CN101374545B - 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种杀死或抑制包含异质或混合细胞群体的肿瘤的方法。实现所述的杀死或抑制肿瘤是通过选择性地指向被认为表达在特定细胞群体上的特定的配体,从而还能杀死缺乏该特定配体的细胞群体。这些结合体的治疗作用是由于其被传送至特定的细胞群体以杀死这些细胞,并且释放细胞毒性药物以杀死非目标细胞,因此消除了肿瘤。
Description
本申请要求2005年4月15日提交的美国临时专利申请No.60/671,498和2006年3月14日提交的美国临时专利申请No.60/781,722的优先权。将两份临时专利申请所公开的全部内容引入本文以作参考。
技术领域
本发明涉及一种消除或杀死异质或混合细胞群体的方法。本发明尤其涉及一种通过择性地将对应于特定细胞群体的专一配体例如抗原、抗原决定基或受体同时还指向并杀死一个缺乏该专一配体的细胞群体,从而杀死肿瘤中的异质或混合细胞群体的方法。
背景技术
细胞毒素抗癌药物的疗效可以通过提高其对于癌细胞的选择性而得以增强。实现该目标的一种方法为将药物和与肿瘤细胞具有选择亲和性的单克隆抗体或其他类型的定向剂共价键合。这种方法已经被广泛应用于已经被开发的同时对于杀死目标肿瘤细胞具有高强度和高选择性、较长的循环保留时间、并且缺乏免疫基因的多种细胞毒素剂、以及多种可用于人源化(或人体)的抗体-药物结合体或免疫结合体。这种新一代的高效抗癌剂包括抗体和美登木素生物碱(maytansinoid)的结合体、CC1065的同功异质体、紫杉醇(taxol)(紫杉类(taxoids))的衍生物、auristatin的衍生物、以及刺孢霉素(calicheamycin)γ1的衍生物。多种美登木素生物碱(maytansinoid)(DM1)的结合体正在进行临床开发,并且anti-CD33抗体与刺孢霉素(calicheamycin)的结合体以及Mylotarg已经被联邦食品及药物管理局批准作为抗癌药物用于临床应用。
已经发表的很多报道详细地试图将单克隆抗体-药物结合体特定地指向肿瘤细胞(Sela等人发表于Immunoconjugates 189-216(C.Vogel,ed.1987);Ghose等人发表于Targeted Drugs1-22(E.Goldberg,ed.1983);Diener等人发表于Antibody Mediated Delivery Systems 1-23(J.Rodwell,ed.1988);Pietersz等人发表于Antibody Mediated Delivery Systems 25-53(J.Rodwell,ed.1988);Bumol等人发表于Antibody Mediated Delivery Systems 55-79(J.Rodwell,ed.1988))。细胞毒素药物例如氨甲蝶呤、柔毛霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、 以及瘤可宁已经与多种单克隆抗体共轭。在一些情况下,药物分子和抗体分子之间的连接是通过中间载体分子例如清蛋白(Gamett等人发表于Cancer Res.46:2407-2412(1986);Ohkawa等人发表于Cancer Immumol.Immunother.23:81-86(1986);Endo等人发表于Cancer Res.47:1076-1080(1980))、葡聚糖(Hurwitz等人发表于Appl.Biochem.2:25-35(1980);Manabi等人发表于Biochem.Pharmacol.34:289-291(1985);Dillman等人发表于Cancer Res.46:4886-4891(1986);Shoval等人发表于Proc.Natl.Acad.Sci.85:8276-8280(1988))、或聚谷氨酸(Tsukada等人发表于J.Natl.Canc.Inst.73:721-729(1984);Kato等人发表于J.Med.Chem.27:1602-1607(1984);Tsukada等人发表于Br.J.Cancer 52:111-116(1985))。
抗体-药物结合体的药效通常折衷为在一些肿瘤中的目标抗原的异质表达,因为通过与抗原-阳性肿瘤细胞结合的抗体的结合药物的定向转送不会伤害无法与抗体结合的任何抗原-阴性肿瘤细胞。此外,作为一种通过减少其血液供给而使肿瘤缩小的方法,肿瘤脉管系统是个有吸引力的目标,越来越引起注意。肿瘤脉管系统通常为肿瘤抗原-阴性。以前有报道发现几种抗体一定向细胞毒素剂确实不但能够根除抗原-阳性细胞而且能够根除抗原-阴性的邻近细胞,即所谓的“旁侧效应”。在免疫放射性核素、免疫脂质体、以及ADEPT中都观察到了该旁侧效应(Allen TM,Nat Rev Cancer 2(10):750-63(2002);Muldoon LL,Neurosurgery53(6):1406-12(2003),Muldoon LL和Neuwelt EA,J Neurooncol 65(1):49-62(2003))。在2000年3月美国癌症研究协会学报第41卷发表的摘要中,作者描述了通过细胞内的p-糖蛋白和其他流出转移剂使分裂的DM1的一部分流出。这是因为在细胞外的环境中,自由释放的DM1-硫醇容易与细胞的具有巯基或二硫键的分子例如半胱氨酸或胱氨酸、氧化或还原谷胱甘肽、或蛋白质(例如血清蛋白)反应。一旦与这些亲水的生物分子反应,DM-1会变成无活性的、混合二硫化合物,可以消除其渗入隔壁细胞的能力以及保留其特性的能力。
因此,如果细胞结合剂-药物结合体可以被设计成这样,就会非常有助于多种增殖疾病的治疗,从而提供一种更稳定并且更有效的游离药物的形式,不但可以消灭抗原-阳性肿瘤细胞,而且可以消灭周围的抗原-阴性肿瘤细胞或赘生脉管系统的细胞,因此通过在目标细胞内由结合体释放稳定游离的药物,可以使治疗肿瘤的效果最大化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种消除异质或混合细胞群体AB的方法,其中A代表选择性地表达特定配体的细胞群体,并且B代表缺乏由A表达的配体的细胞群体。该方法基本包含:转送细胞-结合剂药物结合体,使用含有二硫基团的连接剂连接选择的表达配体的细胞群体A,使该试剂与细胞群体A中的配体结合,选择使该药物进入包含细胞群体A的细胞中。在 结合体中与细胞-结合剂连接的药物表示为前体药物;前体药物一旦离开结合体就转变为细胞毒素药物或“药物”,并且能够进行进一步的修饰,例如烷基化。细胞毒素药物或修饰的细胞毒素药物是活性药剂。这样,在一个实施方式中,药物一旦离开结合体,就经过烷基化,优选为甲基化,可以保护未反应的硫醇基团不被进一步修饰而导致药物失活。游离烷基化的药物可以有效地杀死细胞群体A中的细胞;并且从细胞群体A中释放出该“活化”药物,并导致杀死细胞群体B中的细胞,因此消除了异质或混合细胞群体AB。这里使用的术语“活化”指的是游离的药物,优选为修饰的游离药物,其中对游离药物的修饰可以提高其稳定性或活性。这种修饰包含了从抗体-药物结合体上脱离后药物的烷基化例如甲基化。
因此,意外地发现,如果药物一旦脱离结合体,就在药物的硫醇基团上进行烷基化(例如甲基化),烷基化可以保护药物不与具有巯基的细胞的分子比如半胱氨酸或蛋白质(例如血清蛋白)反应而使游离的药物受阻或灭活。如本发明所示,烷基化的游离药物非常稳定并且有效,而且可以转移至并杀死抗原阴性的邻近的细胞,从而杀死肿瘤中的异质或混合细胞群体。
除了上述发现以外,还有一个令人意外的发现,如果在连接细胞结合剂和药物的连接剂中的二硫键通过在二硫键附近形成空间位阻而被稳定化了,优选将游离药物烷基化。在优选的实施方式中,通过在连接的药物一侧形成空间位阻,使二硫键被稳定化。空间位阻通常由烷基的原子形成,例如甲基,但其他烷基也可以使用。这里的“药物一侧”指的是当结合体的二硫键断裂后二硫键的两个α-碳原子中的会与药物连接的一个α-碳原子上的取代基。
“异质或混合细胞群体”指的是肿瘤细胞群体差异,包括不同的表型特征或分子特征,例如配体异质性,比如肿瘤细胞表面的抗原、抗原决定基或受体。还表示肿瘤组织中的混合细胞群体,例如肿瘤细胞、肿瘤脉管系统细胞、以及肿瘤基质细胞。此外,还表示肿瘤中的肿瘤细胞可能经历了自发突变,并造成基因异质细胞群体由单独恶性变异的细胞成长形成。表型特征可以包含肿瘤细胞表达配体,例如尤其在肿瘤增长阶段在肿瘤细胞表面的抗原、抗原决定基或受体。当细胞经历表型改变例如变异时,相同的肿瘤细胞可能会失去表面的配体表达。表型改变还包括将其散入环境使其失去其配体。
“异质或混合细胞群体”还可以指病毒感染细胞、微生物感染细胞、以及寄生虫感染细胞,其中病毒、微生物或寄生虫可能经历自发突变,并造成基因或表型异质细胞群体由单细胞成长形成。
因此在一个方面,本发明涉及一种将药物指向选定的肿瘤中的细胞群体的方法,其中至少一些细胞表达了特定的配体以杀死或消除在同一个肿瘤中缺乏该配体的无关的细胞群体。 该方法包含使用细胞-结合剂药物结合体接触选定的表达了特定配体的细胞群体或组织,在该结合体中一种或多种药物通过连接剂与细胞-结合剂共价连接,并且选定的细胞群体释放细胞毒素剂或“活性”药物以杀死或消除缺乏由目标细胞群体所表达的配体的无关的细胞。
本发明的另一个方面涉及了一种方法,通过将细胞-结合剂药物结合体指向选定的细胞群体从而消除异质或混合细胞群体,其中至少一些细胞表达了异质或混合细胞群体中的配体。通过结合体的细胞-结合剂识别配体,其中结合体的一种或多种药物通过连接剂共价连接。细胞-结合剂与目标细胞结合,并且被内在化,从而杀死目标细胞。活性的药物被释放到环境中,从而杀死其他选定的缺乏该配体的细胞群体,因此消除了异质或混合细胞群体。
本发明还教授了一种杀死肿瘤中的细胞的方法,包含:指向在异质或混合细胞群体AB的选定的细胞群体A上的最初表达的配体,并且随时间的进程流入介质。这里,细胞结合剂-药物结合体优选指向流出配体。细胞结合剂-药物结合体分离以释放出活性药物,分散进入围绕着流出抗原的邻近的异常的细胞,并杀死这些在肿瘤中的包含异质或混合细胞群体并且缺乏选择性地被指向的配体的细胞,从而杀死了肿瘤中的细胞。
附图说明
图1所示为抗体-药物结合体的结构;
图2所示为huC242抗体与结肠腺癌细胞系COLO205和HT-29、胃癌细胞系SNU-16、黑素瘤细胞系A375、以及Burkitt淋巴瘤细胞系Namalwa结合的柱状图。将细胞与huC242一起培育,然后用如Materials and Methods所述的荧光标记抗人体IgG进行染色,实施例1。将结合了荧光的细胞在荧光活性细胞分选器(FACS)中进行测定,然后以实线柱状图表示。虚线表示没有与huC242一起预培育的被荧光标记抗人体IgG染色(背景染色)的细胞的柱状图。抗原-阳性和抗原-阴性细胞的比例以数字显示;
图3所示为通过二硫键而不是硫醚键连接的免疫结合体在体外实际杀死位于目标细胞附近的非目标细胞;
A.在3D胶原细胞培养基中在未处理的COLO205细胞的增殖上用huC242-DM1、甲醛、或UV光处理的COLO205细胞的效果。未处理的细胞以不同的比例与处理过的细胞混合,并且将样品在胶原中培养5天,然后使用MTT化验测定能存活的细胞。对于各个细胞混合比显示了存活的细胞的片断。黑色、灰色、和白色条柱分别表示培养用huC242-DM1、甲醛、或UV光处理的细胞的结果。试验重复两次得到类似的结果;
B.在混合3D胶原细胞培养基中生长时在未处理的COLO205、Namalwa、A375、以及HepG2细胞上用huC242-DM1或huC242-SMCC-DM1处理的COLO205细胞的效果。用 huC242-DM1或huC242-SMCC-DM1处理的COLO205细胞的样品与相同数量的Namalwa、A375、HepG2、或未处理的COLO205细胞混合,并且将混合的培养基在胶原基质中培养5天,然后使用MTT化验测定存活细胞的数量,并且与对照样品(只有未处理的细胞)相比较。对于各个细胞系显示了存活的细胞的片断,黑色条柱表示COLO205细胞、灰色条柱表示Namalwa细胞、白色条柱表示A375细胞、并且虚线条柱表示HepG2细胞;
C.在液体细胞培养基中用huC242-DM1、huC242-SMCC-DM1、huC242-DC1、或huC242-SMCC-DC1处理CanAg-阳性COLO205细胞、CanAg-阴性Namalwa细胞或混合的COLO205与Namalwa细胞群体。COLO205细胞、Namalwa细胞、以及相等数量的COLO205与Namalwa细胞的混合群体在组织培养板的圆底井中在不存在(左列)或存在(右列)1nM的一种抗体-药物结合体的条件下成长。培养5天后,对井进行拍照;
D.类似于C的实验的结果,除了抗原-阳性细胞系为SNU-16;
图4所示为细胞毒素美登木素生物碱(maytansinoid)在用huC242-DM1处理的抗原-阳性目标细胞的上层清液中逐渐积聚;
使用huC242-DM1(A、B、D、E)或huC242-SMCC-DM1(C、F)培养CanAg-阳性COLO205细胞(A、C、D、F)和CanAg-阴性Namalwa细胞(B、E)的样品。将该培养菌落在开始以及培养6、24和48小时后取出,并且化验结合体(黑色条柱)以及释放的美登木素生物碱(maytansinoid)药物(白色条柱)的存在(A、B、C),并且化验在CanAg-阴性Namalwa细胞(D、E、F)上的细胞毒素的活性。将存活的细胞碎片对样品中结合体的浓度作图;
图5所示为异种移植肿瘤模型中免疫结合体的旁侧效应细胞毒性;
A.在SCID小鼠中成长并且用huC242-DM1或huC242-SMCC-DM1处理的COLO205/Namalwa混合异种移植肿瘤的免疫组织化学分析。滑片被鼠C242抗体染色以检测COLO205细胞(左栏)或被anti-CD38抗体染色以检测Namalwa细胞(右栏)。a和b为未处理肿瘤的连续切片,c和d为用PBS处理的动物的对照组的肿瘤,e和f为用huC242-SMCC-DM1处理的动物的肿瘤,并且g和h为用huC242-DM1处理的动物的肿瘤。箭头指向坏死的区域;
B.huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1结合体对于CanAg-阳性目标COLO205细胞(a)、抗原-阴性Namalwa细胞(b)、和COLO205和Namalwa细胞的混合群体(c)的异种移植肿瘤的活性。将具有尺寸大约为100cm3的确定肿瘤的动物用PBS(■、对照组)、huC242-SMCC-DM1(○、●)、或huC242-DM1(△、▲)以含有150μg/kg的连接DM1的结合体的每日剂量连续处理5天。将单位为mm3的肿瘤体积对时间(细胞接种后的天数) 作图;
