JPWO2003083110A1 - 新規ガラクトース転移酵素、そのペプチド及びこれをコードする核酸 - Google Patents

Abstract

９５７ｂｐのＯＲＦからなる新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２、および９４８ｂｐのＯＲＦからなる新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の同定に成功した。該酵素は、コア１糖鎖（ガラクトースβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆された。該酵素やそれらをコードするポリヌクレオチドは、該酵素の発現や機能の異常に起因する疾患に対する好適な治療薬となるものと期待される。

Description

技術分野
本発明は、新規ガラクトース転移酵素、および該酵素をコードするポリヌクレオチド、並びにこれら分子の用途に関する。
背景技術
複合糖質には、糖タンパク質と糖脂質がある。糖タンパク質には、ペプチドの種類と糖の結合様式によってＮ結合型糖鎖（アスパラギン結合型糖鎖）と０結合型糖鎖（ムチン型糖鎖）とプロテオグリカンの３種類に大別される。０結合型糖鎖は、セリンおよびスレオニンにＯ−グリコシド結合を介して糖が転移される。その糖の種類は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が主であるが、フコース（Ｆｕｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）なども転移される。それらの糖がまずペプチドに転移して、さらに様々な糖転移酵素によって０結合型糖鎖が伸長していく。最初に転移される糖がＧａｌＮＡｃの場合、２番目および３番目の糖の種類、結合様式の違いによって、異なるコア構造が形成される。８種類のコア構造の存在が知られており、その構造は図７に示す。コア１構造（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−ペプチド）は、別名Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原とも言われており、生体内のほとんどの組織および細胞で発現している。この抗原はＴｎ抗原（ＧａｌＮＡｃα１−ペプチドやＳＴｎ抗原（シアリルＴｎ抗原（ＮｅｕＡｃα２−６ＧａｌＮＡｃα１−ペプチド））と共に乳癌、膀胱癌、大腸癌などで癌関連糖鎖抗原として有名である。このコア１構造の生合成に必要なコア１β１，３−ガラクトース転移酵素（ＧａｌＮＡｃα１−ペプチドのＧａｌＮＡｃにβ１，３結合でガラクトースを転移する酵素）が、ＩｇＡ腎症やＴｎ症候群などの疾病において何らかの理由で酵素活性低下あるいは欠損している報告が多数存在する。
このようにガラクトース転移酵素の異常は、種々の疾患と関連しており、病因の解明、治療法の開発にとって、ガラクトース転移酵素についての解析が望まれていた。また、新規なガラクトース転移酵素を同定することができれば、さらなる該酵素と疾病との関連性を明らかにできるものと期待される。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規ガラクトース転移酵素を同定することにある。
また、本発明は、このようにして同定された新規ガラクトース転移酵素の用途を提供することをも目的とする。新規ガラクトース転移酵素の好ましい用途の一つの態様として、該酵素の変異や発現異常を指標とした、該酵素に起因する疾患の検査方法を提供する。さらに、該酵素の活性を指標とすることにより、該酵素に起因する疾患の治療のための候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するため、まず、既知のガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１をクエリーとして公共のデータベース検索を行い、ヒットしたＤＮＡ配列を基に、ｃＤＮＡライブラリーからの新規ガラクトース転移酵素のクローニングを試みた。サンプルとして常法（Ｙｕｚｕｒｕ Ｉｋｅｈａｒａ，Ｈｉｓａｓｈｉ Ｎａｒｉｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．９ ｎｏ．１１ ｐｐ．１２１３−１２２４，１９９９）により作製したヒト大腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５ｃＤＮＡライブラリーを用いた。スクリーニング手法はラジオアイソトープを使用した一般的な核酸プローブによる方法を用いた。
プローブとハイブリダイゼーションする単一のプラークを拾い、ファージを回収した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターに挿入されたｃＤＮＡクローンとして調製した。次いで、該ｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。該ｃＤＮＡは、９５７ｂｐのＯＲＦからなり、３１８アミノ酸をコードすることが判明した。該ＯＲＦによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列とクエリーに使用したＣ１Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列は、３０％未満のホモロジーしか持たず、本発明者らはこのタンパク質を「Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２」と名付けた。アミノ酸配列の解析から、ほとんどの糖転移酵素に見られる典型的な２型の膜タンパク質であることが示唆された。
また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の受容体基質の探索を行ったところ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃに対し強い反応が示され、ｐＮｐ−β−ＧａｌＮＡｃに対し反応しないことから、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２はコア１糖鎖（ガラクトースβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆された。
さらに本発明者らはガラクトースとＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒとの結合様式について解析を行った結果、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２は、細胞内においてもＣｏｒｅ１合成酵素であることが示された。
また本発明者らは、コア１合成酵素を持たない細胞株（ＬＳＣおよびＪｕｒｋａｔ）を用いて、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１および本発明者らによって見出されたＣ１Ｇａｌ−Ｔ２について遺伝子発現解析を行った。その結果、ＬＳＣおよびＪｕｒｋａｔ細胞株では、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２が不活性型であるために、コア１合成活性を示さないことが判明した。また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１はｍＲＮＡの発現があるにもかかわらず酵素活性を検出できなかったことから、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２がより比活性の強いコア１合成酵素であることが示唆された。
さらに本発明者らは、同定されたＣ１Ｇａｌ−Ｔ２をクエリーにしてデータベース検索を行い、アミノ酸配列レベルで約６８％の相同性を有するタンパク質を見出した。該タンパク質をコードする遺伝子は、これまでのところ、そのゲノム配列情報しか知られていない。本発明者らはこの配列をＣ１Ｇａｌ−Ｔ３と名付けた。そして本発明者らは、このＣ１Ｇａｌ−Ｔ３がガラクトース転移酵素活性を有することを見出した。
上記の如く本発明者らは、新規なガラクトース転移酵素（ガラクトース転移活性を有するタンパク質）Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２およびＣ１Ｇａｌ−Ｔ３を同定することに成功し、本発明を完成させた。ガラクトース転移酵素は、生体内で重要な機能を有すると考えられ、その発現や機能の異常は、種々の疾患の原因となり得る。このため、同定されたガラクトース転移酵素の活性または発現を指標とすることにより、このような疾患の検査を行うことも可能である。同定された新規ガラクトース転移酵素やそれらをコードするポリヌクレオチドは、これら疾患に対する好適な治療薬となるものと期待される。
本発明は、新規なガラクトース転移酵素およびその遺伝子、並びにそれらの製造及び用途に関し、より詳しくは、
〔１〕 下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド、
（ａ）配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号：１または１８に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
〔２〕 ガラクトース転移活性を有する、下記（ｃ）または（ｄ）に記載のポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号：１または１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
〔３〕 配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、
〔４〕 〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
〔５〕 〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは〔４〕に記載のベクターを保持する宿主細胞、
〔６〕 〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
〔７〕 〔５〕に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、〔６〕に記載のポリペプチドの製造方法、
〔８〕 〔６〕に記載のポリペプチドに結合する抗体、
〔９〕 〔６〕に記載のポリペプチドの活性または発現を増加させる必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物、
（ａ）〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド
（ｂ）〔４〕に記載のベクター
（ｃ）〔６〕に記載のポリペプチド
〔１０〕 〔６〕に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物、
（ａ）〔８〕に記載の抗体
（ｂ）生体内において、内因性の〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド
〔１１〕 〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または〔６〕に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被験化合物と〔６〕に記載のポリペプチドとを接触させる工程、
（ｂ）〔６〕に記載のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を測定する工程、
（ｃ）被験化合物を接触させない場合と比較して、ガラクトース転移酵素活性を変化させる化合物を選択する工程、を含む方法、
〔１２〕 〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または〔６〕に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法であって、被検者における該遺伝子またはその発現制御領域の変異を検出することを含む方法、
〔１３〕 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を単離する工程
（ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
（ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程、
〔１４〕 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
（ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１５〕 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
（ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
（ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
〔１６〕 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
（ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
（ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１７〕 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
（ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
（ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
〔１８〕 〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常に関連した疾患の検査方法であって、被検者における該遺伝子の発現量を検出することを含む方法、
〔１９〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１８〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
〔２０〕 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、〔１８〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者から調製したｃＤＮＡ試料、および〔５〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる工程
（ｃ）該ｃＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれる〔５〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する工程
（ｄ）測定された〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を対照と比較する工程
〔２１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１８〕に記載の検査方法、
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれる〔６〕に記載のポリペプチドの量を測定する工程
（ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
〔２２〕 疾患がＩｇＡ腎症またはＴｎ症候群である、〔１２〕〜〔２１〕のいずれかに記載の検査方法、
〔２３〕 〔６〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド、
〔２４〕 〔２３〕に記載のオリゴヌクレオチドを含む、〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または〔６〕に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬、
〔２５〕 〔８〕に記載の抗体を含む、〔６〕に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または〔６〕に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬、
〔２６〕 疾患がＩｇＡ腎症またはＴｎ症候群である、〔２４〕または〔２５〕に記載の検査薬、
〔２７〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の発現が人為的に改変された遺伝子改変非ヒト動物、
〔２８〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変非ヒト動物、
〔２９〕 非ヒト動物がマウスである、〔２７〕または〔２８〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物、
〔３０〕 〔２７〕〜〔２９〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物から樹立された細胞、
〔３１〕 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ａ）〔２７〕〜〔２９〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物に被検化合物を投与する、または、〔３０〕に記載の細胞と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記遺伝子改変動物もしくは細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を変化させる化合物を選択する工程、を提供するものである。
以下に本明細書に規定された用語の定義を示すが、これらは、本明細書中で使用される用語は理解を容易にする目的で記載されたものであり、本発明を限定する目的で用いられるべきではないことは理解されたい。
本明細書において「ガラクトース転移酵素」とは、ＵＤＰガラクトースを供与体として、ガラクトースを糖、スフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、ヒドロキシリシン等のヒドロキシル基に転移させる酵素を指す。本発明のガラクトース転移酵素とは、通常、ガラクトース転移活性を有するタンパク質を指す。この「ガラクトース転移活性を有する」には、そのタンパク質自体がガラクトース転移活性を有する場合はもちろん、該タンパク質自体が該活性を有さない場合であっても、該タンパク質が他のタンパク質と相互作用をし（例えば、複合体を形成し）、その結果、これらのタンパク質（複合体）がガラクトース転移活性を示す場合も含まれる。
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドであって、複数の塩基または塩基対からなる重合体を意味する。ポリヌクレオチドには、一本鎖型および二本鎖型のＤＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾された塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。
本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよびタンパク質もまた、ポリペプチドの概念に含まれる。ポリペプチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
本明細書において「単離」とは、本来の環境（たとえば自然に発生するのであればその自然環境）から取り出された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指し、その自然状態から「人の手によって」変えられたものである。「単離」とは、対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物および／または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、および最も好ましくは９０％含まない化合物（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）を指す。
本明細書において用いられる「変異」とは、アミノ酸配列におけるアミノ酸の変化または塩基配列における塩基の変化（すなわち単一または複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換、欠失、付加または挿入）を指す。従って、本明細書において用いられる「変異体」は、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列または一つ以上の塩基が変化している塩基配列を指す。この変異体の塩基配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的変化を有しうる。まれに、変異体は、非保存的置換を有しうる。生物学的または免疫学的活性を阻害することなく、いずれの、およびどれほど多くのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡスター・ソフトウェアを用いて発見することができる。
「欠失」はその中で１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在するガラクトース転移酵素またはガラクトース転移酵素関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化である。
