptix MX2(ART、モントリオール、カナダ)を使用して、BD10ラットまたはBDXラットにおいて皮下で増殖したBSp73ASs6腫瘍のインビボでの撮像を行なった。毛皮の自己蛍光を避けるために、撮像前に腫瘍周囲のラットの毛を剃った。その後、2%イソフルランを使用して動物に麻酔をかけ、データの取得の間中、装置の加熱プレート上に動物を静かに固定した。蛍光バックグラウンドを低減するために、NIRF撮像前に1週間にわたり、ラットにクロロフィル低減飼料(Provimi Kliba AG、カイザーアウークシュト、スイス)を与えた。いかなる蛍光プローブも注射しない動物のネイティブ走査により、全てのインビボ分析を先行させた。インビボ分析の場合、尾静脈を介してラットにDY681標識したラットv6の11merペプチドまたはヒトv6の11merペプチド200μgを注射した。等量のDY681標識マウスv6の11merペプチドをコントロールに注射した。ラット11merは配列WFENEWQGKNP(配列番号12)を有し、マウス11merは配列WFQNGWQGKNP(配列番号13)を有し、ヒト11merは配列WFGNRWHEGYR(配列番号14)を有した。全てのペプチドを蛍光色素DY681で標識した。ペプチドの注射から指定された時間後にデータを取得した。エクスビボでのモニタリングの場合、ペプチド注射から24時間で動物を屠殺し、Optix MX2を使用して目的の腫瘍および器官をエクスビボで走査した。
Pearl(商標)撮像装置(LI−COR Biosciences、バートホンブルク、ドイツ)を使用して、L3.6pl腫瘍を有するマウスのインビボでの撮像を行なった。このシステムは、励起用に2つのレーザー(685nmおよび785nm)を使用し、シグナル検出用に電荷結合素子検出器を使用する。レーザー励起により、深組織への浸透が可能になる。近赤外検出により、組織の自己発光の低減に起因して高感度が達成される。画像を標準化するために、発明者らはPearl Cam Softwareを使用した。撮像の1週間前にクロロフィル低減飼料を動物に与え、蛍光バックグラウンドを低減させた(Regime210、安全な飼料、オジー、フランス)。撮像前に、2.0%イソフルランでマウスに麻酔をかけた。動物を撮像装置の加熱プレート上に置き、撮像ドロワー(imaging drawer)中のノーズコーンを介してイソフルランを継続的に送った。700nmおよび800nmの白色光で撮像した。ペプチドの静脈内注射前に、およびDY681標識ヒトv6ペプチドまたはコントロールとしてのDY681標識ラットv6ペプチドのどちらかの注射から24時間後に、動物を撮像した。各撮像セッション直後に動物を屠殺し、腫瘍、肝臓および脾臓を単離し、700nmおよび800nmの白色光においてエクスビボで走査した。
ASs6細胞またはL3.6pl細胞を、Lab−TekR Chamber SlideTM(Nunc、ネーピアビル、イリノイ州、米国)のウェル当たり5,000個の細胞で播種した。翌日に細胞を冷PBSで洗浄し、室温で30分にわたり4%ホルマリンで固定した。室温で1時間にわたり、PBS中の1%BSAにより非特異的結合をブロックした。細胞をDY681標識ペプチドと共に1時間にわたりインキュベートした。PBSによる3回の洗浄工程後、蛍光マウンティング培地(Dako、グロストルップ、デンマーク)と共にカバーガラスを載置し、レーザー走査型共焦点顕微鏡Leica TCS2 SP2(Exton、ペンシルバニア州、米国)により免疫蛍光を測定し、Leica共焦点ソフトウェアを使用して処理した。20倍の対物レンズを撮像に使用した。
組織形態学的分析のために、肺のパラフィン埋め込み切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびに過ヨウ素酸シッフ(H&EまたはPAS)で染色した。20μmおきに切片を分析することにより全組織ブロックの連続切片を調べ、各切片において、微小転移の存在を評価するために病理学者によって定常的に使用される手順に従って、転移性沈着物の存在および進展を評価した。
7μm厚のパラフィン切片を脱パラフィンして再水和した。P−Met染色の場合、1mM EDTA pH8.0中でスライドを煮沸し、続いて沸点より低い温度で15分にわたりインキュベートすることにより抗原アンマスキングを実現し、CD31染色の場合、切片を37℃で10分にわたりプロテイナーゼK(8μg/ml)で処理した。P−Metによる免疫蛍光染色の場合、60分にわたり5%ヤギ血清(DAKO、グロストルップ、デンマーク)(1×PBS/0.3%TritonX−100に希釈した)で非特異的結合をブロックした。免疫組織化学的検査の場合、内因性ペルオキシダーゼをPBS中の3%H2O2で最初にブロックし、続いてビオチンブロッキングシステム(Dako、グロストルップ、デンマーク)と共にインキュベートし、次いでPBS中の5%FCSと共にインキュベートすることにより非特的結合を阻害した。切片を4℃で、P−Met抗体(D26、1×PBS/1%BSA/0.3%TritonX−100中に1:50で希釈)、Met抗体(C−28、1:50で希釈)、GFP抗体(sc−101525、1:50で希釈)もしくは抗体(5μg/ml)と共に一晩インキュベートした、またはVFF18(5μg/ml)と共に一晩インキュベートした。PBS中での洗浄後、切片を45分にわたり、Alexa Fluor R 546ヤギ抗ウサギ(免疫蛍光P−Met染色および免疫蛍光Met染色の場合、1:500で希釈)またはビオチン化二次抗体(免疫組織化学染色の場合、VFF18およびCD31用にウサギ抗ラット抗体、P−Met用にヤギ抗ウサギ、GFP用に開裂カスパーゼ−3および開裂カスパーゼ−8およびウサギ抗マウス、1:500で希釈)と共にインキュベートした。DAB(3,3’−ジアミノベンジジン)染色の場合、切片をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接合体(Dako、グロストルップ、デンマーク)で処理し、DAB基材システム(3,3’−ジアミノベンジジン;Biozol、エヒング、ドイツ)で現像した。免疫蛍光の場合、核染色にDAPIを使用した。
Metに対するCD44v6の共受容体機能は、ラット膵臓腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段である
Met受容体に対するCD44v6の共受容体機能が腫瘍細胞の転移性拡散の決定的な手段であるかどうかを調べるために、エクソンv6のみを含有するまたはCD44v1〜10アイソフォームに含まれる全てのバリアントエクソンv1〜10を含有するCD44アイソフォームがラットBSp73AS細胞に転移能を付与することができたかどうかを最初に調べた。この細胞では、CD44v6含有アイソフォームが遺伝子導入されている場合を除いて、HGFによりMetを誘導することできない(図1A)。例えばCD44v1〜10Δv6におけるエクソンv6の除去により、HGFによるMetの活性化が損なわれた(図1A)。