图6所示为huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1结合体对于表达了目标抗原CanAg的异质的HT-29异种移植肿瘤的活性。将具有平均尺寸大约为170cm3的13天的皮下肿瘤的五只小鼠组用PBS(■、对照组)、huC242-DM1(A)、或huC242-SMCC-DM1(B)以含有25μg/kg(◇)、75μg/kg(◆)、或150μg/kg(○)的连接DM1的结合体的每日剂量连续处理5天。将单位为mm3的肿瘤体积对时间(细胞接种后的天数)作图;
图7所示为huC242-SPDB-DM4和huC242-SMCC-DM1的细胞毒性以及在溶菌酶抑制剂BafA1存在时其对细胞循环的影响。(A)在暴露在不同浓度的huC242-SPDB-DM4(菱形)或huC242-SMCC-DM1(方形)下4天之后使用MTT化验测定存活的抗原-阳性COLO205(实心符号)和抗原-阴性Nalmawa细胞(空心符号),并且对结合体浓度作图。(B)在具有HT-29人体克隆异种移植肿瘤的SCID小鼠中的huC242-SPDB-DM4和huC242-SMCC-DM1的抗肿瘤活性。剂量基于结合的DM4和DM1的量。用PBS(实心园形)、单剂量50μg/kg的huC242-SPDB-DM4(空心菱形)、150μg/kg的huC242-SPDB-DM4(实心菱形)、或以150μg/kg的剂量注射5天huC242-SMCC-DM1(空心方形)处理具有肿瘤的小鼠。(C)FACS柱状图(FL2-A)显示了在30μM的氯喹、30nM的BafA1的存在下用0.66μM的诺考达唑(nocodazole)、10-8M的DM1-SMe、3×10-9M的huC242-SPDB-DM4处理20小时或不做处理的异步指数生长的COLO205细胞的DNA含量;
图8所示为由huC242-SMCC-DM1诱导的有丝分裂抑制的氯喹的效果。FACS柱状图(FL2-A)显示了存在或不存在在30μM的氯喹的条件下用10-8M的DM1-SMe、3×10-9M的huC242-SMCC-DM1处理20小时或不做处理的异步指数生长的COLO205细胞的样品的DNA含量。在氯喹存在时,由huC242-SMCC-DM1诱导的G2/M抑制几乎完全失效(G2为14%),同时氯喹只有一个适度的由DM1-SMe(G2为51%)造成的G2/M抑制的效果;
图9所示为当用huC242-SMCC-[3H]DM1(A)或huC242-SPDB-[3H]DM4(B)处理COLO205细胞时形成的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物。使用丙酮从细胞小球和所消耗的介质中分别萃取出代谢物,然后通过HPLC进行分析。使用在线的的流动闪烁分析仪以mV2的输出对柱中的流出物进行氚监控;因此色谱显示了横坐标为保留时间并且纵坐标为测得的[3H]的mV2。面板a~f为使用huC242-SMCC-[3H]DM1(A)或huC242-SPDB-[3H]DM4(B)处理了5、9以及26小时的与COLO205细胞的介质和细胞小球相关的色谱。(A)的面板g和(B)的面板h为由丙酮分别萃取在实验中使用的huC242-SMCC-[3H]DM1和huC242-SPDB-[3H]DM4结合体样品所得的色谱。面板g(B)中的色谱源自与9-h培养的细 胞小球相同处理的细胞(如面板c),除了在色谱分离之前将该样品另外暴露于NEM以使巯基烷基化;
图10所示为使用DTT和硒醇处理在由huC242-SPDB-[3H]DM4处理的COLO205细胞的介质中的代谢物。在细胞暴露于结合体26小时之后使用丙酮在所消耗的介质中萃取代谢物。将该萃取液分为相等的两部分。一部分直接进行色谱分析(a)并且另一部分(b)在色谱分析前用DTT和硒醇进行处理以还原所有的二硫键。使用在线的流动闪烁分析仪以mV2的输出对柱中的流出物进行氚监控;因此色谱显示了横坐标为保留时间并且纵坐标为测得的[3H]的mV2;
图11所示为在使用[3H]结合体处理的COLO205细胞内外的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的积聚及其与有丝分裂抑制的相互关系。(A)如Materials and Methods中所述,将图9中的代谢物的放射性的峰的面积量化,并且转换成pmol,实施例2。面板a~c显示了经过26小时的培养期后在样品中的各种代谢物的量的变化。面板a:在使用huC242-SMCC-[3H]DM1处理COLO205细胞之后在介质(空心圆形)和细胞(实心圆形)中赖氨酸-Nε-SMCC-DM1的积聚。面板b:使用huC242-SPDB-[3H]DM4:S-甲基-DM4(方形)、赖氨酸-Nε-SPDB-DM4(圆形)、S-半胱氨酰-DM4(菱形)处理COLO205细胞后,在细胞小球(实心符号)和在介质(空心符号)中的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物量的变化。 面板c:在细胞小球(实心符号)或在细胞小球和介质一起(空心符号)中,两种结合体huC242-SMCC-[3H]DM1(圆形)和huC242-SPDB-[3H]DM4(方块)中存在的所有代谢物总量的变化。(B)用2μg/mL的阿非迪霉素(aphidicolin)处理24小时使COLO205细胞在S相中同步化。通过除去阿非迪霉素(aphidicolin)使细胞从S相中释放出来,并且用10-8M的DM1-SMe、3×10-9M的huC242-SMCC-DM1、3×10-9M的huC242-SPDB-DM4进行培养,或不做任何处理。在阿非迪霉素(aphidicolin)释放后5、10、和18小时进行FACS分析;
图12所示为由细胞表面-结合的huC242-SPDB-[3H]DM4产生美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物量。将增生的COLO205细胞置于冰上并且用饱和量的huC242-SPDB-[3H]DM4(10-7M)进行培养,以使结合体与受体表面结合而没有被内在化。然后清洗细胞,并且通过对样品的小片断进行闪烁计算,使结合的放射性的量被量化。在0 ℃下与结合体结合后涉及细胞样品的放射性的总量显示在纵坐标T=0处(空心三角,78pmol),并且培养22小时后(空心三角,57pmol)。该曲线显示了对于培养了5、9、22和30小时的样品,在细胞(实心符号)和在介质(空心符号)中的各种代谢物的累积。美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物为S-甲基-DM4(方形)、赖氨酸-Nε-SPDB-DM4(圆形)、S-半胱氨 酰-DM4(菱形);
图13所示为细胞代谢物的抗原依赖性。研究了美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物以及没有结合COLO205细胞的结合体。面板A(a、b)显示了用Tras-SMCC-[3H]DM1处理COLO205细胞26小时后细胞(a)和介质(b)的丙酮萃取液的色谱。相应的,面板A(c)(细胞)和(d)(介质)对应于结合体huC242-SPDB-[3H]DM4。面板B显示了Tras-SMCC-[3H]DM1(a)和huC242-SPDB-[3H]DM4(b)的丙酮萃取液的色谱;
图14所示为细胞毒素中主要代谢物的作用。(A)在存在或不存在BafA1的情况下BafA1对huC242-SMCC-[3H]DM1和huC242-SPDB-[3H]DM4的细胞代谢物的影响。色谱取自在存在BafA1的情况下用huC242-SMCC-[3H]DM1或huC242-SPDB-[3H]DM4处理了22小时或不做任何处理的COLO205细胞的丙酮萃取液。(B)比较用huC242-SPDB-D-[3H]DM4和huC242-SPDB-[3H]DM4处理COLO205细胞所形成的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的累积。由huC242-SPDB-D-[3H]DM4(实心方形)和huC242-SPDB-[3H]DM4(实心圆形)所产生的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的总量。如图9所述对代谢物进行定量;
图15所示为由huC242-SPDB-D-[3H]DM4处理COLO205细胞形成的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物。用huC242-SPDB-D-[3H]DM4处理COLO205细胞并且在5、9、22和30小时时对细胞和介质进行取样,并且如图7所述对代谢物进行分析。(A)左面板显示了四个连续时间点的细胞萃取液的色谱,并且右面板显示了相对应的介质样品的色谱。(B)如图9所述对细胞(实心圆形)和介质(空心方形)中由huC242-SPDB-D-[3H]DM4所产生的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的总量进行定量;
图16所示为在目标癌细胞中huC242-美登木素生物碱(maytansinoid)的活化的模型。结合体活化的起始步骤与二硫一被连接的结合体比如huC242-SPDB-DM4、以及非二硫-被连接的结合体比如huC242-SMCC-DM1类似。首先都是通过抗原-介质化细胞内吞作用由目标癌细胞进行内在化,通过小泡传递传送至溶酶体,然后降解为赖氨酸-衍生物:赖氨酸-Nε -SMCC-DM1和赖氨酸-Nε-SPDB-DM4。这些赖氨酸衍生物很可能与细胞内的目标微管蛋白结合,并且通过抑制微管聚合造成细胞毒性。与赖氨酸-Nε-SMCC-DM1不同,赖氨酸-Nε -SPDB-DM4可以承受进一步的细胞内修饰、还原和S-甲基化,从而最后形成S-甲基-DM4。当赖氨酸-衍生物一旦离开目标细胞就不再具有活性,中性的亲脂性S-甲基-DM4化合物仍然具有活性,并且能够重新进入目标细胞或进入相邻的细胞(旁侧效应);以及
图17所示为合成硫甲基美登木素生物碱(maytansinoid)的示意图。
具体实施方式
本发明者意外地发现如果药物一旦从结合体上释放,就在药物的硫醇基团上进行烷基化(例如甲基化),药物烷基化可以保护药物不与具有巯基的细胞分子比如半胱氨酸、或蛋白质(例如血清蛋白)、或具有二硫基团的细胞分子比如胱氨酸、氧化谷胱甘肽反应而使游离的药物受阻或灭活。此外,本发明者还意外地发现在细胞结合剂-药物结合体中的药物的强度依赖于在细胞毒素药物和细胞结合剂之间连接处的位阻。通过在邻近二硫键的两个α-碳上加入烷基例如甲基以阻隔结合体。该位阻如果在结合体的药物一侧,则会诱导游离的药物烷基化(例如甲基化),一旦药物在其目标中释放,可以在细胞内或细胞外。在连接硫原子的α-碳上具有一个或两个烷基取代基的空间位阻硫醇和含有二硫的美登木素生物碱(maytansinoid)的制备如2004年11月25日公布的美国专利申请No.2004/0235840所述,其中全部内容引入本文以作参考。
这样,在一个实施方式中,当细胞结合剂-药物结合体的二硫键断裂时,会在目标细胞内或附近释放药物。此外,药物的硫醇基团经过烷基化(例如甲基化或增加了一个或多个CH3 基团)会使药物稳定并且有效力,不但能够杀死例如在肿瘤中的异质或混合细胞群体中的目标细胞还能杀死非目标细胞,或者在目标细胞周围的细胞。
在细胞结合剂-药物结合体中的受阻的硫醇基团比起在同样结合体中的未受阻的硫醇基团的优势在于,由于与未受阻的硫醇基团相比,对于分离的药物更易进行烷基化,从而可以防止药物遭受修饰反应并造成失去其功能。此外,烷基化的药物在一段时间内有效,并且能够指向肿瘤中的邻近细胞从而杀死邻近的细胞。有效的烷基化药物如实施例所述可以被化学合成,并且发现它们在体外效力至少强100倍。
本发明还提供了一种改进的在混合或异质细胞群体中指向细胞的方法,尤其是需要被杀死的细胞,例如肿瘤细胞(尤其是实心的肿瘤细胞)、病毒感染细胞、微生物感染细胞、以及寄生虫感染细胞,以上皆包括在非正常细胞的异质或混合群体中。
本发明方法中的结合体具有一个或多个美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷类(taxane)或CC-1065类似物,通过二硫连接剂与细胞-结合剂连接。在一种制备结合体的方法中,首先用异双功能交联剂例如SPP、SPDP、SPDB、或SSNPP修饰细胞-结合剂例如抗体。列出的交联剂都使用N-羟基琥珀酰亚胺酯化学与抗体反应。列出的化合物在链的长度上和在与游离的硫醇反应的二硫代吡啶周围的位阻程度上不同。在第二步中,修饰的试剂与药物反应,例如,具有硫醇基团的美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷类(taxane)或CC-1065类似物,从而制备细胞-结合剂药物结合体。因此,最终由两部份组合成连接剂,引入细胞-结合剂的交联剂和药物的巯基例如DM1或DM4。作为选择,药物例如美登木素 生物碱(maytansinoid)在与细胞-结合剂反应之前可以用交联剂进行修饰。参见例如美国专利No.6,441,163B1。
虽然对于分离的药物优选进行烷基化,并且对于本领域内技术熟练人员来说可以分离出该体内烷基化的美登木素生物碱(maytansinoid)(例如,体内甲基化的美登木素生物碱(maytansinoid)),但美登木素生物碱(maytansinoid)也可以如图8所示在体外进行烷基化。该体外甲基化的美登木素生物碱(maytansinoid)对于杀死肿瘤细胞具有很高的效力。
细胞-结合剂
本发明的化合物作为治疗药剂的效果依赖于对合适细胞-结合剂的仔细选择。细胞-结合剂可以是任何已知的种类,或正在研究的并且包括肽和非肽。通常,这些可以是抗体(尤其是单克隆抗体及其碎片)、淋巴因子、激素、增长因子、维生素、营养传送分子(转铁蛋白)、或任何其他细胞-结合分子或结合特定目标的物质。
目标通常在肿瘤中但不一定在肿瘤细胞的细胞表面,例如,目标最初也可以存在于细胞表面并且分离而流入环境介质中。
可以使用的细胞-结合剂的更具体的例子包括:
多克隆和单克隆的抗体,包括人体抗体;
单链抗体(多克隆和单克隆);
抗体碎片(多克隆和单克隆)例如Fab、Fab’、F(ab’)2、以及Fv(Parham,131J.Immunol.2895-2902(1983);Spring等人,113 J.Immunol.470-478(1974);Nisonoff等人,89 Arch.Biochem.Biophys.230-244(1960));
