JPH07236477A

JPH07236477A - 新規糖鎖合成酵素

Info

Publication number: JPH07236477A
Application number: JP6029384A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Tsuji; 崇一辻; Nobuyuki Kurosawa; 信幸黒澤; Toshiro Hamamoto; 敏郎浜本; Eishiyun Ri; 泳春李; Takashi Nakaoka; 隆志中岡; Naoya Kojima; 直也小島
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1994-02-28
Filing date: 1994-02-28
Publication date: 1995-09-12
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: JP3219585B2

Abstract

(57)【要約】【構成】以下の受容体基質特異性：２糖類 Galβ1,3G
alNAc 及び末端に Galβ1,3GalNAc を有する糖脂質また
は糖蛋白を基質とする；および以下の受容体基質選択
性：糖脂質および２糖類の共存下で糖脂質に対して優先
的にシアル酸を取り込ませ、糖脂質の中では Gg4>GM1>G
D1b の順にシアル酸を取り込ませる；により特徴づけら
れる Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素、および
該酵素をコードする Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転
移酵素遺伝子、並びにP-F4M 及びP-F4R の活性に関与す
るポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外
分泌型の蛋白であって Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移を触媒する蛋白および該蛋白の製造方法。【効果】 Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素
は、癌転移抑制、ウイルス感染抑防止、炎症反応抑制、
神経細胞賦活効果を有する薬剤として、あるいは薬剤に
シアル酸を付加することにより生理作用を増加させるた
めの試薬等として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖鎖合成酵素および該酵
素をコードするＤＮＡに関するものである。さらに詳し
くは、本発明はガラクトースβ1,3 N-アセチルガラクト
サミンα 2,3シアル酸転移酵素(Galβ1,3GalNAc α2,3-
シアル酸転移酵素）および該酵素をコードするＤＮＡに
関するものである。本発明のガラクトースβ1,3 N-アセ
チルガラクトサミンα 2,3シアル酸転移酵素は、癌転移
抑制、ウイルス感染抑防止、炎症反応抑制、神経細胞賦
活効果を有する薬剤として、あるいは薬剤にシアル酸を
付加することにより生理作用を増加させるための試薬等
として有用である。

【０００２】

【従来の技術】シアル酸は、例えば細胞−細胞間伝達、
細胞基質相互作用、細胞接着等の重要な生理作用をつか
さどる物質である。発生、分化、及び癌遺伝子のトラン
スホーメーション等の過程において調節をうけた、種々
の異なる細胞表面シアル酸が存在することが知られてい
る。シアル酸は糖蛋白および糖脂質の炭化水素基の末端
位置に存在しており、シアル酸は、翻訳の後の過程で、
酵素的にCMP-Sia からこれらの部位に導入される。例え
ば、糖蛋白には３種の結合様式、すなわち Siaα2,6Ga
l, Siaα2,3Gal, および Siaα2,6GalNAc が共通に存
在しており(Hakomori, S., Ann. Rev. Biochem., 50, 7
33-764, 1981) 、ガングリオシドには高頻度に２種の結
合様式、すなわち Siaα2,3Galおよび Siaα2,8Siaが存
在している(Fishman, P., and Brady, R.O., Science,
194, 906-915, 1976) 。

【０００３】上記の様なシアル酸の酵素的導入（シアル
酸転移）を担う酵素は、シアル酸転移酵素(sialyltrans
ferase) と呼ばるグリコシルトランスフェラーゼ類であ
る。従来既知の全てのシアリルオリゴ糖構造を合成する
ためには、少なくとも12の異なるシアル酸転移酵素が必
要であることが知られている(Broquet, P. et al., In
t. J. Biochem., 23, 385-389, 1991; および Weinstei
n, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 19
87)。これらのうち、５種類のシアル酸転移酵素が精製
されており、いずれの酵素も各受容体基質に対して高い
特異性を示すことが知られている(Sadler, J. et al.,
J. Bio. Chem., 254, 4434-4443, 1979; Weinstein, J.
et al., J. Biol. Chem., 257, 13835-13844, 1982; R
earick, J.et al., J. Biol. Chem., 254, 4444-4451,
1979; および Joqiasse, D.H. eal., J. Biol. Chem.,
260, 4941-4951, 1985)。

【０００４】上記のシアル酸転移酵素をコードするcDNA
については、 Galβ1,4GlcNAc α2,6-シアル酸転移酵素
(Galβ4GlcNAc-α6ST)をコードするcDNAが、肝をはじめ
とする種々の組織からクローニングされている(Weinste
in, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 17735-17743, 1
987; Grundmann U. et al., Nucleic Acids Res. 18,66
7, 1990; Bast, B. et al., J. Cell. Biol., 116, 423
-435, 1992; およびHamamoto, T. et al., Bioorg. Me
d. Chem., 1, 141-145, 1993)。また、Gal β1,3(4)Glc
NAcα2,3-シアル酸転移酵素(Galβ3(4)GlcNAc- α3ST)
をコードするcDNA(Wen, D. X et al., J. Biol. Chem.,
267, 21011-21019, 1992; および Kitagawa, H. et a
l., Biochem. Biophys. Res. Commun. 194, 375)、およ
び Galβ1,3GalNAc/Gal β1,4GlcNAc α2,3-シアル酸転
移酵素をコードするcDNA(Sasaki,K. et al., J. Biol.
Chem., 268, 22782-22787, 1993) もクローニングされ
ている。

【０００５】さらに、 Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素(Galβ3GalNAc-α3ST)をコードするcDNAもクロ
ーニングされている(Gillespie, W. et al., J. Biol.
Chem., 267, 21004-21010, 1992; 特表平5-504678号公
報; および Lee, Y.-C. et al., Eur. J. Biochem, 21
6, 377-385, 1993)。このシアル酸転移酵素（以下、本
明細書において「ST3GalA.1 」という。）は、α2,3-結
合を有する CMP-NeuAcをグリコプロテインのスレオニン
／セリンにO-結合しているガラクトース残基及び糖脂質
の末端ガラクトース残基に転移させる作用を有するもの
であり、糖脂質であるガングリオシドGD1bを受容体基質
として最も高い活性を示すことを特徴としている。しか
しながら、同様な作用を有する他の型の Galβ1,3GalNA
c α2,3-シアル酸転移酵素の存在は知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、 Galβ1,3G
alNAc α2,3-シアル酸転移活性を有し、上記の公知のST
3GalA.1 とは異なる Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転
移酵素を提供することを目的とするものである。また本
発明は、上記の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵
素をコードするcDNAをクローニングし、該酵素をコード
するＤＮＡ配列および該酵素のアミノ酸配列を提供する
ことを目的としている。

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の目的
を達成すべく鋭意努力し、マウス脳組織およびラット脳
組織からそれぞれ Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移
酵素をコードするcDNAをクローニングし、公知のST3Gal
A.1 とは異なる Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵
素であることを見出し本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、以下の受容体基質特異
性および受容体基質選択性：受容体基質特異性：２糖類
Galβ1,3GalNAc 及び末端に Galβ1,3GalNAc を有する
糖脂質または糖蛋白を基質とする；受容体基質選択性：
糖脂質および２糖類の共存下で糖脂質に対して優先的に
シアル酸を取り込ませ、糖脂質の中では Gg4>GM1>GD1b
の順にシアル酸を取り込ませる；により特徴づけられる
Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素を提供するも
のである。また、配列表の配列番号１に示されるアミノ
酸配列により特定される Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル
酸転移酵素P-F4M および配列表の配列番号２に示される
アミノ酸配列により特定される Galβ1,3GalNAc α2,3-
シアル酸転移酵素P-F4R を提供するものである。また、
本発明は上記の各 Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移
酵素のアミノ酸配列をコードする Galβ1,3GalNAc α2,
3-シアル酸転移酵素遺伝子、およびその好ましい態様で
ある配列表の配列番号１および２に示される核酸番号１
から1050の核酸を含む Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素遺伝子を提供するものである。さらに、上記の
Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素遺伝子を含む
組み換えベクター、および上記組み換えベクターにより
形質転換された形質転換体が提供される。

