JP2006524492A - 血管形成に関連する核酸分子を同定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程;
(2)それぞれの時点で集められた細胞から総RNAを得る工程;
(3)それぞれの時点に由来する総RNAからcDNAを調製して、多数のcDNAプールを提供する工程;
(4)サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション(SSH)をそれぞれの時点に由来するcDNAプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している遺伝子に由来するcDNAを段階的に増幅するようにする工程。
(1)モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程;
(2)それぞれの時点で集められた細胞から総RNAを得る工程;
(3)それぞれの時点に由来する総RNAからcDNAを調製して、多数のcDNAプールを提供する工程;
(4)サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション(SSH)をそれぞれの時点に由来するcDNAプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現する遺伝子に由来するcDNAを段階的に増幅するようにする工程;
(5)増幅されたcDNAをクローン化する工程;
(6)各クローンに由来するDNAをマイクロアレイ上において突き止める工程;
(7)前記所定の時間間隔でインビトロモデルから集められた細胞に由来する総RNAの逆転写によってアンチセンスRNAを作製し、そのアンチセンスRNAを標識する工程;および
(8)マイクロアレイを、0時間およびそれ以外の他の時点のそれぞれに由来する標識されたアンチセンスRNAでプローブして、インビトロモデルにおいて前記時点でアップレギュレーションされている遺伝子に由来するcDNAを含有するクローンを別々に同定する工程。
(1)上記に記載されるような細胞を、ポリペプチドを産生させるために効果的な条件のもとで培養する工程;および
(2)ポリペプチドを集める工程。
本発明の別の局面によれば、上記に記載されるような血管形成関連障害を処置する方法が提供され、この方法は、本発明の血管形成遺伝子または血管形成タンパク質の選択的なアンタゴニストまたはアゴニストを、そのような処置を必要としている対象に投与することを含む。
遺伝子またはタンパク質の機能を阻害することを様々な方法で達成することができる。アンチセンス核酸方法論は、障害の原因となっている遺伝子を不活性化するための1つの方法を表す。アンチセンス法または遺伝子標的化サイレンシング法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスRNAの注入、アンチセンスRNA発現ベクターのトランスフェクション、および、RNA干渉(RNAi)または短い干渉RNA(siRNA)の使用(これらに限定されない)を含むことができる。RNAiを、その発現が血管形成に寄与するとき、遺伝子を封じるためにインビトロおよびインビボで使用することができる(SharpおよびZamore、2000;Grishok他、2001)。なおさらに、触媒作用核酸分子(例えば、DNAザイムおよびリボザイムなど)を遺伝子サイレンシングのために使用することができる(BreakerおよびJoyce、1994;HaseloffおよびGerlach、1988)。これらの分子は、従来のアンチセンス法の場合のようにその標的mRNA分子に単に結合するのではなく、その標的mRNA分子を切断することによって機能する。
遺伝子またはタンパク質の機能を強化、刺激または再活性化することを様々な方法で達成することができる。本発明の1つの局面において、上記に記載されるような単離された核酸分子の、そのような処置を必要としている対象への投与を開始することができる。典型的には、本発明の任意の関連した血管形成遺伝子を、血管形成関連障害を処置または防止するために対象に投与することができる。
本発明は、血管形成に関与する可能性がある数多くの遺伝子を提供しているため、従って、血管形成を調節するための方法が可能である。本発明のさらなる局面において、血管形成関連障害の処置のために使用される上記に記載される方法はどれも、細胞を含む任意のシステムにおける血管形成の調節のために使用することができる。これらのシステムには、インビトロアッセイシステム(例えば、Matrigelアッセイ、増殖アッセイ、遊走アッセイ、コラーゲンアッセイ、ウシ毛細血管内皮細胞アッセイなど)、インビボアッセイシステム(例えば、インビボMatrigel型アッセイ、ニワトリ漿尿膜アッセイ、単離された器官、組織または細胞など)、動物モデル(例えば、インビボ血管新生アッセイ、腫瘍血管形成モデルなど)、または処置を必要としている宿主(例えば、以前に記載されたような血管形成関連障害に罹患している宿主)が含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明のさらに別の局面によれば、本発明の核酸分子、同様に本発明のペプチド(特に、任意の関連した精製された血管形成ポリペプチドまたはそのフラグメント)、および、これらを発現する細胞は、血管形成関連障害を処置するための様々な技術における候補の薬学的化合物のスクリーニングのために有用である。
上記に示されるようなスクリーニングアッセイから同定された化合物は、血管形成に伴う障害を処置または改善するために、治療効果的な用量で患者に投与することができる。治療効果的な用量は、障害の症状の改善を生じさせるために十分な化合物のそのような量を示す。
遺伝子の活性および/または発現を変化させて、血管形成関連障害を生じさせる、本発明の血管形成遺伝子のいずれか1つにおける変異が存在するならば、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、これらの障害の診断もしくは予後のために、またはそのような障害に対する素因のために使用することができる。そのような障害の例には、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、および心臓血管疾患(例えば、アテローム性動脈硬化など)、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患が含まれるが、これらに限定されない。適切な治療的介入を開始するために、診断または予後は、疾患状態の重篤度、タイプまたは段階を明らかにするために使用することができる。