嵌合(chimeric)抗体及其抗原-结合碎片;
域(domain)抗体(dAbs)及其抗原-结合碎片,包括camelid抗体(Desmyter等人,3Nature Struct.Biol,752,1996);
鲨(shark)抗体即新抗原受体(IgNAR)(Greenberg等人,374 Nature,168,1995;Stanfield等人,305 Science 1770-1773,2004);
干扰素(例如alpha、beta、gamma);
淋巴激活素例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6;
激素例如胰岛素、TRH(促甲状腺素释放的激素)、MSH(黑素细胞-刺激激素)、类固醇激素例如雄激素和雌激素;
增长因子和群体刺激因子例如EGF、TGF-alpha、FGF、VEGF、G-CSF、M-CSF和GM-CSF (Burgess,5Immunology Today 155-158(1984));
转铁蛋白(O’Keefe等人,260 J.Biol.Chem.932-937(1985));以及
维生素例如叶酸。
单克隆抗体技术使得特定单克隆抗体形式的极端特定的细胞结合剂的制备成为可能。该领域内最为熟知的技术为通过使用相关的抗原例如完整目标细胞、与目标细胞隔离的抗原、完整的病毒、减弱的完整病毒、以及病毒蛋白例如病毒外壳蛋白,使小鼠、老鼠、仓鼠或任何其他哺乳动物免疫而制备形成单克隆抗体。过敏的人体细胞也可以使用。另一种形成单克隆抗体的方法为使用抗体碎片例如Fab和scFv(单链可变区域)尤其是人体scFv(参见例如Griffiths等人,美国专利Nos.5,885,793和5,969,108;McCafferty等人,WO92/01047;Liming等人,WO99/06587)的噬菌体库。此外,也可以使用美国专利No.5,639,641公开的表面重整的抗体作为可以用于人体的抗体。
合适的细胞-结合剂的选择依赖于需要指向的特定细胞群体,但如果合适的细胞-结合剂是可得到的,通常优选人体单克隆抗体。
例如,单克隆抗体J5是特定于普通急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)(Ritz等人,283Nature 583-585(1980))的鼠类IgG2a抗体,并且如果目标细胞表达了CALLA例如在急性淋巴细胞白血病中则可以使用。
单克隆抗体MY9是与特定的CD33抗原(J.D.Griffin等人,8 Leukemia Res.,521(1984))结合的鼠类IgG1抗体,并且如果目标细胞表达了CD33抗原例如在急性髓细胞性白血病(AML)中则可以使用。
与之类似,单克隆抗体anti-B4也可以被称为B4,是与B细胞的CD19抗原(Nadler等人,131 J.Immunol.,224-250(1983))结合的鼠类IgG1抗体,并且如果目标细胞为B细胞或表达了该抗原的患病细胞例如在non-Hodgkin’s淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病中则可以使用。同样,也可以使用鼠类单克隆抗体N901,这是与在神经内分泌细胞中包括小细胞肺肿瘤中发现的CD56(神经细胞粘连分子)抗原结合的抗体。这些抗体在使用前优选进行表面重整或人源化。例如,在药物-抗体结合体中优选表面重整或人源化的MY9、anti-B4或N901作为抗体。
这些抗体的表面重整或人源化如Roguska等人Proc Natl Acad Sci美国1994年2月1日;91(3):969-973所述,其中全部内容引入本文以做参考。
此外,与CanAg抗原结合的单克隆抗体C242(美国专利No.5,552,293)可以被用于处理CanAg表达的肿瘤,例如结肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、以及胃癌。huC242是单克隆 抗体C242的人源化的形式,如美国专利No.5,552,293所述,并且用ECACC沉积杂种瘤,标识编号90012601。可以通过采用CDR-嫁接法(美国专利No.5,585,089、5,693,761、以及5,693,762)或表面重整法(美国专利No.5,693,641)制备人源化的形式。huC242也可以被用于处理CanAg表达的肿瘤,例如结肠癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、以及胃癌。
此外,抗体曲妥单抗(trastuzumab)可以被用于治疗表达Her2抗原的乳腺癌及其他癌症,例如前列腺癌和卵巢癌。
结合胰岛素增长因子受体的Anti-IGF-IR抗体也非常有用。
卵巢癌和前列腺癌可以分别用例如anti-MUC1抗体比如anti-HMFG-2(Taylor-Papadimitriou等人,28.Int.J.Cancer 17-21,1981)或hCTM01(56 Cancer Res.5179-5185,1996)或DS6以及anti-PSMA(前列腺-特定隔膜抗原)比如J591(Liu等人,57 Cancer Res.3629-3634,1997)成功地定向治疗。
非抗体分子也可以被用于指向特定细胞群体。例如,与骨髓细胞结合的GM-CSF可以被作为细胞-结合剂使用以指向急性髓细胞性白血病的患病细胞。此外,与活性T-细胞结合的IL-2可以被用于防止移植排斥,用于治疗并防止移植病毒感染疾病,并且用于治疗急性T-细胞白血病。与黑素细胞结合的MSH可以被用于治疗黑素瘤。叶酸可以被用于指向卵巢和其他肿瘤表达的叶酸受体。表皮增长因子(EGF)能够被用于指向鳞状上皮癌例如肺部、头部和颈部。生长激素抑制素可以被用于指向成神经细胞瘤(neuroblastomas)和其他肿瘤类型。使用雌激素(或雌激素类似物)或雄激素(或雄激素类似物)作为细胞-结合剂可以分别成功地指向乳腺癌和睾丸癌。
交联剂
在这里使用的“连接剂”是任何可以将细胞-结合剂与药物共价连接的化学成分,例如美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷类(taxane)、或CC1065类似物。部分交联剂配有药物。例如DM1,一种含有硫醇的美登木素生物碱(maytansinoid),是一种美登素的衍生物。为了形成DM1,美登素的C-3羟基的侧链被修饰为具有一个自由的SH。这个硫醇化的美登素可以与修饰的细胞-结合剂反应以形成结合体。因此,最终连接剂是由两部分组合而成,一部分来自引入细胞-结合剂的交联剂,并且另一部分来自DM1的侧链。
可断裂的连接剂为能够在适度条件下断裂的连接剂,例如在药物例如美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷类(taxane)、或CC1065的活性不会受影响的条件下以及在细胞内的条件下。很多满足这些条件的连接剂如下所述。
含有二硫化物的连接剂为能够通过在生理条件下发生的二硫交换而断裂的连接剂。
酸解连接剂为在酸性pH下断裂的连接剂。例如,一些细胞内隔膜比如核内体和溶酶体具有酸性pH(pH为4~5),并且具有适合酸解连接剂断裂的条件。
光解连接剂可以用于身体表面以及很多能接收到光的体腔。此外,红外光可以穿透组织。
一些连接剂可以被肽酶所断裂。只有特定肽酶可以在细胞内或细胞外发生断裂,参见例如Trouet等人,79 Proc.Natl.Acad.Sci.美国,626-629(1982)以及Umemoto等人,43 Int.J.Cancer,677-684(1989)。
细胞毒素剂
本发明的细胞毒素结合体中使用的细胞毒素剂可以是任何会造成细胞死亡的化合物,或导致细胞死亡,或以某种方式降低细胞存活力。优选的细胞毒素剂包括,例如美登木素生物碱(maytansinoid)和美登木素生物碱(maytansinoid)类似物、紫杉类(taxoid)、CC-1065和CC-1065类似物、多拉司他汀(dolastatin)和多拉司他汀(dolastatin)类似物,定义如下。这些细胞毒素剂与这里公开的抗体、抗体碎片、功能等价物、改进的抗体及其类似物结合。
细胞毒素结合体可以通过体外的方法进行制备。为了将药物或药物前体与抗体连接,使用了二硫基团。可以通过抗体和药物或药物前体之间的二硫交换反应形成结合体。
美登木素生物碱(Maytansinoids)
在本发明可以使用的用以形成细胞毒素结合体的细胞毒素剂为美登木素生物碱(maytansinoid)和美登木素生物碱(maytansinoid)类似物。合适的美登木素生物碱(maytansinoid)的例子包括美登木醇(maytansinol)和美登木醇(maytansinol)类似物。美登木素生物碱(Maytansinoid)为可以抑制微管形成的药物,并且对于哺乳动物细胞具有很大的毒性。
合适的美登木醇(maytansinol)类似物包括那些具有被修饰的芳环和在其他位置被修饰的化合物。这样的合适的美登木素生物碱(maytansinoid)如美国专利No.4,424,219;4,256,746;4,294,757;4,307,016;4,313,946;4,315,929;4,331,598;4,361,650;4,362,663;4,364,866;4,450,254;4,322,348;4,371,533;6,333,410;5,475,092;5,585,499;以及5,846,545。
合适的具有芳环修饰的美登木醇(maytansinol)的类似物的具体例子包括:
(1)C-19-脱氯(美国专利No.4,256,746)(由安莎霉托素(ansamytocin)P2的LAH还原制得);
(2)C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4,361,650和4,307,016) (由使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)脱甲基化或使用LAH脱氯化制得);以及
(3)C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4,294,757)(由使用酰氯酰化制得)。
合适的具有其他位置修饰的美登木醇(maytansinol)的类似物的具体例子包括:
(1)C-9-SH(美国专利No.4,424,219)(由美登木醇(maytansinol)与H2S或P2S5反应制得);
(2)C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598);
(3)C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)(由诺卡氏菌制得);
(4)C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)(由用链霉菌转化美登木醇(maytansinol)制得);
(5)C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)(由trewia nudiflora离析制得);
(6)C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)(由用链霉菌对美登木醇(maytansinol)脱甲基化制得);以及
(7)4,5-脱氧(美国专利No.4,371,533)(由美登木醇(maytansinol)的三氯化钛/LAH还原制得)。
在优选的实施方式中,本发明的细胞毒素结合体利用了含有硫醇的美登木素生物碱(Maytansinoid)DM1作为细胞毒素剂,分子式为N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素。DM1如下列结构式(I)所示:
在另一个优选的实施方式中,本发明的细胞毒素结合体利用了含有硫醇的美登木素生物碱(Maytansinoid)DM4作为细胞毒素剂,分子式为N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基-4-巯基-1-氧戊基)-美登素。DM4如下列结构式(II)所示:
在本发明的进一步优选的实施方式中,可以使用其他美登素,包括含有硫醇和二硫的在与硫原子相邻的碳原子上具有单或双烷基取代的美登木素生物碱(Maytansinoid)。这些美登木素生物碱(Maytansinoid)包括在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20脱甲基、具有酰化氨基酸侧链的美登木素生物碱(Maytansinoid),其酰基具有有位阻的巯基,其中具有硫醇官能团的酰基的碳原子具有一个或两个取代基,所述取代基为CH3、C2H5、具有1~10个碳原子的直链的或支链的烷基或烯基、具有3~10个碳原子的环烷基或环烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且其中取代基可以是H,并且酰基在羰基官能团和硫原子之间具有的直链长度至少为三个碳原子。
该另外的美登素包括由结构式(III)表示的化合物:
其中:
Y’表示(CR7R8)l(CR9=CR10)pC=CqAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt(CR3R4) nCR1R2SZ,
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基,例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
A、B、D为具有3~10个碳原子的环烷基或环烯基,简单的或取代的芳基或杂环芳基或 杂环烷基基团;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m、n、o、p、q、r、s和t为各自独立的0或1~5的整数,其中l、m、n、o、p、q、r、s和t中至少两个不同时为0;并且
Z为H、SR或-COR,其中R为具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、简单的或取代的芳基或杂环芳香基或杂环烷基基团。
结构式(III)的优选实施方式包括满足下列条件的结构式(III)的化合物:
R1为H,R2为甲基,并且Z为H。
R1和R2为甲基,并且Z为H。
R1为H,R2为甲基,并且Z为-SCH3。
R1和R2为甲基,并且Z为-SCH3。
