KR102033215B1

KR102033215B1 - 건선 유발 동물 모델 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102033215B1
Application number: KR1020170082620A
Authority: KR
Inventors: 이창우; 고현정; 김수현; 배서윤
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2019-10-16
Also published as: US20190281797A1; CN109475108A; KR20180005113A; US20200396973A1

Abstract

본 발명은 건선 유발 동물 모델 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된 건선 유발 동물 모델 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 동물 모델은 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1(Pellino homolog 1) 유전자를 과발현되어 건선 환자에서 나타나는 표현형과 유사성을 나타냄을 확인하였는바, 건선 치료를 위한 후보약물 스크리닝 등의 임상적 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 기질 단백질과 Peli1 단백질의 정상적 기질 결합을 방해하는 FHA 결합 모티브를 표적으로 하는 Peli1 FHA 도메인 유래 펩타이드를 통해 건선 관련 질병의 신약 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대되며, 이에 더하여, 상기 Peli1 단백질의 발현수준을 확인함으로써, 건선 환자의 질병 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

건선 유발 동물 모델 및 이의 용도{Animal model inducing psoriasis and use thereof}

본 발명은 건선 유발 동물 모델 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1(Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된 건선 유발 동물 모델 및 이의 용도에 관한 것이다.

건선은 대표적인 만성피부질환으로서 발병 후에는 10-20년은 지속되는 경우가 대부분이며 치료로 인하여 일시적으로 좋아지더라도 평생 재발에 대한 가능성을 안고 살아야 한다. 건선은 경계가 분명한 은백색의 인설로 덮여 있는 홍반성 피부 병변이 특징으로서 주로 자극을 많이 받는 부위인 팔꿈치, 무릎, 엉덩이, 두피 등에서 발생한다. 또한 건선은 여러 가지 합병증을 통발 할 수 있다. 그 중 건선 환자들에게 발생하는 특이적 관절염인 건선 관절염이 있다. 이러한 건선은 발병을 직접적으로 예방할 수 있는 방법은 현재까지 없으며 악화를 예방하는 것이 최선의 방법이다. 여러 통계에 의하면 건선을 진단받은 환자의 수가 세계적으로는 약 3% 정도이며 국내에서는 약 1-2% 정도 이며 이 중에서도 약 3분의 1 정도의 환자가 완치가 거의 불가한 중증 건선 환자이다. 특히, 건강보험심사평가원의 자료에 따르면 2013년 한 해 동안 국내에서 16만 3936명이 건선으로 치료를 받은 것으로 드러나 있다.

건선의 원인은 아직 정확하게 규명되어 있지 않지만 최근에는 피부에 있는 면역세포인 T세포의 활성이 증가되어 그 결과 T세포에 의해 분비된 사이토카인이 표피세포를 자극하여 표피세포의 과다한 증식과 염증을 일으키는 것으로 면역학적 이상과 유전자의 변이가 주된 연구 분야로 떠오르고 있다. 그 외에도 환경적 요인, 약물, 지속적인 피부자극, 피부 건조, 상기도 염증, 정신적 스트레스 등이 건선을 일으키거나 악화시키는 요인으로 증명되고 있다.

건선의 치료에는 다양한 방법들이 쓰이고 있고 더욱 효과적인 치료법을 찾기 위하여 여러 가지 방법들이 시도되고 있다. 약을 직접 피부에 바르는 국소치료, 광선을 이용한 광치료, 면역억제제나 스테로이드 제제의 약을 복용하는 전신치료로 나누어 지며, 이러한 치료법들은 환자의 경우에 맞게 복합하여 복합치료를 하는 등 여러 방법이 있다. 건선의 심각도, 활성도, 병변의 형태와 상태, 발생 부위에 따라 치료방법이 결정되며 환자의 나이, 치료 접근 가능성과 정신적 상태도 매우 중요하다. 가벼운 경우에는 대개 바르는 약으로 치료를 시작하며, 중증이 되면 광치료나 먹는 약을 함께 사용하게 된다. 그리고 최근에는 다양한 연구를 통하여 개발된 생물학적 제제들이 임상 테스트를 통하여 안정성에 대해 검증 중에 있으며 실제로 환자들에게 생물학적 제제가 쓰이기도 한다. 그렇지만 기존의 치료법들은 대부분 증세를 완화시키는 효과는 있으나 근본적인 치료법은 되지 못하며, 특히 건선의 환자 맞춤형 또는 표적치료법 아직 보고된 바 없다.

이에, 건선에 대한 효과적인 진단 및 치료에 대한 필요성이 요구되고 있으며, 건선의 메커니즘 연구와 치료법 연구를 위한 생체 시료 개발을 위하여 적합한 동물모델은 필수적인바, 이에 연구가 활발히 이루어지고 있으나(한국 공개특허 10-2010-0021561), 아직 미비한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 독시사이클린 투여에 따라 Peli1 유전자가 과발현되도록 형질전환시킨 마우스를 중증 건선의 치료를 위한 동물모델로서 사용할 수 있음을 확인하였을 뿐만 아니라, Peli1 단백질의 과발현에 의한 건선의 유발 가능성을 확인하여, Peli1 단백질 발현 또는 활성 억제제가 건선을 예방, 개선, 억제 또는 치료할 수 있으며, 기질 단백질의 FHA 결합 모티브를 표적으로 하는 Peli1 FHA 도메인 유래 펩타이드가 Peli1 단백질의 정상적 기질 결합을 방해함으로써 새로운 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이에, 본 발명의 목적은 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된, 건선 유발 동물 모델 및 상기 건선 유발 동물 모델 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 동물모델을 이용한 건선 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

또한, 가장 빈번하게 처방되고 있는 건선의 전신적 치료제인 면역억제제나 스테로이드 제제에 의해서 Peli1 단백질 과발현에 의해서 유도된 건선이 효율적으로 치료되기에 Peli1을 건선 치료제 개발의 치료 표적에 대한 활용 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 Peli1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 5 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 세포 투과성 펩타이드와 서열번호 5 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드 및 및 상기 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 Peli1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된, 건선 유발 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Peli1 유전자는 독시사이클린의 투여에 따라 과발현될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Peli1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 건선 유발 동물 모델 제조방법을 제공한다:

(a) Peli1 (pellino homolog 1) 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주동물의 수정란에 도입하는 단계;

(b) 상기 도입된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시키고 출산시켜서 1세대 후대동물을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 수득한 1세대 후대동물과 rtTA (reverse tetracycline transactivator) 모델동물을 교배시켜서 2세대 후대동물을 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 건선 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:

a) 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및

b) 상기 후보물질을 처리한 동물모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계.