さらなる実施形態において、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれかに由来する完全なcDNA、オリゴヌクレオチドまたはより長いフラグメントはマイクロアレイにおけるプローブとして使用することができる。マイクロアレイは、非常に多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために、また、遺伝的な変化体、変異および多型を同定するために使用することができる。この情報は、遺伝子機能を明らかにするために、血管形成関連障害の遺伝的基礎を理解するために、血管形成関連障害の診断または予後を行うために、また、治療剤を開発し、その活性をモニターするために使用することができる。マイクロアレイは、この分野で知られている方法を使用して調製し、使用し、かつ分析することができる(例えば、Schena他(1996);Heller他(1997)を参照のこと)。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む遺伝子改変(ノックアウト、ノックインおよび遺伝子組換え)された非ヒト動物モデルの作製を規定する。これらの動物は、関連した血管形成遺伝子の機能の研究のために、血管形成遺伝子のプロセスを研究するために、これらの遺伝子に関連づけられるような血管形成疾患の機構を研究するために、血管形成関連障害を処置するための候補の薬学的化合物をスクリーニングするために、タンパク質または変異型タンパク質を発現する外植された哺乳動物細胞培養物を作製するために、また、潜在的な治療的介入を評価するために使用される。
数多くの先行技術刊行物が本明細書中に示されているが、この参照は、これらの文書のいずれかがこの分野またはオーストラリアまたは任意の他の国における共通する一般的な知識の一部を形成するということを認めるものでないことが明らかに理解される。本明細書および請求項の全体を通して、単語「含む」(「comprise」、「comprises」および「comprising」)は、文脈が別途要求する場合を除いて、非排他的意味で使用される。
図1は血管形成のインビトロモデルにおける規定された時点の期間中における選択された示差的に発現しているクローンの発現プロフィルの例を示す。インビトロ管形成アッセイの0.5時間、3時間、6時間および24時間の規定された段階での時点が、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために使用されたcy5色素(赤)およびcy3色素(緑)の対数比率に対してプロットされた。A:最大の発現を0.5時間の時点で有するクローンの例;B:最大の発現を3時間の時点で有するクローンの例;C:最大の発現を6時間の時点で有するクローンの例;およびD:最大の発現を24時間の時点で有するクローンの例。
図2は示差的に発現している遺伝子(BNO782およびBNO481)の発現プロフィルを示す。両遺伝子は最大の発現をインビトロ管形成アッセイの6時間の時点で示している。A:BNO782;B:BNO481。
図3はリアルタイムRT−PCRによって測定されたときの、BNO782 siRNA2により媒介されるBNO782の発現ノックダウン、およびBNO481 siRNA1により媒介されるBNO481の発現ノックダウンのレベルの分析を示す。それぞれの遺伝子に対して標的化された3つのsiRNAオリゴヌクレオチドは様々な程度に遺伝子の発現を低下させることができ、BNO781 siRNA2はBNO781の発現を24%阻害し(A)、BNO481 siRNA1はBNO481の発現を36%阻害した(B)。
図4はBNO782またはBNO481のmRNA発現を低下させることにより、HUVEC管形成が阻害されることを示す。BNO782 siRNA2、BNO481 siRNA1、またはベクターコントロールを感染させたHUVECをMatrigelに24時間置床した。ベクター感染細胞は管構造の広範囲の網状組織を形成した(AおよびC)。対照的に、BNO782 siRNA2またはBNO481 siRNA1を感染させた細胞は、非常に多数の不完全な管伸長を伴う、複雑性が著しく低下した管構造の網状組織を示した(BおよびD)。
血管形成のインビトロモデルは、本質的にはGamble他(1993)に記載される通りである。アッセイをホルボールミリスタートアセタート(PMA)および抗インテグリン(α2β1)抗体RMACIIの刺激下でのコラーゲン中で行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を2代〜4代の継代の間ですべての実験において使用した。
指定された時点で集められた細胞を、Trizol試薬(Gibco BRL)を製造者の条件に従って使用する総RNAの単離のために使用した。SMART(RNA転写物の5’末端での切り換え機構)技術を使用して、少量の総RNAを、cDNAサブトラクションを行うことを可能にするための十分なcDNAに変換した(下記参照)。これは、SMART PCR cDNA合成キット(Clontech使用者マニュアルPT3041−1)を製造者の推奨法に従って使用して達成された。SMART−PCR cDNA合成プロトコルは、cDNAサブトラクションのために続いてPCR増幅された大多数の全長cDNAをもたらした。
SSHを、選択された時点によって規定されるcDNA集団の間でアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを受けているcDNAについて濃縮するために、SMART増幅のcDNAに対して行った。この技術はまた、調節されたcDNAの「正規化」を可能にし、それにより、存在量が低いcDNA(すなわち、良好に発現されないが、重要な遺伝子)をより容易に検出可能にする。これを行うために、PCR−Select cDNA合成キット(Clontech使用者マニュアルPT3041−1)およびPCR−Select cDNAサブトラクションキット(Clontech使用者マニュアルPT1117−1)を製造者の条件に基づいて使用した。これらの手法はサブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションPCR増幅に依拠した。SSHを下記の集団の間で行った:0−0.5時間;0.5−3.0時間;3.0−6.0時間;6.0−24時間。