另外的美登素还包括由下列结构式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D,L)所示的化合物:
其中:
Y表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
R3、R4、R5、R6、R7和R8为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m和n为各自独立的1~5的整数,其中n可以为0;
Z为H、SR或-COR,其中R为具有1~10个碳原子的直链的或支链的烷基或烯基、具有3~10个碳原子的环状的烷基或烯基、简单或取代芳基、或杂环芳香基或杂环烷基基团; 并且
May表示在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20脱甲基具有侧链的美登木素生物碱(Maytansinoid)。
结构式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D,L)的优选实施方式包括满足下列条件的结构式(IV-L)、(IV-D)或(IV-D,L)的化合物:
R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为H。
R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为H。
R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为-SCH3。
R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为-SCH3。
优选的细胞毒素剂为如结构式(IV-L)所示。
另外的美登素包括由结构式(V)表示的化合物:
其中:
Y’表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ,
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
R3、R4、R5、R6、R7和R8为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m和n分别为独立的1~5的整数,其中n可以为0;并且
Z为H、SR或-COR,其中R为具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基、具有3~10 个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、简单或取代芳基、或杂环芳香基或杂环烷基基团。
结构式(V)的优选实施方式包括满足下列条件的结构式(V)的化合物:
R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为H。
R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为H。
R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为-SCH3。
R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,并且Z为-SCH3。
另外的美登素还包括由下列结构式(VI-L)、(VI-D)或(VI-D,L)所示的化合物:
其中:
Y2表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
R3、R4、R5、R6、R7和R8为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m和n分别为独立的1~5的整数,其中n可以为0;
Z2为SR或COR,其中R为具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、简单或取代芳基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;并且
May为美登木素生物碱(Maytansinoid)。
另外的美登素包括由结构式(VII)表示的化合物:
其中:
Y2’表示(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt (CR3R4)nCR1R2SZ2,
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
A、B、D为具有3~10个碳原子的环烷基或环烯基,简单或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别为独立的0或1~5的整数,其中l、m、n、o、p、q、r、s和t中至少两个不同时为0;并且
Z2为SR或-COR,其中R为具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、简单或取代芳基、或杂环芳香基或杂环烷基基团。
结构式(VII)的优选实施方式包括满足下列条件的结构式(VII)的化合物:R1为H并且R2为甲基。
上述美登木素生物碱(Maytansinoid)可以与anti-CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、曲妥单抗(trastuzumab)、或其同系物或碎片结合,其中抗体用硫醇或二硫官能团与美登木素生物碱(Maytansinoid)连接,其中的硫醇或二硫官能团位于在美登木素生物碱(Maytansinoid)的C-3、C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20脱甲基的酰化氨基酸侧链的酰基, 并且其中酰化氨基酸侧链的酰基的硫醇或二硫官能团位于具有一个或两个取代基的碳原子,所述取代基为具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且其中一个取代基可以是H,并且酰基在羰基官能团和硫原子之间具有的直链长度至少为三个碳原子。
本发明的优选的结合体包含anti-anti-CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、曲妥单抗(trastuzumab)、或其同系物或碎片,并与结构式(VIII)的美登木素生物碱(Maytansinoid)结合:
其中:
Y1’表示(CR7R8)l(CR9=CR10)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r(C=C)sBt (CR3R4)nCR1R2S-,
其中:
A、B、D为各自独立的具有3~10个碳原子的环烷基或环烯基,简单或取代的芳基或杂环芳基或杂环烷基基团;
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R11和R12为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;并且
l、m、n、o、p、q、r、s和t分别为独立的0或1~5的整数,其中l、m、n、o、p、q、r、s和t中至少两个不同时为0。
优选R1为H并且R2为甲基,或R1和R2为甲基。
本发明的更优选的结合体包含anti-CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、曲妥单抗(trastuzumab)、或其同系物或碎片,并与结构式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D、L) 的美登木素生物碱(Maytansinoid)结合:
其中:
Y1表示(CR7R8)l(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2S-
其中:
R1和R2为各自独立的具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团,并且此外R2可以是H;
R3、R4、R5、R6、R7和R8为各自独立的H、具有1~10个碳原子的直链的烷基或烯基例如CH3和C2H5、具有3~10个碳原子的支链的或环状的烷基或烯基、苯基、取代的苯基、或杂环芳香基或杂环烷基基团;
l、m和n分别为独立的1~5的整数,其中n可以为0;
并且May表示在C-3、C-14羟甲基、C-15羟基、或C-20脱甲基具有侧链的美登木素生物碱(Maytansinoid)。
结构式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D,L)的优选实施方式包括满足下列条件的结构式(IX-L)、(IX-D)或(IX-D,L)的化合物:
R1为H,R2为甲基,或R1和R2为甲基,
R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0,
R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,n为0。
优选的细胞毒素剂为如结构式(IX-L)所示。
本发明的更优选的结合体包含anti-CA6抗体DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、曲妥单抗(trastuzumab)、或其同系物或碎片,并与结构式(X)的美登木素生物碱(Maytansinoid)结合:
其中取代基定义同上述结构式(IX)。
特别优选的任何上述化合物,其中R1为H,R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,并且n为0。
进一步特别优选的任何上述化合物,其中R1和R2为甲基,R5、R6、R7和R8都为H,l和m都为1,并且n为0。
此外,优选L-氨酰立体异构体。
2004年11月25日发布的美国专利No.2004/0235840中所述的各个美登木素生物碱(Maytansinoid)也可以被用于本发明的细胞毒素结合体。将2004年11月25日发布的美国专利No.2004/0235840的全部内容引入本文以作参考。
含有二硫的连接基团
为了将美登木素生物碱(Maytansinoid)与细胞结合剂例如DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9或曲妥单抗(trastuzumab)抗体相连接,美登木素生物碱(Maytansinoid)包含连接部分。该连接部分含有化学键从而在特定位置释放完全活性的美登木素生物碱(Maytansinoid)。合适的化学键已为本技术领域的人们所熟知,并且包括二硫键、酸解键、光解键、肽酶解键以及酯酶解键。优选为二硫键。
连接部分还包含反应活性化学基团。在优选的实施方式中,反应活性化学基团可以通过二硫键连接部分与美登木素生物碱(Maytansinoid)共价结合。
反应活性化学基团特别优选为N-琥珀酰亚胺酯和N-硫代琥珀酰亚胺酯。
特别优选的美登木素生物碱(Maytansinoid)包含的连接部分所含有的反应活性化学基团为美登木素生物碱(Maytansinol)的C-3酯及其类似物,其中连接部分包含二硫键并且化学反应活性基团包含N-琥珀酰亚胺酯和N-硫代琥珀酰亚胺酯。
美登木素生物碱(Maytansinoid)的很多位置都可以作为化学连接该连接部分的位置。例 如,具有羟基的C-3位置、被羟甲基修饰的C-14位置、被羟基修饰的C-15位置,以及具有羟基的C-20位置都可以使用。然而优选为C-3位置,并且特别优选为美登木素生物碱(Maytansinol)的C-3位置。
具有反应活性基团的二硫部分的美登木素生物碱(Maytansinoid)和美登木素生物碱(Maytansinoid)衍生物的合成如美国专利No.6,441,163和6,333,410以及美国专利申请No.10/161,651所述,其中全部内容引入本文以作参考。
含有反应活性基团的美登木素生物碱(Maytansinoid)例如DM1与抗体例如DS6、huN901、huC242、huCD33、MY9、或曲妥单抗(trastuzumab)抗体反应以制备细胞毒素结合体。这些结合体可以通过HPLC或凝胶过滤进行纯化。
2003年3月20日公布的美国专利No.6,716,821、6,441,163和6,333,410以及美国专利申请No.2003/0055226公开了几种出色的制备该抗体一美登木素生物碱(Maytansinoid)结合体的方案,其中全部内容引入本文以作参考。
通常,在缓冲水溶液中的抗体溶液可以用过量摩尔的具有带反应活性基团的二硫部分的美登木素生物碱(Maytansinoid)进行培养。反应混合物可以通过加入过量的胺(例如乙醇胺、牛磺酸等)而停止反应。然后可以通过凝胶过滤对美登木素生物碱(Maytansinoid)-抗体结合体进行纯化。
每个抗体分子结合的美登木素生物碱(Maytansinoid)分子的数量可以通过分光光度法测定252nm和280nm处的吸收率而测得。美登木素生物碱(Maytansinoid)分子/抗体分子优选平均为1~10。
可以对抗体与美登木素生物碱(Maytansinoid)药物的结合体在体外抑制各种有害细胞系的增生能力进行评估。例如,细胞系例如人体表皮癌细胞系A-431、人体小细胞肺癌细胞系SW2、人体乳腺肿瘤细胞系SKBR3和Burkitt淋巴瘤细胞系Namalwa可以简单地被用于评估这些化合物的细胞毒性。待评估的细胞可以暴露于该化合物24小时并且通过已知的方法直接化验测得存活的细胞碎片。然后由化验结果可以算出IC50值。
紫杉烷类(Taxane)
根据本发明的细胞毒素结合体中使用的细胞毒素剂也可以是紫杉烷类(taxane或其衍生物。
紫杉烷类(Taxane)为一个系列的化合物,包括paclitaxel(紫杉醇)(一种天然细胞毒素)以及多西他赛(docetaxel)(泰索帝(Taxotere))(一种半合成的衍生物),这两种化合物被广 泛用于治疗癌症。紫杉烷类(Taxane)是有丝分裂纺锤体毒素,可以抑制微管蛋白的解聚,从而造成细胞死亡。虽然多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel)是治疗癌症的有效的药物,但其抗肿瘤活性仍然有限,因为其对于普通细胞具有非特定的细胞毒性。此外,类似于多西他赛(paclitaxel)和紫杉醇(docetaxel)本身的化合物对于用于细胞结合剂的结合体也不具有充分的药效。
优选的用于制备细胞毒素结合体的紫杉烷类(taxane)为如下列结构式(XI)所示的紫杉烷类(taxane):