또한, 본 발명은 Peli1 (Pellino homolog 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 Peli1 단백질은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 코딩될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 Peli1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Peli1 단백질의 발현 억제제는 Peli1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA (Short hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Peli1 단백질의 활성 억제제는 상기 Peli1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 5 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 펩타이드는 Peli1 단백질과 기질 단백질과의 결합을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 투과성 펩타이드와 서열번호 5 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, Peli1 결합 활성 저해 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드는 GS linker로 연결되어 있을 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포 투과성 펩타이드는 폴리아르기닌 (Polyarginines), Tat₄₉ _-57, 페너트라틴 (Penetratin), Pep-1, 트랜스포탄 (Transportan), NLS (Nuclear localization sequence) 및 HP4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 건선 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 건선 예방 또는 치료용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 건선 치료용 조성물 제조를 위한 Peli1(Pellino homolog 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 신규한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 Peli1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 건선 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 건선을 진단하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 Peli1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 Peli1 단백질의 건선의 진단용도를 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 동물 모델은 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현되어 건선 환자에서 나타나는 표현형과 유사성을 나타냄을 확인하였는바, 건선에 대한 효과적인 치료법 연구를 위한 생체 시료 개발을 위하여 동물 모델의 설계가 가능하며, 건선 치료를 위한 후보약물 스크리닝 등의 임상적 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

또한, Peli1 단백질의 발현 또는 활성을 억제를 통한 건선의 예방, 개선, 억제 또는 치료 가능성을 구체적으로 확인하였으며, 기질 단백질과 Peli1 단백질의 정상적 기질 결합을 방해하는 FHA 결합 모티브를 표적으로 하는 Peli1 FHA 도메인 유래 펩타이드를 통해 건선 관련 질병의 신약 개발에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

이에 더하여, 상기 Peli1 단백질의 발현수준을 확인함으로써, 건선 환자의 질병 정도를 평가하는데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 독시사이클린 투여에 따라 Peli1이 과발현되는 Peli1 유도발현 마우스(doxycycline inducible Peli1 transgenic mice)의 제작과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 1b는 독시사이클린 투여에 따라 Peli1이 과발현되도록 형질전환 됐는지 여부를 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 2는 독시사이클린 투여에 따른 Peli1 유도발현 마우스의 각 조직에서 Peli1 단백질 발현을 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 결과이다.
도 3a는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 자발적 병변 유도를 육안으로 비교한 결과이다.
도 3b는 상기 도 3a와 같은 표현형이 나타난 마우스의 비율을 산출한 결과이다.
도 3c는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 병변 수준을 점수화하여 나타낸 결과이다.
도 4a는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, H&E 염색을 통해 피부층의 구조를 비교한 결과이다.
도 4b는 유도 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 Peli1의 과발현이 유도되는 세포를 확인하기 위해 Peli1 항체와 건선 질병 마커 단백질인 Psoriasin 항체를 이용하여 면역염색을 한 결과이다.
도 4c는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, 기저층의 마커인 K14, 유극층의 마커인 K10, 과립층의 마커인 Loricrin에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행하여 피부층 발달 변화를 비교한 결과이다.
도 4d는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, Ki67와 K14에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행하여 기저층 세포들의 증식능력을 비교한 결과이다.
도 4e는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, CD31 항체를 이용하여 면역염색을 수행하여 혈관 생성 변화를 비교한 결과이다.
도 4f는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, CD3 항체를 이용하여 면역염색을 수행하여 T 세포의 침윤 변화를 비교한 결과이다.
도 4g 및 4h는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, 피부병변 주변의 림프절 변화를 비교한 결과이다.
도 4i는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, 유세포 분석법를 이용하여 림프절에서 면역세포의 활성화를 비교한 결과이다.
도 4j와 도 4k는 상기 도 4i의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 4l은 상기 도 4i의 결과에서 활성화 되어 있는 T 세포의 비율을 독시사이클린 투여에 따라 비교한 것이다.
도 5a는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, 림프절의 CD3⁺ T 세포의 cDNA를 이용하여 IFNγ, IL-4, IL-22, IL-23과 같은 사이토카인의 수준을 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 비교한 결과이다.
도 5b는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, IL-17에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행한 결과이다.
도 5c는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, IL-23에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행한 결과이다.
도 6a는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여 및 제거에 따른 자발적 병변 유도를 육안으로 비교한 결과이다.
도 6b는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여 및 제거에 따른 병변 수준을 점수화하여 나타낸 결과이다.
도 6c는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 독시사이클린 투여 및 제거에 따른 건선 유발 여부를 검증하기 위해, H&E 염색을 통해 피부층의 구조를 비교한 결과이다.
도 7a는 Peli1 단백질의 발현이 억제되었을 때 건선 유발이 억제되는지 확인하기 위하여, 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에 이미퀴모드 유도 건선 모델을 적용한 모식도이다.
도 7b는 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에 이미퀴모드 (Imiquimod, toll-like receptor 7/9 작용제) 처리에 따라 발생한 건선 병변을 육안으로 비교한 결과이다.
도 7c는 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 이미퀴모드 처리에 따른 건선 병변 수준을 점수화하여 나타낸 결과이다.
도 7d는 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 이미퀴모드 처리에 따른 피부의 두께를 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 7e는 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 이미퀴모드를 4번 처리한 후 건선 병변 수준을 검증하기 위해, H&E 염색을 통해 피부층의 구조를 비교한 결과이다.
도 8a는 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)의 치료약 효능 평가를 위한 전 임상(Preclinical) 동물 모델로서 검증을 위해, Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 12주 동안 독시사이클린을 투여한 후에 기존 건선 전신치료제인 사이클로스포린 (cyclosporine, CsA)와 메소트렉세이트 (methotrexate, MTX)를 복강 주사 투여에 대한 모식도이다.
도 8b는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 12주 동안 독시사이클린 투여한 후에 면역억제제인 사이클로스포린 (CsA)와 메소트렉세이트 (MTX)를 일정 기간 동안 복강주사한 후 건선 병변의 수준을 비교하기 위해, H&E 염색을 통해 피부층의 구조를 비교한 결과이다.
도 8c는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 12주 동안 독시사이클린 투여한 후에 면역억제제인 사이클로스포린 (CsA)와 메소트렉세이트 (MTX)를 일정 기간 동안 복강주사한 후 건선 병변의 수준을 점수화하여 나타낸 결과이다.
도 8d는 Peli1 유도발현 마우스(rtTA-Peli1)와 대조군 마우스(rtTA)에서 12주 동안 독시사이클린 투여한 후에 면역억제제인 사이클로스포린 (CsA)와 메소트렉세이트 (MTX)를 일정 기간 동안 복강주사한 후 피부의 두께를 측정하여 그래프로 나타낸 결과이다.
도 9a는 Peli1 mRNA에서의 단백질의 합성을 저해하기 위하여 타겟 mRNA 서열을 확인하고 이에 대한 shRNA를 제작하는 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 9b는 상기 7a를 통해 제작된 shRNA를 세포 내로 주입하여 Peli1 단백질의 발현이 억제되는지를 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 Peli1의 결합 활성을 저해하는 펩타이드의 제작 및 상기 펩타이드가 Peli1의 결합 활성을 저해하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11a는 Peli1의 결합 활성을 저해하는 펩타이드의 제작 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 11b는 세포 침투력을 높이기 위해 세포 투과 향상 펩타이드를 결합한 Peli1의 결합 활성 저해하는 펩타이드의 세포 침투력을 형광염색을 통해 확인한 결과이다.
도 11c는 Peli1의 결합 활성 저해 펩타이드를 처리한 후 toll-like receptor (TLR) 신호전달 활성화를 웨스턴 블랏팅을 통해 비교한 결과이다.