「挿入」または「付加」は、天然に存在するガラクトース転移酵素またはガラクトース転移酵素関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれアミノ酸またなヌクレオチド残基１つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
「置換」とは、天然に存在するガラクトース転移酵素またはガラクトース転移酵素関連ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸またはヌクレオチド１つ以上がそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに入れ替えられたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
本明細書において用いられる「ハイブリダイズ」とは、核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と結合するプロセスを意味する。
本明細書で用いられる「治療」とは、概して、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書で用いられる「治療」という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患の素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させることなどもこの用語に含まれる。
＜ポリペプチド＞
本発明は、ガラクトース転移酵素をコードする新規なポリペプチドを提供する。本発明に含まれる、本発明者らにより同定された新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：１に、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２に示す。また、本発明者らにより同定された新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号：１８に、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号：１９に示す。
本発明は、また、本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを提供する。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが本発明者らにより同定されたポリペプチドと同等の生物学的特性を有していることを意味する。ガラクトース転移酵素が持つ生物学的特性としては、ガラクトースを糖、スフィンゴシン、セラミド、ジアシルグリセロール、ヒドロキシリシン等のヒドロキシル基に転移させる活性（ガラクトース転移酵素活性）が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、ＧａｌＮＡｃα１−ペプチドのＧａｌＮＡｃにβ１，３結合でガラクトースを転移させる酵素活性（コア１β１，３−ガラクトース転移酵素活性）を例示することができる。
従って、対象となるポリペプチドが本発明者らにより同定されたポリペプチドと同等の生物学的特性を有しているか否かの判定は、当業者においては周知の方法によってガラクトース転移酵素活性を測定することにより行うことができる。例えば、放射線同位元素で標識したＵＤＰ−Ｇａｌを糖供与体基質として、生成物に取り込まれる放射線の量を測定することにより行うことができる。より具体的には、後述の実施例に記載された方法により、ガラクトース転移酵素活性を測定することができる。
本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための方法の１つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる。このような方法には、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５））が含まれる。また、ポリペプチド中のアミノ酸の変異は、自然界において生じることもある。本発明には、このように人工的か自然に生じたものかを問わず、本発明者らにより同定されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２または１９）において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などにより変異したタンパク質であって、本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドが含まれる。
置換されるアミノ酸は、タンパク質の機能の保持の観点から、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
これらポリペプチドにおけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内であると考えられる。
本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｈｏｎ Ｗｉｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）を利用して本発明者らにより同定されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または１８）またはその一部をもとに同種または異種生物由来のＤＮＡ試料から、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを得ることは、通常行いうることである。このように本発明者らにより同定されたポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるポリペプチドであって、本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドもまた本発明のポリペプチドに含まれる。
このようなポリペプチドを単離するための生物としては、ヒト以外に、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに制限されない。
本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるＤＮＡがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは少なくとも９５％以上、さらに好ましくは少なくとも９７％以上（例えば、９８〜９９％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
また、遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）を用いて本発明者らにより同定されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号：１または１８）の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定されたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と相同性の高いＤＮＡ断片を単離し、該ＤＮＡを基に本発明者らにより同定されたポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを得ることも可能である。
本発明のポリペプチドは「成熟」タンパク質の形であっても、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。本発明のポリペプチドには、分泌すなわちリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれていてもよい。
＜ポリペプチドの断片＞
本発明は、また、本発明のポリペプチドの断片を提供する。こうした断片は全体的に前記本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチド断片は、通常、８アミノ酸残基以上、好ましくは１２アミノ酸残基以上（例えば、１５アミノ酸残基以上）の配列からなるポリペプチド断片である。好適な断片としては、例えば、アミノ末端を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連の残基の欠失、またはアミノ末端を含む一連の残基とカルボキシル末端を含む一連の残基の二連の残基の欠失したアミノ酸配列を有するトランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減少した断片を含めて、本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片も含まれる。これらのポリペプチド断片は、抗原活性を含めた本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持することが好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は同類アミス酸置換により対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されているものである。典型的なこうした置換は、Ａｌａ，Ｖａｌ，ＬｅｕとＩｌｅの間、ＳｅｒとＴｈｒの間、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの間、ＡｓｎとＧｌｎの間、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの間、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で起こる。
＜ポリペプチドの製造＞
本発明のポリペプチドは任意の適当な方法で製造することができる。このようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせにより製造されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。組み換え的なポリペプチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現したポリペプチドを精製することにより調製することが可能である。一方、天然由来のポリペプチドは、例えば、後述する本発明のポリペプチドに対する抗体を結合したアフィニティーカラムを利用して調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ １６．１−１６．１９）。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、インビトロトランスレーション（例えば、「Ｏｎ ｔｈｅ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｄａｓｓｏ，Ｍ．Ｃ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８９）ＮＡＲ １７：３１２９−３１４４」参照）などにより本発明のポリペプチドを調製することも可能である。本発明のポリペプチドの断片は、例えば、本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
＜ポリヌクレオチド＞
本発明は、また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１または１８に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、遺伝コードの縮重により配列番号：１または１８に記載の塩基配列と異なる塩基配列からなるが配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。本発明のポリヌクレオチドには、さらに、これらポリヌクレオチドがコードするポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードし、該ポリヌクレオチドの配列とその全長において少なくとも４０％以上、好ましくは６０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上（例えば、９８〜９９％）同一である塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。塩基配列の同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８，１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。本発明のポリヌクレオチドには、上記のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリーニングにより、例えば、細胞中のｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列（配列番号：１または１８）と有意な相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーション技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．３−６．４）や遺伝子増幅技術（ＰＣＲ）（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ６．１−６．４）を利用して調製することができる。即ち、ハイブリダイゼーション技術を利用して、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列（配列番号：１または１８）またはその一部をもとに同種または異種生物由来のＤＮＡ試料から、これと相同性の高いＤＮＡを単離することができる。また、遺伝子増幅技術を用いて、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列（配列番号：１または１８）の一部を基にプライマーを設計し、該ポリヌクレオチドの配列と相同性の高いポリヌクレオチドを単離することができる。従って、本発明には、配列番号：１または１８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、通常「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明者らにより同定されたポリヌクレオチドの配列と有意な相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号：１または１８に記載の塩基配列に変異を導入する方法（例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．１−８．５））を利用して調製することもできる。また、このようなポリヌクレオチドは、自然界における変異により生じることもある。本発明には、このような塩基配列の変異により、配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などされたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌクレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもしくは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードするもの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペプチドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例として、マーカー配列は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により提供されかつＧｅｎｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に記載されるようなヘキサ−ヒスチジンペプチド、またはＭｙｃタグである。また、このポリヌクレオチドは５’および３’非コード配列、例えば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
＜プローブ・プライマー・アンチセンス・リボザイム＞
本発明は、本発明者らにより同定されたポリヌクレオチド（配列番号：１もしくは１８に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖）に相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するヌクレオチドを提供する。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ただしＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖核酸の一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。このようなヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出、単離するためのプローブとして、また、本発明のヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することが可能である。プライマーとして用いる場合には、通常、１５〜１００ヌクレオチド、好ましくは１５〜３５ヌクレオチドの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、本発明のＤＮＡの少なくとも一部若しくは全部の配列を含む少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの鎖長のヌクレオチドが用いられる。このようなヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で、本発明者らにより同定されたヌクレオチド（配列番号：１または１８）とハイブリダイズし、他のポリペプチドをコードするＤＮＡとはハイブリダイズしないことを意味する。
これらヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの活性の異常や該ポリペチドをコードする遺伝子の発現の異常を検査・診断するために利用できる。
また、これらヌクレオチドには、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドが含まれる。このようなポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ；本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡ、および該ＲＮＡをコードするＤＮＡ）やリボザイム（本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ）が含まれる。
アンチセンスポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，ｐｐ．３１９−３４７，１９９３）。
本発明で用いられるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むポリヌクレオチドも、本発明で利用されるアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。使用されるアンチセンスポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。アンチセンスポリヌクレオチドの配列は、標的遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスポリヌクレオチドは、アンチセンス効果を引き起こすために、少なくとも１５ヌクレオチド以上、好ましくは１００ヌクレオチド、さらに好ましくは５００ヌクレオチド以上の鎖長を有し、通常、３０００ヌクレオチド以内、好ましくは２０００ヌクレオチド以内の鎖長を有する。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドには、本発明のポリペプチドの異常（機能異常や発現異常）などに起因した疾患の遺伝子治療への応用も考えられる。