合成可以用于本发明的细胞毒素结合体的紫杉烷类(taxane)的方法,连同使该紫杉烷类((taxane)与细胞结合剂(例如抗体)连结的方法,在美国专利No.5,416,064、5,475,092、6,340,701、6,372,738、6,436,931、6,716,821和6,596,757、以及美国专利公开No.2003/0014048(2003年1月16日发布)和美国专利公开No.2004/0024049(2004年2月5日发布)中详述。
CC-1065类似物
根据本发明的细胞毒素结合体中使用的细胞毒素剂也可以是CC-1065及其衍生物。
CC-1065是一种分离自链霉菌zelensis培养液群落的有效的抗肿瘤抗生素。CC-1065在体外的效力大约比常用抗癌药物例如阿霉素、氨甲蝶呤和长春新碱的强1000倍(B.K.Bhuyan等人,Cancer Res.,42,3532-3537(1982))。CC-1065及其类似物如美国专利No.6,372,738、6,340,701、5,846,545和5,585,499所述。
CC-1065的细胞毒性与其烷基化活性以及其DNA-结合或DNA-插入活性有关。这两种活性位于分子不同的部分。因此,烷基化活性被包含在环丙基吡咯吲哚(CPI)亚单元中,并且DNA-结合活性位于两个吡咯吲哚亚单元中。
虽然CC-1065作为细胞毒素剂具有一定的吸引人的特性,但其在治疗应用中尚有局限。将CC-1065以12.5μg/kg的单次静脉剂量给药于小鼠,50天后会造成迟发的肝中毒导致死亡{V.L Reynolds等人,J.Antibiotics,XXIX,319-334(1986)}。因此需要开发出不会造成迟发中毒的类似物,并且基于CC-1065的更简单的类似物的合成如文献所述{M..A.Warpehoski等人,J.Med.Chem.,31,590-603(1988)}。
在另一个系列的类似物中,CPI部分被替换为环丙苯并吲哚(CBI)部分{D.L.Boger等人,J.Org.Chem.,55,5823-5833,(1990)、D.L Boger等人,BioOrg.Med.Chem.Lett.,1,115-120,(1991)}。这些化合物保留了本药物的体外的高效力,而不会造成小鼠迟发中毒。与CC-1065类似,这些化合物为烷基化药剂,以共价的方式与DNA的双螺旋小沟(minor groove)连结并造成细胞死亡。然而,对最有前途的类似物Adozelesin和Carzelesin的临床评估的结果令人失望{B.F.Forster等人,Investigational New Drugs,13,321-326(1996);I.Wolff等人,Clin.Cancer Res.,2,1717-1723(1996)}。这些药物由于具有较高的系统性毒性而显示出较差的疗效。
通过将其定向传送至肿瘤位置而改变其在体内的分布,从而使其对非目标组织具有较低的毒性,因此具有较低的系统性毒性,从而可以极大地提高CC-1065类似物的疗效。为了实现这一目标,CC-1065的类似物和衍生物与特定指向肿瘤细胞的细胞结合剂的结合体如文献所述{美国专利5,475,092;5,585,499;5,846,545}。这些结合体在体外特征性地显示出高的目标特定细胞毒性,以及对于小鼠中的人体肿瘤异种移植具有优异的抗癌活性{R.V.J.Chari等人,Cancer Res.,55,4079-4084(1995)}。
合成可以被用于本发明的细胞毒素结合体的CC-1065类似物的方法,以及将类似物与细胞结合剂(例如抗体)连结的方法,详细如美国专利No.5,475,092、5,846,545、5,585,499、6,534,660、6,586,618和6,756,397以及2003年10月16日公布的美国专利公开No.2003/0195365所述。
其他药物
其他药物例如氨甲蝶呤、柔毛霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、瘤可宁、加利车霉素(calicheamicin)、妥布力辛(tubulysin)以及妥布力辛(tubulysin)类似物、倍癌霉素(duocarmycin)以及倍癌霉素(duocarmycin)类似物、多拉司他汀(dolastatin)以及多拉司他汀(dolastatin)类似物也适用于制备本发明的结合体。通过中间载体分子例如血清白蛋白可以将这些药物分子与抗体分子连接。如美国专利No.6,630,579所述的阿霉素和柔毛霉素化合物也可以用于细胞毒素剂。
使用的组合物和使用的方法
本发明提供了一种药物组合物,包含有效含量的任何本发明的药物-细胞-结合剂、药物中可用的其盐或溶剂、以及药物中可用的载体、稀释液或赋形剂。
本发明还提供了一种治疗方法,包含根据治疗需要服用有效量的任何上述结合体。
同样,本发明提供了一种造成在异质或混合细胞群体中的细胞死亡的方法,包含使目标细胞或含有目标细胞的组织与有效量的包含任何本发明的药物-细胞-结合剂(例如美登木素生物碱(Maytansinoid)、紫杉烷类(taxane)或CC-1065-细胞-结合剂)、其盐或溶剂的细胞毒素剂接触。目标细胞为由于其表达了独特的由这些细胞所表达的抗原而可以被细胞-结合剂结合的细胞。在目标细胞中细胞毒素药物从结合体上断裂以释放药物并且杀死缺乏在目标细胞中表达的抗原的细胞。
本发明还可以杀死异质或混合细胞群体,其中配体最初在特定细胞或组织上表达,然后流入介质。这里的流出的配体是细胞结合剂的目标,并且药物杀死在流出的抗原附近的肿瘤细胞的异质或混合群体。
如果需要的话,其他活性药剂例如其他抗肿瘤药剂也可以与结合体一起使用。
合适的药物中可用的载体、稀释液和赋形剂已经被人们所熟知,并且可以由本领域中的熟练人员确定以作为其临床条件的保证。
合适的载体、稀释液和/或赋形剂包括:(1)Dulbecco氏磷酸盐缓冲的盐,pH大约为7.4,含有或不含大约1mg/ml~25mg/ml人体血清蛋白;(2)0.9%盐水(0.9%w/v的NaCl);以及(3)5%(w/v)葡萄糖;并且还可以含有抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween 20。用于造成选定细胞群体中的细胞死亡的方法可以在体外或体内进行试验。在体外使用的例子如本申请书的实施例部分中所述。
对于体内临床的使用,以经测试为无菌并且为内毒素等级的溶液或冻干的粉末的方式提供本发明的细胞毒素剂。结合体使用的适当规范的例子如下。结合体作为静脉给药每周供给一次持续4周。药物剂量为50~1000ml生理盐水,并且可以加入5~10ml的人类血清蛋白。每次静脉给药的剂量为10μg~2000mg(范围为100ng~20mg/kg每天)。治疗4周以后,患者可以继续接受一周的基础治疗。特定的临床规范,如关于给药的方法、赋形剂、稀释液、剂量、时间等,可以由本领域中的熟练人员确定以作为其临床条件的保证。
可根据在选定细胞群体中导致细胞死亡的体内或体外的方法进行治疗的医药条件的实施例包括任何种类的恶性肿瘤(例如肺、乳腺、结肠、前列腺、肾、胰腺、卵巢等癌症)或任 何种类的包括异质或混合非正常细胞群体的肿瘤生长,。
上文以及下文中的实施例中引用的所有文献都以全文集中描述于此以作参考。
实施例
参考下列实施例可以更好的理解本发明的主要领域,但本发明并不限于此。
实施例1:抗体-药物连结合体的旁侧效应
材料和方法
免疫结合体
制备免疫结合体:由如先前所述的微生物发酵产物安丝菌素P-3合成美登木素生物碱(maytansinoid)DM1(N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素){Chari,R.V.等人,Cancer Res.,52,127-31(1992);美国专利No.6,333,410}。CC-1065类似物、5-[(3-巯基-1-氧丙基)氨基]-二-吲哚基-(seco)-1,2,2,9a-四氢环丙[c]苯[e]吲哚-4-酮、DC1的合成如别处所述{Chari,R.V.等人,Cancer Res.55,4079-84(1995)}。通过如上所述的表面重整法对C242抗体(huC242)进行人源化{Roguska M.A.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91,969-73(1994)}。使用N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯得到二硫键或使用N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)得到硫醚键而制备抗体-药物结合体,如别处所述{Liu C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,8618-23(1996);Chari R.V.等人,Cancer Res.,52,127-31(1992)}。本研究使用的免疫结合体平均每个抗体分子含有3.5个细胞毒素药物分子DM1或DC1。
细胞系
将COLO205(人体结肠腺癌,ATCC CCL-222)、HL-60(人体急性前髓细胞白血病,ATCCCCL-240)和Namalwa(人体Burkitt氏淋巴瘤,ATCC CRL-1432)培养群落保持在RPMI-1640介质中并补充了10%热-失活胎儿牛血清以及50μg/mL庆大霉素硫酸盐。将HT-29(人体结肠腺癌,ATCC HTB-38)、A375(人体恶性黑素瘤,ATCC CRL-1619)以及HepG2(人体肝细胞癌,ATCC HB-8065)培养群落保持在DMEM介质中并补充了10%热-失活胎儿牛血清以及50μg/mL庆大霉素硫酸盐。将SNU-16(胃癌,ATCC CRL-5974)培养群落保持在修饰的RPMI-1640介质(ATCC,30-2003)中并补充了10%热-失活胎儿牛血清以及50μg/mL庆大霉素硫酸盐。将所有细胞系在37℃以及6%CO2的条件下在潮湿的培养器皿中培养。 将huC242抗体与CanAg结合利用流式细胞计通过间接免疫荧光测试法评估huC242抗体与CanAg-阳性细胞之间的结合。将细胞(每个井5×104个)置入圆底96-井底板并且使用在0.2mL的补充了2%(v/v)的普通山羊血清(Sigma)的α-MEM介质中连续稀释的huC242抗体在4℃下培养3小时。每个样品测试三次。对照井不含huC242。然后将细胞用0.2mL的冷(4℃)介质清洗,并且在4℃下用荧光标记山羊anti-人体IgG抗体染色1小时。然后用介质再次清洗细胞,固定在1%甲醛/PBS溶液中并使用FACSCaliburTM流式细胞计(BDBiosciences,San Jose,CA)进行分析。
3D胶原细胞毒性测试
用huC242-DM1(1×10-8M的结合抗体,在37℃以及6%CO2的条件下培养24小时)、1%的甲醛(培养20min)、或5Gy UV照射(UV Stratalinker 1800,Stratagene,CA)处理COLO205细胞(每mL含2×105个细胞)。用20~30mL的新鲜培养介质清洗处理后的细胞三次,并且以每mL含有1×108个细胞的密度重新悬浮于培养介质。将未处理的COLO205、Namalwa、A375和HepG2细胞以相同的方式进行清洗和重新悬浮。然后将一微升的各个未处理的细胞悬浮液与0、1、2、4或8μL的处理过的COLO205细胞混合。向细胞混合物中加入100微升的冰冷胶原凝胶溶液(3D胶原细胞群落系统,Chemicon International),然后将细胞-胶原混合物立即分配入圆底96井底板(每个井5μL)。将底板在37℃下培养1小时以使胶原聚合。然后向各个井中缓慢加入新鲜的培养介质(200μL)。5~6天后,使用比色细胞增殖测试法测定MTT四钠盐(1-(4,5-二甲基噻唑2-基)-3,5-二苯甲(系为汉字(月+替)(formazan),Sigma)被活体细胞还原的甲(系为汉字(月+替)(formazan)),从而检测出存活细胞的数量。向各个井中加入50微升的MTT储存溶液(在磷酸盐缓冲盐水中为5mg/mL)。将底板在37℃下培养3小时,然后以860xg离心分离10分钟。将培养介质从各个井中吸出,使用二甲亚砜(每个井100μL)溶解甲(系为汉字(月+替)(formazan))晶体,并且测定OD540nm 。通过校正介质的背景读出,可以计算出各个井中的相对细胞数量(细胞存活率),然后将各个数值除以对照井(未处理细胞)中的数值的平均值。
液体培养群落细胞毒性测试
将在适当介质中的免疫结合体的稀释液加入含有2×103个COLO205细胞、或2×103个SNU-16细胞、或2×103个Namalwa细胞、或2×103个COLO205细胞与2×103个Namalwa 细胞的混合物、或2×103个SNU-16细胞与2×103个Namalwa细胞的混合物的圆底96井底板的井中。将底板在37℃以及6%CO2下培养五天。使用Nikon Diaphot 300反置显微镜对各个井中的细胞进行拍照。
ELISA测试huC242-DM1、huC242-SMCC-DM1、以及结合体释放的美登木素生物碱(maytansinoid)药物的量
该方法如先前所述{Xie H.等人,J.Pharmacol Exp.Ther.,308,1073-82(2004)}。简要地说,为了测定huC242-DM1的浓度,标准样品或测试样品的结合体被置入涂布了小鼠anti-美登木素生物碱(maytansinoid)单克隆抗体(ImmunoGen)的ELISA底板,并且使用辣根过氧化物酶标记的驴子anti-人体IgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)进行检测。为了检测结合体释放的美登木素生物碱(maytansinoid)药物的浓度,通过加入5体积的冰冷丙酮使样品中的蛋白质沉淀。通过16,000xg的离心分离使沉淀的蛋白质沉积,并且使用如下的竞争ELISA测定上层清液中的释放的药物的浓度。将底板涂布已与牛血清蛋白结合的DM-1(BSA-DM1,ImmunoGen)。将稀释的美登素标准溶液的样品和测试样品与生物素酰化(biotinylated)小鼠anti-美登木素生物碱(maytansinoid)单克隆抗体(ImmunoGen)混合,然后在涂布了BSA-DM1的底板上进行培养。最后,使用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(Jackson ImmunoResearch)检测结合的生物素酰化(biotinylated)anti-美登木素生物碱(maytansinoid)抗体。