【０００８】本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素P-F4M およびP-F4R は疎水性の膜貫通ドメイン
を有するため、発現後に細胞膜に固定されてしまい、細
胞外に分泌されない。また、細胞内濃度が一定以上にな
ると酵素の発現が低下してしまうという問題を生じるこ
とがある。本発明者は Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素P-F4M およびP-F4R の有する Galβ1,3GalNAc
α2,3-シアル酸転移活性を利用するため、上記酵素の活
性を維持しつつ、かつ発現時に細胞から分泌される分泌
形態の蛋白を提供することを目的として種々の研究を行
った。従って、本発明の別の目的は、上記の Galβ1,3G
alNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の活
性に係わる部分を含む分泌型蛋白を提供し、該蛋白を大
量に発現させることにある。

【０００９】本発明者は、上記の目的を達成するために
鋭意努力し、IgM シグナルペプチド配列および Galβ1,
3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の
活性ドメイン（アミノ酸残基番号: 58〜350)からなる融
合遺伝子を作成して、この遺伝子を哺乳動物発現ベクタ
ーpcD-SRαに導入してCOS-7 細胞中にトランスフェクト
することにより上記の目的が達成できることを見出し本
発明を完成するにいたった。

【００１０】従って、さらに本発明により、上記の Gal
β1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4
R の活性に関与するポリペプチド部分とシグナルペプチ
ドとを含む細胞外分泌型の蛋白であって、 Galβ1,3Gal
NAc α2,3-シアル酸転移を触媒する蛋白、ならびに上記
発明の好ましい態様として、それぞれ配列表の配列番号
３および４に示されるアミノ酸配列により特定される蛋
白を提供するものである。また、上記蛋白をコードする
遺伝子、およびその好ましい態様として配列表の配列番
号３または４に示される核酸番号１から942 の核酸を含
む遺伝子も提供される。さらに、上記遺伝子を含む組み
換えベクター、およびその好ましい態様であるプラスミ
ドpcDS930MおよびpcDS930Rが提供される。また、上記の
組み換えベクターにより形質転換された形質転換体、お
よび上記形質転換体を培養し培養物から上記の蛋白を採
取することを特徴とする、上記蛋白の製造方法も提供さ
れる。

【００１１】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはな
い。

【実施例】本実施例に用いた試薬および試料は以下のと
おりである。数種類のグリコスフィンゴリピド（ラクト
シルセラミド、アシアロ-GM2、アシアロ-GM1、GD1a、GD
1b及びウシ脳ガングリオシド混合物) 、ガラクトースβ
1,3-N-アセチルガラクトサミン、 Galβ1,3 GalNAcα1-
Bz、CMP-NeuAc 、ラクト-N-テトラオース、N-アセチル
ラクトサミン、アシアロフェツイン及びトライトン CF-
54はシグマ社（セント・ルイス、米国）から入手した。
CMP-[¹⁴C]-NeuAc [11GBq/mmole]はアマシャム社（英
国）から入手したものである。他のグリコスフィンゴリ
ピド（GM1 及び GT1b)はバイオシンス AG.（スイス）か
ら入手した。

【００１２】N-アセチルガラクトサミンβ1,4-ガラクト
ースは梶本博士（理化学研究所、埼玉県和光市）により
寄贈されたものを用いた。制限酵素（BamHI 、BglII 、
EcoRI 、HindIII 、NcoI、PstI、SacI、SmaI、XbaI及び
XhoI)は宝酒造（京都、日本）から入手し、フェツイン
（スピロの方法により精製）は GIBCO社（ニューヨー
ク、米国）から入手した。NDV シアリダーゼはオックス
フォード・グリコシステムズ社（英国）から購入し、ウ
シ精巣及びアスペルギルス種からのβ- ガラクトシダー
ゼは、それぞれシグマ社（セント・ルイス、米国）及び
東洋紡（大阪、日本）から入手した。なお、ガングリオ
シド類及び糖脂質の名称はスベナーホルムのシステムに
従い (Svennerholm, l., J. Lipid. Res., 5, 145-155,
1964)、略号は NDV: ニューカッスル病ウイルス; CDH:
ラクトシルセラミド； Bz:ベンジル； BSA: ウシ顎下線
ムチンを示す。

【００１３】これまでにクローニングされている他のシ
アル酸転移酵素類の間でアミノ酸配列の同一性が最も高
い領域の配列に基づく縮重 PCRプライマーを用いて、Ga
l β1,3 GalNAcα2,3-シアル酸転移酵素をコードするcD
NAを、ポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR)によりマウス及び
ラットの脳のcDNAライブラリーから単離した。方法の詳
細は以下のとおりである。cDNAライブラリーをスクリー
ニングするためのプローブとして用いる PCRフラグメン
トを、先にクローニングされているシアル酸転移酵素類
の保存領域の配列に基づくプライマーを用いて増幅させ
た (Weinstein, J. et al., J. Biol. Chem., 262, 177
35-17743, 1987; および Gillespie, W., J. Biol. Che
m., 267, 21004-21010, 1992) 。センスプライマー F30
2: GCTGCCGGCGCTGCGCCGTCG及びアンチセンスプライマー
F403: GGTGGTCTTGCTCCC(A/G/C/T)AC はアプライド・バ
イオシステム 394 DNAシンセサイザーで合成し、マウス
脳cDNAをPCR の鋳型として使用した。PCR 増幅は、リー
らの方法 (Lee, Y.-C. et al., Eur. J. Biochem., 21
6, 377-385, 1993)に従い、DNA サーマル・サイクラー
（パーキン−エルマー・シータス社）を用いて行った。

【００１４】該PCR 生成物(150 bp)を平滑末端となるよ
うに切断し、キナーゼ処理した後、プラスミドpUC119上
のSmaI部位中にサブクローニングしたところ、それらの
一つが、公知の Galβ1,3 GalNAcα2,3-シアル酸転移酵
素 ST3GalA.1中に保存されている48アミノ酸のうちの38
アミノ酸を含む予想されたアミノ酸配列を有することが
見出された。マウス及びラットの脳のcDNAライブラリー
をスクリーニングするためのハイブリダイゼーション・
プローブとして上記フラグメントを使用し、1.3 kbの単
一クローン、並びに 2.3及び2.6 kbの２クローンを、そ
れぞれマウスの脳及びラットの脳由来の DNAから以下の
ようにして得た。

【００１５】ラット脳のcDNAライブラリーをλZAPII
（ストラタジーン社）及びcDNA合成キット（ファルマシ
ア社）を用いて作成した。マウス脳のUni-ZAP XR (Lee,
Y.-C.et al., Eur. J. Biochem., 216, 377-385, 199
3)及びラット脳のλZAPII cDNAライブラリーを、それぞ
れ約10⁶プラークずつ上記のPCR フラグメント(150 bp)
でスクリーニングした。陽性のクローンを精製し、最終
的に pBluescriptプラスミドのインビボでの切除を通じ
て単一のコロニーとして選択した。ラット脳から単離さ
れた二つのcDNAクローンは、それぞれ長さの異なる 5´
-及び 3´- 非コード領域を含み、40,166の予測分子量
を有する350 アミノ酸の蛋白をコードする単一のオープ
ン・リーディング・フレームを含んでいた。マウス脳由
来のcDNAクローンも、40,123の予測分子量を有する350
アミノ酸の蛋白をコードする単一のオープン・リーディ
ング・フレームを含んでいた。マウス及びラット由来の
cDNAのオープン・リーディング・フレームの間の同一性
は、ヌクレオチド及びアミノ酸配列レベルでそれぞれ 9
4.3%及び 96%であった。マウス及びラット脳由来の 350
アミノ酸の蛋白を、それぞれ本発明の Galβ1,3GalNAc
α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R と命名し
た。

【００１６】配列表の配列番号１および２に、マウス及
びラット由来のcDNAの全配列、ならびに Galβ1,3GalNA
c α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R のアミノ
酸配列を示す。配列番号１および２に示された該酵素の
コード領域は、それぞれ Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル
酸転移酵素P-F4M 遺伝子および Galβ1,3GalNAc α2,3-
シアル酸転移酵素P-F4R 遺伝子の好ましい態様である。
もっとも、本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転
移酵素P-F4M 遺伝子および Galβ1,3GalNAc α2,3-シア
ル酸転移酵素P-F4R 遺伝子は上記の塩基配列に限定され
ることはなく、Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵
素P-F4M およびP-F4R をコードする塩基配列はすべて本
発明の遺伝子に含まれる。なお、図１はマウス脳由来の
P-F4M およびラット脳由来のP-F4R のアミノ酸配列およ
びこれらの蛋白をコードする遺伝子の核酸配列を比較し
た図である。