본 발명자들은 건선의 치료제를 연구 및 개발하는데 사용하기에 적합한 동물모델을 개발하고자 연구한 결과, 독시사이클린 투여에 따라 Peli1 유전자가 과발현되도록 형질전환시킨 마우스에서 건선 환자에서 나타나는 표현형과 유사성을 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된, 건선 유발 동물 모델을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 건선 유발 동물 모델 제조방법을 제공한다:

본 발명의 용어 "Peli1 (pellino homolog 1) 유전자"란, E3 유비퀴틴 접합효소로 알려진 pellino homolog 1 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하고, 인간의 경우 2번 염색체에 존재하고, 마우스의 경우에는 11번 염색체에 존재한다. 상기 단백질 또는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(NCBI Reference Sequence: NP_065702, NM_020651). 본 발명에서는 Peli1 유전자로서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 동물의 종류로는 마우스, 랫트(rat), 소, 말, 돼지, 원숭이, 오리, 개, 고양이 등이 될 수 있고, 마우스인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 독시사이클린의 투여에 따라 Peli1 유전자가 과발현되는 형질전환 동물 모델을 제작하고(실시예 1 참조), 상기 동물 모델에서 독시사이클린 투여에 따른 자발적 병변 유도 여부를 검증한 결과, 대조군에 비하여 독시사이클린을 지속적으로 투여하였을 때 자발적으로 병변이 나타나는 것을 확인하였다. 특히 털의 윤기가 사라지고 탈모가 진행되며 피부의 비정상적이 소견이 나타남을 확인하였다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 제작된 동물 모델에서 건선 유발을 검증한 결과, 대조군에 비하여 독시사이클린을 지속적으로 투여하였을 때, 표피세포층이 두꺼워지며, 표피층의 혈관 생성이 증가하고, 피부층에 T 세포의 침윤이 증가하며, 피부병변 주변의 림프절에서 면역세포들이 비정상적인 활성화 및 도움 T (helper T 세포) 반응이 있음을 확인함으로써 건선의 표현형(phenotype)과 매우 유사한 것을 확인하였다(실시예 5 참조). 이러한 건선의 표현형은 독시사이클인의 투여를 멈추어 Peli1의 발현이 정상수준으로 낮아졌을 때와 정상적인 Peli1의 발현을 억제시켰을 때 사라지는 것을 확인하였다(실시예 6 참조). 또한 기존의 건선 전신 치료제로 사용되는 면역 억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 주기적으로 복강투여하였을 때 건선의 표현형이 완화되는 것을 확인함으로서 전 임상(Preclinical)동물 모델로서 검증하였다(실시예 7참조).

따라서 본 발명에 따른 동물모델은 건선의 치료 및 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 동물모델을 이용한 건선 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 a) 상기 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 상기 후보물질을 처리한 동물모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 후보물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 건선 유발 동물 모델 제작을 통해 Peli1 단백질의 과발현에 의한 건선의 유발 가능성을 확인하였는바, Peli1 단백질 발현 또는 활성 억제제가 건선을 예방, 개선, 억제 또는 치료에 유용한 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 Peli1 (Pellino homolog 1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 건선 치료방법을 제공한다.

이 때, 본 발명에서 Peli1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 건선을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 건선에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서, Peli1 단백질의 발현 억제제는 Peli1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 Peli1 단백질의 활성 억제제는 상기 Peli1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 이루어지는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니며, Peli1 단백질 활성을 저해하는 모든 약물을 사용하여도 무방하다.

본 발명에서, "펩티드 미메틱스(Peptide Mimetics)"는 Peli1 단백질의 결합 도메인을 억제하여 Peli1 단백질의 활성을 억제하는 것으로서, 상기 펩티드 미메틱스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수도 있다.

본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서, SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

본 발명에서 "항체"는 Peli1 단백질에 특이적이고 직접적으로 결합하여 Peli1 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 Peli1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리크로널(polyclonal) 항체 또는 모노크로널(monoclonal) 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Peli1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며, 상업적으로 알려진 Peli1 단백질 항체를 구입하여 사용할 수도 있다.

또한, Peli1 단백질은 RING-like 도메인을 가짐으로써 E3 유비퀴틴 접합효소로서 작용한다. 즉, Peli1 단백질은 다양한 단백질번역 후 변형(Posttranslational modification of protein)을 통하여 활성화 되어 E3 유비퀴틴 접합효소로서 작용하며, FHA 도메인을 통하여 타겟 단백질과의 결합이 일어난다. 따라서, 기질 단백질의 FHA 결합 모티브를 표적으로 하는 Peli1 FHA 도메인 유래 펩타이드는 Peli1 단백질의 정상적 기질 결합을 방해함으로써 새로운 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, FHA 도메인을 통하여 타겟 단백질과의 결합이 일어나는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Peli1 단백질과 타겟 단백질 사이의 결합을 저해하기 위하여 Peli1 단백질의 FHA 도메인 유래 펩타이드를 제작하였다 (실시예 9 참조).

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 5 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진, 펩타이드및 상기 펩타이드를 포함하는 건선 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 펩타이드는 FHA 결합 모티브를 표적으로하여 Peli1 단백질과 기질 단백질과의 결합을 억제할 수 있고, 또한, 상기 펩타이드는 세포 내 침투를 용이하게 하기 위한 세포 투과 향상 펩타이드(Cell-penetrating peptide)가 연결될 수도 있다.

이 때, 상기 세포 투과성 펩타이드는 Polyarginines, Tat49-57, Penetratin, Pep-1, Transportan, Nuclear localization sequence 및 HP4로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 HP4를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 동물 실험(Animal experiment)

모든 동물 실험은 성균관대학교 의과대학(Sungkyunkwan University School of Medicine; SUSM)에 있는 동물실험윤리위원회(The Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인된 프로토콜 이용하여 실험을 진행하였다. 성균관대학교 의과대학(SUSM)는 국제 실험 동물 평가 관리인 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International; AAALAC International)와 실험 동물 센터(the Institute of Laboratory Animal Resources; ILAR)의 가이드라인 (guidelines)에 따라 모든 동물 실험을 진행하였다.

1-2. 유전형 분석(genotyping)

Doxycyline 투여에 따라 Peli1이 유도되는 Peli1 유도 발현 마우스(doxycycline inducible Peli1 transgenic mice)의 꼬리에서 genomic DNA (gDNA)를 추출한 후, 형질전환 여부를 확인하기 위해 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.

gDNA를 주형으로 하여 프라이머를 사용하여 TetO & Peli1의 경우에는 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 하여 총 4회를 한 다음에, 95℃ 30초, 58℃ 1분, 72℃ 1분으로 하여 총 34회의 RT-PCR을 수행하였다. 또한 R26과 rtTA 의 경우에는 95℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 1분으로 하여 총 34회를 PCR을 수행하였으며, 이때 사용된 프라이머의 구체적인 서열은 하기와 같다:

1) TetO & Peli1 primer sequences: 정방향 프라이머 (cmv TetO-1) 5'-AAG TGA AAG TCG AGC TCG-3'(서열번호 12), 역방향 프라이머 (Peli1 1/3 length) 5'-TGA TAT CGT GTG CTG GTC TTT G -3'(서열번호 13)

2) R26 & rtTA primer sequences: (1) 정상 마우스(WT) - R26(F)와 R26 (R); 정방향 프라이머 5'- AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT -3'(서열번호 14), 역방향 프라이머 5'- GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG -3'(서열번호 15) (2) 형질전환 마우스(Tg) - R26(F)와 rtTA (R); 정방향 프라이머 5'- AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT -3'(서열번호 16), 역방향 프라이머 5'- GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC -3'(서열번호 17)

PCR반응의 산물 중에 10μl를 취해 에티듐 브로마이드(etidium bromide) 존재 하에 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 밴드를 관찰하였다.