シアリルルイスＸ糖鎖およびシアリル６スルホルイスＸ糖鎖は、接着分子セレクチン分子のリガンドであり、リンパ球のホーミング現象、炎症局所での白血球の血管外遊走のための血管内皮細胞への接着、癌細胞の血行性転移に関与していると言われている。これらの糖鎖抗原は、糖タンパク質および糖脂質両方に存在しており、糖タンパク質上でもＮ−結合型、Ｏ−結合型の両方に存在する。Ｏ−結合型糖鎖の場合、主にＣｏｒｅ１構造から糖鎖の伸長、分岐が生じて、非還元末端側にシアリルルイスＸおよびシアリル６スルホルイスＸ糖鎖が存在する。よって、Ｃｏｒｅ１構造の合成の阻害することにより、これらの糖鎖抗原の発現を抑制できる可能性がある。すなわちＣｏｒｅ１合成酵素（Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ）の活性または発現を抑制することにより、抗癌作用もしくは抗炎症作用が期待される。例えば、本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２またはＣ１Ｇａｌ−Ｔ３に対するアンチセンスポリヌクレオチドは、酵素活性阻害剤として、抗炎症作用および血行性転移の抑制に使用できる可能性がある。該アンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号：１または１８）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Ｓｔｅｉｎ，１９８８ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６，３２０９−２１（１９８８））などにより調製することが可能である。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，（１９９０）蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８：２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３９：２８５、小泉誠および大塚栄子，（１９９０）蛋白質核酸酵素，３５：２１９１、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉら，（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７０５９）。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４９，１９８６）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｙ．ＫｉｋｕｃｈｉおよびＮ．Ｓａｓａｋｉ（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：６７５１、菊池洋，（１９９２）化学と生物３０：１１２）。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドは、遺伝子治療に用いる場合には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを利用して、ｅｘ ｖｉｖｏ法やｉｎ ｖｉｖｏ法などにより患者へ投与を行うことが考えられる。
また、最近の研究により、炎症に伴って血小板表面に出現する接着分子のＰ−セレクチンと結合する、新規の糖オリゴペプチドＧＳＰ−６が見出された（Ｌｅｐｐａｎｅｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４８３８−２４８４８，１９９９）。ＧＳＰ−６は、リンパ球のＰ−セレクチンへの接触を阻害する。従ってＧＳＰ−６は、セレクチンが関与する炎症反応、または癌細胞の血行性転移等を抑制する機能を有するものと考えられる。ＧＳＰ−６は、抗炎症剤および抗癌剤等の開発にとって有用な分子と言える。このＧＳＰ−６の合成には、コア１糖鎖の合成酵素が必要であることから、本発明のポリペプチドは、細胞接着を阻害する糖オリゴペプチドＧＳＰ−６の合成に利用できるものと考えられ、大いに有用である。
内因性遺伝子の発現の阻害は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒａｎｃｅ；ＲＮＡｉ）によっても行うことができる。ＲＮＡｉとは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも阻害される現象のことを指す。ＲＮＡｉの機構の詳細は明らかではないが、最初に導入した二本鎖ＲＮＡが小片に分解され、何らかの形で標的遺伝子の指標となることにより、標的遺伝子が分解されると考えられている。ＲＮＡｉに用いるＲＮＡは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。また、二重鎖ＲＮＡを細胞内で合成し得るＤＮＡ分子を導入することもできる。
＜ベクター、宿主細胞、ポリペプチドの製造＞
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター、本発明のポリヌクレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を利用した本発明のポリペプチドの生産方法を提供する。
本発明のベクターとしては、挿入したＤＮＡを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などが好ましい。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればｐＢＥＳＴベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、培養細胞であればｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）、生物個体であればｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８））などが好ましい。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ １１．４−１１．１１）。
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳＦ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ ９．１−９．９）、リポフェクタミン法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
本発明のポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
＜検査方法＞
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法を提供する。ガラクトース転移酵素は、生体内で重要な機能を有すると考えられ、その発現や機能の異常は、種々の疾患の原因となり得る。従って、本発明のポリペプチドの不適当な活性または発現を指標とすることにより、このような疾患の検査を行うことも可能である。
本発明において「疾患の検査」とは、疾患の症状を呈している被検者の治療戦略を立てるための検査のみならず、被検者が疾患にかかりやすいか否かを判断するために行う予防のための検査、または既に罹患しているか否かの検査も含まれる。
最近の研究から、ＩｇＡ腎症やＴｎ症候群などの疾病において、ガラクトース転移酵素活性が低下あるいは欠損しているとの報告が多数なされている。従って、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発明のポリペプチドの活性の異常によって、例えば、ＩｇＡ腎症、Ｔｎ症候群等の疾患が引き起こされることも十分考えられる。本発明において、「本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患」とは、例えば、ＩｇＡ腎症、Ｔｎ症候群等を例示することができる。
本発明の検査方法の一つの態様は、被検者における本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域における変異を検出することを含む方法である。
一つの方法は、被検者における本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域の塩基配列を直接決定することによって検査を行う方法である。この方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料は、被検者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から抽出した染色体ＤＮＡあるいはＲＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えば染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターにクローニングして、ゲノムライブラリーを作製すればよい。ＲＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えば、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製すればよい。本方法においては、次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプローブを用いて、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをすることにより行うことができる。また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲによって単離することもできる。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。選択したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における「対照」とは、正常な（野生型の）本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡの塩基配列を言う。このような比較の結果、被検者のＤＮＡの塩基配列が対照と異なっていた場合には、被検者は、疾患に罹患しているまたは発症の危険があると判定される。
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、種々の方法を用いることができる。
その一つの方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡにし、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
別の方法は、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
このような方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｏｎｙｍｏｕｓ Ａｌｕ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １１．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９２ Ｊａｎ １；１２（１）：１３９−１４６．、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９１ Ａｕｇ １；６（８）：１３１３−１３１８．）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡが異なる位置に移動する。一塩基の置換によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
具体的には、まず、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識されたＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５から１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０から２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４から３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
さらに別の方法は、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
上記の方法以外にも、特定位置の変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだ対照ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
本発明の検査方法の他の態様は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を検出することを含む方法である。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳が含まれる。従って、「発現産物」には、ｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写レベルにおける検査法においては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定された本発明のポリペプチドをコードＲＮＡの量を対照と比較する。
このような方法としては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いたノーザンブロッティング法、または本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法等を例示することができる。
また、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写レベルにおける検査においては、ＤＮＡアレイ（新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅、羊土社、ｐ２８０−２８４）を利用することもできる。具体的には、まず、被検者から調製したｃＤＮＡ試料、および本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する。基板に固定されるポリヌクレオチドプローブは、複数種の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するために、複数種であってもよい。被検者からのｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞から全ＲＮＡの抽出を行う。細胞としては、例えば血液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料の細胞などが例示できる。全ＲＮＡの抽出は、例えば次のようにして行うことができる。純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社”ＲＮＡ ｌａｔｅｒ”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Ｉｓｏｇｅｎ”を用いて全ＲＮＡの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法（Ｌ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄａｄｊａｃｅｎｔ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）で実施することができる。
本発明において「基板」とは、ポリヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意味する。本発明の基板は、ポリヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる。
ＤＮＡアレイ技術の利点は、ハイブリダイゼーションの溶液量が非常に少なく、固定されたヌクレオチドプローブに、細胞の全ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを含む非常に複雑なターゲットをハイブリダイズすることができることである。一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（ｎｏｎ−ｐｏｒｏｕｓ）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（ｐｏｒｏｕｓ）の膜、例えばニトロセルロースメンブレムを使用しすることができる。ヌクレオチドの固定（アレイ）には２つのタイプがあり、一つはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社開発によるポリヌクレオチドを基本としたアレイであり、もう一つは主としてＳｔａｎｆｏｒｄ大学で開発されたｃＤＮＡのアレイである。ポリヌクレオチドのアレイにおいて、ポリヌクレオチドは通常インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で合成される。例えば、ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｃの技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Ｒｏｓｅｔｔａ Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ社）技術等によるポリヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。基板に固定するポリヌクレオチドプローブは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子と特異的にハイブリダイズするものであれば特に制限はない。本発明のポリヌクレオチドプローブには、ポリヌクレオチド、またはｃＤＮＡが含まれる。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと実質的にハイブリダイズし、それ以外のポリヌクレオチドとは実質的にハイブリダイズしないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ポリヌクレオチドプローブは、検出の対象となるポリヌクレオチドの塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。基板に結合するポリヌクレオチドプローブの長さは、通常ｃＤＮＡを固定する場合１００〜４０００ベースであり、好ましくは２００〜４０００ベースであり、さらに好ましくは５００〜４０００ベースである。合成ポリヌクレオチドを固定する場合は、通常１５〜５００ベースであり、好ましくは３０〜２００ベースであり、さらに好ましくは５０〜２００ベースである。基板へのポリヌクレオチドの固定の工程は、一般に「プリント」とも呼ばれる。具体的には、例えば以下ようにプリントすることができるが、これに限定されるものではない。数種のポリヌクレオチドプローブを４．５ｍｍ ｘ４．５ｍｍの一つの領域内にプリントする。その際、それぞれのアレイをプリントするのには一つのピンを用いて行うことが可能である。従って４８ピンのツールを用いた場合、４８回の繰り返したアレイを一つの標準的な顕微鏡用スライドにプリントすることが可能である。
本方法においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な基板上のヌクレオチドプローブに対し、ｃＤＮＡ試料をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
本方法においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する。さらに、測定された本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を対照と比較する。
本発明においては、ｃＤＮＡ試料中に本発明のポリペプチドをコードする遺伝子由来のｃＤＮＡが存在する場合、基板に固定されたヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとがハイブリダイズする。従って、ポリヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度を検出することにより、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定することができる。ポリヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明の方法においては、被検者および対照（健常者）由来のｃＤＮＡ試料について、異なる蛍光物質で標識を施すことにより、１回の測定でそれぞれにおける本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を同時に測定することができる。例えば、上記それぞれのｃＤＮＡ試料の一方を蛍光物質であるＣｙ５で、他方をＣｙ３で標識することができる。それぞれの蛍光シグナルの相対強度は、被検者および対照での本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量に応じた相対量を示す（Ｄｕｇｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１０−１４，１９９９）。
一方、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の翻訳レベルにおける検査においては、まず、被検者からポリペプチド試料を調製する。次いで、該ポリペプチド試料に含まれる本発明のポリペプチドの量を測定する。次いで、測定された本発明のポリペプチドの量を対照と比較する。
このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びに本発明のポリペプチドに結合する抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。
上記の方法において、対照と比較して、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量が有意に変化していた場合、被検者は、該遺伝子の発現異常に関連した疾患を罹患している、または該疾患を発症する危険を有すると判定される。
＜検査薬＞
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬を提供する。
その一つの態様は、上記した本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその発現制御領域を含むＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬である。該オリゴヌクレオチドは、上記本発明の検査方法において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を検出するためのプローブとして、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子またはその発現制御領域を増幅するためのプライマーとして用いることができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得されるの二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