【００１７】マウス脳由来のP-F4M のmRNAのサイズ及び
その組織分布を調べるため、全RNAを幾つかのマウス組
織から単離し、プローブとして 930 bp cDNAインサート
（157-1086ヌクレオチド）を用いたノーザン・ハイブリ
ダイゼーションを行ったところ、約 4.2 kb に単一のバ
ンドが検出された。発現レベルは脳及び肝臓が最も高
く、心臓及び腎臓においては低レベルで見られたが、
肺、膵臓、脾臓及び顎下腺についてはシグナルは殆ど検
出できなかった。これらの結果は、P-F4M mRNAが組織特
異的に発現しており、ST3GalA.1 mRNAとは異なるレベル
及びパターンで発現することを示している（ST3GalA.1
mRNAは、脳においては低レベルで発現し、顎下腺及び肝
臓においては豊富である：Lee, Y.-C. et al., Eur. J.
Biochem., 216, 377-385, 1993)。また、585 bp cDNA
プローブを用いてマウスの脳から調製したゲノムDNA の
サザン・ハイブリダイゼーションでは、ゲルの各レーン
に単一のバンドが観察された。このことはP-F4M がマウ
スゲノム中の単一の遺伝子によりコードされていること
を示すものである。

【００１８】各実験の詳細は以下のとおりである。10μ
g の全RNA を変性用ホルムアルデヒド−アガロース・ゲ
ル (1%) 上で分画化し、その後ナイロンメンブレン（ニ
トラン・シュライヒャー・アンド・シュエル社）上に移
した。標準的方法 (Sambrook, J. et al., Molecular C
loning: a Laboratory Manual, 2nd edn, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)を
用いてマウス脳から調製したゲノムDNA (7.5μg)を各種
の制限酵素（EcoRI 、BamHI 、HindIII 、SacI及び Xba
I)で４時間切断し、その後 0.6% アガロース・ゲル上で
電気泳動した。サザン及びノーザン・ブロッティング
は、リーらの方法(Lee, Y.-C. et al., Eur. J. Bioche
m., 216, 377-385, 1993) に準じて行い、それぞれ 585
bp フラグメント（ヌクレオチド 1-585）及びプローブ
として [³²P]でラベルしたcDNAの 930 bp EcoRI-XhoIフ
ラグメントを用いた。

【００１９】上記のとおり解明された本発明の Galβ1,
3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の
アミノ酸配列は、従来公知の各シアル酸転移酵素または
公知の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素 ST3Ga
lA.1 (Gillespie, W. et al., J. Biol. Chem., 267, 2
1004-21010; および Lee, Y.-C. et al., Eur. J. Bioc
hem., 216, 377-385, 1993) のアミノ酸配列と比較して
以下の特徴を有している。 (i) アミノ酸配列の疎水性分析(Kyte, J. and Doolittl
e, R.F., J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982) によれ
ば、P-F4M およびP-F4R では単一の疎水性セグメントが
蛋白のNH₂-末端領域に位置しており、他のグリコシル転
移酵素と同様にII型の経膜蛋白である。

【００２０】(ii) ST3GalA.1と比較すると、P-F4M およ
びP-F4R の構造が NH₂末端の細胞質ドメイン (６残
基）、疎水性の膜貫通ドメイン（21残基）、蛋白分解感
受性を有するステム領域（36残基）、及び COOH-末端の
活性ドメイン（287 残基）の４領域からなることを示し
ている。 (iii) P-F4M およびP-F4R はN-結合グリコシル化部位と
なりうる部位を二つ有している。クローニングされてい
る他のシアル酸転移酵素類の一次構造を比較すると、P-
F4M およびP-F4R の 139〜183 の46アミノ酸からなる領
域と 273〜303 の31アミノ酸からなる領域は、それぞれ
約 44%及び 29%の相同性を有しているものの、その他の
領域では有意な類似性は見られない。しかしながら、マ
ウス脳由来のP-F4M とST3GalA.1 のアミノ酸配列は約46
% の相同性を示しており、高度に保存されている領域か
ら COOH-末端までの配列（151-350 残基）の相同性は 7
6%である。従ってこの２種の酵素は非常に類似した機能
を持つことが示唆される。

【００２１】上記の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転
移酵素P-F4M およびP-F4R の活性に係わる部分を含む分
泌型蛋白の製造は以下のとおり行った。 Galβ1,3GalNA
c α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の活性ド
メイン（アミノ酸残基番号:58〜350)をコードする末端
切断形態の遺伝子（オープン・リーディング・フレーム
のN-末端から55アミノ酸を欠く遺伝子）を、それぞれEc
oRI 部位(5´-GGCTATTCAGAATTCCAGCGCCTCGGC-3´) を含
む 5´- プライマー及び XhoI 部位(5´-TGCCAGACCCTCG
AGTGACTGGTTCTG-3´) を含む 3´- プライマーを用いた
PCR増幅により調製した。

【００２２】pUGS の 117 bp PstI/XhoI フラグメント
を哺乳動物発現ベクターpcD-SRαの対応部位に導入する
ことによりpcDSベクター・プラスミドを作成し、さらに
上記PCR産物を切断して得た 930 bp EcoRI/XhoIフラグ
メントを対応部位に挿入した(Lee, Y.-C. et al., Eur.
J. Biochem., 216, 377-385, 1993)。挿入物の塩基配
列は制限酵素処理及び DNAシーケンシングによって分析
した。マウスの免疫グロブリンIgM のシグナルペプチド
をコードする遺伝子とGal β1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素P-F4M またはP-F4R の活性ドメインをコードす
る遺伝子とを含む上記ベクター・プラスミドを、それぞ
れpcDS930MおよびpcDS930Rと命名した。それぞれ3 μg
の組み替えプラスミドpcDS930MおよびpcDS930Rを用い
て、 DEAE-デキストラン法により COS-7細胞を一時的に
トランスフェクトした (Sambrook, J. et al., Molecul
ar Cloning: a Laboratory Manual, 2nd edn, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 198
9)。組み替えプラスミドpcDS930MおよびpcDS930Rを導入
した細胞から細胞外に分泌された本発明の蛋白をそれぞ
れSF-314M およびSF-314R と命名した。

【００２３】この蛋白SF-314M およびSF-314R の Galβ
1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移活性をアッセイするた
め、トランスフェクト後 48 時間で細胞培養液を回収し
てセントリコン30フィルター（アミコン社）で10倍に濃
縮した。 Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移活性は、
リーらのアッセイ方法 (Lee, Y.-C. et al., Eur. J. B
iochem., 216, 377-385, 1993)に準じて、以下のとおり
行った。50 mM カコジル酸ナトリウムバッファー、pH
6.0、50μM CMP-[¹⁴C-]NeuAc (0.9 Bq/pmol) 、0.5% (w
/v)トライトン CF-54、1 mM受容体基質（オリゴサッカ
ライド類または糖脂質類）及び 1μl 濃縮 COS細胞培養
液を含む反応液（各10μl)を37℃で１時間インキュベー
トし、その後シリカゲル 60 HPTLC プレート（メルク
社、ドイツ）にのせた。このプレートをオリゴサッカラ
イド受容体についてはエタノール：ピリジン：n-ブタノ
ール：水：酢酸（100:10:10:30:3) を展開溶媒として、
糖脂質受容体についてはクロロホルム: メタノール:0.5
% CaCl₂(55:45:10)を展開溶媒としてそれぞれ展開し
た。アシアロ−グリコプロテイン類を受容体に用いる場
合は、基質濃度を 2 mg/mlに調整した。各プレート上の
放射能活性を BAS2000ラジオイメージアナライザー（富
士写真フィルム社、日本）で可視化して定量した。