1-3. 웨스턴 블랏팅

Doxycycline의 투여에 따라 Myc-Peli1이 발현되는 마우스에서 Peli1 단백질의 발현을 확인하기 위해서, 대조군(-/rtTA) mice와 실험군(Myc-Peli1/rtTA) mice에 doxycycline (2mg/ml)을 2주 동안 먹인 후에 진행하였다. 각 장기 조각에 용해 완충액 (lysis buffer; 150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride, 10 mM NaF, 1 mM Na₃Vo₄, 1 mM dithiothreitol, 및 protease inhibitor cocktail)을 넣고 조직분쇄기(Homogenizer)를 사용하여 균질화 한 후에, 초원심분리기 (14,000 rpm, 30min, 4℃)로 분리하였다. 상충액의 추출물을 얻은 후에 Bradford 정량 방법으로 단백질을 정량하였다. 50μg 장기 추출물을 8% SDS-PAGE에 전기영동을 하여 트랜스퍼(nitrocellulose membraine을 이용)와 5% skin milk가 섞인 TBS-T 완충액 (100Mm NaCl, 20Mm Tris-HCl pH7.4, 0.05% Tween-20)으로 블라킹(blocking)을 한 후에 3% BSA(TBS-T의 용액이 포함된)에 anti-Myc(Roche; 1:2,000 dilution), anti-Peli1(Santa Cruz; 1:2,000 dilution) 또는 anti-β-actin(Sigma; 1:4,000 dilution) 항체를 4℃에서 12시간 이상 반응하고, TBS-T완충액으로 3번의 세척 (Washing; 3 times, 10min, RT)을 거친 후에 HRP가 부착된 2차 항체를 블라킹 용액에 1:3,000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응을 하고, TBS-T로 3번의 세척 (Washing; 3 times, 10min, RT)을 거친 후에 ECL 용액을 이용하여 발광을 유도하여 X-ray 필름에 감광하였다.

1-4. 유세포분석(Flow cytometry)

마우스의 림프절(lymph nodes)에서 세포를 얻고 적혈구(Erythrocytes)를 제거한 후에 다음의 항체를 이용하여 염색하였다. 보다 구체적으로, anti-CD3 Percp cy 5.5, anti-CD4 PE cy7, anti-CD8 PE, anti-CD122 APC, anti-CD44 FITC, anti-CD62L APC cy7을 이용하여 세포를 염색한 후 항체의 형광을 통해 유세포 분석 장비인 Canto II Flow cytometry (BD Bioscience)를 이용하여 분석하였다.

1-5. 조직병리 ( Histopathology )

마우스의 조직들은 10% neutral buffered formalin을 이용하여 고정(Fixation)하였고 파라핀 블록(Paraffin block)을 제작하였다. 상기 파라핀 블록에서 3μm의 두께의 절편을 얻은 후 헤마톡실린&에오신 (H&E) 염색을 하였다. 면역조직화학법(Immunohistochemistry)의 경우 anti-K14 antibody, anti-Ki67 antibody, anti-CD31 antibody, anti-CD3 antibody를 이용하여 염색하였고, 염색한 후 DAPI 시약이 포함된 봉입제을 이용하여 봉입하였다. 염색한 조직 샘플은 현미경[AxioCam digital microscope camera 및 AxioVision image processing software (Carl Zeiss)]을 이용하여 염색된 이미지를 얻었다.

실시예 2. Peli1 유도발현 형질전환 마우스 제작

독시사이클린의 투여에 따라 Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자가 과발현되는 형질전환 동물 모델을 하기와 같이 제조하였으며, 제작 방법의 개략적인 모식도를 도 1a에 나타내었다

보다 구체적으로, Myc epitope이 tagging되어 있는 human Peli1 유전자가 클로닝된 벡터(도 1a 참조)를 수정란(1-cell embryo)에 미세주입(microinjection) 하여 형질전환 마우스를 제작하였다. 미세주입 후 상기 실시예 1-2에 기재된 유전형 분석(genotyping) 방법을 통하여 TetO (tetracycline-responsive element) Myc-Peli1 형질전환 마우스를 선별하였다. 선별된 마우스는 R26-rtTA (reverse tetracycline transactivator) 마우스와 교배하여 후대 형질전환 마우스(doxycycline inducible TetO-Myc-Peli1 transgenic mice)를 얻었고, 형질전환 여부를 상기 실시예 1-2에 기재된 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, Myc-Peli1과 rtTA가 동시에 발현되는 형질전화 마우스를 얻음을 확인하였다.

실시예 3. Peli1 유도발현 형질전환 마우스에서 Peli1 발현수준 검증

상기 실시예 2를 통해 제작된 독시사이클린 투여에 따라 Peli1이 과발현되는 Peli1 유도발현 마우스의 조직에서 단백질 수준에서의 Myc-Peli1 발현을 확인하였다. 이를 위해, 대조군 (-/rtTA) 마우스와 실험군 (Myc-Peli1/rtTA) 마우스에 독시사이클린 (2mg/ml)을 2주 동안 먹인 후 여러 조직을 얻었다. 보다 구체적으로, 대조군 (-/rtTA) 마우스와 실험군(Myc-Peli1/rtTA) 마우스의 뇌(brain), 폐(lung), 심장(heart), 흉선(thymus), 위(Stomach), 소장(Small Intestine), 부고환(Epididymis), 대장(colon), 신장(Kidney), 피부(skin), 고환(testis), 전립선(Prostate), 췌장(Pancreas), 간(Liver), 비장(Spleen), 림프절(Lymphnodes), 골수(Bone marrow)에서 Myc-Peli1의 발현을 상기 실시예 1-3에 기재된 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 폐(lung), 흉선(thymus), 위(Stomach), 부고환(Epididymis), 대장(colon), 신장(Kidney), 전립선(Prostate) 췌장(pancreas), 간(liver), 비장(Spleen), 림프절(Lymphnodes), 골수(Bone marrow) 등에서 Myc-Peli1의 발현이 높은 것을 확인하였다. 반면, 뇌(brain), 심장(heart), 소장(Small Intestine), 피부(skin), 고환(testis)등에서는 Myc-Peli1의 발현이 낮거나 거의 발현이 되지 않는 것을 확인하였다.

실시예 4. Peli1 유도발현 형질전환 마우스에서 독시사이클린 투여에 따른 자발적 병변 유도 여부 검증

먼저, 대조군 (rtTA) 마우스와 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에 독시사이클린 (2mg/ml)을 24주 동안 음용수(Drinking water)로 투여한 후, 육안으로 병변 발생을 확인하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에 독시사이클린을 지속적으로 투여하였을 때 자발적으로 병변이 나타나는 것을 확인하였다. 특히 털의 윤기가 사라지고 탈모가 진행되며 피부의 비정상적이 소견이 관찰되었다.

다음으로, 상기와 같은 표현형이 나타나는 마우스의 비율을 측정한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 모든 마우스에서 Peli1이 독시사이클린의 투여에 따라 과발현되었을 때 상기와 같은 병변이 나타나는 것을 확인하였다.

다음으로, 대조군 (rtTA) 마우스와 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에 독시사이클린을 24주 동안 투여한 다음, 나타나는 표현형 변화를 점수화하였고, 이때 점수는 하기 표 1에 기재된 기준에 근거하여 점수화하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 독시사이클린 투여 기간을 따라 점수가 계속 증가하는 것을 확인하였다.

점수	표현형
0	정상
1	미미한 홍반과 각질이 나타나는 경우
2	홍반의 면적이 넓어 지고 각질이 보이며 피부층이 두꺼워 지기 시작한 경우
3	심각한 각질과 홍반이 나타나며 피부층이 정상보다 30%정도 두꺼워진 경우
4	심각한 각질과 홍반이 나타나며 피부층이 정상보다 60%이상 두꺼워진 경우
5	심각한 각질과 홍반과 피부의 탈락이 관찰되며 피부층이 정상보다 90%이상 두꺼워진 경우

상기 결과로부터, 상기와 같은 병변은 Peli1의 과발현에 의해서 자발적으로 유도된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. Peli1 유도발현 형질전환 마우스의 건선 유발 검증

상기 실시예 2에서 제작된 Peli1 유도발현 형질전환 마우스에서 건선이 유발되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.