CD44v6ペプチドの腫瘍部位へのおよび転移への結合の特異性を検証するために、ならびにインビボでの結合反応速度を推定するために、Optix MX2による近赤外蛍光(NIRF)撮像を行なった。この目的のために、以下の2種のCD44v6ペプチドをフルオロフォアDY681で標識した:ラット特異的CD44v6ペプチド、即ちrv6ペプチドDy681、およびコントロールとしてのマウス特異的CD44v6ペプチド、即ちmv6ペプチドDy681。図3Aの右側に示すように、インビトロでの試験により、実際には標識ラットペプチドのみがMet活性化を阻害し、マウスペプチドはMet活性化を阻害しなかったことが明らかとなった。更に、組織培養液中において、DY681標識ラットv6ペプチドはBSp73ASs6細胞に結合したが、DY681標識マウスv6ペプチドはBSp73ASs6細胞に結合しなかった(図3Aの左側)。
ヒト膵臓腫瘍への研究を発展させるために、高転移性ヒト膵癌細胞L3.6pl(Bruns他、Neoplasia (1999)、1(1):50〜62)を調べた。この細胞は、該細胞を更に転移させる手段である、肝臓中でおよび膵臓中で数回継代しているCOLO375細胞が起源である。この細胞ではMetがその活性化およびシグナル伝達をCD44v6に依存していることを確認した(図4A)。配列番号2または配列番号6のヒトv6ペプチドの存在下でまたは非存在下で、L3.6pl細胞をHGFで処理し、Met活性化およびERKへの下流シグナル伝達を測定した。ヒトv6ペプチドによりMetおよびERKの両方のリン酸化が阻害された。対応するラットv6ペプチド(コントロールペプチド、配列番号10または11)による処理は、受容体活性化および信号伝達に影響を及ぼさなかった(図4A)。
ラット系における肺のおよびヒトモデルにおける肝臓の特定の領域へのCD44v6ペプチドの特異的結合から、このペプチドが既に生じた転移に影響を及ぼすことができたかどうかの疑問が惹起される。図2および4に記載の実験において、腫瘍細胞の注射直後にペプチドを投与し、該ペプチドは転移の発生を完全に抑圧した。既に生じた転移へのCD44v6ペプチドの効果を測定するために、その他の実験的設定を使用した。BSp73ASs6細胞を同系ラットに皮下注射し、L3.6pl細胞を雄のヌードマウスに同所的に皮下注射し、3週間にわたり増殖させた。このとき、コントロール群由来の全ての動物は、ペプチド処理に使用した群の場合と同様であることを示唆する転移(表3)を発症していた。次いで、動物を種特異的CD44v6ペプチドまたはコントロールペプチド(ラット系の場合はマウスおよびヒト系の場合はラット)のどちらかで更に3週間にわたり週当たり2回処理し(図6Aのスキーム)、次いで転移の存在に関して検証した。実験の終了時に、コントロールペプチドで処理した全ての動物で転移を検出することができた(BSp73ASs6細胞の場合は表3、図6B、L3.6pl細胞の場合は表3、図6C)が、種特異的CD44v6ペプチドで処理した動物には転移がなかった。そのため、既に生じた転移はCD44v6ペプチドでの処理により除去される。
1.材料および方法
ペグ化ペプチドの合成
Applied Biosystems自動ペプチド合成機(モデル433A)でペプチド合成を行ない、分取HPLCによりペプチドを精製した。配列NEWQG(配列番号11)のペプチドおよびコントロールペプチドNAAAG(配列番号15)を合成した。質量分析計に接続されたLC(Bruker Daltonics−Bremen(ドイツ)製のμTOF LCMS)により、粗製物および精製物の特徴を明らかにした。
PEG−コントロールペプチド:PEG−NAAAG、
PEG−ラットCD44v6ペプチド:PEG−NEWQG
パルミチン酸−NH−PEG−CONH−コントロールペプチド
パルミチン酸−NH−PEG−CONH−ラットCD44V6ペプチド
PEG−コントロールペプチドおよびPEG−ラットCD44v6ペプチドを、受容体型チロシンキナーゼMetおよびERKのHGF誘導性活性化をブロックする能力に関して比較した。
散乱アッセイを更に行なった。HT29結腸癌細胞を10%FCS含有培地中で増殖させた。播種から1日後に細胞を飢餓させた。3日目に、細胞をHGF(10ng/ml)で誘導し、ペプチドなし、コントロールペプチド(配列番号15)、非ペグ化v6ペプチド(配列番号11)またはペグ化ペプチド、即ちPEG−ラットコントロールペプチドおよびPEG−ラットCD44v6ペプチドのいずれかと共にプレインキュベートした。
図9および10は、ペグ化ペプチドがMetおよびERKのHGF依存性活性化の阻害で効果的であることを示す。非ペグ化ペプチドと比べてペグ化ペプチドによりERKがより効果的に阻害される。
本明細書の記載の直鎖CD44v6ペプチド
ラット:14mer KEKWFENEWQGKNP、5mer NEWQG、DY681標識11mer WFENEWQGKNP
ヒト:14mer KEQWFGNRWHEGYR、5mer NRWHE、DY681標識11mer WFGNRWHEGYR
マウス:DY681標識11mer WFQNGWQGKNP
直鎖ペプチド(ヒト、14mer KEQWFGNRWHEGYR、5mer NRWHE)
使用した細胞株
HT29(結腸直腸癌)
HeLa(子宮頸癌)
L3.6pl(ヒト膵癌細胞)
MCF7(ヒト乳癌)
CD44v6ペプチド(v6 14mer;v6 5merも検証した、データを示さず)を使用して、ヒト上皮膵癌細胞L3.6pl(Colo357に由来する)、子宮頸癌細胞HeLaおよび結腸癌細胞HT29におけるCD44v6のMetシグナル伝達への寄与を分析した。HGFによる誘導前に細胞に添加した場合に、Metのおよびその下流標的Erkの活性化を妨げることができた(図12A、BおよびC)。コントロールペプチドとのインキュベーションによりMet活性化およびシグナル伝達を妨げられなかったことから、この結果から、この細胞株全てにおけるMet活性化にCD44v6が必要であることが分かる。
ポリエチレングリコールポリマー鎖の共有結合のプロセスであるPEG化は、免疫原性および抗原性を低下させることが知られている。PEG化により、化合物の流体力学的サイズが増大し、腎クリアランスの低下により動物中での循環時間が延びる。
この実験では、ペプチドの用量の減少を調べた。週当たり3回の注射の処理サイクルを維持した。更に、共受容体機能に必要である3つの重要なアミノ酸を含有する直鎖配列に基づく環状v6 8merを、その阻害効果に関してインビボで検証した。インビトロでのデータは、全てのペプチドによるリン酸化アッセイおよび細胞アッセイでMetおよびErkの活性化が既にブロッキングされていることを示した。
同所的L3.6pl腫瘍を有する動物において、様々なCD44v6ペプチド誘導体の比較を行なった。それぞれ5匹の動物からなる10個の群に、3週間にわたり週当たり3回、注射当たり20μgの用量のペプチドを投与し、化合物を表4に列挙する。処理の開始から3週後に動物を屠殺し、巨視的な転移および腫瘍の体積を分析した。