SSHの後、標準的な技術(Sambrook他、1989)を使用して、cDNAフラグメントをEagIで消化し、pBluescriptKS+における適合し得る唯一のNotI部位にクローン化した。これにより、フォワードおよびリバースのサブトラクションライブラリーがそれぞれの時間について得られた。最初に、フォワードサブトラクションライブラリーを、血管形成のインビトロモデルの期間中のそれらの発現においてアップレギュレーションされている遺伝子を表すそのようなクローンを同定するためにその後の研究において使用した。これを行うために、マイクロアレイ分析手法を採用した。
4つのフォワードサブトラクションライブラリーに由来する合計で10000個のクローン(0−0.5時間に由来する3200クローン;0.5−3時間に由来する3000クローン;3−6時間に由来する2800クローン;6−24時間に由来する1000クローン)を選び、マイクロアレイスライドを構築した。これらのクローンに由来する挿入物を、隣接するT3およびT7のpBluescriptKS+ベクタープライマーを用いた標準的なPCR技術を使用して増幅した。各クローンに由来するDNAを1枚のマイクロアレイスライドに二連でスポットした。適切な陽性コントロールおよび陰性コントロールもまたプレート上に含まれた。
指定された時間(0時間、0.5時間、3時間、6時間および24時間)で集められたヒト臍帯静脈内皮細胞を、Trizol試薬(Gibco BRL)を製造者の条件に従って使用する総RNAの単離のために使用した。それぞれの時点から、0.5μgの総RNAを、Ambion MessageAmpTM aRNAキットを使用してアンチセンスRNA(aRNA)を増幅するためのテンプレートとして使用した。簡単に記載すると、逆転写によって得られたメッセージのポリ(A)テールから伸びるT7プロモーター配列を含有するcDNAを合成するために、総RNAをT7オリゴ(dT)プライマーを用いて逆転写した。cDNAを二本鎖DNAテンプレートに変換し、そして、蛍光性CyDyeのカップリングを可能にするように5−(3−アミノアリル)−UTPを取り込むaRNAのインビトロ転写のために使用した。最初の総RNAが5%未満のmRNAを含有したことを仮定すると、典型的な増幅反応は約10μgのmRNA(400Xを越える増幅)をもたらしたと考えられる。
CyDyeカップリング後、合成されたaRNAをマイクロアレイスライドに対するハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用した(3.0μg〜3.5μg)。行われたハイブリダイゼーションは下記の通りであった:
1.0対0.5h(6枚のスライド、3回のDye交換)
2.0対3h(4枚のスライド、2回のDye交換)
3.0対6h(4のスライド、2回のDye交換)
4.0対24h(4枚のスライド、2回のDye交換)
マイクロアレイハイブリダイゼーションの分析から、合計で1963個のクローンが、血管形成のインビトロモデルの期間中の指定された時点でそれらの発現においてアップレギュレーションされていると同定された。図1は、クローンの選択のための、インビトロモデルにおける規定された時点の期間中に観測された発現プロフィルの一例を示す。1963個のクローンのそれぞれを配列決定し、続くインシリコデータベース分析を使用して、ベクター配列のみを含有するクローン、および、不良な配列が得られたクローンを除いた。この後、冗長性スクリーニングを使用して、クローンを、それらが表す個々の遺伝子に従ってグループ分けした。これにより、血管形成のプロセス期間中のそれらの発現においてアップレギュレーションされていることが見出された合計で523個の遺伝子が残った。
血管形成における表1および表2の遺伝子の関与についてのさらなる証拠を、各遺伝子の機能的分析によって、例えば、それらの発現のノックダウンが内皮細胞(EC)の機能および毛細管形成に対して有する影響を調べることによって得ることができる。
BNO782およびBNO481のRNAi媒介によるノックダウンのための短い干渉RNA(siRNA)オリゴヌクレオチドを自作のコンピュータソフトウエアの適用によって同定した。このソフトウエアは、適切なsiRNAオリゴヌクレオチドを選択するための一連のパラメーターを取り込む。これらのパラメーターは、siRNA配列がAAジヌクレオチドの後で開始し、siRNAが遺伝子のオープンリーディングフレーム内およびATG開始コドンの100bp下流に存在し、siRNAのGC含有量が35%〜60%の間にあり、かつ、siRNAが、4つ以上のTヌクレオチド、Aヌクレオチド、CヌクレオチドまたはGヌクレオチドからなる領域を有しないことを保証する。複雑性が低い領域を有するsiRNA配列は使用しなかった。また、BLAST分析を使用して、多数の遺伝子と交差ハイブリダイゼーションするプローブを除くように選択した(“expect 500”および“word size 7”でのBlastn_refseq、ならびに、19>スコア>15で許容されたアラインメントスコア[この場合、アライメントスコア=一致する長さ−(ギャップ+ミスマッチ)])。siRNAをレトロウイルスベクターへのクローニングのためにヘアピン様式で合成した。各遺伝子について、3つのsiRNAオリゴヌクレオチドを選択し、各1つを遺伝子ノックダウンおよびEC機能に対するそれらの影響について個々に調べた。
それぞれのsiRNAオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドをヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に送達するためのレトロウイルスベクターにクローン化した。siRNAベクターをpMSCVpuro(BD Biosciences)の改変によって構築した。簡単に記載すると、pMSCVpuroの3’LTRをXbaI/NheIフラグメントの除去によって不活性化した。その後、H1−RNAポリメラーゼIIIプロモーターカセットをベクターのMCSに挿入した。アニーリングしたsiRNAプライマーを、BglIIおよびHindIIIの制限酵素で消化された改変ベクター(pMSCVpuro(H1))に連結した。
