JP2017500854A - ポリペプチド、核酸およびその使用 - Google Patents

ポリペプチド、核酸およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明者らは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を示す）、例えば、配列番号２〜配列番号１８からなる群から選択される配列、好ましくはＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体を記載し、このポリペプチドは、幹細胞の自己複製および／または多能性を維持可能である。

Description

本発明は、医学、細胞生物学、分子生物学および遺伝学の分野に関する。本発明は、医学の分野に関する。
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもと、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２０１３年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／９１１，２７６号の利益を主張する。引用することにより本明細書の一部をなすものとする２０１４年９月２５日に出願された米国特許出願第１４／４９６，６００号も参照される。
ペプチドホルモンは、重要なクラスの分泌性シグナル伝達分子である。内因性ペプチドは、抗菌ペプチドとしての自然防御における（Ｃｅｄｅｒｌｕｎｄら、２０１１年）、ケモカインとしての免疫調節における（Ｂｏｎｅｃｃｈｉら、２００９年）および神経ペプチドとしての挙動の調節における（ｖａｎ ｄｅｎ Ｐｏｌ、２０１２年）その機能について最も注目すべきである。ペプチドホルモンの欠乏は、いくつかのヒト疾患の原因であり、最も顕著なものとして、糖尿病におけるインスリンの喪失またはインスリン抵抗性がある。ニューロペプチドヒポクレチンの欠乏は、ナルコレプシーを引き起こし（Ｎｉｓｈｉｎｏら、２０００年；Ｐｅｙｒｏｎら、２０００年）、一方、食欲および満腹ホルモンレプチン（Ｍｏｎｔａｇｕｅら、１９９７年）およびグレリンの調節の異常が、プラダー・ウィリー症候群（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００２年）における先天性肥満症および過食症の根底にある原因である。
新規のペプチドをコードする遺伝子の発見は、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が小さく、サイズバイアスのかかったＯＲＦ予測アルゴリズムによって見落とされることが多いので、困難である。この制限は、予測不足または非コーディング転写物としての分類につながった（Ｆｒｉｔｈら、２００６年）。これらのホルモンのその同族細胞表面受容体に対するマッチングは、同等に困難である。小さいシグナル伝達ペプチドの大部分は、Ｇ共役タンパク質受容体（ＧＰＣＲ）、細胞表面受容体の最大のファミリーと結合し、それを介してシグナル伝達するとわかっている（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、２００７年）。ＧＰＣＲは、そのリガンドの供給源に基づいて２つのカテゴリーに広く分類できる（Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓら、２００３年）。化学感受性ＧＰＣＲは、匂い物質、味物質およびフェロモンなどの環境信号を感知し、一方で、ｅｎｄｏ−ＧＰＣＲは、ペプチドホルモン、アミン、ヌクレオシドまたは脂質などの内因性化合物に起因するシグナルを伝達する。最近の研究は、ヒトゲノム中のｅｎｄｏ−ＧＰＣＲの数を３７０種近くであると推定する（Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓら、２００３年）。これらのうちおよそ１４０種（４０％）が既知リガンドを有さず、したがって、オーファンＧＰＣＲ受容体である。そのようなものとして、新規内因性ホルモンの発見およびその同族受容体との対合は、依然として相当な試みである。
多数のペプチドホルモンが特性決定されており、成体生理学において重要な役割を果たすことがわかっているが、早期発達の間のこれらの小さいシグナル伝達分子の関与は確立されていない。胚発生の間は、６種の重要なシグナル伝達経路、すなわち、ＷＮＴ、ＢＭＰ／ＮＯＤＡＬ、ＦＧＦ／ＩＧＦ、ＮＯＴＣＨ、ＨＥＤＧＥＨＯＧおよびＨＩＰＰＯが、胚のパターン形成にとって決定的である。特に、ＩＧＦ／ＦＧＦおよびＮＯＤＡＬは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）における多能性を維持するために必須である（Ｄａｌｔｏｎ、２０１３年）。インスリン／ＩＧＦ、ＦＧＦおよびＴＧＦβ／ＡＣＴＩＶＩＮ／ＮＯＤＡＬの他には、フィーダーまたはｈＥＳＣコンディショニング培地から単離されて、ｈＥＳＣ培養に必要であると証明されたその他の可溶性因子はない（Ｈｕｇｈｅｓら、２０１１年）。
本発明者らの知る限り、ペプチドホルモンは、ｈＥＳＣの自己複製能または３種の胚性胚葉のいずれにも分化するその能力の維持に関与していなかった。
本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを提供する。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含み得る。Ｘは、アミノ酸残基を示し得る。
本発明者らは、このようなポリペプチドの断片、相同体、変異体または誘導体を提供する。
ポリペプチド、このようなポリペプチドの断片、相同体、変異体または誘導体は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの生物活性などの活性を有し得る。
例えば、ポリペプチドは、幹細胞の自己複製を維持可能であり得る。幹細胞の多能性を維持可能であり得る。幹細胞の成長を維持可能であり得る。幹細胞の成長を促進可能であり得る。アポトーシスを阻害可能であり得る。胚性幹細胞の細胞表面と結合可能であり得る。幹細胞の分化を内胚葉または中胚葉系列に向けて偏向可能であり得る。アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）と結合可能であり得る。ＣＸＣＲ４受容体と結合可能であり得る。Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化可能であり得る。心保護可能であり得る。虚血および／または再灌流の間に心機能を回復または維持可能であり得る。酸化ストレスを低減可能であり得る。梗塞の大きさを低減可能であり得る。ＨＩＶ感染を阻害可能であり得る。
これらのいずれかの組合せまたはこれらのすべてを行うことが可能であり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の−７位上流に、またはおよそその位置に塩基性残基を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号１６２の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６２の１位は、塩基性アミノ酸残基、好ましくは、ＫまたはＲを含む）の配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の−８位上流に、またはおよそその位置に塩基性残基を含み得る。
塩基性残基は、Ｋ（リシン）を含み得る。塩基性残基は、Ｒ（アルギニン）を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号１６３の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６３の１位は、塩基性アミノ酸残基、好ましくは、ＫまたはＲを含む）の配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の−７位および−８位上流に、またはおよそその位置に一対の塩基性残基を含み得る。塩基性残基の対は、ＫＫを含み得る。塩基性残基の対は、ＫＲを含み得る。塩基性残基の対は、ＲＫを含み得る。塩基性残基の対は、ＲＲを含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号１６３の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６３の１位および２位は、一対の塩基性アミノ酸残基、好ましくは、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫまたはＲＲを含む）の配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２〜配列番号１８からなる群から選択される配列を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、シグナル配列をさらに含み得る。シグナル配列は、配列番号１９に示されるものなどのヒトＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２０〜配列番号３６からなる群から選択される配列を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）における番号付けに基づいて、１位および６位のシステイン残基間の分子内共有結合を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、システイン残基の一方または両方が、例えば、スルフヒドリル基を有する還元システインを含むようなものであり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、３１位に残基の突然変異を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、３２位に残基の突然変異を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｒ３１Ｇ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｒ３１Ａ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｋ３１Ｇ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｋ３１Ａ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｒ３２Ｇ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｒ３２Ａ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｋ３２Ｇ置換を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｋ３２Ａ置換を含み得る。残基番号付けは、配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けの参照によってであり得る。
本発明の第２の態様によれば、上記で示されたようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドをコード可能な配列を含む核酸が提供される。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、配列番号３７〜配列番号４６のいずれかに示される核酸配列を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、配列番号３７または配列番号４２のヒトＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列を含み得る。
本発明の第３の態様によれば、本発明者らは、従って、このような核酸を含む発現ベクターなどのベクターを提供する。本発明者らは、このようなベクターまたはこのような核酸を含む細菌、真菌または酵母細胞などの宿主細胞をさらに提供する。本発明者らは、このような宿主細胞、このようなベクターまたはこのような核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物をさらに提供する。トランスジェニック非ヒト動物は、哺乳動物を含み得る。トランスジェニック非ヒト動物は、マウスを含み得る。
本発明の第４の態様として、抗体またはその抗原結合断片が提供される。
抗体またはその抗原結合断片は、配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、上記で示されたようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、上記で示されたような核酸によってコードされるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと特異的に結合可能であり得る。
抗体またはその抗原結合断片は、任意選択で、標識をさらに含み得る。
それらと結合する抗体が提供されるが、これらの抗原性ポリペプチド断片はまた、独自に有用であり、提供されることは理解されなければならない。
本発明の第５の態様によれば、本発明者らは、上記で示されたＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを調節可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を提供する。ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号４７〜配列番号５１からなる群から選択される配列を含み得る。
本発明の第６の態様として、対象とする化合物をアッセイする方法が提供される。方法は、上記で示されたようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物がＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するかどうかを判定することを含み得る。方法は、上記で示されたようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物がＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの活性を調節するかどうかを判定することを含み得る。アッセイは、上記で示されたようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物が、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性の上昇または低減を引き起こすかどうかを判定することを含み得る。方法は、そのように同定される対象とする化合物を単離または合成することをさらに含み得る。
本発明の第７の態様によれば、本発明者らは、上記で示されたような方法によって同定、単離または合成された対象とする化合物を提供する。
本発明は、第８の態様において、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを下方制御する方法を提供する。方法は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、記載されるような抗体またはその抗原結合断片に曝露することを含み得る。方法は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、記載されるようなｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡに曝露することを含み得る。方法は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、記載されるような対象とする化合物に曝露することを含み得る。
本発明は、第９の態様において、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の治療、予防または軽減において使用するための、記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、記載されるような核酸、記載されるようなベクター、宿主細胞またはトランスジェニック非ヒト動物、記載されるような抗体またはその抗原結合断片、記載されるようなｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子または記載されるような対象とする化合物を提供する。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、心機能不全、高血圧症または血圧、心収縮性もしくは体液平衡における心血管異常を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、心肥大、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、梗塞後治療、心筋虚血−再灌流傷害または心房細動、冠動脈心疾患、心不全、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）などの心血管疾患を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、高血圧症、アンギナ、うっ血性心不全または勃起不全などの高血圧と関連する状態を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、個体におけるＡＩＤＳなどのＨＩＶ感染と関連する状態を含み得る。
本発明の第１０の態様によれば、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の治療、予防もしくは軽減において使用するためのまたは血管拡張薬として使用するための、記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、記載されるような核酸、記載されるようなベクター、宿主細胞もしくはトランスジェニック非ヒト動物、記載されるような抗体もしくはその抗原結合断片、記載されるようなｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ分子または記載されるような対象とする化合物を提供する。
本発明の第１１の態様によれば、本発明者らは、細胞を操作する方法であって、細胞を記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露することまたは記載されるような核酸もしくは記載されるようなベクターを細胞に導入することなどによって、細胞中のまたは細胞の記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを調節する、好ましくは上方制御することを含む方法を提供する。
本発明の第１２の態様に従って、幹細胞中のまたは幹細胞の自己複製および／または多能性を維持または増強する方法であって、上記で示されたような方法によって幹細胞を操作することを含む方法が提供される。
細胞は、幹細胞を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性の上方制御は、幹細胞中のまたは幹細胞の自己複製および／または多能性の維持または増強をもたらし得る。
本発明の第１３の態様として、本発明者らは、幹細胞などの細胞、組織、臓器または生物中のまたは幹細胞などの細胞、組織、臓器または生物のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを検出することを含む方法を提供する。
本発明者らは、本発明の第１４の態様によれば、配列ＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５４）またはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮ（配列番号５５）または両方を含む第１の部分および対象とするポリペプチドを含む第２の部分を含む組合せを提供する。
組合せは、第１の部分および第２の部分は、化学コンジュゲーションなどにより、共有結合で接合されるようなものであり得る。組合せは、第１の部分および第２の部分を含む融合タンパク質を含み得る。
本発明の第１５の態様によれば、本発明者らは、このような融合タンパク質を発現可能な発現構築物を提供する。
本発明の第１６の態様によれば、対象とするポリペプチドを検出または定量化する方法であって、記載されるような組合せを産生すること、および組合せの第１の部分の存在を検出することまたはそれを定量化することを含む方法が提供される。
本発明の第１７の態様によれば、本発明者らは、対象とするポリペプチドを単離する方法を提供する。方法は、記載されるような組合せを産生すること、および組合せを、第１の部分と特異的に結合可能な分子に曝露することとを含み得る。第１の部分と特異的に結合可能な分子は、上記で示されたような抗体またはその抗原結合断片を含み得る。
本発明の第１８の態様によれば、対象とするポリペプチドを配列ＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５４）またはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮ（配列番号５５）または両方とコンジュゲートしまたはその他の形で接合することを含む方法が提供される。
本発明の第１９の態様によれば、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片を作製する方法であって、（ａ）細胞においてＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基であり、ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する）を含む配列をコードする核酸を発現させることまたは（ｂ）化学合成を使用してＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む合成ポリペプチドもしくはその断片もしくは配列番号５３の配列を有する断片を生成することを含む方法を提供する。
本発明の第２０の態様によれば、ＥＬＡＢＥＬＡ発現を測定または検出するためのイムノアッセイキットであって、ａ）以下：（ｉ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチド、または（ｉｖ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドのうち１種または複数と特異的に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原結合断片を含むコーティング抗原と、（ｂ）前記コーティング抗原を使用するための使用説明書とを含むイムノアッセイキットが提供される。
イムノアッセイキットは、単離された抗体またはその抗原結合断片が標識されているようなものであり得る。
イムノアッセイキットは、酵素標識された試薬、単離された抗体または抗原結合断片、固体基質またはそれらのいずれかの組合せと特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合断片をさらに含み得る。
コア胚多能性、ＥＬＡに属するものは、保存されたホルモンをコードすることを示す図である。 図１Ａは、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１およびＰＲＤＭ１４ ｓｙｎ発現群が、コアヒト多能性ネットワークを規定する３３種の遺伝子の共通のリストを共有することを示す図である。ＥＬＡは、これらの遺伝子のうちの１種である。 図１Ｂは、ＥＬＡが、ＰＯＵ５Ｆ１同様、胚様体分化の間にｈＥＳＣにおいて迅速にサイレンシングされることを示す図である。 図１Ｃは、ＥＬＡが、分泌シグナルおよび成熟した３２個アミノ酸のペプチドからなる５４個のアミノ酸の保存された脊椎動物タンパク質をコードすることを示す図である。カルボキシ末端は、不変である。白色矢頭：Ｇ２２とＱ３３の間の予測されるシグナルペプチド切断部位。二重黒色矢頭：保存されたジアルギニンＲ３１Ｒ３２およびＲ４２Ｒ４３モチーフの後ろの可能性あるＦＵＲＩＮ切断部位。αＮおよびαＣ抗体産生のために選択されるＮおよびＣ末端エピトープが記載されている。αＣ抗体は、種に関わらずすべてのＥＬＡペプチドを認識するよう設計される。図１Ｃは、出現の順にそれぞれ配列番号２０、２２、２５〜２８および３０〜３３を開示する。 図１Ｄは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）胚において過剰発現された場合の、翻訳され、プロセシングされ、分泌され、αＣ抗体によって４ｋＤａの単一バンドとして認識されるＥＬＡのウエスタンブロットを示す図である。分泌のブレフェルジンＡ媒介性阻害は、ＥＬＡプロセシングを遮断する。 図１Ｅは、αＣ抗体が、全長ＥＬＡおよびプロセシングされたＥＬＡの両方を認識するが、αＮ抗体は、成熟したプロセシングされたＥＬＡペプチドに特異的であることを示す図である。 ＥＬＡが、ｈＥＳＣによって分泌される内因性ホルモンであり、その生存にとって必須であることを示す図である。 図２Ａは、ｈＥＳＣにおける免疫蛍光によって、αＣ抗体を用いてマークされる内因性ＥＬＡは、ＴＧＮ４６によってマークされるトランスゴルジネットワークと同時局在することを示す図である。 図２Ｂは、ｈＥＳＣのコンディショニング培地中の可溶性細胞外ＥＬＡが、ｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングによって枯渇され得、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって検出され得ることを示す図である。 図２Ｃは、５日の期間にわたって、分泌されたＥＬＡが、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ｈＥＳＣ培養物の上清においてｎＭ濃度に達することを示す図である。同じ期間にわたって、Ｄｏｘ誘導性ｓｈＥＬＡノックダウンは、細胞外ＥＬＡの８５％近くの枯渇に達する。 図２Ｄは、免疫蛍光によって判断されるように、ｓｈβ２Ｍではなく、ｓｈＥＬＡが、ｈＥＳＣＳコロニーを徐々に分化させ、多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１、ＳＳＥＡ−３およびＴＲＡ−１−６０を失うことを示す図である。 図２Ｅは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームで測定された、単細胞として播種されたｓｈβ２Ｍ（挿入図）ではなく、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣが、大きな成長障害を示すことを示す図である。 図２Ｆは、平均ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣＳコロニーが、対照ｈＥＳＣに対して２分の１の大きさであることを示す図である。 図２Ｇは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、Ｇ１／Ｓでの二重チミジン遮断からの放出後の細胞周期進行の明白な変化を示さないことを示す図である。 図２Ｈは、ＦＡＣ分析によって、ｓｈβ２Ｍではなく、ｓｈＥＬＡが、増大したアネキシンＶおよび活性化カスパーゼ３によって判断されるように、単細胞で成長したｈＥＳＣＳに急速なアポトーシスを起こさせることを示す図である。 組換えＥＬＡが、ｈＥＳＣ成長を促進し、中内胚葉系列に向けて細胞を刺激することを示す図である。 図３Ａは、遊離末端および保存されたＣ３９およびＣ４４残基間の分子内シスチン結合を有する、組換え合成によって産生されたＥＬＡおよび突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧ（Ｒ３１Ｇ、Ｒ３２Ｇ）を示す図である。 図３Ｂは、免疫蛍光によって、ＦＩＴＣで標識された、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、組換えＥＬＡが、ｈＥＳＣによって迅速に取り込まれることを示す図である。 図３Ｃは、細胞数によって、外因性ＥＬＡの付加は、ｈＥＳＣの成長の増大を誘発し、一方で、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、未処理ｈＥＳＣに対して、成長の低減を示すことを示す図である。 図３Ｄは、未処理ｈＥＳＣに対して、突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、外因性ＥＬＡの付加が、ｈＥＳＣの生存の増大を誘発することを示す図である。 図３Ｅは、リアルタイム細胞指数解析によって、突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、外因性ＥＬＡの供給が、ｈＥＳＣの成長の増大を提供することを示す図である。 図３Ｆは、突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、外因性ＥＬＡが、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの成長をレスキューするのに十分であることを示す図である。 図３Ｇは、ｈＥＳＣの培地に添加された、親和性精製されたαＣ抗体が、ｈＥＳＣの成長を阻害するのに十分であり、強力な中和活性を実証する図である。 図３Ｈは、組換えＥＬＡの成長促進および生存特性は、ｈＥＳＣ培養物に特有であり、多分化能ｈＥＣまたは単能性ヒト軟骨肉腫および一次線維芽細胞では見られないことを示す図である。 図３Ｉは、ｑＰＣＲによって、組換えＥＬＡで処理されたｈＥＳＣが、大幅に高いレベルの中内胚葉マーカーを発現することを示す図である。逆に、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、低減したレベルのこれらの同中内胚葉マーカーを有する。 図３Ｊは、ＦＡＣによって判断されるように、組換えＥＬＡで処理されたｈＥＳＣが、幹細胞細胞表面マーカーＳＳＥＡ−３およびＴＲＡ−１−６０を失わないことを示す図である。 図３Ｋは、ｑＰＣＲ分析によって判断されるように、組換えＥＬＡで処理されたｈＥＳＣが、胚分化の際に、中内胚葉系列に傾倒せず、３種の胚葉のすべてに分化できることを示す図である。 突然変異体ｅｌａゼブラフィッシュの対立遺伝子シリーズの作製を示す図である。 図４Ａは、ゼブラフィッシュ胚におけるにおけるホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、ｅｌａは、接合子性に発現され、胚盤葉中に遍在性であるとわかることを示す図である。原腸陥入の間に、その発現は、軸性となり、神経管において最強である。 図４Ｂは、ｑＰＣＲ分析が、アクチンに対して、ｅｌａの発現が、もっぱら接合子であり、１００％被包期でピークにあり、受精後４日までには存在しないことを示す図である。 図４Ｃは、ゼブラフィッシュでは、ｅｌａが、第１染色体上に位置する３種のエキソンからなることを示す図である。ｅｌａのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を標的とするエキソン１のカスタムペアを使用して、Ｅｌａのシグナルペプチド内の突然変異の対立遺伝子シリーズを作製した。図４Ｃは、配列番号１５６を開示する。 図４Ｄは、３種の別個の機能喪失対立遺伝子を作製し、ｅｌａｂｒ２１対立遺伝子は、Ｅｌａのシグナルペプチド中に独特の７個のアミノ酸のインフレーム欠失をもたらす。対立遺伝子ｅｌａｂｒ１３およびｅｌａｂｒ１５は、未熟停止コドンを引き起こし、リーディングフレームを撹乱させ、Ｅｌａ成熟ペプチドをもたらさなかった。図４Ｄは、出現の順に、それぞれ、配列番号３６および１５７〜１５９を開示する。 図４Ｅは、野生型胚に対して、ホモ接合性ヌルｅｌａｂｒ１３胚が、欠陥のある被包期運動および７０％被包期で退行周縁部での収縮した胚環を示す図である。 図４Ｆは、１００％被包期で、ＲＴ−ＰＣＲによって、内因性ｅｌａおよびｅｌａｂｒ１３ｍＲＮＡが、別個の大きさのものであることを示す図である。αＣ抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、内因性Ｅｌａは、ｗｔ胚において認識され、ヌルｅｌａｂｒ１３同胞中には存在しない。 ｅｌａノックアウトゼブラフィッシュが、重症心血管欠陥を有することを示す図である。 図５Ａは、ヌルｅｌａｂｒ２１幼生が、心膜浮腫（白色矢頭）、蓄積された赤血球（赤色矢頭）を示し、血液循環を有さないことを示す図である。腹ひれの喪失（黒色矢頭）、尾芽重複（挿入図）および極端な尾／躯幹短縮化（下の胚）を含めた、可変の後方異常が観察される。 図５Ｂは、ｅｌａの喪失が、Ａに示される頂部の胚および下部の胚から得た切片でのＨ＆Ｅ染色によって示されるように、軽度心臓異形成から完全な心臓発育不全の範囲の重症心臓異常を引き起こすことを示す図である。 図５Ｃは、ヌルｅｌａｂｒ１３魚が、発達中の心臓を示すｃｍｌｃ１発現の重度の低減を有することを示す図である。 図５Ｄは、ヌルｅｌａｂｒ１３魚が、ｓｃｌ、血液先駆体のマーカーの上方制御によって判断されるように、造血の増大を示す図である。 図５Ｅは、種々の程度の尾欠陥を有するヌルｅｌａｂｒ１３幼生の分類を示す図である。クラスＩは、心膜浮腫および尾血液血餅を有し、クラス２は、クラス１表現型に加えて腹ひれ欠陥または尾芽重複を有し、クラス３幼生は、軽度から重症の尾／躯幹短縮化と組み合わせたクラス１のすべての表現型を有すると定義される。 図５Ｆは、３種の対立遺伝子すべてを使用するヘテロ接合性交雑から得られたｅｌａ突然変異体繁殖性成体のパーセンテージを示す図である。 ＥＬＡが、内胚葉分化にとって必須であることを示す図である。 図６Ａは、ｗｔ胚に対して、ホモ接合性ヌルｅｌａｂｒ１３胚が、収束−伸長欠陥を示し、ｂｒａ発現の変更によって示されるような、原口閉鎖の遅延および脊索の肥厚（挿入図）をもたらすことを示す図である。 図６Ｂは、ｅｌａの喪失が、心臓前駆体を前方外側板中胚葉に導く中内胚葉細胞を示す、内外方向のｇａｔａ５発現細胞の移入の欠陥を引き起こすことを示す図である。 図６Ｃは、ｅｌａ突然変異胚が、野生型胚が行うよりも緻密なｓｏｘ１７発現パターンを示し、ｓｏｘ１７＋先駆細胞は影響を受けないことを示す図である。 図６Ｄは、ｅｌａヌル胚が、７５％被包期で、そのヘテロ接合性同胞よりもおよそ４０％少ないｓｏｘ１７＋細胞を有することを示す図である。 図６Ｅは、免疫蛍光によるＳＯＸ１７発現の低減によって判断されるように、対照ではなく、ｓｈＥＬＡ、ｈＥＳＣの指示される内胚葉分化が著しく損なわれることを示す図である。組換えＥＬＡの添加は、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣにおける内胚葉分化の可能性のこの喪失をレスキューするのに十分である。 図６Ｆは、５日後のＥＬＡペプチドｈＥＳＣＳを用いる、対照、ｓｈＥＬＡおよびｓｈＥＬＡにおける内胚葉分化効率の定量化が、ＥＬＡ枯渇の際のＳＯＸ１７発現の大幅な４５％の低減を示し、これが、外因性ＥＬＡの付加によって完全にレスキューされ得ることを示す図である。 内胚葉分化のＥＬＡの同族受容体が、ＡＰＬＮＲであることを示す図である。 図７Ａは、ＥＬＡおよびアペリンが、１２を超える等電点を有する極めて塩基性のホルモンであることを示す図である。図７Ａは、出現の順番に、それぞれ、配列番号１６０〜１６１を開示する。 図７Ｂは、Ｑ−ＰＣＲによって、ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂの転写の開始が、中期胞胚変移でｅｌａのものと同時に起こり、アペリン発現が、原腸陥入の際に５時間後に登場することを示す図である。 図７Ｃは、対照胚に対して、７０％被包期でａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂの発現は、より強くなり、ｅｌａ突然変異体において最も赤道の胚盤葉下層に制限される（白色矢頭：動物極における特異的ａｐｌｎｒａ発現）ことを示す図である。 図７Ｄは、受精の６日後に拍動する心臓および血液循環を有する野生型胚、７５％被包期での最終的な内胚葉における正常なｓｏｘ１７発現、中間体細胞塊における赤血球蓄積がないことおよび３０ｈｐｆでの心臓形成領域におけるｃｍｌｃ１発現を示す図である。 図７Ｅは、受精の６日後の拍動する心臓がなく、血液循環がないＡｐｌｎｒモルファント表現型コピーｅｌａ突然変異胚、７５％被包期での最終的な内胚葉におけるｓｏｘ１７発現の低減、中間体細胞塊における赤血球の蓄積および３０ｈｐｆでの心臓形成領域におけるｃｍｌｃ１発現の喪失を示す図である。 図７Ｆは、受精後６日で、ｅｌａ突然変異胚が、Ａｐｌｎｒモルファントと解剖学的に識別不能であり、拍動する心臓を有さず、血液循環を有さず、７５％被包期での最終的な内胚葉におけるｓｏｘ１７発現の低減を示し、中間体細胞塊において蓄積された赤血球を有し、３０ｈｐｆでの心臓形成領域におけるｃｍｌｃ１発現がないことを示す図である。 図７Ｇは、２９３Ｔ細胞では、ゼブラフィッシュａｐｌｎｒａまたはａｐｌｎｒｂまたはヒトＡＰＬＮＲの過剰発現が、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしている組換えＥＬＡ（ＡＰ−ＥＬＡ）との細胞表面結合を付与するのに十分であることを示す図である。 図７Ｈは、２９３Ｔ細胞では、その突然変異体ではなく、ゼブラフィッシュａｐｌｎｒｂの過剰発現が、Ｗ９０Ｌミスセンス突然変異を保持するｇｒｉｎｃｈを形成し、またはＧＰＲ１５、ＡＰＬＮＲと密接に関連するオーファンＧＰＣＲが、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしている組換えＥＬＡ（ＡＰ−ＥＬＡ）との結合を得るのに十分であることを示す図である。 図的要約を示す図である。 ＥＬＡの発現が、ヒト胚盤胞およびｈＥＳＣにおいて最高であり、ＰＯＵ５Ｆ１制御下にあることを示す図であり、図１と関連している。 図９Ａは、Ｕｎｉｇｅｎｅによれば、ＥＬＡが、着床前ヒト胚盤胞において最も高度に発現されることを示す図である。 図９Ｂは、ＧＥＯによれば、ヒト着床前胚におけるＥＬＡ発現が、胚盤胞段階によって開始し、接合子発現と一致することを示す図である。 図９Ｃは、ｈＥＳＣにおけるＥＬＡ発現が、ＰＯＵ５Ｆ１ノックダウン後に下方制御されることを示す図である。 図９Ｄは、ｈＥＳＣにおいてトランスフェクトされるＥＬＡのプロモーター領域（ｃｈｒ４：１６５，７９６，８０６−１６５，７９８，３５９）は、その上流ＰＯＵ５Ｆ１エンハンサー（ｃｈｒ４：１６５，７８７，５７０−１６５，７８８，７９７）の存在下でホタルルシフェラーゼリポーターの発現を唯一駆動できることを示す図である。 図９Ｅは、ＥＬＡ発現が、胚様体分化の際にｈＥＳＣにおいて迅速に下方制御されることを示す図である。 図９Ｆは、ＥＬＡ発現が、最終的な内胚葉分化を起こしているｈＥＳＣにおいて迅速に下方制御されることを示す図である。 図９Ｇは、ＥＬＡ発現が、ＲＡ媒介性神経外胚葉分化を起こしているｈＥＳＣにおいて迅速に下方制御されることを示す図である。 図９Ｈは、ＥＬＡ発現が、心臓分化を起こしているｈＥＳＣにおいて最初に下方制御されるが、５日後に再発現されることを示す図である。 ＥＬＡが、ｈＥＳＣにおいてゴルジに局在し、そのノックダウンは、多能性を損なうことを示す図であり、図２と関連している。 図１０Ａは、ｈＥＳＣでは、ＥＬＡが、ＴＧＮ４６、トランスゴルジネットワークのマーカーと部分的に同時局在することを示す図である。 図１０Ｂは、αＮ抗体を使用して同一ゴルジ染色パターンが観察されることを示す図である。 図１０Ｃは、ｈＥＣにおける内因性ＥＬＡが、ｓｉＲＮＡ媒介性枯渇によって効率的にノックダウンされ得ることを示す図である。 図１０Ｄは、ｈＥＳＣにおける内因性ＥＬＡが、誘導性ｓｈＲＮＡ媒介性枯渇によって効率的にノックダウンされ得ることを示す図である。β２Ｍに対するｓｈＲＮＡは、ドキシサイクリン処理の非特異的効果またはヘアピンＲＮＡ発現に対する対照として使用される。 図１０Ｅは、１０００万個の対照またはｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣを、ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）に皮下注射し、６０日目までに、ｓｈＥＬ ｈＥＳＣではなく、対照のみが腫瘍を生じさせたことを示す図である。 図１０Ｆは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣが、連続継代の際に、多能性マーカーＰＯＵ５１およびＮＡＮＯＧの発現を失うことを示す図である。 図１０Ｇは、継代４のｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの単一コロニーｑＰＣＲ分析によって、ＰＯＵ５１およびＮＡＮＯＧの下方制御が確認されることを示す図である。 図１０Ｈは、ＥＬＡまたはβ２ＭのｓｈＲＮＡ媒介性枯渇が、Ｓ期を経て、ＥＤＵを組み込む細胞の数に影響を及ぼさないことを示す図である。 ｈＥＳＣでは、組換えＥＬＡが、生理活性であり、内因性ＥＬＡは、αＮ抗体によって中和され得ることを示す図であり、図３Ａ〜３Ｋと関連している。 図１１Ａは、組換えＥＬＡペプチドに対するｈＥＳＣの用量依存性反応を示す図である。 図１１Ｂは、ｈＥＳＣ培地への精製されたαＮ抗体の添加が、内因性ＥＬＡを阻害し、ｓｈＥＬＡノックダウンと同様の効果を引き起こすことを示す図である。αＮ抗体の中和活性は、突然変異体非シグナル伝達ＥＬＡＲＲ＞ＧＧペプチドの添加によって競合され得る。 ホモ接合性ｅｌａｂｒ２１およびｅｌａｂｒ１５突然変異魚は、同一表現型を有することを示す図であり、図５と関連している。 図１２Ａは、受精後６日の野生型幼生を示す図である。 図１２Ｂは、７個のアミノ酸のインフレーム突然変異体ｅｌａｂｒ２１対立遺伝子が、２種のフレームシフト突然変異体ｅｌａｂｒ１３およびｅｌａｂｒ１５と同一の表現型を引き起こすことを示す図である。 図１２Ｃは、ｅｌａｂｒ１５突然変異魚が、ｅｌａｂｒ２１およびｅｌａｂｒ１５対立遺伝子と識別不能であることを示す図である。 図１２Ｄは、２００ｐｇのゼブラフィッシュｅｌａ ＯＲＦ ｍＲＮＡの過剰発現が、ｅｌａヌル魚と同様に心臓異形成（中白矢印）およびＩＣＭにおける赤血球の蓄積（赤色矢印）を引き起こすことを示す図である。 内胚葉分化が、ｅｌａ突然変異魚、ＥＬＡが枯渇したｈＥＳＣにおいて欠陥のあるものであることを示す図であり、図６と関連する。 図１３Ａは、ｅｌａｂｒ２１およびｅｌａｂｒ１５突然変異魚が、７５％被包期でのｓｏｘ１７発現パターンにおいて同様の欠陥を示すことを示す図である。 図１３Ｂは、ＳＯＸ１７発現の低減によって判断されるように、ｓｈβ２Ｍおよび対照ｈＥＳＣではなく、ｓｈＥＬＡの指示される内胚葉分化が、著しく損なわれることを示す図である。 図１３Ｃは、指示された分化後の、対照、ｓｈＥＬＡおよびｓｈβ２Ｍ ｈＥＳＣＳにおける内胚葉分化効率の定量化が、ＥＬＡ枯渇の際のＳＯＸ１７発現の大幅な３５％の低減を示すことを示す図である。 ＡＰＬＮＲが、ＥＬＡ結合に必要であるが、ｈＥＳＣにおいてＥＬＡ受容体ではないことを示す図であり、図７と関連している。 図１４Ａは、ｈＥＳＣ中のＥＬＡおよびＡＰＬＮＲ遺伝子座のあたりのＣｈｉｐ−ＳｅｑによるＨ３Ｋ４ｍｅ３、ＲＮＡ ｓｅｑ．による転写物レベルおよびＭｅＤＩＰによるＤＮＡメチル化レベルを示す図である。データは、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ｗｗｗ．ｇｅｎｂｏｒｅｅ．ｏｒｇ）から抽出されている。 図１４Ｂは、３日目の分化した中内胚葉細胞と比較した、０日目の未分化ｈＥＳＣにおけるＡＰＬＮＲ転写物レベルのｑＰＣＲ分析（ＧＡＰＤＨに対して正規化された）を示す図である。ＡＰＬＮＲ転写物レベルは、２種の異なる構築物を使用するｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウンによって大幅に低減される。 図１４Ｃは、０日目の未分化ｈＥＳＣが、均一にＡＰＬＮＲ陰性であるが、３日目の中内胚葉細胞におけるＡＰＬＮＲのレベルは、ＦＡＣによって測定されるように１対数高いことを示す図である。灰色の影を付けたヒストグラムは、二次抗体を用いた場合にのみ染色された細胞である。これらの結果は、ｈＥＳＣ ＨＥＳ３の第２の株を使用して確認される。 図１４Ｄは、ｓｈＡＰＬＮＲの３日目の中内胚葉細胞が、大幅に低減した細胞表面ＡＰＬＮＲレベルを有することを示す図である。０日目の未分化ｈＥＳＣにおいて変化は観察されず、ＡＰＬＮＲがないことが確認される。 図１４Ｅは、ｓｈＡＰＬＮＲの３日目の中内胚葉細胞が、大幅に低減したＡＰ−ＥＬＡ結合を有することを示す図である。この低減は、細胞表面ＡＰＬＮＲのレベルの低下と比例する。ｓｈＡＰＬＮＲは、０日目の未分化ｈＥＳＣと結合しているＡＰ−ＥＬＡのレベルに影響を及ぼさない。 図１４Ｆは、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプラットフォームで測定されるように、未分化ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳＣが、ｓｈ対照ｈＥＳＣと比較して損なわれた成長を示さないことを示す図である。 ＥＬＡが、ｈＥＳＣにおいて必須であるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化することを示す図である。 図１５Ａは、ｈＥＳＣにおけるＥＬＡの即時シグナル伝達を解明するための、ＳＩＬＡＣベースのホスホプロテオミック分析の図式を示す図である。 図１５Ｂは、ＡＫＴ経路の活性化を示唆する、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、ＥＬＡによるＴ４２６でのリン酸化を示す、ＰＲＡＳ４０由来ペプチドのマススペクトルを示す図である。 図１５Ｃは、ＥＬＡを瞬間適用されたｈＥＳＣが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の即時活性化を示すことを示す図である。ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化によって示されるように、ｍＴＯＲ経路は、ＰＲＡＳ４０のリン酸化によってＡＫＴの下流で活性化される。 図１５Ｄは、減少するインスリン濃度で２４時間成長させた対照およびｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣを示す図であり、ＥＬＡ媒介性ＡＫＴ活性化が必要であることを示す。 図１５Ｅは、ＥＬＡによるＡＫＴの活性化が、ＰＩ３Ｋに依存しており、汎ＰＩ３Ｋ阻害剤Ｌｙ２９４００２およびワートマニンによって抑制されることを示す図である。 図１５Ｆは、二重チミジン遮断からの放出後に、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣがＧ１期での細胞の蓄積を示すことを示す図である。 ＥＬＡが、ｈＥＳＣにおけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化の内因性シグナルであることを示す図である。 図１６Ａは、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧまたは媒体対照ではなく、ＥＬＡが、ｈＥＳＣにおいてＡＫＴシグナル伝達を活性化し、ＥＲＫおよびＳＭＡＤ２の活性化はほとんどまたは全くしないことを示す図である。 図１６Ｂは、ＡＫＴのＥＬＡ媒介性活性化は、未分化ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳＣにおいて損なわれないことを示す図である。 図１６Ｃは、ＥＤＵ瞬間適用によって示されるように、定常状態で、対照ｈＥＳＣではなく、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣがＧ０／Ｇ１滞留の増大を示すことを示す図である。 図１６Ｄは、パルスチェイス実験においてそれに応じた標識されたアミノ酸の低速の組込みによって示されるように、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣが、ｍＴＳＥＲ１において培養された場合に、低速のタンパク質合成を有することを示す図である。 ＥＬＡが、ストレス誘導性アポトーシスから保護し、インスリンと部分的に置き換わることを示す図である（図Ｓ５も参照のこと）。 図１７Ａは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣが、インスリン欠乏に対して対照ｈＥＳＣよりも感受性が高いことを示す図である。外因性ＥＬＡは、インスリン欠乏によって引き起こされる細胞死の増大を部分的にレスキューする。 図１７Ｂは、リアルタイム細胞指数分析によって、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、ＥＬＡが、ｈＥＳＣ成長培地においてインスリンの必要性を部分的にレスキューできることを示す図である。 図１７Ｃは、ＦＡＣＳ分析によって、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの大きな割合が、アポトーシス細胞を示すアネキシンＶに対して陽性であることを示す図である。 図１７Ｄは、ＦＡＣＳ分析によって、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの大きな割合が、アポトーシス細胞を示す活性化カスパーゼ３について陽性であることを示す図である。 図１７Ｅは、活性化カスパーゼ３が、対照ｈＥＳＣではなく、免疫蛍光によってｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣにおいて検出され得ることを示す図である。 図１７Ｆは、ＥＬＡ処理されたｈＥＳＣが、対照ｈＥＳＣと比較してγ照射に対してより耐性であることを示す図である。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、γ照射に対して感作され、これは、ＥＬＡの添加によってレスキューされ得る。 図１７Ｇは、ＥＬＡが、照射後のカスパーゼ３の活性化およびアポトーシスを防ぐが、二本鎖切断を示す、γ−Ｈ２ＡＸフォーカスの形成に影響を及ぼさないようであることを示す図である。 図１７Ｈは、ＥＬＡ処理されたｈＥＳＣが、転写ストレスおよびｐ５３依存性細胞死を誘導する、低レベルのアクチノマイシンＤ処理に対してより耐性であることを示す図である。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、より感受性であるが、ＥＬＡの添加によってレスキューされ得ない。 図１７Ｉは、ＥＬＡが、ｈＥＳＣにおけるアクチノマイシンＤ処理後の活性化カスパーゼ３／７およびアポトーシスのレベルを低下させることを示す図である。 図１７Ｊは、頭部および躯幹領域における活性化カスパーゼ３に対して陽性である細胞数の増大によって示されるように、ｅｌａｂｒ１３ヌルゼブラフィッシュ胚が、受精後２４時間（ｈｐｆ）で対照胚に対してより高いレベルのアポトーシスを有することを示す図である。 ＥＬＡが、ストレス誘導性アポトーシスから保護し、インスリンと部分的に置き換わることを示す図である。 図１８Ａは、インスリンが、ＴＳＥＲ−Ｅ８で成長したｈＥＳＣにおけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の主なアクチベーターであることを示す図である。 図１８Ｂは、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく、ＥＬＡが、外因性インスリンの非存在下でｈＥＳＣの生存力をレスキューすることを示す図である。 図１８Ｃは、インスリンの非存在下での３日の成長後に、外因性ＥＬＡを補充したｈＥＳＣのみが成長し続けることを示す図である。ｂＦＧＦおよびＴＧＦβは、培養培地中に存在するが、ＥＬＡと置き換わることはできない。 図１８Ｄは、ＥＬＡが、細胞解離によって引き起こされるアポトーシスを指すアノイキスから保護することを示す図である。ＲＯＣＫ阻害剤は、アノイキスから保護し、ＥＬＡは、細胞解離後にそれと部分的に置き換わることができる。 図１８Ｅは、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧがアクチノマイシンＤ処理されたｈＥＳＣに対して保護効果を有さないことを示す図である。 図１８Ｆは、ＥＬＡが、Ｐ５３のレベルに影響を及ぼさないが、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、抗アポトーシスタンパク質ＭＣＬ−１のレベルを低下させたことを示す図である。 図１８Ｇは、ＥＬＡが、抗アポトーシスタンパク質ＢＡＸのミトコンドリア膜への挿入を阻害することによって、アポトーシスのミトコンドリア経路の活性化を防ぐことを示す図である。結果として、アクチノマイシンＤに応じて、ミトコンドリアから細胞質中へ、より少ないチトクロームＣが放出される。 図１８Ｈは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣが、活性化カスパーゼ９を増大したが、ＥＬＡが、アクチノマイシンＤ処理後に活性化エフェクターカスパーゼ９およびアポトーシスのレベルを低下させることを示す図である。 コンディショナルＥｌａノックアウト（ＥｌａＦｌｏｘ）マウスのゲノム遺伝子座を示す図である。ｌｏｘ部位（黒色三角）がそれぞれの両端に位置するエキソン２のＣｒｅ媒介性切り出しによって、末端切断型Ｅｌａペプチドをコードするヌル対立遺伝子（ＥｌａΔ）が生成する。（ＳＰ＝シグナルペプチド；ＭＰ＝成熟ペプチド）。 ＥｌａΔ／＋交雑が、部分的な胚性致死を示す、離乳時の時点でＥｌａノックアウトマウス数の低減をもたらすことを示す図である。 ｅ１０．５でのＥｌａノックアウト胚が、乏血管性であり、成長遅延されており、心臓発達に欠陥を示す大きな心膜浮腫を有することを示す図である。 Ｐｅｃａｍ−１染色によって示されるように、Ｅｌａノックアウト卵黄嚢における脈管構造が、ＥｌａΔ／＋同腹子対照におけるように、機能的側枝に成熟しないことを示す図である。 胚外層が、Ｅｌａノックアウト卵黄嚢と接着し、Ｅｌａノックアウト卵黄嚢中に機能的血管を生じさせるよう成熟させることができないことを示す図である。 異常な心臓管発達を示す、対照に対する、青色色素で染色されたＥｌａノックアウトマウスにおける心臓の正面像を示す図である。 Ｅｌａノックアウト心臓の断面図が、対照の同腹子のものと比較して、異常な心室中隔形成および心内膜発達を示したことを示す図である。 ＡＰＬＮＲと同様、ＧＰＣＲ ＣＸＣＲ４、最も顕著なＨＩＶ受容体の１種が、ＥＬＡとの細胞表面結合を付与することを示す図である。その他の試験したＧＰＣＲは、結合を付与せず、アッセイ特異性を証明した。 ＣＸＣＲ４の同族リガンドＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２としても知られる）とは異なり、ＥＬＡがＣＸＣＲ４を活性化できないことを示す図である。 ＥＬＡが、ＳＤＦ１媒介性ＣＸＣＲ４活性化を防ぐことによってＣＸＣＲ４拮抗リガンドとして挙動することを示す図である。 ＥＬＡが、ＮＬ（ＨＩＶ−１ ＮＬ４３：ＣＸＣＲ４向性株）への感染を阻害するが、ＡＤ８（ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８：ＣＣＲ５向性ウイルス）またはＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルスへの感染は阻害しないことを示す図である。ＨＩＶ−１感染は、感染の３６〜４８時間後に比色分析アッセイ（Ｂ−Ｇａｌ活性）によって測定される。ＥＬＡは、１０〜４０μＭでＨＩＶを阻害する。ネビラピン、リバーストランスクリプターゼ阻害剤は、試験したすべてのウイルスを遮断する。
本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の能力の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｂｏｏｋｓ１〜３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５年および定期的な付録；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３および１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６年、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ． ＭｃＧｅｅ、１９９０年、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９９９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）（１９８８年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照のこと。これらの一般的な教本の各々は、参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
配列番号１は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドシグネチャー配列の配列を示す。配列番号２は、ヒト属（Ｈｏｍｏ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号３は、シロアシネズミ属（Ｐｅｒｏｍｙｓｃｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号４は、クマネズミ属（Ｒａｔｔｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。
配列番号５は、ハツカネズミ属（Ｍｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号６は、ウシ属（Ｂｏｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号７は、イノシシ属（Ｓｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号８は、アルマジロ属（Ｄａｓｙｐｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号９は、フクロギツネ属（Ｔｒｉｃｈｏｓｕｒｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。
配列番号１０は、ガルス属（Ｇａｌｌｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１１は、ヤモリ属（Ｇｅｋｋｏ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１２は、アノリス属（Ａｎｏｌｉｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１３は、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１４は、トラフサンショウウオ属（Ａｍｂｙｓｔｏｍａ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。
配列番号１５は、メダカ属（Ｏｒｙｚｉａｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１６は、ソウギンザメ属（Ｃａｌｌｏｒｈｉｎｃｈｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１７は、タイヘイヨウサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。配列番号１８は、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチドの配列を示す。
配列番号１９は、ヒトＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列の配列を示す。配列番号２０は、シグナル配列（太字）を有するヒト属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２１は、シグナル配列（太字）を有するシロアシネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２２は、シグナル配列（太字）を有するクマネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。
配列番号２３は、シグナル配列（太字）を有するハツカネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２４は、シグナル配列（太字）を有するウシ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２５は、シグナル配列（太字）を有するイノシシ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２６は、シグナル配列（太字）を有するアルマジロ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２７は、シグナル配列（太字）を有するフクロギツネ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。
配列番号２８は、シグナル配列（太字）を有するガルス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号２９は、シグナル配列（太字）を有するヤモリ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３０は、シグナル配列（太字）を有するアノリス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３１は、シグナル配列（太字）を有するゼノパス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３２は、シグナル配列（太字）を有するトラフサンショウウオ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。
配列番号３３は、シグナル配列（太字）を有するメダカ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３４は、シグナル配列（太字）を有するソウギンザメ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３５は、シグナル配列（太字）を有するタイヘイヨウサケ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。配列番号３６は、シグナル配列（太字）を有するダニオ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列を示す。
配列番号３７は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号３８は、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号３９は、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号４０は、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を示す。配列番号４１は、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）ＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号４２は、ヒトＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列を示す。配列番号４３は、マウスＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列を示す。配列番号４４は、ニワトリＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列を示す。配列番号４５は、アフリカツメガエルＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列を示す。配列番号４６は、ゼブラフィッシュＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列を示す。
配列番号４７は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ａを示す。配列番号４８は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｂを示す。配列番号４９は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ 配列Ｃを示す。配列番号５０は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｄを示す。配列番号５１は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｅを示す。
詳細な説明
本明細書に包含される種々のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド変異体の説明では、参照が容易なように以下の命名法が採用される。
（ｉ）置換が数字および文字、例えば、３１Ａを含む場合には、これは、［番号付けシステムによる位置／置換されるアミノ酸］を指す。したがって、例えば、３１位におけるアミノ酸のアラニンへの置換は、３１Ａと表される、
（ｉｉ）置換が、文字、数字および文字、例えば、Ｒ３１Ａを含む場合には、これは、［元のアミノ酸／番号付けシステムによる位置／置換されるアミノ酸］を指す。したがって、例えば、３１位におけるアルギニンのアラニンでの置換は、Ｒ３１Ａと表される。
特定の位置で２以上のあり得る置換があり得る場合には、これは、任意選択で、スラッシュマーク「／」によって分けられこともある連続文字、例えば、Ｒ３１Ａ／ＧまたはＫ３２Ａ／Ｇによって表される。ある位置で関連アミノ酸が、任意のアミノ酸によって置換され得る場合には、これは、［番号付けシステムによる位置／Ｘ］、例えば、３１Ｘによって表される。
複数の突然変異は、スラッシュマーク「／」によって分離されていること、例えば、それぞれ、アルギニンをアラニンで、リシンをグリシンで置換する３１位および３２位での突然変異を表すＲ３１Ａ／Ｋ３２Ｇによって表され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ
本発明者らは、これまでに、予測シグナルペプチドを有する、未知の５４アミノ酸のホルモンを開示している。ペプチドホルモンは、その変異体、相同体、誘導体および断片と一緒に、全般的に、本明細書においてＥＬＡＢＥＬＡ（ＥＬＡに略される）と呼ばれる。このペプチドホルモンは、すべての脊椎動物種中に存在する。
ＥＬＡＢＥＬＡが同様に知られるその他の名称（本発明者らの発見後に与えられた）として、ｅｎｄｅ、ｔｏｄｄｌｅｒおよびａｐｅｌａがある。ウェブサイトｗｗｗ．ｅｌａｂｅｌａ．ｃｏｍは、ＥＬＡＢＥＬＡに関する情報のレポジトリを含有する。
ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＥＬＡ発現は、ヒト胚盤胞において最高であり（ｈｓ．１０５１９６、ＬＯＣ１００５０６０１３）、ｈＥＳＣ分化の間に迅速に下方制御されると報告されている（Ｍｉｕｒａら、２００４年）。
本発明者らの知る限り、胚発生の間に発現される次に最も早い既知ペプチドホルモンとしてアペリン（ＡＰＬＮ）があり、マウスではその転写は、原腸陥入の間に始まる（Ｄ’Ａｎｉｅｌｌｏら、２００９年）。しかし、Ａｐｌｎノックアウトマウスは、初期胚発達において欠陥がなく（Ｋｕｂａら、２００７年）、その喪失が成長遅延および心臓形成異常による可変胚性致死につながる、その受容体Ａｐｌｎｒ（ＡｐｊまたはＡｇｔｒｌ１としても知られる）の不活性化と一致しない（Ｃｈａｒｏら、２００９年）。
ゼブラフィッシュでは、ＡＰＬＮＲ相同体ａｐｌｎｒｂにおける突然変異は、側板中胚葉由来の心臓前駆体の心臓領域への移入を損なう。ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂは、内胚葉系列の初期前駆体、ａｐｌｎ発現の開始前の時間で発現されるので、ＡＰＬＮＲは、初期ホルモンのシグナルを伝達するが、未だ発見されるべきものであると仮定された（Ｃｈａｒｏら、２００９年；Ｓｃｏｔｔら、２００７年）。
実施例は、ＥＬＡが新規の分泌ペプチドホルモンであることを実証する。本発明者らは、ジンク−フィンガー−ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）媒介性遺伝子不活性化を使用して、ｅｌａヌルゼブラフィッシュの対立遺伝子シリーズを作製し、内胚葉分化および心臓形態形成にとって必須であることを示す。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡ、その変異体、相同体、誘導体および断片ならびにアゴニストおよびアンタゴニストなどのモジュレーターは、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の治療、予防または軽減のために使用され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されており、例えば、心機能不全または心血管疾患または高血圧症を伴う状態を含み得る。
実施例は、Ａｐｌｎではなく、Ｅｌａが、内胚葉分化およびその後の心発生のためのその効果を媒介するＡｐｌｎｒによって認識される第１のリガンドであることを示す。しかし、ＡＰＬＮＲが発現されないｈＥＳＣでは、本発明者らは、ＥＬＡが、アポトーシスから保護し、ｈＥＳＣの自己複製能を維持する内因性シグナルとして働くことを示す。
合わせると、本発明者らの結果は、培養ｈＥＳＣの自己複製にとって不可欠であり、ＡＰＬＮＲシグナル伝達経路を介する心臓形態形成にとってｉｎ ｖｉｖｏで重要である、これまでは特性決定されなかったホルモンＥＬＡの存在を明らかにする。
実施例１９は、その自己複製を維持するためのｈＥＳＣＳにおける傍分泌様式におけるＥＬＡシグナルを実証する。ｓｈＲＮＡまたは中和抗体によるＥＬＡ阻害は、細胞死およびｈＥＳＣ成長の低減を引き起こす。
実施例２０は、合成ＥＬＡが、インスリンと置き換わることによって幾分かｈＥＳＣの成長および生存を増強するのに十分であることを示す。
ＳＩＬＡＣホスホプロテオミックによって示されるＥＬＡの即時シグナル伝達は、ｈＥＳＣ維持に不可欠であるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化することを実証する。これは、実施例４８において示されている。
したがって、ＥＬＡは、ｅｌａヌル胚を用いて証明されるように、培養ｈＥＳＣおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてアポトーシスを防ぐことによって種々の細胞ストレスから保護する。
本発明者らは、ＥＬＡは、代替細胞表面受容体を介して、ＥＳＣ自己複製を支援し、脊椎動物胚によって分泌される最初期生存因子の１種を構成するということを提案する。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
本明細書に記載される方法および組成物は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを使用する。
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡがいくつかの脊椎動物種において発現されることを実証する。本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡが、種間で高度に保存されていることおよびＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列がいくつかの保存された領域を含むことをさらに実証する。
以下の配列アラインメントは、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質が、１７種の脊椎動物種にわたることを示す。保存された残基は、太字で示され、また強調され／影が付けられている。シグナル配列は、イタリック体で示されている。表Ｄ１中の配列は、配列表の配列番号２０〜３４中のものに対応する（配列番号５６として開示される「不変である残基」コンセンサス配列）。
その他の種に由来するいくつかの配列は、長さにおいて小さい変異を示す：
例えば、タイヘイヨウサケ属ＥＬＡＢＥＬＡ配列（配列番号３５）は、下線を引いたＴＶ残基の間に１個のアミノ酸欠失を有する。失われたまたは対応する残基は、ヒト配列におけるメチオニン１５である。これは、シグナルペプチド内にある。
別の例として、ゼブラフィッシュＥＬＡＢＥＬＡ配列（配列番号３６）は、ＤＫＨＧ（配列番号５７）として下線が引かれている４個のアミノ酸挿入を有する。これらの４残基は、成熟ペプチドにおいて維持されると予測される。
広い意味で、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、「ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー」配列を含むポリペプチドである。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書に記載されるような天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの生物活性などの１種または複数の活性をさらに含み得る。配列アラインメントから明らかであるように、いくつかのＥＬＡＢＥＬＡシグネチャーがあり得る。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャーは、配列ＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５７）を含み得る。したがって、本明細書において使用されるように、用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」は、ＨＳＲＶＰＦＰ配列（配列番号５８）を含むポリペプチドを意味することもある。配列番号５８を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャーは、配列ＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５９）を含み得る。したがって、この意味で、用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」は、ＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ配列（配列番号５９）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す）を含むポリペプチドを意味する場合もある。配列番号５９を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書に記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
しかし、好ましい実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャーは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を示す）を指すよう意図される。したがって、本明細書において使用されるような用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」は、ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を示す）を含む配列を指すよう意図される。配列番号１を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
本明細書の目的上、用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」はまた、このようなポリペプチドの任意の断片、相同体、変異体または誘導体を包含するととられなければならない。このようなＥＬＡＢＥＬＡ断片、相同体、変異体および誘導体は、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されている。このようなＥＬＡＢＥＬＡ断片、相同体、変異体および誘導体は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
したがって、本明細書によって包含されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＥＬＡＢＥＬＡが発現される脊椎動物種のいずれかに由来するシグネチャーまたは保存された領域を含み得る（例えば、図１Ｃおよび上記の配列アラインメントを参照のこと）。このようなシグネチャーおよび保存された領域は、配列番号２〜配列番号１８および配列番号６０〜７６として示されている。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、任意の種に由来するシグネチャーまたは保存された領域、例えば、ヒト属配列ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６０）、シロアシネズミ属配列ＣＦＲＲＲＣＶＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６１）、クマネズミ属配列ＣＦＲＲＲＣＩＳＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６２）、ハツカネズミ属配列ＣＦＲＲＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６３）、ウシ属配列ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６４）、イノシシ属配列ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６５）、アルマジロ属配列ＣＦＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６６）、フクロギツネ属配列ＣＰＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６７）、ガルス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列ＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６８）、ヤモリ属配列ＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６９）、アノリス属配列ＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７０）、ゼノパス属配列ＣＦＬＫＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７１）、トラフサンショウウオ属配列ＣＳＬＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７２）、メダカ属配列ＣＬＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７３）、ソウギンザメ属配列ＣＷＨＲＲＣＬＰＦＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７４）、タイヘイヨウサケ属配列ＣＰＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７５）、ダニオ属配列ＣＰＫＫＲＣＬＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７６）を含み得る。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ヒトＥＬＡＢＥＬＡ由来のシグネチャーを含み得る、すなわち、ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）は、ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６０）を含み得る。マウスＥＬＡＢＥＬＡ由来のシグネチャーを含み得る、すなわち、ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）は、ＣＦＲＲＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６３）を含み得る。
ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６０）またはＣＦＲＲＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号６３）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
いくつかのその他の残基もまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド中に存在し得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列の上流に１個または複数の塩基性残基を含み得る。
特に、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の上流−７位に、またはおよそその位置に塩基性残基を含み得る。塩基性残基は、リシン残基またはアルギニン残基を含み得る。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７７）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）を含み得る。
（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７７）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の上流−８位に、またはおよそその位置に塩基性残基を含み得る。塩基性残基は、リシン残基またはアルギニン残基を含み得る。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７８）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）を含み得る。（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７８）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
上記のように、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の上流−７位および−８位に、またはおよそその位置に１対の塩基性残基を含み得る、すなわち、配列（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７９）を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドがシグナル配列含む場合には（以下を参照のこと）、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の上流−８位は、ヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列（配列番号２０）の３１位に対応し、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の上流−７位は、ヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列（配列番号２０）の３２位に対応することは明らかとなる。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２〜配列番号１８からなる群から選択される配列を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号５として示されるマウスＥＬＡＢＥＬＡ配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、シグナルペプチドまたはシグナル配列を含む。シグナルペプチドの存在が、ＥＬＡＢＥＬＡペプチドが細胞から排出および分泌されることを可能にすることは技術を有する読み手には明らかとなろう。技術を有する読み手はまた、このようなシグナル配列を本明細書に記載されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの配列中に遺伝子操作する方法を承知するであろう。
シグナル配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書において、便宜上、「全長」ポリペプチドと呼ばれ得る。それらは、産生されるべきＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド中に、本明細書に開示されるＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列を含めた任意の公知のシグナル配列を含めることによって産生され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、任意の適した種に由来するＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列、例えば、ヒト属ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧ（配列番号１９）、シロアシネズミ属ＭＲＦＱＨＹＦＬＶＦＦＩＦＡＭＳＬＬＦＩＴＥ（配列番号８０）、クマネズミ属ＭＲＦＱＰＬＦＷＶＦＦＩＦＡＭＳＬＬＦＩＴＥ（配列番号８１）、ハツカネズミ属ＭＲＦＱＰＬＦＷＶＦＦＩＦＡＭＳＬＬＦＩＳＥ（配列番号８２）、ウシ属ＭＲＦＨＱＦＦＬＬＦＶＩＦＭＬＳＬＬＬＩＨＧ（配列番号８３）、イノシシ属ＭＲＦＲＱＦＦＬＶＦＦＩＦＭＭＮＬＬＬＩＣＧ（配列番号８４）、アルマジロ属ＭＫＦＱＱＦＦＹＶＦＦＶＦＩＭＳＬＬＬＩＮＧ（配列番号８５）、フクロギツネ属ＭＲＦＱＬＬＦＦＬＦＬＦＦＴＭＧＩＬＬＩＤＧ（配列番号８６）、ガルス属ＭＲＬＲＲＬＬＣＶＶＦＬＬＬＶＳＬＬＰＡＡＡ（配列番号８７）、ヤモリ属ＭＲＬＱＬＬＬＬＴＣＦＬＩＬＴＧＶＬＬＧＮＧ（配列番号８８）、アノリス属ＭＲＬＱＱＬＬＬＴＷＦＬＬＬＡＧＡＬＬＩＮＧ（配列番号８９）、ゼノパス属ＭＤＦＱＫＬＬＹＡＬＦＦＩＬＭＳＬＬＬＩＮＧ（配列番号９０）、トラフサンショウウオ属ＭＫＷＱＫＬＬＡＩＬＦＷＩＬＭＧＡＬＬＶＮＧ（配列番号９１）、メダカ属ＭＲＶＷＮＬＬＹＬＬＬＬＬＡＡＡＬＡＰＶＦＳ（配列番号９２）またはソウギンザメ属ＭＲＦＱＨＬＬＨＩＩＬＬＬＣＴＳＬＬＬＩＳＧ（配列番号９３）を含み得る。
例えば、配列番号１９として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列、すなわち、ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧを含み得る。
「全長」または「天然」ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの例は、本明細書において開示されており、配列番号２０〜配列番号３６として示される配列のうちいずれかを含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２０として示される配列を有するかまたは含むヒトＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含み得るまたはそれからなり得る。配列番号２３を有する配列などのマウスＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含み得るまたはそれからなり得る。
「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」は、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性などの天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の活性を含み得る。このようなＥＬＡＢＥＬＡ活性は、本明細書において別の場所に詳細に記載されており、例えば、幹細胞などの細胞の自己複製または多能性または両方を維持する能力を含む。
上記のように、これらのポリペプチドのいずれか、いくつかまたはすべてのその相同体変異体および誘導体も、用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」に含まれる。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、１個または複数のスルフヒドリル基を有する還元システインを含み得る。還元システインは、ＥＬＡＢＥＬＡアミノ酸配列中のどこにも現れ得る。例えば、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）における番号付けに基づいて１位のシステインは、スルフヒドリル基を有する還元システインを含み得る。６位のシステインは、同様に、スルフヒドリル基を有する還元システインを含み得る。１位および６位の両方のシステイン残基は、そのように修飾され得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）における番号付けに基づいて１位と６位のシステイン残基の間に分子内共有結合を含み得る。
上記の位置番号付けは、それぞれ、ヒトＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２０）中の位置番号３９および４３にそれぞれ対応する。
別の例として、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド」と呼ばれるものなどの本明細書で論じる配列のいずれかの１つまたは複数の突然変異を含み得る。このような突然変異した配列は、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されている。
配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けに基づいて、その配列の３１位に塩基性残基の突然変異を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが含まれる。３１位の塩基性残基は、中性残基に突然変異し得る。例えば、３１位のアルギニンまたはリシン残基は、アラニンまたはグリシン残基に突然変異し得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けに基づいて３２位の塩基性残基の突然変異を含み得る。例えば、３２位の塩基性残基は、中性残基に突然変異し得る。したがって、３２位のアルギニンまたはリシン残基は、アラニンまたはグリシン残基に突然変異し得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、上記で示された塩基性残基の両方がそのように突然変異している突然変異体を含み得る。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、Ｒ３１Ｇ、Ｒ３１Ａ、Ｋ３１ＧまたはＫ３１Ａ置換を含み得る。置換は、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３２Ａ、Ｋ３２ＧまたはＫ３２Ａを含み得る。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列：（Ｒ／Ｋ）（Ａ／Ｇ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号９４）、（Ａ／Ｇ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号９５）または（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号９６）のいずれか１種を含み得る。
上記のように、位置番号付けは、配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けに基づいている。
配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けに基づいて、３１位および３２位は、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の位置番号付けに関して、それぞれ、−８位および−７位に対応することは認められよう。
本明細書に記載されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列の各々は、ＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列を必ず含むので、当業者ならば、所有するＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列内の任意の特定の残基の位置番号付けを確立できる。すなわち、当業者ならば、本明細書においておよび所有するその他の供給源において入手可能な情報を考えて、配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列に基づいて、またはＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド中に含まれるＥＬＡＢＥＬＡシグネチャー配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）の位置番号付けに基づいて、任意のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列において、任意の特定の残基の位置番号付けを確立できるであろう。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、種々の手段のために、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っているか、それを患っていると疑われる個体へのその治療のための投与のために使用され得る。
それらはまた、特定のＥＬＡＢＥＬＡ結合剤、特に、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体などの抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤の産生またはスクリーニングのために使用され得る。これらは、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されている。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の診断または検出のために検出され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されている。
本発明者らは、具体的に、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基である）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片を提供し、ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する。
断片は、配列番号６０〜７６の配列を含まないようなものであり得る。
分子内共有結合が、配列番号１の１位と６位のシステイン残基の間に存在し得るか、または配列番号１の１位および６位の一方もしくは両方のシステイン残基が、スルフヒドリル基を有する還元システインを含み得るか、または両方である。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片は、さらに標識を含み得る。標識は、放射性同位元素を含み得る。放射性同位元素は、１２５Ｉを含み得る。
ポリペプチド断片は、誘導体化され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片は、シグナル配列をさらに含み得る。シグナル配列は、配列番号１９を含み得る。
断片は、配列番号１のＮ末端に７個のさらなるアミノ酸をさらに含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片は、配列番号１６２（ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を有し得る。配列番号１６２の１位は、塩基性アミノ酸残基を含み得る。２〜６、８〜１０および１３〜１５位のＸは、任意のアミノ酸残基を含み得る。ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持可能であり得る。
断片は、配列番号１８１〜１９７の配列を含まないようなものであり得る。
１位の塩基性残基は、ＫまたはＲから選択され得る。
断片は、配列番号１のＮ末端に８個のさらなるアミノ酸をさらに含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片は、配列番号１６３（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を有し得る。配列番号１６３の１位は、塩基性アミノ酸残基を含み得る。２〜７、９〜１１および１４〜１７位のＸは、１個の／任意のアミノ酸残基を含み得る。ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持可能であり得る。
断片は、配列番号１６４〜１８０の配列を含まないようなものであり得る。
１位の塩基性残基は、ＫまたはＲから選択され得る。
断片は、配列番号１のＮ末端に８個のさらなるアミノ酸をさらに含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片は、配列番号１６３（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を含み得る。配列番号１６３の１位および２は、塩基性アミノ酸残基の対を含み得る。位置３〜７、１０〜１２および１５〜１７のＸは、任意のアミノ酸残基を含み得る。ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持可能であり得る。
断片は、配列番号１６４〜１８０の配列を含まないようなものであり得る。
１位および２の塩基性残基の対は、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫおよびＲＲから選択され得る。
ポリペプチド
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いに接合している２個以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を指す。「ポリペプチド」とは、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短鎖および一般的に、タンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。
「ポリペプチド」は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、または当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されるアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本に、およびより詳細な研究論文に、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含めたポリペプチド中のどこでも起こり得る。同じ種類の修飾は、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同一または種々の程度で存在し得ることは認められよう。また、所与のポリペプチドは、多数の種類の修飾を含有し得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐され得、それらは、分岐を有するか有さない環状であり得る。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスに起因し得るか、または合成法によって作製され得る。修飾として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｋｉｎｇ）、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｋｓ）の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加およびユビキチン化が挙げられる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３年およびＰｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年中、Ｗｏｌｄ、Ｆ．、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ、１〜１２頁；Ｓｅｉｆｔｅｒら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ （１９９０年）第１８２巻：６２６〜６４６頁およびＲａｔｔａｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ」、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（１９９２年）第６６３巻：４８〜６２頁を参照のこと。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号５３の配列を有する断片を含み得る。このような断片は、Ｎ末端にピログルタミン酸を含み得る。当業者には理解されるように、グルタミン酸またはグルタミンが、配列番号５３のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片などのポリペプチドのＮ末端にある場合には、自発的に環化して、ピログルタミン酸を形成し得る。いくつかの実施形態では、配列番号５３の配列を有する断片は、標識をさらに含み得る。
用語「ポリペプチド」は、レトロインベルソＤペプチドなどの当技術分野で公知の種々の合成ペプチド変異を含む。ペプチドは、抗原決定基および／またはＴ細胞エピトープであり得る。ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性であり得る。ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで中和抗体を誘導可能であり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡに当てはまるように、得られたアミノ酸配列は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、例えば、ヒトＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに共通する生物活性などの１種または複数の活性を有し得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド活性は、本明細書において別の場所に詳細に記載されている。一例として、ＥＬＡＢＥＬＡ相同体は、幹細胞などの細胞の自己複製または多能性または両方を維持可能であり得る。
特に、用語「相同体」は、得られたアミノ酸配列がＥＬＡＢＥＬＡ活性を有する場合に、構造および／または機能に関する同一性をカバーするものとする。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％など、少なくとも８５％など、少なくとも９０％などの配列同一性があり得る。少なくとも９５％、少なくとも９８％などの配列同一性があり得る。これらの用語はまた、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列の対立遺伝子変異であるアミノ酸に由来するポリペプチドを包含する。
その他のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
ＥＬＡＢＥＬＡ変異体、相同体、誘導体および断片はまた、本明細書に記載される方法および組成物において使用される。
ＥＬＡＢＥＬＡに関して、用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」は、配列からのまたは配列への、１個（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失または付加を含む。文脈が別に認めない限り、「ＥＬＡＢＥＬＡ」への言及は、このようなＥＬＡＢＥＬＡの変異体、相同体、誘導体および断片への言及を含む。このようなＥＬＡＢＥＬＡ変異体、相同体、誘導体および断片は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
本明細書において、「欠失」は、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しないヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかにおける変化と定義される。
本明細書において、「挿入」または「付加」は、天然に存在する物質と比較して、それぞれ、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらしたヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化である。
本明細書において、「置換」は、それぞれ、種々のヌクレオチドまたはアミノ酸による１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換えに起因する。
本明細書において記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドはまた、サイレント変化を生成し、機能的に同等なアミノ酸配列をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。
計画的なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。例えば、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸、正電荷を有するアミノ酸として、リシンおよびアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する電荷を有さない極性ヘッド基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行われ得る。第２列中の同一ブロック中および第３列中の同一行中のアミノ酸は、互いに置換され得る：
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、通常、Ｎ末端またはＣ末端、例えば、Ｎ末端に、異種アミノ酸配列をさらに含み得る。
異種配列は、細胞内または細胞外タンパク質ターゲッティングに影響を及ぼす配列（リーダー配列など）を含み得る。異種配列はまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの免疫原性を増大させ、ならびに／またはポリペプチドの識別、抽出および／もしくは精製を促進する配列を含み得る。使用され得る別の異種配列として、Ｎ末端であり得るポリヒスチジンなどのポリアミノ酸配列がある。少なくとも１０個のアミノ酸、例えば、少なくとも１７個であるが５０個より少ないアミノ酸のポリヒスチジン配列が使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であり得るか、または融合タンパク質などの大きなタンパク質の一部であり得る。また、分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基などの精製に役立つ配列または組換え産生の間の安定性のためのさらなる配列を含有するさらなるアミノ酸配列を含むことも可能である。
シグナル配列（分泌配列またはリーダー配列）は、配列ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧ（配列番号１９）を含み得る。このようなシグナル配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの一例として、配列番号２０として示される全長ヒトＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド配列がある。
本明細書に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、公知の技術を使用して組換え手段によって作製され得る。しかし、それらはまた、固相合成などの化学法を使用してなど、当業者に周知の技術を使用して合成手段によっても作製され得る。
このようなポリペプチドはまた、例えば、抽出および精製に役立つよう、融合タンパク質として産生され得る。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ（配列番号９７）、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写物活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
また、融合タンパク質パートナーと対象とするタンパク質配列の間に、トロンビン切断部位などの、融合タンパク質配列の除去を可能にするためのタンパク質分解性切断部位を含むことが好都合であり得る。融合タンパク質は、対象とするタンパク質の配列の機能を邪魔しないものであり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。この用語は、天然状態からの人の手による変更を指すものとする。「単離された」組成物または物質が天然にある場合には、その元の環境から変更または除去されているか、または両方である。例えば、生存する動物中に天然に存在するポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存する材料から分離されている同一ポリヌクレオチド、核酸またはポリペプチドは、この用語が本明細書において使用されるように「単離されている」。
しかし、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質は、タンパク質の意図される目的を干渉しない担体または希釈剤と混合されてもよく、依然として、実質的に単離されたものと見なされるということは理解されよう。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドはまた、実質的に精製された形態であってもよく、この場合には、一般的に、調製物中のタンパク質の９０％を超える、例えば、９５％、９８％または９９％が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドである調製物中のタンパク質を含む。
種々の種に由来するＥＬＡＢＥＬＡ配列をアラインすることによって、種々の種の間でアミノ酸配列のどの領域が保存されているか（「相同領域」）、また、種々の種の間でどの領域が変わるか（「異種領域」）を決定することが可能である。
このようなアラインメントの一例は、図１Ｃに示されている。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、相同領域の少なくとも一部に相当する配列を含み得る。
相同領域は、少なくとも２種間で高度の相同性を示す。２種は、例えば、ヒトと、シロアシネズミ属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、ウシ属、イノシシ属、アルマジロ属、フクロギツネ属、ガルス属、ヤモリ属、アノリス属、ゼノパス属、トラフサンショウウオ属、メダカ属、ソウギンザメ属、タイヘイヨウサケ属またはダニオ属などの別の種を含み得る。
相同領域は、例えば、上記の試験を使用して、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を示し得る。
相同領域の例が、本明細書に示されており、例えば、ＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５８）、ＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５９）またはＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含み得る。このような相同領域は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
相同領域に相当する配列を含むペプチドは、本明細書において別の場所でさらに詳細に説明されるような治療戦略において使用され得る。あるいは、ＥＬＡＢＥＬＡペプチドは、異種領域の少なくとも一部に相当する配列を含み得る。異種領域は、少なくとも２種間で低い程度の相同性を示す。
ＥＬＡＢＥＬＡ相同体
使用するために開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、任意の供給源、例えば、関連するウイルス／細菌タンパク質、細胞性相同および合成ペプチド、ならびにそれらの変異体または誘導体から得られる相同配列を含む。
したがって、ポリペプチドはまた、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）、特に、霊長類、より特には、ヒトなどの動物を含めたその他の種に由来するＥＬＡＢＥＬＡの相同体をコードするものを含む。より詳しくは、相同体は、ヒト相同体を含む。
本明細書の関連において、相同配列は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９個または６０個またはそれ超のアミノ酸にわたって、関連ＥＬＡＢＥＬＡ配列の配列と、アミノ酸レベルで、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０または少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９５または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むととられる。
特に、相同性は、通常、タンパク質機能にとって必須ではない隣接する配列よりも、必須であると知られている配列の領域に関して考慮されなくてはならない。これは、遠縁の生物に由来する相同配列を考慮する場合には特に重要である。
ＥＬＡＢＥＬＡ中のこのような領域の例は、以下の配列：
（Ｒ／Ｋ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号７９）
中で下線が引かれて示されている。
相同性は、類似性（すなわち、同様の化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点で考慮され得るが、本明細書との関連で、相同性は、配列同一性の点で表され得る。
相同性比較は、目視によって、より普通には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて実施され得る。これらの公的に入手可能な、および市販のコンピュータプログラムは、２種以上の配列間の同一性％を算出できる。
同一性％は、連続配列にわたって算出され得る、すなわち、一方の配列が、もう一方の配列とアラインされ、一方の配列中の各アミノ酸が、もう一方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基が直接比較される。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的短い数の残基（例えば、５０個未満の連続するアミノ酸）にわたる場合にのみ実施される。
これは、極めて単純であり、一貫性のある方法であるが、例えば、そうでなければ同一の配列の対において、１つの挿入または欠失が、以後のアミノ酸残基をアラインメントから合わなくさせ、したがって、グローバルアラインメントが実施された場合に、相同性％の大幅な低下をもたらす可能性があることを考慮に入れることができない。結果として、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度のペナルティーを科すことなく、あり得る挿入および欠失を考慮する最適アラインメントをもたらすよう設計されている。これは、局所同一性または類似性を最大にするよう配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当て、その結果、同数の同一アミノ酸について、２種の比較される配列間のより高い関連性を反映する、できる限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有するものよりも高いスコアを達成する。ギャップの存在について比較的高いコストを、ギャップ中の各々のその後の残基について小さいペナルティーをかける「アフィンギャップコスト」が、通常使用される。これは、最もよく使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントをもたらす。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーが修飾されることを可能にする。しかし、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合にはデフォルト値が使用され得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（本明細書において別の場所を参照のこと）を使用する場合には、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップについて−１２であり、各伸長について−４である。
したがって、最大相同性％の算出は、ギャップペナルティーを考慮した最適アラインメントの作成を最初に必要とする。このようなアラインメントを実施するための適したコンピュータプログラムとして、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ ｐａｃｋａｇｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ第１２巻：３８７頁）がある。配列比較を実施できるその他のソフトウェアの例として、それだけには限らないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年同著−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０頁）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスーツが挙げられる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方が、オフラインおよびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年同著、７−５８〜７−６０参照のこと）。ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムが使用され得る。
最終相同性％が、同一性の点で測定され得るが、アラインメントプロセス自体は、通常、全か無の対比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいてスコアを各ペアワイズ比較に割り当てるスケールド類似性スコアマトリックスが、一般に使用される。よく使用されるこのようなマトリックスの一例として、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴスーツのデフォルトマトリックスがある。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公開されたデフォルト値または供給される場合にはカスタム記号比較表のいずれかを一般的に使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値が、またはその他のソフトウェアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスが使用され得る。
一度、ソフトウェアが最適アラインメントを作り出すと、配列同一性％などの相同性％を算出することが可能である。ソフトウェアは、通常、これを配列比較の一部として行い、数的結果を生成する。
アミノ酸配列に関して用語「変異体」または「誘導体」は、得られるアミノ酸配列が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと少なくとも同一の活性を有するなど、修飾されていない配列と実質的に同一の活性を保持する場合に、配列からのまたは配列への、１個（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失または付加を含む。このようなＥＬＡＢＥＬＡ変異体および誘導体は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
本明細書に開示されるＥＬＡＢＥＬＡアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその断片または相同体は、本明細書に記載される方法および組成物において使用するために修飾され得る。通常、配列の生物活性を維持する修飾が行われる。修飾された配列が修飾されていない配列の生物活性を保持するという条件で、アミノ酸置換、例えば、１、２または３〜１０、２０または３０の置換が行われ得る。あるいは、本明細書に記載されるポリペプチドの１つまたは複数の機能的ドメインを計画的に不活性化するよう、修飾が行われ得る。アミノ酸置換は、例えば、治療上投与されるポリペプチドの血漿半減期を増大するために、天然に存在しない類似体の使用を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ断片
本明細書に記載される方法および組成物において使用するためのポリペプチドはまた、上記で同定されたＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドのいずれかの全長配列の断片を含む。断片は、少なくとも１つのエピトープを含み得る。エピトープを同定する方法は、当技術分野で周知である。断片は、通常、少なくとも５個のアミノ酸、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５個またはそれ超のアミノ酸を含む。
関連ＥＬＡＢＥＬＡアミノ酸配列に由来する５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０個またはそれ以上の残基を含むか、またはそれからなる断片が含まれる。
このようなＥＬＡＢＥＬＡ断片は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含み得る。
本発明者らは、本明細書に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの一部を含むペプチドをさらに記載する。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡの断片およびその相同体、変異体または誘導体が含まれる。ペプチドは、２から６０個の間のアミノ酸、例えば、４から５０個の間のアミノ酸の長さであり得る。ペプチドは、例えば、トリプシンなどの適した酵素を用いる消化によって、本明細書に開示されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドから導かれ得る。あるいは、ペプチド、断片などは、組換え手段によって作製され得るか、固相合成などの化学的手段によって合成によって合成され得る。
したがって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは断片を作製する方法であって、細胞においてＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個のまたは任意のアミノ酸残基である）を含む配列をコードする核酸を発現させることを含む方法を記載し、ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する。
ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列をコードする核酸を発現する細胞は、細菌、真菌または酵母細胞であり得る。
ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列は、配列番号２〜３６からなる群から選択され得る。
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは断片を作製する方法であって、化学合成を使用して、ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個のまたは任意のアミノ酸残基である）を含む合成ポリペプチドまたは配列番号５３の配列を有する断片を作製する方法をさらに記載し、ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは断片、誘導体、相同体または変異体は、標識を含み得る。標識は、放射性同位元素を含み得る。放射性同位元素は、１２５Ｉを含み得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは断片、誘導体、相同体または変異体が導かれ得る。
このようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、断片、誘導体、相同体および変異体は、例えば、このような断片に対して作製された抗体によってＥＬＡＢＥＬＡ発現を選択的に検出するためのプローブを作製するために使用され得る。これらの抗体は、ＥＬＡＢＥＬＡと特異的に結合すると予測され、本明細書において開示される診断および治療の方法において有用である。
ＥＬＡＢＥＬＡおよびその断片、相同体、変異体および誘導体は、組換え手段によって作製され得る。しかし、それらはまた、固相合成などの当業者に周知の技術を使用して合成手段によって作製され得る。タンパク質はまた、例えば、抽出および精製に役立つよう、融合タンパク質として産生され得る。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ（配列番号９７）、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写物活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質パートナーと対象とするタンパク質配列の間に、融合タンパク質配列の除去を可能にするためのタンパク質分解性切断部位を含むことが好都合であり得る。融合タンパク質は、対象とするタンパク質の配列の機能を邪魔しないものであり得る。タンパク質はまた、動物細胞からの細胞抽出物の精製によって得られ得る。
本明細書に開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、実質的に単離された形態であり得る。このようなポリペプチドは、タンパク質の意図される目的を干渉しない担体または希釈剤と混合されてもよく、依然として、実質的に単離されたものと見なされるということは理解されよう。ＥＬＡＢＥＬＡ変異体、相同体、断片または誘導体はまた、実質的に精製された形態であってもよく、この場合には、一般的に、調製物中のタンパク質の９０％を超える、例えば、９５％、９８％または９９％が、あるタンパク質である、調製物中のタンパク質を含む。
本明細書に開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、明示標識で標識され得る。明示標識は、ポリペプチドなどが検出されることを可能にする任意の適した標識であり得る。適した標識として、放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、酵素、抗体、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリンカーが挙げられる。標識されたポリペプチドは、サンプル中のポリペプチドの量を調べるためにイムノアッセイなどの診断手順において使用され得る。ポリペプチドまたは標識されたポリペプチドはまた、標準プロトコールを使用する動物およびヒトにおける前記ポリペプチドに対する免疫反応性の検出のための血清学的または細胞媒介性イムノアッセイにおいて使用され得る。
任意選択で、標識された、本明細書において開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体はまた、固相、例えば、イムノアッセイウェルまたはディップスティックの表面に固定され得る。このような標識されたおよび／または固定されたポリペプチドは、適した試薬、対照、使用説明書などとともに、適した容器中でキットにまとめられ得る。このようなポリペプチドおよびキットは、イムノアッセイによるポリペプチドまたはその対立遺伝子または種変異体に対する抗体の検出の方法において使用され得る。
イムノアッセイ法は、当技術分野で周知であり、（ａ）前記タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含むポリペプチドを用意することと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、生体サンプルを前記ポリペプチドとともにインキュベートすることと、（ｃ）前記ポリペプチドを含む抗体−抗原複合体が形成されるかどうかを判定することとを一般的に含む。
本明細書において開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体は、疾患におけるその機能を含めた細胞機能におけるその対応する遺伝子およびその相同体の役割を研究するためにｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ細胞培養系において使用され得る。例えば、末端切断型または修飾ポリペプチドは、細胞において生じる正常な機能を撹乱するために細胞中に導入され得る。
ポリペプチドは、組換え発現ベクターからのポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ発現によって細胞中に導入され得る（本明細書中の別の場所を参照のこと）。発現ベクターは、任意選択で、ポリペプチドの発現を制御するために誘導プロモーターを保持する。
昆虫細胞または哺乳動物細胞などの適当な宿主細胞の使用は、組換え発現生成物に最適な生物活性を付与するために必要とされ得るような翻訳後修飾（例えば、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーションおよびラピデーションおよびチロシン、セリンまたはトレオニンリン酸化）を提供すると予測される。
本明細書において開示されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、変異体、相同体、断片および誘導体が発現されるこのような細胞培養系は、細胞におけるポリペプチドの機能を干渉または増強する候補物質を同定するためのアッセイ系において使用され得る。
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片を作製する方法であって、（ａ）細胞においてＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基である）を含む配列をコードする核酸を発現させることであり、ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することと、（ｂ）化学合成を使用して、ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む合成ポリペプチドもしくはその断片または配列番号５３の配列を有する断片を作製することとを含む方法を記載する。
ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列をコードする核酸を発現する細胞は、細菌、真菌または酵母細胞を含み得る。
ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列は、配列番号２〜３６からなる群から選択され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片は、標識をさらに含み得る。標識は、放射性同位元素を含み得る。放射性同位元素は、１２５Ｉを含み得る。
ポリペプチドまたはその断片が導かれ得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド活性
本明細書のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、配列番号２０を有するヒトＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドなどの天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの生物活性などの１種または複数の活性を含み得る。このような活性は、便宜上「ＥＬＡＢＥＬＡ活性」または「ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド活性」と呼ばれ得る。
ＥＬＡＢＥＬＡなどのポリペプチドの「活性」または「生物活性」に言及する場合には、これらの用語は、類似の活性または改善された活性または望ましくない副作用が低減したこれらの活性を含めたＥＬＡＢＥＬＡの代謝または生理学的機能を指すものとする。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ活性は、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの任意の活性を含み得る。例えば、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの任意の身体活性、生化学活性、酵素活性、生物学的活性などを含み得る。
特に、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、断片、変異体、相同体および誘導体の活性を含めたＥＬＡＢＥＬＡ活性は、以下のうちいずれか１種または複数を含み得る：
・幹細胞の自己複製を維持する能力
・幹細胞の多能性を維持する能力
・幹細胞の成長を維持する能力
・幹細胞の成長を促進する能力
・アポトーシスを阻害する能力
・胚性幹細胞の細胞表面と結合する能力
・内胚葉または中胚葉系列へ向けて幹細胞の分化を偏向させる能力
・アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）と結合する能力
・ＣＸＣＲ４受容体と結合する能力
・Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化する能力
・心保護、例えば、虚血および／または再灌流の間の心臓機能の回復または維持
・酸化ストレスの低減
・梗塞の大きさの低減
・ＨＩＶ感染の阻害
ＥＬＡＢＥＬＡ活性は、幹細胞の成長能を維持する能力、幹細胞のクローン形成能を維持する能力および幹細胞の生存を維持する能力のうちいずれか１種または複数を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ活性は、胚性幹細胞によって分泌される能力および胚性幹細胞によって取り込まれる能力のうち一方または両方を含み得る。
また、ＥＬＡＢＥＬＡの抗原性および免疫原性活性も含まれる。このような活性およびこれらの活性をアッセイし、定量化する方法の例は、当技術分野で公知であり、この節において後に詳細に記載されている。
自己複製の維持
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、幹細胞などの細胞の自己複製を維持する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
多能性の維持
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、幹細胞などの細胞の多能性を維持する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
自己複製／多能性の維持についてのアッセイ
自己複製／多能性の維持についてのアッセイは、以下の「自己複製または多能性の維持」と見出しのある節において詳細に記載されている。
アポトーシスの阻害
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、アポトーシスを阻害する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、細胞成長を促進する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
細胞成長／アポトーシスの阻害の促進についてのアッセイ
アポトーシス阻害活性は、以下の実施例２に詳細に記載されるようにアッセイされ得る。
手短には、ｈＥＳＣは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単細胞中に解離され、１０μＭ Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）の存在下で１２時間プレーティングされる（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年）。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム成長アッセイは、Ｅ−プレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウェルあたりにプレーティングされた４０００個細胞を用い、４８時間毎に培地交換して実施される。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、２．５μＭ（または１０μｇ／ｍｌ）で添加される。細胞周期研究は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ ＥＤＵ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、二重チミジン遮断（２．５ｍＭチミジン；１６時間遮断、８時間放出、１６時間遮断）を実施することと、それに続く、放出後の示された時間でのＤＮＡ含量のＤＡＰＩ染色によって実施される。
アポトーシスアッセイは、対照およびドキシサイクリン処理細胞を、Ｙ−２７６３２を伴わずにマトリゲル上に６時間プレーティングすることと、それに続いて、回収し、アネキシンＶおよび活性化カスパーゼ３について染色することによって実施される。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、１２０時間の期間にわたってヒトＥＳ細胞に曝露された１０μＭの濃度のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露されていない対照細胞と比較して、ヒトＥＳ細胞の細胞指数を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％またはそれ超増大するようなものであり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、１２０時間の期間にわたってヒトＥＳ細胞に曝露された１０μＭの濃度のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露されていない対照細胞と比較して、ヒトＥＳ細胞の細胞指数を２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、５．５倍以上、６倍以上、６．５倍以上、７倍以上、７．５倍以上、８倍以上、８．５倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上または４０倍以上増大するようなものであり得る。
用語「細胞指数」によって、本発明者らは、細胞培養アッセイの開始時に播種された細胞の初期数と比較した所与の時間での生存細胞の定量的尺度（数など）を意味する（Ｋｅ Ｎ、Ｗａｎｇ Ｘ、Ｘｕ Ｘ、Ａｂａｓｓｉ ＹＡ． Ｔｈｅ ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ａｎｄ ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１１年；第７４０巻：３３〜４３頁を参照のこと）。
ＥＳ細胞表面結合
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＥＳ細胞の細胞表面と結合する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
ＥＳ細胞表面結合のアッセイ
ＥＳ細胞表面結合活性アッセイは、例えば、以下の実施例７に記載されるような当業者に公知のいくつかの方法を用いて実施され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ｈＥＳ細胞などの胚性幹細胞に曝露され、その同族細胞表面受容体と結合することが可能にされ得る。次いで、ｈＥＳ細胞は、固定され、本明細書に記載されるような、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド結合活性を有する抗体のいずれかなどの抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体を用いて染色され得る。抗体結合を示す発色性の方法は、当技術分野で公知であり、アルカリホスファターゼ、ジゴキシゲニンベースの方法などを含み得る。細胞表面結合（細胞内結合と対照的に）を示すために、共焦点顕微鏡が使用され得る。
アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）結合
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）と結合する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
アペリン受容体結合についてのアッセイ
アペリン受容体結合実験は、当技術分野で公知であり、例えば、Ａｎｇｅｌａ Ｇｉｄｄｉｎｇｓ、Ｓｃｏｔｔ Ｒｕｎｙｏｎ、Ｊａｍｅｓ Ｔｈｏｍａｓ、Ｊｕｌｉａｎｎｅ Ｔａｊｕｂａ、Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｂｏｒｔｏｆｆ、Ｒａｎｇａｎ Ｍａｉｔｒａ（２０１０年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＨＴＳ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＰＪ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．２０１０年：第１巻、３９〜４７頁に詳細に記載されている。
ＣＸＣＲ４受容体結合
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＣＸＣＲ４受容体と結合する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
ＣＸＣＲ４受容体結合についてのアッセイ
分泌性ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−アルカリホスファターゼ（ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−ＡＰ）を、先に記載されたように（Ｃｈｎｇら、２０１３年）、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−ＡＰをコードする構築物を２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトすることによって産生する。次いで、ＥＬＡ−ＡＰ発現細胞から得たコンディショニング培地を、ＣＸＣＲ４の全長ＯＲＦをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞とともに３時間インキュベートする。結合していないＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−ＡＰを洗浄除去し、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを用いて溶解する。溶解物を清澄化し、ＡＰ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴとともに３７℃で１５分間インキュベートする。４９５ｎｍで光学濃度を読み取り、青色呈色の強度は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−ＡＰの過剰発現されたＣＸＣＲ４受容体との親和性と直接的に正比例する。
内胚葉または中胚葉系列に向けての偏向
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、多能性細胞を内胚葉または中胚葉系列に向けて偏向させる、平衡をとるまたは進ませる能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、明白な系列傾倒を引き起こさずに幹細胞などの細胞を中内胚葉系列に向けて平衡をとり得る。
内胚葉または中胚葉系列に向けて偏向させる能力についてのアッセイ
中内胚葉系列偏向についてのアッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ２００７／０５００４３に記載されている。
内胚葉または中胚葉系列に向けた偏向についてのアッセイはまた、例えば、以下の実施例３および実施例２０に記載されるように実施され得る。
ヒトＥＳ細胞株Ｓｈｅｆ４細胞株（ＩｎｎｉｓｓおよびＭｏｏｒｅ、２００６年）などの任意の適したＥＳ細胞培養が使用され得る。ＥＳ細胞は、適した濃度のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド（２．５μＭまたは１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間などの適した時間量の間培養される。
インキュベーション後、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳおよびＢＲＡを含めた中内胚葉マーカーの発現が、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは免疫蛍光を使用して、例えば、任意の適した手段によってアッセイされ得る。
したがって、ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出され得る。ｑＰＣＲ反応は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してか、またはＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と並行してＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙシステム（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを使用して実施され得る。
これらのマーカーの各々のプライマー配列は、当技術分野で公知であり、また、例えば、表Ｅ１（実施例３）に列挙されている。
ＳＳＥＡ３およびＴＲＡ−１−６０などの細胞表面マーカーの発現は、ＥＳ細胞が、幹細胞性を失わないことを確認するためにアッセイされ得る。
心保護
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、心保護を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。心保護は、虚血および／または再灌流の間の心臓機能の回復または維持を含み得る。
心保護はまた、梗塞の大きさを低減する能力としてアッセイされ得る。梗塞の低減は、心筋虚血および再灌流傷害のマウスまたはブタモデルにおいてアッセイされ得る。
心保護についてのアッセイ
心保護は、例えば、国際（ＰＣＴ）特許公開ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例５、１０、１４および２０に記載される方法のうちいずれか１種または複数を使用してアッセイされ得る。
酸化ストレス
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、酸化ストレスを低減する能力（または細胞保護作用）を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
酸化ストレスについてのアッセイ
酸化ストレスの低減は、例えば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）誘導性細胞死のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用してアッセイされ得る。要約すると、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）媒介性酸化ストレスは、ヒト白血病ＣＥＭ細胞において誘導され、細胞生存力は、トリパンブルー排除によってモニタリングされる。ヒト白血病ＣＥＭ細胞は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドとともに（対照として生理食塩水とともに）インキュベートされ、酸化ストレスを誘導するために５０μＭ Ｈ２Ｏ２を用いて処理される。細胞生存力は、Ｈ２Ｏ２処理の１２、２４、３６および４８時間後にトリパンブルー排除を使用して評価される。
酸化ストレスの低減は、ＤＮＡ酸化のｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用してさらにアッセイされ得る。ｉｎ ｖｉｖｏ酸化ストレスはまた、以下のようにアッセイされ得る。ブタをＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを用いて（対照として生理食塩水を用いて）処理する。ブタ心臓の組織切片を得る。処理されたおよび処理されていないブタの組織切片における核酸化ストレスを、酸化ＤＮＡの８−ＯＨｄＧ免疫染色によって定量化する。組織切片を、ＤＮＡ酸化および酸化ストレスを示す強い核染色についてアッセイする。
梗塞の大きさの低減
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、梗塞の大きさを低減する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
梗塞の大きさについてのアッセイ
梗塞の大きさは、例えば、国際（ＰＣＴ）特許公開ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例６および１３に記載される方法のうちいずれか１種または複数を使用してアッセイされ得る。
ＨＩＶ感染の阻害
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＨＩＶ感染を含めたＨＩＶの活性のいずれかを阻害する能力を含む天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの特性を有し得る。
ＨＩＶ阻害についてのアッセイ
ＨＩＶ阻害についてのアッセイは、以下の実施例５６に記載されるように実施され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸
本明細書に記載される方法および組成物は、ＥＬＡＢＥＬＡポリヌクレオチド、ＥＬＡＢＥＬＡヌクレオチドおよびＥＬＡＢＥＬＡ核酸ならびにこれらのいずれかの変異体、相同体、誘導体および断片を使用できる。
用語「ＥＬＡＢＥＬＡポリヌクレオチド」、「ＥＬＡＢＥＬＡヌクレオチド」および「ＥＬＡＢＥＬＡ核酸」は、同義的に使用され得、ｃＤＮＡおよびゲノムＥＬＡＢＥＬＡ配列の両方を具体的に含むと理解されなければならない。これらの用語はまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドおよび／またはこれの断片、誘導体、相同体または変異体をコード可能な核酸配列を含むものとする。これらの用語はまた、例えば、配列表に示されるような本明細書に開示される特定の配列を有するＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの断片、誘導体、相同体または変異体である核酸配列を含むものとする。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸が言及される場合には、これは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドをコード可能な核酸配列への言及ととられなければならない。このような核酸は、本明細書において記載されるように、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持することなど、天然ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの１種または複数の生物活性を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドをコードし得る。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列は、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を示す）を含むポリペプチドをコード可能であり得る。得られたコードされるポリペプチド配列は、幹細胞の自己複製および／または多能性を維持可能であるなどのＥＬＡＢＥＬＡ活性を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸はまた、一般に、核酸のＥＬＡＢＥＬＡファミリーの任意のメンバーを指すととられ得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、例えば、配列番号２〜配列番号１９として示される配列のいずれかを含むポリペプチドをコード可能であり得る。ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、配列ＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドをコード可能であり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸の例として、配列番号３７〜配列番号４１または配列番号４２〜配列番号４６からなる群から選択されるものが挙げられる。例えば、配列番号３７の配列を有するヒトＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列が開示されている。
また、本明細書中の別の場所で「その他のＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列」として示される核酸配列のうちいずれか１種または複数が含まれる。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、配列番号３７のヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、本明細書に記載されるような、種々の手段のために使用され得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っているか、それを患っていると疑われる個体を治療するために、またはこのような状態を予防するために、またはこのような状態の結果として生じる任意の症状を軽減するために使用され得る。それらは、幹細胞などの細胞の多能性または自己複製または両方を維持または持続するために使用され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ核酸はまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現または産生のために使用され得る。その他の使用は、当技術分野の読み手にとって明白であり、また、本明細書において包含される。
本明細書において使用されるような、用語「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」は、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより通常は、二本鎖、または一本鎖と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、１個または複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のために、またはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含む。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの異常な塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡに種々の修飾が行われており、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界において通常見られるような、ポリヌクレオチドの化学的に、酵素的にまたは代謝的に修飾された形態ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
当業者ならば、遺伝暗号の縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が、同一ポリペプチドをコードし得ることは理解されよう。
本明細書において、用語「ヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列およびその変異体、相同体、断片および誘導体（その一部など）を指す。ヌクレオチド配列は、センスもしくはアンチセンス鎖またはそれらの組合せを表すかに関わらず、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい、ゲノムまたは合成または組換え起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。用語ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製され得る（例えば、組換えＤＮＡ）。
用語「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡを意味し得る。
その他の核酸
本発明者らはまた、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸の断片、相同体、変異体または誘導体である核酸を提供する。ＥＬＡＢＥＬＡ核酸に関して、用語「変異体」、「相同体」、「誘導体」または「断片」は、ＥＬＡＢＥＬＡヌクレオチド配列の配列からのまたはそれへの、１個（または複数）の核酸の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失または付加を含む。文脈が別に認めない限り、「ＥＬＡＢＥＬＡ」および「ＥＬＡＢＥＬＡ核酸」、「ＥＬＡＢＥＬＡヌクレオチド配列」などへの言及は、ＥＬＡＢＥＬＡのこのような変異体、相同体、誘導体および断片への言及を含む。