1.ヒトの膵癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態1に記載の使用のための化合物。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDを含む群から選択される)(配列番号5)含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択される)(配列番号9)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号9の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態2に記載の使用のための化合物。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む医薬組成物。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態8に記載の使用のための医薬組成物。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDを含む群から選択される)(配列番号5)含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択される)(配列番号9)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号9の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物を含む、実施形態9に記載の使用のための医薬組成物。
実施形態12に記載の使用のための医薬組成物。
前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、化合物の使用。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態16に記載の化合物の使用。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDを含む群から選択される)(配列番号5)含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択される)(配列番号9)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号9の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態17に記載の化合物の使用。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、方法。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WもしくはYまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態23に記載の方法。
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NもしくはQを含む群から選択され、X5が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEもしくはDを含む群から選択される)(配列番号5)含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X2が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X3が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X4が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X5が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X6が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択され、X12が、Gまたは非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばA、V、LもしくはIを含む群から選択され、X13が、非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、例えばF、WまたはYを含む群から選択され、X14が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択される)(配列番号9)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号9の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、NH2基を有するアミノ酸、例えばK、R、NまたはQを含む群から選択され、X11が、負荷電側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、実施形態24に記載の方法。
Claims (11)
- ヒトの膵癌の処置において使用するための化合物であって、
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(X1が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択され、X5が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号1)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X11、X12、X13もしくはX14が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)(配列番号7)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号7の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7およびX11が、A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、WもしくはYを含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む化合物。 - 前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X5が、EもしくはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される)(配列番号4)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X2が、EもしくはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X3が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X4が、F、WもしくはYのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X5が、F、WもしくはYのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X6が、Gまたは、A、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X7が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X11が、EもしくはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X12が、Gまたは、A、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X13が、F、WもしくはYのような非極性側鎖もしくは非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X14が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される)(配列番号8)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号8の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X11が、EもしくはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸、またはA、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、請求項1に記載の使用のための化合物。 - 前記化合物が、
・少なくともアミノ酸配列X1−R−W−H−X5(式中、X1が、K、R、NもしくはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択され、X5が、EもしくはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される)(配列番号5)含むペプチドまたはこのペプチド模倣物、または
・アミノ酸配列X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−R−W−H−X11−X12−X13−X14(式中、X1が、K、R、NまたはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択され、X2が、EまたはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X3が、K、R、NまたはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択され、X4が、F、WまたはYのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、X5が、F、WまたはYのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、X6が、Gまたは、A、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X7が、K、R、NまたはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択され、X11が、EまたはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X12が、Gまたは、A、V、LもしくはIのような非極性側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択され、X13が、F、WまたはYのような非極性側鎖または非荷電側鎖と芳香環構造とを有するアミノ酸を含む群から選択され、X14が、K、R、NまたはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択される)(配列番号9)の内の少なくとも5個の、6個の、7個の、8個の、9個の、10個の、11個の、12個の、13個のまたは14個のアミノ酸を含むペプチドであり、配列番号9の少なくともX7−R−W−H−X11(式中、X7が、K、R、NまたはQのようなNH2基を有するアミノ酸を含む群から選択され、X11が、EまたはDのような負荷電側鎖を有するアミノ酸を含む群から選択される)を含むペプチドまたはこのペプチド模倣物
を含む、請求項2に記載の使用のための化合物。 - 前記化合物が、アミノ酸配列N−R−W−H−E(配列番号2)、アミノ酸配列K−E−Q−W−F−G−N−R−W−H−E−G−Y−R(配列番号6)を含む、場合により、からなるペプチドまたはこのペプチド模倣物を含む、請求項1、2または3のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記化合物が前記ペプチドまたは前記ペプチド模倣物の改変型である、請求項1、2、3または4のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記化合物が、前記ペプチドまたはペプチド模倣物のペグ化型、ヘシル化型、パシル化型、ミリストイル化型、グリコシル化型および/または環状型である、請求項5に記載の使用のための化合物。
- 化合物が経口投与用に、経鼻投与用にまたは皮下投与用に製剤化されている、請求項1、2、3、4または5のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記膵癌が転移をまだ形成していない、請求項1、2、3、4、5、6または7のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記膵癌が転移を既に形成している、請求項1、2、3、4、5、6または7のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 前記膵癌が、対癌米国合同委員会の癌病期分類システムのTNM解剖学的/予後群システムに従ってステージIVと分類できる、請求項1、2、3、4、5、6または7のいずれかに記載の使用のための化合物。
- 膵癌が膵外分泌癌または膵内分泌癌である、請求項8、9または10のいずれかに記載の使用のための化合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1220901.1 | 2012-11-21 | ||
GBGB1220901.1A GB201220901D0 (en) | 2012-11-21 | 2012-11-21 | CD44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer |
PCT/EP2013/074401 WO2014079940A1 (en) | 2012-11-21 | 2013-11-21 | Cd44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016501857A true JP2016501857A (ja) | 2016-01-21 |