【００２４】本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R を含
む細胞培養液に対して基質としてジサッカライドを用い
た場合、ラベル化されたシアル酸は Galβ1,3 GalNAcに
のみ導入されており、 Galβ1,4 GlcNAc、GalNAcβ1,4G
al、又は Galβ1,4 Glc のいずれにも取り込まれなかっ
た。この結果は、ST3GalA.1 をコードする遺伝子を含む
pcD-SRα2,3-STでトランスフェクトした細胞を培養した
培地を用いた場合と同様の結果を与えた。また、pcD-SR
α単独でトランスフェクトした COS-7細胞からの培養液
には放射活性の取り込みは観察されなかった。また、ST
3GalA.1 により得られる NeuAcα2,3Galβ1,3 GalNAcを
対照として、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R を含
む細胞培養液により得られた Galβ1,3 GalNAc由来の生
成物を薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エタノー
ル、ピリジン、n-ブタノール、酢酸、及び水＝100:10:1
0:3:30）、及びペーパー・クロマトグラフィー（展開溶
媒：n-ブタノール、ピリジン、酢酸、及び水＝60:40:3:
30）により分析したところ、両生成物は同一のRf値を与
えた。

【００２５】さらに、NDV シアリダーゼ（2,3-結合及び
2,8-結合シアル酸残基を開裂し2,6-結合シアル酸残基を
開裂しないもの）で本発明の蛋白SF-314M およびSF-314
R の生成物を処理すると、ラベル化された遊離のシアル
酸が放出され、シアル酸が2,3-結合で結合していること
が確認された。２種の異なるβ−ガラクトシダーゼで処
理した場合にも本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R の
生成物の TLC上の移動に影響はなく、Gal β1,3 GalNAc
のβ−ガラクトース残基の３位がシアル酸で置換されて
いることが示された。以上の結果から、本発明の蛋白SF
-314M およびSF-314R の生成物が NeuAcα2,3Galβ1,3
GalNAcであることが明らかである。なお、生成物のNDV
シアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ処理は、50 mM
クエン酸ナトリウムバッファー (pH 5.5) 中で、0.2U/m
l のNDV シアリダーゼ及び 2U/mlのβ−ガラクトシダー
ゼ（ウシ精巣及びアスペルギルス種）をそれぞれ用いて
行った。

【００２６】本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R の受
容体基質特異性を ST3GalA.1の受容体基質特異性と比較
した結果を表１に示す。表中、特異性の比較は基質とし
てのアシアロ GM1中へのシアル酸の取り込みに対する相
対的活性を示している。

【表１】 Galβ1,3 GalNAcα2,3-シアル酸転移酵素の受容体基質特異性の比較 ─────────────────────────────────── 受容体^a) ST3GalA.1 SF-314M SF-314R ─────────────────────────────────── Ａ．糖脂質アシアロ GM1 1.00 (5.60) ^b) 1.00 (10.1) 1.00 (4.17) GM1 1.60 0.37 0.26 GD1b 2.73 0.15 0.02 GD1a 0 0 0 アシアロ GM2 0 0 0 ラクトシルセラミド 0 0 0 Ｂ．オリゴサッカライド Gal β1,3GalNAc 10.34 2.89 3.15 Gal β1,4GlcNAc 0 0 0 GalNAcβ1,4 Gal 0 0 0 Gal β1,3GalNAc α1Bz 9.69 4.25 3.76 GalNAcα1Bz 0 0 0 Ｃ．グリコプロテインアシアロフェツイン 0.80 0.40 0.57 アシアロ-BSM 0.20 0.05 0.08 アシアロ- α1-酸グリコプロテイン 0 0 0 ───────────────────────────────────^a) 各基質は、糖脂質及びオリゴサッカライドについて
は 1 mM 、グリコプロテインについては 2 mg/mlの濃度
で用いた。^b) シアル酸転移酵素の実際の活性(pmol/h/μl 酵素）
を括弧内に示す。

【００２７】上記の表に示された結果から明らかなとお
り、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R の受容体基質
特異性はST3GalA.1 の受容体基質特異性と同様であり、
ジサッカライドである Galβ1,3 GalNAcのみに対する顕
著な受容体特異性を示す。また、末端に Galβ1,3GalNA
c を有するオリゴサッカライド類のみならず、末端にGa
lβ1,3GalNAc を有するガングリオシド類も本発明の蛋
白SF-314M およびSF-314R の受容体として作用すること
が明らかである。試験した他の基質に対しては検出可能
な酵素活性は見られず、Gal β1,3(4)GlcNAc- 及び Gal
β1,3 GalNAc/Galβ1,4 GlcNAcα2,3-シアル酸転移酵素
(ST3GalB及びC)の基質特異性とは全く異なっていた (We
n, D.X. et al., J. Biol. Chem., 267, 21011-21019,
1992; Kitagawa, H. et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 194, 375-382, 1993;および Sasaki, K. et a
l., J. Biol. Chem., 268, 22782-22787, 1993) 。従っ
て、本発明によりクローニングされたcDNAが Galβ1,3
GalNAcα2,3 シアル酸転移酵素をコードしていることが
明らかである。

【００２８】また、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314
R は、シアル酸のアシアロフェツイン及びアシアロBSA
中への取り込みも触媒し、これらの蛋白により基質とし
て糖脂質中に取り込まれるシアル酸の順位は Gg4>GM1>G
D1b であった。一方、ST3GalA.1 により基質として糖脂
質中に取り込まれるシアル酸の順位は GD1b>GM1>Gg4で
あった。さらに、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R
によりGg4 及び GM1からの生成される生成物はTLC プレ
ートから抽出し、別のTLC プレート上でクロロホルム：
メタノール：0.02% CaCl₂(65:35:8) による再クロマト
グラフィーに付したところ、それぞれST3GalA.1 により
合成されたGM1b及び GD1a と同一のRf値を与えた。

【００２９】ST3GalA.1 及び本発明の蛋白SF-314M およ
びSF-314R の基質特異性及び選択性を明らかにするため
に、可溶性オリゴサッカライド及び糖脂質に対する Km
値を界面活性剤の存在下で比較した結果を表２に示す。

【表２】 Gal β1,3 GalNAcα2,3-シアル酸転移酵素の K_m値の比較 ─────────────────────────────────── 基質 ST3GalA.1 SF-314M SF-314R ─────────────────────────────────── (mM) Gal β1,3GalNAc 0.17 0.63 0.56 アシアロ GM1 0.91 0.67 0.71 GM1 2.00 0.83 0.95 ───────────────────────────────────

【００３０】本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R の G
alβ1,3 GalNAcに対するKm値は、ST3GalA.1 のKm値より
も４ないし５倍大きかった。対照的に、本発明の蛋白SF
-314M およびSF-314R の Gg4及び GM1に対するKm値は、
ST3GalA.1 のKm値よりも小さかった。本発明の蛋白SF-3
14M およびSF-314R は Galβ1,4 GalNAc、アシアロ-GM1
及び GM1に対して同様の Km 値を示したが、ST3GalA.1
は糖脂質に対して Galβ1,3 GalNAcに対するよりも５な
いし10倍大きな Km 値を示した。これらの結果は、アシ
アロ-GM1及び GM1が ST3GalA.1に対するよりも本発明の
蛋白SF-314M およびSF-314R に対してはるかに適した基
質であり、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314RSがST3G
alA.1 とは異なる効率で受容体基質を利用することを示
すものである。

【００３１】本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R のア
ミノ酸配列および該蛋白をコードする各遺伝子の塩基配
列を、それぞれ配列表の配列番号３および４に示す。上
記の各蛋白は、それぞれ Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル
酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の活性に関与するポリペ
プチド部分とシグナルペプチドとを含む細胞外分泌型の
蛋白の好ましい態様である。もっとも、当業者は上記の
開示により公知のシグナルペプチドと Galβ1,3GalNAc
α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の活性に関
与する任意の部分とを組み合わせて本発明の目的に合致
する蛋白を容易に製造でき、そのような蛋白はすべて本
発明の範囲に包含されるものである。

【００３２】また、配列番号３および４に開示された遺
伝子は、本発明の蛋白の好ましい態様である蛋白SF-314
M およびSF-314R をコードする好ましい遺伝子である
が、本発明の遺伝子はこれらに限定されることはなく、
Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M および
P-F4R の活性に関与するポリペプチド部分とシグナルペ
プチドとを含む細胞外分泌型の蛋白をコードするいかな
る遺伝子も本発明の範囲に包含される。また、このよう
な遺伝子を含む本発明の組み替えベクターは上記に具体
的に示されたものに限定されず、当業者に公知のベクタ
ーを用いて種々の組み替えベクターを製造することがで
きる。また、この遺伝子により形質転換すべき細胞の種
類も上記に具体的に開示されたものに限定されることは
ない。