本発明の検査薬の他の一つの態様は、後述する本発明のポリペプチドに結合する抗体を含む検査薬である。該抗体は、上記の本発明の検査方法において、本発明のポリペプチドを検出するために用いられる。抗体は、本発明のポリペプチドを検出可能であればその形態に制限はない。検査のための抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体は必要に応じて標識されていてもよい。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
＜抗体＞
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。
本発明のポリペプチドに結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。本発明のポリペプチドあるいはそのＧＳＴとの融合タンパク質をウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、本発明のポリペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、同定、および精製に利用することができる。本発明のポリペプチドに結合する抗体は、本発明のポリペプチドの活性または発現を抑制するものと考えられることから、該抗体を有効量含む組成物は、本発明のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物となるものと期待される。また、該抗体は、本発明のポリペプチドの発現異常に関連した疾患の検査において、本発明のポリペプチドの発現量を測定するために用いることもできる。
＜治療薬候補化合物の同定＞
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの発現異常に関連した疾患の治療薬候補化合物のスクリーニングにおいて使用することができる。同定の対象となるこれら分子は、天然由来であっても、人工的に合成された構造的または機能的な模擬物であってもよい。本発明のポリペプチドは多くの病理を含めて多数の生物学的機能に関与している。従って、本発明のポリペプチドを活性化する化合物および本発明のポリペプチドの活性化を阻害し得る化合物を発見することが望まれる。
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または本発明のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供する。本方法においては、まず、本発明のポリペプチドと候補化合物とを接触させ、次いで、本発明のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を測定する。そして、被験化合物を接触させない場合と比較して、ガラクトース転移酵素活性を変化させる（増加または抑制させる）化合物を選択する。
本発明の上記スクリーニング方法により本発明のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を増加させる化合物として単離される化合物は、例えば、ＩｇＡ腎症、またはＴｎ症候群等の疾患に対する治療薬として有用である。一方、本発明のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を抑制させる化合物として単離される化合物は、酵素活性阻害剤として、例えば、抗炎症剤、または抗癌剤として有用である。さらに、本発明のポリペプチドを結晶化することによりドラッグデザインされた化合物は、酵素活性阻害剤として使用することも可能である。また、該化合物は被験化合物として、本発明の上記スクリーニング方法に供することもできる。
ガラクトース転移酵素活性の測定は、例えば、上述の方法により行うことができる。被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、種々の公知化合物やペプチド（例えば、ケミカルファイルに登録されているもの）あるいはファージ・ディスプレイ法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）２２２，３０１−３１０）などを応用して作成されたランダム・ペプチド群を用いることができる。また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などもスクリーニングの対象となる。その他、脳をはじめとする生体組織抽出物、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物などが挙げられるが、これらに制限されない。
＜疾患の治療のための医薬組成物＞
本発明は、本発明のポリペプチドの活性または発現を増加または抑制させる必要がある患者を治療するための医薬組成物を提供する。
本発明のポリペプチドの活性または発現を増加させるための、医薬組成物の有効成分としては、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、本発明のポリペプチドを用いることができる。一方、本発明のポリペプチドの活性または発現を抑制させるための医薬組成物の有効成分としては、本発明のポリペプチドに対する抗体、または生体内において内因性の本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを用いることができる。該ポリヌクレオチドとしては、上記したアンチセンスポリヌクレオチドやリボザイムが含まれる。
治療用化合物を医薬品として用いる場合には、該化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化した医薬組成物として投与を行うことも可能である。例えば、薬理学上許容しうる担体（賦形剤、結合剤、崩壊剤、矯味剤、矯臭剤、乳化剤、希釈剤、溶解補助剤等）と混合して得られる医薬組成物または錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、液剤、乳剤、懸濁剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、眼軟膏等の製剤として経口または非経口に適した形態で処方される。
患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。
遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなどを例示することができる。該ベクターを利用して、ｅｘ ｖｉｖｏ法やｉｎ ｖｉｖｏ法などにより患者へ目的のＤＮＡの投与を行うことができる。
＜遺伝子改変動物＞
本発明は、本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の発現が人為的に改変された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
上記Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに必ずしも限定されず、遺伝子を改変される動物が内在的に有する該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド、あるいは該動物についてのホモログタンパク質等も含まれる。
本発明において、「Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現が人為的に改変された」とは、通常、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする遺伝子上に、ヌクレオチドの付加、挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有することにより該遺伝子の発現量が変化した状態、該Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子のコピー数が変化した状態、あるいは、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードする外来性のＤＮＡが導入された状態等を指す。例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物、あるいは、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の遺伝子改変非ヒト動物に含まれる。遺伝子変異が存在する部位は、該遺伝子の発現が改変され得る部位であれば特に制限されず、例えばエキソン部位、プロモーター部位等を挙げることができる。
また、正常なＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質としての機能が亢進あるいは低下している変異Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質が発現している場合も、このＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現の「改変」に含まれる。通常、遺伝子の発現制御領域、例えばプロモーター部位に変異を有すると、遺伝子の発現が亢進する場合があることが知られている。従って、本発明の「改変」の一つの態様としては、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現制御領域が、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現が亢進するように変異が導入された状態を示すことができる。
また、本発明は、内因性のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現が亢進した非ヒト動物以外に、例えば、発現可能な状態のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする外来ＤＮＡが導入された非ヒト動物を好適に示すことができる。即ち、本発明の好ましい態様においては、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする外来ＤＮＡが導入された遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、例えば、ＩｇＡ腎症、またはＴｎ症候群等の疾患のための治療薬のスクリーニング方法に利用することが可能であり、非常に有用である。
本方法における「非ヒト動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いて遺伝子の発現を人為的に改変するのに適した非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）であり、最も好ましくはマウスである。
遺伝子改変動物の作製方法は公知である。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３８０−７３８４（１９８０）に記載の方法により、遺伝子改変動物を得ることができる。
例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする外来ＤＮＡが導入された遺伝子改変非ヒト動物（トランスジェニック動物）を作製する場合には、まず、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡを動物の全能細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させる。得られた個体のうち、体細胞および生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とする遺伝子改変動物を作製することができる。遺伝子を導入する全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞などが挙げられる。当業者においては、公知の方法を適宜改変して、所望の遺伝子の発現が改変された遺伝子改変動物を作製することが可能である。
上記の「Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡ」は、該ＤＮＡを導入すべき動物の細胞において発現可能なプロモーターに連結した組み換え遺伝子コンストラクト（発現ベクター）とするのが一般的である。本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、適当な宿主を利用してクローニング可能なベクターに、前記Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡと、その上流にプロモーターとを挿入し、クローニングすることによって構築することができる。
本発明に利用することができるプロモーターとしては、動物細胞で発現可能なプロモーターであれば特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞由来のプロモーターや、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーターを挙げることができる。例えば、ＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）２７７，１０８）に従って、上記コンストラクトを作製することができる。
また、本発明に使用可能なベクターとしては、好ましくは、ＣＡＧベクター（例えば、ｐＣＡＧＧＳ）を挙げることができる。このベクター以外でも、導入遺伝子を動物の生体内で広範囲に発現誘導でき得るものであればよく、当業者において周知の発現ベクターを利用することができる。具体的には、ｐＣＡＧＧＳ以外では、ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ（ｈＥＦ１α）のプロモーター（Ｈａｎａｏｋａ Ｋ ｅｔ ａｌ．：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １９９１；４８：１８３−１８９）やＣＭＶのプロモーター−エンハンサーを有するベクター（Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｅ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０：１０：４４０６−４４１１）等を好適に用いることができる。
また、ＣＭＶに由来するエンハンサーは、哺乳動物における外来遺伝子の発現を増強することが知られている。従って本発明の上記コンストラクトには、外来遺伝子の発現を増強するために、エンハンサーを組み合わせることができる。
これらの遺伝子から構成される組み換え遺伝子コンストラクトの構築にあたり、エンハンサーとプロモーターを備え、さらにその下流に外来遺伝子挿入用のマルチクローニングサイトを配置したベクターを用いることができる。このような構造を持つベクターは、たとえばｐＣＡＧＧＳ等をもとに構築することができる。
適当な制限酵素によって前記ベクターから切り出した組み換え遺伝子コンストラクトは、十分に精製され遺伝子改変動物の作製に用いられる。通常、遺伝子改変動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに、前記コンストラクトを導入することによって作製される。コンストラクトを導入する細胞としては、通常、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、より具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、通常８細胞期以前のものが利用される。上記コンストラクトの導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等が公知である。さらに、こうして得られた形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることにより遺伝子改変動物を作製することも可能である。
上記コンストラクトを導入する細胞は、遺伝子改変動物の作製が可能なあらゆる非ヒト動物に由来する細胞であることができる。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、あるいはネコ等の細胞を利用することができる。マウスの場合、例えば、排卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。マウス受精卵では、一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入される。コンストラクトを導入した細胞は、体外での培養の後、導入に成功したと思われる細胞が代理母の卵管に移植され、遺伝子改変キメラ動物が誕生する。代理母には、通常、精管を切断したオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが利用される。
生まれた遺伝子改変キメラ動物は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡが組み込まれていることを確認した上で、Ｆ１動物の誕生のために正常な動物と交配させる。一般にコンストラクトとして導入した外来ＤＮＡは、ゲノムの同一の部分に複数コピーが直列に組み込まれる。通常はこの組み込みコピー数が多いほど、多量の遺伝子発現につながり、より明瞭な表現型が期待できるためである。体細胞ゲノムにおいて、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡが正しい方向で組み込まれていることは、コンストラクトに特異的なプライマーを用いたＰＣＲや特異的なプローブを用いたサザンブロット法によって確認することができる。
この交配の結果誕生するＦ１動物の中で、体細胞に外来遺伝子（Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡ）を有するもの（ヘテロザイゴート）は、生殖細胞に外来遺伝子（Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡ）を伝えることができる遺伝子改変動物である。Ｆ１動物の中から体細胞に外来遺伝子（Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２をコードするＤＮＡ）を保持するものを選び、これらを両親とすることによって、Ｆ２動物であるホモザイゴートを得ることができる。
本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子改変動物は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の発現が改変されたものであれば、上記の遺伝子改変動物のいずれの世代の動物であってもよい。例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の外来ＤＮＡをヘテロで保持する遺伝子改変物であってもよい。
また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現を人為的に抑制する手段としては、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子全体またはその一部を欠損させる方法やＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現制御領域の全部またはその一部を欠損させる方法等を例示することができるが、好ましくはＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の一方または双方に外来遺伝子を挿入することによりＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子を不活性化する方法である。
本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現が人為的抑制された動物、例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子ノックアウト動物は、当業者においては一般的に公知の遺伝子工学技術により作製することができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを例にとって説明すると、以下のようにして本発明のノックアウトマウスを作製することができる。まず、マウスからＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子のエクソン部分を含むＤＮＡを単離し、このＤＮＡ断片に適当なマーカー遺伝子を挿入し、ターゲッティングベクターを構築する。このターゲッティングベクターをエレクトロポレーション法などによりマウスのＥＳ細胞株に導入し、相同組み換えを生じた細胞株を選抜する。挿入するマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入した場合には、抗生物質を含む培地で培養するだけで相同組み換えを生じた細胞株を選抜することができる。また、より効率的な選抜を行うためには、ターゲッティングベクターにチミジンキナーゼ遺伝子などを結合させておくことも可能である。これにより、非相同組み換えを起こした細胞株を排除することができる。また、ＰＣＲおよびサザンブロットにより相同組み換え体の検定を行い、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の一方が不活性化された細胞株を効率よく得ることもできる。