得られたヌクレオチド配列は、いずれか１種または複数のＥＬＡＢＥＬＡ活性を有するポリペプチドをコードし得る。用語「相同体」は、構造および／または機能に関する同一性をカバーするものとし得、その結果、得られたヌクレオチド配列は、ＥＬＡＢＥＬＡ活性を有するポリペプチドをコードする。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡの相同体などは、正常細胞と比較して、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っている個体から得られた細胞における発現レベルの増大を有し得る。配列同一性（すなわち、類似性）に関して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の配列同一性があり得る。配列表に示される任意の核酸配列（例えば、配列番号３７を有するＥＬＡＢＥＬＡ配列）などの関連配列に対して、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性があり得る。これらの用語はまた、配列の対立遺伝子変異を包含する。
変異体、誘導体および相同体
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸変異体、断片、誘導体および相同体は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、それら内に合成または修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドへのいくつかの異なる種類の修飾は、当技術分野で公知である。これらとして、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書における目的上、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得るということは理解されなくてはならない。このような修飾は、対象とするポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施され得る。
ポリヌクレオチドが二本鎖である場合には、二本鎖の両鎖は、個別にまたは組み合わせてのいずれかで、本明細書に記載される方法および組成物によって包含される。ポリヌクレオチドが一本鎖である場合には、そのポリヌクレオチドの相補配列も含まれることは理解されなければならない。
ヌクレオチド配列に関して、用語「変異体」、「相同体」または「誘導体」は、配列からのまたは配列への、１個（または複数）のアミノ酸の任意の置換、変異、修飾、置換え、欠失または付加を含む。前記変異体、相同体または誘導体は、生物活性を有するポリペプチドをコードし得る。このようなＥＬＡＢＥＬＡの断片、相同体、変異体および誘導体は、上記で示されたような調節された活性を含み得る。
上記で示されたように、配列同一性に関して、「相同体」は、配列表に示される任意の核酸配列（例えば、配列番号３７を有するＥＬＡＢＥＬＡ配列）などの関連配列に対して、少なくとも５％の同一性、少なくとも１０％の同一性の同一性、少なくとも１５％の同一性、少なくとも２０％の同一性、少なくとも２５％の同一性、少なくとも３０％の同一性、少なくとも３５％の同一性、少なくとも４０％の同一性、少なくとも４５％の同一性、少なくとも５０％の同一性、少なくとも５５％の同一性、少なくとも６０％の同一性、少なくとも６５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性を有し得る。
少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性があり得る。ヌクレオチドの同一性比較は、上記のように実施され得る。使用され得る配列比較プログラムとして、上記のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムがある。デフォルトスコアリングマトリックスは、各同一ヌクレオチド各々について１０のマッチ値を有し、各ミスマッチについて−９を有する。デフォルトギャップ作製ペナルティーは、−５０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティーは、各ヌクレオチドについて−３である。
ハイブリダイゼーション
本発明者らは、本明細書において提示される配列のいずれかまたはその任意の変異体、断片もしくは誘導体と、または上記のいずれかの相補体と選択的にハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列をさらに記載する。ヌクレオチド配列は、少なくとも５、１０または１５ヌクレオチドの長さ、例えば、少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチドの長さであり得る。
用語「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書において、「核酸の鎖が塩基対合によって相補鎖と接合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術において実施されるような増幅のプロセスを含むものとする。
本明細書において提示されるヌクレオチド配列と、またはその相補体と選択的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドは、配列表に示される任意の核酸配列（例えば、配列番号３７を有するＥＬＡＢＥＬＡ配列）などの、本明細書において提示される対応するヌクレオチド配列と、少なくとも４０％相同、少なくとも４５％相同、少なくとも５０％相同、少なくとも５５％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも６５％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも７５％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも８５％相同、少なくとも９０％相同または少なくとも９５％相同であり得る。このようなポリヌクレオチドは、一般的に、少なくとも５、１０、１５または２０、例えば、少なくとも２５または３０、例えば、少なくとも４０、６０または１００もしくはそれ超の連続するヌクレオチドの領域にわたって対応するヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０または９０％または少なくとも９５％または９８％相同であり得る。
用語「選択的にハイブリダイズ可能」とは、プローブとして使用されるポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドが、バックグラウンドを大幅に上回るレベルでプローブとハイブリダイズするとわかる条件下で使用されることを意味する。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、スクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中に存在するその他のポリヌクレオチドのために起こり得る。この事象では、バックグラウンドは、標的ＤＮＡで観察される特異的相互作用の強度の１０倍未満、例えば、１００倍未満である、プローブとライブラリーの非特異的ＤＮＡメンバー間の相互作用によって生じたシグナルのレベルを暗示する。相互作用の強度は、例えば、プローブを例えば、３２Ｐもしくは３３Ｐを用いて放射標識することによって、または非放射性プローブを用いて（例えば、蛍光色素、ビオチンまたはジゴキシゲニン）測定され得る。
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７年、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ ＤｉｅｇｏＣＡ）において教示されるように、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、本明細書において別の場所で説明されるような既定の「ストリンジェンシー」を付与する。
最大ストリンジェンシーは、通常、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）で生じ、Ｔｍより約５℃〜１０℃下で高ストリンジェンシー、Ｔｍの約１０℃〜２０℃下で中程度のストリンジェンシー、Ｔｍの約２０℃〜２５℃下で低ストリンジェンシー。当業者には理解されるであろうが、最大ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一ポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得、中程度（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同様のまたは関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る。
本発明者らは、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３ ｐＨ７．０））下で、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸、断片、変異体、相同体または誘導体とハイブリダイズでき得るヌクレオチド配列を提供する。
相同体、変異体および誘導体の作製
ＥＬＡＢＥＬＡの、関連配列（例えば、配列番号３７を有するヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列）と１００％同一ではないが、同様に含まれるポリヌクレオチドならびに相同体、変異体および誘導体は、いくつかの方法で得られ得る。配列のその他の変異体は、さまざまな個体、例えば、異なる集団から得た個体から作製されたＤＮＡライブラリーをプローブすることによって得ることができる。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ相同体は、その他の個体またはその他の種から同定され得る。さらなる組換えＥＬＡＢＥＬＡ核酸およびポリペプチドは、本明細書において別の場所に記載されるように、相同体中の対応する位置を同定することと、分子を合成することまたは産生することとによって産生され得る。
さらに、ＥＬＡＢＥＬＡのその他のウイルス／細菌または細胞相同体、特に、哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシおよび霊長類細胞）中に見られる細胞相同体を得ることができ、このような相同体およびその断片は、一般に、ヒトＥＬＡＢＥＬＡと選択的にハイブリダイズ可能となる。このような相同体は、非ヒトＥＬＡＢＥＬＡ核酸、断片、変異体および相同体を設計するために使用され得る。さらなる多様性をもたらすために、突然変異誘発が当技術分野で公知の手段によって実施され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ相同体の配列は、その他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはその他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリーをプローブすることならびにこのようなライブラリーを、高ストリンジェンシーの培地の条件下で、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸、断片、変異体および相同体またはＥＬＡＢＥＬＡのその他の断片のいずれかのすべて、または一部を含むプローブを用いてプローブすることによって得ることができる。
同様の考察は、本明細書に開示されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子変異体を得ることに当てはまる。
変異体および株／種相同体はまた、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体および相同体内の配列を標的とするよう設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを使用して得ることができる。保存された配列は、例えば、いくつかの変異体／相同体に由来するアミノ酸配列をアラインすることによって予測され得る。配列アラインメントは、当技術分野で公知のコンピュータソフトウェアを使用して実施され得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
縮重ＰＣＲにおいて使用されるプライマーは、１つまたは複数の縮重位置を含有し、既知配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用されるものよりも低いストリンジェンシー条件で使用される。当業者には、遠縁の生物に由来する配列間の全体的なヌクレオチド相同性は、極めて低い可能性があり、したがって、これらの状況では、標識された断片ＥＬＡＢＥＬＡ配列を用いてライブラリーをスクリーニングすることよりも縮重ＰＣＲが、第１選択の方法であり得るということは理解されるであろう。
さらに、相同配列は、プログラムのＢＬＡＳＴスーツなどの検索アルゴリズムを使用してヌクレオチドおよび／またはタンパク質データベースを検索することによって同定され得る。
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特性決定された配列、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸またはその変異体、相同体、誘導体または断片の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞のためにコドン優先を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要である場合には、有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変更するために、その他の配列変化が望ましい場合もある。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、代替増幅反応のためのプライマー、例えば、放射性もしくは非放射性標識を使用する従来の手段によって明示標識を用いて標識されたプローブを産生するために使用され得、またはポリヌクレオチドは、ベクター中にクローニングされ得る。このようなプライマー、プローブおよびその他の断片は、少なくとも８、９、１０または１５、例えば、少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さとなり、また、本明細書において用語「ポリヌクレオチド」によって包含される。
ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換えによって、合成によってまたは当業者が利用可能な任意の手段によって産生され得る。それらはまた、標準的技術によってクローニングされ得る。
一般に、プライマーは、所望の核酸配列の一度に１ヌクレオチドの段階的な製造を含む合成手段によって産生される。自動化技術を使用するこれを達成するための技術は、当技術分野で容易に利用可能である。
ＥＬＡＢＥＬＡの断片を含むプライマーは、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態と関連するようなＥＬＡＢＥＬＡ発現の上方制御などのＥＬＡＢＥＬＡ発現の検出の方法において特に有用である。ＥＬＡＢＥＬＡの増幅のための適したプライマーは、ＥＬＡＢＥＬＡの任意の適したストレッチから作製され得る。使用され得るプライマーとして、特異的であるＥＬＡＢＥＬＡの配列を増幅可能なものが挙げられる。
ＥＬＡＢＥＬＡプライマーはそれ自体で提供され得るが、それらは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むプライマー対として最も有用に提供される。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を使用して産生される。これは、プライマーの対（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）を作製することと、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させることと、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施することと、増幅された断片を単離すること（例えば、アガロースゲル上の反応混合物を精製することによって）と、増幅されたＤＮＡを回収することとを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが、適したクローニングベクター中にクローニングされ得るよう、適した制限酵素認識部位を含有するよう設計され得る。
ポリヌクレオチドまたはプライマーは、明示標識を保持し得る。適した標識は、３２Ｐまたは３５Ｓなどの放射性同位体、ジゴキシゲニン、蛍光色素、酵素標識またはビオチンなどのその他のタンパク質標識を含む。このような標識は、ポリヌクレオチドまたはプライマーに付加され得、それ自体公知の技術を使用して検出され得る。ヒトまたは動物の身体においてポリヌクレオチドを検出または配列決定するための核酸ベースの試験において、標識された、または標識されていないポリヌクレオチドまたはプライマーまたはその断片が、当業者によって使用され得る。
検出するためのこのような試験は、一般に、ハイブリダイズ条件下で、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと接触させることと、サンプル中のプローブと核酸間で形成された任意の二本鎖を検出することとを含む。このような検出は、ＰＣＲなどの技術を使用して、またはプローブを固相支持体上に固定化することと、プローブとハイブリダイズされないサンプル中の核酸を除去することと、次いで、プローブとハイブリダイズされている核酸を検出することとによって達成され得る。あるいは、サンプル核酸は、固相支持体上に固定され得、このような支持体と結合しているプローブの量が検出され得る。この形式およびその他の形式の適したアッセイ法は、例えば、ＷＯ８９／０３８９１およびＷＯ９０／１３６６７に見出すことができる。
ヌクレオチド、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸を配列決定するための試験は、ハイブリダイズ条件下で標的ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する生体サンプルを、ポリヌクレオチドまたはプライマーを含むプローブと接触させることと、例えば、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結法によって配列を決定することと（Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと）を含む。
このような方法は、一般に、適した試薬の存在下で、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的である鎖の合成によってプライマーを伸長することと、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基のうち１種または複数で伸長反応を選択的に終結することと、鎖伸長および終結反応が起こるのを可能にすることと、伸長した生成物を大きさに従って分離して、選択的終結が起こったヌクレオチドの配列を決定することとを含む。適した試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、バッファーおよびＡＴＰが挙げられる。ジデオキシヌクレオチドは、選択的終結のために使用される。
ＥＬＡＢＥＬＡ制御領域
いくつかの目的のために、ＥＬＡＢＥＬＡの制御領域を利用し、調べることが必要であり得る。このような制御領域は、プロモーター、エンハンサーおよび遺伝子座制御領域を含む。本発明者らは、制御領域によって、それと作動可能に連結しているコード配列の発現を調節可能である核酸配列または構造を意味する。
例えば、制御領域は、ＥＬＡＢＥＬＡを発現するトランスジェニック動物の作製において有用である。さらに、制御領域は、ＥＬＡＢＥＬＡの発現構築物を作製するために使用され得る。これは、本明細書中の別の場所にさらに詳細に記載されている。
ＥＬＡＢＥＬＡの制御領域の同定は、単純であり、いくつかの方法で実施され得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡのコード配列は、プローブとしてヒトまたはマウスＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列を使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって生物から得ることができる。５’配列は、適当なゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、または当技術分野で公知のようにプライマー伸長によって得ることができる。ゲノムデータベースのデータベース検索も使用され得る。特に興味深いこのような５’配列は、非コード領域を含む。５’領域は、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域の存在を示す配列モチーフを同定するために、目視によって、またはコンピュータプログラムを用いて調べられ得る。
さらに、２種以上の生物から得たＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列の配列アラインメントが実施され得る。異なる種から得たＥＬＡＢＥＬＡ配列をアラインすることによって、種々の種間でアミノ酸配列のどの領域が保存されているかを判定することが可能である。このような保存された領域は、問題の遺伝子（すなわち、ＥＬＡＢＥＬＡ）の制御領域を含有する可能性が高い。本明細書において開示されるようなマウスおよびヒトゲノム配列、例えば、マウスＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列が、この目的のために使用され得る。さらに、マウスおよびヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列から作製された適当なプローブを使用し、スクリーニングの標準法を使用して、その他の生物からＥＬＡＢＥＬＡ相同体を得ることができる。ＥＬＡＢＥＬＡ相同体を同定するために、フグ（トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ））またはゼブラフィッシュのゲノムもスクリーニングされ得、このようにして、ＥＬＡＢＥＬＡのいくつかのゼブラフィッシュ配列が同定されている（上記で記載された）。制御領域を含有する保存された領域を同定するために、フグまたはゼブラフィッシュＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子の５’非コード領域のマウスまたはヒトゲノムＥＬＡＢＥＬＡ配列との比較が使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡのプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を同定するために欠失研究も実施され得る。
推定制御領域の同一性は、候補配列がリポーター遺伝子と連結され、リポーターの発現が検出される分子生物学実験によって確認され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡの調節
本発明者らは、細胞を操作する方法であって、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを上方制御することなどの調節することを含む方法を記載する。方法は、細胞をＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露することを含み得る。
あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、ＥＬＡＢＥＬＡ発現構築物（ＥＬＡＢＥＬＡ構築物としても知られる）を細胞中に導入することによって上方制御され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ発現構築物またはＥＬＡＢＥＬＡ構築物は、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸またはＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列を含むベクター（発現ベクターなど）を含み得る。
このような操作の結果として、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、操作を受けていない細胞と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％またはそれ超、上方制御され得る。
細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、操作を受けていない細胞と比較して、少なくとも１ｘ、少なくとも１．５ｘ、少なくとも２ｘ、少なくとも２．５ｘ、少なくとも３ｘ、少なくとも３．５ｘ、少なくとも４ｘ、少なくとも５ｘ、少なくとも１０ｘ、少なくとも２０ｘ、少なくとも３０ｘ、少なくとも４０ｘ、少なくとも５０ｘまたはそれ超、上方制御され得る。
このような構築物、核酸およびベクターの送達の機序は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム形質転換または微粒子銃を含み得る。しかし、構築物の導入は、細胞膜を物理的または化学的に透過処理する記載された方法のいずれかによって実施され得る。
１．エレクトロポレーション
ＥＬＡＢＥＬＡ構築物は、エレクトロポレーションによって細胞中に導入され得る。エレクトロポレーションは、高圧放電に対する細胞の懸濁液およびＤＮＡの曝露を含む。
エレクトロポレーションを使用する真核細胞のトランスフェクションは極めて成功してきた。この方法で、マウスプレＢリンパ球が、ヒトκ−免疫グロブリン遺伝子を用いてトランスフェクトされ（Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、ラット肝細胞が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされている（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６年）。
種々の供給源から得た細胞のエレクトロポレーション条件は最適化され得ることが考慮される。特に、電圧、電気容量、時間およびエレクトロポレーション培地組成のようなパラメータを最適化するよう望むことができる。その他の日常的な調整の実行は、当業者に公知であろう。
２．微粒子銃
裸のＤＮＡ構築物を細胞中に導入する方法の１種として、微粒子銃が挙げられる。この方法は、ＤＮＡがコーティングされた微粒子を、細胞膜に穴を開け、それらを死滅させることなく細胞に入ることを可能にする高速に加速する能力に頼る（Ｋｌｅｉｎら、１９８７年）。使用される微粒子は、タングステン、白金または金ビーズなどの生物学的に不活性な物質からなっていた。
いくつかの場合には、微粒子銃を使用するレシピエント細胞へのＤＮＡ送達にとって、金属粒子上へのＤＮＡ沈殿は必要ではないことが考慮される。粒子は、ＤＮＡでコーティングされるよりもＤＮＡを含有し得ることが考慮される。したがって、ＤＮＡがコーティングされた粒子は、微粒子銃によるＤＮＡ送達のレベルを増大し得るが、それ自体において、それ自体は必要ではないと提案される。
小さい粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。１種のこのような装置は、電流を生成する高圧放電に頼り、これは、順に、駆動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０年）。別の方法は、ＤＮＡでコーティングされた粒子を、ステンレス鋼またはナイテックススクリーン（Ｎｙｔｅｘ ｓｃｒｅｅｎ）などのスクリーンを通って、懸濁液中の細胞で覆われたフィルター表面上に推進させるために使用され得る遺伝子銃粒子送達系の使用を含む。スクリーンは、それらが大きな凝集塊でレシピエント細胞に送達されないよう粒子を分散させる。粒子装置と、衝撃が与えられる細胞間に介在するスクリーンは、粒子凝集塊の大きさを低減し、大きすぎる粒子によってレシピエント細胞に与えられる損傷を低減することによって、より高い頻度の形質転換に寄与し得ると考えられる。
衝撃のために、懸濁液中の細胞は、フィルター上に、あるいは、固体培養培地上に濃縮されてもよい。衝撃が与えられる細胞は、巨大粒子（ｍａｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）停止板の下の適当な距離に配置される。必要に応じて、加速装置と、衝撃が与えられる細胞の間に１個または複数のスクリーンも配置される。
衝撃形質転換では、最大数の安定な形質転換体が得られるよう衝撃前培養条件および衝撃パラメータを最適化できる。この技術では、衝撃の物理的および生物学的パラメータの両方が重要である。物理的因子として、ＤＮＡ／微粒子沈殿物を操作することを含むものまたは巨大粒子もしくは微粒子いずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものがある。生物学的因子として、衝撃の前および直後の細胞の操作に含まれるすべてのステップ、衝撃と関連する外傷の軽減に役立つ標的細胞の浸透圧調整およびまた線形化ＤＮＡまたは無傷のスーパーコイルプラスミドなどの形質転換ＤＮＡの性質が挙げられる。衝撃前操作は、始原生殖細胞の形質転換の成功にとって特に重要であると考えられる。
したがって、条件を十分に最適化するための小規模の研究で、さまざまな衝撃パラメータを調整することを望むことができると考えられる。特に、間隙距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧などの物理パラメータを調整することを望むことができる。また、レシピエント細胞の生理学的状態に影響を及し、したがって、形質転換および組込み効率に影響を及ぼし得る条件を改変することによって、外傷低減因子を最適化できる。例えば、最適形質転換のために、レシピエント細胞の浸透圧状態、組織水和および継代培養段階または細胞周期が調整され得る。その他の日常的な調整の実行は、当業者に公知であろう。
３．ウイルス形質転換
ａ．アデノウイルス感染
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物の送達のための１つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの組込みのための低い能力を有するとわかっているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子導入の高い効率によって均衡がとられている。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングを支援し、（ｂ）その中にクローニングされた構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むものとする。
ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。遺伝子構成またはアデノウイルス、３６ｋｂの、線形の、二本鎖ＤＮＡウイルスの知識によって、アデノウイルスＤＮＡの大きな部分の、最大７ｋｂの外来配列との置換が可能となる（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２年）。宿主細胞のアデノウイルス感染は、レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡが、遺伝毒性の可能性を伴わずにエピソーム様式で複製できるので、染色体組込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大幅な増殖後にゲノム再配列が検出されていない。
アデノウイルスは、中程度の大きさのゲノム、操作が容易なこと、高い力価、広い標的細胞範囲および高い感染性のために遺伝子導入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである、１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含有する。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分かれている異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよび２、３種の細胞性遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞シャットオフに関与している（Ｒｅｎａｎ、１９９０年）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含めた後期遺伝子の生成物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる簡単な一次転写物の相当なプロセシングの後でのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期相の間に特に有効であり、このプロモーターから与えられるすべてのｍＲＮＡは、それらを翻訳に適したｍＲＮＡにする５’−３分子リーダー（ＴＰＬ）配列を有する。
現在の系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターおよびプロウイルスベクター間の相同組換えから作製される。２種のプロウイルスベクター間のあり得る組換えのために、このプロセスから野生型アデノウイルスが生じ得る。したがって、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調べることが重大である。
複製に欠陥のある現在のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、ヒト胚性腎臓細胞からＡｄ５ ＤＮＡ断片によって形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる独特のヘルパー細胞株に頼る（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８年）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、外来ＤＮＡをＥ１、Ｄ３または両方の領域中に保持する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１年）。実際、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ１０５％をパッケージングでき（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７年）、約２ｋｂの追加のＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１およびＥ３領域において置換え可能であるおよそ５．５ｋｂのＤＮＡと組み合わせて、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋｂ未満またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％超がベクター骨格中にある。
ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞またはその他のヒト胚性間葉もしくは上皮細胞などのヒト細胞に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容的であるその他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞として、例えば、ベロ細胞またはその他のサル胚性間葉もしくは上皮細胞が挙げられる。適したヘルパー細胞株として、２９３がある。
Ｒａｃｈｅｒら（１９９５年）は、２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改善された方法を開示した。ある形式では、個々の細胞を１００〜２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中に播種することによって天然細胞凝集体を成長させる。４０ｒｐｍで撹拌した後、トリパンブルーを用いて細胞生存力を推定する。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように使用する。５ｍｌの培地中に再懸濁した細胞播種材料を、２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のキャリヤー（５０ｍｌ）に添加し、時々撹拌しながら、１〜４時間静置する。次いで、培地を５０ｍｌの新鮮培地と置き換え、振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を約８０％のコンフルエンスに成長させ、その時間の後、培地を置き換え（２５％の最終容量に）、アデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を一晩静置し、その後、容量を１００％に増大し、さらに７２時間の振盪を開始する。
アデノウイルスベクターが複製に欠陥がある、または少なくとも条件的に欠陥があるという必要条件以外は、アデノウイルスベクターの性質は、本明細書に記載される方法および組成物の実施の成功のために重大であるとは考えられていない。アデノウイルスは、４２種の種々の既知血清型または亜群Ａ〜Ｆのいずれかのものであり得る。本明細書に記載される方法および組成物において使用するためのコンディショナル複製欠陥アデノウイルスベクターを得るために、亜群Ｃのアデノウイルス５型が出発材料として使用され得る。これは、アデノウイルス５型が、多量の生化学的および遺伝情報が知られているヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物のために歴史的に使用されてきたためである。
上記で示されたように、本明細書に記載される方法および組成物に従う通常のベクターは、複製に欠陥があり、アデノウイルスＥ１領域を有さない。したがって、Ｅ１をコードする配列が除去された位置に形質転換構築物を導入するために最も好都合である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本明細書に記載される方法および組成物にとって重大ではない。対象とする遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６年）によって記載されるようなＥ３置換えベクター中の欠失されたＥ３領域の代わりに、またはＥ４領域中に挿入され得、ここでヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスがＥ４欠陥を補完する。
アデノウイルス成長および操作は、当業者に公知であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで広い宿主域を示す。この群のウイルスは、高力価、例えば、１ｍｌあたり１０．ｓｕｐ．９〜１０．ｓｕｐ．１１プラーク形成単位で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソーマルであり、したがって、宿主細胞に対して低い遺伝毒性しか有さない。野生型アデノウイルスを用いるワクチン接種の研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３年；Ｔｏｐら、１９７１年）、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターとしてのその安全性および治療能力を実証する。
アデノウイルスベクターは、真核生物の遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１年；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２年）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２年；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９２年）において使用されてきた。最近、動物研究によって、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法のために使用され得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１年；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０年；Ｒｉｃｈら、１９９３年）。組換えアデノウイルスを種々の組織に投与する研究として、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１年；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３年）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３年）および脳への定位接種（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３年）が挙げられる。
ｂ．ＡＡＶ感染
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、高頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染し得、したがって、組織培養での哺乳動物細胞への遺伝子送達にとって有用なものにするので、本明細書に記載される方法および組成物において使用するための魅力的なベクター系である（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年）。ＡＡＶは、感染性のための広い宿主域を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４年；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８６年；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８年；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年）、これは、それが本明細書に記載される方法および組成物とともに使用するのに適当であることを意味する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、各々、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を実証する研究として、ＬａＦａｃｅら（１９８８年）；Ｚｈｏｕら（１９９３年）；Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３年）；およびＷａｌｓｈら（１９９４年）が挙げられる。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔら、１９９４年；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９年；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、１９９４年；Ｙｏｄｅｒら、１９９４年；Ｚｈｏｕら、１９９４年；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４年；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８５年；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年）およびヒト疾患に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９２年；Ｌｕｏら、１９９４年；Ｏｈｉら、１９９０年；Ｗａｌｓｈら、１９９４年；Ｗｅｉら、１９９４年）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ形質導入のために成功裏に使用されてきた。最近、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の治療のための第Ｉ相ヒト試験のために承認された。
ＡＡＶは、培養細胞における増殖性感染を起こすには別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）との同時感染を必要とする依存性パルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年）。ヘルパーウイルスとの同時感染がない場合には、野生型ＡＡＶゲノムは、ヒト第１９染色体にその末端を介して組み込まれ、そこでプロウイルスとして不顕性状態で存在する（Ｋｏｔｉｎら、１９９０年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１年）。しかし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質も発現されない限り、組込みについて第１９染色体に制限されない（ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ、１９９４年）。ＡＡＶプロウイルスを保持する細胞が、ヘルパーウイルスに重感染された場合に、ＡＡＶゲノムは、染色体から、または組換えプラスミドから「レスキュー」され、正常な増殖性感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９年；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年；Ｋｏｔｉｎら、１９９０年；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年）。
通常、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復がその両端に位置する対象とする遺伝子を含有するプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８年；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９年；各々参照により本明細書に組み込まれる）と、末端反復を含まない野生型ＡＡＶコード配列を含有する発現プラスミド、例えば、ｐＩＭ４５（ＭｃＣａｒｔｙら、１９９１年；参照により本明細書に組み込まれる）を同時トランスフェクトすることによって作製される。細胞はまた、アデノウイルスまたはＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保持するプラスミドを用いて感染されるまたはトランスフェクトされる。このような様式で作製ｒＡＡＶウイルスストックは、アデノウイルスで汚染されており、これは、ｒＡＡＶ粒子から物理的に分離されなければならない（例えば、塩化セシウム密度遠心分離によって）。あるいは、ＡＡＶコーディング領域を含有するアデノウイルスベクターまたはＡＡＶコーディング領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部またはすべてを含有する細胞株が使用され得る（Ｙａｎｇら、１９９４ａ；Ｃｌａｒｋら、１９９５年）。組み込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶ ＤＮＡを保持する細胞株も使用され得る（Ｆｌｏｔｔｅら、１９９５年）。
ｃ．レトロウイルス感染
レトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力を特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０年）。得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、３種の遺伝子、それぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードするｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に見られる配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列が、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、また、宿主細胞ゲノムにおける組込みに必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０年）。
レトロウイルスベクターを構築するために、複製に欠陥のあるウイルスを産生するために、対象とする遺伝子をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入される。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を有さないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３年）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と一緒に、この細胞株中に導入され（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列が、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物が、ウイルス粒子中にパッケージングされるのを可能にし、次いで、これは培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年；Ｔｅｍｉｎ、１９８６年；Ｍａｎｎら、１９８３年）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地が回収され、任意選択で、濃縮され、遺伝子導入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広く多様な細胞型に感染できる。しかし、組込みおよび安定発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５年）。
欠陥のあるレトロウイルスベクターの使用に関する懸念は、パッケージング細胞における野生型の複製能のあるウイルスの出現の可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流の組換えウイルス挿入部分に由来する無傷の配列が、宿主細胞ゲノム中に組み込まれる組換え事象に起因し得る。しかし、組換えの可能性が大幅に低下したはずである新規パッケージング細胞株が、現在利用可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８年；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０年）。
ｄ．その他のウイルスベクター
その他のウイルスベクターは、本明細書に記載される方法および組成物においてＥＬＡＢＥＬＡ構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年）およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用され得る。それらは、種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９年；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０年）。
欠陥のあるＢ型肝炎ウイルスの最近の認識を用いて、種々のウイルス配列の構造−機能関係についての新しい洞察が得られた。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、ウイルスは、そのゲノムの最大８０％を欠失してもヘルパー−依存性パッケージングおよび逆転写の能力を保持できることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０年）。これは、ゲノムの大きな部分が、外来遺伝物質で置き換えられ得ることを示唆した。Ｃｈａｎｇらは、最近、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を、ポリメラーゼ、表面および前表面コード配列の代わりにアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム中に導入した。鳥類肝細胞腫細胞株中に野生型ウイルスと同時トランスフェクトされた。一次子アヒル肝細胞に感染させるために高力価の組換えウイルスを含有する培養培地を使用した。トランスフェクション後少なくとも２４日間、安定なＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇら、１９９１年）。
さらなる実施形態では、送達されるべきＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、特異的結合リガンドを発現するよう操作されている感染性ウイルス内に収容される。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体と特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするよう設計された新規アプローチが、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学修飾に基づいて最近開発された。この修飾によって、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染が可能となり得る。
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するおよび特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用される、組換えレトロウイルスのターゲッティングの別のアプローチが設計された。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介してカップリングされた（Ｒｏｕｘら、１９８９年）。彼らは、主要組織適合複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのその表面抗原を有する種々のヒト細胞の、エコトロピックウイルスによる感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９年）。
４．リン酸カルシウム共沈またはＤＥＡＥ−デキストラン処理
その他の実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物は、リン酸カルシウム共沈を使用して細胞に導入される。マウス始原生殖細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いてトランスフェクトされ、優れた結果が得られた（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９７年）。ヒトＫＢ細胞は、この技術を使用して、アデノウイルス５ＤＮＡを用いてトランスフェクトされた（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３年）。また。この方法では、マウスＬ（Ａ９）、マウスＣ１２７、ＣＨＯ、ＣＶ−１、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＨｅＬａ細胞が、ネオマイシンマーカー遺伝子を用いてトランスフェクトされ（ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７年）、ラット肝細胞が、種々のマーカー遺伝子を用いてトランスフェクトされた（Ｒｉｐｐｅら、１９９０年）。
別の実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ発現構築物は、ＤＥＡＥ−デキストランと、続いてポリエチレングリコールを使用して細胞中に送達される。この方法で、リポータープラスミドがマウス骨髄腫および赤白血病細胞中に導入された（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）。
５．直接マイクロインジェクションまたは超音波処理負荷
さらなる実施形態は、直接マイクロインジェクションまたは超音波処理負荷によるＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物の導入を含む。直接マイクロインジェクションは、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物をゼノパス属卵母細胞に導入するために使用されており（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５年）、ＬＴＫ．ｓｕｐ．−線維芽細胞は、超音波処理負荷によってチミジンキナーゼ遺伝子を用いてトランスフェクトされている（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７年）。
６．リポソーム媒介性形質転換
さらなる実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物は、リポソーム中に封入され得る。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質相を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自発的に形成する。脂質成分は、閉鎖された構造の形成の前に自己再配列を起こし、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を封入する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１年）。また、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と複合体を形成したＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物も考慮される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリポソーム媒介性核酸送達および外来ＤＮＡの発現は、極めて成功してきた（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２年；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年；Ｎｉｃｏｌａｕら、１９８７年）。Ｗｏｎｇら．（１９８０年）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａおよび肝細胞腫細胞におけるリポソーム媒介性送達および外来ＤＮＡの発現の実現可能性を実証した。
特定の実施形態では、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成され得る。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソームに被包されたＤＮＡの細胞侵入を容易にするすることがわかっている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９年）。その他の実施形態では、リポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体形成されるか、それとともに使用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１年）。なおさらなる実施形態では、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体形成されるか、それとともに使用され得る。
７．アデノウイルス支援トランスフェクション
特定の実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物は、アデノウイルス支援トランスフェクションを使用して細胞中に導入される。アデノウイルス共役系を使用する細胞系において、トランスフェクション効率の増大が報告されており（ＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＶｏｓ、１９９４年；Ｃｏｔｔｅｎら、１９９２年；Ｃｕｒｉｅｌ、１９９４年）、本発明者らは、トランスフェクション効率を高めるために同一技術を使用することを考慮した。
８．受容体媒介性トランスフェクション
さらに、標的細胞にＥＬＡＢＥＬＡ核酸構築物を送達するために使用され得るＥＬＡＢＥＬＡ構築物として、受容体媒介性送達媒体がある。これらは、標的細胞において起こる受容体媒介性エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。種々の受容体の細胞型特異的分布を考慮して、この送達法は、ある程度の特異性を加える。別の哺乳動物細胞型との関連での特異的送達は、ＷｕおよびＷｕによって記載されている（１９９３年；参照により本明細書に組み込まれる）。
特定の核酸送達構築物は、細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤を含む。その他のものは、送達されるべきＤＮＡ構築物が機能し得る形で結合された細胞受容体特異的リガンドを含む。受容体媒介性遺伝子導入のためにいくつかのリガンドが使用されてきて（ＷｕおよびＷｕ、１９８７年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９０年；Ｆｅｒｋｏｌら、１９９３年；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４年；Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）、これらは、技術の操作性を確立する。
その他の実施形態では、ＤＮＡ送達媒体成分は、リポソームと組み合わせて特異的結合リガンドを含み得る。送達されるべき核酸は、リポソーム内に収容され、特異的結合リガンドは、リポソーム膜中に機能的に組み込まれる。したがって、リポソームは、標的細胞の受容体と特異的に結合し、細胞に内容物を送達する。このような系は、例えば、ＥＧＦ受容体の上方制御を示す細胞への核酸の受容体媒介性送達において、上皮成長因子（ＥＧＦ）が使用される系を使用して機能的であるとわかっている。
さらなる実施形態では、送達媒体のＤＮＡ送達媒体成分は、細胞特異的結合を指示する１種または複数の脂質または糖タンパク質を含み得るリポソーム自体であり得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７年）は、リポソーム中に組み込まれた、ラクトシル−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシドを使用し、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。本明細書に記載されるＥＬＡＢＥＬＡ核酸は、同様の方法で標的細胞中に特異的に送達され得ることが考慮される。
ＥＬＡＢＥＬＡの下方制御
本発明者らは、細胞を操作する方法であって、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを下方制御することを含む方法を記載する。
方法は、細胞をＥＬＡＢＥＬＡ活性の阻害剤に曝露することを含み得る。方法は、細胞を、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体またはその抗原結合断片に曝露することを含み得る。あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを細胞中に導入することによって下方制御され得る。
このような操作の結果として、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、操作を受けていない細胞と比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％またはそれ超下方制御され得る。
細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、操作を受けていない細胞と比較して、少なくとも１ｘ、少なくとも１．５ｘ、少なくとも２ｘ、少なくとも２．５ｘ、少なくとも３ｘ、少なくとも３．５ｘ、少なくとも４ｘ、少なくとも５ｘ、少なくとも１０ｘ、少なくとも２０ｘ、少なくとも３０ｘ、少なくとも４０ｘ、少なくとも５０ｘまたはそれ超下方制御され得る。
自己複製または多能性の維持
本発明者らは、幹細胞中のまたは幹細胞の自己複製または多能性または両方を維持または増強する方法を開示する。このような方法は、上記で示された方法によって幹細胞を操作することを含み得る。
したがって、本発明者らは、上方制御などの調節によって、幹細胞中のまたは幹細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを操作する方法を記載する。方法は、幹細胞をＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露することを含み得る。
あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、ＥＬＡＢＥＬＡ発現構築物（ＥＬＡＢＥＬＡ構築物としても知られる）を細胞中に導入することによって、幹細胞において上方制御され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ発現構築物またはＥＬＡＢＥＬＡ構築物は、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸またはＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列を含むベクター（発現ベクターなど）を含み得る。このような構築物を導入する方法は、直前の節に詳細に示されている。
多能性の維持
本明細書に記載される方法および組成物によって処理された細胞は、多能性を保持する。言い換えれば、このような細胞は、脊椎動物、哺乳動物、霊長類またはヒト幹細胞などの幹細胞の少なくとも１種の特徴を保持する。このような細胞は、１回または複数回の継代後に特徴を保持し得る。それらは、複数の継代後にもそうであり得る。
多能性または幹細胞の特徴は、形態学的特徴、免疫組織化学的特徴、分子生物学的特徴などを含み得る。特徴は、生物活性を含み得る。
幹細胞の特徴
多能性が保持される、本発明者らの方法によって処理された細胞は、以下の幹細胞特徴のいずれかを示し得る。
幹細胞は、Ｏｃｔ４／ＰＯＵ５Ｆ１、ＴＲＡ−１−１６０および／またはＳＳＥＡ−１の発現の増大を示し得る。Ｆｌｋ−１、Ｔｉｅ−２およびｃ−ｋｉｔのうちいずれか１種または複数の発現が低減され得る。自己複製している幹細胞は、自己複製していない幹細胞と比較して短縮化された細胞周期を示し得る。
幹細胞は、規定の形態学を示し得る。例えば、標準顕微鏡像の２次元において、ヒト胚性幹細胞は、像の面における高い核／細胞質比、顕著な核小体および細胞結合があまり識別可能でない緻密なコロニー形成を示す。
幹細胞はまた、以下にさらに詳細に記載されるような発現された細胞マーカーを特徴とし得る。
多能性マーカーの発現
保持される生物活性は、多能性マーカーの発現を含み得る。
段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚細胞型に特有である。ＳＳＥＡマーカーの抗体は、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｂｏｍａ Ｂａｎｋ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）から入手可能である。その他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１と称される抗体を使用して検出可能である（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７年、前掲中の、Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｎ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒｓ）。ヒト胚性幹細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陰性であり、ＳＳＥＡ−４陽性である。ｈＥＧ細胞は、通常、ＳＳＥＡ−１陽性である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｐＰＳ細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１発現の喪失およびＳＳＥＡ−１の発現の増大をもたらす。ｐＰＳ細胞はまた、アルカリホスファターゼ活性の存在を特徴とし得、これは、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定すること、次いで、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．）によって記載されるように、基質としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを用いて発色させることとによって検出され得る。
胚性幹細胞はまた、通常、テロメラーゼ陽性であり、ＯＣＴ−４／ＰＯＵ５Ｆ１陽性である。テロメラーゼ活性は、市販のキット（ＴＲＡＰｅｚｅ．ＲＴＭ．ＸＫ テロメラーゼ検出キットカタログｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．、Ｐｕｒｃｈａｓｅ Ｎ．Ｙ．；またはＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．テロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡ ｐｌｕｓ、カタログ２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）を使用し、ＴＲＡＰ活性アッセイを使用して決定され得る（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６：２０１１、１９９７年）。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで評価され得る。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ．ＴＭ．ｈＴＥＲＴ定量化キット（カタログ３，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が、研究目的のために市販されている。
ＦＯＸＤ３、ＰＯＤＸＬ、アルカリホスファターゼ、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ−４としても知られる）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＴＲＡ−１−６０などを含めたこれらの多能性マーカーのうちいずれか１種または複数が、本明細書に記載される方法および組成物によって産生された細胞によって保持され得る。
マーカーの検出は、当技術分野で公知の任意の手段によって、例えば、免疫学的に達成され得る。組織化学的染色、フローサイトメトリー（ＦＡＣ）、ウエスタンブロット、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが使用され得る。
細胞表面マーカーを検出するためにフロー免疫細胞化学が使用され得る。細胞内または細胞表面マーカーのために免疫組織化学（例えば、固定された細胞または組織切片の）が使用され得る。ウエスタンブロット解析は、細胞抽出物で実施され得る。細胞抽出物または培地中に分泌された生成物のために、酵素結合免疫測定法が使用され得る。
この目的のために、市販の供給源から入手可能なものとして多能性マーカーに対する抗体が使用され得る。
段階特異的胚性抗原１および４（ＳＳＥＡ−１およびＳＳＥＡ−４）および腫瘍拒絶抗原１−６０および１−８１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）を含めた幹細胞マーカーの同定のための抗体は、例えば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）から商業的に入手できる。モノクローナル抗体を使用するこれらの抗原の免疫学的検出は、多能性幹細胞を特性決定するために広く使用されている（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ Ｍ．Ｊ．ら（１９９８年）ＰＮＡＳ第９５巻：１３７２６〜１３７３１頁；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ Ｍ．ら（２０００年）ＰＮＡＳ第９７巻：１１３０７〜１１３１２頁；Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｊ．Ａ．ら（１９９８年）．Ｓｃｉｅｎｃｅ第２８２巻：１１４５〜１１４７頁；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ Ｂ．Ｅ．ら（２０００年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１８巻：３９９〜４０４頁；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ．Ｋ．ら（２００２年）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ第２０巻：３２９〜３３７頁；Ｐｅｒａ Ｍ．ら（２０００年）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ第１１３巻：５〜１０頁）。
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、または標準増幅法において配列特異的プライマーを使用するリバーストランスクリプターゼによって開始されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ｍＲＮＡレベルで検出され得る。本開示に列挙される特定のマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）などの公開データベースから得ることができる。さらなる詳細については、米国特許第５，８４３，７８０号を参照のこと。
本明細書に記載される方法および組成物によって処理された細胞の実質的にすべて、またはそれらの相当な部分は、マーカー（単数または複数）を発現し得る。例えば、マーカー（単数または複数）を発現する細胞のパーセンテージは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上または実質的に１００％であり得る。
細胞生存力
生物活性は、本明細書に記載される方法および組成物による処理後に、または処理後の増殖後に細胞生存力を含み得る。細胞生存力は、種々の方法で、例えば、トリパンブルー排除によってアッセイされ得る。
生体染色のプロトコールは、以下の通りである。適当な試験管中に、適した容量の細胞懸濁液（２０〜２００μＬ）を入れ、等容量の０．４％トリパンブルーを添加し、穏やかに混合し、室温で５分間静置する。血球算定器中に１０μｌの染色された細胞を入れ、生存（染色されていない）および死滅（染色された）細胞の数を計数する。各四分円中の染色されていない細胞の平均数を算出し、２×１０４を乗じて、細胞／ｍｌを見出す。生存細胞のパーセンテージは、死滅および生存細胞の数によって除した生存細胞の数である。
細胞の生存力は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上または実質的に１００％であり得る。
核型
多能性が増強または誘導される、本明細書に記載される方法および組成物によって処理された細胞は、増殖の間または増殖後に正常な核型を保持し得る。「正常な」核型は、栄養繁殖体が由来する親の幹細胞の核型と同一、同様または実質的に同様である核型またはそれとは変わるが、何らかの実質的な方法では変わらないものである。例えば、転位置、染色体の喪失、欠失などの任意の肉眼的異常はないはずである。
核型は、いくつかの方法によって、例えば、光学顕微鏡下で視覚的に評価され得る。核型は、ＭｃＷｈｉｒら（２００６年）、Ｈｅｗｉｔｔら（２００７年）ならびにＧａｌｌｉｍｏｒｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（１９７３年）に記載されるように調製され、分析され得る。細胞はまた、標準Ｇバンド技術（Ｏａｋｌａｎｄ Ｃａｌｉｆ．のＣｙｔｏｔｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂなどの、日常的な核型分析サービスを提供する多数の臨床診断実験室で利用可能）を使用して核型分析され、公開された幹細胞核型と比較され得る。
本明細書に記載される方法および組成物によって処理された細胞のすべてまたは相当な部分が、正常な核型を保持し得る。この割合は、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上または実質的に１００％であり得る。
多能性
本発明者らの方法によって処理された細胞は、３種の胚系列すべて、すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉に分化する能力を保持し得る。これらの系列の各々に分化するための幹細胞の誘導の方法は、当技術分野で公知であり、細胞の分化する能力をアッセイするために使用され得る。処理された細胞のすべてまたは相当な部分は、この能力を保持し得る。これは、処理された細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９７％以上、９９％以上または実質的に１００％であり得る。
同時培養およびフィーダー
本発明者らの方法は、同時培養の存在下または非存在下で幹細胞を培養することを含み得る。用語「同時培養」とは、一緒に成長された２種以上の異なる種類の細胞の混合物、例えば、間質フィーダー細胞を指す。２種以上の異なる種類の細胞は、粒子または細胞容器表面などの同一表面で、または異なる表面で成長され得る。異なる種類の細胞は、異なる粒子または容器表面で成長され得る。
フィーダー細胞とは、この用語が本明細書において使用されるように、異なる種類の細胞の培養のために使用されるか、またはその培養のために必要である細胞を意味し得る。幹細胞培養との関連で、フィーダー細胞は、生存、増殖およびＥＳ細胞多能性の維持を確保する機能を有する。ＥＳ細胞多能性は、フィーダー細胞を直接同時培養することによって達成され得る。あるいは、またはさらに、フィーダー細胞は、それをコンディショニングするための培地で培養され得る。コンディショニング培地は、幹細胞を培養するために使用され得る。
培養ディッシュなどの容器の内表面は、分裂しないよう処理されているマウス胚性皮膚細胞のフィーダー層を用いてコーティングされ得る。フィーダー細胞は、ＥＳ細胞成長に必要である栄養素を培養培地中に放出する。幹細胞は、このようなコーティングされた容器中で成長され得る。
