CN112210001A

CN112210001A - 多肽片段ela13及其用途

Info

Publication number: CN112210001A
Application number: CN202011151156.1A
Authority: CN
Inventors: 张虹锐; 史影; 薛吉军
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-10-25
Filing date: 2020-10-25
Publication date: 2021-01-12

Abstract

本发明涉及一种多肽及其用途。本发明所述的多肽片段为ELA13，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。本发明的多肽ELA13可在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用。本发明的多肽ELA13是Elabela的碳端13个氨基酸的片段，本发明相关的试验表明，多肽ELA13具有抗肾脏纤维化作用，可显著降低纤维化标志物表达，体外条件下对NRK‑52E细胞纤维化具有明显的治疗作用。

Description

多肽片段ELA13及其用途

技术领域

本发明涉及一种多肽及其用途。

背景技术

近年来的研究表明一些多肽片段，特别是一些动物蛋白中的多肽片段具有显著的生物活性，具有潜在的开发前景。

Elabela是最近发现的一个基因，，编码54或32个氨基酸保守的C末端成熟肽激素。Chng的团队在2013年对哺乳类、禽类、两栖动物、鱼类等多种动物体内Elabela 的序列进行了测定系统。在前期的研究中Elabela主要影响胚胎的发育和治疗脑血管疾病，而在近期研究中发现Elabela在肾脏中高度表达，且与相关性肾病相关 (Stem Cells andDevelopment.2004,13:694-715；Journal of the American Society ofNephrology.2017,28:2694-2707；Cellular Physiology and Biochemistry.2018, 48:1347-1354)。

发明内容

本发明提供Elabela中的一个多肽片段，及这一片段的用途。

本发明所述的多肽片段为ELA13，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

本发明的多肽ELA13可在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用。

进一步，本发明的含有多肽ELA13的药物是以ELA13为活性成分，加入药剂学的至少一种辅料，制成冻干粉剂；或者是以ELA13为活性成分，加入药剂学的至少一种辅料，制成口服制剂；而且还可以以ELA13为活性成分，加入药剂学的至少一种辅料，制成注射，喷雾，外用制剂等。

更为具体的是本发明所述的药物，其制剂可以是注射剂、粉剂、肠溶衣制剂、微球、微囊、毫微球、脂质体、纳米粒或微乳制剂中的任一种。

肾脏纤维化(Renal fibrosis)是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程。不管最初的病因如何，肾脏纤维化被认为是各种损伤发生后的一个失败的伤口愈合过程，而且肾纤维化几乎是所有进行性慢性肾脏疾病的共同最终结果。在我国成年人慢性肾脏病患病率在逐年升高，如果引起慢性肾病的损伤延长，肾间质成纤维细胞被激活，细胞外基质积聚，肾组织广泛性瘢痕形成，导致肾功能受损，最终发展为终末期肾病，进而引起较高的发病率和死亡率(Kidney Int.2006,69:213-217；Lancet.2012, 379:815-822；Journal oftheAmerican Geriatrics Society.2009,57:2217-2223)。

肾纤维化的作用机制已经被大量研究，成纤维细胞和肌成纤维细胞是肾纤维化的关键效应细胞，被认为是与细胞外基质合成和沉积有关的主要细胞类型。炎症反应通过释放导致进行性肾纤维化的炎症细胞因子，从而在触发肾纤维化方面也起着重要作用。此外，肾纤维化的进展与许多信号通路有关，包括有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、血管生成、细胞凋亡和缺氧。TGF-β是一种重要的促纤维化细胞因子，可导致ECM调节失衡和肌成纤维细胞活化。目前，一些靶向TGF-β的分子已进入临床研究，如AP12009， LY2157299。Smad蛋白是典型TGF-β的重要中间产物。磷酸化Smads蛋白，转运到细胞核以调节下游基因表达。最新研究通过特异性Smad3抑制剂(SIS3) 抑制单侧输尿管梗阻肾的纤维化、凋亡和炎症。作为MAPKs的一员，ERK的激活调节了许多参与肾纤维化发生的细胞过程，包括凋亡、细胞增殖、上皮间质转化和ECM沉积。虽然对肾纤维化的作用机制有大量的研究，但在目前治疗肾纤维化的方法还是很有限的，主要是通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的治疗，其药物有两种：血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素转化酶拮抗剂，这两种药物对人和实验模型的蛋白尿、慢性肾病进展和肾纤维化初期都有明显的抑制作用。但到目前为止，还没有专门的治疗方法可以预防慢性肾病或改善肾纤维化(Cell stem cell.2017,21:166-177；Nephrology.2014,10:493-503；Journal of theAmerican Society of Nephrology.2014,25:2835-2846；Journal of the AmericanSociety ofNephrology.2017,28:2393-2408)。