JP2016501857A5 JP2016501857A5 (ja) | 2016-12-22 |
Family
ID=47521471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015543431A Pending JP2016501857A (ja) | 2012-11-21 | 2013-11-21 | 膵癌を処置するためのcd44v6由来ペプチド |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9586993B2 (ja) |
EP (1) | EP2922561A1 (ja) |
JP (1) | JP2016501857A (ja) |
GB (1) | GB201220901D0 (ja) |
WO (1) | WO2014079940A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201421647D0 (en) * | 2014-12-05 | 2015-01-21 | Amcure Gmbh And Ruprecht-Karls-Universitat And Karlsruher Institut F�R Technologie | CD44v6-derived cyclic peptides for treating cancers and angiogenesis related diseases |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997016557A1 (de) * | 1995-10-31 | 1997-05-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | TUMORTHERAPIE DURCH ADOPTIVEN TRANSFER CD44v-SPEZIFISCHER ZYTOTOXISCHER T-LYMPHOZYTEN |
EP1417974A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy |
JP2004529963A (ja) * | 2001-05-18 | 2004-09-30 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞傷害性cd44抗体免疫コンジュゲート |
WO2005065709A2 (de) * | 2003-12-24 | 2005-07-21 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Gefriergetrocknete formulierung von antikörperkonjugaten |
EP1647556A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-19 | TopoTarget Germany AG | Peptidic compounds and derivatives thereof for the treatment of human diseases through inhibition of signaling via growth factors |
EP2218457A1 (en) * | 2009-02-16 | 2010-08-18 | Karlsruher Institut für Technologie | CD44v6 peptides as inhibitors of bacterial infections |
EP2266593A1 (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Karlsruher Institut für Technologie | Use of CD44v6 in the treatment of ophthalmic diseases |
WO2011022335A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods of using cd44 fusion proteins to treat cancer |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9901710D0 (en) | 1999-01-26 | 1999-03-17 | Prolifix Ltd | Peptide inhibitors |
EP1391213A1 (en) | 2002-08-21 | 2004-02-25 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents |
EP2343551B1 (en) | 2006-04-10 | 2014-05-28 | Genentech, Inc. | Dishevelled PDZ modulators |
SI2193142T1 (sl) | 2007-08-30 | 2015-05-29 | Curedm Group Holdings, Llc | Sestavek in postopek za uporabo proislet peptidov in analogov le-teh |
US20120258998A1 (en) | 2011-04-05 | 2012-10-11 | Patrick Tan | Fusion genes in gastrointestinal cancer |
-
2012
- 2012-11-21 GB GBGB1220901.1A patent/GB201220901D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-11-21 EP EP13794910.3A patent/EP2922561A1/en not_active Withdrawn
- 2013-11-21 WO PCT/EP2013/074401 patent/WO2014079940A1/en active Application Filing
- 2013-11-21 JP JP2015543431A patent/JP2016501857A/ja active Pending
- 2013-11-21 US US14/407,244 patent/US9586993B2/en active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997016557A1 (de) * | 1995-10-31 | 1997-05-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | TUMORTHERAPIE DURCH ADOPTIVEN TRANSFER CD44v-SPEZIFISCHER ZYTOTOXISCHER T-LYMPHOZYTEN |