フィーダー細胞は、それ自体、粒子上で成長され得る。それらは、幹細胞について記載されたものと同様の方法で粒子上に播種され得る。増殖される幹細胞は、このようなフィーダー粒子と一緒に成長され得るか、またはそれらから分離し得る。したがって、幹細胞は、このようなフィーダー細胞でコーティングされた粒子上の層上で成長され得る。他方、幹細胞は、別個の粒子上で成長され得る。これらの配置のいずれかの任意の組合せ、例えば、粒子上で成長されたフィーダー細胞を含む培養、フィーダー細胞および幹細胞を有する粒子ならびに幹細胞が成長している粒子も可能である。これらの組合せは、フィーダー層を有するか、有さない容器中で成長され得る。
フィーダー細胞が存在しないか、または必要とされない配置も可能である。例えば、細胞は、フィーダー細胞または幹細胞によってコンディショニングされた培地で成長され得る。
培地およびフィーダー細胞
多能性幹細胞を単離および増殖させるための培地は、得られる細胞が所望の特徴を有し、さらに増殖され得る限り、いくつかの異なる配合のうちいずれかを有し得る。
適した供給源は以下の通りである：ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ１１９６５−０９２番；ノックアウトダルベッコの改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ１０８２９−０１８番；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ１５０３９−０２７番；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｍ７５２２番；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ１３２５６−０２９番。例示的血清含有胚幹（ＥＳ）培地は、８０％ ＤＭＥＭ（通常、ＫＯ ＤＭＥＭ）、２０％ 熱不活化されていない規定のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて作製される。培地は、濾過され、４℃で２週間以内保存される。無血清胚幹（ＥＳ）培地は、８０％ ＫＯ ＤＭＥＭ、２０％ 血清代替品、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて作製される。有効な血清代替品として、Ｇｉｂｃｏ１０８２８−０２８番がある。培地は、濾過され、４℃で２週間以内保存される。使用の直前に、ヒトｂＦＧＦが４ｎｇ／ｍＬの最終濃度に添加される（Ｂｏｄｎａｒら、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ、国際特許公開ＷＯ９９／２０７４１）。
培地は、１０％血清代替培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および５ｎｇ／ｍｌ ＰＤＧＦ ＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を補充したノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含み得る。
フィーダー細胞（使用される場合には）は、９０％ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１９６５−０９２番）、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ３００７１−０３番）および２ｍＭグルタミンを含有するｍＥＦ培地で増殖され得る。ｍＥＦは、１日おきに、トリプシンを用いて細胞を１：２に分割し、細胞をサブコンフルエントで維持しながら、Ｔ１５０フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ４３０８２５番）中で増殖される。フィーダー細胞層を調製するために、細胞を、増殖を阻害するが、ヒト胚性幹細胞を支援する重要な因子の合成は可能にする用量（約４０００ラドγ照射）で照射する。６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ３０４番）を、ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンとともに３７℃で一晩インキュベートすることによってコーティングし、ウェルあたり３７５，０００個の照射されたｍＥＦを用いてプレーティングする。フィーダー細胞層は、通常、プレーティング後、５時間〜４日使用される。培地は、ｐＰＳ細胞を播種する直前に新鮮なヒト胚幹（ｈＥＳ）培地で置換される。
その他の幹細胞を培養するための条件は公知であり、細胞型によって適宜最適化できる。これまでの節において言及された特定の細胞型のための培地および培養技術は、引用された参考文献中に提供されている。
無血清培地
本明細書に記載される方法および組成物は、無血清培地での幹細胞などの細胞の培養を含み得る。
用語「無血清培地」は、血清タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清を含まない細胞培養培地を含み得る。無血清培地は、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，６３１，１５９号および同５，６６１，０３４号に記載されている。無血清培地は、例えば、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。
無血清培地は、タンパク質、加水分解物および未知組成の成分を欠き得る点で無タンパク質であり得る。無血清培地は、すべての成分が既知化学構造を有する化学的に規定された培地を含み得る。化学的に規定された無血清培地は、変動性を排除する完全に規定された系を提供し、改善された再現性およびより一貫した性能を可能にし、不定の物質による汚染の可能性を低減するので使用され得る。
無血清培地は、ノックアウトＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含み得る。
無血清培地は、例えば、５％、１０％、１５％などの濃度の血清代替培地などの１種または複数の成分を補充され得る。無血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ− Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）製の１０％血清代替培地を補充され得る。
分離されたまたは脱凝集された胚性幹細胞が培養される無血清培地は、１種または複数の増殖因子を含み得る。ＦＧＦ２、ＩＧＦ−２、Ｎｏｇｇｉｎ、アクチビンＡ、ＴＧＦβ１、ＨＲＧ１β、ＬＩＦ、Ｓ１Ｐ、ＰＤＧＦ、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、Ｗｎｔ３Ａなどを含めたいくつかの増殖因子は、当技術分野で公知である。増殖因子（単数または複数）は、１ｐｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌの間などの任意の適した濃度で使用され得る。
幹細胞
本明細書において使用されるように、用語「幹細胞」とは、分裂の際に２つの発達選択肢に直面する細胞を指す：娘細胞は、元の細胞と同一であり得る（自己複製）か、またはそれらは、より専門化した細胞型の前駆体であり得る（分化）。したがって、幹細胞は、一方または他方の経路に適応可能である（各細胞型の１種が形成され得るさらなる経路が存在する）。したがって、幹細胞は、高分化しておらず、その他の種類の細胞を産生できる細胞である。
本明細書において言及されるような幹細胞は、分化全能性の幹細胞、多能性幹細胞および多分化能幹細胞を含み得る。それらはまた、具体的には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を含む。
分化全能性幹細胞
用語「分化全能性の」細胞とは、成体において任意の細胞型になる潜在能力を有する細胞または胚外膜（例えば、胎盤）の任意の細胞を指す。したがって、唯一の分化全能性の細胞とは、受精卵およびその分割によって生じた最初の４つほどの細胞である。
多能性幹細胞
「多能性幹細胞」は、身体において任意の分化した細胞を作製する潜在能力を有する真の幹細胞である。しかし、それらは栄養膜に由来する胚外膜を作製することには寄与できない。いくつかの種類の多能性幹細胞が見出されている。
胚性幹細胞
胚幹（ＥＳ）細胞は、着床が起こるときの胚発達の段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から単離され得る。
胚性生殖細胞
胚性生殖（ＥＧ）細胞は、中絶胎児中の生殖腺の先駆体から単離され得る。
胚性癌腫細胞
胚性癌腫（ＥＣ）細胞は、奇形癌腫、胎児の生殖腺に生じることもある腫瘍から単離され得る。最初の２種とは異なり、それらは、普通、異数体である。これらの種類の多能性幹細胞の３種すべてが、胚または胎児組織からのみ単離され得、培養で成長され得る。これらの多能性細胞を分化から防ぐ方法は、当技術分野で公知である。
成体幹細胞
成体幹細胞は、神経細胞、皮膚および骨髄移植における有効成分である血液形成性幹細胞を含めた多様な種類を含む。これらの後者の幹細胞の種類はまた、臍帯由来幹細胞の主な特徴である。細胞型の正確な数は、選択された幹細胞の種類によって制限されるが、成体幹細胞は、実験室および身体の両方で、機能的な、より専門化した細胞型に成熟し得る。
多分化能幹細胞
多分化能幹細胞は、真の幹細胞であるが、制限された数の種類にのみ分化できる。例えば、骨髄は、血液のすべての細胞を生じさせるが、別の種類の細胞は生じさせない多分化能幹細胞を含有する。多分化能幹細胞は、成体動物において見出される。身体中のどの臓器（脳、肝臓）も、それらが死滅細胞または損傷を受けた細胞と置き換わることができる場合にはそれらを含有すると考えられる。
幹細胞を特性決定する方法は、当技術分野で公知であり、クローンアッセイ、フローサイトメトリー、長期間培養および分子生物学的技術、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングなどの標準アッセイ法の使用を含む。
形態学的相違に加えて、ヒトおよびマウス多能性幹細胞は、そのいくつかの細胞表面抗原（幹細胞マーカー）の発現が異なる。幹細胞のマーカーおよびその検出方法は、本明細書において別の場所に記載されている（「幹細胞特徴の維持」のもとで）。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤のスクリーニング
ＥＬＡＢＥＬＡモジュレーター、アゴニストおよびアンタゴニストの同定
抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤として使用するために、ＥＬＡＢＥＬＡを特異的に阻害するためにアンタゴニスト、特に、小分子が使用され得る。
本発明者らは、対象とする化合物をアッセイする方法であって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物がＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するかどうかを判定することを含む方法を開示する。
本発明者らは、対象とする化合物をアッセイする方法であって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物がＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの活性を調節するかどうかを判定することを含む方法をさらに開示する。
本発明者らは、対象とする化合物をアッセイする方法であって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、候補化合物が、細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性の上昇または低減を引き起こすかどうかを判定することを含む方法をさらに開示する。
次いで、そのように同定された対象とする化合物が、単離または化学的に合成され得る。
したがって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡアンタゴニストおよび小分子ＥＬＡＢＥＬＡ阻害剤ならびにこれらのスクリーニングのためのアッセイを開示する。ＥＬＡＢＥＬＡのアンタゴニストは、結合またはその他のＥＬＡＢＥＬＡ活性の下方制御などの調節を検出することによってスクリーニングされ得る。したがって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性を下方制御可能な化合物を提供する。このような化合物は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療または予防するために、本明細書に記載される方法および組成物において使用され得る。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然物混合物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価するために使用され得る。これらの基質およびリガンドは、天然基質およびリガンドであり得、または構造的もしくは機能的ミメティクスであり得る。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第１巻（２）：第５章（１９９１年）を参照のこと。さらに、特に、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態においてＥＬＡＢＥＬＡの発現に影響を及ぼす因子を同定するために、スクリーニングが実施され得る。
一般に、アゴニストおよびアンタゴニストのアッセイは、ＥＬＡＢＥＬＡの１種または複数の活性に対する候補分子の効果を判定することに頼る。アッセイは、候補分子の存在下、および任意選択で、候補分子の非存在下で、またはＥＬＡＢＥＬＡ活性を阻害もしくは活性化することがわかっている分子の存在下でＥＬＡＢＥＬＡ活性をアッセイすることを含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態において、ＥＬＡＢＥＬＡの発現は調節、例えば上方制御され得る。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡの発現および／もしくは活性を刺激するか、またはこのタンパク質の機能を阻害し得る化合物および薬物を見出すことが望まれ得る。一般に、アゴニストおよびアンタゴニストが、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の治療および予防目的のために使用され得る。
本発明者らは、「下方制御」によって、研究されている挙動に対する任意の負の効果を含む；これは全体的なものである場合も部分的なものである場合もある。したがって、結合が検出されている場合には、候補アンタゴニストは、２つの実体間の結合を低減、回復または消失可能である。候補分子によって達成される結合（または任意のその他の活性）の下方制御は、候補分子の非存在下での結合（またはどの活性にしても）と比較して、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％またはそれ超であり得る。したがって、アンタゴニストとして使用するのに適した候補分子は、結合またはその他の活性を１０％以上低減可能であるものである。
用語「化合物」とは、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質、非ペプチドまたは有機分子）などの化合物（天然に存在するまたは合成の）または細菌、植物、真菌もしくは動物（特に、哺乳動物）細胞または組織などの生体材料から作製された抽出物、またはさらに、無機要素もしくは分子さえも指す。化合物は、抗体であり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡの可能性あるアンタゴニストの例として、ＥＬＡＢＥＬＡの結合パートナー、例えば、結合パートナーの断片またはＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するが、反応を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性が妨げられる小分子などと密接に関連している、抗体、小分子、ヌクレオチドならびにプリンおよびプリン類似体を含むそれらの類似体、オリゴヌクレオチド、ステープルドペプチドまたはタンパク質が挙げられる。
スクリーニングキット
このようなスクリーニングが実施されるのに必要な材料は、スクリーニングキットにまとめられ得る。
このようなスクリーニングキットは、ＥＬＡＢＥＬＡの生成を低減または増強するＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは化合物のアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素などを同定するのに有用である。スクリーニングキットは、（ａ）ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、（ｂ）ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現する組換え細胞または（ｃ）ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに対する抗体を含み得る。スクリーニングキットは、ライブラリーを含み得る。スクリーニングキットは、本明細書中の別の場所に記載されるようなスクリーニングに必要な成分のうちいずれか１種または複数を含み得る。スクリーニングキットは、任意選択で、使用のための説明書を含み得る。
核酸レベルでＥＬＡＢＥＬＡ発現を検出可能であるスクリーニングキットもまた、提供され得る。このようなキットは、ＥＬＡＢＥＬＡの増幅のためのプライマーまたは増幅のためのプライマーの対を含み得る。プライマー（単数または複数）は、任意の適した配列、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ配列の一部から選択され得る。プライマー配列を同定する方法は、当技術分野で周知であり、当業者ならば、このようなプライマーを容易に設計できるであろう。キットは、本明細書に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡ発現のための核酸プローブを含み得る。キットはまた、任意選択で、使用のための説明書を含み得る。
合理的な設計
ＥＬＡＢＥＬＡと相互作用し得る可能性がある候補化合物の合理的な設計は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの分子形状の構造的研究に基づいたものであり得る。どの部位が特定のその他のタンパク質と相互作用するかを判定するための１つの手段は、物理的構造決定、例えば、Ｘ線結晶学または二次元ＮＭＲ技術である。これらは、どのアミノ酸残基が分子接触領域を形成するかについての指針を提供する。タンパク質構造決定の詳細な説明については、例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９７６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
ポリペプチド結合アッセイ
ＥＬＡＢＥＬＡ活性または発現のモジュレーターおよびアンタゴニストは、当技術分野で公知の任意の手段によって同定され得る。
その最も簡単な形態では、アッセイは、候補化合物を、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含有する溶液と混合して、混合物を形成するステップと、混合物中のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの活性を測定するステップと、混合物の活性を標準と比較するステップとを簡単に含み得る。
さらに、分子は、ＥＬＡＢＥＬＡと推定分子間の結合を検出するアッセイにおいてＥＬＡＢＥＬＡとのその結合によって同定され得る。
ある種類の、本明細書に記載されるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合する物質を同定するアッセイは、固相支持体上に固定されているＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、固定されていない候補物質と接触させて、対象とするＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドおよび候補物質が互いに結合するかどうか、および／またはどの程度結合するかを判定することを含む。あるいは、候補物質が、固定され、本明細書に示されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが固定されていなくてもよい。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドとの物質の結合は、一過性、可逆性または永久的なものであり得る。物質は、対照ポリペプチド（例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態に関与していないとわかっているポリペプチド）との結合のＫｄ値よりも低いＫｄ値を有するポリペプチドと結合し得る。物質のＫｄ値は、対照ポリペプチドとの結合のＫｄ値よりも２倍低いもの、例えば、対照ポリペプチドとの結合のものよりも１００倍低いＫｄ値または１０００倍低いＫｄであり得る。
例示的アッセイ法では、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、アガロースビーズなどのビーズ上に固定され得る。通常、これは、細菌、酵母またはより高度の真核細胞株においてＧＳＴ−融合タンパク質としてＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現させることおよびグルタチオン−アガロースビーズを使用して粗細胞抽出物からＧＳＴ−ＥＬＡＢＥＬＡ融合タンパク質を精製することによって達成され得る（ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年；Ｇｅｎｅ６７（１０）：３１〜４０頁）。対照として、ＧＳＴ−融合タンパク質ではない候補物質の、固定されたポリペプチドとの結合が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの非存在下で判定され得る。次いで、候補物質の、固定されたＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドとの結合が決定され得る。この種のアッセイは、ＧＳＴプルダウンアッセイとして当技術分野で公知である。やはり、候補物質が固定され、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが固定されていなくてもよい。
また、成分、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、ヒスチジンタグを付けた成分のうち１種を固定化するための種々のアフィニティー精製系ならびに抗体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを使用して、この種のアッセイを実施することが可能である。
ポリペプチドの候補物質との結合は、当技術分野で周知の種々の方法によって判定され得る。例えば、固定化されていない成分は、標識され得る（例えば、放射性標識、エピトープタグまたは酵素抗体コンジュゲートを用いて）。あるいは、結合は、免疫学的検出技術によって調べられ得る。例えば、反応混合物は、ウエスタンブロットされ、ブロットは、固定化されていない成分を検出する抗体を用いてプローブされ得る。ＥＬＩＳＡ技術も使用され得る。
候補物質は、通常、１〜１０００ｎｍｏｌ／ｍｌ、例えば、１〜１００ｎｍｏｌ／ｍｌの最終濃度に添加される。抗体の場合には、使用される最終濃度は、通常、１００〜５００μｇ／ｍｌ、例えば、２００〜３００μｇ／ｍｌである。
ＥＬＡＢＥＬＡのモジュレーターおよびアンタゴニストもまた、ＥＬＡＢＥＬＡと、このポリペプチドが結合する任意の分子間の結合の調節またはこのような結合または放出に対する結果として生じる任意の活性の調節を検出することによって同定され得る。
細胞ベースのアッセイ
細胞ベースのアッセイは、候補化合物の結合を簡単に調べることができ、ここで、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを有する細胞との接着が、候補化合物と直接的にまたは間接的に関連している標識によって、または標識された競合物との競合を含むアッセイにおいて検出される。
さらに、これらのアッセイは、ポリペプチドをその表面に有する細胞に適当な検出系を使用して、候補化合物が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドとの結合によって生じたシグナルをもたらすか否かを調べることができる。活性化の阻害剤は、一般に、既知アゴニストの存在下でアッセイされ、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化に対する効果が観察される。
化合物をスクリーニングする別の方法は、化合物のライブラリーを発現する組換えＤＮＡ分子を用いて安定に形質転換された真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。このような細胞は、生存形態または固定された形態のいずれかで、標準結合パートナーアッセイのために使用され得る。細胞反応を検出する高感度の方法を記載するＰａｒｃｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４６巻：２４３〜２４７頁；およびＯｗｉｃｋｉら（１９９０年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８７巻；４００７〜４０１１頁も参照のこと。
化合物のライブラリーを発現する細胞が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するとわかっている標識抗体、例えば、１２５Ｉ−抗体と結合組成物との結合親和性が測定されている候補化合物などの試験サンプルと接触されるか、それらとともにインキュベートされる競合アッセイは、特に有用である。次いで、結合の程度を評価するために、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの、結合しているおよび遊離の標識された結合パートナーが分離される。結合している試験サンプルの量は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドとの標識された抗体結合の量に反比例する。
結合の程度を評価するために遊離の結合パートナーから結合している結合パートナーを分離するために、多数の技術のいずれか１種が使用され得る。この分離ステップは、通常、フィルターとの接着と、それに続く洗浄、プラスチックとの接着と、それに続く洗浄または細胞膜の遠心分離などの手順を含み得る。
アッセイは、候補分子を、結腸、肺、唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含めた扁平細胞、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣細胞などの細胞に曝露することと、任意の適した手段によってＥＬＡＢＥＬＡの発現をアッセイすることとを含み得る。このようなアッセイにおいてＥＬＡＢＥＬＡの発現を下方制御する分子は、任意選択で、さらなる研究のために選択され得、ＥＬＡＢＥＬＡ発現を下方制御する薬物として使用され得る。このような薬物は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療または予防するために有用に使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質およびそのタンパク質に対する抗体をコードするｃＤＮＡもまた、細胞におけるＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡおよびタンパク質の産生に対する添加された化合物の効果を検出するためのアッセイを形成するために使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡは、当技術分野で公知の標準法によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用して、分泌されたＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの細胞会合型レベルを測定するために構築され得、これは、適宜操作された細胞または組織からのＥＬＡＢＥＬＡタンパク質の産生を阻害または増強し得る薬剤（それぞれ、アンタゴニストまたはアゴニストとも呼ばれる）を発見するために使用され得る。スクリーニングアッセイを実施するための標準法は、当技術分野で十分に理解されている。
活性アッセイ
モジュレーターまたはアンタゴニストを検出するためのアッセイは、通常、候補分子の存在下で、任意選択で、候補分子の非存在下での活性の調節の検出と一緒に、ＥＬＡＢＥＬＡの任意の活性の調節を検出することを含む。
ホスファターゼ活性などのＥＬＡＢＥＬＡの特定の生物活性を検出するアッセイが使用され得る。アッセイは、通常、ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸または細胞、オルガネラ、抽出物またはこのようなものを含むその他の材料の形態であるか否かに関わらずＥＬＡＢＥＬＡを有する候補分子（例えば、ライブラリーの形態の）を、候補モジュレーターと接触させることを含む。候補モジュレーターの存在が、何らかの効果を有するか否かを確立するために、ＥＬＡＢＥＬＡの関連活性（本明細書において別の場所に記載されるようなホスファターゼ活性など）が検出され得る。
ホスファターゼアッセイは、当技術分野で公知であり、Ｗｕら（２００４年）、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．第３６巻（８）：１５４２〜５３頁およびＡｌｏｎｓｏら（２００４年）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０；２７９（３４）：３５７６８〜７４頁に記載されている。このようなアッセイは、ＥＬＡＢＥＬＡの、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの、またはホスホ−チロシンおよびホスホ−トレオニン残基を含有するオリゴペプチドのような適した基質を脱リン酸化する能力をアッセイすることを含む。アッセイは、候補モジュレーターの存在下または非存在下で実施され得、適当な活性が、ＥＬＡＢＥＬＡ活性の調節を検出するために、ひいては、ＥＬＡＢＥＬＡの候補モジュレーターおよび／またはアンタゴニストを同定するために検出され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡと結合する、および／またはその転写もしくは発現に影響を及ぼす候補モジュレーターを検出するためのプロモーター結合アッセイも使用され得る。次いで、さらなる研究のために候補モジュレーターが選択され得るか、または使用するために単離され得る。このようなスクリーニング手順の詳細は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）に記載されている。
本明細書に記載されるスクリーニング法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のために設定され得るが、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用し得る。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイは、一般に、ＥＬＡＢＥＬＡを含む細胞を、候補分子に曝露することを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、ＥＬＡＢＥＬＡは、任意選択で、粗もしくは半精製細胞抽出物または精製タンパク質などのその他の成分の存在下で、候補分子に曝露される。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが実施される場合には、これらは、候補分子のアレイ（例えば、整列されたライブラリー）を使用し得る。ｉｎ ｖｉｖｏアッセイが使用され得る。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、異種などの細胞中に含まれ得る。このような細胞は、上記のようにＥＬＡＢＥＬＡを発現するよう操作されているトランスジェニック細胞であり得る。
抽出物が使用される場合には、細胞質抽出物または核抽出物を含み得、それを調製する方法は、当技術分野で周知である。
オルガネラなどのＥＬＡＢＥＬＡを含む細胞の任意の成分が使用され得ることは認められよう。一実施形態は、例えば、記載されたようなＥＬＡＢＥＬＡを含む細胞核を含む細胞質または核調製物を利用する。核調製物は、１つまたは複数の核を含み得、これは、例えば、界面活性剤処理によって透過処理または半透過処理され得る。
したがって、特定の実施形態では、アッセイ形式は、以下を含み得る：マルチウェルマイクロタイタープレートが、各ウェルに、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現する１種または複数の細胞を含むよう設定される；例えば、ライブラリーに由来する個々の候補分子または候補分子のプールが、個々のウェルに添加され、ＥＬＡＢＥＬＡ活性の調節が測定され得る。プールが使用される場合には、これらは、さらなるプールに細分され、同一方法で試験され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ活性、例えば、本明細書において別の場所に記載されるような、結合活性または転写同時活性化活性が、次いでアッセイされ得る。
あるいは、または上記のアッセイ方法に加えて、ＥＬＡＢＥＬＡのモジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために「差し引く」手順も使用され得る。このような「差し引く」手順の下では、モジュレーターとして機能可能な１種または複数の候補分子を含む複数の分子（例えば、細胞抽出物、核抽出物、分子のライブラリーなど）が提供され、複数の分子から１種または複数の成分が除去され、枯渇されまたは差し引かれる。「差し引かれた」抽出物などは、次いで、記載されたようなＥＬＡＢＥＬＡ（またはその成分）を含む細胞に対する曝露によって、活性についてアッセイされる。
したがって、例えば、以下のように、このようなモジュレーターを同定するために「免疫枯渇」アッセイが実施され得る。細胞質または核抽出物が、適した細胞から調製され得る。推定モジュレーターを回収するために、適当な抗体を用いる免疫枯渇の使用などによって、抽出物が枯渇されるか、または分画され得る。モジュレーターの抽出物が枯渇される場合には、ＥＬＡＢＥＬＡ機能または活性または発現に影響を及ぼす能力を失う。一連の差し引きおよび／または枯渇は、モジュレーターまたはアンタゴニストを同定するために必要であり得る。
また、上記の「枯渇」または「差し引き」アッセイは、さらなるスクリーニングのために推定調節因子を同定するための予備ステップとして使用され得ることは理解されよう。さらに、またはあるいは、「枯渇」または「差し引き」アッセイは、その他の手段（例えば、本明細書において別の場所に記載されるような「陽性」スクリーニング）によって推定モジュレーターとして同定された分子の調節活性を確認するために使用され得る。
アッセイに付され、対象であると見いだされる候補分子は、単離され、さらに研究され得る。対象とする分子を単離する方法は、ライブラリーの形態であるか、どれほど多数の候補分子が常に試験されているか、バッチ手順がたどられているかどうかなどに関わらず、使用される分子の種類に左右される。
候補分子は、ライブラリーの形態で提供され得る。一実施形態では、２種以上の候補分子が同時にスクリーニングされ得る。当技術分野で公知の手段によって、候補分子のライブラリー、例えば、小分子ライブラリー、ポリペプチドライブラリー、核酸ライブラリー、化合物のライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡなどのアンチセンス分子のライブラリー、抗体ライブラリーなどが作製され得る。このようなライブラリーは、ハイスループットスクリーニングに適している。ＥＬＡＢＥＬＡを含む種々の細胞が、ライブラリーの個々のメンバーに曝露され、ＥＬＡＢＥＬＡ活性に対する効果が調べられ得る。この目的のためにアレイ技術が使用され得る。細胞は、空間的に、例えば、マイクロタイタープレートのウェル中に分離され得る。
一実施形態では、小分子ライブラリーが使用される。本発明者らは、「小分子」によって、分子量が約５０ｋＤａ未満であり得る分子を指す。特定の実施形態では、小分子は、約３０ｋＤａ未満、例えば、約１５ｋＤａ未満または１０ｋＤａ未満などである分子量を有し得る。本明細書において「小分子ライブラリー」と呼ばれるこのような小分子のライブラリーは、ポリペプチド、小ペプチド、例えば、２０個のアミノ酸以下の、例えば、１５、１０または５個のアミノ酸のペプチド、単純化合物などを含有し得る。
あるいはまたはさらに、本明細書において別の場所でさらに詳細に記載されるコンビナトリアルライブラリーは、ＥＬＡＢＥＬＡのモジュレーターまたはアンタゴニストについてスクリーニングされ得る。ＥＬＡＢＥＬＡ活性についてのアッセイは、上記で記載されている。
ライブラリー
ポリペプチドまたは核酸のライブラリーなどの候補分子のライブラリーは、本明細書において記載されるＥＬＡＢＥＬＡアンタゴニストおよび阻害剤のスクリーニングにおいて使用され得る。このようなライブラリーは、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質に曝露され、あるとすれば、タンパク質の活性に対するその効果が判定される。
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは、ファージディスプレイ技術によって代表されるように当技術分野で公知である。多様なペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面にディスプレイされるこのような系（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０年前掲）は、標的抗原と結合する特異的抗体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択および増幅のための抗体断片（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するために有用であると証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔にそれらを向けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、結果として、得られた抗体断片は、通常、バクテリオファージコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合物として、バクテリオファージの表面上にディスプレイされる。あるいは、抗体断片は、λファージキャプシド（ファージ本体）上に外側にディスプレイされる。ファージベースのディスプレイ系の利点は、それらが生物学的系であるので、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを細菌細胞中で成長させることによって選択されたライブラリーメンバーが簡単に増幅され得るということである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージまたはファージミドベクター上に含有されるので、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作が比較的簡単である。
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーを構築するための方法は、当技術分野で周知である（参照により本明細書に組み込まれる、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）前掲；Ｋａｎｇら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻：４３６３頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻：６２４頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３０巻：１０８３２頁；Ｂｕｒｔｏｎら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻：１０１３４頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１９巻：４１３３頁；Ｃｈａｎｇら（１９９１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻：３６１０頁；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら（１９９１年）Ｇｅｎｅ、第１０４巻：１４７頁；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）前掲；Ｂａｒｂａｓら（１９９２年）前掲；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２２巻：８６７頁；Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６７巻：１６００７頁；Ｌｅｒｎｅｒら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１３１３頁）。このような技術は、ポリペプチドライブラリーの全般的に発現のために必要に応じて修飾され得る。
１つのアプローチは、ｓｃＦｖファージ−ライブラリーの使用であった（Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４２巻：４２３〜６頁、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻：５８７９〜５８８３頁；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻：１０６６〜１０７０頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）前掲；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）前掲；Ｍａｒｋｓら（１９９１年）前掲；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら（１９９２年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、第１０巻：８０頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）前掲）。バクテリオファージコートタンパク質上にディスプレイされたｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態が記載されている。ファージディスプレイアプローチの精緻化も、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌら）およびＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、前掲）に記載されるように知られている。
代替ライブラリー選択技術は、バクテリオファージλ発現系を含み、これは、バクテリオファージプラークとして、または溶原菌のコロニーとして、これまでに記載された両方として直接スクリーニングされ得（Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻：１２７５頁；ＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻；Ｍｕｌｌｉｎａｘら（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８７巻：８０９５頁；Ｐｅｒｓｓｏｎら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８８巻：２４３２頁）、本明細書に記載される方法および組成物において使用される。これらの発現系が、ほぼ約１０６またはそれ以上の程度の多数の異なるライブラリーのメンバーをスクリーニングするために使用され得る。その他のスクリーニング系は、例えば、ライブラリーメンバーの直接化学合成に頼る。１つの初期方法は、ＷＯ８４／０３５６４に記載されるような、一連のピンまたはロッド上でのペプチドの合成を含む。各ビーズが個々のライブラリーメンバーであるペプチドライブラリーを形成する、ビーズ上でのペプチド合成を含む同様の方法が、米国特許第４，６３１，２１１号に記載されており、関連方法が、ＷＯ９２／０００９１に記載されている。ビーズベースの方法の大幅な改善は、各ライブラリーメンバーのアミノ酸配列の同定を容易にするために、オリゴヌクレオチドなどの独特の識別子タグを用いて各ビーズにタグを付けることを含む。これらの改善されたビーズベースの方法は、ＷＯ９３／０６１２１に記載されている。
別の化学合成法は、各別個のライブラリーメンバー（例えば、独特のペプチド配列）を、アレイ中の別個の所定の位置に置く方法での、表面上でのペプチド（またはペプチドミメティックス）のアレイの合成を含む。各ライブラリーメンバーの同一性は、アレイ中のその空間位置によって判定される。所定の分子（例えば、受容体）と反応性ライブラリーメンバーの間の結合相互作用が起こるアレイ中の位置が決定され、それによって、空間位置に基づいて反応性ライブラリーメンバーの配列が同定される。これらの方法は、米国特許第５，１４３，８５４号；ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２；Ｆｏｄｏｒら（１９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５１巻：７６７頁；ＤｏｗｅｒおよびＦｏｄｏｒ（１９９１年）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、第２６巻：２７１頁に記載されている。
ポリペプチドまたはヌクレオチドのライブラリーを作製するためのその他の系は、ライブラリーメンバーのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための無細胞酵素機序の使用を含む。一方法では、ＲＮＡ分子は、標的リガンドに対する選択の代替ラウンドおよびＰＣＲ増幅によって選択される（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻：５０５頁；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、第３４６巻：８１８頁）。同様の技術が、所定のヒト転写因子と結合するＤＮＡ配列を同定するために使用され得る（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ（１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１８巻：３２０３頁；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５７巻：６３５頁；ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３）。同様の方法において、大きなライブラリーを作製するための方法として、ポリペプチドを合成するためにｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳が使用され得る。一般に、安定化されたポリソーム複合体を含むこれらの方法は、ＷＯ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８およびＷＯ９２／０２５３６にさらに記載されている。ＷＯ９５／２２６２５およびＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）に開示されるものなどのファージベースではない代替ディスプレイ系は、選択のためにポリペプチドをディスプレイするためにポリソームを使用する。これらおよび前記の文書のすべても、参照により本明細書に組み込まれる。
コンビナトリアルライブラリー
ライブラリー、特に、候補分子のライブラリーは、適宜、コンビナトリアルライブラリー（コンビナトリアル化学ライブラリーとしても知られる）の形態であり得る。
「コンビナトリアルライブラリー」は、この用語が本明細書において使用されるように、無作為に選択されたサブユニットからなる複数の種の化合物の収集物である。コンビナトリアルライブラリーは、ＥＬＡＢＥＬＡを阻害可能である分子についてスクリーニングされ得る。
中でも、タンパク質分解酵素および非タンパク質分解酵素に対して活性のライブラリー、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の、アゴニストおよびアンタゴニストのライブラリー、非ＧＰＣＲ標的（例えば、インテグリン、イオンチャンネル、ドメイン相互作用、核受容体および転写因子）に対して活性のライブラリーおよび全細胞腫瘍学および抗感染標的のライブラリーを含めた、化合物の種々のコンビナトリアルライブラリーが現在利用可能である。コンビナトリアルライブラリー、特に、その構築および使用の包括的総説は、ＤｏｌｌｅおよびＮｅｌｓｏｎ（１９９９年）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１巻、第４号、２３５〜２８２頁に提供されている。コンビナトリアルペプチドライブラリープロトコールも参照される（Ｓｈｍｕｅｌ Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．編：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｃ１９９８．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ第８７巻）。特定のコンビナトリアルライブラリーおよびその構築のための方法は、米国特許第６，１６８，９１４号（Ｃａｍｐｂｅｌｌら）に、およびＢａｌｄｗｉｎら（１９９５年）、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｅｎｃｏｄｅｄ ｗｉｔｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔａｇｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１７巻：５５８８〜５５８９頁に、ならびにそれらの文書に記載された参考文献に開示されている。
一実施形態では、スクリーニングされるコンビナトリアルライブラリーは、細胞の成分と相互作用して、遺伝子発現に影響を及ぼす分子を潜在的に含むよう設計されているものである。例えば、クロマチン構造タンパク質に対するコンビナトリアルライブラリーがスクリーニングされ得る。この実施形態にとって有用であるその他のライブラリーとして、ヒストン修飾酵素（例えば、ヒストンアセチル化またはヒストンメチル化酵素）またはＤＮＡ修飾、例えば、ＤＮＡメチル化または脱メチル化に対するコンビナトリアルライブラリーが挙げられる。
化学コンビナトリアルライブラリー、その産生および使用を説明するさらなる参考文献として、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｐａｖｉａ、Ｓｐｈｉｎｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ（１９９５年７月に公開）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ−ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｉｔｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ ｐｌａｙｓ ｉｎ ｍａｎａｇｉｎｇ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（１９９５年７月に公開）；Ｓｏｌｉｄ Ｓｕｐｏｒｔ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｌｅａｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ＳＡＲ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ、Ａｄｎａｎ Ｍ．Ｍ．ＭｊａｌｌｉおよびＢａｒｒｙ Ｅ．Ｔｏｙｏｎａｇａ、Ｏｎｔｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９５年７月に公開）；Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｉｃ Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｆｒｏｍ ａ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｏｎ−Ｐｅｐｔｉｄｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ．Ｓａｒｖａｊｉｔ Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｙ、Ｂａｂｕ Ｊ． Ｍａｖｕｎｋｅｌ、Ｒｏｂｉｎ Ａｎｄｙ、Ｄｏｎａｌｄ Ｊ．Ｋｙｌｅ＊、Ｓｃｉｏｓ Ｎｏｖａ Ｉｎｃ．（１９９５年７月に公開）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｄｅｓｉｇｎ ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｋｅｉｔｈ Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｖｅ Ｂｒｉａｎｔ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．（１９９５年７月に公開）；Ａ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ−Ｃｒａｉｇ Ｊａｍｅｓ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｗｅｉｎｉｎｇｅｒ、Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（１９９５年７月に公開）；Ａｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｋｅｉｔｈ Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｗｈｉｔｅ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．（１９９５年７月に公開）；Ｎｏｖｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｒ．Ｓ．Ｐｅａｒｌｍａｎ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ（１９９６年６／７月に公開）；Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ａｆｆｏｒｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ａｎ Ｏｐｉｎｉｏｎ、Ｙｖｏｎｎｅ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ Ｍａｒｔｉｎ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９９６年６／７月に公開）；Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ： Ａ Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、Ａｒｎｏ Ｆ．Ｓｐａｔｏｌａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ（１９９６年６／７月に公開）；Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒ．Ｐａｖｉａ、Ｓｐｈｉｎｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ（１９９６年６／７月に公開）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｔｏ Ｔｈｅ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ． Ｓｏｆｉａ、Ｔｒａｎｓｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊｕｎｅ／Ｊｕｌｙ、１９９６）；Ｄａｔａ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｍａｒｙｊｏ Ｚａｂｏｒｏｗｓｋｉ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｈｅｉｌａ Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５年１１月に公開）；およびＴｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｆｈｐｕｔ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｎ Ｒ＆Ｄ ｉｎ Ｂｉｏ−Ｂａｓｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｐ． Ｄｅｖｌｉｎ（１９９６年３月に公開）を含め、ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ／Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｃｏｍｂｉｃｈｅｍ／から入手可能なものがある。
コンビナトリアル化学における技術は、新規医薬リードの作製のための現代の方法の中で幅広い支持を得ている（Ｇａｌｌｏｐ，Ｍ．Ａ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３７巻：１２３３〜１２５１頁；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３７巻：１３８５〜１４０１頁）。使用における１つのコンビナトリアルアプローチは、固相支持体の各粒子上に異なる構造を含有するライブラリーの合成、ライブラリーの可溶性受容体との相互作用、高分子標的と相互作用する「ビーズ」の同定および同定された「ビーズ」によって保持される構造の決定を含む戦略に基づいている（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ第３５４巻：８２〜８４頁）。このアプローチの代替法として、固相支持体からの既定のアリコートの化合物の逐次放出およびその後の溶液における活性の決定、活性化合物が放出された粒子の同定および直接配列決定によるその構造の解明がある（Ｓａｌｍｏｎ，Ｓ．Ｅ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９０巻：１１７０８〜１１７１２頁）、またはそのコードを読み取ることによる（Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９３年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ第１１５巻：２５２９〜２５３１頁；Ｎｉｋｏｌａｉｅｖ，Ｖ．ら、１９９３年、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．第６巻：１６１〜１７０頁；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９０巻：１０９２２〜１０９２６頁）。
可溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーは、Ｆｕｒｋａによって最初に記載されたペプチドの等モル混合物の作製のための簡単な原理（Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９８８年、Ｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ １９８８年；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９８８年、１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｒａｇｕｅ １９８８年；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、１９９１年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第３７巻：４８７〜４９３頁）を使用して合成され得る。反復性スクリーニングのための可溶性ライブラリーの構築も記載されている（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ第３５４巻：８４〜８６頁）。Ｋ．Ｓ．Ｌａｍは、不溶性ランダムコンビナトリアルライブラリーを使用するという新規の予想外に強力な技術を開示した。Ｌａｍは、各支持体が均一分子構造の試験化合物を有するよう、固相支持体上でランダムコンビナトリアルライブラリーを合成し、固相結合プロトコールによって支持体から試験化合物を事前に除去せずにライブラリーをスクリーニングした（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ第３５４巻：８２〜８４頁）。
したがって、候補分子のライブラリーは、合成コンビナトリアルライブラリー（例えば、コンビナトリアル化学ライブラリー）、細胞抽出物、体液（例えば、尿、血液、涙、汗または唾液）または合成もしくは天然物のその他の混合物（例えば、小分子または発酵混合物のライブラリー）であり得る。
分子のライブラリーは、例えば、アミノ酸、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドもしくはタンパク質の断片；核酸（例えば、アンチセンス；ＤＮＡ；ＲＮＡ；またはペプチド核酸、ＰＮＡ）；アプタマー；または炭水化物もしくは多糖を含み得る。ライブラリーの各メンバーは、唯一のものである場合も、混合物の一部である場合もある（例えば、圧縮ライブラリー）。ライブラリーは、精製化合物を含有し得るか、または「汚れている」場合もある（すなわち、相当な量の不純物を含有する）。
市販のライブラリー（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＡｒＱｕｌｅ、Ｎｅｏｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｒｃｏ、Ｃｉｄｄｃｏ、Ｏｘｆｏｒｄ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐａｎｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、ＳｉｇｍａまたはＴｒｉｐｏｓｅ製）も本明細書に記載される方法とともに使用され得る。
上記のライブラリーに加えて、新規方法の特異性、信頼性または再現性を評価するために、多様性ファイルと呼ばれる特定のライブラリーが使用され得る。多様性ファイルは、アッセイにおいて非特異的検出をもたらす可能性が高い多数のクラスの化合物を代表する多数の化合物（例えば、１０００種以上の小分子）を含有する。多様性ファイルは、市販されているか、または、上記のベンダーから市販されている個々の化合物から組み立てられてもよい。
抗体
このタンパク質の活性を調節するために（例えば、本明細書において記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡ関連状態などの疾患を治療または予防する方法のために）使用され得るＥＬＡＢＥＬＡのアンタゴニストまたはモジュレーターを含めた抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤は、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質に対する抗体を含み得る。
したがって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、その断片、相同体、変異体または誘導体と結合する抗体を提供する。このような抗体は、ＥＬＡＢＥＬＡ発現の検出において、特に、ＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患または状態の診断において有用であり得る。その他の抗体として、治療活性を有するもの、すなわち、任意のＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患または状態を治療、管理または予防するために治療方法で使用されるものが挙げられる。
ＥＬＡＢＥＬＡに対する抗体は、本明細書に開示されるＥＬＡＢＥＬＡ配列から、当技術分野で公知の任意の手段によって作製され得る。
例えば、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、本明細書に開示されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは配列表に記載されるＥＬＡＢＥＬＡ配列のいずれかなどの本明細書に開示されるようなＥＬＡＢＥＬＡ核酸によってコードされるポリペプチドに対して作製され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡに対する抗体は、ヒトＥＬＡＢＥＬＡのアミノ酸残基（４４〜５４）に対応するペプチドＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を用いて免疫処理することによって、実施例に記載されるように作製され得る。
配列ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧ（配列番号１９）またはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチドまたは配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドに対する抗体も、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体として作製され得る。
さらに、ＥＬＡＢＥＬＡに対して特異的である抗体は、任意の適したエピトープ、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質に由来するエピトープに対して作製され得る。ＥＬＡＢＥＬＡの適した断片の配列は、ＥＬＡＢＥＬＡの残基ＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５８）、ＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５９）またはＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含み得、この配列から得られた任意のエピトープが、特異的ＥＬＡＢＥＬＡ抗体の作製のために使用され得る。
したがって、本発明者らは、
（ａ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、
（ｂ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、
（ｃ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチド、
（ｄ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むポリペプチド
のうち１種または複数と特異的に結合可能である単離された抗体またはその抗原−結合断片を開示する。
単離された抗体またはその抗原−結合断片は、放射標識、例えば、１２５Ｉなどの標識をさらに含み得る。
本明細書の目的上、用語「抗体」とは、完全抗体または選択された標的と結合可能な抗体断片を指す。反対に明記されない限り、この用語は、それだけには限らないが、ポリクローナル、モノクローナル、天然またはキメラ、ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体を含めた操作された抗体およびファージディスプレイまたは代替技術を使用して産生された人工的に選択された抗体を含む。この用語はまた、一本鎖、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生された断片を含む。このような断片は、標的物質に対するその結合活性を保持する全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質および抗体の抗原−結合部位を含むその他の合成タンパク質を含む。ＦｖおよびＳｃＦｖなどの小断片は、その小さいサイズおよび結果として優れた組織分布のために診断および治療適用のための特性を有する。
抗体およびその断片は、例えば、ＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されるようなヒト化抗体であり得る。さらに、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号および同６，０７５，１８１号に記載されるような、完全ヒト可変領域（またはその断片）を有する抗体も使用され得る。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、中和抗体を含み得る。中性抗体、すなわち、ＥＬＡＢＥＬＡの任意の生物活性を阻害するものが、診断学および治療学のために使用され得る。
本明細書に記載される抗体は、標識などのエフェクタータンパク質を含む変更された抗体であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗体の分布のイメージングを可能にする標識が使用され得る。このような標識は、胚または細胞塊内で容易に可視化できる、放射性標識または金属粒子などの放射線不透過性（ｒａｄｉｏｏｐａｑｕｅ）標識であり得る。さらに、それらは、蛍光標識または組織サンプルで可視化できるその他の常識であり得る。
抗体は、標準技術によって、例えば、免疫処理によって、またはファージディスプレイライブラリーを使用することによって産生され得る。このような抗体は、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質または相同体、断片などと特異的に結合可能であり得る。
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体が望ましい場合には、選択された哺乳動物または脊椎動物種（例えば、ニワトリ、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダなど）が、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物を用いて免疫処理され得る。宿主種に応じて、免疫学的反応を増大するよう種々のアジュバントが使用され得る。このようなアジュバントとして、それだけには限らないが、フロイントのもの、水酸化アルミニウムなどの無機ゲルおよびリゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられる。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）は、使用され得る潜在的に有用なヒトアジュバントであり、精製されると、物質アミノ酸配列が、免疫学的に易感染性の個体に全身防御を刺激する目的で投与される。
既知手順に従って、免疫処置された動物から得た血清が集められ、処理される。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドから得ることができるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が、その他の抗原に対する抗体を含有する場合には、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を産生し、処理するための技術は、当技術分野で公知である。そのような抗体が作製され得るために、本発明者らは、動物またはヒトにおいて免疫源として使用するために、別のアミノ酸配列にハプテン化されたＥＬＡＢＥＬＡアミノ酸配列またはその断片も提供する。
モノクローナル抗体
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに対するモノクローナル抗体も、当業者によって容易に産生され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論は周知である。不死抗体産生性細胞株は、細胞融合によって、また発癌性ＤＮＡを用いるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン−バーウイルスを用いるトランスフェクションなどのその他の技術によって作製され得る。周辺エピトープに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性について、すなわち、アイソタイプおよびエピトープ親和性についてスクリーニングされ得る。
モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株によって抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製され得る。これらとして、それだけには限らないが、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻：４９５〜４９７頁）によって元々記載されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ第４巻：７２頁；Ｃｏｔｅら（１９８３年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ第８０巻：２０２６〜２０３０頁）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｍａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６頁、Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）が挙げられる。
組換えＤＮＡ技術は、本明細書に記載されるような抗体を改善するために使用され得る。したがって、診断または治療適用においてその免疫原性を低減するために、キメラ抗体が構築され得る。このような技術は、適当な抗原特異性および生物活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを含む（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ第８１巻：６８５１〜６８５５頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８４年）Ｎａｔｕｒｅ第３１２巻：６０４〜６０８頁；Ｔａｋｅｄａら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ第３１４巻：４５２〜４５４頁）。さらに、免疫原性は、ＣＤＲグラフトによって抗体をヒト化することによって最小化され得る［欧州特許出願０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ）］および任意選択で、フレームワーク修飾［ＥＰ０２３９４００を参照のこと］。
あるいは、物質特異的一本鎖抗体を産生するために、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７９号）が適応され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはペプチドから得ることができるエピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナル両方の抗体は、診断において特に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を作製するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、それに対する保護が望まれる物質および／または薬剤の「内部イメージ」を保持する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を作製するための技術は、当技術分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、療法において有用であり得る。
抗体はまた、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ第８６巻：３８３３〜３８３７頁）およびＷｉｎｔｅｒ ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（１９９１年；Ｎａｔｕｒｅ第３４９巻：２９３〜２９９頁）に開示されるように、リンパ球集団におけるｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘導することによって、または組換え免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生され得る。
ポリペプチドまたはペプチドに対する特異的結合部位を含有する抗体断片も作製され得る。例えば、このような断片として、それだけには限らないが、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド橋を還元することによって作製され得るＦａｂ断片が挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速な、容易な同定を可能にするよう構築され得る（Ｈｕｓｅ ＷＤら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５６巻：１２７５〜１２８１頁）。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するために、一本鎖抗体を産生するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が適応され得る。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳動物を含めたその他の生物が使用され得る。
ポリペプチドを発現するクローンを単離または同定するために、またはアフィニティークロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するために、上記の抗体が使用され得る。
抗体産生の組換え技術
細菌または哺乳動物細胞培養において、確立された手順にしたがって抗体を産生するために、組換えＤＮＡ技術が使用され得る。選択された細胞培養系は、抗体産物を分泌し得る。