相同組み換えを生じた細胞株を選抜する場合、相同組み換え箇所以外にも、遺伝子挿入による未知の遺伝子破壊の恐れがあることから、複数のクローンを用いてキメラ作製を行うことが好ましい。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の一方を不活性化したマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したマウスを取得することができる。マウス以外のＥＳ細胞が樹立された動物においても、同様の手法により、遺伝子ノックアウトを行うことができる。
また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株は、以下の方法により取得することも可能である。すなわち、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を高濃度の抗生物質を含む培地で培養することにより、遺伝子対のもう一方も不活性化された細胞株、即ち、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の遺伝子対の双方を不活性化したＥＳ細胞株を得ることができる。また、遺伝子対の一方を不活性化したＥＳ細胞株を選抜し、この細胞株に再度ターゲッティングベクターを導入し、相同組換えを生じた細胞株を選択することでも作製することができる。ターゲッティングベクターに挿入するマーカー遺伝子は、前出のマーカー遺伝子とは異なるものを使用することが好ましい。
さらに本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現が人為的に抑制された動物は、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）に挙げるポリヌクレオチドを該動物へ導入することによっても、作製することが可能である。
（ａ）Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンスポリヌクレオチド
（ｂ）Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するポリヌクレオチド
（ｃ）Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉ効果により阻害するポリヌクレオチド。
また、本発明は、本発明の遺伝子改変動物から樹立された細胞を提供する。本発明の遺伝子改変動物由来の細胞株を樹立する方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養の方法（新生化学実験講座、１８巻、１２５頁〜１２９頁東京化学同人、およびマウス胚の操作マニュアル、２６２頁〜２６４頁、近代出版）に従って細胞株を樹立することが可能である。
本発明の遺伝子改変動物、および該動物から樹立した細胞株は、例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の詳細な機能の解析に利用することができる。例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子の発現を調節する化合物の作用機序の解析等に利用することができる。遺伝子改変動物の組識から樹立された細胞を用いることで、各組識における被検化合物の作用をより詳細に検討することが可能である。
さらに本発明は、本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を変化させる化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明の好ましい態様においては、本発明の遺伝子改変非ヒト動物または本発明の細胞における、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量の変化を指標とするスクリーニング方法である。この方法においては、まず、被検化合物を本発明の遺伝子改変非ヒト動物に投与する、または、本発明の細胞と被検化合物を接触させる（工程（ａ））。
本方法に用いる被検化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。
上記工程（ａ）における、本発明の遺伝子改変動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、または注射等により行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、本発明の遺伝子改変動物に該遺伝子を導入することも可能である。
上記方法における「接触」は、通常、本発明の細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に特に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、例えば、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
上記方法においては、次いで、本発明の上記遺伝子改変動物もしくは細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性または発現量を測定する（工程（ｂ））。
上記「活性」とは、通常、ガラクトース転移活性である。この活性は、上述の方法によって測定することができる。
また、本方法における発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子を発現する本発明の細胞、あるいは、本発明の遺伝子改変動物の細胞からｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。さらに、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
本発明においては、次いで、被検化合物を投与していない場合と比較して、本発明のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を変化させる化合物を選択する（工程（ｃ））。このようにして選択された化合物は、本発明のタンパク質の活性の変化に起因する疾患の治療または予防のための医薬品候補化合物となるものと期待される。上記の「疾患」としては、ＩｇＡ腎症、またはＴｎ症候群等を挙げることができるが、本発明のタンパク質の発現量または活性の変化に起因する疾患であれば、特にこれらに限定されない。本発明のスクリーニング方法によって取得される化合物もまた本発明に含まれる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の同定
Ｊｕらによってデータベース登録されたＣｏｒｅ１ β１，３−Ｇａｌ−Ｔ１（ＡＦ１５５５８２）をクエリーにして公共のデータベースを検索したところ、相同性をもつ遺伝子が登録されていた。この遺伝子は、ゲノム配列（ＡＣ０１１８９０（Ｘｑ２３））およびｃＤＮＡ配列（ＡＦ１５０２６８，ＢＣ０１１９３０）の両方が登録されているが、それぞれの配列の不一致がわずかではあるが存在するため、ｃＤＮＡライブラリーからのクローニングを選択した。用いたサンプルは常法（Ｙｕｚｕｒｕ Ｉｋｅｈａｒａ，Ｈｉｓａｓｈｉ Ｎａｒｉｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．９ ｎｏ．１１ ｐｐ．１２１３−１２２４，１９９９）により作製したヒト大腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５ｃＤＮＡライブラリーである。また、スクリーニング手法はラジオアイソトープを使用した一般的な核酸プローブによる方法を用いた。
まず、ヒト大腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５ｃＤＮＡライブラリーより常法に従って調製したラムダファージを鋳型とし、プライマーＣＢ−７３９（５’−ｇａａｇａｔｃｔａｇ ａａｔｇｃａｃｃａｃ ｃａｔｇａｇｃａｔｃ−３’／配列番号：３）とＣＢ−７４０（５’−ａｔａａｇａａｔｇｃ ｇｇｃｃｇｃｔｃａｇ ｔｃａｔｔｇｔｃａｇ ａａｃｃａｔｔｔｇ−３’／配列番号：４）を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片８７８ｂｐをアマシャム社製Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを用いて^３２Ｐ−ｄＣＴＰで放射能ラベルした。このプローブを用いて、大腸菌上に形成されたラムダファージのプラークのうち、プローブとハイブリダイゼーションする単一のプラークを拾い、上記プライマーＣＢ−７３９とＣＢ−７４０を用いてＰＣＲで目的とするＤＮＡ部位の存在を確認した。挿入が確認されたプラークより得られたファージはラムダＺＡＰ ＩＩベクター（ストラタジーン社）で構築されているため（Ｙｕｚｕｒｕ Ｉｋｅｈａｒａ，Ｈｉｓａｓｈｉ Ｎａｒｉｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．９ ｎｏ．１１ ｐｐ．１２１３−１２２４，１９９９）、付属の説明書に従った方法によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ベクターに挿入されたｃＤＮＡクローンとして調製（Ｅｘｃｉｓｉｏｎ）することが出来る。同方法によりこれを調製し、得られたコロニーよりＤＮＡを得た。このｃＤＮＡクローンは、ＳＫ−／Ｃ２と名付けた。その後、通常の方法に従ってｃＤＮＡクローンの１４７１ｂｐの塩基配列を決定した（配列番号：１； 以下「配列１」という）。理論上のＯＲＦ ９５７ｂｐが得られ、このＯＲＦから３１８アミノ酸が推定されＣ１Ｇａｌ−Ｔ２と名づけた（配列番号：２）（図１）。また、１０４ｂｐの５’非翻訳領域と４１０ｂｐの３’非翻訳領域が存在しており、ポリ（Ａ）の付加は見られなかった。アミノ酸配列によりほとんどの糖転移酵素に見られる典型的な２型の膜タンパク質であることが予想された。配列１とＡＣ０１１８９０で登録されたゲノム配列を比較検討したところ、ＯＲＦ、ＡＴＧから上流５ｂｐと３’非翻訳領域はひとつのエキソンからなり、９９ｂｐの５’非翻訳領域との間には２７４６ｂｐのイントロンが存在した。このエキソン−イントロンのスプライス部位はＧＵ−ＡＧ則に従っていた。よってこのＣ１Ｇａｌ−Ｔ２は、少なくとも２つのエキソンから構成されていた。アクセッションＮｏ．ＢＣ０１１９３０でほぼ同等の長さのｃＤＮＡ配列が登録されていたが、このｃＤＮＡの３’末端にはポリＡが付加されている。しかし配列１よりもポリＡ配列を除いて２５０ｂｐ短いことから、３’非翻訳領域に選択的ポリＡシグナル付加のｍＲＮＡのアイソフォームが存在することが示唆された。クエリーに使用したＣ１Ｇａｌ−Ｔ１とＣ１Ｇａｌ−Ｔ２のアミノ酸配列の比較をすると、ホモロジーが３０％に満たないのにかかわらず７カ所のシステイン残基がすべて保存されていた。しかし、２価カチオンの結合部位とされるＤｘＤ配列は、両遺伝子ともに存在してはいるが位置は異なるものであった（図２）。
〔実施例２〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の発現ベクターへの組込み
（ａ） Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の発現系を作成するため、まずＣ１Ｇａｌ−Ｔ２のＯＲＦ全長をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＤＯＮＲ２０１に組込み、さらにインビトロジェン社のｐＤＥＳＴ１２．２に組み替えた。
（ｂ） ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＤＯＮＲ２０１への組込み
（ｉ）エントリークローンの作成
ＳＫ−／Ｃ２を鋳型としてプライマーＦ（ＣＢ−７６０：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ａｇａａｇｇａｇａｔ ａｇａａｃｃａｔｇｃ ｔｔｔｃｔｇａａａｇ ｃａｇｃｔｃｃ−３’／配列番号：５）とプライマーＲ（ＣＢ−７６１：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ｔｃａａｔｃａｔｔｇｔｃａｇａａｃｃａｔ−３’／配列番号：６）によりＰＣＲ（９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分を１５サイクル）により再度ＤＮＡ断片を得た。目的の断片をゲルから切りだし、精製後ＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片５μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分おき反応を終了させた。
その後上記ｍｉｘ全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＯＮＲ−Ｃ２）を抽出・精製した。
（ｉｉ）発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
まずエントリークローン１μｌ、ｐＤＥＳＴ１２．２を０．５μｌ（７５ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４．５μｌ、ＬＲクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ２が生成される）。ｐＤＥＳＴ１２．２は、インビトロジェン社で市販されているネオマイシン耐性遺伝子をもつ動物細胞発現用ベクターである。
その後上記混合液全量（１１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）１００μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ２）を抽出・精製した。
〔実施例３〕 大腸癌細胞株ＬＳＣへのｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ２をトランスフェクション
大腸癌細胞株ＬＳＣは、Ｃｏｒｅ１合成活性（ＧａｌＮＡｃに対してのβ１，３Ｇａｌ−Ｔ活性）を持たず、細胞表面のタンパク質上にＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ抗原；ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）をもつ細胞株である。この細胞株にｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ２をトランスフェクトすることによりＣ１Ｇａｌ−Ｔ２を強制発現させ、その細胞溶解物を酵素源にして、Ｃｏｒｅ１合成活性を検出した。大腸癌細胞株ＬＳＣの培養は、１０％ウシ胎児血清−ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン社）（ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）／ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／Ｌ−グルタミン（０．２９２ｍｇ／ｍｌ））で３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。トランスフェクション前日に１．２ｘ１０^６細胞／２ｍｌを６穴ディッシュにまいた。このとき、ストレプトマイシンおよびペニシリンを除いた培地に移しかえた。細胞をまいて、次の日にトランスフェクションを実施した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）２５０μｌに対してＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）１０μｌ加え、室温で５分間インキュベートした。それにＯｐｔｉ−ＭＥＭ ２５０μｌに対してｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ２ １０μｇを混合したものと混ぜ、室温で２０分間インキュベートした。合計５００μｌを前日まいた細胞に滴下した。トランスフェクションして２日後、細胞をトリプシン（０．２５％）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）（インビトロジェン社）で剥がした。細胞は二分し、ひとつは新しいディッシュにまきなおし、もうひとつは一過性発現での活性測定用にリン酸緩衝液で２回洗浄後、−８０℃に保存した。まきなおした細胞は次の日にジェネティシン（インビトロジェン社）を最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌになるように加えた。この安定導入株をＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２と名付けた。
〔実施例４〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の受容体基質の探索
Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２は、約１００種類の既存の糖転移酵素遺伝子と比較して最もＣｏｒｅ１ Ｇａｌ−Ｔ１に相同性は高いので、ｃｏｒｅ１β１，３−ガラクトース転移酵素類に分類した。そこで、第一に糖供与体基質としてＵＤＰ−Ｇａｌを用いて検討した。
以下の反応系を用いて、Ｃ２の受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃおよびｐＮｐ−β−ＧａｌＮＡｃ（すべてシグマ社）を用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（１０ｎｍｏｌ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１４ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（１２．５ｍＭ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（２５０μＭ）、ＵＤＰ−［^１４Ｃ］−Ｇａｌ（１７５ｎＣｉ）、から成り、これに酵素液を５μｌ加えて、さらにＨ_２Ｏを加えて全量２０μｌとした。酵素液は、５ｘ１０^６個の細胞あたり５０ｍｌの細胞破砕用緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（２０ｍＭ），ＮａＣｌ（１５４ｍＭ），ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１％））に懸濁し、水槽式の超音波破砕装置で４℃、１５分インキュベート後、遠心してその上清を使用した。上記反応混合液を３７℃で２時間反応させ、反応終了後、Ｈ_２Ｏを２００μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。１０ｍｌのメタノールで１回洗浄後、１０ｍｌのＨ_２Ｏで２回洗浄して平衡化したＳｅｐ−Ｐａｋ ｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）に該上清を通し、上清中の基質および生成物をカートリッジに吸着させた。１０ｍｌのＨ_２Ｏにて２回カートリッジを洗浄後、５ｍｌのメタノールで吸着した基質および生成物を溶出した。溶出液を４０℃のヒートブロックにて加熱しながら、窒素ガスを吹き付け蒸発乾固させた。これに、メタノール２０μｌを添加し、ＴＬＣプレート（ＨＰＴＬＣ ｐｌａｔｅ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０：ＭＥＲＣＫ社製）にプロットし、クロロホルム：メタノール：水（０．２％ＣａＣｌ_２含む）＝５５：４５：８の組成からなる展開溶媒を用いて展開した。ＴＬＣプレートの上端から５ｍｍの所まで展開し、プレートを乾燥後、バイオ・イメージアナライザーＦＬＡ３０００（富士写真フィルム社製）を用いて生成物に取り込まれている放射線の量を測定した。
その結果、ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２細胞抽出液でｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃには強い反応が示され、ｐＮｐ−β−ＧａｌＮＡｃに反応しないことから、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２がガラクトースβ１−３アセチルガラクトサミニルα１−Ｒの合成酵素であることが示唆された（図３）。
〔実施例５〕 Ｎ−アセチルガラクトサミニル−ペプチド（ＧａｌＮＡｃ α１−ｐｅｐｔｉｄｅ）を受容体基質とした活性の確認
上記の実験でＣ１Ｇａｌ−Ｔ２がコア１糖鎖（ガラクトースβ１−３Ｎ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒ）の合成酵素であることが示唆されたため、様々なＧａｌＮＡｃ α１−ｐｅｐｔｉｄｅを受容体基質として再度上記実験を行ったところ、ｐＮｐ−α−ＧａｌＮＡｃに対する場合と同様の反応が示された。
ＧａｌＮＡｃα１−ｐｅｐｔｉｄｅ受容体基質に対するガラクトース転移酵素活性を調べるために以下の方法で受容体基質を調整した。