96ウエル組織培養プレートを2層プロセスで4℃において50μLの冷Matrigel(BD Biosciences)でコーティングした。Matrigelを、使用前に、少なくとも30分間、37℃で重合させた。トリプシン処理した細胞を500μLのEGM−2培地に集め、400rcfで3分間遠心分離して、細胞をペレットにした。これは、アッセイを妨害し得るトリプシンの除去を可能にした。細胞ペレットを500μLのEGM−2培地に再懸濁し、血球計を使用して計数した。細胞をEGM−2培地において2.5x105細胞/mLに希釈した。100μLの希釈された細胞懸濁物を二連のMatrigelコーティングウエルに加えた。最終的な細胞密度は25000細胞/ウエルであった。プレートを加湿インキュベーターにおいて37℃で5%CO2とともに22時間インキュベーションした。画像を、4X対物レンズおよびOptonics MagnaFireソフトウエアを用いるOlympus BX−51顕微鏡を使用して得た。リアルタイムRT−PCR分析(下記参照)のためのRNAを抽出するために、残る細胞を400rcfで3分間ペレット化して、培地を除き、ペレットを−80℃で保存した。行われたすべてのアッセイについて、ベクターコントロールが含められた。これは、siRNA挿入物を含有しないベクターについて行われたウイルスによる感染および選抜プロセスを受けているHUVECからなった。これは、コントロール(ベクター)と分析中の個々のsiRNAとの間における毛細管形成能力の比較を可能にした。
HUVECにおいて生じる(siRNAにより媒介される)遺伝子ノックダウンのレベルを測定するために、リアルタイムRT−PCRを用いた。これは、RNeasy MiniキットまたはRNeasy Midiキット(Qiagen)を製造者の説明書(オンカラムDNase処理を含む)に従って使用する感染細胞からのRNAの単離を伴った。総RNAを、品質および純度について調べるために、臭化エチジウムを含有する1.2%TBEアガロースゲルにおいて可視化した。総RNA濃度を分光光度計でのA260によって決定した。
BNO782およびBNO481の発現をノックダウンするために設計されたsiRNAオリゴヌクレオチドは配列番号45〜47および配列番号48〜50によってそれぞれ表される。これらのsiRNAをレトロウイルスにより感染させたHUVECのリアルタイムRT−PCR分析は、それぞれのsiRNAが様々な程度でBNO782またはBNO481の発現をノックダウンすることができたことを明らかにした。BNO782 siRNA(配列番号46)によって媒介されるBNO782の発現ノックダウンのレベルは24%(図3A)であり、一方、BNO481の発現は、BNO481 siRNA1(配列番号48)を使用したとき、36%減少した(図3B)。続いて、これらのsiRNAはともに、それぞれの遺伝子についてのこのレベルのノックダウンが、毛細管形成に関係するHUVECの能力に対して有した影響を調べるために、Matrigelアッセイにおいて別々に使用された。図4において認めることができるように、BNO782またはBNO481のmRNAレベルを低下させることにより、HUVEC管形成が阻害される。ベクター感染細胞は管構造の広範囲の網状組織を形成し(図4Aおよび図4C)、一方、BNO782 siRNA2またはBNO481 siRNA1を感染させた細胞は、非常に多数の不完全な管伸長を伴った、複雑性が著しく低下した管構造の網状組織を示した(図4Bおよび図4D)。この結果から、血管形成のプロセスにおけるBNO782およびBNO481の両方についての役割が確認される。
既知のタンパク質および未知のタンパク質と結合する本発明の血管形成タンパク質(BNO782およびBNO481を含む)のいずれか1つの能力を調べることができる。酵母ツーハイブリッドシステムなどの手法が、何らかの機能的パートナーを発見および同定するために使用される。酵母ツーハイブリッド手法の基礎となっている原理は、酵母における転写活性化因子を含めて、真核生物の多くの転写活性化因子は、2つの異なったモジュール状ドメインからなるということである。第1のドメインは、特異的なプロモーター配列に結合するDNA結合ドメインであり、第2のドメインは、RNAポリメラーゼII複合体に、DNA結合部位の下流側の遺伝子を転写することを行わせる活性化ドメインである。いずれのドメインも単独では転写を活性化することができないため、両方のドメインが転写活性化のために要求される。酵母ツーハイブリッド手法では、目的とする遺伝子またはその一部分(おとり)が、DNA結合ドメインを有するペプチドに対する融合体として発現されるような方法でクローン化される。第2の遺伝子または数多くの遺伝子(例えば、cDNAライブラリーに由来する遺伝子など)(標的)が、活性化ドメインに対する融合体として発現されるようにクローン化される。目的とするタンパク質とその結合パートナーとの相互作用はDNA結合ペプチドを活性化ドメインと一緒にし、レポーター遺伝子の転写を開始させる。第1のレポーター遺伝子は、相互作用するタンパク質を含有する酵母細胞のために選択される(このレポーターは通常、選択培地における成長のために要求される栄養遺伝子である)。第2のレポーターは確認のために使用され、一方、相互作用するタンパク質に応答して発現している間は通常、成長のために要求されない。
Claims (136)
- 生物学的システムのインビトロモデルにおいて示差的に発現している核酸分子を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法:
(1)モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程;
(2)それぞれの時点で集められた細胞から総RNAを得る工程;
(3)それぞれの時点に由来する総RNAからcDNAを調製して、多数のcDNAプールを提供する工程;
(4)サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション(SSH)をそれぞれの時点に由来するcDNAプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している核酸分子に由来するcDNAを段階的に増幅するようにする工程。 - モデルシステムは血管形成に対するインビトロモデルである請求項1に記載の方法。
- 請求項1または2の方法によって同定される、血管形成時に示差的に発現している核酸分子。
- 表1および表2に掲げられるものからなる群から選択される請求項3に記載の核酸分子。
- 生物学的システムのインビトロモデルにおいてアップレギュレーションされている核酸分子を同定するための方法であって、下記の工程を含む方法:
(1)モデルシステムから所定の時点で細胞を集める工程;
(2)それぞれの時点で集められた細胞から総RNAを得る工程;