小鼠中的人体异种移植肿瘤模型
由Taconic(Germantown,NY)获得5周大的雌性CB-17患有重度联合免疫缺陷综合征(SCID)的小鼠。一周后。对小鼠皮下植入下列细胞系中的一种:HT-29(每只小鼠2×106 个细胞)、COLO205(1×107)、Namalwa(2×106)、或COLO205和Namalwa细胞的混合物(每只小鼠分别1×107和2×106个细胞)。9~13天后,每只小鼠每日接受含有25、75或150μg/kg的结合的DM1的PBS(对照)、huC242-SMCC-DM1或huC242-DM1的静脉丸剂注射,连续5天(qd×5)。每周测定两次肿瘤直径,并且以1/2(L×W×H)计算体积,其中L为肿瘤的长度,W为宽度,并且H为高度。
免疫组织化学
肿瘤组织被固定在10%的福尔马林并且埋置在石蜡中。使用小鼠C242抗体进行石蜡切 片的免疫组织化学测试以检测COLO205细胞,并且使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶(ABC)技术由小鼠anti-CD38抗体(RDI-CD38abm-290,Research Diagnostic,Flanders,NJ)进行石蜡切片的免疫组织化学测试以检测Namalwa细胞。
结论:
在体外huC242-DM1杀死其目标细胞附近的非目标细胞
免疫结合体cantuzumab美登素或huC242-DM1能够有效根除表达CanAg的小鼠中异种移植的人体肿瘤,包括那些以异种方式表达抗原的细胞{Liu C.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,93,8618-23(1996)},但对于CanAg阴性的异种移植肿瘤无效。为了检测与CanAg-阳性的细胞关联的huC242-DM1结合体是否具有杀死邻近的非目标细胞的能力,在体外使用在3D胶原基质中的抗原-阳性和抗原-阴性混合细胞群落对其表现进行了研究。细胞可以模拟体内的肿瘤环境以较高的密度埋置在基质中。
在第一个系列的试验中,使用了处理过的和未处理的抗原-阳性COLO205细胞(图2)。一组细胞使用huC242-DM1在培养介质中在37℃下培养16小时。通过大量清洗除去未结合的结合体,并且使更多数量的处理过的细胞与未处理的细胞样品混合,处理过与未处理过细胞的比例分别为0∶1(对照)、1∶1、4∶1、以及8∶1。然后将细胞混合物置埋入胶原中,培养5天,并且在MTT测试中检测各个样品中存活细胞的数量。在另一对照群落中,使用由甲醛处理或UV光处理过的COLO205细胞代替由免疫结合体处理过的COLO205细胞。结果如图3A所示。在含有数量增大的结合体处理过的细胞的培养群落中,存活的细胞分数逐渐减少(图3A,黑色条柱)。因此在混合群落中未处理过的细胞被杀死。这种被杀死依赖于结合体,而不是由于任何在未处理过的细胞群体中的濒死的COLO205细胞的抑制效果,这是由于被甲醛处理或UV照射而被杀死的COLO205细胞没有明显影响到未处理过细胞的增殖(图3A,分别为灰色和白色条柱)。
在第二个系列的试验中,如上所述用huC242-DM1处理的COLO205细胞与抗原-阴性细胞系以1∶1混合,包埋置入胶原中,培养5天,然后在MTT测试中检测细胞增长。抗原-阴性细胞系来自不同源头:Burkitt氏淋巴瘤(Namalwa)、黑素瘤(A375)、以及肝癌(HepG2)。如图3B所示,huC242-DM1处理过的细胞抑制了所有共同培养的抗原-阴性细胞系的增长。Namalwa细胞对于由结合体预处理过的COLO205细胞产生的细胞毒素效果最为敏感,表现为存活分数减少到小于0.2,HepG2细胞的敏感度最低,存活分数为大约0.7,并且A375和COLO205细胞表现出中等程度的敏感度。
接下来检测目标细胞-非目标细胞的从属性杀死是否也会在液态细胞培养群落中发生。以抗原-阴性的非粘合的Namlwa细胞作为混合群落中的指示细胞,并且以半粘合的COLO205细胞作为目标细胞。将两种细胞一起置于圆底96井底板中。几小时后所有的细胞一起沉降在非常接近于井的中间。试验包括的井在0.2mL的含有1nM的huC242-DM1的液体培养介质中单独含有2×103个Namalwa细胞、单独含有2×103个COLO205细胞、以及含有两种细胞系各2×103个细胞的混合物。在37℃下培养5天后,拍摄细胞群体的照片(图3C)。在不具有结合体的情况下(图3C,左栏),通过细胞计数测得在所有井中的细胞数量都增长了大约20倍。对混合细胞群体还用流式细胞计测试并证实了Namalwa和COLO205细胞都发生了增殖。Alexa标记的huC242用于染色CanAg-阳性COLO205细胞,同时B细胞-特定Alexa标记的anti-CD19抗体被用于检测Namalwa细胞。该分析表明经过5天的增殖后,不含连结体的混合细胞群落由40%的COLO205细胞和60%的Namalwa细胞组成,证明两种细胞类型具有类似的增殖率。根据预期,huC242-DM1杀死了在含有CanAg-阳性COLO205细胞的井中的大多数细胞(图3C,顶栏),并且对于在含有抗原-阴性Namalwa细胞的井中的细胞的生长没有明显的影响(图3C,中栏)。在具有混合细胞群体的井中,结合体同时杀死了COLO205和Namalwa细胞(图3C,底栏)。因此,huC242-DM1处理过的COLO205细胞在液体培养群落中也能够根除邻近的抗原-阴性细胞,与在3D胶原细胞培养群落中一样。
为了测试除了COLO205以外的目标细胞系是否能够表现出这种对于邻近细胞的细胞毒性效果,使用另一种CanAg-阳性细胞系胃癌SNU-16进行类似的试验(图2)。如图3D所示,huC242-DM1(1nM)杀死了SNU-16细胞,没有影响到Namalwa细胞的增殖,并且杀死了Namalwa/SNU-16混合细胞群体。综合起来看,这些试验证明在体外huC242-DM1旁侧效应并不限于特定类型的CanAg-阳性目标细胞,也不限于特定类型的CanAg-阴性邻近的细胞。免疫结合体的旁侧效应受抗体-药物连接剂的类型影响
huC242-DM1包含通过含有二硫的连接剂与huC242抗体结合的DM1分子。该连接剂在体外在细胞游离的环境中易被硫醇还原,因此可能被许多细胞-缔合硫醇分裂。为了测试连接剂中存在的二硫键对于产生旁侧效应是否是不可缺的,合成了其中DM1与抗体通过不能还原的硫醚键相连接的结合体huC242-SMCC-DM1(图1),并且测试了其对于COLO205细胞、Namalwa细胞、以及COLO205/Namalwa混合细胞群体的体外的细胞毒性。huC242-SMCC-DM1对于杀死COLO205目标细胞具有与huC242-DM1相同的效力,其IC50 值为4×10-11M(数据未显示)。该细胞毒性为CanAg-选择性,这是由于在整个测试的浓度 范围内(直到1×10-9M),没有一个结合体对于抗原-阴性Namalwa细胞具有细胞毒性。与huC242-DM1不同,在3D胶原基质测试或液体培养群落测试中,huC242-SMCC-DM1对于邻近的细胞即便有也都只显示出少量的毒性(分别为图3B和3C),表明huC242-DM1的旁侧效应的机理包括二硫键断裂的步骤。
旁侧效应不限于抗体-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体
为了检测旁侧效应是否是抗体-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体特有的属性,还检测了huC242和DC1的结合体。DC1为双螺旋小沟(minor groove)-结合DNA烷基化CC-1065的类似物,与DM1的差别在于其结构(图1)和作用机理。有效的抗原-DC1与anti-CD19抗体、以及anti-CD56抗体的选择性结合体在文献中已经有所报道{Chari R.V.等人,Cancer Res.55,4079-84(1995)}。类似的结合体由DC1与huC242构成,如图1所示,其中药物和抗体通过含有二硫的连接剂(huC242-DC1)结合或通过含有硫醚的连接剂(huC242-SMCC-DC1)结合,并且测试了其在体外杀死抗原-阳性和邻近细胞的能力。在2×10-10M~2×10-9M的浓度之间,两种结合体都能杀死大多数抗原-阳性COLO205群落中的细胞(图3C,顶栏显示了浓度为1×10-9M的结果),但都不能杀死抗原-阴性Namalwa群落中的细胞(图3C,中栏),证明其细胞毒性具有抗原-依赖型。当测试目标/非目标细胞混合群落时,huC242-DC1可以杀死大多数的两种细胞,而huC242-SMCC-DC1不行(图3,底栏)。这些试验表明,杀死邻近细胞的能力不是DM1连结体所独有的性质,而是还适用于其他由含有二硫的键连接的抗体-药物结合体。
huC242-DM1的旁侧效应是通过由目标细胞处理连结体并且将细胞毒性的美登木素生物碱(maytansinoid)释放入介质而产生的
为了定义旁侧效应的机理,测定了用huC242-DM1处理的CanAg-表达的细胞是否会将细胞毒性化合物释放入介质,然后扩散至邻近的细胞。将目标COLO205或抗原-阴性的Namalwa细胞用huC242-DM1或huC242-SMCC-DM1(10-7M)在37℃下培养0、6、24或48小时。通过离心分离从介质中除去细胞,并且使用两种不同的ELISA方法测定上层清液中是否存在huC242-DM1以及游离的美登木素生物碱(maytansinoid)(参见材料和方法(Materials andMethods)。结果如图4A~C所示。用目标细胞培养48小时后,两种结合体在上层清液中的浓度下降了大约3倍,并且同时游离的美登木素生物碱(maytansinoid)的浓度增加了大约4倍(图4A、C)。类似的huC242-DM1与CanAg-阴性的Namalwa细胞的培养没有导致结合 体消失或在介质中出现游离的美登木素生物碱(maytansinoid)(图4B),这表明与细胞表面抗原结合对于处理这些结合体以及释放美登木素生物碱(maytansinoid)的药物进入介质是必要的。
然后通过将CanAg-阴性Namalwa细胞暴露于含有结合体的具有COLO205细胞的介质以测定释放的美登木素生物碱(maytansinoid)药物的细胞毒性的活性。含有huC242-DM1的介质的非特定的细胞毒性在48小时内逐渐增加了约10倍,通过由最初的IC50值为2×10-8M(混合后立刻取样的上层清液,没有经过培养)分别变为24小时培养后的3×10-9M和48小时培养后的1.7×10-9M可以证明(图4D)。相反,当条件为存在Namalwa细胞时,没有检测出含有huC242-DM1的介质的细胞毒性增大(图4E)。如图4A所示,含有结合体的COLO205-条件介质的细胞毒性的增大对应于游离的美登木素生物碱(maytansinoid)的浓度的增大。这些数据表明其中结合体与抗原-表达细胞结合的huC242-DM1的旁侧效应细胞毒性的机理为,随着结合体的细胞媒介过程,逐渐释放的细胞毒性美登木素生物碱(maytansinoid)物种能够杀死邻近的细胞。
huC242-SMCC-DM1与COLO205细胞的培养只造成培养介质的非特定的细胞毒性适度地增长了2倍(图4F)。由于由二硫连接的结合体和由硫醚连接的结合体都被COLO205细胞所处理并且向介质中释放数量相当的游离的细胞毒性美登木素生物碱(maytansinoid)物种(图4A和4C),由huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1形成截然不同的代谢物。如下所述,代谢物的化学结构已经被鉴定,并且确认了一些huC242-DM1处理的产物比huC242-SMCC-DM1的代谢物的效力大100~10,000倍。
huC242-DM1在人体异种移植肿瘤模型中的旁侧效应
与体外混合细胞培养群落系统相类似,研制出了由CanAg表达的COLO205细胞和CanAg-阴性的Namalwa细胞组成的混合异种移植肿瘤模型。将COLO205和Namalwa细胞的混合物皮下注射入SCID小鼠(每个小鼠总计1.2×107个细胞)。每个动物(总共23只小鼠)培养一种可以检测的肿瘤,并且细胞植入9天后,平均肿瘤体积近似达到100mm3。将两个9天大的肿瘤从试验动物身上取下,并且通过分别用小鼠C242抗体和小鼠anti-CD38抗体对组织进行免疫组织化学染色,从而分析COLO205细胞(CanAg+/CD38-)和Namalwa细胞(CD38+/CanAg-)的存在与否。COLO205细胞的标记(图5Aa)和Namalwa细胞的标记(图5Ab)染色区域近似为相同的尺寸,确定了肿瘤的混合特性。绝大多数的COLO205细胞和Namalwa细胞能够存活,具有极少的坏死。对具有尺寸为大约100mm3的混合肿瘤的小鼠组 进行5次PBS(对照组)、huC242-SMCC-DM1或huC242-DM1的静脉注射,连续5天(qd×5),每日剂量的结合体含有150μg/kg的连接的DM1。最后一次注射后的一天,每组各取出并杀死两只小鼠并通过免疫组织化学进行分析,如上所述。在PBS处理的对照组,其肿瘤切片看起来类似于未处理的肿瘤(对比图5Ac和5Aa,5Ad和5Ab),具有类似大小区域的COLO205和Namalwa组织,都只显示了最小程度的坏死。由huC242-SMCC-DM1处理的肿瘤切片显示了严重坏死的COLO205的组织(50~60%的坏死,图5Ae)和健康的Namalwa组织(图5Af)。最后,由huC242-DM1处理的肿瘤切片在COLO205和Namalwa组织上都显示了很高程度的坏死(70~80%)(图5Ag和5Ah)。这些体内数据反映了使用混合细胞群体的体外的结果。含有非二硫连接剂的结合体的活性限于表达目标抗原的细胞,而含有二硫连接剂的结合体可以同时杀死相同肿瘤中的目标和非目标肿瘤细胞。
这些免疫组织化学的结果与huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1对于肿瘤生长的效果是一致的。处理任意一个结合体对于CanAg-阳性COLO205肿瘤具有相同的效果(图5Ba):5只中有4只小鼠的肿瘤完全消退,并且直到90天没有复发,当试验结束时,在各个组中一只小鼠复发导致肿瘤生长延迟28天。没有一个结合体对于非目标的Namalwa肿瘤具有活性:huC242-SMCC-DM1处理没有延迟肿瘤生长,而huC242-DM1的作用只对肿瘤生长适度延迟7天(图5Bb),证明抗肿瘤活性是CanAg选择性的。两种结合体对于混合COLO205-Namalwa肿瘤的抗肿瘤活性有显著的差别。huC242-SMCC-DM1没有延迟混合肿瘤的生长,而huC242-DM1造成在两周内肿瘤完全消退。(图5Bc),并且5只中有4只小鼠保持了没有肿瘤直到试验结束(150天,也就是说大约为34个肿瘤倍增时间)。该组中唯一复发的肿瘤的免疫组织化学分析表明该肿瘤完全由Namalwa细胞组成(数据未显示)。结论是只有具有二硫连接剂的结合体具有在体内杀死邻近细胞的能力。