ヒトＩｇＡ１のヒンジ領域のペプチド配列ＨＰ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ／配列番号：７）の４、７、９、１１、または１５番目のＳまたはＴの−ＯＨ基にＧａｌＮＡｃを１つ導入したペプチドおよび４、７、９、１１、１５番目のＳまたはＴの−ＯＨ基にＧａｌＮＡを１つずつ導入したペプチドを合成した（ペプチド研究所社）。合成したペプチドは４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴＰＰＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ）、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳ（ＧａｌＮＡｃ）ＴＰＰＴＰＳＰＳ）、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳＰＳ）、４，７，９，１１，１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（ＶＰＳＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＰＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳ（ＧａｌＮＡｃ）ＴＰＰＴ（ＧａｌＮＡｃ）ＰＳＰＳ）と命名した。さらに、受容体基質となる各種ＧａｌＮＡｃ−ＨＰは、Ｈ_２Ｏに溶かして、ジメチルホルムアミドに溶かしたＣｙ５と１：１０のモル比となるように混合して、４℃で一晩Ｃｙ５標識反応を行った。反応液は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（カラムにはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ_１８ ＵＧ１２０（資生堂社）を、分離バッファーには０．１％トリフルオロ酢酸を使用し、１５から３０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出した。また、流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行い、検出条件は励起波長：６４９ｎｍ、蛍光波長：６７０ｎｍとした）による精製を行った。Ｃｙ５の蛍光を指標に、Ｃｙ５標識された各種ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ（４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、４，７，９，１１，１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５）は各々保持時間３５．２分、３４．４分、３５．１分、３４．９分、３４．６分、３１．１分での単一基質ピークとして基質を分取した。分取した基質は凍結乾燥により濃縮した。このように調整した基質は４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、７−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、９−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５、４，７，９，１１，１５−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５と命名した。
ＦＩＴＣ標識されたヒトの消化器官由来のムチンペプチド配列ＦＩＴＣ−ＭＵＣ１ａ’（ＦＩＴＣ−ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲ）、同じくＦＩＴＣ標識されたラットの顎下腺ムチンペプチド配列ＥＡ２−ＦＩＴＣ（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ−ＦＩＴＣ）を合成した（サワディー・テクノロジー社）。さらに、ＦＩＴＣ−ＭＵＣ１ａ’、ＥＡ２−ＦＩＴＣペプチドを受容体基質として、既知のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ６またはＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０）と反応させた。反応液をＨＰＬＣ（カラムには５Ｃ_１８−ＡＲ Ｃｏｄｅ Ｎｏ．３７８−６６（ＣＯＳＭＯＳＩＬ社）を、分離バッファーには０．０５％トリフルオロ酢酸を使用し、０から５０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出した。また、流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行い、検出条件は励起波長：４９２ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍとした）分析し、受容体基質ＦＩＴＣ−ＭＵＣ１ａ’ピーク（保持時間１９．６分）と０．８分差を示す単一の産物ピーク（保持時間１８．８分）、および、受容体基質ＥＡ２−ＦＩＴＣピーク（保持時間２０．３分）と０．７分差を示す単一の産物ピーク（保持時間１９．６分）を分取し、凍結乾燥後、一部をＭＡＬＤＩ−Ｍａｓｓ（ＢＲＵＫＥＲ社、機種：ＲＥＦＬＥＸ）で分析し、両産物が受容体基質にＧａｌＮＡｃが１つ転移されたものであることを確認した。このように調整した基質はＦＩＴＣ−ＭＵＣ１ａ’−ＧａｌＮＡｃ、ＥＡ２−ＧａｌＮＡｃ−ＦＩＴＣと命名した。
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（５ｐｍｏｌ）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）（１００ｍＭ）、ＭｎＣｌ_２（２０ｍＭ）、ＡＴＰ（２ｍＭ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（０．５ｍＭ）、から成り、これにＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の酵素源を５μｌ加えて、さらにＨ_２Ｏを加えて全量２０μｌとした。
上記反応混合液を３７℃で８時間反応させ、反応終了後、Ｈ_２Ｏを６０μｌ加え、軽く遠心後上清を取得した。この上清をウルトラフリー−ＭＣカラム（ミリポア社）で精製し、３０μｌを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。カラムにはＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ_１８ ＵＧ１２０（資生堂社）を、分離バッファーには０．１％トリフルオロ酢酸を使用し、１５から３０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出した。また、流速は１ｍｌ／ｍｉｎで行った。
前記の細胞破砕用緩衝液で調整したものを酵素源とした場合、ＧａｌＮＡｃ α１−ｐｅｐｔｉｄｅを受容体基質のペプチドの分解が起こり、ＨＰＬＣ解析で多数のピークが検出されてしまう。よってＧａｌＮＡｃ α１−ｐｅｐｔｉｄｅを受容体基質として使用する場合、ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２トランスフェクタントからミクロソーム画分を調整し、酵素源として使用した。この場合、ペプチドの分解を抑えられ、目的の生成物がＨＰＬＣによって単一ピーク検出が可能であった。
ミクロソーム画分の調整法は、以下に示す。
１ｘ１０^８個の細胞株を１ｍｌの０．２５Ｍスクロース／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、１００μｌのプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社）を加える。ダウンスのホモジナイザーに細胞懸濁液を移し、２００回ストロークして細胞を破砕する。１，０００ｘｇで４℃、１０分間遠心して上清を回収する。その上清を１０，０００ｘｇで４℃、２０分間遠心して上清を回収する。その上清を１０５，０００ｘｇで４℃、１時間遠心して沈殿をミクロソーム画分として回収し、適当量の０．２５Ｍスクロース／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し酵素源として使用した。
その結果、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５を受容体基質、ＵＤＰ−Ｇａｌを供与体基質に用いた場合に、その反応産物は２８．８分に新たなピークとなって現れた。（図４Ａ，Ｂ）
〔実施例６〕 ガラクトースとＮ−アセチルガラクトサミニルα１−Ｒとの結合様式の解析
ガラクトースとＮ−アセチルガラクトサミンがどの様な結合様式であるかをグリコシダーゼ処理によって確認した。ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２によって１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５にガラクトースが転移された反応産物をβ１，３−ガラクトシダーゼ（明治乳業）で処理して、ガラクトースが転移した１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５のピークがもとの１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰ−Ｃｙ５のピークに移ることをＨＰＬＣで確認できたので、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２は、ＧａｌＮＡｃ α１−ペプチドのＧａｌＮＡｃの非還元末端にβ１，３結合でガラクトースが転移するｃｏｒｅ１合成酵素であることがｉｎ ｖｉｔｒｏで証明された。（図４Ｃ）
〔実施例７〕 培養細胞株の細胞表面の糖タンパク質の糖鎖構造の解析
大腸癌細胞株ＬＳＣは、Ｃｏｒｅ１ β１−３ガラクトース転移酵素活性が検出されない。よってこの細胞表面には、Ｔｎ抗原およびＳＴｎ抗原の発現が見られる。この細胞株にＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の安定導入株（ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２）を作製し、細胞表面上の糖鎖抗原の変化をフローサイトメーターで解析した。ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の作製法は上記に記述済みである。細胞は、トリプシン（０．２５％）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）によってディッシュから剥がし、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％アザイド／リン酸緩衝液によって細胞を洗浄した。１ｘ１０^５個の細胞をコア１構造を認識するＦＩＴＣラベルされたＰｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎレクチン（ＰＮＡ−ＦＩＴＣ；ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＨＢ ＳＴｎ１（抗シアリルＴｎ抗原モノクローナル抗体、マウスＩｇＭ；ＤＡＫＯ）、ＨＢ−Ｔ１（抗Ｔｎ抗原モノクローナル抗体、マウスＩｇＧ１；ＤＡＫＯ）で染色した。ＰＮＡ−ＦＩＴＣは、５０μｇ／ｍｌ、ＨＢ ＳＴｎ１およびＨＢ−Ｔ１は、１００倍希釈して細胞と４℃で３０分間反応させた。０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％アザイド／リン酸緩衝液によって２回細胞を洗浄後、ＨＢ ＳＴｎ１およびＨＢ−Ｔ１で染色した細胞に対して、ＦＩＴＣラベルの二次抗体（抗マウスＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＭ抗体は共に１，０００倍希釈）と４℃で３０分間反応させた。０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％アザイド／リン酸緩衝液によって２回細胞を洗浄後、０．５％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液で固定し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（ベクトンディッキンソン社）にてＦＩＴＣの強度を測定した。ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２は、ＬＳＣ細胞と比べＰＮＡで染色性が増加し、ＴｎおよびシアリルＴｎ抗原の染色性の低下が見られた（図５）。ＬＳＣ細胞表面上のＴｎ抗原はＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の作用によってガラクトースが転移されＴ抗原になり、シアリルＴｎ抗原もＣ１Ｇａｌ−Ｔ２が内因性のシアル酸転移酵素との競合作用に打ち勝つことにより減少し、Ｔ抗原が発現したと考えられた。この結果からＣ１Ｇａｌ−Ｔ２は、細胞内においてもＣｏｒｅ１合成酵素であることが証明された。
〔実施例８〕 ヒト種々組織及び株化細胞での発現
ヒト正常組織及び株化細胞のｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲにより該遺伝子の発現量を定量した。正常組織のｃＤＮＡとしてはクロンテック社のＭａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを使用し、株化細胞に関しては総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製し使用した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２の定量的発現解析に使用したプライマーはＣ２−ＲＴ−ＦＰ１（５’−ｇｔｔｔｇｃｃｔｇａ ａａｔａｔｇｃｔｇｇ ａｇｔａｔ−３’／配列番号：８）、Ｃ２−ＲＴ−ＲＰ３（５’−ｃａａｃａｇｃｃｔｔ ｃｔａｃｔａｃｃｔｇ ｇｔｔｇ−３’／配列番号：９）、プローブはＣ２−ＲＴ−ＭＧＢ１（５’−ｃａｇａａａａｔｇｃ ａｇａａｇａｔｇｃｔ ｇａｔｇｇａａａａｇ ａｔｇｔａ−３’／配列番号：１０）である。なお、Ｃ２−ＲＴ−ＭＧＢ１プローブにはアプライドバイオシステムズ社のマイナーグルーブバインダーを結合したものを使用した。酵素及び反応液にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにアプライドバイオシステムズ社）により反応液量２５μｌで定量を行った。定量の標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。反応温度は５０℃２分、９５℃１０分のあと、９５℃１５秒・６０℃１分を５０サイクル行った。結果を図６に示した。
〔実施例９〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２変異体の解析
ヒト細胞株であるＬＳＣおよびＪｕｒｋａｔ細胞は、コア１合成活性を持たないことが知られている。この２つの細胞株のＣ１ＧａｌＴ−１およびＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲで定量したところ、コア１合成活性を持つ細胞株ＬＳＢおよびＫ５６２細胞と同レベルの発現を確認した（図８）。
これらの４つの細胞株のゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡから、ＰＣＲによってＣ１ＧａｌＴ−１およびＣ１Ｇａｌ−Ｔ２遺伝子を増幅し、直接シーケンス法によって核酸配列を決定した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１のｃＤＮＡからの増幅プライマーには、５’−ＡＧＡＡＡＴＡＣＡＣＴＴＴＣＧＧＧＡＡ−３’（配列番号：１１）と５’−ＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号：１２）を使用し、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２のｃＤＮＡからの増幅プライマーには、５’−ＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＡＡＧＣＣＧＴＴＣ−３’（配列番号：１３）と５’−ＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：１４）を使用した。また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２のゲノムＤＮＡからの増幅プライマーには、５’−ＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＣ−３’（配列番号：１５）と５’−ＧＣＣＣＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：１４）を使用した。
Ｃ１ＧａｌＴ−１の配列は、４つの細胞株のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡですべて登録された配列と同一であった。コア１合成活性を持つＬＳＢおよびＫ５６２細胞のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の配列は、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ共にコア１合成活性の確認された配列と同一であった（図９Ａ）。ＬＳＣ細胞のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の配列は、開始コドンのＡＴＧのＡを１とした時の５３番目のＴと５４番目のＣの間にＴが１つ挿入されていた（図９Ｂ）。このことによりフレームシフトが生じ、途中終止コドンが出現した。Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の配列は、４２８番目のＣがＴに変わり、アミノ酸がアラニンからバリンに変わるミスセンス変異と４６８番目のＴが欠失していた（図９Ｃ）。この場合もフレームシフトが生じ、途中終止コドンが出現した。
Ｃ１ＧａｌＴ−２遺伝子は、Ｘ染色体上にあり、男性の場合はこの遺伝子をもつアリルは１本であり、女性の場合は、２本である。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、男性由来の細胞株であり、１本のＸ染色体上の不活性型のＣ１Ｇａｌ−Ｔ２が存在することになる。ＬＳＣの場合、どちらかわからないが、ｃＤＮＡおよびゲノムでＣ１Ｇａｌ−Ｔ２配列に変異のあるものしか見つからなかった。
以上よりＬＳＣおよびＪｕｒｋａｔ細胞ではＣ１Ｇａｌ−Ｔ２が不活性型のためコア１合成活性を示さないことが判明した。また、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１が、ｍＲＮＡの発現があるのに酵素活性を検出することができなかったことにより、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２がより比活性が強いコア１合成酵素であることが示唆された。
〔実施例１０〕 新規ガラクトース転移酵素Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の同定
本発明者らによって同定されたＣ１Ｇａｌ−Ｔ２（ＡＢ０８４１７０）をクエリーにして、公共のデータベースを検索したところ、相同性をもつ配列が登録されていた。この遺伝子は、ヒトではゲノム配列情報でしか存在しておらず（ＡＣ０１１２４２，ＡＣ０８４２６４（第２染色体））、ＯＲＦは一つのエキソンからなると予想され、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２とアミノ酸レベルで６８％の相同性を持ち、システイン残基は、７か所中６か所で保存されていた（図１０）。この配列によってコードされる新規ガラクトース転移酵素を、本発明者らはＣ１Ｇａｌ−Ｔ３と名付けた。また、この遺伝子と９６％相同性をもつクローンがＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの精巣のｃＤＮＡクローン（ＡＢ０７１１０９）として登録されていた。
〔実施例１１〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現ベクターへの組込み
（ａ） Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現系を作成するため、まずＣ１Ｇａｌ−Ｔ３のＯＲＦ全長をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＤＯＮＲ２０１に組込み、さらにインビトロジェン社のｐＤＥＳＴ１２．２に組み換えた。
（ｂ） 次のようにして、ＧａｔａｗａｙシステムによるｐＤＯＮＲ２０１への組込みを行った。
（ｉ）エントリークローンの作成
Ｕｔｅｒｕｓより得られたｃＤＮＡ（クロンテック社、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を鋳型としプライマーＦ（Ｃ５ＧＦＳＫＤ１：５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ｃｇａａｇｇａｇａｔ ａｇａａｃｃａｔｇｇ ｔｔｔｃｃｇｃｔａｇ ｔｇｇｇａｃａｔｃ−３’／配列番号：１６）とプライマーＲ（Ｃ５ＧＲ：５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ｔｃａｇｔｃａｔｔｔ ｔｃｔｇａａｃｃａａ ｃｔｇｇａｇ−３’／配列番号：１７）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分３０秒を３０サイクル）を行いＤＮＡ断片を得た。目的の断片をゲルから切り出し、精製後ＢＰクロナーゼ反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片２μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１ １μｌ（１５０ｎｇ）、ＢＰ反応緩衝液２μｌ、ＢＰクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間インキュベーションして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃、１０分間おき反応を終了させた。その反応混合液１μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートに播いた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＯＮＲ−Ｃ１ＧａｌＴ−３）を抽出、精製した。理論上のＯＲＦ ９４８ｂｐ（配列番号：１８）が得られ、このＯＲＦから３１５アミノ酸が推定された（配列番号：１９）。アミノ酸配列によりほとんどの糖転移酵素に見られる典型的な２型の膜タンパク質であることが予想された。