JP2004529963A (ja) * | 2001-05-18 | 2004-09-30 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 細胞傷害性cd44抗体免疫コンジュゲート |
EP1417974A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy |
WO2005065709A2 (de) * | 2003-12-24 | 2005-07-21 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Gefriergetrocknete formulierung von antikörperkonjugaten |
EP1647556A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-19 | TopoTarget Germany AG | Peptidic compounds and derivatives thereof for the treatment of human diseases through inhibition of signaling via growth factors |
EP2218457A1 (en) * | 2009-02-16 | 2010-08-18 | Karlsruher Institut für Technologie | CD44v6 peptides as inhibitors of bacterial infections |
EP2266593A1 (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-29 | Karlsruher Institut für Technologie | Use of CD44v6 in the treatment of ophthalmic diseases |
WO2011022335A1 (en) * | 2009-08-21 | 2011-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Methods of using cd44 fusion proteins to treat cancer |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
A MATZKE, ET AL., CANCER RES, 2005, 65(14), PP6105-6110, JPN6017034275, ISSN: 0003823484 * |
M HOFMANN, ET AL., CANCER RESEARCH, 1991, 51, PP5292-5297, JPN6017034281, ISSN: 0003637326 * |
M TREMMEL, ET AL., BLOOD, 2009, 114(25), PP5236-5244, JPN6017034277, ISSN: 0003823485 * |
MARGOT ZOELLER, NATURE REVIEWS CANCER, vol. V11 N4, JPN5016002244, 10 March 2011 (2011-03-10), pages 254 - 267, ISSN: 0003637327 * |
VERONIQUE ORIAN-ROUSSEAU, EUROPEAN J CANCER, 2010, 46, PP1271-1277, JPN6017034280, ISSN: 0003823486 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB201220901D0 (en) | 2013-01-02 |
US20150166607A1 (en) | 2015-06-18 |
US9586993B2 (en) | 2017-03-07 |
WO2014079940A1 (en) | 2014-05-30 |
EP2922561A1 (en) | 2015-09-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11155603B2 (en) | Mimetic peptides derived from collagen type IV and their use for treating angiogenesis- and lymphangiogenesis- dependent diseases | |
US9593146B2 (en) | CD44v6-derived peptides for treating metastasizing cancer | |
WO2017143115A2 (en) | Enhancing the therapeutic activity of an immune checkpoint inhibitor | |
US9586993B2 (en) | CD44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer | |
US20230321283A1 (en) | Near infrared fluorescent dyes, formulations and related methods | |
WO2014079914A1 (en) | Cd44v6-derived pegylated peptides | |
US20170305995A1 (en) | CD44V6-Derived Peptides for Treating Metastasizing Cancer | |
US9586994B2 (en) | CD44V6-derived peptides for treating breast cancer | |
CA2931023C (en) | Pharmaceutical compositions of isolated peptides for the treatment of metastatic cancer | |
CN113454099A (zh) | 使用靶向过表达cMET的近红外肽在体内检测结肠瘤形成 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161031 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161031 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170912 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180125 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180126 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180626 |