【００３３】本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R につ
いて受容体基質特異性や選択性を説明したが、これらの
蛋白はそれぞれ本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル
酸転移酵素P-F4M およびP-F4R の活性部位を保持してい
るので、本発明の蛋白SF-314M およびSF-314R について
開示された上記の受容体基質特異性や選択性が、本発明
の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およ
びP-F4R についてもそのままあてはまることは、当業者
に容易に理解されるであろう。また、本発明の Galβ1,
3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4M およびP-F4R
は、それぞれマウスおよびラットの脳に由来するもので
あり、本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵
素と同じ型のシアル酸転移酵素が他の哺乳類の組織（例
えば脳組織）に存在し、かつ、それらのシアル酸転移酵
素が本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素
P-F4M およびP-F4R と高度の相同性を有していることも
当業者に容易に理解されよう。

【００３４】このようなシアル酸転移酵素は、本発明の
蛋白SF-314M およびSF-314R について開示された上記の
受容体基質特異性及び受容体基質選択性と実質的に同一
の特性を有することにより特徴付けられるものであり、
すべて本発明の範囲に属するものである。すなわち、本
発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素は、以
下の受容体基質特異性および受容体基質選択性：受容体基質特異性：２糖類 Galβ1,3GalNAc 及び末端に
Galβ1,3GalNAc を有する糖脂質または糖蛋白を基質と
する；受容体基質選択性：糖脂質および２糖類の共存下で糖脂
質に対して優先的にシアル酸を取り込ませ、糖脂質の中
では Gg4>GM1>GD1b の順にシアル酸を取り込ませる；を
有することを特徴としている。このような酵素として
は、哺乳類組織由来の天然型酵素（例えば本発明の酵素
P-F4M およびP-F4R)やその変異体、または本発明の蛋白
SF-314M およびSF-314R のように、 Galβ1,3GalNAc α
2,3-シアル酸転移を触媒し、遺伝子組み替え技術により
製造された細胞外分泌型蛋白等を挙げることができる
が、これらはいずれも本発明の範囲に包含されるもので
ある。