したがって、本発明者らは、宿主、例えば、前記抗体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ配列に適切なリーディングフレームで連結された、シグナルペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列に作動可能に連結しているプロモーターを含む発現カセットを含むハイブリッドベクターを用いて形質転換されている、大腸菌または哺乳動物細胞を培養することと、前記タンパク質を単離することとを含む、抗体を産生するためのプロセスを開示する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、任意選択で、哺乳動物血清、例えば、ウシ胎仔血清または微量元素および成長持続性栄養補助剤、例えば、正常マウス腹膜浸出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージなどのフィーダー細胞、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低比重リポタンパク質、オレイン酸などによって補充された、通常の標準培養培地、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地である適した培養培地で実施される。細菌細胞または酵母細胞である宿主細胞の増殖は、当技術分野で公知の適した培養培地、例えば、細菌については、培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ培養液、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴまたはＭ９最小培地で、酵母については、培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地または完全最小ドロップアウト培地で同様に実施される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ産生は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、多量の所望の抗体をもたらすためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母または哺乳動物細胞培養のための技術は、当技術分野で公知であり、例えば、エアリフト反応器における、または連続撹拌反応器における均一懸濁培養または例えば、中空繊維、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズもしくはセラミックカートリッジ上での固定化されたもしくは捕捉された細胞培養を含む。
ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞を増殖させることによって、多量の所望の抗体を得ることができる。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物中に注射して、抗体産生性腫瘍の成長を引き起こす。任意選択で、注射に先立って、炭化水素、特に、プリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱物油を用いて動物をプライムする。１〜３週間後、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。例えば、適した骨髄腫細胞の、Ｂａｌｂ／ｃマウスから得られた抗体産生性脾臓細胞または所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクトされた細胞との融合によって得られたハイブリドーマ細胞を、任意選択でプリスタンを用いて前処理されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹膜内に注射し、１〜２週間後に、動物から腹水を採取する。
前記のおよびその他の技術が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻：４９５〜４９７頁；ＵＳ４，３７６，１１０；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８８年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒにおいて論じられている。組換え抗体分子を調製するための技術は、上記の参考文献に、また、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ０６２３６７９；ＥＰ０３６８６８４およびＥＰ０４３６５９７に記載されている。
細胞培養上清は、ＰＧＣまたはその他の多能性細胞、例えば、ＥＳまたはＥＧ細胞の免疫蛍光染色によって、免疫ブロット法によって、酵素イムノアッセイ、例えば、サンドイッチアッセイまたはドットアッセイまたはラジオイムノアッセイなどによって、所望の抗体についてスクリーニングされる。
抗体の単離のために、培養上清中の、または腹水中の免疫グロブリンが、例えば、硫酸アンモニウムとともの沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜を通る濾過などによって濃縮され得る。必要に応じておよび／または望ましい場合には、抗体が、通常のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーおよび／または（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィー、例えば、抗原もしくはその断片を用いる、またはプロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も提供される。ハイブリドーマ細胞は、遺伝的に安定であり、所望の特異性のモノクローナル抗体を分泌し得、急速冷凍培養物から解凍し、再クローニングすることによって活性化され得る。
また、適した哺乳動物、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスが、１種または複数のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその抗原性断片を用いて免疫処置され、免疫処置された哺乳動物の抗体産生性細胞が、適した骨髄腫細胞株の細胞と融合され、融合において得られたハイブリッド細胞がクローニングされ、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択されることを特徴とする、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに対して向けられたモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製するためのプロセスも含まれる。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡを用いて免疫処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合し、得られたハイブリッド細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングし、陽性ハイブリドーマ細胞をクローニングする。
本発明者らは、Ｂａｌｂ／ｃマウスが、ＥＬＡＢＥＬＡを発現する１０〜１０７および１０８個の間の細胞および適したアジュバントを皮下におよび／または腹膜内に、数カ月、例えば、２〜４か月にわたって、数回、例えば、４〜６回注射することによって免疫処置され、最後の注射の２〜４日後に、免疫処置されたマウスから脾臓細胞が採取され、ポリエチレングリコールなどの融合プロモーターの存在下で骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合されることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株を調製するためのプロセスを記載する。骨髄腫細胞は、分子量約４０００の約３０％〜約５０％ポリエチレングリコールを含有する溶液中で、免疫処置されたマウスから得られた３〜２０倍過剰の脾臓細胞と融合され得る。融合後、細胞は、正常な骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞を上回って増殖することを防ぐために一定の間隔で選択培地、例えば、ＨＡＴ培地が補充された、以上に記載したような適した培養培地で増殖される。
以上に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡに対して向けられる抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入部分を含む組換えＤＮＡも開示される。定義によって、このようなＤＮＡは、コーディング一本鎖ＤＮＡ、前記コーディングＤＮＡと、その相補ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡまたはこれらの相補（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。
さらに、ＥＬＡＢＥＬＡに対して向けられる抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正のＤＮＡ配列またはその突然変異体を有する酵素的にまたは化学的に合成されたＤＮＡであり得る。真正ＤＮＡの突然変異体は、１個もしくは複数のアミノ酸が欠失しているか、または１個もしくは複数のその他のアミノ酸と交換されている上記の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。修飾（単数または複数）は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側であり得る。このような突然変異体ＤＮＡはまた、１個または複数のヌクレオチドが、同一アミノ酸（単数または複数）をコードする新規コドンを有するその他のヌクレオチドによって置き換えられているサイレント突然変異体であるよう意図される。このような突然変異体配列はまた、縮重配列である。縮重配列は、元々コードされていたアミノ酸配列の変更をもたらさずに、無制限の数のヌクレオチドがその他のヌクレオチドによって置換されているという遺伝暗号の意味内で縮重している。このような縮重配列は、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適発現を得るために、その異なる制限部位および／または特定の宿主、特に、大腸菌によって好まれる特定のコドンの頻度のために有用であり得る。
突然変異体という用語は、当技術分野で公知の方法に従う真正のＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発によって得られたＤＮＡ突然変異体を含むものとする。
完全四量体免疫グロブリン分子の組み立ておよびキメラ抗体の発現のために、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡ挿入部分が、重鎖および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡと融合され、次いで、例えば、ハイブリッドベクター中への組込み後に、適当な宿主細胞中に導入される。
また、ヒト定常ドメインｇ、例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４、例えば、γ１またはγ４に融合された、ＥＬＡＢＥＬＡに対して向けられた抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードする挿入部分を含む組換えＤＮＡも開示される。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ、例えば、κに融合された、ＥＬＡＢＥＬＡに対して向けられた抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードする挿入部分を含む組換えＤＮＡも開示される。
別の実施形態では、本発明者らは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、宿主細胞における抗体のプロセシングを容易にするシグナル配列を任意選択で含むスペーサー基によって連結している組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡならびに／または抗体および／もしくは切断部位および／もしくはペプチドスペーサーおよび／もしくはエフェクター分子の精製を容易にするペプチドをコードするＤＮＡを開示する。
エフェクター分子をコードするＤＮＡは、診断または治療適用において有用なエフェクター分子をコードするＤＮＡであるよう意図される。したがって、毒素または酵素、特に、プロドラッグの活性化を触媒可能な酵素であるエフェクター分子が特に示される。このようなエフェクター分子をコードするＤＮＡは、天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡまたはその突然変異体の配列を有し、当技術分野で周知の方法によって調製され得る。
抗体
本明細書において使用されるような、用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、文脈が許す場合には同義的に使用され得る。これらの用語は、ＥＬＡＢＥＬＡまたはそのエピトープ、例えば、２０９によって結合されるＥＬＡＢＥＬＡのエピトープと選択的に反応可能であるか、またはそれを認識可能である抗体分子のタンパク質分解によって切断されたまたは組換えによって調製された部分の断片を含む。
このようなタンパク質分解および／または組換え断片の制限されない例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片およびペプチドリンカーによって接合されたＶＬおよびＶＨドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。これらのＦｖは、共有結合によってまたは非共有結合によって連結されて、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成し得る。
「ＳｃＦｖ分子」によって、本発明者らは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、可動性オリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。その特定の結合部位を保持する抗体断片の合成に関与している技術の一般的な概説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ第３４９巻、２９３〜２９９頁に見出されるべきものである。
全抗体およびＦ（ａｂ’）２断片は、「二価」である。「二価」によって、本発明者らは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）断片が２つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ断片は、１つの抗原結合部位のみを有する一価である。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、１０−２ｓ−１〜１０−４ｓ−１の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する高親和性抗体を含み得る。解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、約２×１０−４ｓ−１であり得る。
用語「解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）」とは、本明細書において使用されるように、本明細書において開示される抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体などの抗体の解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ）を指す。これは、ＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して測定され得る。Ｆａｂ断片の抗原に対する親和性を反映するので、低い解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が望ましい。
用語「親和性」とは、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体などの抗体の解離速度（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）または解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ）の点で定義される。解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が低いほど、ＥＬＡＢＥＬＡなどの抗原に対して抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体などの抗体が有する親和性が高い。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、ペプチドそれ自体を含み得るか、または融合タンパク質の一部を形成し得る。
本明細書に記載される抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、細胞内ＥＬＡＢＥＬＡとの結合能力または場合によっては２０９によって結合される同一エピトープとの結合などのＥＬＡＢＥＬＡ結合活性を含む任意の抗体を含む。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体はまた、全抗体（ｅｎｔｉｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、マウス、ヒト化またはヒトにかかわらず、このような抗体誘導体および生物学的に活性な断片も含む。これらは、アミノ酸置換を有するか、または糖もしくはアミノ酸官能基と結合しているその他の部分などを有する、ＥＬＡＢＥＬＡ結合活性を有する抗体断片を含み得る。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、単離抗体または精製抗体を含み得る。天然であろうとなかとうと、任意の適した供給源から得られるか、または任意の適した供給源によって産生され得るか、または合成抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体、半合成抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体、誘導体化抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体もしくは組換え抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体であり得る。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体が非天然抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体である場合には、少なくとも、組換えＤＮＡ技術によって調製された部分、化学合成技術によって産生された抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体またはそれらの組合せを含み得る。
本明細書において使用されるような用語「誘導体」は、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体の化学修飾を含む。このような修飾の例示的なものは、例えば、水素のアルキル、アシルまたはアミノ基による置換えであろう。抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体の配列は、天然に存在する形態のものと同一であり得るか、またはその変異体、相同体、断片もしくは誘導体であり得る。
抗体可変領域
本明細書において使用されるように、用語「可変領域」とは、場合によっては、ＥＬＡＢＥＬＡ（または変異体、相同体、断片または誘導体）に対する抗体の、結合認識特異性および全体的な親和性の決定基を含有する軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域またはドメインを指す。
軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の各対の可変ドメインは、抗原認識に関与しており、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎖のドメインは、同一の一般的な構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を有し、その配列は、比較的保存されており、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続している。ＦＲ領域は、可変ドメインの構造的整合性を維持する。ＣＤＲは、抗原の結合を媒介する可変ドメイン内のポリペプチドセグメントである。
本明細書において使用されるように、用語「定常領域」とは、構造的安定性および抗体鎖会合、分泌、経胎盤性移動性および相補体結合などのその他の生物学的機能を提供するが、ＥＬＡＢＥＬＡエピトープとの結合には関与していない、抗体（または変異体、相同体、断片もしくは誘導体）の軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）のドメインを指す。定常領域の遺伝子中のアミノ酸配列および対応するエキソン配列は、由来する種に応じて変わる。しかし、アロタイプにつながるアミノ酸配列の変異は、種内で特定の定常領域に比較的制限されている。「アロタイプ」は、対立遺伝子を区別する抗原決定基（またはエピトープ）である。
各鎖の可変領域は、連結するポリペプチド配列によって定常領域と接合している。連結配列は、軽鎖遺伝子中の「Ｊ」配列ならびに重鎖遺伝子中の「Ｄ」配列および「Ｊ」配列の組合せによってコードされる。
抗体：可変領域配列
本明細書に記載される方法および組成物に従う抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、これらの可変領域配列から、当技術分野で公知の方法によって作製され得る。例えば、重鎖および軽鎖配列は、当業者に公知である組換え遺伝子工学技術によって選択された抗体の定常配列に組換えられ得る。
定常領域配列は、当技術分野で公知であり、ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７８１−Ｄ７８４およびＬｅＦｒａｎｃら（１９９５年）ＬＩＧＭ−ＤＢ／ＩＭＧＴ：Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｉｇ ａｎｄ ＴｃＲ、Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第７６４巻（１）、４７〜４７頁 ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１７４９−６６３２．１９９５．ｔｂ５５８０５．ｘに記載される）およびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢデータベース（Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、２００５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５年１月１日；３３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５６−６１に記載される）などのいくつかのデータベースから入手可能である。ＩＭＧＴ／ＬＩＧＭ−ＤＢおよびＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｇｔ／に位置するＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースの一部である。
可変領域を所与の配列および定常領域と組み合わせて、全抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、実施例１６に、およびＨａｎｓｏｎら、（２００６年）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第７巻：１２６頁に記載されている。Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片などの全抗体の断片または一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、当技術分野で公知の手段によって産生され得る。
本明細書において開示された配列および記載された方法を使用して、例えば、上記で示された配列を有する、抗体２０９の可変領域の重鎖および軽鎖が、マウスＩｇＧ定常領域配列と遺伝子導入で融合されて、マウスモノクローナル抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体が産生され得る。
使用
抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体は、（ａ）抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体を用意することと、（ｂ）抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で生体サンプルを前記抗体とともにインキュベートすることと、（ｃ）前記抗体を含む抗体−抗原複合体が形成されるか否かを判定することとを含む方法によって、生体サンプル中に存在するＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを検出する方法において使用され得る。
適したサンプルは、脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織などの組織からの、またはこれらの組織に由来する腫瘍性増殖からの抽出物を含む。特に、サンプルは、関連するＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患を患っていると疑われる個体から得られた、結腸、肺、唇、喉頭、外陰部、子宮頸部および陰茎を含めた扁平細胞、膵臓、脳、食道、胃、膀胱、腎臓、皮膚、卵巣、前立腺および精巣組織などの組織を含み得る。
抗体は、固相支持体と結合され得るおよび／または適した試薬、対照、使用説明書などとともに適した容器中でキットにまとめられ得る。
抗体送達
ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質に対する抗体は、当技術分野で公知の技術によって、例えば、リポソーム、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ＨＥＭＡ、線形ポリアミドアミンポリマーなど）などの使用によって、細胞中に送達され得る。免疫グロブリンおよび／または抗体はまた、細胞膜および／または核膜を通過可能なタンパク質とのタンパク質融合物またはコンジュゲートとして細胞中に送達され得る。例えば、免疫グロブリンおよび／または標的は、転位置活性に関与しているこのようなタンパク質から得たドメインまたは配列と融合またはコンジュゲートされ得る。転位置ドメインおよび配列は、ＨＩＶ−１−トランス活性化タンパク質（Ｔａｔ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンンテナペディアホメオドメインタンパク質および単純ヘルペス１型ＶＰ２２タンパク質に由来するドメインおよび配列を含み得る。
検出および診断法
ＥＬＡＢＥＬＡの発現の検出
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸およびその変異体、相同体、誘導体および断片などを含めたＥＬＡＢＥＬＡの発現を検出する方法を記載する。
ＥＬＡＢＥＬＡ発現は、ＥＬＡＢＥＬＡの量またはその活性を調べるために手段として検出され得る。幹細胞などの細胞中または細胞のＥＬＡＢＥＬＡ発現が検出され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ発現の検出はまた、細胞組織、臓器または生物の部分もしくはすべてを含むサンプルで実施され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態におけるＥＬＡＢＥＬＡの発現は、正常組織と比較した場合に、上方制御されるなど、調節され得る。したがって、本発明者らは、個体の細胞または組織におけるＥＬＡＢＥＬＡの発現の調節または上方制御などのＥＬＡＢＥＬＡの発現の調節の検出を含むＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を診断する方法を提供する。
ＥＬＡＢＥＬＡ発現、活性または量の検出は、細胞の状態を判定する方法を提供するために使用され得る。したがって、対象とする細胞は、正常細胞と比較して高レベルのＥＬＡＢＥＬＡ発現、活性または量を有するものであり得る。同様に、対象とする細胞は、正常細胞と比較して低レベルのＥＬＡＢＥＬＡ発現、活性または量を有するものであり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡの検出はまた、細胞が対象とする細胞であるか否かを判定するために使用され得る。したがって、細胞中のＥＬＡＢＥＬＡの高レベルのＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性が検出され得る。同様に、細胞において低レベルのＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性も検出され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡのレベルが、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の攻撃性とともに変わる場合には、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性の検出はまた、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を有する個体の生存率を予測するために使用され得、すなわち、両方とも正常レベルのＥＬＡＢＥＬＡを有する個体または同族集団と比較して、高レベルのＥＬＡＢＥＬＡは、低い生存率または可能性を示し、低レベルのＥＬＡＢＥＬＡは、高い生存率または可能性を示すことが認められよう。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性の検出は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を有する個体の予後の方法として使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量またはレベルの検出は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を有する個体における特定の療法の成功の見込みを判定するために使用され得る。
本明細書に記載される診断方法は、記載される治療方法と組み合され得る。したがって、本発明者らは、個体においてＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療、予防または軽減する方法であって、個体の細胞中のＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性の調節を検出することと、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の攻撃性に基づいて個体に適当な療法を施すこととを含む方法を提供する。療法は、別の場所に記載されるような抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を含み得る。
本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されるようなサンプル中のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドおよび核酸の存在および量が検出され得る。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患は、対象に由来するサンプルから、異常に低減または増大した発現、量または活性、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡの増大した発現、量または活性を判定することを含む方法によって診断され得る。
サンプルは、発現、量または活性のレベルまたはパターンの空間的または時間的変化を示す、増大した、低減した、そうでなければ異常なＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性と関連している疾患を患っているか、患っていると疑われる生物または個体から得た細胞または組織サンプルを含み得る。このような疾患を患っているか、または患っていると疑われる生物におけるＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性のレベルまたはパターンは、疾患の診断の手段として、正常な生物における発現、量または活性のレベルまたはパターンと有用に比較され得る。
サンプルは、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っているか、それを患っていると疑われる個体から得られた細胞または組織サンプル、例えば、それらの組織または細胞のいずれかの組織または細胞サンプルを含み得る。
いくつかの実施形態では、増大したレベルのＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性が、サンプル中で検出される。ＥＬＡＢＥＬＡのレベルは、正常な細胞またはＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っていないとわかっている個体から得られた細胞と比較した場合に大幅な程度増大され得る。このような細胞は、試験されている個体または別の個体、例えば、試験される個体と年齢、体重、ライフスタイルなどによって対応しているものから得ることができる。
いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性のレベルが、１０％、２０％、３０％または４０％またはそれ超増大される。いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性のレベルは、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションによって判断されるように４５％以上、例えば、５０％以上増大される。
ＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性は、当技術分野で公知のような、本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されるようないくつかの方法で検出され得る。通常、個体から得られた組織のサンプル中のＥＬＡＢＥＬＡの量が測定され、影響を受けていない個体から得られたサンプルと比較される。ＥＬＡＢＥＬＡ核酸ならびにＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドレベルの両方が測定され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡの量、活性または発現の検出は、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を段階分けするために使用され得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡの高レベルの量、活性または発現は、攻撃的なＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を示し得る。同様に、ＥＬＡＢＥＬＡの低レベルの量、活性または発現は、攻撃的ではないＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を示し得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子発現のレベルは、いくつかの異なる技術を使用して決定され得る。
ＲＮＡレベルでのＥＬＡＢＥＬＡの発現の測定
ＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子発現は、ＲＮＡレベルで検出され得る。
したがって、一実施形態では、本発明者らは、サンプルを、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸に対して特異的である少なくとも１種の核酸プローブと接触させることと、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸の存在について前記サンプルをモニタリングすることとによって、サンプル中のＥＬＡＢＥＬＡ核酸を含む核酸の存在を検出する方法を開示する。例えば、核酸プローブは、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸またはその一部と特異的に結合し得、２者間の結合が検出され、複合体自体の存在も検出され得る。
したがって、一実施形態では、サンプル中のＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡの形態のＥＬＡＢＥＬＡ核酸の量が測定され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティングおよびリバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応によってアッセイされ得る。核酸配列は、特異的プライマーを使用する、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、一本鎖高次構造多型、ＰＣＲ増幅およびＤＮＡチップ解析によって同定され得る（Ｋａｗａｓａｋｉ、１９９０年；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９９２年；Ｌｉｃｈｔｅｒら、１９９０年；Ｏｒｉｔａら、１９８９年；Ｆｏｄｏｒら、１９９３年；Ｐｅａｓｅら、１９９４年）。
ＥＬＡＢＥＬＡ ＲＮＡは、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ； Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）またはＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することを含め、ＲＮＡ抽出物技術を使用して細胞から抽出され得る。通常、リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用するアッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１２巻：７０３５頁を含む。使用され得る検出する方法は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識およびその他の適した標識を含む。
これらの方法の各々は、定量的決定がなされることを可能にし、当技術分野で周知である。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性の低減または増大は、ポリヌクレオチドの定量化のための当技術分野で周知の方法のいずれかを使用してＲＮＡレベルで測定され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ配列から得られた任意の適したプローブ、例えば、適したヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の任意の部分がプローブとして使用され得る。ＥＬＡＢＥＬＡプローブを設計するための配列は、配列番号３７〜４１を有する配列またはその一部を含み得る。
通常、ＲＮＡ標的を増幅するためにＲＴ−ＰＣＲが使用される。このプロセスでは、リバーストランスクリプターゼ酵素が使用されて、ＲＮＡが相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換され、これが、次いで、検出を容易にするために増幅され得る。
多数のＤＮＡ増幅法が公知であり、そのほとんどは、酵素的連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応または自家持続配列複製法など）に頼るか、またはクローニングされているベクターのすべてまたは一部の複製からである。
多数の標的およびシグナル増幅法が、文献、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ、Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４２巻：２２９〜２３７頁（１９８８年）およびＬｅｗｉｓ，Ｒ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ第１０巻：１、５４〜５５頁（１９９０年）におけるこれらの方法の全般的な総説に記載されている。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡを検出するためにポリメラーゼ連鎖反応が使用され得る。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同４，６８３，２０２号に記載される核酸増幅法である。ＰＣＲは、診断に関連して任意の既知核酸を増幅するために使用され得る（Ｍｏｋら、１９９４年、Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ第５２巻：２４７〜２５２頁）。自家持続配列複製法（３ＳＲ）は、酵素カクテルおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の逐次ラウンドによる核酸鋳型の等温増幅を含む、ＴＡＳの変法である（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８７巻：１８７４頁）。連結増幅反応または連結増幅系は、ＤＮＡリガーゼおよび４種のオリゴヌクレオチド、標的鎖あたり２種を使用する。この技術は、Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．およびＷａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．、１９８９年、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ第４巻：５６０頁によって記載されている。Ｑβレプリカーゼ技術では、Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第６巻：１１９７頁によって記載されるように、標的ＤＮＡを増幅するために、一本鎖ＲＮＡを複製するバクテリオファージＱβのＲＮＡレプリカーゼが使用される。
ＰＣＲ手順は、（１）抽出されたＤＮＡを一本鎖相補鎖を形成するよう処理することと、（２）対の一方のプライマーが、センス鎖中の配列の部分と実質的に相補的であり、各対のもう一方のプライマーが、相補的アンチセンス鎖中の同一配列の異なる部分と実質的に相補的である、オリゴヌクレオチドプライマーの対を添加することと、（３）対のプライマーを相補配列とアニーリングすることと、（４）各プライマーの３’末端からアニーリングしたプライマーを同時に伸長して、各プライマーとアニーリングした鎖に相補的である伸長生成物を合成することであって、相補体からの分離後に前記伸長生成物が、各対のもう一方のプライマーの伸長生成物の合成の鋳型として働くことと、（５）前記伸長生成物を前記鋳型から分離して、一本鎖分子を産生することと、（６）前記アニーリング、伸長および分離ステップを少なくとも１回反復することによって、前記一本鎖分子を増幅することとを基本的に含む。
逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が使用され得る。定量的ＲＴ−ＰＣＲも使用され得る。このようなＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、ＥＬＡＢＥＬＡ配列に由来する任意の適したプライマーを使用し得る。
代替増幅技術も使用され得る。例えば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９９８年、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ第１９巻：２２５頁）は、市販の増幅技術（ＲＣＡＴ（商標））であり、ＤＮＡポリメラーゼによって駆動され、等温条件下で線形または幾何動態学のいずれかを用いて環状オリゴヌクレオチドプローブを複製し得る。さらなる技術、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８０巻：３９２頁）は、特定の標的に特有の、具体的に規定された配列を用いて始まる。
ポリペプチドレベルでのＥＬＡＢＥＬＡの発現の測定
ＥＬＡＢＥＬＡ発現は、ポリペプチドレベルで検出され得る。
したがって、さらなる実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性は、サンプル中のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの存在または量を検出することによって検出され得る。これは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合する分子を使用することによって達成され得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの存在を検出するための、それと直接的または間接的のいずれかで結合する適した分子／薬剤として、ペプチドおよびタンパク質、例えば、抗体などの天然に存在する分子が挙げられ、またはそれらは合成分子であってもよい。
したがって、本発明者らは、細胞サンプルを、ポリペプチドと結合可能な抗体と接触させることと、前記サンプルをポリペプチドの存在についてモニタリングすることとによって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの存在を検出する方法を開示する。
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体を使用して検出され得る。このような抗体は、当技術分野で公知の手段によって（本明細書において別の場所にさらに詳細に記載されるように）作製され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡの検出は、好都合なことに、抗体およびＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド間で形成された複合体の存在をモニタリングすることと、またはポリペプチドおよび抗体間の結合をモニタリングすることとによって達成され得る。２種の実体間の結合を検出する方法は、当技術分野で公知であり、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、表面プラズモン共鳴などを含む。
上記のような免疫ブロット法などの標準実験室技術は、同一細胞集団中の未処理細胞と比較された、ＥＬＡＢＥＬＡタンパク質のレベルの変更を検出するために使用され得る。
遺伝子発現はまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの翻訳後プロセシングまたはＥＬＡＢＥＬＡ核酸の転写後修飾における変化を検出することによって決定され得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの差示的リン酸化、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの切断またはＥＬＡＢＥＬＡ ＲＮＡの選択的スプライシングなどが測定され得る。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドなどの遺伝子産物の発現のレベルおよびその翻訳後修飾は、専売のタンパク質アッセイまたは２Ｄポリアクリルアミドゲル電気泳動などの技術を使用して検出され得る。
宿主から導かれたサンプル中のＥＬＡＢＥＬＡタンパク質のレベルを決定するために使用され得るアッセイ技術は、当業者に周知である。抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって免疫特異的結合についてアッセイされ得る。
使用され得るイムノアッセイとして、それだけには限らないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散法沈降素反応、免疫拡散法アッセイ、凝集アッセイ、相補体固定アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用する競合および非競合アッセイ系が挙げられる。このようなアッセイは、当技術分野で日常的なものである（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡ発現を測定または検出するためのイムノアッセイキットを記載する。イムノアッセイキットは、
（ａ）コーティング抗原、
（ｂ）（ｉ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号１〜３６のうちいずれかの配列を含むポリペプチド
のうち１種または複数と特異的に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原−結合断片、
（ｃ）使用のための説明書
を含み得る。
単離された抗体または抗原−結合断片は、例えば、放射標識、例えば、１２５Ｉを用いて標識され得る。
イムノアッセイキットは、酵素標識された試薬、単離された抗体または抗原−結合断片と特異的に結合可能な二次抗体、固体基質またはこれらのいずれかの組合せをさらに含み得る。
試料は、免疫組織化学的および免疫細胞化学的染色（全般的に、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ、１９９４年を参照のこと）、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、イムノブロット、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、機能的アッセイおよびタンパク質短縮化試験によって、ポリペプチド／タンパク質についてアッセイされ得る。その他のアッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者には周知である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体両方が、アッセイにおいて使用され得る。適当な場合には、当業者に公知であるので、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのその他のイムノアッセイが使用され得る。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号、同３，８３９，１５３号、同３，８５０，７５２号、同３，８５０，５７８号、同３，８５３，９８７号、同３，８６７，５１７号、同３，８７９，２６２号、同３，９０１，６５４号、同３，９３５，０７４号、同３，９８４，５３３号、同３，９９６，３４５号、同４，０３４，０７４号、同４，０９８，８７６号、同４，８７９，２１９号、同５，０１１，７７１号および同５，２８１，５２１号ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、１９９２年を参照のこと。
診断キット
本発明者らはまた、個体においてＥＬＡＢＥＬＡ関連状態または個体におけるこのようなＥＬＡＢＥＬＡ関連状態に対する感受性を検出するための診断キットを提供する。
診断キットは、本明細書に記載されるようないずれかの手段によって個体においてＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性を検出するための手段を含み得る。したがって、診断キットは、ＥＬＡＢＥＬＡポリヌクレオチドもしくはその断片、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸もしくはその断片の相補的ヌクレオチド配列、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドもしくはその断片またはＥＬＡＢＥＬＡに対する抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体、例えば、抗ペプチド抗体ヒトＥＬＡＢＥＬＡ抗体などを含む、ＥＬＡＢＥＬＡに対する抗体のうちいずれか１種または複数を含み得る。
診断キットは、使用のための説明書またはその他の証印を含み得る。診断キットは、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療もしくは予防するための手段、例えば、本明細書に記載される組成物のいずれかまたはこのようなＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療するための当技術分野で公知の任意の手段をさらに含み得る。特に、診断キットは、記載されるような、例えば、スクリーニングによって得られる抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を含み得る。診断キットは、治療薬を含み得る。治療薬はまた、抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体を含み得る。
イムノアッセイ
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡ発現を測定または検出するためのイムノアッセイキットであって、（ａ）（ｉ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドまたは（ｉｖ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドのうち１種または複数と特異的に結合する、１種または複数の単離された抗体またはその抗原−結合断片を含むコーティング抗原および（ｂ）前記コーティング抗原を使用するための説明書を含むイムノアッセイキットを記載する。
単離された抗体またはその抗原−結合断片は標識され得る。
キットは、酵素標識された試薬、単離された抗体または抗原−結合断片と特異的に結合する二次抗体、固体基質またはそれらのいずれかの組合せをさらに含み得る。
予防および治療方法
本発明者らは、異常な状態、例えば、不十分なまたは過剰な量のＥＬＡＢＥＬＡ発現または活性と関連するＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を治療する方法を開示する。ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を予防する方法（すなわち、予防）はまた、同一または同様のアプローチを適宜使用する。
大まかに言えば、本発明者らの方法は、細胞中のＥＬＡＢＥＬＡの発現、量または活性を調節（例えば、下方制御する）ことによる細胞の操作を含む。細胞において調節されたＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性を検出するステップは、操作ステップの前後に実施され得る。検出ステップは、上方制御または下方制御されたＥＬＡＢＥＬＡ発現、量または活性を検出し得る。本明細書において別の場所に詳細に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡを調節または下方制御する方法のいずれも使用され得る。
方法は、細胞を、適したｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはキメラＲＮＡｉに曝露することを含み得る。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの例は、配列表に示されている。例えば、配列番号４７〜配列番号５１として示されるｓｈＲＮＡ配列のいずれも、ＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡ発現を下方制御するために使用され得る。
キメラＲＮＡ干渉（キメラＲＮＡｉ）は、低分子干渉ＲＮＡ／ＤＮＡキメラが、元の遺伝子のｍＲＮＡの破壊を誘発するプロセスである。キメラＲＮＡｉは、Ｕｉ−Ｔｅｉ Ｋら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００８年４月；第３６巻：２１３６〜２１５１頁、Ｎａｉｔｏ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００５年７月；第３３巻：Ｗ５８９〜Ｗ５９１頁、Ｕｉ−Ｔｅｉ Ｋら．、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４年２月９日；３２（３）：９３６〜４８頁およびＮａｉｔｏら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４年７月１日；第３２巻（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ１２４〜９頁に詳細に記載される。
方法はまた、細胞を、ＥＬＡＢＥＬＡと特異的に結合可能な抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体に曝露することを含み得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載されるような任意の抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体を含み得る。
ＥＬＡＢＥＬＡが、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の攻撃性と関連している場合には、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を有する個体の細胞においてＥＬＡＢＥＬＡのレベルが検出され得、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の攻撃性が評価される。正常な細胞と比較して高レベルのＥＬＡＢＥＬＡ量、発現または活性は、攻撃的なＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を示し得、したがって、より強力なまたはより厳しい療法が必要とされ、選択され得る。同様に、より低いレベルは、より攻撃的でない治療を示し得る。
一般に、本明細書に記載されるアプローチは、任意のＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患の療法のために使用され得る。ＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患は、本明細書において別の場所に詳細に記載される。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連疾患は、疾患と関連している状態が、対照に対して大幅に阻害される（すなわち、５０％以上）場合に「治療され」ていると定義される。阻害は、対照に対して少なくとも７５％、例えば、対照に対して９０％、９５％または１００％であり得る。用語「治療」によって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の予防または軽減も含むことを意味する。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態または障害の治療のための１つのあり得るアプローチは、本明細書に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリヌクレオチドに対して向けられたアンチセンス構築物を発現させることおよびそれらを細胞またはＥＬＡＢＥＬＡ関連状態を患っている個体に投与することである。
アンチセンス構築物は、増殖細胞において、遺伝子機能を阻害して、成長または進行を妨げるために使用され得る。アンチセンス構築物、すなわち、センス核酸またはｍＲＮＡと相補的であるＲＮＡなどの核酸構築物は、ＵＳ６，１００，０９０（Ｍｏｎｉａら）およびＮｅｃｋｅｒｓら、１９９２年、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ３（１−２）：１７５〜２３１頁に詳細に記載されており、その文書の教示は、参照により具体的に組み込まれる。
特定の例では、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態は、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡと結合可能であり、ＥＬＡＢＥＬＡ ｍＲＮＡを破壊するｓｉＲＮＡによって、ＥＬＡＢＥＬＡの量、発現または活性を全体にまたは一部において低減することによって治療または予防され得る。本発明者らは、ＲＮＡ干渉によってＥＬＡＢＥＬＡを下方制御する抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を具体的に提供する。抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含み得る。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の直接導入によって誘導され、種々の生物において特定の遺伝子の発現をノックアウトする有用なツールとして現れた転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の方法である。ＲＮＡｉは、Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ第３９１号：８０６〜８１１頁（１９９８年）によって記載されている。ＰＴＧＳのその他の方法は公知であり、例えば、導入遺伝子またはウイルスの導入が挙げられる。一般に、ＰＴＧＳでは、サイレンシングされた遺伝子の転写物が合成されるが、迅速に分解されるので蓄積しない。ＲＮＡｉを含めたＰＴＧＳのための方法は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍワールドワイドウェブサイトに、ディレクトリ「／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／」に、「ｒｎａｉ」ファイルに記載されている。
ＲＮＡｉ ｉｎ ｖｉｔｒｏのための適した方法は、本明細書に記載されている。１つのこのような方法は、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）の導入を含む。現在のモデルは、これらの２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡが、ＰＴＧＳを誘導し得ることを示す。有効なｓｉＲＮＡを設計するための方法は、例えば、上記のＡｍｂｉｏｎウェブサイトに記載されている。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡ前駆体はまた、ＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列のすべてまたは一部によってコードされ得る。
あるいは、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、さまざまな生物において遺伝子発現を干渉する強力な方法であり、最近、哺乳動物において成功であるとわかった（ＷｉａｎｎｙおよびＺｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ、２０００年、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ第２巻：７０〜７５頁）。ＥＬＡＢＥＬＡ活性を干渉するために、ＥＬＡＢＥＬＡポリヌクレオチドの配列に対応する二本鎖ＲＮＡが、候補生物の卵母細胞および細胞に導入され得るか、そこで発現され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子発現を調節するその他の方法は、当業者に公知であり、ドミナントネガティブアプローチを含む。したがって、別のアプローチとして、内因性遺伝子産物と競合し、機能の阻害をもたらす、本明細書におけるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの非機能的変異体を使用することがある。
ＥＬＡＢＥＬＡの非機能的変異体の一例として、配列番号２０のヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列（またはそれに対応する）の３１位または３２−位または両方でのアルギニンまたはリシン残基のアラニンまたはグリシンへの突然変異がある。
ＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子発現はまた、遺伝子発現または機能活性を阻害するペプチドまたは小分子の導入によって、調節され得る。したがって、本明細書に記載されるアッセイによって同定された化合物は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するので、またはＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの量、活性または発現を調節する、例えば下方制御するので、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの機能を妨げるために細胞に投与され得る。このような化合物は、ＥＬＡＢＥＬＡの発現または活性を下方制御するために、またはＥＬＡＢＥＬＡ発現、活性または量を制御する第２のシグナルを活性化または下方制御し、それによって、異常な状態を軽減することによって有効な量の薬学的に許容される担体とともに投与され得る。
本明細書に記載されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに対する適した抗体はまた、治療薬として使用され得る。
あるいは、遺伝子療法は、対象における胚性または成体幹細胞などの関連細胞によるＥＬＡＢＥＬＡの内因性産生を制御するために使用され得る。例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドまたはこの一部は、本明細書において別の場所で論じられるように複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために遺伝子操作され得る。次いで、レトロウイルス発現構築物は、単離され、抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｉＲＮＡをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて形質導入されたパッケージング細胞中に導入され得、その結果、パッケージング細胞がここで対象とする配列を含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生株細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞を操作し、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現を調節するために対象に投与され得る。遺伝子療法の概要については、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓｓ、Ｔ ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡ Ｐ Ｒｅａｄ、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ（１９９６年）中の第２０章、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびそこで引用された参考文献）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡのレベルは、幹細胞において低減される。さらに、いくつかの実施形態では、治療は、幹細胞にターゲッティングされ得るか、または幹細胞に特異的であり得る。ＥＬＡＢＥＬＡの発現は、罹患幹細胞においてのみ特異的に低減され得、その他の罹患していない幹細胞では実質的に低減されない。これらの方法では、ＥＬＡＢＥＬＡの発現は、その他の細胞、すなわち、幹細胞ではない細胞では実質的に低減されない場合もある。したがって、このような実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡのレベルは、治療の過程または治療後に、非幹細胞においてと実質的に同一または同様であるままである。
ＥＬＡＢＥＬＡレベルの幹細胞特異的低減は、ターゲッティングされた投与、すなわち、治療をその他の細胞ではなく幹細胞のみに適用することによって達成され得る。しかし、その他の実施形態では、幹細胞におけるＥＬＡＢＥＬＡ発現の下方制御（その他の細胞または組織種では実質的にない）が使用される。このような方法は、当技術分野で公知のように、例えば、ｓｉＲＮＡの幹特異的発現のために幹特異的発現ベクターを利用し得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態
「ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態」は、この用語が本明細書において使用されるように、任意の心機能不全、高血圧症または血圧、心収縮性もしくは体液平衡における心血管異常を包含するよう意図される。
用語「ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態」はまた、心肥大、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、梗塞後治療、心筋虚血−再灌流傷害または心房細動、冠動脈心疾患、心不全、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）などの任意の心血管疾患を包含するよう意図される。
「ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態」はまた、高血圧症、アンギナ、うっ血性心不全または勃起不全などの高血圧と関連している状態を含み得る。
「ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態」はまた、個体におけるＡＩＤＳなどのＨＩＶ感染と関連している状態を含み得る。
例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、以下に示される状態または疾患のいずれかを予防、治療または軽減するために使用され得る：
心疾患
心疾患は、心臓に影響を及ぼす種々の疾患の多様性についての包括的な用語である。２００７年の時点で、米国、英国、カナダおよびウェールズにおいて死因の第１位であり、米国単独で３４秒に１人が死亡する。心疾患は、以下のうちいずれかを含む。
冠動脈心疾患
冠動脈疾患は、心筋を供給する動脈壁内のアテローム性プラークの蓄積によって引き起こされる動脈の疾患である。狭心症（胸痛）および心筋梗塞（心臓発作）は、冠動脈心疾患の症状であり、冠動脈心疾患によって引き起こされる状態である。４５９，０００人を超える米国人が、毎年、冠動脈心疾患のために死亡する。英国では、年間１０１，０００人の死亡が、冠動脈心疾患によるものである。
心筋症
心筋症は、何らかの理由による心筋（すなわち、実際の心臓の筋肉）の機能の悪化である。心筋症を有する人は、不整脈および／または突然の心臓死の危険にあることが多い。外因性心筋症−主な病理が心筋自体の外側である心筋症は、心筋症の大部分をなす。心筋症の間違いなく最もよくある原因は、虚血である。
世界保健機構は、特定の心筋症として、アルコール性心筋症、冠動脈疾患、先天性心疾患、心臓に影響を及ぼす栄養性疾患、虚血性（ｉｓｃｈｅｍｉｃ）（または虚血性（ｉｓｃｈａｅｍｉｃ））心筋症、高血圧性心筋症、弁膜症性心筋症、炎症性心筋症を含む。
同様に以下も含まれる：
全身性代謝疾患に続発する心筋症
内因性心筋症（同定可能な外因によらない心臓の筋肉の脆弱）
拡張性心筋症（ＤＣＭ、最もよくある形態、心臓移植の第１位の適応症の１種。ＤＣＭでは、心臓（特に、左心室）が肥大し、ポンプ機能が減少する）
肥大性心筋症（ＨＣＭまたはＨＯＣＭ、サルコメアタンパク質をコードする遺伝子における種々の突然変異によって引き起こされる遺伝子障害。ＨＣＭでは、心臓筋肉が肥厚し、これが血流を妨げ、心臓が適切に機能することを妨げ得る）。
不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ、心臓筋肉が線維性瘢痕組織によって置き換わる、心臓の電気妨害から起こる。一般に、右心室が最も影響を受ける）
拘束性心筋症（ＲＣＭ、極めて稀な心筋症である。心室の壁が堅いが、肥厚していない場合もあり、血液での心臓の正常な充填に抵抗する）。
緻密化障害心筋症−左心室壁が誕生から適切に成長できず、そのようなものとして、心エコー図の際に観察されると海綿状の外観を有する。
心血管疾患
心血管疾患は、心臓自体および／または血管系、特に、心臓につながるおよび心臓からの静脈および動脈に影響を及ぼすいくつかの特定の疾患のうちいずれかである。疾患二形性に関する研究は、心血管疾患を患う女性が、普通、血管に影響を及ぼす形態を患うのに対し、男性は、普通、心臓筋肉自体に影響を及ぼす形態を患うことを示唆する。心血管疾患の既知のまたは関連する原因として、糖尿病、高血圧症、高ホモシステイン血症および高コレステロール血症が挙げられる。
心血管疾患の種類として、アテローム性動脈硬化症が挙げられる。
虚血性心疾患
虚血性心疾患は、臓器への血液供給の減少を特徴とする心臓自体の疾患である。これは、酸素および栄養素を供給する動脈が停止し、心臓が十分な酸素および栄養素を得られず、最終的に拍動を停止する場合に起こる。
心不全
うっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）（またはＣＨＦ）およびうっ血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｃａｒｄｉａｃ ｆａｉｌｕｒｅ）（ＣＣＦ）とも呼ばれる心不全は、心臓の身体中を十分な量の血液で満たすまたはポンプで送る能力を損なう任意の構造的または機能性心臓障害に起因し得る状態である。肺性心は、心臓の右側の不全である。
高血圧性心疾患
高血圧性心疾患は、高血圧症、特に、局在化高血圧症によって引き起こされる心疾患である。高血圧性心疾患によって引き起こされ得る状態として、左心室肥大、冠動脈心疾患、（うっ血性）心不全、高血圧性心筋症、心不整脈、炎症性心疾患などが挙げられる。
炎症性心疾患は、心筋および／またはその周囲の組織の炎症を含む。心内膜炎は、心臓の内層、心内膜の炎症を含む。関与する最もよくある構造は、心臓弁である。炎症性心拡大。心筋炎は、心筋、心臓の筋肉部分の炎症を含む。
弁膜症性心疾患
弁膜症性心疾患は、心臓の１つまたは複数の弁に影響を及ぼす疾患プロセスである。心臓の右側の弁は、三尖弁および肺動脈弁である。心臓の左側の弁は、僧帽弁および大動脈弁である。大動脈弁狭窄症、僧帽弁逸脱症および弁膜症性心筋症が含まれる。
［上記の本文は、Ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．（２００９年２月３日）を出典とする。ウィキペディアでは、Ｔｈｅ Ｆｒｅｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ。ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｔｉｔｌｅ＝Ｈｅａｒｔ＿ｄｉｓｅａｓｅ＆ｏｌｄｉｄ＝２６８２９０９２４から２００９年２月２０日、６時３３分に検索された］
医薬組成物および投与
ＥＬＡＢＥＬＡ核酸、ポリペプチド、その断片、相同体、変異体または誘導体、モジュレーター、アゴニストまたはアンタゴニスト、いずれかの構造的に関連する化合物または酸性塩を含めた抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤が、単独で投与されることは可能であるが、有効成分は、医薬製剤として製剤化されてもよい。
したがって、本発明者らはまた、抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を含む医薬組成物を開示する。このような医薬組成物は、記載されるような症状の治療または軽減のための、個体への記載されるような組成物の形態などの抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤の送達にとって有用である。
本明細書との関連において医薬組成物は、有効成分として少なくとも１種の抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を含む物質の組成物である。
医薬製剤は、有効量の抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤を、１種または複数の薬学的に許容される担体と一緒に含む。「有効量」とは、記載されるような疾患の少なくとも１つの症状を軽減するのに十分な量である。
有効量は、治療または軽減されるべき特定の疾患または症候群ならびに患者の年齢および体重、疾患などの状態がどの程度進行しているか、患者の全身の健康、症状の重症度および抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤が単独でまたはその他の療法と組み合わせて投与されているか否かを含めたその他の因子に応じて変わる。
適した薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知であり、医薬製剤の所望の投与形態および様式に伴って変わる。例えば、それらは、希釈剤または増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの賦形剤を含み得る。通常、担体は、固体、液体または気化可能な担体またはそれらの組合せである。各担体は、製剤中のその他の成分と適合しており、患者にとって有害ではないという意味で「許容され」なければならない。担体は、宿主に投与された場合に有害反応（例えば、免疫応答）を誘発することなく生物学的に許容されなくてはならない。
医薬組成物の有効成分（単数または複数）は、例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の軽減において治療活性を示すと考慮される。投与計画は、最適治療反応を提供するよう調整され得る。例えば、いくつかの分割用量が、毎日投与されてもよく、または用量は、治療状況の緊急事態によって示されたように比例して低減されてもよい。
活性化合物は、経口、静脈内（水溶性の場合には）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内または坐剤経路または植え込み（例えば、遅延放出分子を使用する）などによって、好都合な方法で投与され得る。投与経路に応じて、有効成分を酵素、酸または前記成分を不活性化し得るその他の天然条件の作用から保護するために、前記成分が、材料でコーティングされることが必要であり得る。
抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤は、単独で、またはその他の治療薬と組み合わせて投与され得る。本明細書において使用するのに適したその他の治療薬は、意図される目的にとって有効である任意の適合性薬物または薬剤製剤にとって補完的である薬物である。併用療法において使用される製剤は、組み合わされた効果が達成されるようその他の治療と同時にまたは逐次投与され得る。
経口投与
いくつかの実施形態では、ＥＬＡＢＥＬＡ活性、発現または量の阻害剤が、経口組成物として提供され、それに応じて投与される。ＥＬＡＢＥＬＡ活性、発現または量の阻害剤の投与量は、約１ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の間であり得る。
医薬組成物は、錠剤、カプセル剤または溶液の形態の経口製剤で投与され得る。有効量の経口製剤は、患者に、疾患の症状が軽減されるまで１日１〜３回投与される。
有効量の薬剤は、患者の年齢、体重および状態に応じて変わる。一般に、薬剤の１日経口用量は、１２００ｍｇ未満および１００ｍｇ超である。１日経口用量は、約３００〜６００ｍｇであり得る。経口製剤は、単位投与形で従来提示され、薬学の分野で公知の任意の方法によって提示され得る。組成物は、適した薬学的に許容される担体と一緒に、任意の所望の投与形に製剤化され得る。通常の単位投与形として、錠剤、丸剤、散剤、溶液、懸濁液、エマルジョン、顆粒剤、カプセル剤、坐剤が挙げられる。一般に、製剤は、薬剤組成物を液体担体または細分割固体担体または両方と均一に、密接に関連させることおよび必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。有効成分は、疾患を治療するために有効量の有効成分をもたらすよう、液体、散剤、錠剤またはカプセル剤の形態の種々の基本材料中に組み込まれ得る。
組成物は、例えば、不活性希釈剤とともに、または同化可能な食用担体とともに適宜経口投与され得るか、またはハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセル中に封入され得るか、または錠剤に打錠され得るか、または食事の食物ともに直接組み込まれ得る。経口治療投与のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ、摂取可能錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウェハーなどの形態で使用され得る。このような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、適した投与量が得られるようなものである。
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、トラガカントゴム、アラビアガム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などといった崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含有し得、スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料またはペパーミント、ウィンターグリーンのオイルもしくはチェリーフレーバーなどの矯味剤が添加されてもよい。投与単位形態が、カプセル剤である場合には、上記の種類の材料に加えて、液体担体を含有し得る。
種々のその他の材料が、コーティングとして、またはそうではなく、投与単位の物理的形態を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖または両方でコーティングされ得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてスクロース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジフレーバーなどの矯味剤を含有し得る。もちろん、任意の投与単位形態の調製において使用される任意の材料は、薬学的に純粋で、使用される量で実質的に非毒性でなくてはならない。さらに、活性化合物は、徐放性調製物および製剤中に組み込まれ得る。
注射用または静脈内投与
いくつかの実施形態では、抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤は、注射用または静脈内組成物として提供され、それに応じて投与される。抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤阻害剤の投与量は、約５ｍｇ／ｋｇ／２週間〜約１０ｍｇ／ｋｇ／２週間の間であり得る。抗ＥＬＡＢＥＬＡ剤阻害剤は、１０〜３００ｍｇ／日の間、例えば、少なくとも３０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日未満または３０ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日の間の投与量で提供され得る。
注射用使用に適した医薬形態は、滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散物および滅菌散剤を含む。すべての場合において、形態は無菌でなくてはならず、容易な注射可能性が存在する範囲で流体でなくてはならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなくてはならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適した混合物および植物油を有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持され得る。
局所投与
本明細書に開示される医薬組成物は、局所および経口投与に適したものを含む。局所製剤は、罹患組織が主に皮膚または表皮である場合（例えば、乾癬、湿疹およびその他の上皮疾患）に使用され得る。
局所製剤は、組成物が、治療されるべき皮膚表面との直接接触によって外側に適用される医薬形態を含む。局所適用用の従来の医薬形態として、ソーク（ｓｏａｋ）、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ジェル、スティック、スプレー、エアゾール、バスオイル、溶液などが挙げられる。局所治療は様々な媒体によって送達され、媒体の選択は重要となり得るが、一般に、急性疾患が治療されるべきであるか、または慢性疾患が治療されるべきであるかに関連する。例として、急性皮膚増殖性疾患は、一般に、水性の乾燥調製物を用いて治療されるが、慢性皮膚増殖性疾患は、含水調製物を用いて治療される。ソークは、急性の湿潤性皮疹を乾燥する最も簡単な方法である。ローション（水中散剤懸濁液）および溶液（溶媒中に溶解している医薬）は、有毛領域および間擦領域に理想的である。軟膏または油中水エマルジョンは、乾燥鱗屑様皮疹にふさわしい最も効果的な水和剤ではあるが、ベタベタしており、病巣の部位に左右され望ましくないこともある。適切な場合には、それらは、特に、薬剤組成物の病巣への浸透を高めることが望ましい場合に、帯具と組み合わせて塗布され得る。クリームまたは水中油エマルジョンおよびジェルは、吸収性があり、患者に最も美容的に許容される（Ｇｕｚｚｏら、ｉｎ Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１５９３〜１５９５頁（１９９６年））。クリーム製剤は、一般に、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、鉱油、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸グリセリル、セテアリルアルコール、酢酸トコフェリル、ミリスチン酸イソプロピル、ラノリンアルコール、シメチコン、カルボマー、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、シクロメチコンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースならびにそれらの混合物などの成分を含む。
局所適用のためのその他の製剤には、洗髪剤、石鹸、振盪合剤など、特に、頭皮などの隠された皮膚の上に残留物を残すために配合されるものが挙げられる（Ａｒｎｄｔら、ｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第２巻：２８３８頁（１９９３年））。
一般に、局所製剤中の組成物の濃度は、組成物の約０．５〜５０重量％、例えば、約１〜３０％、約２〜２０％または約５〜１０％の量にある。使用される濃度は、最初はその範囲の上部であってもよく、治療が続くにつれて、その濃度は低減されてもよいし、製剤の適用があまり頻繁でなくてもよい。局所適用は、多くの場合、１日２回適用される。しかし、１日１回のより大用量の適用またはより高頻度のより小用量の適用が有効である場合もある。角質層は、貯蔵所として作用する場合があり、長期間かけた生存皮膚層中への薬物の段階的浸透を可能にする。
局所適用では、所望の薬理効果を得るために、十分な量の有効成分が患者の皮膚に浸透しなければならない。薬物の皮膚への吸収は、薬物の性質、媒体および皮膚の挙動の関数であることが一般的に理解されている。３つの主要な変数は、異なる媒体中の異なる局所用薬物または同じ薬物の吸収速度または流動速度の差、媒体中の薬物の濃度、角質層と媒体との間の薬物の分配係数および角質層における薬物の拡散係数からなる。薬物は、治療に有効であるために、皮膚のバリア機能を担う角質層を通過しなければならない。一般に、高いｉｎ ｖｉｔｒｏ皮膚浸透を発揮する局所製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで有効である。Ｏｓｔｒｅｎｇａら（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、第６０巻：１１７５〜１１７９頁（１９７１年）は、局所適用されたステロイドのｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのデルマトームの（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）ヒト皮膚中へのステロイド浸透速度に比例すると実証した。
皮膚表面から上皮ケラチノサイトへの活性化合物（単数または複数）の浸透を増大するために、皮膚科学上許容され、薬剤と適合する皮膚浸透促進剤が、製剤中に組み込まれ得る。活性化合物（単数または複数）の皮膚中への吸収を増大するスキンエンハンサーは、有効治療に必要とされる薬剤の量を低減し、製剤のより長く持続する効果を提供する。皮膚浸透促進剤は、当技術分野で周知である。例えば、ジメチルスルホキシド（米国特許第３，７１１，６０２号）；オレイン酸、１，２−ブタンジオール界面活性剤（Ｃｏｏｐｅｒ， Ｊ． Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、第７３巻：１１５３〜１１５６頁（１９８４年））；エタノールおよびオレイン酸またはオレイルアルコールの組合せ（ＥＰ２６７，６１７）、２−エチル−１，３−ヘキサンジオール（ＷＯ８７／０３４９０）；デシルメチルスルホキシドおよびＡｚｏｎｅ．ＲＴＭ．（Ｈａｄｇｒａｆｔ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ、第２１巻：１６５〜１７３頁（１９９６年））；アルコール、スルホキシド、脂肪酸、エステル、Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．、ピロリドン、尿素およびポリオール（Ｋａｌｂｉｔｚら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、第５１巻：６１９〜６３７頁（１９９６年））；
１，８−シネオール、メントン、リモネンおよびネロリドールなどのテルペン（Ｙａｍａｎｅ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｙ ＆ Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｙ、第４７巻：９７８〜９８９頁（１９９５年））；Ａｚｏｎｅ．ＲＴＭ．およびトランスクトール（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．第１３巻：５４２〜５４６頁（１９９６年））；ならびにオレイン酸、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール（Ｓｉｎｇｈら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、第５１巻：７４１〜７４４頁（１９９６年））が、有効成分の皮膚浸透を改善すると知られている。
薬剤または組成物の浸透レベルは、当業者に公知の技術によって決定され得る。例えば、活性化合物を放射能標識し、次いで皮膚に吸収された放射能標識化合物の量を測定することによって、当業者は、試験化合物の皮膚浸透を判定するいくつかの方法のいずれかを使用して吸収された組成物のレベルを決定できる。皮膚浸透研究に関連する刊行物として、Ｒｅｉｎｆｅｎｒａｔｈ，Ｗ ＧおよびＧ Ｓ Ｈａｗｋｉｎｓ．Ｔｈｅ Ｗｅａｎｉｎｇ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ Ｐｉｇ ａｓ ａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓｗｉｎｅ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｍｂｌｅｓｏｎ編）Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６年およびＨａｗｋｉｎｓ，Ｇ．Ｓ． Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｋｉｎ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｋｉｎ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ、Ｂ Ｗ ＫｅｍｐｐａｉｎｅｎおよびＷ Ｇ Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９０年、６７〜８０頁；およびＷ．Ｇ．Ｒｅｉｆｅｎｒａｔｈ、Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ＆ Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ、第１１０巻：３〜９頁（１９９５年）が挙げられる。
いくつかの適用については、ポリマーなどの当技術分野で公知の製剤を使用して長時間作用型の薬剤または組成物が投与され得る。薬剤は、皮膚パッチ（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．、ｉｎ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｎｏｒｄｉｃａ第４巻：１１７頁（１９９２年）；Ｔｈａｃｈａｒｏｄｉら、ｉｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ第１６巻：１４５〜１４８頁（１９９５年）；Ｎｉｅｄｎｅｒ Ｒ．、ｉｎ Ｈａｕｔａｒｚｔ第３９巻：７６１〜７６６頁（１９８８年））中に組み込まれてもよく、または治療されるべき領域への薬物の送達の効率を増大するために当技術分野で公知の方法に従って帯具中に組み込まれてもよい。
任意選択で、本明細書に記載される局所製剤は、さらなる賦形剤、例えば、メチルパラベン、ベンジルアルコール、ソルビン酸または第４級アンモニウム化合物などの保存料、ＥＤＴＡなどの安定剤、ブチル化ヒドロキシトルエンまたはブチル化ヒドロキシアニソールなどの抗酸化剤、ならびにクエン酸塩およびリン酸塩などのバッファーを有してもよい。
非経口投与
活性化合物はまた、非経口的に、または腹膜内に投与されてもよい。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中、およびオイル中で調製されてもよい。いくつかの実施形態では、分散物は、３０％カプシトール（Ｃａｐｓｉｔｏｌ）（ＣｙＤｅｘ、Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ、ＵＳＡ）中で調製され得る。カプシトールは、スルホン酸ナトリウム塩がブチルエーテルスペーサー基またはスルホブチルエーテル（ＳＢＥ）によって親油性キャビティーから隔てられたポリアニオン性β−シクロデキストリン誘導体である。シクロデキストリンは、ＳＢＥ７−β−ＣＤであり得る。
アジュバント
組成物は、酵素阻害剤と同時投与されたアジュバント中で、またはリポソーム中で投与され得る。アジュバントは、その最も広い意味で使用され、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書において考慮されるアジュバントとして、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン界面活性剤が挙げられる。酵素阻害剤として、膵臓トリプシンが挙げられる。リポソームとしては、水中油中水ＣＧＦエマルジョンならびに従来のリポソームが挙げられる。
微生物成長の防止
貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有し得る。
微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（ｔｈｉｒｍｅｒｏｓａｌ）などによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが可能である。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされ得る。
滅菌注射用溶液は、適当な溶媒中に、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上記で列挙された種々のその他の成分とともに組み込むことと、続いて、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌媒体中に、滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製方法は、その先に滅菌濾過した溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる、真空乾燥および凍結乾燥技術を含み得る。
薬学的に許容される担体
本明細書において「薬学的に許容される担体および／または希釈剤」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が考慮される。追加の有効成分も組成物中に組み込まれ得る。
投与単位形態
医薬組成物は、投与の容易性および投与量の均一性のために投与単位形態に製剤化され得る。
投与単位形態とは、本明細書において、治療されるべき対象のための単位投与形として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の活性材料を含有する。新規投与単位形態についての仕様は、（ａ）活性材料および達成される特定の治療効果の独特な特徴ならびに（ｂ）身体的健康が損なわれている病的状態を有する生存対象における疾患の治療のための活性材料などの配合の分野に固有の制限によって決定され、また、それらに直接的に左右される。
主な有効成分は、投与単位形態中に、適した薬学的に許容される担体とともに、有効量の好都合な有効な投与のために配合される。追加の有効成分を含有する組成物の場合には、投与量は、前記成分の有用な用量および投与方法を参照することによって決定される。
ＥＬＡＢＥＬＡ組合せ
本明細書に開示されるようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、対象とする分子と組み合され得る。それらは対象とする分子とコンジュゲートされ得る。あるいは、またはさらに、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、対象とするポリペプチドなどの対象とする分子と一緒に含む１種または複数の融合タンパク質が産生され得る。
このような組合せは、本明細書において全般的に、「ＥＬＡＢＥＬＡ組合せ」と呼ばれる。
本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含む第１の部分と、対象とする分子を含む第２の部分とを含むＥＬＡＢＥＬＡ組合せを開示する。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、本明細書に開示される任意の配列、例えば、配列ＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５４）またはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮ（配列番号５５）または両方を含み得る。
組合せは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含む第１の部分が、対象とする分子を含む第２の部分にカップリングされ、融合され、混合され、組み合わされ、そうでなければ接合されるようなものであり得る。
上記のように、組合せは、第１の部分および第２の部分が共有結合によって接合されるようなものであり得る。このような共有結合による接合は、例えば、化学的コンジュゲーションによって達成され得る。あるいは、またはさらに、組合せは、第１の部分および第２の部分を含む融合タンパク質を含み得、これでは、対象とする分子は、ポリペプチドを含む。本発明者らは、このような融合タンパク質を発現可能な発現構築物をさらに開示する。
このようなＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドおよび対象とする分子の組合せの作製は、対象とする分子の追跡、定量化、抽出物または精製に役立ち得る。言い換えれば、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、「ｆｌａｇ」ペプチドとして作用し得る。Ｆｌａｇペプチドは、当技術分野で公知であり、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ（配列番号９７）、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合および／または転写活性化ドメイン）およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。
ＥＬＡＢＥＬＡ組合せは、本明細書において別の場所に開示される抗ＥＬＡＢＥＬＡ抗体などのＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合可能な任意の薬剤によって、追跡、定量、抽出、精製などをなされ得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ組合せが、融合タンパク質として産生される場合には、融合タンパク質配列の除去を可能にするために、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと対象とするタンパク質配列の間に、トロンビン切断部位などのタンパク質分解による切断部位を含むことも好都合であり得る。
ＥＬＡＢＥＬＡ組合せにおけるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと対象とする分子間のカップリングなどは、永久的である場合も一過性である場合もある。共有結合または非共有結合相互作用（イオン性相互作用、疎水力、ファンデルワールス相互作用などを含む）を含み得る。正確なカップリング様式は、重要ではない。したがって、「含んでいる」、「コンジュゲートしている」、「カップリングしている」などが言及される場合には、これらの言及は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと対象とする分子間の相互作用の任意の形態を含むととられなければならない。
ＥＬＡＢＥＬＡ融合タンパク質
例えば、ＥＬＡＢＥＬＡ組合せは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを有する融合タンパク質として提供される対象とするポリペプチドなどの対象とする分子であり得る。発現ベクターは、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現可能なヌクレオチド配列を、対象とするポリペプチドを発現可能なヌクレオチド配列と一緒に含み、その結果、対象とするポリペプチドに融合された対象のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含む融合タンパク質が発現されるよう、標準組換えＤＮＡ技術によって構築され得る。発現ベクターは、当技術分野で公知の（および本明細書において別の場所に詳細に記載されるような）手段によって、融合タンパク質の大規模産生のために適した宿主中にトランスフェクトされ得るか、または形質転換され得る。融合タンパク質の精製もまた、公知の手段によって実施され得る。
あるいは、またはさらに、上記で論じられたように、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、対象とする分子と物理的に会合され得るか、または化学的コンジュゲーションによってそれに付着され得る。
組合せまたはコンジュゲートまたは融合タンパク質などのＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、全ＥＬＡＢＥＬＡ分子またはその断片を含み得る。例えば、天然ＥＬＡＢＥＬＡまたは上記で開示されたような任意のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを含み得る。対象とする分子の部分は、タンパク質性であるか否かに関わらず対象の任意の分子を含み得る。対象とする分子が天然でタンパク質性である（すなわち、対象とするポリペプチド）場合には、共有結合、例えば、アミド結合によってＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド部分にコンジュゲートされ得る（例えば、融合タンパク質として）。
さらに、タンパク質−タンパク質コンジュゲーションはまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド部分と対象とする分子の部分間のコンジュゲーションのための好都合な、代替選択肢を提供する。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと対象とする分子をカップリングするために、コンジュゲーションの任意の適した手段、例えば、化学コンジュゲーションが使用され得る。架橋剤、例えば、ヘテロ二機能性架橋剤が、当技術分野で公知であり、使用され得る。さらに、その他のコンジュゲーション剤、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もまた使用され得る。
化学カップリング
上記のように、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、いくつかの方法によって対象とする分子にカップリングされ得る。架橋剤は、２つの同一の反応性基を含有するホモ二機能性架橋剤または２つの異なる反応性基を有するヘテロ二機能性架橋剤に分けられる。ヘテロ二機能性架橋剤は、逐次コンジュゲーションを可能にし、重合を最小化する。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを対象とする分子とカップリングして、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド−対象とする分子コンジュゲートを産生するために、以下の表中に示されるホモ二機能性またはヘテロ二機能性架橋剤のいずれも使用され得る。
カップリング
対象とする分子は、いくつかの方法によって、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに付着され得か、またはカップリングされ得る。例えば、対象とする分子は、臭化シアンの使用によってＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドにカップリングされ得る。
リガンド−受容体相互作用、三次構造におけるコンホメーション変化を研究するために、またはタンパク質標識のために、タンパク質を共有結合によって修飾するために化学架橋剤が使用される。架橋剤は、２つの同一の反応性基を含有するホモ二機能性架橋剤または２つの異なる反応性基を有するヘテロ二機能性架橋剤に分けられる。ヘテロ二機能性架橋剤は、逐次コンジュゲーションを可能にし、重合を最小化する。
これらの試薬の各々は、いくつかの製造業者、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（列中のコード番号２）またはＰｉｅｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる。
対象とする分子は、その反応性を増大させるために、カップリングに先立って活性化され得る。例えば、対象とする分子は、クロロ酢酸を使用して活性化され、続いて、ＥＤＡＣ／ＮＨＳ−ＯＨを使用してカップリングされ得る。対象とする分子はまた、ヘキサンジイソシアネートを使用して活性化され、第一級アミノ基が得られる。このような活性化された対象とする分子は、任意のヘテロ二機能性架橋剤と組み合わせて使用され得る。特定の実施形態では、対象とする分子は、ジビニルスルホンを使用して活性化される。このような活性化された対象とする分子は、例えば、ペプチド上のアミノまたはチオール基と反応し得る部分を含む。
対象とする分子はまた、塩化トレシルを使用して活性化され、アミノまたはチオール基と反応可能である部分が得られる。対象とする分子はまた、塩化シアンを使用して活性化され、アミノまたはチオール基と反応し得る部分が得られる。
ペプチドカップリング
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、この節に詳細に記載されるようにペプチドカップリング技術によって対象とする分子にカップリングされ得る。
ペプチドは、固相合成法によって得ることができる。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第８５巻、２１４９〜２１５４頁（１９６３年）およびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２３２巻、３４１〜３４７頁（１９８６年））によって最初に紹介されたこの技術の第１段階は、ポリマー支持体上での保護されたアミノ酸誘導体を用いるペプチド鎖組み立てからなる。この技術の第２段階は、すべての側鎖保護基の同時切断を用いる支持体からのペプチドの切断であり、粗遊離ペプチドが得られる。より大きなペプチドを達成するために、これらのプロセスは、順次反復され得る。
この方法の柔軟性によって、天然に存在するおよび天然に存在しないアミノ酸、種々のリンカーおよびいわゆるスペーサーを有するペプチドを含めた、長い、短い、分岐ペプチドの合成が可能となる。通常、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ誘導体またはポリアルカンまたはホモポリアミノ酸であるスペーサー。固相合成法によって、対象とする分子の材料への化学選択的カップリングスキームのために、反応性官能基、例えば、遊離チオールで終結したペプチドの調製が可能となる。
特異的抗体との免疫反応性を増強するために、最終ペプチド配列中でアミノ酸の配列が反復され得る。反復性および反応性配列は、線形ペプチドにおいて無関係のアミノ酸配列で分けられ得る。また、多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）のような分岐または樹状ペプチド構築物を合成することによって、免疫反応性が増強され得る。
種々の化学保護スキームならびに固体および可溶性支持体を含めた一般的な方法論の概説については、例えば、Ｇ．Ｂａｒａｎｙ、Ｎ．Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ、Ｄ．Ｇ．Ｍｕｌｌｅｎ、Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ ｓｉｌｖｅｒ ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第３０巻、７０５〜７３９頁（１９８７年）およびＧ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．Ｎｏｂｌｅ、Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．第３５巻、１６１〜２１４頁（１９９０年）を参照のこと。
ペプチドを得るためのその他の方法として、酵素的断片連結、例えば、部位特異的突然変異誘発のような遺伝子操作技術が挙げられる。標準ＤＮＡクローニング技術を使用する、関連アミノ酸配列をコードするＤＮＡ材料のオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物またはクローニングされた断片の遺伝子操作は、ポリペプチドを得る十分に確立された方法である。あるいは、ペプチドは、タンパク質精製および消化などによる天然供給源からの単離後に得ることができる。
標的分子（例えば、ペプチド）のコンジュゲーションは、共有結合を形成することによって、または強力な結合対、例えば、イオン結合、ビオチン−アビジンを使用して達成され得る。ストレプトアビジン、アビジンおよび誘導体およびビオチンおよびビオチン類似体以外の結合実体の例として、ＡＰ−１のロイシンジッパードメイン（Ｊｕｎ ａｎｄ ｆｏｓ）、ヘキサ−ヒス（金属キレート部分）、ヘキサ−ｈａｔ ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、三価バンコマイシン、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、炭水化物、脂質およびタンパク質を含めた多様な化合物と結合するレクチン、例えば、Ｃｏｎ Ａ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）、コンカナバリンＡおよびＷＧＡ（コムギ胚芽（Ｗｈｅｔ ｇｅｒｍ）凝集素）およびテトラネクチンまたはプロテインＡまたはＧが挙げられる。これらおよびその他の方法は、コンジュゲーションのあらゆる当業者に周知である。
共有結合コンジュゲーション付与は、分解に対する抵抗性の増大を可能にする。
コンジュゲーションに有用なカップリング法は、関与する標的およびパートナーの化学構造に応じて変わる。使用される通常の化学試薬として、いわゆる長さゼロの架橋剤、ホモ二機能性、ヘテロ二機能性またはポリマー架橋剤がある。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）または１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＨＭＣ）のような長さゼロの架橋剤およびその他のカルボジイミドは、例えば、リシン残基、例えば、ペプチドのＮ末端とのＧｌｕまたはＡｓｐ間の直接カップリングを促進し得る。
グルタル（ジ）アルデヒド、イミデート、ビス−ジアゾ化ベンジジン、ビス（イミドエステル）、ビス（スクシンイミジルエステル）、ジイソシアネート、二酸塩化物、ジビニルスルホンまたは類似のもののようなホモ二機能性架橋剤によって、アミノまたはヒドロキシル基が、短いリンカー分子を介して一緒に共有結合されることが可能になる。ホルムアルデヒドまたはグルタル（ジ）アルデヒドはまた、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと対象とする分子間の架橋を促進し得る。
コンジュゲーションのあらゆる当業者に公知の方法論によって対象とする分子にＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを架橋するための、ヘテロ二機能性架橋剤の使用は、より詳細に記載されている。
ヘテロ二機能性架橋剤によって、例えば、ホモ二機能性架橋剤に頼る方法よりも、架橋にわたってより大きく制御することが可能になる。
ヘテロコンジュゲートを形成するための最も一般的なスキームは、普通、２または３ステップの反応順序によって、第２の生体分子上のチオール基に生体分子上のアミン基を間接的にカップリングすることを含む。チオールの高い反応性および多数の生体分子中のその相対的な希少性によって、チオール基は、制御された化学的架橋の理想的な標的となる。
チオール基が存在しない場合には、いくつかの方法によってチオール基を導入してもよい。スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）の使用と、それに続く、ＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いる３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルコンジュゲートの還元を含む、１つの一般的な方法。還元は、発色団２−ピリジンチオンを放出し、これは、チオール化の程度を判定するために使用され得る。
あるいは、チオール化の程度は、チオール基との反応の際に、発色団５−メルカプト−２−ニトロ安息香酸を化学量論的に生じる、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬）を使用して測定され得る。
ヘテロ二機能性架橋剤は、通常、一方の末端に、アミノ基と反応し得る、活性化されたカルボキシル基を、反対側の末端に、システイン残基のスルフヒドリル基と容易に反応する、マレイミドまたはヨードアセトアミド基を含有する。
２種の頻繁に使用されるヘテロ二機能性架橋剤として、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カーボネート（ＳＭＣＣ）がある。
架橋剤が、光活性化された反応性部分を含有し得ることは理解されなくてはならない。光反応性部分は、マスクされた反応性基として作用する。光活性カップリング法を使用することによって、共有結合カップリングのために光反応性基を使用する前に、標的分子を、例えば、対象とする分子の特定の部分中に持ち込むことが可能である。
通常、ペプチドは、Ｎ−またはＣ−末端のいずれかで単一のシステイン残基を用いて合成される。あるいは、内部Ｃｙｓ残基またはリンカー上のＣｙｓ残基が使用され得る。ペプチドがチオール基を含有しない場合には、いくつかのチオール化法のうち１種を使用して、通常、アミノ基の１個を修飾することによって、１個または複数が導入され得る。
例えば、ペプチドのような標的プローブのカップリングは、チオール選択的カップリングスキームの使用によって制限されないということは理解されなければならない。
官能基選択的またはランダムコンジュゲーションスキーム両方のためのその他の有用な化学部分として、カルボキシル、ヒドロキシル、芳香族、フェノール酸またはアミノ基が挙げられる。特に、アミノ基は、それらが適切なｐＨで極めて反応性であり、強力な化学結合を形成し得、生体材料中に広く分布しているので有用である。
リシンまたはポリリジンの側鎖のアミノ基を含めた、ペプチドのＮ−末端のアミノ基を使用してコンジュゲーションスキームを使用する可能性は、本明細書に記載される組成物および方法と特に関連性がある。
架橋剤を、まず、対象とする分子上のアミノ基と反応させ、続いて、例えば、デカントすることまたは遠心分離を使用して未反応の架橋剤を除去する。次いで、活性化された担体をＣｙｓ含有ペプチドと反応させる。過剰のペプチドを、例えば、脱塩カラム、透析、濾過または遠心分離を使用して除去する。ペプチドまたは架橋剤の量は、種々の直接または間接分析法によって評価され得る。
コンジュゲーション順序は、まず、ペプチドにヘテロ二機能性架橋剤を付着させ、次いで、対象とする分子上のチオールに付着させることによって逆転させてもよい。
コンジュゲーション反応の際に、遊離チオールは、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはトリブチルホスフィンまたは類似物を添加することによって、または保護的雰囲気を使用することによって自発的酸化から保護されることが多い。
共有結合による架橋のその他の方法として、ホモまたはヘテロ二機能性ポリマー架橋剤の使用が挙げられる。試薬の例として、トレシルまたはビニルスルホンによって活性化されたデキストランまたは活性化されたポリアクリル酸ポリマーまたは誘導体が挙げられる。特に、例えば、対象とする分子上のヒドロキシル基の活性化のためには、得られる第二級ビニルスルホンがチオールに向けて高度に反応性であるので、ジビニルが好ましい。
カップリングされたペプチドの量は、ペプチドのシステイン残基のすぐ隣に、１個のβ−アラニン残基を組み込むことを含めたいくつかの方法によって決定され得る。次いで、得られたコンジュゲートの精製後に存在するβ−アラニンの量を決定するために、アミノ酸分析が使用され得る。
架橋剤は、トレーサーまたは検出可能な部分を含む可能性を提供し得る。この部分は、生体分子と結合している架橋剤の量を測定するために使用され得る。トレーサーは、蛍光、放射活性、ハプテンまたは任意のその他の検出可能な分子であり得る。
さらなる態様
本発明のさらなる態様および実施形態を、ここで、以下の番号付けされた段落において示す；本発明が、これらの態様を包含することは理解されるべきである。
段落１。幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基である）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落２。配列番号６０〜７６の配列を含まない、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落３。（ａ）配列番号１の１位および６位のシステイン残基の間に分子内共有結合が存在するか、または（ｂ）配列番号１の１位および６位の一方または両方システイン残基が、スルフヒドリル基を有する還元されたシステインを含む、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落４。標識をさらに含む、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落５。標識が、放射性同位元素である、段落４のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落６。放射性同位元素が、１２５Ｉである、段落５のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落７。ポリペプチド断片が誘導体化される、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落８。シグナル配列をさらに含む、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落９。シグナル配列が、配列番号１９を含む、段落８のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１０。配列番号１のＮ−末端の７個のさらなるアミノ酸をさらに含み、配列番号１６２（ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を有し、配列番号１６２の１位が塩基性アミノ酸残基であり、２〜６位、８〜１０位および１３〜１５位のＸが、１個の／任意のアミノ酸残基であり、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１１。配列番号１８１〜１９７の配列を含まない、段落１０のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１２。１位の塩基性残基が、ＫまたはＲから選択される、段落１０のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１３。配列番号１のＮ−末端の８個のさらなるアミノ酸をさらに含み、配列番号１６３（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を有し、配列番号１６３の１位が、塩基性アミノ酸残基であり、２〜７位、９〜１１位および１４〜１７位のＸが、１個の／任意のアミノ酸残基であり、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１４。配列番号１６４〜１８０の配列を含まない、段落１３のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１５。１位の塩基性残基が、ＫまたはＲから選択される、段落１３のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１６。配列番号１のＮ−末端の８個のさらなるアミノ酸をさらに含み、配列番号１６３（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）の配列を有し、配列番号１６３の１位および２位が、塩基性アミノ酸残基の対であり、３〜７位、１０〜１２位および１５〜１７位のＸが、１個の／任意のアミノ酸残基であり、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する、段落１のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１７。配列番号１６４〜１８０の配列を含まない、段落１６のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１８。１位および２位の塩基性残基の対が、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫおよびＲＲから選択される、段落１６のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド断片。
段落１９。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片を作製する方法であって、（ａ）細胞においてＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基である）を含む配列をコードする核酸を発現させることであり、ポリペプチド断片が、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持すること、または（ｂ）化学合成を使用してＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む合成ポリペプチドもしくはその断片もしくは配列番号５３の配列を有する断片を作製することであり、Ｘが１個の／任意のアミノ酸残基であり、ポリペプチド断片が、幹細胞の自己複製、多能性もしくは両方を維持することとを含む方法。
段落２０。ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列をコードする核酸を発現する細胞が、細菌、真菌または酵母細胞である、段落１９の方法。
段落２１。ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む配列が、配列番号２〜３６からなる群から選択される、段落１９の方法。
段落２２。ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片が、標識をさらに含む、段落１９の方法。
段落２３。標識が、放射性同位元素である、段落２２の方法。
段落２４。放射性同位元素が、１２５Ｉである、段落２３の方法。
段落２５。ポリペプチドまたはその断片が誘導体化される、段落１９の方法。
段落２６。（ａ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、（ｂ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、（ｃ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドおよび（ｄ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドのうち１種または複数と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
段落２７。標識をさらに含む、段落２６の単離された抗体またはその抗原結合断片。
段落２８。ＥＬＡＢＥＬＡ発現を測定または検出するためのイムノアッセイキットであって、（ａ）（ｉ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、（ｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチドまたは（ｉｖ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドのうち１種または複数と特異的に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原結合断片を含むコーティング抗原と、（ｂ）前記コーティング抗原を使用するための使用説明書とを含む、イムノアッセイキット。
段落２９。単離された抗体またはその抗原結合断片が標識される、段落２８のイムノアッセイキット。
段落３０。酵素標識された試薬、単離された抗体または抗原結合断片と特異的に結合する二次抗体、固体基質またはそれらのいずれかの組合せをさらに含む、段落２８のイムノアッセイキット。
材料および方法：アクセッションコード
ヒトＥＬＡＢＥＬＡ遺伝子およびその脊椎動物相同体は、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）：ＥＮＳＧ０００００２４８３２９、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）：ＥＮＳＭＵＳＧ００００００７４３０、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）：ＥＮＳＧＡＬＧ００００００２３４４４、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）：遺伝子ＩＤはまだ存在しないが、ＵｎｉＧｅｎｅ Ｘｌ．４０６８４として規定される、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）：ＥＮＳＤＡＲＧ００００００９４７２９を用いてアクセス可能である。
材料および方法：細胞培養およびアッセイ
Ｓｈｅｆ４細胞株を全体を通して使用し、ｈＥＳＣの標準の形態学的特徴および表面マーカー特徴ならびに正常な４６ＸＹ核型を示す（ＩｎｎｉｓｓおよびＭｏｏｒｅ、２００６年）。フィーダー不含ｈＥＳＣを、マトリゲル（ＢＤ ３５４２７７）上で、ｍＴＳＥＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞塊で培養した。
一次ヒト線維芽細胞、ＳＷ１３５３軟骨肉腫（ＡＴＣＣ）およびＮＴＥＲＡ２ ｈＥＣ（Ｂａｒｂａｒａ ＫｎｏｗｌｅｓおよびＤａｖｏｒ Ｓｏｌｔｅｒからの寄贈）を、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを有する「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ）中で成長させた。
ｈＥＳＣを、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単細胞に解離し、１０μＭ Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）の存在下で１２時間プレーティングした（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年）。
ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム成長アッセイのために、Ｅ−プレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウェルあたり４０００個の細胞をプレーティングし、４８時間毎に培地交換した。
組換えＥＬＡを、２．５μＭ（または１０μｇ／ｍｌ）で添加した。細胞周期研究を、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ ＥＤＵ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、二重チミジン遮断（２．５ｍＭチミジン；１６時間遮断、８時間放出、１６時間遮断）を実施することと、それに続く、放出後の示された時間でのＤＮＡ含量のＤＡＰＩ染色によって実施した。
ＥＬＡによって活性化されたシグナル伝達経路をアッセイするために、ｈＥＳＣを解離し、ｍＴＳＥＲ１中で４８時間プレーティングした、続いて、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で２時間飢餓させた。あらゆる残存する合成バッファーを除去するためにＰＢＳに対して透析された、合成によって産生されたＥＬＡまたはＥＬＡＲＲ＞ＧＧペプチドを、５μＭ（または示されるように（Ｄ）の最終濃度で、示される期間の間添加した。適当な場合には、ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（５μＭ）およびワートマニン（１μＭ）を３０分間添加し、その後、ＥＬＡペプチドを瞬間適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにＰｈｏｓｐｈｏＳａｆｅＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて細胞を溶解した。
アポトーシスアッセイを、対照およびドキシサイクリン処理した細胞を、マトリゲル上に６時間Ｙ−２７６３２を伴わずにプレーティングし、続いて、回収し、アネキシンＶおよび活性化カスパーゼ３について染色することによって実施した。
アポトーシスを誘導するために、ｈＥＳＣを、示された用量のアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）または電離放射線を用いて処理し、処理の１２時間後に、Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはカスパーゼ ＧＬＯ３／７（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを続けた。
インスリン置換アッセイのために、ＳＨＥＦ４またはＨＥＳＣ３ ｈＥＳＣを、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充し、インスリン（１０μｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ）を含むか、含まないＴＳＥＲ−Ｅ５（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。
胚様体分化を、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、Ａｇｇｒｅｗｅｌｌ４００プレートのウェルあたり１００万個の細胞をプレーティングし、続いて、回収し、低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に再プレーティングすることによって実施した。
示された期間の後、胚様体を回収し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｑＰＣＲ反応を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した、またはＴａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と並行してＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙシステム（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを使用して実施した。プライマー配列は、表Ｅ１中に見出すことができる。
材料および方法：ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ媒介性ＥＬＡノックダウン
ｈＥＳＣにおいてＥＬＡの安定な誘導性ノックダウンを作製するために、ＥＬＡの３’ＵＴＲをターゲッティングする配列ＧＴＧＡＴＴＣＴＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＣ（配列番号１３２）をｐＳＵＰＥＲＩＯＲ（Ｏｌｉｏｇｏｅｎｇｉｎｅ）中にクローニングし、Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５ ｈＥＳＣ中にヌクレオフェクトした（Ｌｏｎｚａ）（Ｚａｆａｒａｎａら、２００９年）。ネオマイシン耐性細胞をクローン増殖させ、ドキシサイクリン（２０ｎｇ／ｍｌ）誘導性ノックダウンについてアッセイした。１種の代表的なクローン（Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５ ｓｈＥＬＡ）から得たデータを本明細書に示す。Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５ ｓｈβ２Ｍは、これまでに記載されたように導いた（Ｚａｆａｒａｎａら、２００９年）。別に記載されない限り、ＥＬＡノックダウンを、２０ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンを用いて−４日目に誘導して、ｓｈＥＬＡ細胞を作製した。
抗ＥＬＡ ｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって産生した二本鎖全長ＥＬＡ ｍＲＮＡのＲＮアーゼＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）切断によって産生した。アッセイに先立って４８〜７２時間、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡをｈＥＳＣ中にトランスフェクトした。
ＰＯＵ５Ｆ１ノックダウン
Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５におけるＰＯＵ５Ｆ１の誘導性ノックダウンを、Ｚａｒａｆａｎａおよび共同研究者によってこれまでに報告されたように実施した（Ｚａｆａｒａｎａら、２００９年）。手短には、Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５ ｓｈＰＯＵ５Ｆ１ ｈＥＳＣを、５ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下（ｓｈＰＯＵ５Ｆ１）または非存在下（対照）で示された期間培養し、ｑＰＣＲ分析のために回収した。
材料および方法：抗体
ヒトＮ末端エピトープ（ｎｈ２−ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ）（配列番号５３）、Ｃ末端エピトープ（ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ−ｃｏｏｈ）（配列番号５３）または分子内シスチン結合を有する全成熟ＥＬＡＢＥＬＡペプチド（ｎｈ２−ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ−ｃｏｏｈ）（配列番号２）およびウサギおよびヤギ血清からペプチド親和性精製したものに対するポリクローナル抗体を作製した。
細胞外中和アッセイのために、ウサギαＮおよびαＣ親和性精製抗体をＰＢＳ中で４℃で一晩透析し、１０μｇ／ｍＬでｈＥＳＣ培養物に添加した。ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光アッセイのために、ＥＬＡ抗体を１μｇ／ｍＬで使用した。すべてのその他の抗体は市販されている：ＴＧＮ−４６（Ｓｅｒｏｔｅｃ ＡＨＰ５００ＧＴ番）；ＳＳＥＡ−３（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ ６００６１ＡＤ番）；ＴＲＡ−１−６０（ＢＤ ５６０１７３番）；ＳＯＸ１７（Ｒ＆Ｄ ＡＦ１９２４番）；ＰＯＵ５Ｆ１（ＳＣＢＴ ｓｃ−５２７９番）。
材料および方法：発生学的方法
受精、マイクロインジェクション、分泌アッセイおよびホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）のプロトコールは、本発明者らのプロトコールウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｖｅｒｓａｄｅ．ｃｏｍ−ａ．ｇｏｏｇｌｅｐａｇｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／）にあり、また、以下に示す。
ツメガエル卵のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精
Ｎａｔｈａｌｉｅ Ｅｓｃａｎｄｅ−Ｂｅｉｌｌａｒｄ、２００９年３月
このプロトコールは、マイクロインジェクションおよび実験操作の準備のできた、多量の同調的、ゼリー除去胚を得るための、ツメガエル卵のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を説明する。
１日目−排卵の誘導
１．実績のある種親のアフリカツメガエル色素有およびアルビノを、Ｎａｓｃｏ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎａｓｃｏ．ｃｏｍ／ｘｅｎｏｐｕｓ／）から購入した。
２．大きな腹部および赤色の総排出腔を有する雌の種親を、これらは、普通、産卵の準備ができている印であるので選ぶ。
３．８００ユニット（８００μｌ）のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）を、雌のカエルの背側リンパ嚢に注射する。各側に半容量を注入する。ニードルを、側線感覚器の近くの後肢の高さで後側に入れる。しっかりと押して皮膚を貫通し、次いで、シリンジを背中とほぼ平行に保持する。
４．カエルを別のバケツに入れ、炭濾過水で満たし、覆う。
５．室温（２３℃）で維持されたカエルは、排卵の誘導の約９〜１０時間後に産卵を始めるが、１５℃で維持されたカエルは、注射のおよそ１４時間後に産卵を始める。
６．排卵後、カエルは再度誘導される前に３カ月休息する必要がある。
２日目−ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精
１．朝、雌を炭濾過水で希釈した、１Ｘ高塩Ｂａｒｔｈ溶液中に入れる。それらを別個のバケツ中で維持する。
２．１〜２時間後、卵を集め始める。カエルが良好に産卵する場合、１時間毎に卵を集めることが可能である。卵を集めるために、弓のこで先端が切られたわずかなチップを有していた２５ｍｌのピペットが装備されたピペットマンを使用する。卵を集めながら、常に、ピペットマンを遅い設定に設定しておく。受精のプロセスの間すべての時点で、卵の何らかの撹乱をできる限り避けるよう努める。卵を、バッファーの量をできる限り制限するよう努めながら、１００ｍｍのガラスペトリディッシュ中にピペットで入れ、プレートの表面を約１／３覆う。任意の余分なバッファーを注意深くピペットで除去する。
３．卵がどのカエルに由来するかに従って、ラベルを、ガラスペトリディッシュに、底部のディッシュの側面および蓋の頂部に付ける。どのカエルが良好な卵を与えるかを知ることは極めて重要である。
４．雄を屠殺し、精巣を切り取る。精巣を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で４℃で維持する。
５．パスツールピペットを使用し、ディッシュを傾けて、１×高塩Ｂａｒｔｈをできる限り多く取り除く。キムワイプを使用して、できる限り多くのバッファーを吸い取る（ディッシュを傾けて維持しながら）。
６．１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに約１ｍｌのＳｔｅｉｎｂｅｒｇ溶液を添加する。精巣の小片を切除し、チューブ中でハサミを用いて刻む。約５〜１０滴のこの溶液を、卵上に添加する。常に、新鮮な精巣を刻む。
７．ディッシュを覆い、室温で５分間インキュベートする。
８．０．１×Ｂａｒｔｈを注意深く添加する。浮遊している卵はいずれも、予め湿らせた指先で沈める。ディッシュを覆い、ディッシュでの受精の時間をディッシュの蓋に書き留める。０．１×Ｂａｒｔｈを添加したときに精子が卵に入る。室温で２０分間インキュベートする。胚は回転しなくてはならず、将来の動物極（有色素側）が上でなくてはならないことは留意されたい。
９．水をデカントして、パスツールピペットを用いて過剰の水を除去する。浮遊している卵はいずれも指先で穏やかに押して沈めながら、新鮮なシステイン溶液を添加する（卵に触れる前に指をシステイン中に入れ、それらが指に粘着することを防ぐ）。
室温で８分間インキュベートする。このステップによって、卵の周囲のゼリーの完全な除去が可能になる。
１０．デカントし、新鮮なシステイン溶液を添加する。３分間インキュベートする。
１１．システイン溶液をデカントし、０．１×Ｂａｒｔｈを用いて少なくとも６回洗浄する。
１２．０．１×Ｂａｒｔｈ中で卵をインキュベートする。室温で培養された胚は、受精の１時間２０分後に２細胞段階であるはずである（ステップ７）。
１３．胚が、１％アガロース溶液のクッションで覆われた５０ｍｍプラスチックペトリディッシュ中で０．１×Ｂａｒｔｈ中で培養されることを留意されたい。
１４．２日目の最後に雌を正規のタンク中に戻すことを忘れない。
溶液
１０×高塩Ｂａｒｔｈ溶液
４Ｌのビーカーをナノピュア水で３Ｌまで満たし、以下を添加する：
２５ｍｌのナノピュア水に各々を溶解させた後、以下を滴加する：
ｐＨを、ＨＣｌを用いて７．７に、ナノピュア水で４Ｌにする。１×希釈を作製する場合には、１リットルあたり１ｍｌの５％アンピシリンを添加する。
１０×Ｂａｒｔｈ溶液
５００ｍｌのビーカーをナノピュア水で３５０ｍｌまで満たし、以下を添加する：
２５ｍｌのナノピュア水に各々を溶解させた後、以下を滴加する：
ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．６に。ナノピュアＨ２Ｏで５００ｍＬにする。１×および０．１×希釈を作製する場合には、１リットルあたり１ｍｌの５％アンピシリンを添加する。
１０×Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ溶液
１リットルのビーカーをナノピュア水で８００ｍｌまで満たす。
ｐＨを、ＨＣｌを用いて７．３５〜７．４５に、容量をナノピュアＨ２Ｏで１Ｌに調整する。
２％システイン溶液
１Ｌのビーカーを、０．１×Ｂａｒｔｈを用いて８００ｍＬまで満たす。２０ｇのＬ−システイン塩酸塩一水和物を添加する。ｐＨを、ＮａＯＨを用いて７．８に。０．１×Ｂａｒｔｈを用いて１リットルにする。
５％アンピシリン
１００ｍｌのナノピュアＨ２Ｏに５グラムのアンピシリンを溶解する。濾過滅菌し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の１ｍｌのアリコートを作製し、−２０℃で保存する。
アガロースペトリディッシュの調製
アガロースを水に１％に溶解し、マイクロ波で融解し、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加する。ペトリディッシュに５ｍｌのアガロース溶液を注ぐ。ひと度、冷却し、室温で凝結させれば、ペトリディッシュを４℃で保存する。
化学物質
１．１０ｍｌの水で再構成した、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン１００００ユニット／バイアル。４℃で維持。Ｓｉｇｍａ ＣＧ１０−ＩＶＬ番。
２．システイン塩酸塩一水和物。Ｓｉｇｍａ Ｃ７８８０−５００Ｇ番。
３．アンピシリン。Ｓｉｇｍａ Ａ９５１８番。
ゼノパス属胚のマイクロインジェクション
このプロトコールは、モルホリノ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質またはその他の化学物質を使用する、機能の獲得および喪失研究のためのゼノパス属胚のマイクロインジェクションを説明する。
１日目−注入
１．マイクロインジェクションのための胚を、本明細書に記載されるツメガエル卵のｉｎ ｖｉｔｒｏ受精：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｖｅｒｓａｄｅ．ｃｏｍ−ａ．ｇｏｏｇｌｅｐａｇｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに従って得る。
２．マイクロピペットプラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリー製のニードルを引っ張る。引っ張られたニードルは、繊細であるのでセーフボックス中に入れる。
３．プラスチックチューブを用いてニードルを微量注入器に連結し、組み立てられたニードルをミクロマニピュレーター上に置く。
４．実体顕微鏡下で、ピンセットを用いてその細い末端の小さいセグメントを上手く切断することによってニードルを調整する。調整する目的で、１×Ｂａｒｔｈ溶液が使用され得る。
細胞質注入のために、２０〜２５ＰＳＩの間の注入圧を用いて１秒で４ｎｌを送達するよう、ニードルを調整する。薄すぎるニードルは、容易に詰まり、充填することが困難となる。大きすぎるニードルは胚に損傷を与え、細胞質の漏出につながる。
４’．胞胚腔注入のためには、２０〜２５ＰＳＩの間の注入圧を用いて２秒で５０ｎｌを送達するよう、ニードルを調整する。
５．ひと度調整すれば、ニードルを空にし、所望の溶液でのニードルの充填を開始する。
充填するために、ニードルを、数μＬの注入するための溶液を含有する黄色チップ中に注意深く入れる。キャピラリー内の溶液の進行をモニタリングする。空気が引き込まれる前に停止する。
６．１×Ｂａｒｔｈで満たした、アガロースペトリディッシュを調製する。スポイトを用いて胚を穏やかにピペッティングして、１×Ｂａｒｔｈディッシュ中に入れる。倍率、焦点、照明、椅子の位置を調整し、焦点を合わせ、前腕をバンチに乗せる。注入する準備が整う。
７．充填されたニードルを胚に近づけ、ピンセットで胚を適所に保持し、卵膜および細胞膜を通ってニードルを穏やかに挿入する。ひと度、内側に入れば、微量注入器と連結している足ふみペダルを圧縮することによって注入する。１秒で４ｎＬが胚に送達される。胚を保持することによってニードルを除去する。すべての胚が標的とされる場合には４−細胞段階の各卵割球に微量注入する。
７’．胞胚腔注入のためには、段階７〜８に達するまで胚を培養する。１×Ｂａｒｔｈ中に入れ、動物極キャップのすぐ下に位置する胞胚腔中に微量注入する。胞胚腔中に５０ｎｌが送達されるので、胚の膨張を確認するはずである。
８．ひと度、胚が１×Ｂａｒｔｈで注入されれば、それらを新鮮な０．１×Ｂａｒｔｈディッシュ中に移す。ディッシュの蓋に表示を付ける。注入されていない胚を維持することを忘れてはならない。対照胚は、同一受精パッチおよび母カエルに由来するものでなければならない。
９．胚を、０．１×Ｂａｒｔｈ中で、発達を減速させるために１３℃（下回らない）で、またはより速い発達のために最大２２℃で培養する。
２日目−胚の世話をする
１．毎日、死滅した胚を除去する。細いピンセットを使用して卵膜を除去し、スポイトを使用して、胚を、０．１×Ｂａｒｔｈで満たした新鮮なディッシュに入れる。
２．段階２０までは、胚を１×Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇで培養することが好ましい。
３．胚を固定するために、スポイトを用いてガラスバイアル中の２ｍｌのＭＥＭＦＡ中に胚を滴加する。穏やかに振盪しながら、室温で２時間または４℃で一晩固定する。
４．メタノールシリーズ（ＰＢＳ １×中、２５％、５０％、７５％、２×１００％）によって脱水する。胚は、１００％メタノール中、−２０℃で保存できる。
５．ゼノパス属のためのホールマウントＩｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｖｅｒｓａｄｅ．ｃｏｍ−ａ．ｇｏｏｇｌｅｐａｇｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されたプロトコールをたどる。
溶液
１０×Ｂａｒｔｈ溶液
５００ｍｌのビーカーをナノピュア水で３５０ｍＬまで満たし、以下を添加する：
２５ｍｌのナノピュア水に各々を溶解させた後、以下を滴加する：
ＮａＯＨを用いてｐＨ７．６にする。ナノピュアＨ２Ｏで５００ｍＬにする。１×および０．１×希釈を作製する場合には、１リットルあたり１ｍｌの５％アンピシリンを添加する。
１０×Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ溶液
１リットルのビーカーをナノピュア水で８００ｍｌまで満たす。
ｐＨを、ＨＣｌを用いて７．３５〜７．４５に。容量をナノピュアＨ２Ｏで１Ｌに調整する。
１０×ＭＥＭ
１Ｌを作製するため。
ｐＨを、１０Ｍ ＮａＯＨを用いて７．４に調整し、濾過し、４℃で保存する。
ＭＥＭＦＡ １×
各回、小容量の１×を調製する。１００ｍｌについて、１０ｍｌの１０Ｘ ＭＥＭ、１０ｍｌのホルムアルデヒド（３７％）、８０ｍｌの水。
アガロースペトリディッシュ
アガロースを水に１％に溶解し、マイクロ波で融解し、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加する。ペトリディッシュに５ｍｌのアガロース溶液を注ぐ。ひと度、冷却し、室温で凝結させれば、ペトリディッシュを４℃で保存する。
機器
ニードルプラー：ＳＵＴＴＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ ＣＯ．。Ｆｌａｍｉｎｇ／ｂｒｏｗｎ型マイクロピペットプラーモデルＰ−９７
ニードル：Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．ホウケイ酸ガラスキャピラリー品目番号：ＴＷ１００−６
微量注入器：Ｈａｒｖａｒｄ ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＰＬＩ−１００ ＯＲ ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ ＩＭ ３００微量注入器
ミクロマニピュレーター：Ｓｉｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｍｋ１ミクロマニピュレーター
実体顕微鏡：Ｌｅｉｃａ ＭＺ１２．５またはＭＺ９．５
光源：Ｌｅｉｃａ ＣＬＳ １５０Ｘ
ピンセット：ＤＵＭＯＮＴ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製のＲｕｓｔｌｅｓｓ ＤＵＭＯＸＥＬ ３番または５番 ＦＳＴ
スポイト：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｐｅｔ Ｓｔｒａｉｇｈｔ Ｍｅｄ Ｄｒｏｐ ＦＩＳ １３−７００番
ガラスバイアル：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ バイアルＳＴ Ｗ／ Ｃｌｏｓｕｒｅ １ＤＲ ＦＩＳ ０３−３９９−２５Ｂ番
ゼノパス属ホールマウントＩｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＩＳＨは、遺伝子の時空間的発現パターンを決定するために使用される方法である。
アンチセンスＲＮＡプローブの合成
１．適した酵素を用いて消化することによって、ＤＮＡプラスミドを線状化する。例えば、アガロースゲルで１μｌのＤＮＡを流すことによって完全消化を調べる。＊＊すべての条件は、ＲＮアーゼ不含でなくてはならない：手袋およびフィルターチップを使用する。
２．ＤＮＡをフェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させるか、またはＤＮＡを浄化するためのキットを使用する。
３．ＤＮＡを適した容量のＲＮアーゼ不含水に再懸濁して、およそ０．５または１μｇ／μｌを得る。ＤＮＡ濃度を測定する（ｎａｎｏｄｒｏｐ）。
４．転写反応を設定する：１０００〜２０００ｎｇのＤＮＡ、４μｌの１０×転写バッファー、４μｌの標識混合物（ジゴキシゲニン）、１μｌのＲＮＡガード（４０Ｕ／μｌ）、４μｌのＲＮＡポリメラーゼ（２０Ｕ／μｌ）、４０μｌまでのＲＮアーゼ不含水。
５．３７℃で４〜５時間インキュベートする。
６．ＤＮアーゼ用いて３７℃で２０分間処理する（１ユニットの酵素／μｇのＤＮＡ）。
７．Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎカラムを用いて組み込まれていない遊離ヌクレオチドを除去する。
・気泡を避けるために、最初に、カラムからトップキャップを、次いで、ボトムキャップを除去する。
・スイングバケット遠心機で、４℃、１８００ｒｐｍで５分間回転させる。
・溶出液を除去し、さらに５分間回転させる。
・カラムを新規（表示された）チューブ中に入れ、ピペットチップを用いて樹脂を撹乱することなく、転写反応物を加え、それをカラムの中心に直接添加することを確実にする。
・４℃、１８００ｒｐｍで１５分間回転させる。
８．ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＲＮＡ収率を定量化して、ＩＳＨのためにどのくらい使用するべきかを決定する。
９．１μｌを用いてゲルに流して、予測される大きさおよびプローブの品質を確認する。
一般的な注釈
使用されるすべての処方およびほとんどの化学物質は、本プロトコールの最後にそのベンダーおよびカタログ番号とともに列挙されている。ＲＮアーゼ不含条件において作用するために極めて重要なこと。固定ステップからハイブリダイゼーションの最後まで手袋およびフィルターチップを使用する。
１日目
１日目のすべてのステップは、プロテイナーゼＫ処理（ステップ３番）を除いて氷上で行う。示されない限り、各洗浄のために少なくとも２ｍｌのバッファーを使用する。
１．ＰＢＳｗ中のメタノールシリーズ（７５％、５０％、２５％）によって胚を再水和する。各再水和ステップは、５分間インキュベートする。
２．ＰＢＳｗを用いて、各５分間、３回洗浄する。
３．胚をＰＢＳｗ中、１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて（チューブあたり１ｍｌ）室温で８分間処理する。高度に発現される遺伝子の染色は、短い消化を必要とするが、より長い消化は、低い発現の遺伝子に役立ち得る。８分を超えない！
４．ＰＢＳｗ中の２ｍｇ／ｍｌグリシンを用いて洗浄することによって消化を停止する。
５．ＰＢＳｗを用いて高速洗浄を行い、次いで、ＰＢＳｗを用いて、各５分で２回洗浄する。
６．５ｍｌの、ＰＢＳｗ中の４％パラホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒド中で１５分間、胚を再固定する。各回でバッファーを新鮮にする。
７．ＰＢＳｗを用いて高速洗浄を行い、次いで、ＰＢＳｗを用いて、各５分で３回洗浄する。
８．１ｍｌの５０％ ＰＢＳｗ／５０％ハイブリダイゼーション溶液中で３分間洗浄する。
９．１ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（１００％）中で３分間洗浄する。胚はまた、ハイブリダイゼーション溶液中、−２０℃で、このステップで保存できる。
１０．１ｍｌのハイブリダイゼーション溶液を４００μｌのハイブリダイゼーション溶液で交換し、６５℃で３時間プレハイブリダイズする。
１１．１００μｌのハイブリダイゼーション溶液中の適当な量のプローブを、９５℃で５分間変性させる。氷上に置き、ボルテックス処理し、この混合物を胚に添加し、７０℃で一晩ハイブリダイズする。