对于在SCID小鼠中的HT-29人体结肠癌异种移植模型中的huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1在体内的旁侧效应也进行了测定。HT-29肿瘤是特殊种类的“混合”肿瘤的例子,由单细胞系自发产生,具有异种抗原表达。HT-29细胞只在体外少量细胞(20~40%)上(图2)或在异种移植肿瘤中表达了huC242抗体目标CanAg{Liu C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.;93,8618-23(1996)}。使用huC242-DM1和huC242-SMCC-DM1以不同的剂量(25μg/kg、75μg/kg或100μg/kg的连接的DM1,qd×5)处理具有植入的(大约130mm3)的HT-29肿瘤的小鼠,并且监视肿瘤生长。二硫连结的结合体huC242-DM1在各个剂量都造成显著的肿瘤生长延迟(5~25天,随剂量变化,图6A),而huC242-SMCC-DM1结合体只有边际的抗肿瘤效果(2.5~3.5天的生长延迟,图6B)。综合考虑,这些数据证明 含有非二硫连接剂的huC242-SMCC-DM1结合体只对其中所有增殖的细胞都表达目标抗原的肿瘤具有效果。相反,含有二硫的结合体的旁侧效应使该连结体对于其中只有一部分细胞表达CanAg目标的肿瘤也有效果。
实施例2:抗体-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体的细胞内活化缩写
BafA1:巴弗洛霉素A1
BSA:牛血清蛋白
FACS:荧光活性细胞分类器
HPLC:高压液相色谱
MTT:1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基甲(系为汉字(月+替)(formazan))
NEM:N-乙基马来酰亚胺
SPDB:N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯
SMCC:N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯
DM1:N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素
DM4:N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素
DM1-SMe:N2’-脱乙酰基-N2’-[(3-甲基二硫代)-1-氧丙基)]-美登素
DTT:二硫苏糖醇
材料和方法
RPMI1640和谷氨酰胺购自Cambrex Bioscience。Ultima FloTM M闪烁液购自PerkinElmer生命及分析科学。庆大霉素硫酸盐购自Gibco BRL。N-乙基马来酰亚胺(NEM)和所有其他化学品均购自Sigma。所有使用的抗体、huC242、Tras、和huB4都是人源化的IgG1抗体。美登木素生物碱(Maytansinoid)[3H]DM4、D-[3H]DM4、S-甲基-DM4、赖氨酸-Nε -SMCC-DM1、以及赖氨酸-Nε-SPDB-DM4、以及结合体、huC242-SPDB-[3H]DM4、huC242-SMCC-[3H]DM4、Tras-SMCC-[3H]DM4、以及huB4-SPDB-[3H]DM4都是根据文献进行制备的{Chari R.V.等人,Cancer Res.,52,127-131(1992);以及Xie H.等人,J.Pharmacologyand Experimental Therapeutics,308,1073-1082(2004)}。
使用抗体-药物结合体处理COLO205细胞
将悬浮在3mL的培养介质中的COLO205细胞(6×106)在37℃下培养3~30小时,其中的培养介质含有抗体-药物结合体并且结合的抗体的浓度为10-7M。然后通过离心分离(2000xg,5分钟)分离细胞和介质。上层清液(3mL)冷藏在冰中,混合了4mL的冰冷丙酮,然后在-80℃下保持至少1小时或保持到下一步的操作。将细胞悬浮于3mL的HBBS缓冲液并且通过离心分离使其沉淀,然后再次使其悬浮于0.3mL的含有0.5%BSA的TBS中。在这里,如果需要进行烷基化以保护自由的硫醇,则将NEM加至7.5mM,将溶液混合并且置于室温下30分钟。然后将细胞悬浮液与0.6mL的冰冷丙酮混合。将样品置于-80℃下保持至少1小时h或保持到下一步的操作。用丙酮处理的介质样品从-80℃被除去。通过2500xg的离心分离除去沉淀的蛋白质,并且用5%的乙酸将上层清液酸化,并且蒸干。将样品溶解在12mL20%的含有0.025%的TFA的CH3CN水溶液中,取0.1mL进行HPLC分析。
体内研究
如前所述在具有HT-29肿瘤的雌性CB-17 SCID小鼠(Taconic Labs,Germantown,NY)中评估结合体的抗肿瘤活性{Liu C.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.;93,8618-23(1996)}。将结合体静脉注射给6只小鼠组。
细胞循环研究
在药物或结合体处理之前,将指数增长的COLO205细胞以1-2×105细胞/mL的密度重新悬浮。细胞核被碘化丙锭染色,如文献所述{Firpo E.J.等人,Mol Cell Biol,14,4889-901(1994)}。使用FACSCalibur进行DNA含量分析(Becton Dichinson,San Jose,CA)。每个样品采样10,000次,并且对每个样品形成FL2-A柱状图。使用细胞循环分析软件ModFit LT 3.1(Verity Software House,Topsham,ME)测定在不同细胞循环相中细胞的比例。
分析方法
在分析的C-18柱(0.46×25cm)上分离所有的美登木素生物碱(maytansinoid),该柱用20%的含有0.025%的三氟乙酸(TFA)的CH3CN水溶液平衡,并且以2%的CH3CNmin-1的线性剃度以及1mLmin-1的流量展开。将流出液直接引入二极管阵列检测仪,然后根据应用,将其通过Radiomatic150β-计数器(Perkin Elmer),或通过Bruker Daltonice Esquire 3000电子喷雾质谱仪,在Radiomatic150β-计数器中流出液持续与3mL的闪烁混合液(scintillationcocktail)混合,然后其直接流入0.5mL的流动池。取样间隔为6s。如下所述将色谱的峰面 积转化为微微摩尔:通过注入1000cpm~50,000cpm的被含有0.025%的TFA的20%的CH3CN水溶液稀释的[3H]DM4原液(250mCi/mmol),获得色谱的放射峰(mV2)与氚的每分钟计数(cpm)的标准曲线。如上所述将各个样品重复注入HPLC。
结论:
huC242-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体的体外药效和体内活性
首先,使用MTT-基础测试法测定二硫连接的抗体-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体huC242-SPDB-DM4和硫醚连接的结合体huC242-SMCC-DM1对于抗原-阳性COLO205细胞和抗原-阴性Namalwa细胞(两种细胞系都对美登素敏感,IC50值大约为30~60pM)的细胞毒性强度。将细胞暴露于结合体4天后,结合体显示了类似的强度,其对于COLO205细胞的IC50值为40pM,并且对于Namalwa细胞为20~80pM(图7A)。在具有皮下HT-29或COLO205肿瘤(均为CanAg-阳性人体结肠腺癌)的SCID小鼠中测定两种结合体的抗肿瘤活性。单支剂量为50μg/kg(浓度基于结合的DM4)的huC242-SPDB-DM4对于根除HT-29肿瘤的活性强于以150μg/kg/天的剂量连续注射5天的huC242-SMCC-DM1的活性(图7B)。当两种结合体都以150μg/kg/天的剂量在具有COLO205肿瘤的SCID小鼠中连续注射5天时,huC242-SPDB-DM4也显示了比huC242-SMCC-DM1更强的活性(五只小鼠都持续无肿瘤122天对比五只小鼠中的两只持续无肿瘤122天一数据未显示)。这些结果表明当两种结合体在体外都显示出类似的细胞毒性时,其在体内的抗肿瘤功效差别显著。
溶菌酶抑制剂对于由huC242-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体引起的细胞循环停止的效果
在G2/M相中美登木素生物碱(maytansinoid)能够抑制导致细胞循环停止的微管蛋白聚合{Issell B.F.等人,Cancer Treat Rev.,5,199-207(1978)},因此对两种结合体都测定一下其活性。将异步生长细胞的样品在37℃下暴露于结合体(3nM)、或DM1-SMe(10nM,结构见图16)、或另一种微管蛋白聚合抑制剂nocodazole(0.66μM)20小时,然后通过流式细胞计测定细胞的DNA含量。在用nocodazole或DM1-SMe处理的培养群落中,在G2/M相中50%以上的细胞被停止(图7C,第一栏),相比之下未处理过的COLO205细胞只有10%(典型情况为大约60%在G1中并且30%在S中)。在用两种结合体中任一种处理的样品中,在G2/M相中的大于70~80%的细胞被停止,表明美登木素生物碱(maytansinoid)结合体的细胞循环效果与游离的美登木素生物碱(maytansinoid)类似(图7C)。在缺乏目标抗原的细胞中结合 体无法导致细胞循环停止(数据未显示)。
为了测试通过溶菌酶吸收并处理结合体对于其针对癌细胞的活性是否必要,测试了在溶菌酶抑制剂Bafilomycin A1的存在下由结合体造成G2/M抑制。BafA1可以选择性地抑制V-ATPase,其为存在于核内体和溶菌体中的质子泵,会导致这些泡囊中的pH中和{Drose S.等人,J.Exp.Biol.,200,1-8(1997);Bowman E.J.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,7972-76(1988)}。pH中和会堵塞从晚期核内体到溶菌体的传输以及溶菌体的运作,适度影响内在化率和循环率,并且不会抑制核内体和trans-Golgi之间的传输{van Weert A.W.等人,J.Cell.Biol.130,821-34(1995);Oda K.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun,178,369-77(1991);Zetser A.等人,J.Cell Sci.,117,2249-58(2004)}。还发现荧光修饰的huC242的内在化率不受BafA1影响(数据未显示)。单独用BafA1处理COLO205细胞不会显著改变在细胞循环的不同相中的细胞分布(图7C)。然而在BafA1的存在下,由huC242-SMCC-DM1或huC242-SPDB-DM4导致的G2/M抑制几乎完全被消除(在G2/M中为6-9%,图7C)。相反,BafA1处理对由游离的美登木素生物碱(maytansinoid),DM1-SMe导致的G2/M抑制程度有适度的作用(在G2/M中为37-39%,图7C)。当使用另一种以不同机理中和pH的溶菌酶抑制剂氯喹时也可以发现类似的结果{ZetserA.等人,J.Cell Sci.,117,2249-58(2004);HomewoodC.A.等人,Nature,235,50-52(1972)}(图8)。这些发现第一次表明了在huC242-SMCC-DM1和huC242-SPDB-DM4活化中溶菌酶处理的重要性。
由huC242-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体分离美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物
为了检测对于用抗体-美登木素生物碱(maytansinoid)结合体培养目标细胞的效果,我们制备了在C-20甲氧基标记了[3H]的美登木素生物碱(maytansinoid)的结合体(见图16)。放射标记的美登木素生物碱(maytansinoid)结合体huC242-SPDB-[3H]DM4(250mCi/mmol)和huC242-SMCC-[3H]DM1(214mCi/mmol)在体外表现出与非放射标记的结合体样品类似的细胞毒性(数据未显示)。将2×106的COLO205细胞的群落暴露于10-7M的[3H]标记的结合体5、9、以及26小时,分离为细胞和条件介质部分,并且将各个样品用丙酮萃取。如用台盼蓝染色所测得的,在这些条件下处理的细胞至少在前26小时的暴露中仍保持存活并具有完整的质膜(数据未显示)。通过反相位HPLC分析丙酮萃取液的[3H]标记的代谢物。色谱显示了在由硫醚连接的huC242-SMCC-[3H]DM1处理过的细胞获得的丙酮萃取液样品中的放射量的信号(图9A)。由用于本试验的结合体的丙酮萃取液制备对照样,以鉴定在暴露于细胞 之前存在于huC242-SMCC-[3H]DM1样品中的游离的美登木素生物碱(maytansinoid)种类(图9A;g)。在细胞小球的萃取液中在保留时间大约为18.7分钟和19.2分钟分别鉴定出了两个新的部分分开的放射峰。这些代谢物在暴露5小时后可以被检测出,并且在9和26小时增大(图9A;a、c、e)。这些相同的代谢物在培养介质中也能被检测出,但直到9小时的时间点后才出现,然后在26小时的样品中也能检测到。在单独的试验中,分离两种代谢物,并且通过质谱发现是两种赖氨酸-Nε-SMCC-[3H]DM1的异构体(在结合反应中形成的硫醚键的碳原子处为R或S结构;两个峰M+=1103.5;M+Na=1125.5)。