【００３５】

【発明の効果】本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル
酸転移酵素は、癌転移抑制、ウイルス感染抑防止、炎症
反応抑制、神経細胞賦活効果を有する薬剤として、ある
いは薬剤にシアル酸を付加することにより生理作用を増
加させるための試薬等として有用である。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ： 1189 配列の型：２本鎖トポロジー：直鎖配列の種類： cDNA to mRNA 起源： Mus musculus（マウス）配列の特徴： CDS 1-1050 (-101) A -101 ATCGGCACGA GGCCAAAACA AGCAGGCTGC GCCGTGGCTG GCCCCGCAGC -51 GGGCCGGGGA AAGGATTGGC CACGGTGACA GCCACCCCGT GGCCAGCACG -1 ATG AAG TGC TCT CTT CGG GTG TGG TTC CTC TCT ATG GCA TTC CTG 45 MET Lys Cys Ser Leu Arg Val Trp Phe Leu Ser MET Ala Phe Leu 15 CTG GTG TTC ATT ATG TCC CTG CTC TTC ACC TAC TCG CAC CAC AGC 90 Leu Val Phe Ile MET Ser Leu Leu Phe Thr Tyr Ser His His Ser 30 ATG GCT ACC TTG CCC TAC CTG GAC TCG GGG GCT CTG GGC GGC ACA 135 MET Ala Thr Leu Pro Tyr Leu Asp Ser Gly Ala Leu Gly Gly Thr 45 CAC CGG GTG AAG CTG GTA CCA GGC TAT TCA GGA CTA CAG CGC CTC 180 His Arg Val Lys Leu Val Pro Gly Tyr Ser Gly Leu Gln Arg Leu 60 GGC AAG GAG GGG CTT TTG GGG AGA AAT TGT GCC TGC AGT CGC TGC 225 Gly Lys Glu Gly Leu Leu Gly Arg Asn Cys Ala Cys Ser Arg Cys 75 ATG GGT GAC GCC AGC ACC TCT GAA TGG TTT GAC AGC CAC TTT GAC 270 MET Gly Asp Ala Ser Thr Ser Glu Trp Phe Asp Ser His Phe Asp 90 GGC AAC ATC TCA CCC GTC TGG ACC AGA GAT AAC ATG AAC CTC CCC 315 Gly Asn Ile Ser Pro Val Trp Thr Arg Asp Asn MET Asn Leu Pro 105 CCG GAT GTC CAG CGG TGG TGG ATG ATG CTA CAA CCC CAA TTC AAG 360 Pro Asp Val Gln Arg Trp Trp MET MET Leu Gln Pro Gln Phe Lys 120 TCA CAC AAC ACC AAC GAA GTG CTG GAA AAA CTG TTC CAG ATC GTG 405 Ser His Asn Thr Asn Glu Val Leu Glu Lys Leu Phe Gln Ile Val 135 CCT GGC GAG AAC CCC TAC CGC TTC CGG GAC CCC CAA CAG TGC CGG 450 Pro Gly Glu Asn Pro Tyr Arg Phe Arg Asp Pro Gln Gln Cys Arg 150 CGC TGT GCT GTG GTC GGG AAC TCA GGC AAC CTT CGG GGC TCT GGC 495 Arg Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gly Ser Gly 165 TAT GGA CAA GAA GTG GAC AGC CAC AAC TTT ATC ATG AGG ATG AAT 540 Tyr Gly Gln Glu Val Asp Ser His Asn Phe Ile MET Arg MET Asn 180 CAG GCA CCG ACT GTG GGC TTT GAG AAG GAT GTT GGC AGC CGA ACA 585 Gln Ala Pro Thr Val Gly Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Arg Thr 195 ACT CAC CAT TTC ATG TAC CCA GAG AGT GCC AAG AAC CTG CCT GCC 630 Thr His His Phe MET Tyr Pro Glu Ser Ala Lys Asn Leu Pro Ala 210 AAT GTC AGC TTC GTG CTG GTC CCC TTC AAG GCC CTG GAC CTA ATG 675 Asn Val Ser Phe Val Leu Val Pro Phe Lys Ala Leu Asp Leu MET 225 TGG ATT GCC AGC GCC CTC TCC ACA GGA CAG ATC CGA TTC ACC TAT 720 Trp Ile Ala Ser Ala Leu Ser Thr Gly Gln Ile Arg Phe Thr Tyr 240 GCC CCA GTG AAG TCC TTC CTT CGA GTG GAC AAA GAG AAG GTC CAG 765 Ala Pro Val Lys Ser Phe Leu Arg Val Asp Lys Glu Lys Val Gln 255 ATT TAC AAC CCA GCC TTC TTC AAG TAC ATT CAC GAC AGG TGG ACC 810 Ile Tyr Asn Pro Ala Phe Phe Lys Tyr Ile His Asp Arg Trp Thr 270 GAG CAC CAC GGG CGC TAC CCT TCC ACA GGA ATG CTG GTG CTC TTC 855 Glu His His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly MET Leu Val Leu Phe 285 TTT GCA CTA CAT GTG TGT GAT GAG GTG AAC GTG TAT GGG TTC GGG 900 Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Val Tyr Gly Phe Gly 300 GCC GAC AGT CGA GGC AAC TGG CAC CGC CAC TGG GAG AAC AAC CGG 945 Ala Asp Ser Arg Gly Asn Trp His Arg His Trp Glu Asn Asn Arg 315 TAC GCG GGC GAG TTC CGG AAG ACA GGC GTG CAT GAC GCC GAC TTC 990 Tyr Ala Gly Glu Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Ala Asp Phe 330 GAA GCC CAC ATC ATC GAC ATG CTG GCC AAG GCC AGC AAG ATC GAG 1035 Glu Ala His Ile Ile Asp MET Leu Ala Lys Ala Ser Lys Ile Glu 345 GTC TAC CGA GGG AAC TGA 1053 Val Tyr Arg Gly Asn --- 350 GCGGCCCTGA GCGCCTTCAG AACCAGTCAC TCGAG 1088 配列番号：２配列の長さ： 2725 配列の型：２本鎖トポロジー：直鎖配列の種類： cDNA to mRNA 起源： Rattus norvesicus （ラット）配列の特徴 CDS 1-1050 (-80) AAGCAGGCTG CGCCGTGGCT GGCCCCACAG -51 TGGGCTGGGA AAGGATTGGC CACGGTGACA GCCGCCCCGT GGCCAGCACA -1 ATG AAG TGC TCC CTT CGA GTG TGG TTC CTC TCT ATG GCC TTC CTG 45 MET Lys Cys Ser Leu Arg Val Trp Phe Leu Ser MET Ala Phe Leu 15 CTG GTG TTC ATT ATG TCT CTG CTC TTC ACG TAC TCA CAC CAC AGC 90 Leu Val Phe Ile MET Ser Leu Leu Phe Thr Tyr Ser His His Ser 30 ATG GCT ACC TTG CCC TAC CTG GAC TCG GGG ACT CTG GGC GGA ACA 135 MET Ala Thr Leu Pro Tyr Leu Asp Ser Gly Thr Leu Gly Gly Thr 45 CAC CGA GTG AAG CTG GTA CCG GGC TAT ACT GGG CAA CAG CGC CTT 180 His Arg Val Lys Leu Val Pro Gly Tyr Thr Gly Gln Gln Arg Leu 60 GTC AAG GAG GGG CTT TCG GGG AAA AGT TGT ACC TGC AGT CGC TGC 225 Val Lys Glu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Cys Thr Cys Ser Arg Cys 75 ATG GGT GAT GCC GGC ACC TCT GAG TGG TTT GAC AGC CAC TTT GAC 270 MET Gly Asp Ala Gly Thr Ser Glu Trp Phe Asp Ser His Phe Asp 90 AGT AAC ATC TCA CCT GTC TGG ACG AGA GAT AAC ATG AAC CTC ACC 315 Ser Asn Ile Ser Pro Val Trp Thr Arg Asp Asn MET Asn Leu Thr 105 CCG GAT GTC CAG CGG TGG TGG ATG ATG CTG CAA CCC CAA TTC AAG 360 Pro Asp Val Gln Arg Trp Trp MET MET Leu Gln Pro Gln Phe Lys 120 TCA CAC AAC ACC AAT GAA GTG CTG GAG AAG CTC TTC CAG ATC GTG 405 Ser His Asn Thr Asn Glu Val Leu Glu Lys Leu Phe Gln Ile Val 135 CCC GGT GAG AAC CCC TAC CGC TTC CGG GAC CCC CAG CAG TGC CGG 450 Pro Gly Glu Asn Pro Tyr Arg Phe Arg Asp Pro Gln Gln Cys Arg 150 CGC TGT GCT GTG GTC GGG AAC TCA GGC AAC CTT CGG GGC TCT GGC 495 Arg Cys Ala Val Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gly Ser Gly 165 TAT GGG CAA GAA GTG GAC AGC CAC AAC TTT ATC ATG AGG ATG AAT 540 Tyr Gly Gln Glu Val Asp Ser His Asn Phe Ile MET Arg MET Asn 180 CAG GCA CCG ACT GTA GGC TTT GAG AAG GAT GTT GGC AGC CGA ACA 585 Gln Ala Pro Thr Val Gly Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Arg Thr 195 ACT CAC CAT TTC ATG TAC CCG GAG AGT GCC AAG AAC CTG CCT GCC 630 Thr His His Phe MET Tyr Pro Glu Ser Ala Lys Asn Leu Pro Ala 210 AAC GTG AGC TTT GTG CTG GTG CCC TTC AAG GCC CTG GAC CTG ATG 675 Asn Val Ser Phe Val Leu Val Pro Phe Lys Ala Leu Asp Leu MET 225 TGG ATT GCC AGC GCC CTC TCC ACA GGA CAG ATC CGA TTC ACC TAT 720 Trp Ile Ala Ser Ala Leu Ser Thr Gly Gln Ile Arg Phe Thr Tyr 240 GCT CCA GTG AAG TCC TTC CTT CGA GTG GAC AAA GAG AAG GTC CAG 765 Ala Pro Val Lys Ser Phe Leu Arg Val Asp Lys Glu Lys Val Gln 255 ATT TAC AAC CCA GCC TTC TTC AAG TAC ATC CAT GAC AGG TGG ACC 810 Ile Tyr Asn Pro Ala Phe Phe Lys Tyr Ile His Asp Arg Trp Thr 270 GAG CAC CAT GGC CGC TAC CCC TCC ACA GGA ATG CTG GTG CTC TTC 855 Glu His His Gly Arg Tyr Pro Ser Thr Gly MET Leu Val Leu Phe 285 TTT GCA CTA CAC GTG TGT GAT GAG GTG AAC GTG TAT GGG TTC GGG 900 Phe Ala Leu His Val Cys Asp Glu Val Asn Val Tyr Gly Phe Gly 300 GCC GAC AGC CGT GGC AAC TGG CAC CAC TAC TGG GAG AAC AAC CGG 945 Ala Asp Ser Arg Gly Asn Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn Arg 315 TAC GCG GGC GAG TTC CGG AAG ACA GGC GTG CAT GAT GCC GAC TTC 990 Tyr Ala Gly Glu Phe Arg Lys Thr Gly Val His Asp Ala Asp Phe 330 GAA GCC CAC ATC ATT GAC ATT CTG GCC AAG GCC AGC AAG ATT GAA 1035 Glu Ala His Ile Ile Asp Ile Leu Ala Lys Ala Ser Lys Ile Glu 345 GTC TAC CGA GGG AAC TGA 1053 Val Tyr Arg Gly Asn --- 350 GCAGCCTCAG GCGCCTTCAG AACCAGTCAC TTCAGGGTCT GGCAAGCGCC 1103 GGTTGCCGCC CACCAATCAG ACTGCGCCGT CCCCAGCAAC CAATCAGTGC 1153 TGCAGTTGGG AGGAGCTTCT TTCTTAGCCA ATCACACAAC TCAAGGAGAA 1203 CTTCCGGCGC CGCCGTCTCC ACCAATCATG GCCTTGGGAG GCGGCGGGCC 1253 TGGACCCCCT CCCCCAACCC CCAACCCCCA ACCCCGCTTT GGATGAGAAT 1303 TTTTCTGCTT TTTAAGAGGC CGGTCTGGGT CTGGGAGGGA GCACCTTGAA 1353 CTGCTCATTT CCAGCTTAGT CCCGATGGGT GAGTGAAGCC CGCCAAAGAA 1403 ATGTGGTCCC GGCGAGATAC TTTCCAGGGC ATTCTGTGGC