（ｉｉ）発現クローンの作成
まずエントリークローン１μｌ、ｐＤＥＳＴ１２．２を１μｌ（１５０ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ ４μｌ、ＬＲクロナーゼｍｉｘ ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼＫを１μｌ加えて１０分間、３７℃でインキュベーションし反応を終了させた。ｐＤＥＳＴ１２．２はインビトロジェン社から市販されているネオマイシン耐性遺伝子をもつ動物細胞発現用ベクターである。
その後上述反応混合液１μｌをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートに播いた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＥＳＴ１２．２−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３）を抽出、精製した。
〔実施例１２〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のＦＬＡＧタグつき融合タンパク発現ベクターへの組込み
ｐＤＯＮＲ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のＤＮＡを鋳型にしてプライマーＦ（ＴＫＣ−７：５’−ｇｃｃｃａａｇｃｔｔ ｃａｃａｇａｇｇｔｃ ａａａｃｔｃａａｇａ ｃｃａｃ−３’（配列番号：２０）／下線部はＨｉｎｄＩＩＩの切断配列）とプライマーＲ（ＴＫＣ−９：５’−ｃｇｇａａｔｔｃｔｃ ａｇｔｃａｔｔｔｔｃ ｔｇａａｃｃａａｃｔ ｇ−３’（配列番号：２１）／下線部はＥｃｏＲＩの切断配列）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分３０秒を１８サイクル）を行いＤＮＡ断片を得た。制限酵素処理（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ）後、目的の断片をゲルから切り出し、精製後ＤＮＡリガーゼ反応によってｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３ベクター（シグマ社）へ組込み、ｐＦＬＡＧ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３と名付けた。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３ベクターは、５’からプレプロトリプシンの分泌シグナル、タグとしてＦＬＡＧ配列を持っており、その３’側に目的の遺伝子を挿入することによりリコンビナントタンパク質を作製することができる。糖転移酵素遺伝子の場合、アミノ末端に存在する膜貫通領域を除いたカルボキシル末端側（酵素活性領域）を組み換えることによりその酵素の活性を持つものを得ることができるが知られている。
〔実施例１３〕 ＣＯＳ−１細胞へのｐＦＬＡＧ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の一過性トランスフェクション
ｐＦＬＡＧ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のプラスミドＤＮＡをＣＯＮＣＥＲＴ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｉｔｙ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）により大量に精製した。ＣＯＳ−１細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清−ＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）（ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）／ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／）で３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養した。トランスフェクション前日に３ｘ１０^６細胞／１２ｍｌを９ｃｍディッシュにまいた。このとき、ストレプトマイシンおよびペニシリンを除いた培地に移しかえた。細胞をまいて、次の日にトランスフェクションを実施した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）１．５ｍｌに対してＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社）６０μｌ加え、室温で５分間インキュベートした。それにＯｐｔｉ−ＭＥＭ １．５ｍｌに対してｐＦＬＡＧ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３ ３０μｇを混合したものと混ぜ、室温で２０分間インキュベートした。合計３ｍｌを前日まいた細胞に滴下した。トランスフェクションして２日後、培養上清を回収し使用するまで−８０℃に保存した。
〔実施例１４〕 培養上清からのリコンビナント酵素の精製とその確認
１０ｍｌの培養上清に対して、１００μｌの抗ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローン抗体−アガロースアフィニティーゲル、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ_２、０．０５％ＮａＮ_３になるように加え、回転板でレジンが混ざるように回転させながら４℃で一晩吸着させた。１ｍＭ ＣａＣｌ_２／ＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄後、５０μｌの抽出バッファー（２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＴＢＳ緩衝液）を加えた。その一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行い、そのタンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｐナイロンメンブレンに転写させた後、抗ＦＬＡＧ Ｍ１モノクローン抗体（シグマ社）によりウエスタン解析を行った。コニカイムノステインＨＲＰ１０００（コニカ社）により発色を行い、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のリコンビナント酵素は、約４０ｋＤａの位置に検出できた。
〔実施例１５〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のＮ−アセチルガラクトサミニルーペプチド（ＧａｌＮＡｃ α１−ｐｅｐｉｄｅ）を受容体基質とした活性の確認
ＣＯＳ−１細胞で発現させたＣ１Ｇａｌ−Ｔ３のリコンビナント酵素を酵素源として、実施例５と同様にＮ−アセチルガラクトサミニル−ペプチドを受容体基質として、ガラクトース転移酵素活性を測定した。その結果、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰに対してのガラクトース転移酵素活性が確認できた。
〔実施例１６〕 ヒト種々組織でのＣ１Ｇａｌ−Ｔ３転写産物の発現
ヒト正常組織のｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲにより該遺伝子の発現量を定量した。正常組織のｃＤＮＡとしてはクロンテック社の総ＲＮＡから、常法によりｃＤＮＡを作製し使用した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の定量的発現解析に使用したプライマーはＣ５−ＲＴ−ＦＰ１（５’−ｇｃｃｔｇａａａｔａ ｔｇｃａｇｇａｇｔｔ ｃａ−３’（配列番号：２２））、Ｃ５−ＲＴ−ＲＰ２（５’−ｇｇｔｔａｔｔａｇａ ｃａａｔｇｃｃｔｃｔ ｔｃａａｔａａｇ−３’（配列番号：２３））、プローブはＣ５−ＲＴ−ＭＧＢ１（５’−ＦＡＭ−ｇｃａｇａａａａｔｇ ｃａｇａｇｇａｔｔａ ｔｇａａｇｇａａｇａ ｇａｔｇｔａ−ＭＧＢ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号：２４））である。なお、Ｃ５−ＲＴ−ＭＧＢ１プローブにはアプライドバイオシステムズ社のマイナーグルーブバインダーを結合したものを使用した。酵素及び反応液にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ともにアプライドバイオシステムズ社）により反応液量２５μｌで定量を行った。定量の標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。反応温度は５０℃２分、９５℃１０分のあと、９５℃１５秒・６０℃１分を５０サイクル行った。結果を図１１に示した。
〔実施例１７〕 リアルタイムＰＣＲによるヒト種々組織でのＣ１Ｇａｌ−Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３転写物の発現
リアルタイムＰＣＲにより、ヒト末梢血単核球、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞各画分におけるヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の定量解析を行った。末梢血単核球は健常者ボランティア全血よりＦｉｃｏｌを用いて分離した。Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞各画分は、末梢血単核球より、それぞれａｎｔｉ−ＣＤ１９、ａｎｔｉ−ＣＤ４、ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体が結合されたビーズを用いて得た。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３およびＧＡＰＤＨの標準曲線は、各プラスミドの希釈系列によって作成した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の発現レベルはＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルで標準化した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、比較的Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現量が高い精巣について、同時に測定を行った（図１２）。
また、血球細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ１、−Ｔ２、−Ｔ３の発現についても、上記Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３と同様に転写物の定量解析を行い、三者を比較した（図１３）。
さらに、ヒトＢ細胞由来の各種細胞株を用いて、リアルタイムＰＣＲにより、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の定量解析を行った（図１４）。Ｂ細胞でＣ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現が認められた。また、ヒトＢ細胞由来各種細胞株におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ１、−Ｔ２、−Ｔ３の転写物の定量解析をリアルタイムＰＣＲにて行い、三者を比較した（図１５）。
〔実施例１８〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のＣＯＳ−１細胞へのトランスフェクト
ＣＯＳ−１細胞へＣ１Ｇａｌ−Ｔ３をトランスフェクションした。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞の培養上清より、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を結合したＭ１アガロースで精製した。１２．５％アクリルアミドゲルを用いた。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果およびクマシー染色結果を図１６に示す。
さらに、ＣＯＳ−１−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタントのＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するコア１合成活性を解析した。培養上清より精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３を用い、蛍光標識したＮ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ α１−０−Ｓｅｒｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ）またはＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅをアクセプター基質、ＵＤＰ−Ｇａｌをドナー基質としてコア１合成反応を行いＨＰＬＣにて解析した。
酵素源として、ＣＯＳ−１−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタント培養上清よりＦＬＡＧ ｔａｇで精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３、Ｃｏｒｅ１合成活性を有する細胞株ＬＳＢの細胞抽出液（ポジティブコントロール）、Ｃｏｒｅ１合成活性をもたない細胞株ＬＳＣの細胞抽出液（ネガティブコントロール）を用いた結果を図１７に示した。受容体として、蛍光標識したＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒを用いた。
また、酵素源として、すべてＣＯＳ−１−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタント培養上清よりＦＬＡＧ ｔａｇで精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３を用いた結果を図１８に示した。
〔実施例１９〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３の基質特異性の比較
Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３の基質特異性の比較を行った。ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２のマイクロゾーム画分、ＣＯＳ−１−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３由来の精製酵素を酵素源として、各アクセプター基質に対するコア１合成活性を解析した（図１８）。
〔実施例２０〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３の共発現
Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３を下記に示す組み合わせで２９３Ｔ細胞に共発現させた。

培養上清および細胞より精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３のｘ１，０００ ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体でウェスタンブロットを行い、共発現を解析した（図１９）。
さらに、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１、２、３の共発現２９３Ｔトランスフェクタントを用いたコア１合成活性の解析を行った。各２９３Ｔトランスフェクタントの培養上清より精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔを酵素源に、ＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するコア１合成活性をＨＰＬＣにて解析した（図２０）。アクセプター基質は、あるＧａｌＮＡｃに結合するＩｇＡヒンジペプチドである。
〔実施例２１〕 Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２病態モデルマウスの調製
以下の手順でノックアウトマウスを得た。まず、マウスのＣ１Ｇａｌ−Ｔ２のＯＲＦ全長を含む約１０ｋｂの染色体断片を挿入した直鎖状ターゲティングベクター８０μｇを、ＥＳ細胞（Ｅ１４／１２９Ｓｖマウス由来）にトランスフェクション（エレクトロポレーション）し、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択した。Ｇ４１８耐性コロニーを２４ウェルプレートに移し、培養を行った。細胞の一部を凍結保存した後、残りのＥＳ細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲにより組み換えが起こっているクローンを１２０コロニー程度選択した。さらに、サザンブロッティングにより組み換えが予定通り起こっていることを確認し、最終的に組み換え体を１０クローン程度選択した。選択したうちの２クローンのＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞内に注入した。ＥＳ細胞を注入したマウス胚を、仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させた。その後、ジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得た。
Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３に関しては、現在のところマウスホモログが確認されていないが、ヒト由来細胞におけるｓｉＲＮＡ法によるノックダウン、あるいはトランスジェニック動物を得ることは可能である。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規ガラクトース転移酵素をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドの製造方法が提供された。さらに、該ポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を変化させる化合物の同定方法が提供された。本発明のポリペプチドやポリヌクレオチド、または本発明のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を変化させる化合物は、本発明のポリペプチドが関連する疾患の新しい予防薬や治療薬の開発への利用が期待される。さらに本発明によって、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の変異や発現を検出することを含む疾患の検査方法が提供された。ガラクトース転移酵素は医薬品開発や医療の分野において最も重要かつ注目されている分子の一つであり、本発明において新規ガラクトース転移酵素が提供されたことにより、これら分野の発展が期待される。ガラクトース転移酵素の研究者にとっても、本発明は貴重な情報源となり得るものと期待される。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２ ｃＤＮＡの塩基配列、および該配列によってコードされるアミノ酸配列を示す図である。推定膜貫通ドメインを四角で囲み、ポリアデニル化シグナルは下線で示した。アスパラギンにリンクしたグリコシル化サイトを二重下線で示し、矢印はスプライシングサイトを示す。
図２は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２とＣ１Ｇａｌ−Ｔ１のアミノ酸配列の比較を示す図である。保存されたシステイン残基を四角で囲んだ。
図３は、ＴＬＣプレートをイメージアナライザーＦＬＡ３０００で測定した結果を示す写真である。
図４は、１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰから由来する反応産物のＨＰＬＣ解析の結果を示す図である。Ｃｙ５−ラベル化１１−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰの溶出位置は、ピークＳとして示した（パネルＡ）。パネルＢは、ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２細胞ライセートおよび残りの基質（ピークＳ）のミクロソーム画分の反応生成物（ピークＰ）を示す。β１，３−ガラクトシダーゼによる消化後の反応生成物（ピークＰ）をパネルＣに示す。