5-1. 표피세포층 변화 확인

먼저, 대조군(rtTA) 마우스와 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에 독시사이클린(2mg/ml)을 24주 동안 음용수(Drinking water)로 투여한 후, 상기 실시예 1-5에 기재된 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 통하여 피부층의 구조를 확인하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스의 경우에는 정상적인 피부층이 형성된 반면, 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서는 비정상적인 병변이 관찰되었다. 특히, 표피층 세포 (Epidermal cell)의 층이 매우 크게 증가되어 있는 것은 물론 건선 환자의 피부층 구조에서 흔히 발견되는 착각화증(Parakeratosis), 과각화증(Hyperkeratosis), 표피능(rete ridge), 미세고름(microabscess)의 표현형이 관찰되었다. 상기 결과로부터, Peli1 유도 발현 마우스에서 건선의 표현형(phenotype)이 관찰되는 것을 확인하였다. 또한 대조군(rtTA) 마우스와 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에 독시사이클린(2mg/ml)을 24주 동안 음용수(Drinking water)로 투여한 후, Peli1 단백질이 피부층에서 과발현되는지 확인하기 위하여 Peli1 항체를 이용하여 조직면역염색을 수행하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 실험군 (rtTA-Peli1)마우스의 피부층에서 Peli1 단백질이 과발현되는 것을 확인하였다. 또한 건선 질병 마커 단백질인 Psoriasin 항체를 이용하여 조직면역염색을 수행한 결과 독시사이클린을 투여한 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 Psoriasin 발현이 강하게 유도되는 것을 관찰하였다.

다음으로, 상기 도 4a를 통해 Peli1 유도 발현 마우스에 독시사이클린을 지속적으로 투여한 경우 대조군과는 다르게 비정상적으로 표피세포층이 두꺼워지는 것을 확인하였는바, 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 표피층을 구성하는 기저층의 마커인 K14, 유극층의 마커인 K10, 과립층의 마커인 Loricrin에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행하고, 염색된 이미지를 확인하였다. 그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 표피층의 기저층과 유극층이 매우 증가되어 있는 것을 확인하였다.

추가적으로, Peli1 유도 발현 마우스에서 비정상적으로 증가되어 있는 기저세포들의 증식능력을 확인하기 위해, 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 세포의 증식을 확인할 수 있는 마커인 Ki67을 함께 염색하고, 염색된 이미지를 확인하였다. 그 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 증식중인 기저세포의 수가 증가되어 있는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서 증식중인 기저세포의 수가 비정상적으로 높아져 있으며 이에 따라 표피세포층이 두꺼워진다는 것을 확인하였다.

5-2. 표피층의 혈관 생성 변화 확인

건선 환자에서 나타나는 표현형 중 비정상적으로 표피층이 두꺼워지는 특징과 함께 비정상적으로 진피층 (Dermal layer)에 혈관 생성이 활발하게 일어나 있을 뿐만 아니라 혈관 확장이 일어나는 것이 있다. 이를 확인하기 위해, 먼저 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 모세혈관의 마커인 CD31 항체를 이용하여 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 4e에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 혈관의 생성이 활발하게 일어나 있을 뿐 만 아니라 혈관이 확장되어 있는 것을 확인하였다.

5-3. 면역세포 활성화 변화 확인

건선 환자에서 나타나는 표현형 중 하나로 면역세포들의 침윤이 활발하게 일어나 있다. 더욱이, 최근의 연구에 따르면 건선은 T 세포의 비정상적인 활성에 의해서 유도된다고 알려져 있고, 그리하여 피부층에 T 세포의 침윤이 관찰된다고 알려져 있다.

이를 확인하기 위해, 먼저 상기 실시예 1-5에 기재된 방법에 따라 T 세포의 마커인 CD3 항체로 염색을 실시하였다. 그 결과, 도 4f에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 피부층에 T 세포의 침윤이 증가되어 있는 것을 확인하였다.

다음으로, 상기 도 4f의 결과를 통하여 비정상적인 면역반응이 유도되고 있다는 것을 예상할 수 있었는바, 피부병변 주변의 림프절을 확인하였다. 보다 구체적으로, 피부층에 가까이에 존재하는 서혜부(Inguinal), 겨드랑이(Axillary), 팔(Brachial), 목(Cervical) 주변의 림프절을 분리하여 상기 실시예 1-5에 기재된 H&E 염색을 통하여 구조를 확인하였다. 그 결과, 도 4g 및 4h에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 병변 주변에 존재하는 림프절들이 커져있는 것을 확인하였다. 또한 림프절들이 검게 변해 있는 것도 확인하였는바, 이를 통해 면역 세포들의 활성 증가에 의해 비정상적으로 sinus의 형성이 증가되어 있음을 알 수 있었다.

다음으로, 상기 도 4g 및 4h의 결과를 통하여 피부 병변 주변의 림프절들이 커져있는 것을 확인하였는바, 이러한 림프절에서 면역세포의 활성화를 상기 실시예 1-4에 기재된 유세포 분석법를 이용하여 확인하였다.

보다 구체적으로, 림프절에서 면역세포를 분리하여 T 세포들 중 CD4⁺ T 세포의 활성을 CD44, CD62L, CD122 항체를 이용하여 확인하였다. 그 결과, 도 4i에 나타낸 바와 같이, 대조군 (rtTA) 마우스에 비하여 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에서 비활성화 (naive) T 세포(CD62L⁺/CD44^-)의 비율은 감소되어 있고 활성화(activated) T 세포(CD62L⁺/CD44^hi-low, CD62L^-/CD44^hi, CD122⁺/CD44⁺)의 비율은 증가되어 있음을 확인하였다.

추가적으로, 상기 도 4i의 결과를 그래프로 나타내어 분석한 결과, 도 4j에 나타낸 바와 같이, 림프절을 구성하고 있는 T 세포의 비율에서의 차이는 관찰할 수 없었지만 세포의 수로 비교해 본 결과 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서 전체적인 면역세포의 수가 증가되어 있을 뿐 아니라 CD3⁺, CD4⁺,CD8⁺ T 세포의 수가 크게 증가되어 있는 것을 확인하였다.

또한, 활성화 되어 있는 T 세포의 비율과 수를 그래프를 이용하여 분석한 결과, 도 4k 및 도 4l에 나타낸 바와 같이, Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)의 림프절에서의 전체적인 면역세포의 수가 증가되어 있기 때문에 비활성화, 활성화 T 세포의 수는 증가하였지만 그 비율을 확인한 결과 비활성화 세포에 대한 활성화 세포의 비율이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 본 발명에 따른 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서의 면역세포들은 비정상적으로 활성화되어 있음을 알 수 있었다.

5-4. T세포의 도움 T 반응 변화 확인

기존에 보고된 바에 의하면 건선 동물 모델 및 환자에서 비정상적인 도움 T 반응이 유도된다고 알려져 있다. 이에 림프절의 CD3⁺ T 세포의 cDNA를 이용하여 IFNγ, IL-4, IL-22, IL-23과 같은 사이토카인의 수준을 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 비교하였다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 1형 도움 T 반응에서 분비되는 사이토카인인 IFNγ와 17형 도움 T 반응에서 분비되는 사이토카인인 IL-22, IL-23가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 비정상적인 도움 T 반응이 피부층에서도 또한 유도되고 있는지 확인하기 위하여 실시예 1-5에 기재된 면역염색법을 통하여 IL-17과 IL-23에 대한 항체를 이용하여 수행하였다. 그 결과, 도 5b와 도 5c에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스(rtTA)에 비해서 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서 IL-17 또는 IL-23에 대한 항체로 염색된 세포의 수가 크게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

이는 건선에서 나타나는 표현형과 매우 유사하며 이를 통하여 본 발명에 따른 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서의 면역세포는 비정상적으로 활성화되어 있을 뿐만 아니라 비정상적인 도움 T 반응을 확인할 수 있었다.