TCACCAGCTA 1453 GTAGGGGGTT GTATTCACTC CCTAGTTGGG TTAACTCATT AAGAATGGGA 1503 AATTATTATG TGGACACTGA AGGGAAGTGT TTTCTGGGGC CTGAGGCATT 1553 CACTGAAGCC CTTTCTCCCA AATGAACCTC AACTTTGACC TAGGTCAAGT 1603 CATGCAAATA GCTTCCAGTT GTAACCCGAT TCTTGACTCA CCAGCCCTTT 1653 AGGAGCTGGA AAGTAGGTTA GAACAGGCGA GTAAGCATGG TAAAGGGGCG 1703 GACAGGAGGA GCCATGCATG GCAGATACCA ATCTGCTCCT CCCCAGCAAA 1753 GCTCCGAGCC ATCTGCAAGG CCTGCAAACA ACTGTCAAGC GATCTTGGTT 1803 GGATAGCCAT CCCTGGCAGC TGGAGGGTAA CTAAAGTATG AATCCAAAGC 1853 AAATCCAACA CCCAAGCAAG AGGCTGCCTG CTCCTCTTTG GGGTGACAAT 1903 GAAAGAAAAA GATACATGCA CAGGGCACTC CTTTCCAGCC TACTGTCCAA 1953 CCCTGCTGCT CTCGCCTTAG GGCTAAAGAC TTGGGCCGCG TGTGTGAGAG 2003 CACAAGCAGC GGAGTCCCGG TGGTCTCATT TTGTCTCCAA ATCAACAGGT 2053 GAGCTGGAGA GGAGACCCAG GACCTAAGGA CAGACGCTGA GAAGGTGGTG 2103 GGGAACAGGA GTGAGGGCAC ACGTGAGAGA AGCACCTTGC ATGTGACCCG 2153 GTGGAGCTTC CTACCCGTTC CTGACACTAA TGAGGCCCTA GGGAGGTCGA 2203 CATTAACAAG CAGCTTCCTG GTTGGGGGAC AGTCACACGT AAGGAGTGTG 2253 TTAAAGTTTG GTATGAGGCA AGTACCCCTA AAAACTAATA TATGAAGAAC 2303 TTTGCTTGAA TTTGTTCCTT CCAAGTTTCA AAAGCAGGGG TAGAGAAAAA 2353 GGGAGTATAC CGAGAAGGGC TGTAGCGGAA CCTCTCAGGG CTCTAATCAT 2403 CGTGCAGTCA CTGTACCAGT GGCCGTTCTT GCCTGTCTCC GCTCTCCCAA 2453 GAAGCTGCTG TGATGAGAAG TGGGAAAGTA CTGCGATTAC GACAAACAGT 2503 ATTGAGAAGA AGAATTTATT TTTCCTCCTT TTGTTTTGCT TAAACCATGA 2553 GTCACCATTC TAGAAAAGGT AGGTCCCAGC ACCCACATCC TTTTTCTTCT 2603 ACAGTTATTT AAACATTCAA TTTTTCCCTC TGTTTCTTTT CC 2645 配列番号：３配列の長さ： 1023 配列の型：２本鎖トポロジー：直鎖配列の種類： cDNA to mRNA 起源： Mus musculus（マウス）配列の特徴： CDS 1-942 分泌型酵素 (-43) CTG CAGGGTTTTT ATTTTTAATT TTCTTTCAAA TACTTCCACC -1 PstI ATG AAA TTC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 MET Lys Phe Ser Trp Val MET Phe Phe Leu MET Ala Val Val Thr 15 GGG GTC AAT TCA GAA TTC CAG CGC CTC GGC AAG GAG GGG CTT TTG 90 Gly Val Asn Ser Glu Phe Gln Arg Leu Gly Lys Glu Gly Leu Leu 30 GGG AGA AAT TGT GCC TGC AGT CGC TGC ATG GGT GAC GCC AGC ACC 135 Gly Arg Asn Cys Ala Cys Ser Arg Cys MET Gly Asp Ala Ser Thr 45 TCT GAA TGG TTT GAC AGC CAC TTT GAC GGC AAC ATC TCA CCC GTC 180 Ser Glu Trp Phe Asp Ser His Phe Asp Gly Asn Ile Ser Pro Val 60 TGG ACC AGA GAT AAC ATG AAC CTC CCC CCG GAT GTC CAG CGG TGG 225 Trp Thr Arg Asp Asn MET Asn Leu Pro Pro Asp Val Gln Arg Trp 75 TGG ATG ATG CTA CAA CCC CAA TTC AAG TCA CAC AAC ACC AAC GAA 270 Trp MET MET Leu Gln Pro Gln Phe Lys Ser His Asn Thr Asn Glu 90 GTG CTG GAA AAA CTG TTC CAG ATC GTG CCT GGC GAG AAC CCC TAC 315 Val Leu Glu Lys Leu Phe Gln Ile Val Pro Gly Glu Asn Pro Tyr 105 CGC TTC CGG GAC CCC CAA CAG TGC CGG CGC TGT GCT GTG GTC GGG 360 Arg Phe Arg Asp Pro Gln Gln Cys Arg Arg Cys Ala Val Val Gly 120 AAC TCA GGC AAC CTT CGG GGC TCT GGC TAT GGA CAA GAA GTG GAC 405 Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gly Ser Gly Tyr Gly Gln Glu Val Asp 135 AGC CAC AAC TTT ATC ATG AGG ATG AAT CAG GCA CCG ACT GTG GGC 450 Ser His Asn Phe Ile MET Arg MET Asn Gln Ala Pro Thr Val Gly 150 TTT GAG AAG GAT GTT GGC AGC CGA ACA ACT CAC CAT TTC ATG TAC 495 Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Arg Thr Thr His His Phe MET Tyr 165 CCA GAG AGT GCC AAG AAC CTG CCT GCC AAT GTC AGC TTC GTG CTG 540 Pro Glu Ser Ala Lys Asn Leu Pro Ala Asn Val Ser Phe Val Leu 180 GTC CCC TTC AAG GCC CTG GAC CTA ATG TGG ATT GCC AGC GCC CTC 585 Val Pro Phe Lys Ala Leu Asp Leu MET Trp Ile Ala Ser Ala Leu 195 TCC ACA GGA CAG ATC CGA TTC ACC TAT GCC CCA GTG AAG TCC TTC 630 Ser Thr Gly Gln Ile Arg Phe Thr Tyr Ala Pro Val Lys Ser Phe 210 CTT CGA GTG GAC AAA GAG AAG GTC CAG ATT TAC AAC CCA GCC TTC 675 Leu Arg Val Asp Lys Glu Lys Val Gln Ile Tyr Asn Pro Ala Phe 225 TTC AAG TAC ATT CAC GAC AGG TGG ACC GAG CAC CAC GGG CGC TAC 720 Phe Lys Tyr Ile His Asp Arg Trp Thr Glu His His Gly Arg Tyr 240 CCT TCC ACA GGA ATG CTG GTG CTC TTC TTT GCA CTA CAT GTG TGT 765 Pro Ser Thr Gly MET Leu Val Leu Phe Phe Ala Leu His Val Cys 255 GAT GAG GTG AAC GTG TAT GGG TTC GGG GCC GAC AGT CGA GGC AAC 810 Asp Glu Val Asn Val Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Arg Gly Asn 270 TGG CAC CGC CAC TGG GAG AAC AAC CGG TAC GCG GGC GAG TTC CGG 855 Trp His Arg His Trp Glu Asn Asn Arg Tyr Ala Gly Glu Phe Arg 285 AAG ACA GGC GTG CAT GAC GCC GAC TTC GAA GCC CAC ATC ATC GAC 900 Lys Thr Gly Val His Asp Ala Asp Phe Glu Ala His Ile Ile Asp 300 ATG CTG GCC AAG GCC AGC AAG ATC GAG GTC TAC CGA GGG AAC TGA 945 MET Leu Ala Lys Ala Ser Lys Ile Glu Val Tyr Arg Gly Asn --- 314 GCGGCCCTGA GCGCCTTCAG AACCAGTCAC TCGAG 980 XhoI 配列番号：４配列の長さ： 1023 配列の型：２本鎖トポロジー：直鎖配列の種類： cDNA to mRNA 起源： Rattus norvesicus 配列の特徴： CDS 1-942 分泌型酵素 (-43) CTG CAGGGTTTTT ATTTTTAATT TTCTTTCAAA TACTTCCACC -1 PstI ATG AAA TTC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA 45 MET Lys Phe Ser Trp Val MET Phe Phe Leu MET Ala Val Val Thr 15 GGG GTC AAT TCA GAA TTC CAG CGC CTC GGC AAG GAG GGG CTT TCG 90 Gly Val Asn Ser Glu Phe Gln Arg Leu Gly Lys Glu Gly Leu Ser 30 GGG AAA AGT TGT ACC TGC AGT CGC TGC ATG GGT GAT GCC GGC ACC 135 Gly Lys Ser Cys Thr Cys Ser Arg Cys MET Gly Asp Ala Gly Thr 45 TCT GAG TGG TTT GAC AGC CAC TTT GAC AGT AAC ATC TCA CCT GTC 180 Ser Glu Trp Phe Asp Ser His Phe Asp Ser Asn Ile Ser Pro Val 60 TGG ACG AGA GAT AAC ATG AAC CTC ACC CCG GAT GTC CAG CGG TGG 225 Trp Thr Arg Asp Asn MET Asn Leu Thr Pro Asp Val Gln Arg Trp 75 TGG ATG ATG CTG CAA CCC CAA TTC AAG TCA CAC AAC ACC AAT GAA 270 Trp MET MET Leu Gln Pro Gln Phe Lys Ser His Asn Thr Asn Glu 90 GTG CTG GAG AAG CTC TTC CAG ATC GTG CCC GGT GAG AAC CCC TAC 315 Val Leu Glu Lys Leu Phe Gln Ile Val Pro Gly Glu Asn Pro Tyr 105 CGC TTC CGG GAC CCC CAG CAG TGC CGG CGC TGT GCT GTG GTC GGG 360 Arg Phe Arg Asp Pro Gln Gln Cys Arg Arg Cys Ala Val Val Gly 120 AAC TCA GGC AAC CTT CGG GGC TCT GGC TAT GGG CAA GAA GTG GAC 405 Asn Ser Gly Asn Leu Arg Gly Ser Gly Tyr Gly Gln Glu Val Asp 135 AGC CAC AAC TTT ATC ATG AGG ATG AAT CAG GCA CCG ACT GTA GGC 450 Ser His Asn Phe Ile MET Arg MET Asn Gln Ala Pro Thr Val Gly 150 TTT GAG AAG GAT GTT GGC AGC CGA ACA ACT CAC CAT TTC ATG TAC 495 Phe Glu Lys Asp Val Gly Ser Arg Thr Thr His His Phe MET Tyr 165 CCG GAG AGT GCC AAG AAC CTG CCT GCC AAC GTG AGC TTT GTG CTG 540 Pro Glu Ser Ala Lys Asn Leu Pro Ala Asn Val Ser Phe Val Leu 180 GTG CCC TTC AAG GCC CTG GAC CTG ATG TGG ATT GCC AGC GCC CTC 585 Val Pro Phe Lys Ala Leu Asp Leu MET Trp Ile Ala Ser Ala Leu 195 TCC ACA GGA CAG ATC CGA TTC ACC TAT GCT CCA GTG AAG TCC TTC 630 Ser Thr Gly Gln Ile Arg Phe Thr Tyr Ala Pro Val Lys Ser Phe 210 CTT CGA GTG GAC AAA GAG AAG GTC CAG ATT TAC AAC CCA GCC TTC 675 Leu Arg Val Asp Lys Glu Lys Val Gln Ile Tyr Asn Pro Ala Phe 225 TTC AAG TAC ATC CAT GAC AGG TGG ACC GAG CAC CAT GGC CGC TAC 720 Phe Lys Tyr Ile His Asp Arg Trp Thr Glu His His Gly Arg Tyr 240 CCC TCC ACA GGA ATG CTG GTG CTC TTC TTT GCA CTA CAC GTG TGT 765 Pro Ser Thr Gly MET Leu Val Leu Phe Phe Ala Leu His Val Cys 255 GAT GAG GTG AAC GTG TAT GGG TTC GGG GCC GAC AGC CGT GGC AAC 810 Asp Glu Val Asn Val Tyr Gly Phe Gly Ala Asp Ser Arg Gly Asn 270 TGG CAC CAC TAC TGG GAG AAC AAC CGG TAC GCG GGC GAG TTC CGG 855 Trp His His Tyr Trp Glu Asn Asn Arg Tyr Ala Gly Glu Phe Arg 285 AAG ACA GGC GTG CAT GAT GCC GAC TTC GAA GCC CAC ATC ATT GAC 900 Lys Thr Gly Val His Asp Ala Asp Phe Glu Ala His Ile Ile Asp 300 ATT CTG GCC AAG GCC AGC AAG ATT GAA GTC TAC CGA GGG AAC TGA 945 Ile Leu Ala Lys Ala Ser Lys Ile Glu Val Tyr Arg Gly Asn --- 314 GCAGCCTCAG GCGCCTTCAG AACCAGTCAC TCGAG 980 XhoI