由二硫键连接的huC242-SPDB-[3H]DM4结合体的类似试验的结果也如图9B所示。在用huC242-SPDB-[3H]DM4处理细胞小球5和9小时的色谱中,在20.5、26.5、和27分钟的保留时间观察到三个不同的放射峰(图9B;a、c)。处理26小时的细胞在保留时间为27分钟处获得一个大峰(图9B;e),表示在20.5和26.5分钟洗脱的代谢物被转化为在27分钟洗脱的代谢物,或在细胞中已经不存在了。在26.5分钟处的峰具有与DM4中相同的保留时间。为了进一步研究该代谢物并且检测是否有其他含有自由巯基的代谢物,将暴露了9小时的丙酮萃取液用N-乙基-马来酰亚胺(NEM)处理,然后进行HPLC分析(图2B;g)。进行烷基化后,在5小时和9小时的样品中观察到的在26.5分钟处的峰被替换为一个在25分钟处的新峰。该新峰与标准纯化的DM4-NEM反应产物共洗脱(数据未显示),表明在26.5分钟处的代谢物实际为DM4。
有关处理过的细胞的条件介质的对应色谱如图9B(b、d和f)所示。暴露5小时后无法检测出代谢物,存在的峰在对照组的结合体样品的丙酮萃取液的色谱中也能找到(图9B;h)。然而,9小时的暴露后,在介质中能够检测到一种在5小时后的细胞中也观察到保留时间为20.5分钟的未知的代谢物,并且26小时后出现了两种保留时间为18.5分钟和27分钟的另外的代谢物。可以发现介质中的在18.5分钟处洗脱的唯一的代谢物与DM4和半胱氨酸间的混合二硫化物具有相同的保留时间(S-半胱氨酰-DM4,数据未显示)。RPMI1640介质含有0.21mM的胱氨酸,并且在单独的试验中显示DM4在这种条件下通过硫醇-二硫化物互换反应而迅速反应(t1/2<1小时)以形成S-半胱氨酰-DM4(数据未显示)。因此已知在介质中如果在细胞小球中发现的DM4离开细胞,会形成S-半胱氨酰-DM4二硫化物。为了进一步测试是否任何在介质中的代谢物都是二硫化物,将暴露26小时的细胞上层清液样品等分为两部分,一部分直接进行色谱分析,并且另一部分在进行色谱分析前用DTT和硒醇进行处理以还原所有的二硫键(18)。还原后,色谱中除了在27分钟处洗脱的峰以外其他的放射峰都消失了,并且在26.5分钟的保留时间处出现了一个单独的新峰,即DM4的峰(图10)。因此,在18.5 分钟和20.5分钟处洗脱的代谢物是含有二硫连接的取代基的DM4,但不是在27分钟处洗脱的代谢物。在单独的试验中,发现在20.5和27分钟处洗脱的未知的代谢物分别是质量相同的赖氨酸-Nε-SPDB-DM4(M+Na=1048.4)和S-甲基-DM4(M+Na=816.4/M+K=832.5)。
在上述试验中,在3mL的含有10-7M的结合体的介质中培养了2×106的COLO205细胞。从这大量的结合体中,细胞培养26小时后,小于20%的结合体-结合的美登木素生物碱(maytansinoid)在识别的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物中被回收(图11A;c中的虚线表示20%的程度)。在将huC242-SPDB-[3H]DM4在4℃下与细胞结合后的单独试验中,测得在37℃下22小时内,73%的与COLO205细胞结合的DM4被转化为四种美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物:DM4、S-半胱氨酰-DM4、赖氨酸-Nε-SPDB-DM4和S-甲基-DM4(图12)。这些代谢物被认为代表了在细胞活化过程中形成的大多数(如果不是全部)代谢物。此外,当COLO205细胞与二硫连接的或与SMCC连接的不会与这些细胞的目标抗原结合的美登木素生物碱(maytansinoid)结合体一起培养时,不会观察到这些美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物产生(图13)。
代谢物积聚和细胞循环抑制的动力学
测定由huC242-SMCC-[3H]DM1和huC242-SPDB-[3H]DM4(图9)产生的代谢物的放射性的峰面积,并且如材料和方法中所述将其转化为皮摩尔(pmol)的美登木素生物碱(maytansinoid)。结果如图11A所示,显示了由将结合体加入细胞(T=0)开始的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的积聚与时间的关系。面板(a)显示了在细胞小球和在介质中huC242-SMCC-[3H]DM1的单一的代谢物赖氨酸-Nε-SMCC-DM1的积聚。在培养9小时后在细胞中代谢物的浓度达到了稳定的状态,这可能是由于细胞内结合位饱和。该美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物在介质中开始出现是在9小时,说明带电荷的赖氨酸-Nε -SMCC-DM1有效地穿过质膜流出。图11A(b)显示了在细胞小球和在介质中由huC242-SPDB-[3H]DM4产生的三种稳定的代谢物的积聚。在细胞中二硫化物,赖氨酸-Nε -SPDB-DM4的量在观察的26小时的时间内逐渐减少,这可以推测为通过在细胞内减少的环境中二硫化物断裂为DM4,然后将产生的自由的硫醇、DM4转化为稳定的S-甲基-DM4衍生物。在9小时的培养后在细胞内几乎无法观察到任何DM4,表明可能是由甲基转移酶催化使其迅速被甲基化。代谢物在细胞内的总积聚量在暴露于任何结合体9小时后达到稳定状态,并且在稳定状态的代谢物的程度对于各个结合体几乎都相同(图11A),这表明结合体产生代谢物时具有相同的限速步骤,并且这些代谢物会与相同的细胞内的目标结合。
由于代谢物在细胞内的积聚达到稳定状态大约只要9小时,因此进行了一个试验以检测由结合体导致的G2/M抑制是否会在该时段发生。首先用阿非迪霉素(aphidicolin)处理24小时使COLO205细胞同步,阿非迪霉素(aphidicolin)是一种可逆的DNA复制抑制剂,可以在S相中阻断细胞(Ikagami S.等人,Nature,275,458-460(1978))。由于大多数异步的COLO205细胞群体在G1相中,大多数的阿非迪霉素(aphidicolin)处理的细胞在S相开始时被抑制,从而无法在FACS分析中由G1相进行分辨(图11B,顶图)。然后通过除去阿非迪霉素(aphidicolin)将异步的细胞从抑制中释放出来,然后不做处理,或使用DM1-SMe或各种结合体进行处理。未处理的细胞立刻继续与DNA合成,并且5小时后大多数都在G2/M相中(59%)(图11B),并且经过10小时的有丝分裂后都在G1相中(76%)。相反,用DM1-SMe或各种结合体进行处理的大多数细胞在10小时后和18小时后都在G2/M相中(75~85%),表明当阿非迪霉素(aphidicolin)释放细胞开始有丝分裂时,充足量的活性药物已经在细胞内积聚并且使有丝分裂抑制。因此,COLO205细胞仅需要5小时且不多于10小时以产生足够的活性药物代谢物使细胞循环抑制。这样,由这些结合体造成G2/M相抑制的动力学与药物代谢物在细胞内积聚达到稳定状态所需要的时间有关。
美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物的活性
合成两种主要的代谢物S-甲基-DM4和赖氨酸-Nε-SMCC-DM1,并测试其在体外对于COLO205细胞和Namalwa细胞的毒性。S-甲基-DM4对于上述两种细胞系具有较高的细胞毒性,IC50值为2pM,而赖氨酸-Nε-SMCC-DM1对于两种细胞系的细胞毒性大约小105倍,IC50 值为0.1μM(数据未显示)。这种差异可以解释为化合物之间不同的电荷状态。带电荷的赖氨酸衍生物对于穿透细胞膜的效率非常低,因此需要较高的外部浓度以使细胞内的浓度满足需要的毒性,而中性的亲脂性的S-甲基-DM4化合物对于穿透细胞膜非常有效。
源自不可断裂的结合体的赖氨酸-Nε-SMCC-DM1代谢物的积聚符合源自可断裂的结合体所观察到的有效的S-甲基-DM4、DM4、和赖氨酸-Nε-SPDB-DM4的形成。这表明当细胞内传递时赖氨酸-Nε-SMCC-DM1代谢物的效力与源自可断裂的结合体的代谢物相同,并且当在细胞内产生时所有的美登木素生物碱(maytansinoid)代谢物都具有活性。在溶菌酶抑制剂BafA1的存在下,可断裂和不可断裂的结合体的细胞循环抑制效果都会被消除(图7C)。如果赖氨酸-Nε-SMCC-DM1代谢物和其他源自可断裂结合体的可观察到的代谢物使细胞抑制,则BafA1会防止其形成。为了研究这种可能性,将COLO205细胞在37℃下用10-7M的huC242-SMCC-[3H]DM1或huC242-SPDB-[3H]DM4结合体在存在或不存在300nM的BafA1 的条件下培养22小时。BafA1抑制了由硫醚连接的结合体所形成的赖氨酸-Nε-SMCC-DM1的形成,也抑制了由二硫连接的结合体所形成的S-甲基-DM4的形成(图14A)。此外,在存在BafA1的条件下在由各个结合体处理的细胞的介质中,没有检测到代谢物(数据未显示)。这些结果表明当细胞内传递时赖氨酸代谢物具有毒性,并且对于产生所有上述观察到的代谢物都需要溶菌酶的处理。
总代谢物的释放速率近似恒定为20小时,在9小时后细胞内代谢物的量达到最大时,而少数代谢物在此时刻前亦在介质中被观察到(图11A,c)。这表明代谢物与细胞内目标的结合会影响流出的速率,并且如果细胞毒性下降是由于与细胞内目标的结合亲和力较低,则毒性较小的DM4的衍生物会较早流出。为了探究这一可能,对由效力弱50倍(数据未显示)的DM4的异构体D-[3H]DM4制得的结合体的细胞处理进行了研究。DM4在侧链具有天然的 L-N-甲基-丙氨酰基,而D-DM4具有其D-N-甲基-丙氨酰基的异构体。用DM4的D-异构体制得的huC242结合体对于COLO205细胞的毒性比其对应的L-异构体的结合体弱700倍(数据未显示)。在37℃下将2×106个COLO205细胞的样品以各种时间段暴露于10-7M的huC242-SPDB-D-[3H]DM4结合体,并且以10-7M的huC242-SPDB-[3H]DM4结合体作为对照组,并且用反相HPLC进行分析(图15)。在用huC242-SPDB-D-[3H]DM4处理的细胞中即使是30小时后也几乎没有观察到任何代谢物,而在介质中仅培养5小时后就观察到一个保留时间为22分钟的未知的代谢物,并且在暴露9、22和30小时后稳定增大。通过MS分析,确认了该未知代谢物为赖氨酸-Nε-SPDB-D-DM4(M+Na=1048.5)。
30小时后赖氨酸-Nε-SPDB-D-DM4代谢物的量与30小时后由huC242-SPDB-[3H]DM4处理的对照组细胞的所有代谢物的总量相类似(图14B),表明具有DM4的D和L异构体的两种结合体都以类似的速率内在化并且被转化为其各自的赖氨酸-DM4加合物。由用DM4的 D异构体形成的结合体中没有观察到D-DM4、S-半胱氨酰-D-DM4和S-甲基-D-DM4的明显积聚,这可以解释为赖氨酸-Nε-SPDB-D-DM4的较弱的细胞内结合和较快的流出速度之故。
实施例3
一些硫代甲基美登木素生物碱(maytansinoid)的合成(图17)
N2’-脱乙酰基-N2’-(3-甲基硫代-1-氧丙基)-美登素(S-甲基-DM1,DM1Me):在氩气保护及电磁搅拌下,向N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧丙基)-美登素(DM1,30mg,0.041mmol)的二甲基乙酰胺(0.25mL)溶液中加入碘甲烷(5.8mg,0.041mmol)的二甲基乙酰胺(0.2mL)溶液。然后加入二异丙基乙胺(5.0mg,0.041mmol)并且在搅拌下反应3小时。通过 高压液态色谱使用反相C18柱以及去离子水和乙腈的剃度(gradient)进行纯化并制得20mg(产率为65%)的目标产物DM1Me。质谱:测定值774.5(M+Na+),计算值774.3(M+Na +);1H NMR(CDCl3)δ0.84(3H,s)、1.33(3H,d,J=5Hz)、1.35(3H,d,J=5Hz)、1.60(3H,s)、1.68(3H,s)、2.05(3H,s)、2.22(1H,dd,J=3Hz、14Hz)、2.60-2.82(2H,m)、2.88(3H,s)、3.08-3.20(2H,m)、3.25(3H,s)、3.39(3H,s)、3.55(1H,d,J=9Hz)、3.71(1H,d,J=12Hz)、4.02(3H,s)、4.32(1H,t,J=10Hz)、4.81(1H,dd,J=3Hz、12Hz)、5.45(1H,q,J=7Hz)、5.67(1H,dd,J=9Hz、15Hz)、6.25(1H,s)、6.47(1H,dd,J=11Hz、15Hz)、6.70(1H,d,J=1.5Hz)、6.75(1H,d,J=11Hz)、6.86(1H,d,J=1.5Hz)。
N2’-脱乙酰基-N2’-(4-甲基硫代-4-甲基-1-氧戊基)-美登素(S-甲基-DM4,DM4Me):在氩气保护及电磁搅拌下,向N2’-脱乙酰基-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧戊基)-美登素(DM4,12mg,0.015mmol)的二甲基乙酰胺(0.1mL)溶液中加入碘甲烷(2.2mg,0.015mmol)的二甲基乙酰胺(0.04mL)溶液。然后加入二异丙基乙胺(2.0mg,0.015mmol)并且在搅拌下反应3小时。通过反相高压液态色谱使用C18柱以及去离子水和乙腈的剃度(gradient)分离制得目标产物(7mg,产率为57%)。质谱:测定值816.4(M+Na+),计算值816.3(M+Na+); 1H NMR(CDCl3)δ0.798(3H,s)、1.219(3H,d,J=15.6Hz)、1.294(6H,d,J=6.4Hz)、1.331(3H,d,J=15.6Hz)、1.470(2H,m)、1.639(3H,s)、1.76(3H,s)、1.805-1.966(2H,m)、1.826(1H,dd,J=19.2Hz、7.2Hz)、2.179(1H,dd,J=17.6Hz、11.2Hz)、2.595(2H,m)、2.877(3H,s)、3.035(1H,d,J=10Hz)、3.113(1H,d,J=12.4Hz)、3.234(3H,s)、3.353(3H,s)、3.500(1H,d,J=8.8Hz)、3.634(1H,d,J=12.8Hz)、3.819(1H,d,J=1.6Hz)、3.983(3H,s)、4.273(1H,t)、4.787(1H,dd,J=15.2Hz、8.8Hz)、5.414(1H,q,J=6.8Hz)、5.682(1H,dd,J=24.4Hz、6Hz)、6.214(1H,s)、6.424(1H,dd,J=26.4Hz、4Hz)、6.649(1H,d,J=1.6Hz)、6.731(1H,d,J=11.2Hz)。
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