5-5. 건선 환자에서 나타나는 병변과의 유사성 비교

상기 실시예 5-1 내지 5-4을 통해 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서 나타나는 다양한 병변들을 분석한 결과를 토대로 건선환자에서 나타나는 표현형과 유사성을 비교하였다. 그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 건선환자에서 나타나는 표현형과 본 발명에 따른 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서 나타나는 표현형이 매우 유사한 것을 확인하였다.

실시예 6. 새로운 건선 치료 타겟으로서의 Peli1 가능성 검증

상기 실시예 4 및 실시예 5의 결과를 토대로 Peli1 단백질의 과발현에 의한 건선의 유발 가능성을 확인하였는바, Peli1 단백질 발현 억제에 의한 건선 질환의 치료 가능성을 확인하고자 하기 실험을 수행하였다.

6-1. Doxycycline 투여에 의한 건선 치료 가능성 확인

대조군 마우스(rtTA)와 실험군 마우스(rtTA-Peli1)에 일정기간 Doxycycline 투여를 통하여 건선의 표현형이 나타날 때 다시 Doxycycline의 투여를 제거함에 따라 Peli1의 발현이 정상 수준으로 낮아 졌을 때 건선의 표현형을 분석하였다. 그 결과, 도 6a에 나타난 바와 같이, 5개월 동안 계속해서 Doxycycline을 투여한 경우 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)에서는 건선의 표현형이 나타나는 반면 3개월 동안 Doxycyline을 투여한 이후 Doxycyline을 제거하였을 때 건선의 표현형이 사라지고 대조군 마우스(rtTA)와 흡사한 표현형을 확인할 수 있었다.

다음으로, 대조군 (rtTA) 마우스와 실험군 (rtTA-Peli1) 마우스에 독시사이클린을 12주 동안 투여한 다음, 다시 독시사이클린을 투여 및 제거하면서 나타나는 표현형 변화를 점수화하였다. 그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 독시사이클린 투여 및 제거기간을 따라 점수가 계속 증가 및 감소하는 것을 확인하였다.

상기 도 6a와 도 6b의 결과에 따라 피부층의 구조를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-5에 기재된 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, Doxycycline 투여에 따라 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)의 피층 세포 (Epidermal cell)의 층이 매우 크게 증가되어 있는 것은 물론 건선 환자의 피부층 구조에서 흔히 발견되는 착각화증(Parakeratosis), 과각화증(Hyperkeratosis), 표피능(rete ridge), 미세고름(microabscess)의 표현형이 관찰되었다. 하지만, doxycyline을 투여한 후 제거한 Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)의 피부층의 구조에서 착각화증(Parakeratosis), 과각화증(Hyperkeratosis), 표피능(rete ridge)의 표현형 사라짐은 물론 대조군 마우스(rtTA)의 피부층 구조와 매우 유사한 것을 확인하였다.

상기로부터, 비정상적으로 증가한 Peli1의 발현은 건선의 발병을 유도할 수 있으며 이러한 Peli1의 발현을 다시 정상수준으로 낮추어 주었을 때 정상과 매우 유사한 피부층의 표현형이 나타나는 것을 확인함으로써 새로운 건선 치료 타겟로서의 Peli1의 가능성을 확인할 수 있었다.

6-2. Peli1의 발현이 억제되었을 때 건선 유도에 따른 병변 수준 확인

상기 실시예 6-1에 따라 비정상적으로 증가한 Peli1의 발현을 정상수준으로 낮추어 주었을 때 건선 병변 수준이 정상 수준으로 낮아지는 것을 확인하였는바, 정상 수준에서 Peli1의 발현이 억제되었을 때 건선 유도에 따른 병변 수준을 확인하고자 하기 실험을 수행하였다.

구체적으로, 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에 TLR 7과 9의 작용제(agonist)인 이미퀴모드(IMQ)를 이용한 건선 동물 모델을 이용하여 매일 62.5mg의 이미퀴모드를 제모한 마우스의 등에 처리하는 실험을 진행하였다 (도 7a 참조).

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스(WT)의 경우 이미퀴모드 처리에 따라 홍반 및 각질과 같은 건선의 표현형이 나타나는 것을 확인 하였으나 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서는 홍반은 나타나지만 정상 마우스(WT)에 비해 각질의 형성 수준이 낮은 것을 확인하였다.

다음으로, 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에 이미퀴모드를 처리한 다음, 건선 표현형 변화를 점수화하였다. 그 결과, 도 7c에 나타낸 바와 같이, 이미퀴모드 처리에 따라 정상 마우스(WT)의 경우 점수가 증가하는 것을 확인하였으며 그에 비해 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서는 정상 마우스 보다 낮은 점수를 나타냄을 확인하였다.

상기 도 7b 및 도 7c의 결과에 따라 피부층의 구조를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-5에 기재된 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하였다. 그 결과 도 7d와 도 7e에 나타낸 바와 같이, 이미퀴모드의 처리에 따라 정상 마우스(WT)의 피부 두께가 증가하는 것을 확인하였으나 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서는 정상 마우스에 비해 피부 두께가 덜 증가하는 것을 확인하였다. 또한 표피능(Rete ridge)의 깊이가 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 정상 마우스(WT)에 비해 짧은 것을 확인으며 과각화증(Hyperkeratosis) 또한 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 정상 마우스(WT)에 비해 완화되어 있는 것을 확인하였다.

상기로부터, 기존의 이미퀴모드 처리에 의한 건선 동물 모델을 이용하여 정상 마우스(WT)와 Peli1 발현 억제 마우스(Peli1 KO)에서 건선 병변의 표현형이 비교한 결과, Peli1 발현이 억제 되었을 때 이미퀴모드 처리에 의한 건선 병변 수준이 정상에 비해 낮은 것을 확인함으로써 새로운 건선 치료의 타겟으로서의 Peli1의 가능성을 다시 확인할 수 있었다.

실시예 7. Peli1 유도 발현 마우스의 전임상 건선 동물 모델용도 검증

상기 실시예 4 및 실시예 5의 결과를 토대로 Peli1 유도 발현 마우스에 독시사이클린의 투여에 따른 Peli1 단백질의 과발현에 의한 건선의 유발 가능성을 확인하였는바, Peli1 유도 발현 마우스의 건선 치료제 스크리닝 및 효과 검증을 위한 전 임상(Preclinical) 건선 동물 모델로서 검증해 보고자 하였다.

이를 위해서, 기존의 강력한 면역억제제로서 건선질병을 완화시킴으로서, 건선 환자에 사용되는 전신 치료제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)의 작용기전은 사이클로스포린(CsA)의 경우 T 세포의 활성을 유도하는 calcineurin의 활성을 저해함으로써 NFAT의 기능을 저해하고 이로 인하여 특정 사이토카인의 분비를 감소시켜 T 세포의 활성을 억제한다.

또한, 메소트렉세이트(MTX)의 경우에는 상피세포의 과분열, 활성 T 세포의 세포자살 유도 및 호중구의 주화성(chemotaxis)과 특정 사이토카인의 분비를 저해한다.

상기에 따라, 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 투여하였을 때 Peli1 유도 발현 마우스의 건선 표현형을 완화시키는지, 또한, 이에 전 임상(Preclinical) 동물 모델로서 적용이 가능한지 검증해 보고자 하였다.

이를 위해, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스(rtTA)와 실험군 마우스(rtTA-Peli1)에 일정기간(12주)동안 Doxycycline 투여를 통하여 건선의 표현형이 나타날 때 사이클로스포린(CsA)는 주 6회 투여하고 메소트렉세이트(MTX)는 주 4회 복강주사로 투여한 후 건선의 표현형을 분석하였으며, 피부층의 구조를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-5에 기재된 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, Peli1 유도 발현 마우스(rtTA-Peli1)의 착각화증(Parakeratosis), 과각화증(Hyperkeratosis), 표피능(rete ridge), 미세고름(microabscess)의 표현형이 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 투여한 후에 대부분 사라지는 것을 확인하였다. 하지만 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 투여한 후에도 표피층 세포(Epidermal cell)의 증식에 따른 피부 두께의 증가는 여전히 관찰됨을 확인하였다.