(3)それぞれの時点に由来する総RNAからcDNAを調製して、多数のcDNAプールを提供する工程;
(4)サプレッション・サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション(SSH)をそれぞれの時点に由来するcDNAプールに対して順次行い、その結果、ある期間から次の期間まで示差的に発現している核酸分子に由来するcDNAを段階的に増幅するようにする工程;
(5)増幅されたcDNAをクローン化する工程;
(6)各クローンに由来するDNAをマイクロアレイ上において突き止める工程;
(7)前記所定の時間間隔でインビトロモデルから集められた細胞に由来する総RNAの逆転写によってアンチセンスRNAを作製し、そのアンチセンスRNAを標識する工程;および
(8)マイクロアレイを、0時間およびそれ以外の他の時点のそれぞれに由来する標識されたアンチセンスRNAでプローブして、インビトロモデルにおいて前記時点でアップレギュレーションされている核酸分子に由来するcDNAを含有するクローンを別々に同定する工程。 - インビトロモデルは血管形成に対するインビトロモデルである請求項5に記載の方法。
- 請求項5または6の方法によって同定される核酸分子。
- 表1および表2に掲げられるものからなる群から選択される請求項7に記載の核酸分子。
- 請求項3,4,7または8のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド。
- 配列番号1〜配列番号44の一つに規定される配列を含む単離された核酸分子。
- 配列番号1〜配列番号44の一つに規定される配列を含むかまたは表1および表2に掲げられる単離された核酸分子またはそれらのフラグメントであって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子またはそれらのフラグメント。
- 配列番号1〜配列番号44の一つに規定される配列を含む核酸分子に対してまたは表1および表2に掲げられる核酸分子に対して少なくとも70%の同一性を有する単離された核酸分子であって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
- 少なくとも85%の同一性を有する請求項12に記載の単離された核酸分子。
- 少なくとも95%の同一性を有する請求項12に記載の単離された核酸分子。
- 血管形成プロセスにおいて役割を果たしているポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、配列番号1〜配列番号44の一つに規定されるヌクレオチド配列を含む核酸分子とまたは表1および表2に掲げられる核酸分子とストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションする単離された核酸分子。
- 血管形成に関連する疾患において役割を果たすポリペプチドをコードする請求項10〜15のいずれか一項に記載の単離された核酸分子であって、前記疾患はがん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患を含むが、これらに限定されない単離された核酸分子。
- 配列番号1〜配列番号44に規定されるヌクレオチド配列のいずれか一つからなる単離された核酸分子。
- 血管形成プロセスに関与している全長のヒト遺伝子を同定および/または取得するための、配列番号1〜配列番号15、配列番号17〜配列番号37および配列番号39〜配列番号44に規定される配列を有するDNA分子からなる群から選択される核酸分子の使用。
- 追加の配列が、前記核酸分子のうち一つ以上とのハイブリダイゼイション、インバースPCR、制限部位PCR、歩行PCR技術、またはRACEを使用して得られる請求項18に記載の使用。
- 配列番号1〜配列番号15、配列番号17〜配列番号37および配列番号39〜配列番号44から選択される核酸分子の使用によって同定される遺伝子。
- 配列番号51〜配列番号58の一つに規定される配列を含む単離されたポリペプチド。
- 配列番号51〜配列番号58の一つに規定される配列を含むかまたは表1および表2に掲げられる単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメントであって、血管形成プロセスにおいて役割を果たしている単離されたポリペプチドまたはそれらのフラグメント。
- 血管形成プロセスにおいて役割を果たし、配列番号51〜配列番号58の一つに規定されるアミノ酸配列に対してまたは表1および表2に掲げられる遺伝子に対して少なくとも70%の同一性を有する単離されたポリペプチド。
- 少なくとも85%の配列同一性を有する請求項23に記載の単離されたポリペプチド。
- 少なくとも95%の配列同一性を有する請求項23に記載の単離されたポリペプチド。
- 血管形成プロセスに関連する疾患において役割を果たす請求項21〜25のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドであって、前記疾患はがん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、アテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患を含むが、これらに限定されない単離されたポリペプチド。
- 配列番号51〜配列番号58に規定されるアミノ酸配列のいずれか一つからなる単離されたポリペプチド。
- 請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項28に記載の発現ベクターを含む細胞。
- 真核生物の細胞である請求項29に記載の細胞。
- 下記の工程を含むポリペプチドを調製する方法:
(1)請求項29または30に記載の細胞を、ポリペプチドの産生のために効果的な条件のもとで培養する工程;および
(2)ポリペプチドを集める工程。 - 請求項31に記載の方法により調製されたポリペプチド。
- 血管形成を調節する方法であって、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を細胞内で調節する工程を含む方法。
- 核酸分子は配列番号1〜配列番号44からなる群から選択される請求項33に記載の方法。