２日目
１．プローブ／ハイブリダイゼーション混合物を除去し、８００μｌのハイブリダイゼーション溶液と交換する。７０℃で５分間洗浄する。
２．各バイアルに４００μｌの２×ＳＳＣ（ｐＨ４．５）を添加する。７０℃で５分間インキュベートする。
３．前のステップをさらに２回反復する（最終容量＝８００μｌ＋４００μｌ＋４００μｌ＋４００μｌ＝２０００μｌ）。各回、７０℃で５分間インキュベートする。
４．混合物を回収し、２×ＳＳＣ（ｐＨ７）／０．１％ ＣＨＡＰＳを用いて、７０℃で３０分間、２回洗浄する。
５．ＭＡＢ中、室温で各１０分間、２回洗浄する。
６．ＭＡＢ中、７０℃で各３０分間、２回洗浄する。
７．ＰＢＳ中、室温で各１０分間、２回洗浄する。
８． ＰＢＳｗ中、室温で５分間洗浄する。
９．１ｍｌの抗体バッファー（抗体を含まない）中、４℃で振盪しながら最小２時間、胚をインキュベートする。
１０．この時、同様に、抗体バッファー中の抗体を４℃で振盪しながら２時間、プレブロッキングする：１５０ユニット／２００μｌのストックからの抗−Ｄｉｇ−アルカリホスファターゼ希釈１：５０００。１５０ユニット／ｍｌのストックからの抗−Ｄｉｇ−ペルオキシダーゼ希釈１：２００。
１１．抗体バッファーを１．５ｍｌのプレブロッキングされた抗体と交換する。浸透しながら４℃で一晩インキュベートする。すべてが溶液中に浸漬される（ガラスの蓋にはまっていない）ことを確実にするよう胚を調べる。
３日目
１．ＰＢＳｗ中の０．１％ ＢＳＡを用いて胚を高速洗浄する。
２．ＰＢＳｗ中の０．１％ ＢＳＡで、振盪しながら、各洗浄で１時間室温で５回洗浄する。
３．ＰＢＳｗ中で、各３０分間、室温で２回洗浄する。
４．ＡＰ１バッファー中で、ＢＭ Ｐｕｒｐｌｅ染色のために各１０分間、２回洗浄する。
５．ＡＰ１バッファーを１ｍｌ ＢＭ Ｐｕｒｐｌｅで交換し、アルミホイルで覆い、所望の染色が達成されるまで浸透しながらインキュベートする。すべてが溶液中に浸漬される（ガラスの蓋にはまっていない）ことを確実にするよう胚を調べる。染色時間は、発現のレベルおよびプローブ品質に応じて変わる。反応を４℃で一晩起こさせることが推奨される。室温では、胚は、より多くのバックグラウンドを生じる。
４日目
１．停止溶液中で各１５分間２回洗浄することによって染色反応を停止する。キャップを同様にすすぐ。
２．メタノールシリーズ（２５％、５０％、７５％、２×１００％）によって脱水する。胚は、メタノール中、−２０℃で保存できる。
３．任意選択：色素沈着または過度のバックグラウンドを除去するために、また対比を増強するために、３ｍｌの新鮮な漂白溶液を用いて胚を漂白してもよい。プロセスを加速するために、チューブをアルミホイル上、強いネオン光下に数時間〜一晩置く。
４．胚をメタノール１００％中に戻す。
溶液
１０×保存溶液を希釈する場合には、ＤＥＰＣ処理水およびフィルターを使用する。すべてのその他のバッファーは、ＤＥＰＣ処理水を、次いで、フィルターを使用して作製する。
ＤＥＰＣ処理バッファーまたは水
０．１％ ＤＥＰＣを添加する。完全に溶解するまで撹拌しながらインキュベートし、オートクレーブ処理する。
１０×ＰＢＳ
８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ、１４．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４、２．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、８００ｍｌの蒸留水（ＤＤＷ）。溶解させ、ｐＨを７．４にし、ＤＤＷを１Ｌまで添加し、ＤＥＰＣ処理し、オートクレーブ処理する。
ＰＢＳｗ
０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ。ＤＥＰＣ処理し、オートクレーブ処理する。
２０ｘ ＳＳＣ
１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸ナトリウム、８００ｍｌのＤＤＷ。溶解し、ｐＨを７．０にし、ＤＤＷを１Ｌまで添加し、ＤＥＰＣ処理し、オートクレーブ処理する。
４％パラホルムアルデヒド
パラホルムアルデヒドを新鮮なＰＢＳ（１００ｍｌに対して４ｇ）に溶解する。６０℃で加熱し、完全に溶解するまで混合する。氷上で冷却し、フィルター処理し、アリコートに分け、−２０で保存する。
ハイブリダイゼーション溶液
１Ｌを作製し、フィルター処理し、アリコートに分け、−２０℃で保存する。１０ｇのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｂｌｏｃｋ、５００ｍｌのホルムアミド、２５０ｍｌの２０×ＳＳＣ。６５℃で１時間加熱する。１２０ｍｌのＤＥＰＣ処理水、１００ｍｌのＴｏｒｕｌａ ＲＮＡ（水中、１０ｍｇ／ｍｌ；フィルター処理）、２ｍｌのヘパリン（１×ＳＳＣ中、５０ｍｇ／ｍｌ）、５ｍｌの２０％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１０ｍｌの１０％ ＣＨＡＰＳ、１０ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ
ＭＡＢ
１００ｍＭのマレイン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７．５
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッキング溶液（１０％）
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッキング試薬をマレイン酸バッファー（ＭＡＢ）（１００ｍｌに対して１０ｇ）に溶解する。加熱し、頻繁にボルテックス処理して、完全に溶解する。保存溶液として−２０℃で保存する。
抗体バッファー
１０％の熱不活化ヤギ血清、１０％のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒブロッキング保存溶液。８０％のＰＢＳｗ。７０℃で１０分間加熱し、ボルテックス処理し、氷上で冷却し、フィルター処理する。アリコートに分け、−２０℃で保存する。
ＡＰ１バッファー
０．１ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ９．５、５０ｍＭのＭｇＣｌ２
停止溶液
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ
漂白溶液
２／３メタノール１００％、１／３ヒドロキシドペルオキシド（Ｈｙｄｒｏｘｙｄｅ Ｐｅｒｏｘｙｄｅ）３１．５％（最終１０．５％）、毎回新鮮なものを作製する。
プローブを作製するための化学物質
Ｄｉｇ ＲＮＡ標識混合物（１０×）−Ｒｏｃｈｅ １２７７０７３番、Ｆｌｕ ＲＮＡ標識混合物（１０×）−Ｒｏｃｈｅ １６８５６１９番、転写バッファー（１０×）−Ｒｏｃｈｅ １４６５３８４番、ＲＮＡ Ｇｕａｒｄ−Ｒｏｃｈｅ ３３３５３９９番、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ−Ｒｏｃｈｅ １０３１１６３番、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ−Ｒｏｃｈｅ ８８１７６７番、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ−Ｒｏｃｈｅ ８１０２７４番、Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎカラム−Ｒｏｃｈｅ １２７４０１５番、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット−Ｑｉａｇｅｎ ２８７０６番
ＩＳＨのための化学物質
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｂｌｏｃｋ−Ｒｏｃｈｅ １０９６１７６番、プロテイナーゼＫ−Ｇｉｂｃｏ ２５５３０−０４９番、抗Ｄｉｇ−ＡＰ−Ｒｏｃｈｅ １０９３２７４番、抗Ｆｌｕ−ＡＰ−Ｒｏｃｈｅ １４２６３３８番、抗Ｄｉｇ−ＰＯＤ−Ｒｏｃｈｅ １２０７７３３番、抗Ｆｌｕ−ＰＯＤ−Ｒｏｃｈｅ １４２６３４６番、ＢＭ Ｐｕｒｐｌｅ−Ｒｏｃｈｅ １４４２０７４番、過酸化水素３１．５％−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ３８６７９０番。
ＺＦＮは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２５０ｐｇの、ＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡを１細胞段階の胚に注入した。エキソン１内のＺＦＮ結合部位は、５’＿ＴＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴ＿３’（配列番号１３３）および５’＿ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴ＿３’（配列番号１３４）である。突然変異部位のそれぞれの両端に位置する配列決定プライマーは、フォワード５’＿ＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＧ＿３’（配列番号１３５）、リバース５’＿ＡＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＴＡＧＣ＿３’（配列番号１３６）である。ｅｌａ過剰発現のために、２００ｐｇのＳＰ６転写ゼブラフィッシュｅｌａキャップ化ｍＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１細胞段階のゼブラフィッシュ胚中に注入した。ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂのために使用される翻訳ブロッキングＭＯは、これまでに記載されており（Ｓｃｏｔｔら、２００７年；Ｚｅｎｇら、２００７年）、Ｇｅｎｅ ｔｏｏｌｓ（ＵＳＡ、オレゴン州）から購入した。胚は、１ｎｇのａｐｌｎｒａ ＭＯおよび０．５ｎｇのａｐｌｎｒｂ ＭＯの組合せを用いて１細胞段階で注入された（Ｚｅｎｇら、２００７年）。ｑ−ＰＣＲおよびＷＩＳＨのために使用されるプローブに関する情報は、表Ｅ１およびＥ２に見出すことができる。１００％被包期でのゼブラフィッシュ胚を卵膜除去し、これまでに記載されたように（Ｌｉｎｋら、２００６）ウエスタンブロッティングのために処理した。ゼノパス属分泌アッセイのために、１６ｎｇのＳＰ６転写ヒトＥＬＡキャップ化ｍＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、４細胞段階胚の各細胞中に注入した。段階８で、胚を卵膜除去し、５ｍＭ ＥＤＴＡを有するＣＭＦＭ培地中で解離した。１０個の胚の細胞ペレットを、１．５ｍＬのチューブ中に移し、４０μｌの、ＢＦＡを含むか、含まない新鮮ＣＭＦＭ培地中で、室温で２４時間、分泌を可能にした。すべての細胞からコンディショニングされた上清を注意深く枯渇させ、その後、１６．５％ Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅプレキャストゲル（ＢｉｏＲａｄ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。
材料および方法：ＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイのために、ヤギαＣ抗体（４μｇ／ｍｌ）を、捕獲抗体として使用し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ｖ／ｖ）中、３％ ＢＳＡを用いてブロッキングした。ｈＥＳＣを、ｍＴＳＥＲ１中で２４時間培養し、上清を回収し、捕獲抗体とともに室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴを用いて５回洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン発色基質を用いる検出のために、３％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中、ウサギαＣ（０．８μｇ／ｍＬ）と、続いて、抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ、０．１２μｇ／ｍｌ）を使用した。既知濃度の組換えＥＬＡペプチド（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット）を使用して、標準曲線を作製した。
材料および方法：ＡＰ−ＥＬＡ結合アッセイ
ゼノパス属コーディン由来のＮ末端シグナル配列を含有するアルカリホスファターゼＯＲＦの３’末端とインフレームで、ＥＬＡの成熟Ｃ末端３２マーをクローニングすることによってＡＰ−ＥＬＡ融合構築物を作製した（ＲｅｖｅｒｓａｄｅおよびＤｅ Ｒｏｂｅｒｔｉｓ、２００５年）。この構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトし、血清不含培地中への分泌を４８時間可能にした（Ｐｒｏ２９３ａ ＣＤＭ、Ｌｏｎｚａ）。得られた上清を、試験細胞とともに３時間インキュベートし、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、溶解し、６５℃で加熱して内因性アルカリホスファターゼを不活性化した。次いで、発色現像のために、溶解物を、ＢＭ Ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃でインキュベートした。
材料および方法：統計分析
群間の相違の統計的有意性を分析するために、研究にわたって、手段、両側独立スチューデントＴ検定を使用した。有意性レベルは、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）、＊＊＊（ｐ＜０．００１）によって示されている。
特に断りのない限り、すべての値が、平均±ＳＥＭとして表されている。手段の比較は、Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄにおいて両側スチューデントの独立ｔ検定を使用して実施し、有意レベルは、ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１のように示した。
材料および方法：ＤＮＡ構築物および部位特異的突然変異誘発
ゼブラフィッシュａｐｌｎｒａ、ａｐｌｎｒｂおよびｅｌａｂｅｌａ ＯＲＦを、８０％−被包期 ｃＤＮＡからベクターｐＣＳ２＋に、制限部位ＢａｍＨＩとＸｂａＩの間にクローニングした。ヒトＡＰＬＮＲおよびＧＰＲ１５ ＯＲＦを、ヒトゲノムＤＮＡからｐＣＳ２＋に、制限部位ＢａｍＨＩとＸｂａＩの間にクローニングした。使用されるプライマーは、表Ｅ３に見出すことができる。ａｐｌｎｒｂｇｒｉｎｃｈ（ａｐｌｎｂＷ９０Ｌ）は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、プライマー対：
５’＿ＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＴＧＴＴＧＧＣＣＧＴＣＴＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧ＿３’（配列番号１４５）および
５’＿ＣＡＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＧＡＣＧＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＡＧ＿３’（配列番号１４６）
を用いて作製した。
材料および方法：ｓｉＲＮＡ媒介性ＥＬＡノックダウン
抗ＥＬＡｓｉＲＮＡを、Ｔ７ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって産生した二本鎖全長ＥＬＡ ｍＲＮＡのＲＮアーゼＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）切断によって産生した。ｓｉＲＮＡを、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｈＥＳＣ中に４８〜７２時間トランスフェクトし、その後アッセイした。
材料および方法：ＰＯＵ５Ｆ１ノックダウン
ＰＯＵ５Ｆ１はまた、ＯＣＴ−４としても知られている。Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５においてＰＯＵ５Ｆ１の誘導性ノックダウンを、Ｚａｒａｆａｎａおよび共同研究者によってこれまでに報告されたように実施した（Ｚａｆａｒａｎａら、２００９年）。手短には、Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５ ｓｈＰＯＵ５Ｆ１ ｈＥＳＣを、５ｎｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下（ｓｈＰＯＵ５Ｆ１）または非存在下（対照）で、示された期間培養し、ｑＰＣＲ分析のために回収した。
材料および方法：ルシフェラーゼリポーターアッセイ
座標ｃｈｒ４：１６５，７９６，８０６〜１６５，７９８，３５９（ｈｇ１９）の間に位置するＥＬＡプロモーターを、ヒトゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のホタルルシフェラーゼリポーター遺伝子の上流にクローニングして、ｐＧＬ３−ＥＬＡｐｒｏｍｏｔｏｒを作製した。ｐＧＬ３−ＥＬＡｐｒｏｍｏｔｏｒ＋ＰＯＵ５Ｆ１ｅｎｈａｎｃｅｒを作製するために、ＴＲＡＮＳＦＡＣによって予測されるような（Ｍａｔｙｓら、２００６）いくつかのＰＯＵ５Ｆ１推定結合部位を含有する、座標ｃｈｒ４：１６５，７８７，５７０〜１６５，７８８，７９７（ｈｇ１９）の間に位置するＰＯＵ５Ｆ１エンハンサー領域を、ヒトゲノムＤＮＡからクローニングし、ｐＧＬ３−ＥＬＡｐｒｏｍｏｔｏｒ中のＥＬＡプロモーターの５’に挿入した。これらの構築物を、ｈＥＳＣ（Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット、Ｌｏｎｚａ）中に、ｐＲＬ−ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と一緒に２４時間ヌクレオフェクトした。Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、正規化したホタル活性を測定した。
材料および方法：奇形腫分析
Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５−ｓｈＥＬＡ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下（ｓｈＥＬＡ）または非存在下（対照）で３継代（４日／継代）の間培養した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を回収し、１部のマトリゲル対２部のｍＴＳＥＲ１中に再懸濁した。２００μｌ中、１０００万個の細胞を、ＳＣＩＤマウスの右後腹部中に皮下注射した。ｓｈＥＬＡ注射したマウスにドキシサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）を、注射後３週間与えた。腫瘍分析のためにマウスを注射の６０日後に屠殺した。
材料および方法：指示された内胚葉分化
Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５−ｓｈＥＬＡおよびＳｈｅｆ４ＴｅｔＲ５−ｓｈβ２Ｍ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下（それぞれ、ｓｈＥＬＡおよびｓｈβ２Ｍ）または非存在下（対照）で１継代（４日）の間培養し、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて解離した。６０万個の細胞を、ｍＴＳＥＲ１中の１０μＭのＹ−２７６３２の存在下でマトリゲルコーティングされた６ウェルディッシュの各ウェルにプレーティングした。２４時間後、培地を、Ｅｎｄｏ分化培地１［ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｂ−２７栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］に３日間変更した。３日目に、培地を、Ｅｎｄｏ分化培地２（ＲＰＭＩ１６４０、Ｂ２７、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビン）にさらに２培養日変更した。Ｓｈｅｆ４ＴｅｔＲ５−ｓｈＥＬＡに２．５μＭのＥＬＡペプチドを添加することによって、同時に、内因性ＥＬＡの下方制御によって判断されるように、ＥＬＡペプチドがもはや必要ではない場合には３日目までドキシサイクリンを用いて、レスキュー実験を実施した。
５日目に、４％パラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、αＳＯＸ１７（ＡＦ１９２４、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＤＡＰＩを用いて染色した。各ウェルにつき、３つの異なる無作為に選択された視野を撮像し、ＳＯＸ１７およびＤＡＰＩの核染色陽性の数を、ＩｍａｇｅＪ中のカスタムマクロを使用して計数した。各実験について条件あたり最小２ウェルを使用し、独立実験において最小２を実施して、結果を作製した。
材料および方法：ＡＰＬＮＲのｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウン
ｓｈＲＮＡヘアピンをコードするレンチウイルス構築物を、先に記載されたように調製した（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００６ａ）。手短には、ｈＥＳＣにおける安定発現のために、Ｌ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＮｈｅＩベクターを、ＣＭＶ−ＧＦＰをＰＧＫ−ＧＦＰ−Ｐ２Ａ ＰＵＲＯカセットと置換することによって修飾した。確認されたｓｈＲＮＡ配列（ｓｈＡＰＬＮＲ−１：５’ＡＣＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＡＣＴＡＴＧＡ３’（配列番号１５３）、ｓｈＡＰＬＮＲ−２：５’ＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＴＡ３’（配列番号１５４）および対照：５’ＧＡＣＣＴＣＴＧＣＧＣＣＴＡＡＴＴＡＴ３’（配列番号１５５））を、Ｈ１プロモーターとともにＮｈｅＩ部位中にクローニングした。レンチウイルス粒子を記載されたように調製した（Ｔｉｓｃｏｒｎｉａら、２００６ｂ）。ＨＥＳ３ヒト胚性幹細胞を、２ＴＵのレンチウイルスを用いて形質導入し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて、フィーダー不含培養系で２週間選択した。
材料および方法：ｈＥＳＣの中内胚葉分化
本発明者らは、ＡＰＬＮＲを発現するｈＥＳＣ由来細胞を得るために、ＡＰＬＮＲ発現がピークとなる３日目に停止される心臓分化のためのプロトコールを採用した（Ｌｉａｎら、２０１３年）。本発明者らは、この中間細胞型を、３日目分化中内胚葉と呼ぶ。手短には、Ｓｈｅｆ４およびＨＥＳ３ ｈＥＳＣをＡｃｃｕｔａｓｅを用いて解離し、１４万個の細胞を、５μＭの、ｍＴＳＥＲ１中のＹ−２７６３２の存在下で、マトリゲルコーティングされた２４ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。培地を、細胞が９０％コンフルエントになるまでｍＴＳＥＲ１を用いて４日間毎日交換した。次いで、０日目に、ｍＴＳＥＲ１を、９μＭのＧＳＫ３β−阻害剤ＣＨＩＲ９９２０１（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を有する分化培地［インスリンを含まない、ＲＰＭＩ １６４０、Ｂ−２７栄養補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］と２４時間を交換した。細胞を、３日目まで、インスリンを含まないＲＰＭＩ＋Ｂ２７中で２日間さらに成長させ、その時点で、それらをｑＰＣＲ、フローサイトメトリーおよびＡＰ−結合アッセイに使用した。
材料および方法：フローサイトメトリー
細胞を２５０万個／ｍｌに再懸濁し、ＰＢＳ／５％ＦＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡ中の、５μｇ／ｍｌのαＡＰＬＮＲ（ｍＡＢ８５６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて氷上で３０分間染色し、続いて、バッファーで洗浄し、αマウス−ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて氷上で３０分間染色した。ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーを実施し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いてデータ分析を実施した。
結果：ＥＬＡは、ヒト胚性多能性と関連している保存されたホルモンである。
ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１およびＰＲＤＭ１４の同時発現群のコア共通部分と本発明者らが詳述した（Ｄａｙら、２００９年；ＮｉｅｈｒｓおよびＰｏｌｌｅｔ、１９９９年）ヒト多能性回路網ネットワーク内に、３３種の転写物の一覧があり（図１Ａ）、そのうち６種は、今まで未知であり、特性決定されていない。１種の、ＡＫ０９２５７８が、未分化ｈＥＳＣに特異的であるとこれまでに報告された（Ｍｉｕｒａら、２００４年）。ＵｎｉＧｅｎｅによれば、この転写物は、着床前のヒト胚盤胞において顕著に発現される（図９Ａおよび図９Ｂ）。その発現は、そのプロモーターの１０ｋｂ上流の活性ＰＯＵ５Ｆ１調節エレメントに左右され、ＰＯＵ５Ｆ１枯渇ｈＥＳＣでは下方制御される（図９Ｃおよび図９Ｄ）。これと一致して、ＥＬＡ転写は、未分化ｈＥＳＣにおいて最高であり、胚様体、内胚葉、ＲＡ媒介性神経細胞および心臓に向けられた分化の間に迅速にサイレンシングされるようになる（図１Ｂ、図９Ｅ〜図９Ｈ）。
これらのデータから、ＥＫＡ発現が、ｈＥＳＣの未分化段階と関連していることおよび着床前ヒト発達と関連していることが確認される。
ヒトＥＬＡは、非コーディングＲＮＡと注釈がつけられた転写物を生成する、染色体４上の３つのエキソンからなる。しかし、ＥＬＡ ｍＲＮＡは、５４個のアミノ酸の予測されるポリペプチドをコードする保存されたＯＲＦを含有する（図１Ｃ）。系統発生解析によって、このポリペプチドは、２２残基の予測されるＮ末端シグナル配列を有する高度に保存されたタンパク質であるということが示された（図１Ｃ）。すべての脊椎動物種において、１対の保存されたシステインとともに、残りの１３残基はほとんど不変である（図１Ｃ）。この予測に基づいて、本発明者らは、予測される成熟したＥＬＡペプチドのＮ−およびＣ−末端に対する抗体作製した（本明細書において、以下、αＮおよびαＣ抗体と呼ぶ）（図１Ｃ）。ＥＬＡが分泌のためにプロセシングされることを確認するために、ヒトＥＬＡ ＯＲＦ ｍＲＮＡを、４細胞段階アフリカツメガエル胚中にマイクロインジェクションした。１０時間の分泌後、本発明者らは、αＣ抗体を使用して、ＥＬＡが胚によって翻訳され、プロセシングされ、分泌されることを確認した（図１Ｄ）。上清では、プロセシングされたＥＬＡは、合成によって産生された組換えＥＬＡと同一の大きさのものであった。漸増量のブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）、小胞体から分泌タンパク質が出ることを遮断する抗生物質は、ＥＬＡプロセシングおよび分泌を遮断できた（図１Ｄ）。全長およびプロセシングされたＥＬＡの両方を認識するαＣ抗体とは異なり、αＮ抗体は、成熟ＥＬＡに特異的であって、これは、そのエピトープは、ひと度シグナルペプチドが切断されると示されることを示した（図１Ｅ）。総合すると、これらのデータによって、ＥＬＡは、ｈＥＳＣの多能性ネットワークに属し、４ｋＤａ未満の分子量を有する潜在的に可溶性の成熟ペプチドをコードすることが確認される。
結果：ＥＬＡは、ｈＥＳＣによって分泌され、その自己複製のために必要とされる
ＥＬＡは、ｈＥＳＣおよび関連するヒト胚性癌腫細胞（ｈＥＣ）においてαＮおよびＣ抗体を使用する免疫蛍光によって検出可能であるので、真正の内因性タンパク質である（図２Ａおよび図１０Ａ〜図１０Ｃ）。ＥＬＡ染色は、ＴＧＮ４６、トランスゴルジネットワークのマーカーとの同時局在性によって証明されるようにゴルジ体において最高であるが、細胞質にも見出される（図２Ａおよび図１０Ａ）。この染色は、両多能性細胞型におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ媒介性ＥＬＡノックダウンの際に著しく低減されたので特異的である（図２Ａおよび図１０Ｃ）。本発明者らは、内因性ＥＬＡが、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、培養されたｈＥＳＣの上清中で容易に検出されるので、実際に分泌されたことを確認した（図２Ｂ）。本発明者らは、５日の期間をかけて、可溶性内因性ＥＬＡは、ｈＥＳＣの上清中で、ナノモル範囲の濃度に達すると推定した（図２Ｃ）。
本発明者らは、ＥＬＡ機能を評価するために、ＥＬＡおよび非必須遺伝子β２−ＭＩＣＲＯＧＬＯＢＵＬＩＮ（β２Ｍ）に対する安定なドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡノックダウンｈＥＳＣを次いで作製した（図１０Ｄ）（Ｚａｆａｒａｎａら、２００９年）。ｓｈＥＬＡノックダウンは、対照レベルに対して、細胞外ＥＬＡのおよそ８５％の枯渇を達成した（図２Ｃ）。β２ＭではなくＥＬＡの長期の枯渇は、ｈＥＳＣコロニー形態の段階的な喪失ならびに多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ３およびＴＲＡ−１−６０の下方制御をもたらした（図２Ｄ、図１０Ｆおよび図１０Ｇ）。ＳＣＩＤマウスに注入されたｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、対照ｈＥＳＣが形成しなかったように、奇形腫を形成しなかった（図１０Ｅ）。これらの結果と一致して、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、リアルタイム細胞指数分析によって示されるように、単細胞として播種された場合に、対照およびｓｈβ２Ｍ ｈＥＳＣと比較して、著しく低下した成長速度を示した（図２Ｅ）。この指数は、細胞数の代用物の役目を果たし、占有された表面積に比例する（図２Ｅ）。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣコロニーにおいて、ｓｈβ２Ｍ ｈＥＳＣの大きさの平均して半分未満である、より遅い成長速度も実証された（図２Ｆ）。
総じて、これらの知見は、ｈＥＳＣによって作製されたペプチドホルモンＥＬＡは、培養におけるその自己複製および維持にとって重要であるということを主張する。
この細胞数における障害は、ＥＤＵ染色によって証明されるように、Ｇ１／Ｓチェックポイントの活性化またはＧ０滞留の延長によるものではなかった（図１０Ｈ）。ｈＥＳＣをＧ１相に同調させる二重チミジン遮断からの放出後の細胞周期分析によって、この結果が確認された（図２Ｇ）。むしろ、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、アネキシンＶおよび活性化カスパーゼ３陽性細胞数のおよそ４０％増大によって示されるように、対照ｈＥＳＣと比較して相当に高い割合でアポトーシスを起こす（図２Ｈ）。
本発明者らは、これらの観察結果から、ＥＬＡは、ｈＥＳＣの生存および自己複製に必須であり、その枯渇がアポトーシスおよび段階的分化を引き起こす内因性の分泌ペプチドであると結論付ける。
結果：外因性ＥＬＡは、成長を促進し、ｈＥＳＣを中内胚葉系列に向けて刺激する。
本発明者らは、次いで、成熟ＥＬＡの生物活性を評価した。この目的で、本発明者らは、９８％の純度で組換え成熟ＥＬＡを、システイン残基３９と４４の間に分子内シスチン結合を有する３２個のアミノ酸のペプチドとして合成によって産生した（図３Ａ）。
この組換えＦＩＴＣ標識ＥＬＡは、ｈＥＳＣによって迅速に取り込まれた（図３Ｂ）。本発明者らは、２個の不変であるアルギニンの、グリシンへの突然変異（Ｒ３１ＧおよびＲ３２Ｇ）によって、組換えＥＬＡの取り込みが完全に消失することを見出した（図３Ａおよび３Ｂ）。
ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、成長の低減を示したが、ＥＬＡペプチドを瞬間適用されたｈＥＳＣは、未処理細胞に対して、用量依存性の増強された成長を示した。これは、細胞数によって（図３Ｃ）、コロニーの大きさによって（図３Ｄ）および細胞指数のリアルタイム測定によって（図３Ｅおよび図１１Ａ）独立に実証された。二重に突然変異したＥＬＡ突然変異体ペプチド（ＥＬＡＲＲ＞ＧＧと呼ばれる）は、これらのアッセイでは効果を伴わなかった（図３Ｄおよび３Ｅ）。特に、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの成長は、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなく組換えＥＬＡの添加によって正常レベルに完全にレスキューされ、これは、ＥＬＡが、非細胞自律因子としてその役割を完全に発揮できることを示す（図３Ｆ）。
したがって、本発明者らは、細胞外間隙におけるその直接阻害は、ｍＲＮＡレベルでのその枯渇と同様の結果をもたらすはずであると仮定した。実際、本発明者らは、ｈＥＳＣ培地への親和性精製されたαＣおよびＮ抗体の添加が、ｓｈＥＬＡの効果を再現することを見出し（図３Ｇおよび図１１Ｂ）、これは、これらの抗体が強力なＥＬＡ中和活性を有することを示す。このアッセイの特異性を証明するために、非シグナル伝達突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧペプチドを、αＣ抗体の競合阻害剤として使用した（図３Ｇ）。組換えＥＬＡが、ｈＥＳＣ培養物に対してのみ活性を発揮し、ｈＥＣ、ヒト軟骨肉腫細胞株または一次ヒト線維芽細胞を含めた、その他の分化した細胞型には発揮しなかったことは注目すべきである（図３Ｈ）。
本発明者らは、これらのデータから、外因性ＥＬＡＢＥＬＡは、ｈＥＳＣの成長を増強するのに十分であるということを結論付ける。
本発明者らは、ｈＥＳＣ培養物への外因性ＥＬＡペプチドの添加後の上昇したＥＬＡの存在下で、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＥＯＭＥＳおよびＢＲＡを含めた中内胚葉遺伝子が一貫して上方制御されたことを観察した。これらの同マーカーは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣでは逆に下方制御された（図３Ｉ）。これにもかかわらず、ｈＥＳＣは、細胞表面マーカーＳＳＥＡ３およびＴＲＡ−１−６０の不変のレベルによって判断されるように幹細胞性を失わないようであった（図３Ｊ）。ＥＬＡ処理ｈＥＳＣが、胚様体分化の間に中胚葉または内胚葉系列に向けて偏向せず、ＮＥＳＴＩＮ神経外胚葉マーカーを等しく発現し得たので、この中内胚葉に向けた誘導は、永久的な系列傾倒には相当しなかった（図３Ｋ）。総合すると、これらのデータは、細胞外因子としての成熟したＥＬＡ機能は、ｈＥＳＣの成長および生存の増強を誘発できることを示唆する。ＥＬＡは、過剰発現すると、ｈＥＳＣを中内胚葉系列に向けて準備するが、明白な系列傾倒を引き起こさない。
結果：ゼブラフィッシュにおけるｅｌａ突然変異体の対立遺伝子シリーズの作製
ゼブラフィッシュ胚発生の間に、ｅｌａは、中期胞胚変移（ＭＢＴ）から受精後３日まで発現される（図４Ａおよび４Ｂ）。ｅｌａは、測定可能な母系性寄与は全く伴わず、胚盤葉の分裂細胞において遍在性であり、原腸陥入後に軸性構造に限定されるようになり、最も顕著な発現は神経管においてである（図４Ａ）。ｅｌａは、染色体１上に位置し、同様に３つのエキソンからなる（図４Ｃ）。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｅｌａの正確な機能および必要性を実証するために、そのシグナルペプチドをコードするｅｌａのエキソン１において二本鎖破壊を誘導するためのカスタムＺＦＮを設計し、注入した。Ｆ１世代のスクリーニングによって、ヘテロ接合性ｅｌａ魚の対立遺伝子シリーズを同定することが可能となり（図４Ｄ）、これは、選択され、少なくとも５回戻し交配され、その後、表現型分析を受けた。
本発明者らは、３種の別個のｅｌａ対立遺伝子を分析した。ｅｌａｂｒ２１は、２１ｂｐ欠失であり、シグナルペプチド内で独特の７個のアミノ酸のインフレーム欠失を引き起こすが、無傷の成熟ペプチドを残す。ｅｌａｂｒ１３およびｅｌａｂｒ１５は、全成熟Ｅｌａペプチドを撹乱する、それぞれ、１３および１５ｂｐの欠失によって引き起こされるフレームシフト対立遺伝子である（図４Ｄ）。ｅｌａヌル胚は、５０％被包期までは普通に発達し、その後、胚環において移入異常が観察されたた；ｅｌａヌル胚は、シールド段階での退行周縁部層の「粗い」および収縮した外観を使用して眼によって容易にスコア化された（図４Ｅ）。ｅｌａ発現がピークである１００％被包期で（図４Ｂ）、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって、ｅｌａｂｒ１３ｍＲＮＡが、野生型ｅｌａ ｍＲＮＡのものよりも短いことを確認し（図４Ｆ）、これは、２対立遺伝子のゲノム欠失と一致する。αＣ抗体を使用するウエスタンブロッティングによって、内因性Ｅｌａ全長タンパク質は、ｗｔ胚の抽出物では検出され得るが、ｅｌａｂｒ１３胚からは非存在であった（図４Ｆ）。
結果：ｅｌａの喪失が、心臓異形成による胚性致死を引き起こす
すべてのｅｌａホモ接合性突然変異魚は、同様の表現型を示し、予測されたメンデルの劣性割合のものであり（図５Ａおよび図１２Ａ〜図１２Ｃ）、これは、３種の対立遺伝子が機能喪失突然変異体として挙動することを示唆する。ｅｌａヘテロ接合性魚は、表面上は正常であるが、ｅｌａヌル魚は、未発達の心臓から心臓無しの範囲の重症心臓異形成を示した（図５Ａ、図５Ｂおよび図１２Ａ〜図１２Ｃ）。分析される対立遺伝子にかかわらず９５％を超えるｅｌａヌル胚において（ｎ＞３７０）、胚性心臓マーカーｃｍｌｃ１の喪失または重度の低減が見られた（図５Ｃ）。血液循環は観察されず、過剰の赤血球が、中間体細胞塊（ＩＣＭ）で蓄積され（図５Ａ）、これは、ｅｌａ突然変異胚において、ヘテロ接合性同胞に対するｓｃｌ上方制御によって確認された（図５Ｄ）。
さらに、ｅｌａ突然変異幼生は、可変後側短縮化を示し、尾芽重複を示すこともある。後側組織欠陥は、腹ひれの喪失から完全な尾および躯幹短縮化の範囲であった（図５Ａ）。予期しないことに、同様の表現型はまた、ｅｌａ ｍＲＮＡ過剰発現の際にも観察された（図１２Ｄ）。３種すべての遺伝子型から数千のｅｌａヌル胚を得、尾欠陥の重症度に従って３クラスにスコア化した（図５Ａおよび５Ｅ）。本発明者らは、ヘテロ接合性交配間で、同一親から生まれた異なるクラッチの胚の間でさえ（示されていないデータ）、各クラスの相対的比率が大幅に変わる（図５Ｅ）ことを観察し、これは、心臓形態形成においてではなく、尾発達における顕著な表現型の相違を示唆する。ｅｌａヌル突然変異体の極めて低いパーセンテージが、繁殖性成体に発達することは注目すべきことであり（図５Ｆ）、母系性ｅｌａ効果を全く無視して、ホモ接合性交配が１００％ヌルクラッチをもたらすことを可能にする。これらの３種のｅｌａ機能喪失対立遺伝子は、Ｅｌａシグナルペプチドの３分の１の短縮化が、フレームシフト突然変異と同一の表現型を引き起こすことを示し、これは、Ｅｌａがｉｎ ｖｉｖｏで機能的であるために無傷のシグナルペプチドを必要とすることを示す。さらに、これらの劣性ｅｌａ対立遺伝子は、半分までのＥｌａレベルの低下は、明らかな結果のものではないが、それが完全にないことは、心臓発達、造血および尾伸長のより少ない程度と適合しないことを示唆する。
結果：ＥＬＡは、ゼブラフィッシュおよびｈＥＳＣにおいて適切な内胚葉分化に必要である
ｅｌａ突然変異魚において観察された重症心臓欠陥の発生学的起源を理解するために、本発明者らは、３種すべての胚性胚葉の一連のマーカーをホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって分析した。最も顕著には、ｅｌａ突然変異原腸胚は、中内胚葉系列において特定の欠陥を示した（図６Ａ〜Ｄ）。ｂｒａによって示された中胚葉は、おそらくは収斂伸長異常によって引き起こされた被包期運動の障害を示した。１００％被包期で、ｅｌａ突然変異胚は、遅延され、野生型（ｗｔ）胚に対してより短くより肥厚した脊索を有する開いた原口（ｏｐｅｎ ｂｌａｓｔｏｐｏｒｅ）を有していた（図６Ａ）。中内胚葉を示し、心血管前駆細胞（ＣＰＣ）の発達を促進するｇａｔａ５の発現は、７５％被包期でｗｔ胚に対してｅｌａ胚において別個に変更され；ｅｌａヌル胚は、心臓形成領域において別個の軸性細胞集団を示す代わりに、周縁部ｇａｔａ５発現細胞と接続している、形成体のあたりの特徴的なシェブロン形状を示した（図６Ｂ）。最終的な内胚葉先駆体を示すｓｏｘ１７の発現は、背側では同様にシェブロン形状であったが、ｓｏｘ１７先駆細胞はｅｌａの非存在によって変更されなかった（図６Ｃおよび図１３Ａ）。本発明者らは、７５％被包期でｓｏｘ１７＋細胞の総数の大幅な低減を観察し、それらは、ｗｔまたはｅｌａヘテロ接合性同胞と比較して平均して３０〜４０％低減した（図６Ｄ）。
ヒトＥＬＡが同様にｈＥＳＣの内胚葉分化に必要とされるか否かを調べるために、本発明者らは、ｈＥＳＣを５日間分化させ、ＳＯＸ１７＋最終的な内胚葉細胞の数を計数した。本発明者らは、ｓｈＥＬＡの内胚葉分化の障害を観察したが、ｓｈβ２Ｍまたは対照ｈＥＳＣでは観察しなかった（図６Ｅ、図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７＋細胞数において対照を上回る大幅な４５％の低減を示し、これは、組換えＥＬＡペプチドの添加によって完全にレスキューされ得る（図６Ｆ）。本発明者らは、ＥＬＡは、胚性多能性のために、また内胚葉先駆体の適切な分化のためにｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で必須であると結論付ける。
結果：ＡＰＬＮＲは、心臓発達の間のＥＬＡの同族受容体である
ペプチドホルモンは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を通してシグナル伝達する。１つのこのようなＧＰＣＲ、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）は、魚およびマウスにおける心臓発達に関与している。ａｐｌｎｒｂに劣性Ｗ９０Ｌミスセンス突然変異を保持する、ゼブラフィッシュ突然変異体ｇｒｉｎｃｈおよびＡｐｌｎｒノックアウトマウスは両方とも、心臓形態形成に欠陥を有する（Ｃｈａｒｏら、２００９年；Ｓｃｏｔｔら、２００７年）。しかし、予期しないことに、ＡＰＬＮ、ＡＰＬＮＲの許容されるリガンドの喪失は、ゼブラフィッシュまたはＡｐｌｎｒヌルマウスにおいてｇｒｉｎｃｈの表現型を再現しない。本発明者は、ＥＬＡは、ＡＰＬＮＲの代替の、初期リガンド後の念願のものであり得ると推測した（Ｃｈａｒｏら、２００９年；Ｓｃｏｔｔら、２００７年）。中性近くの等電点を有するほとんどのその他のホルモンとは異なり、ＥＬＡおよびＡＰＬＮは、塩基性残基が豊富であり、１２を超える等電点を有し（図７Ａ）、これは、それらが共通の受容体を共有し得ることを示唆する。ＡＰＬＮＲの第１のリガンドであるＥＬＡについて、本発明者らは、１）原腸陥入の開始の前にａｐｌｎｒと同時に発現されなくてはならない、２）ａｐｌｎｒ発現細胞において発現されなくてはならないか、またはａｐｌｎｒ発現細胞に隣接していなくてはならない、３）ａｐｌｎｒ突然変異体を表現型コピーしなくてはならない、４）細胞の表面でＡＰＬＮＲと結合しなくてはならないと主張した。これまでの報告と一致して、ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂの開始は、ＭＢＴのｅｌａのものと一致するが、ａｐｌｎ発現は、原腸陥入の際に５時間後に始まる（図７Ｂ）。ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂを発現する細胞は、ｅｌａが偏在性に転写される覆っている被覆層の直下の胚盤葉下層にある（Ｚｅｎｇら、２００７年）（図４Ａおよび７Ｃ）。本発明者らは、ａｐｌｎｒａおよびａｐｌｎｒｂの発現はまたｅｌａの喪失に応じたものであり、ｗｔ胚に対して、周縁で、より凝縮されたパターンを示すことを見出した（図７Ｃ）。表現型的に、マーカーのアレイを使用して、本発明者らは、ａｐｌｎｒモルファントは、ｅｌａヌル胚と識別不能であることを見出した。両方とも、心膜浮腫を示し、３０受精後時間（ｈｐｆ）で、著しく低減したｃｍｌｃ１発現およびＩＣＭにおける赤血球の蓄積があった。６日目までに、すべてのｅｌａ突然変異体およびａｐｌｎｒモルファント胚は、心臓異形成を有しており、血液循環はわずかしかない、ないしなかった（図７Ｄ〜７Ｆ）。これらのｉｎ ｖｉｖｏデータは、ｅｌａ表現型コピーの喪失ａｐｌｎｒの喪失を実証し、それらがｉｎ ｖｉｖｏでリガンド−受容体対を形成することを主張する。最後に、ＡＰＬＮＲを発現せず、ＥＬＡと結合しないＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ゼブラフィッシュａｐｌｎｒａ／ｂおよびヒトＡＰＬＮＲの過剰発現は、アルカリホスファターゼとコンジュゲートしているＥＬＡ（ＡＰ−ＥＬＡ）に細胞−表面結合を提供するのに十分であった（図７Ｇ）。対照的に、ａｐｌｎｒｂｇｒｉｎｃｈは、ＡＰ−ＥＬＡと結合できず、ＧＰＲ１５もできず（図７Ｈ）、オーファンＧＰＣＲは、ＡＰＬＮＲと密接に関連していた（Ｖａｓｓｉｌａｔｉｓら、２００３年）。これらの結果は、細胞外ＥＬＡは、天然細胞状況においてＡＰＬＮＲと結合できるということを示唆する。総合すると、本発明者らの結果は、ＡＰＬＮではなくＥＬＡが、心臓発達のために内胚葉分化を協力して指示するＡＰＬＮＲの第１のアゴニストであるという考えを強力に支援する。
予期しないことに、ＡＰＬＮＲは、ｈＥＳＣには存在しないと報告されており（Ｖｏｄｙａｎｉｋら、２０１０年；Ｙｕら、２０１２年）、ｈＥＳＣ自己複製を媒介するＥＬＡ受容体ではないことを主張する。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によって示され、ｈＥＳＣにおいて活発に転写されるＥＬＡとは異なり、ＡＰＬＮＲは、メチル化されており、転写されない（図１４Ａ）。本発明者らは、ｑＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって、Ｓｈｅｆ４およびＨＥＳ３ ｈＥＳＣ株においてＡＰＬＮＲ転写物がないことを確認した。対照的に、ＡＰＬＮＲ転写物は、細胞表面ＡＰＬＮＲが確実に検出可能となる場合には、中内胚葉分化の際に約２５００倍上方制御された（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。それにもかかわらず、本発明者らは、ｈＥＳＣにおける痕跡レベルのＡＰＬＮＲが、ＥＬＡの細胞表面結合の主な原因となり得ないことを確実にするために、ｈＥＳＣにおいてＡＰＬＮＲのｓｈＲＮＡ媒介性枯渇を実施した。ｈＥＳＣにおけるＡＰＬＮＲの枯渇（図１４Ｂおよび図１４Ｄ）は、未分化ｈＥＳＣとのｓＡＰ−ＥＬＡの結合を低減できなかったが、ｈＥＳＣ由来中内胚葉細胞と結合しているＡＰ−ＥＬＡのレベルを大幅に減少するのに十分であった（図１４Ｅ）。これらのデータは、ＡＰＬＮＲは、分化した細胞においてＥＬＡとの細胞表面結合を付与するのに必要であり、十分であるが、未分化ｈＥＳＣにおいてはＥＬＡの内因性受容体ではないということを示唆する。この結論と一致して、ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳＣの成長は、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣのものとは異なり、損なわれなかった（図１４Ｆ）。これらの実験から、本発明者らは、ｈＥＳＣには代替ＥＬＡ受容体が存在し、胚性自己複製の維持に関与していることを予測する。
考察
本発明者らの研究は、強力な胚性シグナル伝達活性を有する２、３のペプチドホルモンを対象としなかった。本発明者らは、複数エキソン転写物の注意深い検査は、系統学的に保存された小さいＯＲＦの存在についてスクリーニングされるので、より多くが明るみに出ると予測する。非コーディングＲＮＡであると考えられる転写物によってコードされる、ＥＬＡＢＥＬＡは、実際、すべての脊椎動物種において見られる小さい分泌ペプチドの先駆体である。その成熟した形態ＥＬＡは、ｈＥＳＣの自己複製の中心であり、内胚葉分化に必要である。ｉｎ ｖｉｖｏで、ｅｌａは、ＡＰＬＮＲによって変換されるその活性が、心臓系列の移入および分化を引き起こす中内胚葉系列に特異的に影響を及ぼす。ｈＥＳＣにおけるＥＬＡの受容体の同一性は知られておらず、徹底した調査の対象である。
考察：分泌因子による胚性多能性の調節
多能性回路の維持のための転写因子に、不相応な重点が置かれてきており、過剰の転写因子が、多能性状態にとって重要であり、初期化を増強すると示されてきた（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。しかし、新規の分泌因子は、多能性のための確立された因子であるＮＯＤＡＬ／ＢＭＰおよびＩＧＦ／ＦＧＦとともに、２０年間発見されていない。本明細書において、本発明者らは、１種のこのような細胞外分子、ＥＬＡが幹細胞性中に存在し、重要な役割を果たすという証拠を示す。ｈＥＳＣにおいて多能性を維持するために、外因的に添加される、またはフィーダー細胞によって分泌されることを必要とするＦＧＦとは異なり、ＥＬＡは、自己分泌および／または傍分泌様式で自己に十分な量で、ｈＥＳＣによって内因的に合成され、分泌され、取り込まれる。このような分子が必要とされる理由は、完全に明確ではないが、ＥＬＡの阻害が迅速なアポトーシスを引き起こすという事実は、特に、解離後にｈＥＳＣに本来備わっている高レベルの自発的アポトーシスに対抗するための生存促進因子として働くことを示唆する（Ｗａｎｇら、２００９年；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年）。これと一致して、本発明者らは、単細胞として成長したｈＥＳＣにおけるＥＬＡの枯渇は、コロニー中で成長したｈＥＳＣよりも有害であると注記する。あるいは、これは、単細胞によってよりも、ｈＥＳＣコロニーによる傍分泌様式においてより容易に捕獲され得るペプチドの細胞外活性を指し示す可能性がある。また、本発明者らは、内因性ＥＬＡは、ｎＭ範囲でｈＥＳＣコンディショニング培地中に存在するが、本発明者らの組換えペプチドは、特異的であるが、μＭ範囲でのみ生理活性であることを注記する。この知見は、グレリンの場合のように（Ｋｏｊｉｍａら、１９９９年）、その完全な効力のために必要である、内因性ＥＬＡでの、あり得る翻訳後修飾の存在を示唆する。
組換えＥＬＡは、ｈＥＳＣによって迅速に取り込まれるという観察結果および内因性ＥＬＡは、細胞質中に見出され得るという本発明者らの観察結果は、これらの細胞中に献身的な受容体を有することを示唆する。本発明者らは、ＥＬＡが、その極めて塩基性のアミノ酸構成（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年）にもかかわらず自己貫通性ペプチドの行動をとるという可能性を支持しないが、これは、その迅速な細胞取り込みは、ｈＥＳＣのみにおいて観察され、その他の試験された細胞型では観察されないからである。ＡＰＬＮＲは、ｈＥＳＣにおいてサイレントであり（図１４Ａ〜図１４Ｃ）、したがって、本発明者らは、別の細胞表面受容体がＥＬＡ活性を媒介すると考える。
考察：心血管発達におけるＥＬＡ−ＡＰＬＮＲ軸
Ｓｔａｉｎｉｅｒおよび共同研究者は、適切な心臓形態形成のために原腸陥入の開始の前に必要であるが、その既知リガンドａｐｌｎは、原腸陥入中期まで発現されないと示している（Ｓｃｏｔｔら、２００７年）。同様に、マウスにおいて、いくつかのグループが、ＡｐｌｎおよびＡｐｌｎｒのノックアウトは、線形の排他的リガンド−受容体関係がＡｐｌｎをＡｐｌｎｒに関連付けた場合に予測されるような機能的対立遺伝子ではないと報告した。これは、Ａｐｌｎｒは、リガンド独立性機能を有し得ると仮定することにつながり、最近の報告によって、Ａｐｌｎｒは、Ａｐｌｎの非存在下で進展に応答し得ると示された（Ｓｃｉｍｉａら、２０１２年）。この現象の代替の、非突然変異的排他的説明は、ＡＰＬＮＲの第２のリガンドの存在を想起させる。本発明者らの結果は、ＥＬＡが、初期ゼブラフィッシュ胚発生においてこの役割を果たし、ここで、ｅｌａがａｐｌｎｒの喪失を表現型コピーし、適切な心臓個体発生のための内胚葉先駆体の移入および増幅を指示することを強力に示唆する。
今のところ、ＡＰＬＮおよびＥＬＡシグナルがＡＰＬＮＲを介して同一のシグナル伝達カスケードを誘発し、したがって、互いに部分的に代償するかどうかは不明である。しかし、本発明者らは、心血管発達に関して、ゼブラフィッシュモルファントまたはａｐｌｎマウスノックアウトは、明白な先天性心臓異常を示さないことを注記する（Ｋｕｂａら、２００７年；Ｓｃｏｔｔら、２００７年）。したがって、ＥＬＡ−ＡＰＬＮＲ軸は、心臓発達にとって排他的であると思われ、ＡＰＬＮは、ＡＰＬＮＲの下流の分岐したシグナル伝達のために、または簡単に不適合な時空間的発現パターンのいずれかのために不十分であり得る。
被包期胚盤葉においてｅｌａが、胚盤葉下層においてａｐｌｎｒ発現性内胚葉先駆体の移入および分化にどのように影響を及ぼすかは、明らかではない。本発明者らの分析は、ｅｌａをｇａｔａ５、ｅｌａ突然変異体において正中線に癒着できない中内胚葉細胞の最初期マーカーの１種の上流に位置付ける。ｆａｕｓｔゼブラフィッシュにおけるｇａｔａ５における突然変異は、この転写因子が、前心臓中胚葉が胚性正中線に移入するのに必要であることを実証する（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９９年）。前側側板中胚葉中（ＡＬＰＭ）に移入する第１の沿軸細胞集団の１種である心筋系列は、Ｎｏｄａｌ経路によって特定される内胚葉系列の変化に対して極めて感受性が高い（Ｓｃｈｉｅｒ、２００３年）。本発明者らの機能喪失対立遺伝子は、シグナル伝達をＥｌａ上流の近くに、または心臓形態形成のための内胚葉媒介性経路と並行して配置する。ｅｌａ突然変異魚におけるその数の低減によって判断されるように、Ｅｌａは、内胚葉先駆細胞の妥当な増殖にとって必要であり得る。あるいは、または同時に、Ｅｌａは、内胚葉細胞の正中線に向けたタイムリーな移入を促進し、順に、心血管前駆細胞（ＣＰＣ）をＡＰＬＭに向けて導き、それらを心発生を開始する能力があるようにする走化性刺激として挙動し得る。
考察：リガンド−受容体対合の複婚
１種の受容体、複数のリガンド。ＴＧＦβリガンド、アクチビンおよびＮＯＤＡＬは、発達の間に別個の時空間的発現を有し、これが、同一セットの受容体が逐次活性化されることを可能にする。ＥＬＡおよびＡＰＬＮの場合には、同様に、組織および発現のタイミングの相違は、ＡＰＬＮＲシグナル伝達カスケードの有用性を潜在的に拡大し得る。しかし、構造的に関連するＴＧＦβサイトカインであるアクチビンおよびＮＯＤＡＬとは異なり、ＥＬＡおよびＡＰＬＮは、配列相同性を共有せず、その上、両方とも極めて塩基性のタンパク質である。小ペプチドの世界の中に同様のシナリオが存在し、ここで、例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）およびアドレノメデュリン（ＡＭ）ホルモンについて、単一の膜貫通ＲＡＭＰタンパク質のメンバーに応じて同一ＧＰＣＲカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）を介した両シグナルが存在する。ＲＡＭＰ１と相互作用することによって、ＣＲＬＲは、ＣＧＲＰに対して高親和性を獲得するが、ＲＡＭＰ２またはＲＡＭＰ３と相互作用することによって、ＣＲＬＲは、ＡＭに対する高親和性を獲得する（ＭｃＬａｔｃｈｉｅら、１９９８年）。この系は、１種の受容体が複数のリガンドのシグナルを伝達することを可能にする。
考察：１種のリガンド、複数の受容体
ＥＬＡシグナル伝達は、心臓発達の間、ＡＰＮＬＲによって媒介されるようであるが、本発明者らは、ＡＰＬＮＲは、ＥＬＡが強力な生物活性を有するｈＥＳＣでは発現されないことを見出している。これは、前例のないものではなく、組織との関連で、また組織依存性に別個の受容体を介してシグナル伝達するリガンドの例は、多くある。例えば、ＷＮＴリガンドは、主に、ＦＲＩＺＺＬＥＤファミリーのＧＰＣＲを介して（Ｎｉｅｈｒｓ、２０１２年）であるが、同様に、収斂伸長運動のＲＯＲなどのＲＴＫを介してもシグナルを送る（Ｈｉｋａｓａら、２００２年）。同様に、ＥＬＡは、初期胚においてＡＰＬＮＲを介してシグナルを送り、心臓前駆体移入を指示するが、ｈＥＳＣにおいてまだ同定されないない受容体を介してシグナルを送り、自己複製および成長を促進することもある。この推定「４人婚（ｍｅｎａｇｅ ａ ｑｕａｔｒｅ）」は、単一および二重リガンドおよび受容体突然変異体の組織特異的不活性化の調査を正当化する、ＥＬＡ、ＡＰＬＮ、ＡＰＬＮＲおよびＥＬＡのｈＥＳＣ特異的受容体間の繊細な、微調整された関係の存在を示唆する。
考察：今後の方向性
着床前ヒト胚におけるその発現に加え、ＥＬＡ ｍＲＮＡはまた、ヒトにおいて成人の前立腺および腎臓においても見出される。これらの外分泌腺におけるその役割を調べることも同様に興味深いこととなろう。この段階では全く推測上であるが、いくつかの将来の見通しに関する記述が、組換えＥＬＡの可能性ある治療的価値に関してなされ得る。ＥＬＡが成体においてＡＰＬＮＲを介してシグナルを送ると仮定すると、このホルモンが、ＡＰＬＮのように強力な心保護および血管拡張性特性を持っており（Ａｓｈｌｅｙら、２００５年；Ｍａｇｕｉｒｅら、２００９年）、したがって、心臓修復／再生および血圧管理のための新規治療ペプチドとして働くか否かを評価することが重要となる。これに関連して、ＥＬＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心臓系列の強力なインデューサーとして働き、この系統に沿って、潜在的機能喪失ＥＬＡ対立遺伝子は、一般的なヒト集団における心血管疾患と関連している可能性がある。同時に、ＡＰＬＮＲが、共受容体として働くことによって、ＨＩＶ−１の侵入を可能にするので（Ｚｏｕら、２０００年）、ＥＬＡの非シグナル伝達型がＡＩＤＳの進行を変更し、おそらくは減速する手段として働き得るか否かを決定することは興味深いものとなる。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、心保護活性を有する
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドが心保護を付与することを実証するために、本発明者らは、虚血および再灌流傷害のマウスまたはブタモデルを使用する。
マウス研究のための研究デザイン
心筋虚血（Ｍｙｏｃａｒｉａｌ ｉｓｃｈａｅｍｉａ）を、３０分の左冠動脈（ＬＣＡ）閉塞およびその後の再灌流によって誘導する。
マウスを、再灌流の５分前に尾静脈を介してＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを用いて処理する。翌日、梗塞の大きさを評価する（再灌流の２４時間後）。
ブタ研究のための研究デザイン
３０匹の雌のＤａｌｌａｎｄ Ｌａｎｄｒａｃｅブタ（６０〜７０ｋｇ；ＩＤＤＬＯ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、すべて、クロピドグレル７５ｍｇ／日を用いて３日間、アミオダロン４００ｍｇ／日を用いて１０日間前処理し、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、非ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは生理食塩水処理に無作為に割り当てた。
新鮮な、コンディショニングされていない培養培地の効果を評価するために生理食塩水群を加える。すべてのブタにおいて、７５分の近位左回旋動脈（ＬＣｘＣＡ）結紮と４時間のその後の再灌流によってＭＩを誘導する。７５分の虚血期間は、完全に貫壁性の心筋梗塞を誘導せずに重症心筋傷害を与えるよう選択される。ＴＴＣ染色を使用する梗塞の大きさの測定は、３時間の再灌流後に最も信頼できるので、４時間の再灌流が使用される（Ｂｉｒｎｂａｕｍら、１９９７年）。
長期の再灌流後に、酸化ストレス状態およびアポトーシス機序を評価することがより困難になる。処理は、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド（１．０ｍｌ、２．０ｍｇタンパク質）非ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは生理食塩水の静脈内注入によって、再灌流の開始の５分前に開始する。再灌流の直後に、さらなる冠内ボーラスＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド（４．０ｍｌ、８．０ｍｇタンパク質）、非ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは生理食塩水を与える。心筋梗塞の大きさおよび機能は、再灌流の４時間後に評価する。
ＭＩおよび操作手順
全操作の間、ＥＣＧ、全身動脈圧およびカプノグラムを連続的にモニタリングする。先に記載されたように全身麻酔下で（Ｔｉｍｍｅｒｓら２００７年）、胸骨正中切開を実施し、６Ｆｒガイドカテーテルおよび８Ｆｒコンダクタンスカテーテルのために２枚の導入シートを頸動脈中に挿入する（ＣＤ Ｌｅｙｃｏｍ、Ｚｏｅｔｅｒｍｅｅｒ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。
スワンガンツカテーテルの遠端を、内頚静脈を通って肺動脈中に入れる。Ｔｒａｎｓｏｎｉｃフロープローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ）を近位大動脈およびＬＣｘＣＡの周辺に設置して、心拍出量および冠動脈流を測定し、ワイヤを大静脈の周囲に設置し、ＰＶループの変動するローディング条件下での機能的測定を可能にする。機能的測定後に、１０．０００ＩＵのヘパリンを静脈内に投与し、縫合を密接にして、近位ＬＣｘＣＡを閉塞させる。心室細動が起こる場合には、５０Ｊを用いる体内式除細動を使用する。虚血の７５分後、縫合を取り除くことによってＬＣｘＣＡを再開する。再灌流の直後に、ニトログリセリン（再流なしを防ぐために０．１ｍｇ）を、ガイドカテーテルによってＬＣｘＣＡを通して注入し、ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、非ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたは生理食塩水を用いる冠内処置を続ける。４時間の再灌流後、最終的な機能的測定を実施し、梗塞サイズ分析のために心臓を外植する。
フェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、ドルミカム（５ｍｇ／ｋｇ）およびドミトール（０．５ｍｇ／ｋｇ）を用いてマウスに麻酔をかけ、平滑末端を有する２４−ゲージ静脈内カテーテルを使用して挿管する。マウスに、げっ歯類人工呼吸器を使用し、Ｏ２およびＮ２Ｏ（１：２ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物を用いて、１０５ストローク／分の速度で人工呼吸器し、それにイソフラン（２．５〜３．０％ ｖｏｌ／ｖｏｌ）を加える。マウスを加温パッド上に置いて、体温を３７℃で維持する。第３肋間腔で開胸し、８−０プロリン縫合糸を使用して、左冠動脈（ＬＣＡ）を３０分間閉塞させる。閉胸し、翌日（２４時間後）、梗塞サイズ分析のために心臓を外植する。
機能測定
ＥＣＧ、動脈圧および心拍出量を、２５０Ｈｚのサンプリング速度でデジタル化し、オフライン分析（Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２、ＣＤ Ｌｅｙｃｏｍ）のために保存する。左室（ＬＶ）圧および容量を、先に記載されたようにコンダクタンスカテーテル法を使用して測定する（Ｔｉｍｍｅｒｓら２００７年）。Ｌｅｙｃｏｍ ＣＦＬ−５１２（ＣＤ Ｌｅｙｃｏｍ）を用いて、コンダクタンスカテーテルから導かれたＬＶ圧および容量シグナルをディスプレイさせ、２５０Ｈｚのサンプリング速度で獲得する。
定常状態の間および一時的な大静脈閉塞の間のデータを獲得し、すべて、最後の呼吸で人工呼吸器を止める。先に記載されるようなカスタムソフトウェアを用いて圧力−容量ループの分析を実施する（Ｓｔｅｅｎｄｉｊｋら１９９８年）。さらに、短軸心外膜超音波像（Ｐｒｏｓｏｕｎｄ ＳＳＤ−５０００、５−ＭＨｚプローブＵＳＴ−５２８０−５、Ａｌｏｋａ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｅｕｒｏｐｅ ＡＧ、Ｚｕｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を中間乳頭筋レベルで得る。心臓拡張末期（ＥＤ）および収縮末期（ＥＳ）で、梗塞領域、遠隔領域（隔壁）およびＬＶ内部領域（ＬＶｉａ）の壁厚（ＷＴ）を測定する。
収縮期壁厚（ＳＷＴ）を、［（ＷＴ（ＥＳ）−ＷＴ（ＥＤ））／ＷＴ（ＥＤ）］＊１００％として、左室面積収縮率を（ＦＡＳ）［（ＬＶｉａ（ＥＳ）−ＬＶｉａ（ＥＤ））／ＬＶｉａ（ＥＤ）］＊１００％として、左室駆出率（ＬＶＥＦ）を［（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶ］＊１００％として算出する。拡張末期心室硬度を、拡張末期血圧−容量関係の線形回帰によって定量化する。ＭＩの前、虚血の１時間後および再灌流の４時間後に、心エコー検査およびＰＶループを測定する。静脈内ドブタミン注入（２．５μｇ／ｋｇ／分および５．０μｇ／ｋｇ／分）によって気絶心筋に負荷をかけるために、医薬的に誘導されるストレスの間にさらなる測定を実施する。
梗塞の大きさ
心臓の切除の直前に、ＬＣｘＣＡ（ブタ）またはＬＣＡ（マウス）を、ＭＩの誘導のためと正確に同一の点で再結紮する。エバンスブルー色素を冠動脈系を通って注入し、危険領域（ＡＡＲ）を表現する。次いで、心臓を切除し、ＬＶを単離し、尖部から基部まで５切片に切断する。
切片を、１％トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中、３７℃のＳｏｒｅｎｓｅｎバッファー（１３．６ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４＋１７．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）中で１５分間インキュベートして、梗塞組織を生存心筋と識別する。
すべての切片を両側からスキャンし、各スライドにおいて、デジタル面積測定ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ）の使用によって、梗塞領域を危険領域および総領域と比較する。切片の重量について補正した後、梗塞の大きさを、ＡＡＲのおよびＬＶのパーセンテージとして算出する。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは心筋虚血−再灌流傷害から保護する
心筋虚血−再灌流傷害において、ＡＰＬＮ／ＡＰＬＮＲ（アペリン／アペリン受容体）軸が保護効果を有することはわかっている。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、心筋虚血−再灌流傷害の重要な治療選択肢となる。
材料および方法
以下の刊行物は、心筋虚血−再灌流傷害に対する保護においてペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｔａｏ Ｊ、ＺｈｕＷ、Ｌｉ Ｙら Ａｐｅｌｉｎ−１３ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥＲ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ａ ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１；３０１：Ｈ１４７１−８６。
Ｚｅｎｇ ＸＪ、Ｚｈａｎｇ ＬＫ、Ｗａｎｇ ＨＸ、Ｌｕ ＬＱ、Ｍａ ＬＱ、Ｔａｎｇ ＣＳ． アペリン ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｈｅａｒｔ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｒａｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２００９；３０：１１４４−５２。
Ｓｉｍｐｋｉｎ ＪＣ、Ｙｅｌｌｏｎ ＤＭ、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ＳＭ、Ｌｉｍ ＳＹ、Ｗｙｎｎｅ ＡＭ、Ｓｍｉｔｈ ＣＣ． Ａｐｅｌｉｎ−１３ ａｎｄ Ａｐｅｌｉｎ−３６ ｅｘｈｉｂｉｔ ｄｉｒｅｃｔ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ． Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００７；１０２：５１８−２８。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンのＥＬＡＢＥＬＡで置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、再灌流の間に投与されるＥＬＡＢＥＬＡは、対象の心臓において梗塞の大きさを大幅に低減するとわかる。
理論に捉われようとは思わないが、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡの投与が、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＥＲＫ経路の活性によって心臓を虚血−再灌流傷害から保護し、および／または反応性酸素種の生成を阻害し得ると考える。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体における心筋虚血再灌流傷害を治療、予防または軽減のために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、冠動脈疾患から保護する
材料および方法
以下の刊行物は、冠動脈疾患からの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ａｚｉｚｉ Ｙ、Ｆａｇｈｉｈｉ Ｍ、Ｉｍａｎｉ Ａ、Ｒｏｇｈａｎｉ Ｍ、Ｎａｚａｒｉ Ａ．Ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｃｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ［Ｐｙｒ１］−ａｐｅｌｉｎ−１３ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｄａｍａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２０１３年；第４６巻：７６〜８２頁。
Ｌｉ Ｌ、Ｚｅｎｇ Ｈ、Ｃｈｅｎ ＪＸ．Ａｐｅｌｉｎ−１３ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｒｅｐａｉｒ ｐｏｓｔｍｙｏｃａｒｄｉａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１２年；第３０３巻：Ｈ６０５−１８．
Ｐｉｓａｒｅｎｋｏ ＯＩ、Ｓｅｒｅｂｒｙａｋｏｖａ ＬＩ、Ｐｅｌｏｇｅｙｋｉｎａ ＹＡら Ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｅｒｆｕｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｗｉｔｈ ａｐｅｌｉｎ−１２ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ ｒａｔｓ． Ｂｕｌｌ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２０１１年；第１５２巻：７９〜８２頁。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、対象へのＥＬＡＢＥＬＡの注入は、心筋梗塞の大きさを制限し、心筋細胞に対する損傷を低減するとわかる。
理論に捉われようとは思わないが、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡの効果は、酸化傷害の低減および一酸化硝酸（ＮＯ）産生の増強によって心筋損傷を大幅に減弱することによって達成されると考える。
さらに、ＥＬＡＢＥＬＡは、血管新生を促進し、心筋梗塞後の心臓修復を改善するとわかる。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体において冠動脈疾患を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、動脈硬化症（Ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）から保護する
材料および方法
以下の刊行物は、動脈硬化症からの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｃｈｕｎ ＨＪ、Ａｌｉ ＺＡ、Ｋｏｊｉｍａ Ｙら Ａｐｅｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ Ａｎｇ ＩＩ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００８年；第１１８巻：３３４３〜５４頁。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、本発明者らは、ＡＰＬＮのように、ＥＬＡＢＥＬＡはアテローム性動脈硬化症（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）から保護できると見出す。本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡが、Ａｎｇ ＩＩの血管疾患促進作用をアンタゴナイズし、アテローム性動脈硬化症の負担のＡｎｇ ＩＩ媒介性増大を軽減すると見出す。また、腹部大動脈動脈瘤形成および破裂を阻害するとわかっている。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体においてアテローム性動脈硬化（ａｒｔｈｅｒｏｓｃｌｏｅｒｓｉｓ）を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、心不全から保護する
本明細書に記載される方法および組成物によれば、ＥＬＡＢＥＬＡは、心血管系において有益な効果を示し、および／または心臓修復を改善する。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、心不全の患者を治療するための治療計画として、またはその一部として使用され得る。
材料および方法
以下の刊行物は、心不全からの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｓｃｉｍｉａ ＭＣ、Ｈｕｒｔａｄｏ Ｃ、Ｒａｙ Ｓ、Ｍｅｔｚｌｅｒ Ｓ、Ｗｅｉ Ｋ、Ｗａｎｇ Ｊ、Ｗｏｏｄｓ ＣＥ、Ｐｕｒｃｅｌｌ ＮＨ、Ｃａｔａｌｕｃｃｉ Ｄ、Ａｋａｓａｋａ Ｔ、Ｂｕｅｎｏ ＯＦ、Ｖｌａｓｕｋ ＧＰ、Ｋａｌｉｍａｎ Ｐ、Ｂｏｄｍｅｒ Ｒ、Ｓｍｉｔｈ ＬＨ、Ａｓｈｌｅｙ Ｅ、Ｍｅｒｃｏｌａ Ｍ、Ｂｒｏｗｎ ＪＨ、Ｒｕｉｚ−Ｌｏｚａｎｏ Ｐ． （２０１２年）、ＡＰＪ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｄｕａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ． Ｎａｔｕｒｅ ２０１２年８月第１６巻；４８８（７４１１）：３９４〜８頁。
Ｓａｔｏ Ｔ、Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈ、Ｋａｄｏｗａｋｉ Ａ、Ｆｕｋａｍｉｚｕ Ａ、Ｌｉｕ ＰＰ、Ｋｉｍｕｒａ Ａ、Ｉｔｏ Ｈ、Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ ＪＭ、Ｉｍａｉ Ｙ、Ｋｕｂａ Ｋ．（２０１３年） Ａｐｅｌｉｎ ｉｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＡＣＥ２ ｉｎ ｆａｉｌｉｎｇ ｈｅａｒｔｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３年１１月１日。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、本発明者らは、ＡＰＬＮのように、ＥＬＡＢＥＬＡは、心不全からの保護を提供できることを見出す。
理論に捉われようとは思わないが、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）／Ａｎｇ ＩＩ／Ａｎｇ １−７軸を介してレニン−アンジオテンシン系とクロストークして、心収縮性を増大し、心不全を管理すると考える。
したがって、ＥＬＡ／ＡＰＬＮＲ系の調節不全は、心血管疾患の素因と関与している可能性がある。したがって、本発明者らは、ＥＬＡＢＥＬＡ作用の増強が、重要な治療効果を有すると提案する。
さらに、ＥＬＡＢＥＬＡの投与は、横大動脈狭窄（ＴＡＣ）、心不全のモデルによる持続圧負荷後に、アペリンのように心肥大を鈍らせるために使用され得る。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体において心不全を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、高血圧症から保護する
本発明者らは、アペリンのように、ＥＬＡＢＥＬＡが血管拡張薬として作用し、血圧を効率的に低下させると提案する。したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、高血圧症の患者を治療するための治療計画として、または治療計画の一部として使用され得る。
材料および方法
以下の刊行物は、高血圧症からの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｔａｔｅｍｏｔｏ Ｋ、Ｔａｋａｙａｍａ Ｋ、Ｚｏｕ ＭＸら Ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｅｌｉｎ ｌｏｗｅｒｓ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｖｉａ ａ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄａｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００１年；第９９巻（２−３）：８７〜９２頁。
Ｃｈｅｎｇ Ｘ、Ｃｈｅｎｇ ＸＳ、Ｐａｎｇ ＣＣ．Ｖｅｎｏｕｓ ｄｉｌａｔｏｒ ｅｌｌｅｃｔ ｏｆ ａｐｅｌｉｎ、ａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒｐｈａｎ ＡＰＪ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｉｎ ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ ｒａｔｓ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２００３年；第４７０巻（３）：１７１〜１７５頁。