다음으로, 대조군 마우스(rtTA)와 실험군 마우스(rtTA-Peli1)에 일정기간 (12주)동안 Doxycycline 투여를 통하여 건선의 표현형이 나타날 때 기존의 환자에 사용되는 치료용 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 일정기간동안 복강주사로 투여한 후 건선 표현형을 점수화하였다.

그 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 일정기간동안 복강주사로 투여하였을 때 건선 표현형 점수가 감소하는 것을 확인하였다.

상기 도 8b의 결과에 따라 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 일정기간동안 복강주사로 투여한 후 대부분의 건선 표현형은 사라지나 표피층 세포(Epidermal cell)의 증식에 따른 피부 두께의 증가는 여전히 관찰됨을 확인한 바, 피부 두께 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 8d에 나타낸 바와 같이, Doxycycline 투여에 따라 건선의 표현형이 나타난 Peli1 유도 발현 마우스에 면역억제제인 사이클로스포린(CsA)와 메소트렉세이트(MTX)를 일정기간동안 복강주사로 투여한 후 피부의 두께가 절반 정도 감소하는 것을 확인하였다.

상기로부터, Doxycycline 투여에 따라 건선의 표현형을 나타내는 Peli1 유도 발현 마우스를 이용하여 건선 치료제를 이용하여 효과 검증을 확인한 결과 건선 질병 표현형이 감소하는 것을 확인함으로써 새로운 건선 치료제의 스크리닝 및 효과 검증을 위한 전 임상(Preclinical) 동물 모델로서의 가능성을 검증할 수 있었다.

실시예 8. Peli1 단백질 발현 억제제 제조

상기 실시예 6의 결과를 토대로 Peli1 단백질 발현 억제에 의한 건선 질환의 치료 가능성을 확인하였는바, Peli1 mRNA에서의 단백질의 합성을 저해하기 위하여 타겟 mRNA 서열을 확인하고(도 9a 참조), 이를 기반으로 하여 하기와 같이, shRNA 및 siRNA를 제작하였다.

Target mRNA sequence #1 : GGGTTCAACACACTAGCAT (서열번호 3)

Target mRNA sequence #2 : GCTCCTTTGGATATGCAATTT (서열번호 4)

다음으로, 제작된 shRNA를 세포 내로 주입하여 Peli1 단백질의 발현을 상기 실시예 1-3에 기재된 웨스턴 블랏팅을 통하여 확인한 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, Peli1의 mRNA를 타겟으로 하는 shRNA가 세포 내로 주입된 경우에는 Peli1 단백질의 발현이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.

실시예 9. Peli1의 결합 활성을 저해하는 펩타이드 제조

9-1. Peli1의 결합 활성 저해 펩타이드 제작

Peli1은 E3 유비퀴틴 접합효소로서 RING-like 도메인을 통하여 접합효소로서의 활성을 나타내며 FHA 도메인을 통하여 타겟 단백질과의 결합이 일어난다. 이에, Peli1 과 타겟 단백질 사이의 결합을 저해하기 위하여 Peli1 단백질의 FHA 도메인 유래 펩타이드를 제작하였다.

	FHA 도메인 유래 펩타이드 서열
95-114	SNTDMFQIGRSTESPIDFVV
101-116	QIGRSTESPIDFVVTD
109-124	PIDFVVTDTVPGSQSN
117-132	TVPGSQSNSDTQSVQS
125-140	SDTQSVQSTISRFACR
133-149	TISRFACRIICERNPP
177-196	DGQMDGLTTNGVLVMHPRNG

또한, 제작된 펩타이드의 세포 내 침투를 용이하게 하기 위하여 세포 투과 향상 펩타이드(Cell-penetrating peptide)를 연결하였고, 이때 사용된 세포 투과 향상 펩타이드는 하기와 같다(도 10 참조):

i) Polyarginines(RRRRRRRRR)

ii) Tat_49-57(RKKRRQRRR)

iii) Penetratin(RQIKIWFQNRRMKWKK)

iv) Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)

v) Transportan(GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL)

vi) Nuclear localization sequences (VQRKRQKLMP, SKKKKIKV, GRKRKKRT)

vii) HP4 (RRRRPRRRTTRRRR)

도 10을 토대로 Peli1의 결합 활성 저해 펩타이드를 제작하기 위해 도 11a에 나타낸 모식도와 같이 세포 투과 향상 펩타이드인 HP4와 두 펩타이드를 연결시켜주는 GS linker 서열을 이용하여 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드를 제작하였다.

9-2. Peli1의 결합 활성 저해 펩타이드의 세포 침투력 확인

상기 실시예 9-1로부터 제작된 Peli1의 결합 활성 저해 펩타이드의 세포 침투력을 확인하가 위해서, 세포배양액에 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드를 처리한 후, 형광 염색을 통하여 세포 침투 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 11b에 나타난 바와 같이, 세포 투과 향상 펩타이드인 HP4가 결합된 경우 세포 침투력이 크게 향상되는 것을 확인하였다. 이에, 세포 투과 향상 펩타이드가 결합된 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드가 세포 내로 침투되는 것을 확인하였다.

9-3. Peli1 결합 활성 저해 펩타이드의 기능 확인

다음으로, 상기 실시예 9-2에서 확인한 세포 내로 침투한 Peli1 결합 활성 저해 펩타이드에 대해서 그 기능을 확인하고자 하기와 같은 실험을 진행하였다.

구체적으로, 골수세포 유래의 대식세포를 이용하여 Peli1이 매개하는 TLR3 신호 전달 작용물질인 Poly(I:C)를 처리한 후, TLR3 신호전달의 활성화를 비교하였다.