- ポリペプチドが請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項33に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号51〜配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項35に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項33に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項33に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項33に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションするRNA分子である請求項39に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項39に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項39に記載の方法。
- 触媒作用核酸分子がDNAザイムである請求項42に記載の方法。
- 触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項42に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項33に記載の方法。
- 抗体が完全なヒト抗体である請求項45に記載の方法。
- 抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはFabフラグメント、(Fab’)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項45に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項33に記載の方法。
- 核酸分子が請求項28に記載の発現ベクターによって導入される請求項48に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項33に記載の方法。
- 血管形成が、制御されない血管形成または増強された血管形成である請求項33〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 血管形成が不適当に停止されているかまたは低下されている請求項33〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 血管形成関連障害の処置方法であって、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を調節する工程を含む方法。
- 核酸分子が配列番号1〜配列番号44からなる群から選択される請求項53に記載の方法。
- ポリペプチドが請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項53に記載の方法。
- ポリペプチドが配列番号51〜配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項55に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項53に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項53に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項53に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションするRNA分子である請求項59に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項59に記載の方法。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項59に記載の方法。
- 触媒作用核酸分子がDNAザイムである請求項62に記載の方法。
- 触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項62に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項53に記載の方法。
- 抗体が完全なヒト抗体である請求項65に記載の方法。
- 抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはFabフラグメント、(Fab’)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項65に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項53に記載の方法。
- 核酸分子が請求項28に記載の発現ベクターによって導入される請求項68に記載の方法。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項53に記載の方法。
- 血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項53〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項71に記載の方法。
- 血管形成関連障害が、不適当に停止されているかもしくは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項53〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項73に記載の方法。
- 血管形成関連障害を処置するための医薬品の製造における、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性の調節因子の使用。
- 核酸分子の配列は配列番号1〜配列番号44からなる群から選択される請求項75に記載の使用。
- ポリペプチドが請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその活性なフラグメントである請求項75に記載の使用。