Ｊａｐｐ ＡＧ、Ｃｒｕｄｅｎ ＮＬ、Ａｍｅｒ ＤＡら Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｐｅｌｉｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎ ｍａｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．２００８年；第５２巻（１１）：９０８〜９１３頁。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、ＥＬＡＢＥＬＡの投与は、血圧の低下を引き起こすと見出される。理論に捉われようとは思わないが、本発明者らは、一酸化窒素依存性経路によって動脈性および／または静脈性拡張薬として機能することによってそうすると考える。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体において高血圧症を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳから保護する
ＡＰＬＮＲ媒介性ＨＩＶ−１侵入の特異的阻害剤の同定は、ＨＩＶ−１感染を妨げるための新規試薬を見出す努力を大きく支援するであろう。
材料および方法
以下の刊行物は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳからの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｃａｙａｂｙａｂ Ｍ、Ｈｉｎｕｍａ Ｓ、Ｆａｒｚａｎ Ｍ、Ｃｈｏｅ Ｈ、Ｆｕｋｕｓｕｍｉ Ｓ、Ｋｉｔａｄａ Ｃ、Ｎｉｓｈｉｚａｗａ Ｎ、Ｈｏｓｏｙａ Ｍ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｏ、Ｍｅｓｓｅｌｅ Ｔ、Ｐｏｌｌａｋｉｓ Ｇ、Ｇｏｕｄｓｍｉｔ Ｊ、Ｆｕｊｉｎｏ Ｍ、Ｓｏｄｒｏｓｋｉ Ｊ． （２０００） Ａｐｅｌｉｎ、ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｐｈａｎ ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＡＰＪ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｔｕｓ ｔｙｐｅ １ ｅｎｔｒｙ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ． Ｄｅｃ；第７４巻（２４）：１１９７２〜６頁。
Ｘｕｅｊｕｎ Ｆａｎ、Ｎａｉｍｉｎｇ Ｚｈｏｕ、Ｘｉａｏｌｉｎｇ Ｚｈａｎｇ、Ｍｕｈａｍｍａｄ Ｍｕｋｈｔａｒ、Ｚｈｉｘｉａｎ Ｌｕ、Ｊｉａｎｈｕａ Ｆａｎｇ、Ｇａｒｒｅｔｔ Ｃ．ＤｕＢｏｉｓ、ａｎｄ Ｒｏｇｅｒ Ｊ．Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ．（２００３） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐｅｌｉｎ−１３ Ｐｅｐｔｉｄｅ、ａｎ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ Ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＡＰＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第４２巻、１０１６３〜１０１６８ １０１６３。
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、ＥＬＡＢＥＬＡは、ＨＩＶ−１侵入を防ぐまたは減速すると見出される。
ＡＰＬＮＲが脳において広く発現されるならば、ＥＬＡＢＥＬＡは、ＨＩＶ−１誘導性認知症の患者における中枢神経系感染にとって特に有用である。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体においてＨＩＶ感染またはＡＩＤＳまたは両方を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、肺動脈性高血圧症から保護する
ＡＰＬＮ／ＡＰＬＮＲ系は、心血管疾患の発生および進行において重要な役割を果たす。ＥＬＡ／ＡＰＬＮＲ軸を標的とすることはまた、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）の新規クラスの可能性ある治療薬に相当する。
材料および方法
以下の刊行物は、肺動脈性高血圧症からの保護におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ａｌａｓｔａｌｏ ＴＰ、Ｌｉ Ｍ、Ｐｅｒｅｚ Ｖｄｅ Ｊら Ｄｉｓｔｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＡＲγ／β−ｃａｔｅｎｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｅｒｉｎ ｉｍｐａｉｒｓ ＢＭＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ＥＣ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１１年；第１２１巻：３７３５〜４６頁。
Ｆａｌｃａｏ−Ｐｉｒｅｓ Ｉ、Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｎ、Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ−Ｃｏｅｌｈｏ Ｔ、Ｍｏｒｅｉｒａ−Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ Ｄ、Ｒｏｎｃｏｎ Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ Ｊｒ Ｒ、Ｌｅｉｔｅ−Ｍｏｒｅｉｒａ ＡＦ． Ａｐｅｒｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｒｉｇｈｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｎｏｃｒｏｔａｌｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００９年；第２９６巻：Ｈ２００７〜１４．
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、ＥＬＡＢＥＬＡは、肺動脈性高血圧症の症状を軽減すると見いだされる。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体において肺動脈性高血圧症を治療、予防または軽減するために使用され得る。
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドは、勃起不全を治療する
材料および方法
以下の刊行物は、勃起不全の治療におけるペプチドホルモン（アペリン）の役割を示す実験を記載する。
Ｋｗｏｎ ＭＨ、Ｔｕｖｓｈｉｎｔｕｒ Ｂ、Ｋｉｍ ＷＪ、Ｊｉｎ ＨＲ、Ｙｉｎ ＧＮ、Ｓｏｎｇ ＫＭ、Ｃｈｏｉ ＭＪ、Ｋｗｏｎ ＫＤ、Ｂａｔｂｏｌｄ Ｄ、Ｒｙｕ ＪＫ、Ｓｕｈ ＪＫ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｐｅｌｉｎ−ＡＰＪ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｅｒｅｃｔｉｌｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ Ｅｒｅｃｔｉｌｅ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｓｅｘ Ｍｅｄ． ２０１３ Ａｐｒ １１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｓｍ．１２１５８．
上記の刊行物に記載される実験を、アペリンをＥＬＡＢＥＬＡと置き換えて反復する。
結果
上記の実験が実施される場合には、ＥＬＡＢＥＬＡは、勃起機能の大幅な回復を提供すると見出される。
したがって、ＥＬＡＢＥＬＡは、個体において勃起不全を治療、予防または軽減するために使用され得る。
材料および方法：ＳＩＬＡＣ細胞培養および細胞溶解
ＳＨＥＦ４ ｈＥＳＣを、Ｌ−リシン−（２Ｈ４）の安定な中同位元素（Ｋ４）およびＬ−アルギニン−（１３Ｃ６）（Ｒ６）または重同位元素Ｌ−リシン−（１３Ｃ６１５Ｎ２）（Ｋ８）およびＬ−アルギニン−（１３Ｃ６１５Ｎ４）（Ｒ１０）のいずれかを含有する特注のｍＴＳＥＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、３継代の間培養して、同位元素の完全な交換を可能にした。次いで、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２中に２時間回収し、続いて、５μＭのＥＬＡまたはＥＬＡＲＲ＞ＧＧを１０分間瞬間適用した。細胞を９Ｍの尿素溶解バッファーに溶解し、これは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、９Ｍの尿素、１ｍＭの活性化バナジン酸ナトリウム、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウムおよび１ｍＭのβ−グリセロリン酸塩からなる。中（Ｋ４Ｒ６）および重（Ｋ８Ｒ１０）細胞から得られた等量の細胞溶解物を混合した。実験を、２つのフォワード（中細胞ＥＬＡＲＲ＞ＧＧ対重細胞ＥＬＡ）実験および２つのリバース（重細胞ＥＬＡＲＲ＞ＧＧ対中細胞ＥＬＡ）実験として４複製で実施した。
材料および方法：還元、アルキル化および消化
９Ｍの尿素溶解バッファー中の約１ｍｇのタンパク質を、清澄化した細胞上清に１／１０容量の５５ｍＭ ＤＴＴを添加することによってを還元し、室温で３０分間インキュベートし、続いて、１２０ｍＭのヨードアセトアミドをＤＴＴ溶液と同等の容量で添加し、暗所、室温で３０分間インキュベートした。次いで、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８）を使用してサンプルを６Ｍ尿素の最終濃度に１．５倍希釈した。ＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ １２９−０２４５１）を、１：１００のＬｙｓＣ対タンパク質比で添加し、３７℃で一晩インキュベートした。サンプルを、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８）を使用し約１Ｍの尿素の最終濃度にさらに希釈した。配列決定等級のトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、１：５０（ｗ／ｗ）のトリプシン対タンパク質比で添加した。３７℃で４時間消化した後、Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｖａｃ ＲＣ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、カートリッジあたり１００ｍｇのＳｏｒｂｅｎｔ）を使用してペプチド溶液を清澄化した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して得られたペプチドの量を測定した。
材料および方法：ＩＭＡＣビーズ調製
ＩＭＡＣビーズを、わずかな修飾を用い、記載されたように調製した（Ｆｉｃａｒｒｏら、２００９年）。手短には、２００μＬのＮｉ−ＮＴＡアガロースコンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）を、８００μｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで３回すすいだ。次いで、８００μｌの１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０とともに、混合しながら室温で３０分間インキュベートすることによってニッケルを樹脂から取り除いた。残存するニッケルを、８００μｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで３回すすぎ、続いて、８００μｌの１００ｍＭ 塩化物イオン溶液とともに３０〜４５分間インキュベートした。樹脂を、８００μｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏで３回洗浄し、続いて、８００μｌの８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を用いて４回すすいだ。
材料および方法：ホスホペプチド濃縮
ＩＭＡＣビーズを使用してトリプシンペプチドからホスホペプチドを濃縮した。６００μＬの５０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中に約６００μｇのトリプシンペプチドを再構成し、続いて、１００％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸を用いて１：１希釈した。次いで、ペプチドを１０μＬのＩＭＡＣビーズとともに３０分間回転しながらインキュベートした。次いで、ビーズを、事前に、２００μＬのメタノールで調整し、１００μＬの５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸で洗浄し、２００μＬの１％ギ酸で平衡化した、自己充填Ｃ１８ ＳｔａｇｅＴｉｐ（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒら、２００７年）上にロードした。ｓｔａｇｅ ｔｉｐ上にロードした後、ＩＭＡＣビーズを、１００μＬの８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸および２００μＬの１％ギ酸を用いて洗浄した。４×７０μＬの５００ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を使用して、ＩＭＡＣビーズからｓｔａｇｅ ｔｉｐ上のＣ１８メンブラン上にホスホペプチドを溶出し、続いて、２００μＬの１％ギ酸を使用して洗浄した。ホスホペプチドを、ＬＣ−ＭＳで分析される準備が整うまでｓｔａｇｅ ｔｉｐ上に保存した。６０μＬの５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸を用いて、ホスホペプチドをＣ１８メンブランから溶出し、ｓｐｅｅｄｖａｃを使用して乾燥させ、２４μＬの０．１％ギ酸中に再構成した。
材料および方法：ＬＣ／ＭＳ分析
ＥＡＳＹ−ｎＬＣ １０００（Ｐｒｏｘｅｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が連結したＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、再構成しペプチドを分析した。ペプチドを、Ｃ１８プレカラム上に捕捉し、０〜４０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の範囲の２４５分の勾配、続いて、４０〜８０％アセトニトリル／０．１％ギ酸の範囲の１０分の勾配を使用して、５０ｃｍの分析用カラム（ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、５０℃で分離し、８０％アセトニトリル／０．１％ギ酸で１０分間とどめた。サンプルをＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。ｒ＝７０，０００の分解能、３ｅ６のＡＧＣ標的および１０ｍｓの最大注入時間を用いて、サーベイフルスキャンＭＳスペクトル（ｍ／ｚ ３１０〜２０００）を獲得した。１０，０００の強度閾値、１％の充填不足率および荷電状態≧２を有する、各サーベイスキャン中の２０の最も強いペプチドイオンを、５０，０００の標的値に対して２Ｔｈの単離ウィンドウ、５０ｍｓの最大注入時間を用いて逐次単離し、２５％の正規化された衝突エネルギーを使用する高エネルギー衝突解離によって高エネルギー衝突セル中でフラグメンテーションした。１７，５００の分解能およびｍ／ｚ１００の出発質量を用いてＭＳ／ＭＳを獲得した。１５ｓの排除期間を使用して動的排除を適用した。
材料および方法：ホスホペプチドの同定および定量化
２６２種のよく観察される夾雑物を含有するｕｎｉｐｒｏｔ ２０１４−０４ヒトデータベースに対してＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．３．０．５）（Ｃｏｘ ａｎｄ Ｍａｎｎ、２００８；Ｃｏｘら、２００９年）を使用して、データを処理した。最大２つの見逃された切断および２つの標識されたアミノ酸ならびに前駆体イオンに対して６ｐｐｍおよびフラグメントイオンに対して２０ｐｐｍの初期質量許容差を可能にするトリプシン特異性を用いて、データベースサーチを実施した。ペプチドの最小長のデフォルト設定（７個のアミノ酸）を使用した。固定修飾としてシステインカルバミドメチル化を探索し、可変修飾としてＮ−アセチル化、酸化メチオニン、リン酸化セリン／トレオニン／チロシンを探索した。標識されたアルギニンおよびリシンは、親イオンについての予備知識に応じて固定または可変修飾として指定した。ＳＩＬＡＣペプチドおよびタンパク質定量化を、デフォルト設定を使用して実施した。最大偽発見率は、タンパク質およびペプチドの両方について０．０１と設定した。
材料および方法：ゼブラフィッシュ操作
ｅｌａｂｒ１３ゼブラフィッシュをこれまでに記載されたように作製した（Ｃｈｎｇら、２０１３年）。ｅｌａｂｒ１３およびＡＢ野生型ゼブラフィッシュを、受精後２４時間まで標準条件下で成長させた。カスパーゼ３染色を記載されたように実施した（Ｓｏｒｒｅｌｌｓら、２０１３年）。像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡および特注のライトシートベースの蛍光顕微鏡で獲得した（Ｓｗｏｇｅｒら、２０１４年）。
結果：ＡＰＬＮＲは、ｈＥＳＣにおいてＥＬＡ受容体ではない
本発明者らなどは、ＥＬＡは、細胞表面アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ、別名ＡＰＪ）に対して同族リガンドとして働いて、内胚葉およびその後の心臓形態形成を媒介し得ると示した。しかし、ＡＰＬＮＲは、未分化ｈＥＳＣには存在しないと報告された（Ｖｏｄｙａｎｉｋら、２０１０年；Ｙｕら、２０１２年）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によって示され、活発に転写されるＥＬＡとは異なり、ＡＰＬＮＲ遺伝子座は、メチル化されており、ｈＥＳＣでは転写されない（図１４Ａ）。本発明者らは、ｑＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって、ＳＨＥＦ４およびＨＥＳ３ ｈＥＳＣ株においてＡＰＬＮＲ転写物がないことを確認した。対照的に、ＡＰＬＮＲ転写物は、細胞表面ＡＰＬＮＲが確実に検出可能となる場合には、中内胚葉分化の際に約２５００倍上方制御された（図１４Ｂおよび図１４Ｃ）。それにもかかわらず、本発明者らは、痕跡レベルのＡＰＬＮＲが、ｈＥＳＣでのＥＬＡの効果を媒介し得ないことを確実にするために、未分化ｈＥＳＣにおいてＡＰＬＮＲのｓｈＲＮＡ媒介性枯渇を実施した。本発明者らは、組換えＡＰ−ＥＬＡと容易に結合するｈＥＳＣに対してこれまでに記載されたＥＬＡ細胞表面結合アッセイを適合させた（Ｃｈｎｇら、２０１３年）。未分化ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳＣは、不変のＡＰ−ＥＬＡ結合能を有していたが、ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳ由来中内胚葉細胞は、組換えＡＰ−ＥＬＡの大幅に少ない細胞表面保持を有していた（図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄおよび図１４Ｅ）。これらのデータは、ＡＰＬＮＲは、中内胚葉細胞においてＥＬＡとの細胞表面結合を付与するのに必要であるが、未分化ｈＥＳＣではＥＬＡの受容体ではないということを示唆する。この結論と一致して、ｓｈＡＰＬＮＲ ｈＥＳＣの成長は、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣのものとは異なり、損なわれなかった（図１４Ｆ）。本発明者らは、これらの実験から、ｈＥＳＣには代替ＥＬＡ受容体が存在し、胚性自己複製の維持に関与していることを予測する。
結果：ＥＬＡは、ｈＥＳＣにおいてＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化する
ｈＥＳＣにおける即時ＥＬＡシグナル伝達経路を描写するために、本発明者らは、下流標的にそれを見出そうとした。細胞培養におけるアミノ酸による安定な同位元素標識（ＳＩＬＡＣ）（ＣｏｈｅｎおよびＭｅｌｔｏｎ、２０１１年）として知られるプロテオミクスアプローチを使用して、本発明者らは、ベースライン対照として不活性ＥＬＡＲＲ＞ＧＧペプチドを使用してＥＬＡを１０分間瞬間適用されたｈＥＳＣのホスホプロテオームを分析した（図１５Ａ）。実験は、フォワードおよびリバース両立体配置で２回実施し、再現されたヒットのみをさらに調べた。ＥＬＡＲＲ＞ＧＧではなくＥＬＡによって活性化された最上位のホスホペプチドは、ＰＲＡＳ４０（４０ｋＤａのプロリンリッチＡｋｔ別名ＡＫＴ１Ｓ１の基質）に由来するＬＮｐＴＳＤＦＱＫであった（図１５Ｂ）。ＰＲＡＳ４０は、ＡＫＴの基質であり、順に、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）によって活性化される（Ｖａｎｄｅｒ Ｈａａｒら、２００７年）。これは、ＥＬＡが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化できることを示唆する。実際、ｈＥＳＣＳへの組換えＥＬＡの添加は、セリン４７３でのＡＫＴの即時リン酸化を引き起こし、トレオニン２４６でのＰＲＡＳ４０のリン酸化につながるのに十分である（図１５Ｃ）。これは、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧまたは媒体対照で処理された細胞では観察されず（図１６Ａ）、細胞を汎ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２４９００４またはワートマニンで前処理することによって抑制された（図１５Ｄ）が、ｓｈ媒介性ＡＰＬＮＲ枯渇を使用して抑制されなかった（図１６Ｃ）。これは、ＡＫＴのＥＬＡ活性化がＡＰＬＮＲ独立性であり、ＰＩ３Ｋを必要とすることを実証する。ひと度、リン酸化されると、ＰＲＡＳ４０は、不活性になり、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）シグナル伝達経路に対するその抑制効果を軽減する（Ｓａｎｃａｋら、２００７年；Ｗａｎｇら、２０１２年；Ｗａｎｇら、２００７ａ）。ｍＴＯＲＣ１複合体のその後の活性化は、プロトタイプのその基質ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化によって示される（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ｗａｎｇら、２００７ａ）（図１５Ｃ）。したがって、ＥＬＡは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を、続いて、ｍＴＯＲＣ１経路を活性化する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびｍＴＯＲは両方とも、成長および生存力の強力な調節因子であり、ｈＥＳＣの自己複製能に完全に貢献する（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００６年；Ｚｈｏｕら、２００９年）。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの自己複製および生存力の喪失と一致して、本発明者らは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、実際、低レベルの内因性ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびｍＴＯＲ活性を有し、これは、成長培地中の外因性インスリンの段階的に低下するレベルによって示され得ると見出す（図１５Ｅ）。これらの結果は、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣにおいて見られる成長欠乏症は、ＥＬＡによって媒介される傍分泌および自己分泌ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の喪失に起因するということを示唆する。
結果：ＥＬＡは、細胞周期およびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの下流のタンパク質翻訳に影響を及ぼす
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴは、成長および増殖に関与する多くの細胞プロセスの上流である（Ｂｒｏｎｓら、２００７年）。１つのこのような機能は、細胞周期の間にＧ１／Ｓ遷移によって細胞の信号を調節することである（Ｔｅｓａｒら、２００７年）。胚性幹細胞は、分化細胞と比較して、簡略化されたＧ１相を有する（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＳｍｉｔｈ、２０１２年）。サイクリンＤが最も不活性であるｍＥＳＣにおいてとは異なり（ＤｒｅｅｓｅｎおよびＢｒｉｖａｎｌｏｕ、２００７年）、ｈＥＳＣでは、ｐＲＢ−サイクリンＤ／ＣＤＫ４／６カスケードが使用可能であり（ＤｒｅｅｓｅｎおよびＢｒｉｖａｎｌｏｕ、２００７年）、Ｇ１／Ｓ遷移および多能性にとって不可欠である（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年；Ｖｏｓｋａｓら、２０１４年）。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴは、サイクリンＤの転写後安定化にとって重大であるので（Ｘｕら、２００５年）、本発明者らは、ｓｈＥＬＡ細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の喪失は、Ｇ１相での細胞の蓄積をもたらすであろうと仮定した。二重チミジン遮断からの放出後のｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの細胞周期の注意深い分析は、Ｇ１での細胞の注目すべき増大（図１５Ｆ、黒）およびＧ２／ＭからＧ１／Ｇ０に戻る遷移にわずかな遅れ（図１５Ｆ、マジェンタ）を示した。定常状態で、ＥＤＵ組込みもまた、Ｇ１／Ｇ０相でのｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣの同様の蓄積を示した（図１６Ｃ）。ＡＫＴの下流のｍＴＯＲの改善された活性化と一致して、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、蛍光標識されたアミノ酸の組込みによってアッセイされたように。タンパク質合成の低減を示した（Ｖａｎｄｅｒ Ｈａａｒら、２００７年；Ｗａｎｇら、２０１２年）（図１６Ｄ）。これらのデータは、ＥＳＣにおけるＥＬＡの機能の１つが、細胞周期進行および最適タンパク質翻訳を促進すること示唆する。
結果：ＥＬＡは、アポトーシスから保護し、ストレス誘導性細胞死を防ぐ
ｈＥＳＣは、外因性インスリン（Ｓａｎｃａｋら、２００７年）および自己由来ＩＧＦ２（Ｗａｎｇら、２００７ａ）に依存性であり、その両方ともＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化して、自己複製を媒介し、分化を防ぐ（Ｗａｎｇら、２００７ａ）。このため、ｍＴＳＥＲ１培地（この研究において使用される）およびｈＥＳＣ培地のほとんどの処方（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、２００６年；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年）は、高レベルのインスリンを含有する。ＥＬＡの必要性を調べるために、本発明者らは、その組成の正確な管理を可能にする４種の増殖因子：インスリン、ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１およびトランスフェリンのみを含有する、既定のＴＳＥＲｅ８培地（Ｚｈｏｕら、２００９年）で培養した。本発明者らは、インスリンが、この処方においてＡＫＴの唯一のアクチベーターであることを確認した（図１８Ａ）。２種の異なるｈＥＳＣ株ＳＨＥＦ４およびＨＥＳＣ３において、本発明者らは、インスリンの非存在下での成長の２４時間後に、高率の細胞死を観察した。ＥＬＡの添加は、細胞生存力において８０％〜９０％のレスキューを提供したが、ＥＬＡＲＲ＞ＧＧは効果を発揮しなかった（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。対照的に、本発明者らは、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、対照ｈＥＳＣＳと比較してインスリン欠乏に対して非常に感度が高いが、ＥＬＡの添加は、中間の成長レスキューを提供した（図１７Ａ）と見出した。これらの結果は、ＬＹ２９４００２の添加が、ＥＬＡのレスキュー効果を抑制したので、ＥＬＡがＰＩ３Ｋ依存的に部分的にインスリンを置き換える、５日にわたる細胞指数測定によって確認された（図１７Ｂ）。したがって、ＥＬＡは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性によって、ｈＥＳＣの成長培地においてインスリンと部分的に置き換わる。
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴは、正常および癌幹細胞両方における、その抗アポトーシス特性について最も認識されている（Ｂｒｏｎｓら、２００７年）。ＡＫＴは、ＮＫ−ｋＢなどの生存促進経路を活性化しながら、ＢＡＤおよびＦＯＸＯなどの多数のアポトーシス促進分子のリン酸化および不活性化によってアポトーシスを阻害する（Ｂｒｏｎｓら、２００７年）。このため、本発明者らは、ＥＬＡはアポトーシスを防ぎ、それによってｈＥＳＣ成長を増強し得ると仮定した。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、損なわれたＡＫＴシグナル伝達および成長を有するという本発明者らの観察結果と一致して、本発明者らは、アネキシンＶの（図１７Ｃ）および細胞内活性化カスパーゼ３（図１７Ｄ）の表面発現によって示され、免疫蛍光染色によっても観察される（図１７Ｅ）ように、継代培養後に、大幅に高い割合のｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣがアポトーシスを起こすと見出した。これは、解離誘導性細胞死、すなわち、アノイキス（Ｂｅｎｄａｌｌら、２００７年；Ｗａｎｇら、２００７ｂ）などの、日常的なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養条件によって誘導されるアポトーシスから保護するために、内因性ＥＬＡが必要であることを示唆する。この観察結果と一致して、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害によってアノイキスを阻害するＹ−２７６３２の非存在下では単細胞解離を生き残らない（ＨａｎａｈａｎおよびＣｏｕｓｓｅｎｓ、２０１２年）（図１８Ｄ）。逆に、合成ＥＬＡペプチドは、未処理ｈＥＳＣと比較して、解離後の生存を増大でき、部分的に、Ｙ−２７６３２と置き換わる（図１８Ｄ）。細胞ストレスに対するＥＬＡの保護的役割をさらに実証するために、本発明者らは、ｈＥＳＣを電離放射線に曝露して、ＤＮＡ損傷をシミュレートした（図１７Ｆ）。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、対照に対してγ照射に対して２倍の感受性であったが、ＥＬＡ処理ｈＥＳＣは、５倍より抵抗性であった。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣへの外因性ＥＬＡの添加は、この表現型をレスキューした（図１７Ｆ）。これらの結果と一致して、１グレイのγ照射に対する曝露の３時間後に、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣにおいて、対照と比較して高レベルの活性化カスパーゼ３が検出されたが、ＥＬＡ処理ｈＥＳＣでは、ＤＮＡ二本鎖切断を示す、匹敵する数のγＨ２ＡＸフォーカスにもかかわらず（図１７Ｇ）ほとんど検出不能であった。ｈＥＳＣをナノモル濃度のアクチノマイシンＤを用いて処理した場合に同様の結果が得られ、これは、翻訳ストレスを負わせ（Ｊｕｎｔｔｉｌａおよびｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ、２０１３年）、Ｐ５３依存性細胞周期停止およびアポトーシスを伴う（Ｍｏｒａｌ ａｎｄ Ｐａｒａｍｉｏ、２００８年）。ＳｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、対照と比較して、より感受性が高いが、ＥＬＡの付加は、対照ｈＥＳＣに相当な耐性を付与し、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣを完全にレスキューした（図１７Ｈ）。突然変異体ＥＬＡＲＲ＞ＧＧは、保護効果を有していなかった（図１８Ｅ）。ＥＬＡは、ストレスに対する曝露後にＰ５３タンパク質のレベルに対して明らかな効果はなかった（図１８Ｆ）。ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、低レベルの抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーＭＣＬ−１を有しており、これは外因性ＥＬＡを用いてレスキューされた（図１８Ｆ）。同時に、ｓｈＥＬＡ細胞は、ミトコンドリアにおいて高レベルのＢＡＸを有していたが、ＥＬＡ処理細胞では細胞質において本来のままであった（図１８Ｇ）結果として、ｓｈＥＬＡ ｈＥＳＣは、ＣＹＴ Ｃ（図１７Ｉおよび１８Ｇ）およびＢＡＸによって媒介される（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇら、２０１４年）カスパーゼ９の完全な漏出と一致して、増大したレベルの活性化カスパーゼ３／７を有していた。これは、外因性ＥＬＡの添加によって完全に抑制された（図１８Ｈ）。総合すると、本発明者らの結果は、外因性ＥＬＡは、細胞ストレスによって活性化された内因性アポトーシス経路から保護するが、ＥＬＡが枯渇したｈＥＳＣは、ストレスに対して高度に感受性であることを示す。
本発明者らは、次いで、培養ｈＥＳＣにおいて観察された細胞死に対するＥＬＡの保護効果は、ｉｎ ｖｉｖｏでも関連があるか否かを調べようとした。劣性ヌル対立遺伝子（Ｇａｇｇｉｏｌｉら、２００７年）を保持するｅｌａ突然変異体ゼブラフィッシュ胚では、本発明者らは、２４受精後時間（ｈｐｆ）で活性化カスパーゼ３−陽性細胞数の全身性の増大を観察し、ｅｌａｂｒ１３の躯幹、脳および眼周辺領域においてアポトーシス細胞のクラスターを有していたが、野生型胚ではなかった（図１７Ｊ）。これは、Ｅｌａの抗アポトーシス活性もまた、胚発生の間に関連していることを示唆する。
考察：ＥＬＡの代替受容体は、ｈＥＳＣにおいてその機能を媒介する
組換えＥＬＡは、ｈＥＳＣによって迅速に取り込まれる、内因性ＥＬＡは、細胞質中に見出され得るという本発明者らの観察結果は、これらの細胞中に献身的な受容体を有することを示唆する。本発明者らは、ＥＬＡが、その極めて塩基性のアミノ酸構成（Ｃｈｎｇら）にもかかわらず、自己貫通性ペプチドの行動をとる（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８年）という可能性を指示しないが、これは、その迅速な細胞取り込みがが、ｈＥＳＣのみにおいて観察され、その他の試験された細胞型では観察されないからである。本発明者らによってこれまでに報告され、確認されたように、ＡＰＬＮＲは、ｈＥＳＣにおいてサイレントである。したがって、本発明者らは、ｈＥＳＣでは、別の細胞表面受容体が、ＥＬＡの活性を媒介すると考える。さらに、特定の細胞型においてＡＰＬＮＲを介してＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを活性化するアペリン−１３（Ｔａｎｇら、２００７年）は、ｈＥＳＣに対して効果がない（示されていないデータ）。ＥＬＡの既知受容体ＡＰＬＮＲは、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーに属するので、本発明者らは、代替および初期受容体もＧＰＣＲであり得ると予測するが、本発明者らは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などのその他の受容体の種類を除外できない。
考察：ＥＬＡによる胚性成長能の調節
多能性回路の維持のための転写因子に、不相応な重点が置かれてきた。近年、過剰の転写因子が、多能性状態にとって重要であり、初期化を増強すると示されてきた（ＴａｋａｈａｓｈおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年）。しかし、多能性のための確立された因子であるＮＯＤＡＬ／ＢＭＰ、ＩＧＦ／ＦＧＦおよびＷＮＴの十分に研究された役割の他には、この２０年で、多能性において役割の証明された極めて少ない新規分泌因子しか発見されていない。インスリン／インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで着床前胚性成長を刺激し、マウス胚の内部細胞塊中の細胞数を増大し、酸化ストレスによって誘導されるアポトーシスから保護するするとよく知られている（Ｋｕｒｚａｗａら、２００２年；ＭａｒｋｈａｍおよびＫａｙｅ、２００３年；Ｒａｐｐｏｌｅｅら、１９９２年）。ヒトおよびマウスの両方で、ＩＧＦ−２は胚において産生され、自己分泌様式で作用するのに対し、インスリンおよびＩＧＦ−１は、着床前胚では検出不能であるが、母系性環境によって供給されると考えられる（Ｌｉｇｈｔｅｎら、１９９７年；Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９３年）。
本明細書において、本発明者らは、新規細胞外分子、ＥＬＡが存在し、幹細胞性において重要な役割を果たすことを証明する。ＥＬＡは、インスリンおよびＩＧＦ同様、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化でき、初期胚発生の間、この重要な経路の内因性または代替アクチベーターのいずれかである。ｈＥＳＣにおいて多能性を維持するために、外因的に添加される、またはフィーダー細胞によって分泌されることを必要とするＦＧＦとは異なり、ＥＬＡは、十分な量で、ｈＥＳＣによって内因的に合成され、分泌される。ＥＬＡの阻害は、迅速なアポトーシスを引き起こし、ｈＥＳＣに本来備わっている高レベルの自発的アポトーシスに対抗するための生存促進因子として働くことを示唆する。これと一致して、本発明者らは、単細胞として成長したｈＥＳＣにおけるＥＬＡの枯渇は、解離後の効率のアノイキスのために（Ｗａｎｇら、２００９年；Ｗａｔａｎａｂｅら、２００７年）、コロニーで成長したｈＥＳＣよりも有害である注記する。あるいは、これは、単細胞によってよりも、ｈＥＳＣコロニーによる傍分泌様式においてより容易に捕捉され得るペプチドの細胞外活性を指し示す可能性がある。また、本発明者らは、内因性ＥＬＡは、ｈＥＳＣコンディショニング培地中にｎＭ範囲で存在し、本発明者らの組換えペプチドは特異的であり、生理活性であるが、μＭ範囲でのみ働くことを注記する。この知見は、グレリンなどのその他のペプチドホルモンについてそうであるように（Ｋｏｊｉｍａら、１９９９年）、その完全な効力のために必要である、内因性ＥＬＡでのあり得る翻訳後修飾の存在を示唆する。
総合すると、本発明者らのデータは、成熟したＥＬＡは、ＥＳ細胞および初期胚の生存および自己複製を維持するために、ｈＥＳＣによって分泌され、傍分泌様式でｈＥＳＣによって取り込まれ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の未知の受容体を介してシグナル伝達する内因性ペプチドホルモンとして機能することを示唆する。ＥＬＡは、ヒト胚盤胞、ｈＥＳＣが由来する段階において高度に発現されるので、本発明者らは、ゼブラフィッシュ胚においてそうであるのと同様の保護的役割を哺乳動物着床前胚において果たす可能性があると推論する。ＥＬＡが保護し得る、哺乳動物胚において内因性ストレスがシグナル伝達するものは、完全には明らかになっていない。酸素正常状態、複製ストレス、栄養素欠乏、温度は、胚発生の間のＥＬＡの必要性を同じように求め得る潜在的刺激である。
ＥＬＡマウスノックアウト：導入
本発明者らは、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の新規、初期内因性リガンドとしてのＥＬＡＢＥＬＡ（ＥＬＡ）の発見を最近報告した。Ａｐｌｎｒ（またはＡｐｊ）を欠損したマウスは、心血管欠陥を示し、適切な循環がないためにおよそ１０．５日の妊娠に敗れる（Ｃｈａｒｏら、２００９年）。しかし、アペリン、Ａｐｊの既知リガンドを欠損したマウスは、表現型的に正常である（Ｃｈａｒｏら、２００９年）。これは、Ａｐｊの心血管機能がアペリンよりもＥｌａによって媒介されることを示唆し、本発明者らをマウス胚性発達へのＥｌａの寄与を調べるよう促した。
ＥＬＡマウスノックアウト：材料および方法
コンディショナルＥｌａノックアウトマウスの構築
ｌｏｘ−ｐ部位がそれぞれの両端に位置する、Ｅｌａｂｅｌａの相同性アームおよびエキソン２を、ＦＲＴ部位がそれぞれの両端に位置するｎｅｏカセットと一緒に含有する線形化ターゲッティングベクターを、１２９Ｓｖマウス胚性幹細胞中にエレクトロポレーションした。ターゲッティングを、サザンブロッティングによって確認した。確認されたクローンを、Ｆｌｐリコンビナーゼを用いてカセットを除去するようトランスフェクトし、続いて、Ｃ５７ＢＬ６レシピエント胚盤胞中に注入し、偽妊娠雌中に移植した。＞５０％キメラ化を有するＦ０創始者をＣ５７ＢＬ６と戻し交配した。安定なＥＬＡＦｌｏｘ生殖系列伝達を確認すれば、Ｆ１世代を、ＺＰ３−ｃｒｅリコンビナーゼ含有トランスジェニックマウスと交配して、エキソン２を除去してＥｌａΔヌル対立遺伝子を作製した。その後、８世代の間、ＥｌａΔ／＋ヘテロ接合性マウスをＣ５７ＢＬ６と交配し、その後、表現型分析した。
Ｅｌａ欠損胚の表現型特徴
表現型分析のために、ＥｌａΔ／＋マウスを交配して、ＥｌａΔ／Δ、ＥｌａΔ／＋および野生型胚を作製した。胚をｅ１０．５．卵黄嚢で回収し、胚を４％ ＰＦＡを用いて１時間固定し、続いて、Ｐｅｃａｍ−１（ＭＥＣ１３．３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について免疫組織化学検査を行った。胚および卵黄嚢も、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために切片に、心血管構造の形態学を観察した。
ＥＬＡマウスノックアウト：結果
本発明者らは、図１Ａに示される図式に従ってＥｌａノックアウトマウス（ＥｌａΔ／Δ）を成功裏に作製した。Ｅｌａノックアウトマウスは、生存可能であり、繁殖性があるが、統計上有意な低減を示したが、離乳の時点でメンデル比において統計上有意な低減を示し、これは、部分胚性致死を示唆する（図１Ｂ）。ｅ１０．５胚の分析は、Ｅｌａノックアウトの部分は、Ａｐｊノックアウトマウスの表現型を暗示する重症心血管形成異常を有することを示した。これらは、乏血管化卵黄嚢（図１Ｃ）、心臓浮腫（図１Ｃ）および心臓管の異形成（図１Ｆ）を含む。内皮細胞を示すＰｅｃａｍ−１染色は、Ｅｌａノックアウトマウスが、内皮細胞および未熟な血管網を発達させたが、これらは、成熟せず、機能性血管に癒合しなかった（図１Ｄ）ことを示した。さらに、血液形成の最初の部位である卵黄嚢の内胚葉および中胚葉層は、対照同腹仔と比較して、正しく融合されず、内皮細胞で裏打ちされなかった（図１Ｅ）。最後に、Ｅｌａノックアウトマウスにおいて間違って形成された心臓の検査は、目に見える肉柱形成を欠く、いくつかの形成不足の心内膜を示した。総合すると、本発明者らの結果は、アペリンではなく、ＥｌａがＡｐｊと行動を共にして、正しい心血管形態形成を媒介することを示す。
ＨＩＶ阻害：材料および方法
ＥＬＡ 受容体 結合実験
これまでに記載されたように（Ｃｈｎｇら、２０１３年）、ＥＬＡ−ＡＰをコードする構築物を２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトすることによって分泌型ＥＬＡ−アルカリホスファターゼ（ＥＬＡ−ＡＰ）を産生した。次いで、ＥＬＡ−ＡＰ発現細胞から得たコンディショニング培地を、推定受容体の全長ＯＲＦをコードするプラスミドを用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞とともに３時間インキュベートした。結合していないＥＬＡ−ＡＰを洗浄除去し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ／ＰＢＳを用いて細胞を溶解した。溶解物を清浄化し、ＡＰ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴとともに３７℃で１５分間インキュベートした。光学濃度を４９５ｎｍで読み取り、青色呈色の強度は、過剰発現された受容体に対するＥＬＡ−ＡＰの親和性と正比例している。
ＥＬＡ−ＣＸＣＲ４結合アッセイ
ＥＬＡまたはＳＤＦ−１によるＣＸＣＲ４の活性化を検出するために、下流リポーターに連結されたＣＸＣＲ４を安定に発現する細胞に、組換えＥＬＡまたはＳＤＦ−１を漸増濃度で９０〜１８０分間添加した。β−アレスチン補充を、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）β−アレスチンＣＸＣＲ４アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ）を使用して測定した。ＣＸＣＲ４のアレスチンとの相互作用を、一方がＣＸＣＲ４と融合しており、もう一方がβ−アレスチンと融合しているβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の２つの相補性ドメイン間の酵素断片相補（ＥＦＣ）によって検出した。ＣＸＣＲ４へのβ−アレスチン補充は、２つのドメインの相補をもたらし、β−Ｇａｌ活性が生じる。活性％＝１００％×（試験サンプルの平均ＲＬＵ−媒体対照の平均ＲＬＵ）／（平均ＭＡＸ対照リガンド−媒体対照の平均ＲＬＵ）。ＥＬＡによるＳＤＦ−１の拮抗作用を検出するために、ＥＣ８０濃度のＳＤＦ−１の存在下で、ＥＬＡのＥＣ５０を測定することによって、アッセイをアンタゴニストモードで実施した。ＥＬＡおよびＳＤＦ−１間の相乗作用を検出するために、ＥＣ２０濃度のＳＤＦ−１の存在下で、ＥＬＡのＥＣ５０を測定することによって、アッセイを正のアロステリックモードで実施した。
ＨＩＶ阻害アッセイ
ＨＩＶ−１（ＮＬ４３、ＪＲＣＳＦおよびＮＬＡＤ８株）およびＨＩＶ（ＶＳＶ）、ｅｎｖ遺伝子が欠失している欠陥のあるＨＩＶ−１およびＶＳＶ−Ｇエンベロープを有する偽型を産生し、これまでに記載されたように（Ｍａｒｅｃｈａｌら、１９９８年；Ｏｂｅｒｌｉｎら、１９９６年；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９８年）、感染を実施した。Ｐ４Ｃ５細胞（ＨｅＬａ ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋ＣＣＲ５＋ＬＴＲ−ｌａｃＺ）（Ｍａｒｅｃｈａｌら、１９９８年）を、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。９６ウェルプレート中のＰ４Ｃ５細胞（ウェルあたり１０４個）を２４時間培養し、その後、これまでに記載されたように（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９８年）ＥＬＡの非存在下または存在下で、２０ｎｇのＤＥＡＥデキストラン／ｍｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）とともに、２００μｌのウイルス上清（３連で）を用いて感染させた。ウイルス播種材料は、それぞれ、ＮＬ４３のｐ２４およびＪＲＣＳＦウイルスについて２および２．５ｎｇに相当した。ウイルス曝露（３７℃で２時間）後および毎翌日、上清を回収し、ＥＬＡを含有するか含有しない新鮮培地と交換した。示された期間の後、細胞を洗浄して結合していないウイルスを除去した。２４時間後、β−ｇａｌ活性を測定した。細胞を、１００μｌの６０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび０．１２５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０に溶解した。溶解物を、１００μｌの８０ｍＭ ＮａＰＯ４（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび６ｍＭクロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシドモノ−Ｎａ塩と混合し、３７℃でインキュベートし、その後、５４０ｎｍで光学濃度を測定した。
ＨＩＶ阻害：結果
上記の実験結果の結果は、図２０Ａ〜２０Ｄに示されている。
図２０Ａは、ＣＸＣＲ４は、ＥＬＡの代替受容体であることを示す。図は、色強度が結合の程度と相関するＥＬＡＢＥＬＡの結合アッセイを示す。ＡＰＬＮＲ同様、ＧＰＣＲ ＣＸＣＲ４は、最も顕著なＨＩＶ受容体の１種であり、ＥＬＡとの細胞表面結合を付与する。その他の試験されたＧＰＣＲは、結合を付与せず、アッセイ特異性を証明した。
図２０Ｂは、ＣＸＣＲ４は、ＥＬＡによって活性化されないことを示す。ＣＸＣＲ４の同族リガンドＳＤＦ１（別名ＣＸＣＬ１２）とは異なり、ＥＬＡはＣＸＣＲ４を活性化できない。
図２０Ｃは、ＣＸＣＲ４はＥＬＡによってアンタゴナイズされることを示す。ＥＬＡは、ＳＤＦ１媒介性ＣＸＣＲ４活性化を防ぐことによってＣＸＣＲ４拮抗リガンドとして行動する。
図２０Ｄは、ＥＬＡが、ＨｅＬａ細胞においてＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ株を阻害することを示す。ＥＬＡは、ＮＬ（ＨＩＶ−１ ＮＬ４３：ＣＸＣＲ４向性株）への感染を阻害するが、ＡＤ８（ＨＩＶ−１ ＮＬＡＤ８：ＣＣＲ５向性ウイルス）またはＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルスへの感染は阻害しない。ＨＩＶ−１感染は、感染の３６〜４８時間後の比色分析アッセイ（Ｂ−Ｇａｌ活性）によって測定される。ＥＬＡは、１０〜４０μＭでＨＩＶを阻害する。ネビラピン、リバーストランスクリプターゼ阻害剤は、試験されたすべてのウイルスを遮断する。
［参考文献］
本明細書およびその特許請求の範囲において、動詞「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用は、その単語に続く項目が含まれることを意味するようその制限されない意味で使用されるが、具体的に記載されていない項目は排除されない。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、要素のうち１つおよび１つのみがあることを文脈が明確に必要としない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、普通、「少なくとも１つの」を意味する。
本明細書において記載された出願および特許の各々および上記の出願および特許の各々において引用または参照された各文書、出願および特許の各々の審査の間を含めて（出願に引用された文書）ならびに出願および特許の各々において、および出願に引用された文書のいずれかにおいて、引用または記載された任意の製品の任意の製造業者の説明書またはカタログは、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に引用されたすべての文書および本明細書において引用された文書において引用または参照されたすべての文書ならびに本明細書において引用または記載された任意の製品の任意の製造業者の説明書またはカタログは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
記載された方法および本発明の系の種々の修飾および変法は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に制限されないと理解されなくてはならない。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載された様式の種々の修飾は、特許請求の範囲内にあるものとする。
非公式の配列表
配列番号１
ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドシグネチャー配列
ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号２
ヒト属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号３
シロアシネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＶＮＦＰＫＫＲＫＶＹＲＨＮＣＦＲＲＲＣＶＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号４
クマネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＥＫＳＶＮＦＰＲＲＲＫＬＹＲＨＮＣＦＲＲＲＣＩＳＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号５
ハツカネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＫＰＶＮＦＰＲＲＲＫＬＹＲＨＮＣＦＲＲＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号６
ウシ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＱＡＮＬＡＭＲＲＫＬＨＲＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号７
イノシシ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＡＮＬＡＶＲＲＫＬＨＲＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号８
アルマジロ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＡＮＬＡＭＲＲＫＬＨＲＨＮＣＦＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号９
フクロギツネ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＧＮＬＡＬＲＲＫＰＨＲＨＩＣＰＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１０
ガルス属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＡＮＬＡＬＲＲＫＬＨＲＨＮＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１１
ヤモリ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＡＮＬＳＬＲＲＫＬＨＲＱＨＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１２
アノリス属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＡＮＬＡＳＲＲＫＬＨＲＨＨＣＳＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１３
ゼノパス属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＫＰＡＮＬＡＱＲＲＲＩＨＲＨＮＣＦＬＫＲＣＩＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１４
トラフサンショウウオ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＲＰＶＮＡＡＨＲＲＲＬＨＲＨＮＣＳＬＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１５
メダカ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＡＲＰＤＦＬＮＬＲＲＫＹＨＲＨＨＣＬＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１６
ソウギンザメ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＱＫＳＧＮＳＷＲＲＫＫＭＱＲＲＮＣＷＨＲＲＣＬＰＦＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１７
タイヘイヨウサケ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＶＲＰＤＩＬＮＩＲＲＲＹＨＲＨＨＣＰＨＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１８
ダニオ属ＥＬＡＢＥＬＡ成熟ポリペプチド
ＤＫＨＧＴＫＨＤＦＬＮＬＲＲＫＹＲＲＨＮＣＰＫＫＲＣＬＰＬＨＳＲＶＰＦＰ
配列番号１９
ヒトＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列
ＭＲＦＱＱＦＬＦＡＦＦＩＦＩＭＳＬＬＬＩＳＧ
配列番号２０
シグナル配列（太字）を有するヒト属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２１
シグナル配列（太字）を有するシロアシネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２２
シグナル配列（太字）を有するクマネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２３
シグナル配列（太字）を有するハツカネズミ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２４
シグナル配列（太字）を有するウシ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２５
シグナル配列（太字）を有するイノシシ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２６
シグナル配列（太字）を有するアルマジロ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２７
シグナル配列（太字）を有するフクロギツネ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２８
シグナル配列（太字）を有するガルス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号２９
シグナル配列（太字）を有するヤモリ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３０
シグナル配列（太字）を有するアノリス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３１
シグナル配列（太字）を有するゼノパス属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３２
シグナル配列（太字）を有するトラフサンショウウオ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３３
シグナル配列（太字）を有するメダカ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号 ３４
シグナル配列（太字）を有するソウギンザメ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３５
シグナル配列（太字）を有するタイヘイヨウサケ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３６
シグナル配列（太字）を有するダニオ属ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
配列番号３７
ヒトＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列
配列番号３８
マウスＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＮ配列
配列番号３９
ニワトリＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列
配列番号４０
アフリカツメガエルＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列
配列番号４１
ゼブラフィッシュＥＬＡＢＥＬＡ ｃＤＮＡ配列
配列番号４２
ヒトＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列
ＡＫ０９２５７８；ＬＯＣ１００５０６０１３；ｃＤＮＡ ＦＬＪ３５２５９ ｆｉｓ；クローンＰＲＯＳＴ２００４２５１；Ｈｓ．１０５１９６
＞ｇｉ｜２１７５１２０２｜ｄｂｊ｜ＡＫ０９２５７８．１｜ヒトｃＤＮＡ ＦＬＪ３５２５９ ｆｉｓ、クローンＰＲＯＳＴ２００４２５１
配列番号４３
マウスＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列
マウス遺伝子ＡＫ０１４１１９；ＸＭ＿００３０８４７７１．１；Ｍｍ．５８８４７
＞ｇｉ｜７４１８２８８５｜ｄｂｊ｜ＡＫ０１４１１９．１｜マウス１３日胚 頭部ｃＤＮＡ、ＲＩＫＥＮ全長濃縮ライブラリー、クローン：３１１００３３Ｉ２０生成物：仮定上タンパク質、全長挿入配列
配列番号４４
ニワトリＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列
Ｇｇａ．３９５７５； ｅｎｓｅｍｂｌ中の遺伝子：ＥＮＳＧＡＬＴ００００００３８７７７；ガルス属仮定上タンパク質ＬＯＣ７７０１５４（ＬＯＣ７７０１５４）、ｍＲＮＡ
配列番号４５
アフリカツメガエルＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列
Ｘｌ．４０６８４； ＵＧＩＤ：１２５７９５４； ＵｎｉＧｅｎｅ Ｘｌ．４０６８４
配列番号４６
ゼブラフィッシュＥＬＡＢＥＬＡゲノム配列
Ｄｒ．８１８５７；ＵＧＩＤ：２４４３１３１；ＵｎｉＧｅｎｅ Ｄｒ．８１８５７； ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＷ７７７２１５．１；ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００１３３５１８６．１；ｇｉ｜１２５８０３４４２｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１３３５１８６．１｜
配列番号４７
抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ａ
ＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡ
配列番号４８
抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｂ
ＣＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣ
配列番号４９
抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｃ
ＧＴＧＡＴＴＣＴＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＣ
配列番号５０
抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｄ
ＣＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＴＧＡＣＴ
配列番号５１
抗ＥＬＡＢＥＬＡ ｓｈＲＮＡ配列Ｅ
ＴＴＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＴ

Claims (30)

  1. 幹細胞の自己複製を維持すること、幹細胞の多能性を維持すること、幹細胞の成長を維持すること、幹細胞の成長を促進すること、アポトーシスを阻害すること、胚性幹細胞の細胞表面と結合すること、幹細胞の分化を内胚葉または中胚葉系列に向けて偏向させること、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）と結合すること、ＣＸＣＲ４受容体と結合すること、Ｐ１３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化すること、心保護、例えば、虚血および／または再灌流の間に心機能を回復または維持すること、酸化ストレスを低減すること、梗塞の大きさを低減することならびにＨＩＶ感染を阻害することからなる群から選択されるＥＬＡＢＥＬＡ活性を含む、配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表す）を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、またはその断片、相同体、変異体もしくは誘導体。
  2. （ａ）配列番号１６２の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６２の１位は、塩基性アミノ酸残基、好ましくは、ＫまたはＲを含む）、
    （ｂ）配列番号１６３の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６３の１位は、塩基性アミノ酸残基、好ましくは、ＫまたはＲを含む）、
    （ｃ）配列番号１６３の配列（ＸＸＸＸＸＸＸＸＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ）（式中、Ｘは、アミノ酸残基を表し、配列番号１６３の１位および２位は、塩基性アミノ酸残基の対、好ましくは、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫまたはＲＲを含む）
    のうち１種または複数から選択される、請求項１に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  3. 配列番号２〜配列番号１８からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号２として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  4. 配列番号１９に示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡシグナル配列などのシグナル配列をさらに含む、請求項１、２または３のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  5. 配列番号２０〜配列番号３６からなる群から選択される配列、好ましくは配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列を含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  6. 前記配列ＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）における番号付けに基づいて、１位および６位の、またはおよそその位置のシステイン残基間の分子内共有結合を含むか、またはシステイン残基の一方または両方が、スルフヒドリル基を有する還元システインを含む、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  7. 配列番号２０として示されるヒトＥＬＡＢＥＬＡ配列の位置番号付けに基づいて、
    （ａ）好ましくは３１位の塩基性残基が中性残基に突然変異し、より好ましくは３１位のＫまたはＲがＡまたはＧに突然変異している、３１位にある塩基性残基の突然変異、
    （ｂ）好ましくは３２位の塩基性残基が中性残基に突然変異し、より好ましくは３２位のＫまたはＲがＡまたはＧに突然変異している、３２位にある塩基性残基の突然変異、
    （ｃ）Ｒ３１Ｇ、Ｒ３１Ａ、Ｋ３１ＧまたはＫ３１Ａ置換、好ましくは、Ｒ３２Ｇ、Ｒ３２Ａ、Ｋ３２ＧまたはＫ３２Ａ置換
    のうちいずれか１つまたは複数を含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  8. 請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドをコード可能な配列を含む核酸。
  9. 配列番号３７〜配列番号４６、好ましくは、配列番号３７または配列番号４２のヒトＥＬＡＢＥＬＡ核酸配列のうちいずれかに示される核酸配列を含む、請求項８に記載の核酸。
  10. 請求項８または９に記載の核酸を含む発現ベクターなどのベクター、このようなベクターもしくは核酸を含む細菌、真菌または酵母細胞などの宿主細胞、またはこのような宿主細胞、このようなベクターもしくはこのような核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物、好ましくは、マウスなどの哺乳動物。
  11. （ａ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、
    （ｂ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、
    （ｃ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチド、
    （ｄ）請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、
    （ｅ）請求項８または９に記載の核酸によってコードされるＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド、および
    （ｆ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
    のうちいずれか１種または複数と特異的に結合可能であり、任意選択で、標識をさらに含む、抗体またはその抗原結合断片。
  12. 好ましくは配列番号４７〜配列番号５１からなる群から選択される配列を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを調節可能なｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子。
  13. 対象とする化合物をアッセイする方法であって、
    （ａ）請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、前記候補化合物が前記ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドと結合するかどうかを判定すること、
    （ｂ）請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、前記候補化合物が前記ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの活性を調節するかどうかを判定すること、または
    （ｃ）請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを発現する細胞を、候補化合物と接触させること、およびアッセイを実施して、前記候補化合物が、前記細胞中のまたは細胞のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性の上昇または低減を引き起こすかどうかを判定すること
    を含み、
    好ましくは、そのように同定される前記対象の化合物を単離または合成することをさらに含む、方法。
  14. 請求項１３に記載の方法によって同定、単離または合成された、対象とする化合物。
  15. 請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを下方制御する方法であって、前記ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドを、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片、請求項１２に記載のｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたは請求項１４に記載の対象とする化合物に曝露することを含む、方法。
  16. （ａ）心機能不全、高血圧症または血圧、心収縮性もしくは体液平衡における心血管異常、
    （ｂ）心肥大、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、アテローム性動脈硬化症、梗塞後治療、心筋虚血−再灌流傷害または心房細動、冠動脈心疾患、心不全、肺動脈性高血圧症（ＰＡＨ）などの心血管疾患、
    （ｃ）高血圧症、アンギナ、うっ血性心不全または勃起不全などの高血圧症と関連している状態、
    （ｄ）個体におけるＡＩＤＳなどのＨＩＶ感染と関連している状態
    からなる群から選択されるＥＬＡＢＥＬＡ関連状態の治療、予防または軽減において使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター、宿主細胞もしくはトランスジェニック非ヒト動物、請求項１１に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１２に記載のｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ分子または請求項１４に記載の対象とする化合物。
  17. 血管拡張薬として使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド。
  18. 細胞を操作する方法であって、前記細胞を請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドに曝露することまたは請求項８または９に記載の核酸もしくは請求項１０に記載のベクターを前記細胞に導入することなどによって、前記細胞中のまたは細胞の、請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを調節する、好ましくは上方制御することを含む、方法。
  19. ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性の上方制御が、幹細胞中のまたは幹細胞の自己複製および／または多能性の維持または増強をもたらす、前記幹細胞中のまたは幹細胞の自己複製および／または多能性を維持または増強するための請求項１８に記載の方法。
  20. 幹細胞などの細胞、組織、臓器もしくは生物中のまたは幹細胞などの細胞、組織、臓器もしくは生物の、請求項１から７のいずれか１項に記載のＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドの発現、量または活性のいずれかの組合せを検出することを含む方法。
  21. 配列ＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰまたはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮまたは両方を含む第１の部分および対象とするポリペプチドを含む第２の部分を含む組合せであって、好ましくは、前記第１の部分および前記第２の部分が、化学コンジュゲーションなどにより、共有結合で接合され、前記組合せが、前記第１の部分および前記第２の部分を含む融合タンパク質を含む、組合せ。
  22. 請求項２１に記載の融合タンパク質を発現可能な発現構築物。
  23. 対象とするポリペプチドを検出または定量化する方法であって、請求項２１に記載の組合せを産生すること、および前記組合せの前記第１の部分の存在を検出することまたはそれを定量化することを含む、方法。
  24. 対象とするポリペプチドを単離する方法であって、請求項２１に記載の組合せを産生すること、および前記組合せを、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片などの前記第１の部分と特異的に結合可能な分子に曝露することを含む、方法。
  25. 対象とするポリペプチドを配列ＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰまたはＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮまたは両方とコンジュゲートしまたはその他の形で接合することを含む、方法。
  26. ＥＬＡＢＥＬＡポリペプチドまたはその断片を作製する方法であって、（ａ）細胞においてＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）（式中、Ｘは、１個の／任意のアミノ酸残基であり、前記ポリペプチド断片は、幹細胞の自己複製、多能性または両方を維持する）を含む配列をコードする核酸を発現させることまたは（ｂ）化学合成を使用してＣＸＸＸＲＣＸＸＸＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号１）を含む合成ポリペプチドもしくはその断片もしくは配列番号５３の配列を有する断片を生成することを含む、方法。
  27. ＥＬＡＢＥＬＡ発現を測定または検出するためのイムノアッセイキットであって、
    （ａ）（ｉ）配列ＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号５２）を含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣ（配列番号５３）を含むポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列ＱＲＰＶＮＬＴＭＲＲＫＬＲＫＨＮＣＬＱＲＲＣＭＰＬＨＳＲＶＰＦＰ（配列番号２）を含むポリペプチド、または
    （ｉｖ）配列番号１〜３６のいずれかの配列を含むＥＬＡＢＥＬＡポリペプチド
    のうち１種または複数と特異的に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原結合断片を含むコーティング抗原と、
    （ｂ）前記コーティング抗原を使用するための使用説明書と
    を含むイムノアッセイキット。
  28. 前記単離された抗体またはその抗原結合断片が標識されている、請求項２７に記載のイムノアッセイキット。
  29. 酵素標識された試薬、前記単離された抗体または抗原結合断片、固体基質またはそれらのいずれかの組合せと特異的に結合する二次抗体またはその抗原結合断片をさらに含む、請求項２７または２８に記載のイムノアッセイキット。
  30. 添付の図面の図１から２０を参照して以上に記載されているような方法または物、および添付の図面の図１から２０に示されるような方法または物。
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