그 결과, 도 11c에 나타낸 바와 같이, Peli1 결합 활성 저해 펩타이드의 세포 침투를 유도한 후 TLR3 신호 전달 작용물질인 Poly(I:C)를 처리하였을 때 신호 전달 활성이 저해되는 것을 구체적으로 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Animal model inducing psoriasis and use thereof <130> MP17-103 <150> KR 10-2016-0084594 <151> 2016-07-05 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1257 <212> DNA <213> Pellino homolog 1 <400> 1 atgttttctc ctgatcaaga aaatcatcca tctaaagcac cagtaaaata tggtgaactc 60 attgtcttag ggtataatgg gtctctccca aatggcgata gaggaaggag gaaaagtagg 120 tttgctttgt ttaaaagacc taaggcaaat ggggtgaagc ccagcactgt gcatattgct 180 tgtactcctc aggctgcaaa ggcaataagc aacaaagacc agcatagcat atcatatact 240 ttatctcggg cccagactgt ggtggttgaa tatactcatg acagcaacac cgatatgttt 300 cagattggcc ggtcgactga aagccccatt gattttgtag taactgacac ggttcctgga 360 agtcaaagta attctgatac acagtcagta caaagcacta tatcaagatt tgcctgcaga 420 atcatatgtg aacggaatcc tccctttaca gcacggattt atgctgcagg atttgactca 480 tcaaaaaaca tctttcttgg ggagaaggct gccaaatgga agacatcaga tggacagatg 540 gatggcttga ccactaatgg tgttcttgtg atgcatccac gcaatgggtt cacagaagac 600 tccaagcctg gaatatggag agaaatatcg gtgtgtggaa atgtatttag cctacgtgaa 660 accagatcgg ctcagcagag aggaaaaatg gtggaaattg aaaccaatca gttacaagat 720 ggctcgttaa ttgacctctg tggtgcaaca ttgttatggc gtactgcaga aggcctttcc 780 cacactccta ccgtgaagca tttagaagct ttaagacagg aaatcaatgc agcacgacct 840 cagtgccctg tagggttcaa cacactagca tttcctagta tgaagaggaa agacgttgta 900 gatgaaaaac aaccatgggt atatctaaac tgcggccatg tacatggcta tcataactgg 960 ggaaacaaag aagaacgtga tggaaaagat cgtgaatgtc ctatgtgtag gtctgttggt 1020 ccctatgttc ctctgtggct tggatgtgaa gctggatttt atgtggacgc cggccctcca 1080 acccatgcgt ttagcccgtg tgggcatgtg tgttcagaaa agacaactgc ctattggtcc 1140 cagatcccac ttcctcatgg tactcatact tttcatgcag cctgtccctt ttgtgcacat 1200 cagttggctg gtgaacaagg ctacatcaga cttatttttc aaggacctct agactaa 1257 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> Pellino homolog 1 <400> 2 Met Phe Ser Pro Asp Gln Glu Asn His Pro Ser Lys Ala Pro Val Lys 1 5 10 15 Tyr Gly Glu Leu Ile Val Leu Gly Tyr Asn Gly Ser Leu Pro Asn Gly 20 25 30 Asp Arg Gly Arg Arg Lys Ser Arg Phe Ala Leu Phe Lys Arg Pro Lys 35 40 45 Ala Asn Gly Val Lys Pro Ser Thr Val His Ile Ala Cys Thr Pro Gln 50 55 60 Ala Ala Lys Ala Ile Ser Asn Lys Asp Gln His Ser Ile Ser Tyr Thr 65 70 75 80 Leu Ser Arg Ala Gln Thr Val Val Val Glu Tyr Thr His Asp Ser Asn 85 90 95 Thr Asp Met Phe Gln Ile Gly Arg Ser Thr Glu Ser Pro Ile Asp Phe 100 105 110 Val Val Thr Asp Thr Val Pro Gly Ser Gln Ser Asn Ser Asp Thr Gln 115 120 125 Ser Val Gln Ser Thr Ile Ser Arg Phe Ala Cys Arg Ile Ile Cys Glu 130 135 140 Arg Asn Pro Pro Phe Thr Ala Arg Ile Tyr Ala Ala Gly Phe Asp Ser 145 150 155 160 Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gly Glu Lys Ala Ala Lys Trp Lys Thr Ser 165 170 175 Asp Gly Gln Met Asp Gly Leu Thr Thr Asn Gly Val Leu Val Met His 180 185 190 Pro Arg Asn Gly Phe Thr Glu Asp Ser Lys Pro Gly Ile Trp Arg Glu 195 200 205 Ile Ser Val Cys Gly Asn Val Phe Ser Leu Arg Glu Thr Arg Ser Ala 210 215 220 Gln Gln Arg Gly Lys Met Val Glu Ile Glu Thr Asn Gln Leu Gln Asp 225 230 235 240 Gly Ser Leu Ile Asp Leu Cys Gly Ala Thr Leu Leu Trp Arg Thr Ala 245 250 255 Glu Gly Leu Ser His Thr Pro Thr Val Lys His Leu Glu Ala Leu Arg 260 265 270 Gln Glu Ile Asn Ala Ala Arg Pro Gln Cys Pro Val Gly Phe Asn Thr 275 280 285 Leu Ala Phe Pro Ser Met Lys Arg Lys Asp Val Val Asp Glu Lys Gln 290 295 300 Pro Trp Val Tyr Leu Asn Cys Gly His Val His Gly Tyr His Asn Trp 305 310 315 320 Gly Asn Lys Glu Glu Arg Asp Gly Lys Asp Arg Glu Cys Pro Met Cys 325 330 335 Arg Ser Val Gly Pro Tyr Val Pro Leu Trp Leu Gly Cys Glu Ala Gly 340 345 350 Phe Tyr Val Asp Ala Gly Pro Pro Thr His Ala Phe Ser Pro Cys Gly 355 360 365 His Val Cys Ser Glu Lys Thr Thr Ala Tyr Trp Ser Gln Ile Pro Leu 370 375 380 Pro His Gly Thr His Thr Phe His Ala Ala Cys Pro Phe Cys Ala His 385 390 395 400 Gln Leu Ala Gly Glu Gln Gly Tyr Ile Arg Leu Ile Phe Gln Gly Pro 405 410 415 Leu Asp <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> shRNA of Peli1 <400> 3 gggttcaaca cactagcat 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> siRNA of Peli1 <400> 4 gctcctttgg atatgcaatt t 21 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 1 <400> 5 Ser Asn Thr Asp Met Phe Gln Ile Gly Arg Ser Thr Glu Ser Pro Ile 1 5 10 15 Asp Phe Val Val 20 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 2 <400> 6 Gln Ile Gly Arg Ser Thr Glu Ser Pro Ile Asp Phe Val Val Thr Asp 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 3 <400> 7 Pro Ile Asp Phe Val Val Thr Asp Thr Val Pro Gly Ser Gln Ser Asn 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 4 <400> 8 Thr Val Pro Gly Ser Gln Ser Asn Ser Asp Thr Gln Ser Val Gln Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 5 <400> 9 Ser Asp Thr Gln Ser Val Gln Ser Thr Ile Ser Arg Phe Ala Cys Arg 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 6 <400> 10 Thr Ile Ser Arg Phe Ala Cys Arg Ile Ile Cys Glu Arg Asn Pro Pro 1 5 10 15 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> FHA Binding Peptide 7 <400> 11 Asp Gly Gln Met Asp Gly Leu Thr Thr Asn Gly Val Leu Val Met His 1 5 10 15 Pro Arg Asn Gly 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> TetO & Peli 1 forward primer <400> 12 aagtgaaagt cgagctcg 18 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> TetO & Peli 1 reverse primer <400> 13 tgatatcgtg tgctggtctt tg 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> R26 & rtTA forward primer <400> 14 aaagtcgctc tgagttgtta t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> R26 & rtTA reverse primer <400> 15 ggagcgggag aaatggatat g 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> R26 & rtTA forward primer 2 <400> 16 aaagtcgctc tgagttgtta t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> R26 & rtTA reverse primer 2 <400> 17 gcgaagagtt tgtcctcaac c 21

Claims

Peli1 (Pellino homolog 1) 유전자를 과발현하도록 형질전환된, 건선 치료용 약물의 스크리닝용 동물 모델.
제1항에 있어서, 상기 Peli1 유전자는 독시사이클린의 투여에 따라 과발현되는 것을 특징으로 하는, 건선 치료용 약물의 스크리닝용 동물 모델.
제1항에 있어서, 상기 Peli1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 건선 치료용 약물의 스크리닝용 동물 모델.
하기의 단계를 포함하는, 청구항 1의 건선 치료용 약물의 스크리닝용 동물 모델 제조방법:
(a) Peli1 (pellino homolog 1) 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주동물의 수정란에 도입하는 단계;
(b) 상기 도입된 수정란을 대리모의 자궁에 착상시키고 출산시켜서 1세대 후대동물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 수득한 1세대 후대동물과 rtTA (reverse tetracycline transactivator) 모델동물을 교배시켜서 2세대 후대동물을 수득하는 단계.
하기의 단계를 포함하는 건선 치료제의 스크리닝 방법:
a) 상기 제1항의 동물모델에 후보물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 후보물질을 처리한 동물모델을 사육하면서 예후를 확인하는 단계.
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