- ポリペプチドが配列番号51〜配列番号58からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項77に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子のアンタゴニストまたはアゴニスト、または請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニストの細胞への導入によって調節される請求項75に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対するアンチセンスの細胞への導入によって調節される請求項75に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の少なくとも一部の相補体でありかつ前記核酸分子の発現またはレベルを調節することができる核酸分子の細胞への導入によって調節される請求項75に記載の使用。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションするRNA分子である請求項81に記載の使用。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるmRNAとハイブリダイゼーションする短い干渉オリゴヌクレオチドである請求項81に記載の使用。
- 核酸分子が請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対して標的化された触媒作用核酸分子である請求項81に記載の使用。
- 触媒作用核酸分子がDNAザイムである請求項84に記載の使用。
- 触媒作用核酸分子がリボザイムである請求項84に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性がポリペプチドに結合することができる抗体によって調節される請求項75に記載の使用。
- 抗体が完全なヒト抗体である請求項87に記載の使用。
- 抗体が、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはFabフラグメント、(Fab’)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項87に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子またはその活性なフラグメントまたはその変化体を細胞に導入することによって調節される請求項75に記載の使用。
- 核酸分子が請求項28に記載の発現ベクターによって導入される請求項90に記載の使用。
- ポリペプチドの発現または活性が、請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドを細胞に導入することによって調節される請求項75に記載の使用。
- 血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項75〜92のいずれか一項に記載の使用。
- 障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項93に記載の使用。
- 血管形成関連障害が、不適当に停止されているかまたは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項75〜92のいずれか一項に記載の使用。
- 障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項95に記載の使用。
- 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
- 請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
- 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
- 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングのための、請求項29または30に記載の細胞の使用。
- 請求項29または30に記載の細胞の使用により同定される血管形成関連障害の処置に有用な化合物。
- 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程:
(1)請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドを提供する工程;
(2)候補薬学的化合物を前記ポリペプチドに添加する工程;および
(3)前記ポリペプチドへの前記候補薬学的化合物の結合を決定する工程;
を含み、ポリペプチドに結合する化合物が候補薬学的化合物である方法。 - 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程:
(1)請求項29または30に記載の細胞を提供する工程;
(2)候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程;および
(3)前記細胞の機能的特性に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程;
を含み、前記細胞の機能的特性を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。 - 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程:
(1)請求項29または30に記載の細胞を提供する工程;
(2)候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程;および
(3)前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子の発現に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程;
を含み、前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子の発現を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。 - 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニング方法であって、以下の工程:
(1)請求項29または30に記載の細胞を提供する工程;
(2)候補薬学的化合物を前記細胞に添加する工程;および
(3)前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性に対する前記候補薬学的化合物の効果を決定する工程;