図５は、ヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ２でトランスフェクトしたＬＳＣ細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す図である。ＬＳＣ−ｈＣ１Ｇａｌ−Ｔ２トランスフェクタントの表面のＴ関連抗原の発現をフローサイトメトリーによって解析した。各パネルの薄い線は、各種レクチンまたは抗体により染色したＬＳＣ細胞でｍｏｃｋトランスフェクトした結果を示す。各パネルは、（Ａ）ＰＮＡレクチン、（Ｂ）ＨＢＳＴｎ１（ＳＴｎ）、および（Ｃ）ＨＢ−Ｔ１（Ｔｎ）で染色したＬＳＣ細胞のステーブルトランスフェクタントを示す。
図６は、リアルタイムＰＣＲによる種々のヒト細胞におけるヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ２転写物の定量解析の結果を示す図である。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２およびＧＡＰＤＨの標準曲線は、各プラスミドの希釈系列によって作成した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２転写物の発現レベルは、ＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルで標準化した。
図７は、糖転移酵素の８種類のコア構造を示す図である。
図８は、各種細胞株およびＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２におけるＧａｌＮＡｃ−α−ｐＮｐに対するコア１合成活性（Ａ）とＣ１Ｇａｌ−Ｔ１とＣ１Ｇａｌ−Ｔ２の転写発現量（Ｂ）を示す写真および図である。
図９は、ＡはＣ１ＧａｌＴ１−２配列と、Ｋ５６２、ＬＳＢ、ＬＳＣ、Ｊｕｒｋａｔの各配列との比較を模式的に示す図である。ＢはＬＳＢとＬＳＣ、ＣはＬＳＢとＪｕｒｋａｔとの比較を示す図である。
図１０は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３とＣ１Ｇａｌ−Ｔ２のアミノ酸配列の比較を示す図である。
図１１は、定量的ＰＣＲによる種々のヒト組識におけるヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の定量発現解析の結果を示す図である。定量の標準遺伝子としてはＧＡＰＤＨ遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。
図１２は、血球細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現を示す図である。リアルタイムＰＣＲによるヒト末梢血単核球、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞各画分におけるヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の定量解析の結果を示した。末梢血単核球は健常者ボランティア全血よりＦｉｃｏｌを用いて分離した。Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞各画分は、末梢血単核球より、それぞれａｎｔｉ−ＣＤ１９、ａｎｔｉ−ＣＤ４、ａｎｔｉ−ＣＤ８抗体が結合されたビーズを用いて得た。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３およびＧＡＰＤＨの標準曲線は、各プラスミドの希釈系列によって作成した。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の発現レベルはＧＡＰＤＨ転写物の発現レベルで標準化した。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、比較的Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現量が高い精巣についても、同時に測定を行った。
図１３は、血球細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ１，−Ｔ２，−Ｔ３の発現を示す図である。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，−Ｔ２についても、上記Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３と同様に転写物の定量解析を行い、三者を比較した。
図１４は、ヒトＢ細胞由来各種細胞株におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現を示す図である。Ｂ細胞でＣ１Ｇａｌ−Ｔ３の発現が認められたため（図１２、１３）各種細胞株におけるヒトＣ１Ｇａｌ−Ｔ３転写物の定量解析をリアルタイムＰＣＲにて行った。
図１５は、ヒトＢ細胞由来各種細胞株におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ１，−Ｔ２，−Ｔ３の発現を示す図である。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，−Ｔ２についても、上記Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３と同様に転写物の定量解析を行い、三者を比較した。
図１６は、ＣＯＳ−１細胞へのＣ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクションの結果を示す写真である。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３をトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞の培養上清より、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を結合したＭ１アガロースにて精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を写真に示した。ＨＲＰ−ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体はｘ１０００希釈したものを用いて、ゲルは１２．５％アクリルアミドゲルを使用した。１から５までの各レーンについては図の下に説明を付けた。
左の図が、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体でのウェスタンブロット、右の図がクマシー染色の結果を示す。
図１７は、ＣＯＳ−１−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタントのＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するコア１合成活性をＨＰＬＣで解析した結果を示す図である。図中のＨＰはＩｇＡ１ヒンジ部位のアミノ酸配列を模した合成ペプチドを示し、４−，７−，等の数字はＧａｌＮＡｃが付加しているアミノ酸の位置を示す。例えば、４−ＧａｌＮＡｃ−ＨＰは、Ｎ末から４番目のアミノ酸にＧａｌＮＡｃが付加したＩｇＡ１ヒンジペプチドである。ただし、５ｘＧａｌＮＡｃ−ＨＰは４−，７−，９−，１１−，１５−の５箇所すべてにＧａｌＮＡｃが結合したペプチドである。酵素源として上段からＣＯＳ−１−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタント培養上清よりＦＬＡＧ ｔａｇで精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３、ＣＯＳ−１−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３トランスフェクタント（ベクターのみのｍｏｃｋトランスフェクタント）培養上清のＦＬＡＧ ｔａｇ精製画分、Ｃｏｒｅ１合成活性を有する細胞株ＬＳＢの細胞抽出液（ポジティブコントロール）、Ｃｏｒｅ１合成活性をもたない細胞株ＬＳＣの細胞抽出液（ネガティブコントロール）を用いた結果を示した。受容体として、蛍光標識したＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒを用いた。図の右側はドナー基質を添加せずに酵素反応を行ったコントロールであり、図中Ｓはアクセプター基質ピークを、Ｐは酵素反応の結果検出された生成物ピークを示す。
図１８は、酵素源として、すべてＣＯＳ−１−ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ３−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３トランスフェクタント培養上清よりＦＬＡＧ ｔａｇで精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ３を用いて、ＨＰＬＣ解析を行った結果を示す図である。クロマトグラムの左側にアクセプター基質を示した。
図１９は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，２，３の基質特異性の比較をした結果を示す図である。ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，ＬＳＣ−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２のマイクロゾーム画分、ＣＯＳ−１−Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ３由来の精製酵素を酵素源として、各アクセプター基質に対するコア１合成活性を解析した。
図２０は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，２，３の共発現結果を示す写真である。Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，２，３を図に示した組み合わせで２９３Ｔ細胞に共発現させ、培養上清および細胞より精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔ１，２，３のａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロットを行った。ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体はｘ１０００に希釈したものを用いた。
図２１は、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ１，２，３の共発現２９３Ｔトランスフェクタントを用いたコア１合成活性の解析結果を示す図である。各２９３Ｔトランスフェクタントの培養上清より精製したＣ１Ｇａｌ−Ｔを酵素源に、ＧａｌＮＡｃ−ｐｅｐｔｉｄｅに対するコア１合成活性をＨＰＬＣにて解析した。アクセプター基質；ＩｇＡ ｈｉｎｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｔｔａｃｈｅｄ ｏｎｅ ＧａｌＮＡｃ、Ｎ．Ｃ．；ドナー基質なし。

Claims (31)

1. 下記（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチド。
   （ａ）配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
   （ｂ）配列番号：１または１８に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
2. ガラクトース転移活性を有する、下記（ｃ）または（ｄ）に記載のポリヌクレオチド。
   （ｃ）配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
   （ｄ）配列番号：１または１８に記載の塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
3. 配列番号：２または１９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
5. 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを保持する宿主細胞。
6. 請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
7. 請求項５に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞またはその培養上清から、産生させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項６に記載のポリペプチドの製造方法。
8. 請求項６に記載のポリペプチドに結合する抗体。
9. 請求項６に記載のポリペプチドの活性または発現を増加させる必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）から（ｃ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
   （ａ）請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド
   （ｂ）請求項４に記載のベクター
   （ｃ）請求項６に記載のポリペプチド
10. 請求項６に記載のポリペプチドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療するための医薬組成物であって、下記（ａ）または（ｂ）に記載の分子を治療上有効な量含む医薬組成物。
    （ａ）請求項８に記載の抗体
    （ｂ）生体内において、内因性の請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド
11. 請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または請求項６に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、
    （ａ）被験化合物と請求項６に記載のポリペプチドとを接触させる工程、
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチドのガラクトース転移酵素活性を測定する工程、
    （ｃ）被験化合物を接触させない場合と比較して、ガラクトース転移酵素活性を変化させる化合物を選択する工程、を含む方法。
12. 請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または請求項６に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査方法であって、被検者における該遺伝子またはその発現制御領域の変異を検出することを含む方法。
13. 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を単離する工程
    （ｃ）単離したＤＮＡの塩基配列を決定する工程
    （ｄ）工程（ｃ）により決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程。
14. 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する工程
    （ｃ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
    （ｄ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
15. 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
    （ｃ）増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する工程
    （ｄ）ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する工程
    （ｅ）検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する工程
16. 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
    （ｃ）増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる工程
    （ｄ）解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する工程
    （ｅ）分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
17. 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＤＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域を増幅する工程
    （ｃ）増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する工程
    （ｄ）分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する工程
18. 請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常に関連した疾患の検査方法であって、被検者における該遺伝子の発現量を検出することを含む方法。
19. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１８に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
    （ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれる請求項６に記載のポリペプチドをコードするＲＮＡの量を測定する工程
    （ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
20. 以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む、請求項１８に記載の検査方法。
    （ａ）被検者から調製したｃＤＮＡ試料、および請求項５に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を提供する工程
    （ｂ）該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる工程
    （ｃ）該ｃＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれる請求項５に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を測定する工程
    （ｄ）測定された請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を対照と比較する工程
21. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１８に記載の検査方法。
    （ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
    （ｂ）該タンパク質試料に含まれる請求項６に記載のポリペプチドの量を測定する工程
    （ｃ）測定されたポリペプチドの量を対照と比較する工程
22. 疾患がＩｇＡ腎症またはＴｎ症候群である、請求項１２〜２１のいずれかに記載の検査方法。
23. 請求項６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはその発現制御領域にハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
24. 請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または請求項６に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬。
25. 請求項８に記載の抗体を含む、請求項６に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現の異常または請求項６に記載のポリペプチドの活性の異常に関連した疾患の検査薬。
26. 疾患がＩｇＡ腎症またはＴｎ症候群である、請求項２４または２５に記載の検査薬。
27. Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の発現が人為的に改変された遺伝子改変非ヒト動物。
28. Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変非ヒト動物。
29. 非ヒト動物がマウスである、請求項２７または２８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
30. 請求項２７〜２９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物から樹立された細胞。
31. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性を変化させる化合物のスクリーニング方法。
    （ａ）請求項２７〜２９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物に被検化合物を投与する、または、請求項３０に記載の細胞と被検化合物を接触させる工程
    （ｂ）前記遺伝子改変動物もしくは細胞におけるＣ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を測定する工程
    （ｃ）被検化合物を投与していない場合と比較して、Ｃ１Ｇａｌ−Ｔ２タンパク質の活性もしくは発現量を変化させる化合物を選択する工程

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