【図面の簡単な説明】

【図１】マウス脳由来のP-F4M およびラット脳由来の
P-F4R のアミノ酸配列およびこれらの蛋白をコードする
遺伝子の核酸配列を比較した図である。図中、マウス由
来P-F4M のアミノ酸配列および核酸配列を"Mouse" の欄
に、ラット由来P-F4R のアミノ酸配列および核酸配列を
"Rat" の欄にそれぞれ記載してある。核酸配列及びアミ
ノ酸配列の番号は開始コドン及び開始メチオニンからの
ものである。P-F4R の核酸配列及びアミノ酸配列中の破
線はP-F4M と同一であることを示し、異なる核酸及びア
ミノ酸はP-F4R の核酸配列及びアミノ酸配列中に記号で
示されている。P-F4M のアミノ酸配列中の枠で囲まれた
部分はシングル−アンカー・ドメインに対応する部分で
ある。分泌型蛋白SF-314M およびSF-314Rの製造に用い
たP-F4R およびP-F4M の核酸配列のN-末端アミノ酸残基
を垂直の矢印で示す。星印はN-グリコシル化が起こりう
る部位 (Asn-X-Ser/Thr)を示す。

【図２】本発明の Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転
移酵素のクローニングのために増幅されたフラグメント
(150 bp)のアミノ酸配列、及び公知の４種のシアル酸転
移酵素のアミノ酸配列の比較を示した図である。図中、
アミノ酸配列は１文字標記で記載してあり、本発明の G
alβ1,3GalNAcα2,3-シアル酸転移酵素のクローニング
のために増幅されたフラグメント(150 bp)のアミノ酸配
列は ST3GalA.2の欄に記載されている。他の４種のシア
ル酸転移酵素は、マウス由来 Galβ1,3 GalNAcα2,3-シ
アル酸転移酵素[ST3GalA.1(mouse): 136-183残基] 、ブ
タ由来 Galβ1,3 GalNAcα2,3-シアル酸転移酵素[ST3Ga
lA.1(pig): 142-189残基] 、ラット由来 Galβ1,3(4) G
lcNAc α2,3-シアル酸転移酵素[ST3GalB(rat): 156-203
残基] 、及びヒトの Galβ1,3 GalNAc/Galβ1,4GlcNAc
α2,3-シアル酸転移酵素[ST3GalC(human): 113-160残
基] である。いずれかの３配列中に保存されているアミ
ノ酸を枠で囲んである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 38/45 ＡＤＴＡＤＵＡＤＹＡ６１Ｋ 37/52 ＡＤＴＡＤＵＡＤＹ (72)発明者李泳春埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者中岡隆志埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者小島直也埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の受容体基質特異性および受容体基
質選択性：受容体基質特異性：２糖類 Galβ1,3GalNAc 、及び末端
に Galβ1,3GalNAc を有する糖脂質または糖蛋白を基質
とする；受容体基質選択性：糖脂質と２糖類との共存下で糖脂質
に対して優先的にシアル酸を取り込ませ、糖脂質の中で
は Gg4>GM1>GD1b の順にシアル酸を取り込ませる；によ
り特徴づけられる Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移
酵素。
【請求項２】配列表の配列番号１に示されるアミノ酸
配列により特定される Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素P-F4M 。
【請求項３】配列表の配列番号２に示されるアミノ酸
配列により特定される Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸
転移酵素P-F4R 。
【請求項４】請求項２または３に記載の Galβ1,3Gal
NAc α2,3-シアル酸転移酵素のアミノ酸配列をコードす
る Galβ1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素遺伝子。
【請求項５】配列表の配列番号１に示される核酸番号
１から1050の核酸または配列表の配列番号２に示される
核酸番号１から1050の核酸を含む請求項４に記載の Gal
β1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素遺伝子。
【請求項６】請求項２に記載の Galβ1,3GalNAc α2,
3-シアル酸転移酵素P-F4M または請求項３に記載の Gal
β1,3GalNAc α2,3-シアル酸転移酵素P-F4R の活性に関
与するポリペプチド部分とシグナルペプチドとを含む細
胞外分泌型の蛋白であって、 Galβ1,3GalNAc α2,3-シ
アル酸転移を触媒する蛋白。
【請求項７】配列表の配列番号３に示されるアミノ酸
配列により特定される請求項６記載の蛋白SF-314M 。
【請求項８】配列表の配列番号４に示されるアミノ酸
配列により特定される請求項６記載の蛋白SF-314R 。
【請求項９】請求項６に記載の蛋白をコードする遺伝
子。
【請求項１０】配列表の配列番号３に示される核酸番
号１から942 の核酸または配列表の配列番号４に示され
る核酸番号１から942 の核酸を含む請求項９に記載の遺
伝子。
【請求項１１】請求項９または10に記載の遺伝子を含
む組み換えベクター。
【請求項１２】プラスミドpcDS930Mまたはプラスミド
pcDS930Rである請求項11に記載のベクター。
【請求項１３】請求項11または12に記載のベクターで
形質転換された形質転換体。
【請求項１４】請求項13に記載の形質転換体を培養
し、培養物から請求項６記載の蛋白を採取することを特
徴とする、請求項６記載の蛋白の製造方法。