を含み、前記細胞の発現ベクターの一部である核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現または活性を変化させる化合物が候補薬学的化合物である方法。 - 請求項103〜106のいずれか一項に記載の方法によって同定される化合物。
- 請求項98,100,102または107のいずれか一項に記載の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
- 請求項21に記載の単離されたポリペプチドと免疫学的に反応する抗体。
- 完全なヒト抗体である請求項109に記載の抗体。
- モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはFabフラグメント、(Fab’)2フラグメント、Fvフラグメント、単鎖抗体および単一ドメイン抗体を含む抗体フラグメントからなる群から選択される請求項109に記載の抗体。
- 請求項10に記載の核酸分子によってコードされるmRNAに対して標的化される短い干渉オリゴヌクレオチド。
- 請求項10に記載の核酸分子に対して標的化される触媒作用核酸分子。
- DNAザイムである請求項113に記載の触媒作用核酸分子。
- リボザイムである請求項113に記載の触媒作用核酸分子。
- 血管形成関連障害の診断または予後における請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
- 血管形成関連障害の診断または予後における請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 血管形成関連障害の診断または予後における請求項109〜111のいずれか一項に記載の抗体または請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する抗体の使用。
- 血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程:
(1)正常なヒトにおいて、請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の正常な発現および/または活性についてプロフィルを確立する工程;
(2)遺伝子の異常な発現および/または活性が疑われる対象において前記核酸分子の発現および/または活性のレベルを測定する工程;および
(3)測定した前記核酸分子の発現および/または活性のレベルを正常な発現および/または活性についてのプロフィルと比較する工程;
を含み、前記対象における前記核酸分子の発現および/または活性の変化したレベルが、血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。 - 逆転写酵素PCRが発現のレベルを測定するために利用される請求項119に記載の方法。
- 遺伝子またはそのフラグメントに由来するプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイが発現のレベルを測定するために利用される請求項119に記載の方法。
- 血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程:
(1)対象から請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子に対応するDNAを得る工程;および
(2)前記対象からのDNAを野生型核酸分子に対応するDNAと比較する工程;
を含み、前記対象における変化したDNA特性が血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。 - 核酸分子のDNAが配列決定され、配列が比較される請求項122に記載の方法。
- 核酸分子のDNAがSSCP分析に供される請求項122に記載の方法。
- 血管形成関連障害の診断または予後のための方法であって、以下の工程:
(1)請求項9,21〜27または32のいずれか一項に記載の野生型ポリペプチドの物理的特性を確立する工程;
(2)前記ポリペプチドが異常になっていると疑われる対象から前記ポリペプチドを得る工程;および
(3)前記対象によって発現されるポリペプチドの特性を測定し、それを野生型ポリペプチドの確立された特性と比較するする工程;
を含み、前記対象における変化したポリペプチド特性が、血管形成関連障害の徴候であるか、またはその素因である方法。 - 特性が電気泳動移動度である請求項125に記載の方法。
- 特性がタンパク質分解的切断パターンである請求項125に記載の方法。
- 請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む遺伝子改変された非ヒト動物。
- 請求項3,4,7,8または10〜17のいずれか一項に記載の核酸分子の破壊を含む遺伝子改変された非ヒト動物。
- 動物が、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタならびにサルおよびチンパンジーの如き非ヒト霊長類からなる群から選択される請求項128または129に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 動物がマウスである請求項128〜130のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
- 血管形成関連障害の処置に有用な候補薬学的化合物のスクリーニングにおける請求項128〜131のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物の使用。
- 血管形成関連障害が、制御されない血管形成または増強された血管形成に関係するか、または低下された脈管構造が有利である障害である請求項97〜102または132のいずれか一項に記載の使用。
- 障害が、がん、関節リウマチ、糖尿病網膜症、乾癬、およびアテローム性動脈硬化の如き心臓血管疾患からなる群から選択される請求項133に記載の使用。
- 血管形成関連障害が、不適当に停止されているかまたは低下されている血管形成に関係するか、または拡大された脈管構造が有利である障害である請求項97〜102または132のいずれか一項に記載の使用。
- 障害が、虚血性四肢疾患および冠状動脈疾患からなる群から選択される請求項135に記載の使用。
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