本发明的多肽ELA13是Elabela的碳端13个氨基酸的片段，本发明相关的试验表明，多肽ELA13具有抗肾脏纤维化作用，可显著降低纤维化标志物表达，体外条件下对NRK-52E细胞纤维化具有明显的治疗作用。

附图说明

图1使用CCK-8试剂盒检测ELA13对细胞生长的影响，图中横坐标为给药浓度，纵坐标为细胞成活率。

图2 ELA13对TGF-β1诱导NRK-52E细胞纤维化标志物的影响。其中：

A为NRK-52E细胞中Collagen I，FN，和α-SMA蛋白的WB检测结果；

B为对WB结果的统计,图中横坐标细胞模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

图3 ELA13对UUO诱导小鼠肾脏纤维化病理变化的影响。

A为小鼠肾脏组织切片的H&E染色；

B为小鼠肾脏组织切片的Masson染色；

C为对胶原纤维蛋白Masson染色的统计结果，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

在H&E染色结果中，与对照组相比模型组小鼠肾小管严重萎缩，且间隙明显增大，正常肾脏组织结构被破坏；而对于给药治疗组小鼠组织形态则有明显改善。在Masson染色中，模型组小鼠蓝色的胶原纤维占据了肾脏组织的绝大部分，几乎丧失正常的肾脏形态，给药后的小鼠组织切片蓝色胶原纤维占比明显下降，且能看到部分肾脏形态。对组织切片Masson染色中胶原纤维的统计结果中显示出ELA13对胶原纤维明显的抑制作用，说明了ELA13对于UUO手术诱导的小鼠肾脏纤维化有一定的治疗作用。

图4 ELA13改善UUO诱导小鼠肾脏纤维化形态变化。

A为血清尿素氮含量，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为血清中尿素氮的相对含量；

B为血清血肌酐含量，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为血清中血肌酐的相对含量。

图5免疫组化检测小鼠肾脏中纤维化标志物的影响。

A-C为小鼠肾脏组织切片的Collagen I，FN和α-SMA免疫组化染色；

D为对小鼠肾脏组织切片免疫组化染色的统计结果，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

从三种标志物的免疫组化结果图中可以看出：模型组肾脏组织切片中大量面积被染成棕色，治疗组棕色沉淀面积显著减少；而且对切片中的棕色沉淀的占有面积进行统计，其结果表明ELA13在抑制纤维化标志物的产生中发挥重要作用。

图6 WB检测小鼠肾脏中纤维化标志物及TGF-β1的表达变化。

A为小鼠肾脏中Collagen I，FN，α-SMA和TGF-β1蛋白的WB检测结果；

B为对WB结果的统计，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

图7 q-PCR检测小鼠肾脏中纤维化标志物及TGF-β1的表达变化。

A-D为小鼠肾脏中Collagen I，FN，α-SMA和TGF-β1基因的q-PCR的统计结果。图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对基因水平。

图8 ELA13对UUO诱导小鼠肾脏中炎症的影响。

A为小鼠肾脏组织切片的CD68免疫组化染色；

B为对免疫组化染色的统计结果，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平；

C-E分别为对小鼠肾脏中IL-1β，IL-6和MCP-1基因的q-PCR的统计结果，其中，图8C为“C为对小鼠肾脏中IL-1β的q-PCR的统计结果，图8D为对小鼠肾脏中IL-6基因的q-PCR的统计结果，图8E为小鼠肾脏中MCP-1基因的 q-PCR的统计结果，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对基因水平；

F为小鼠肾脏中CD68,IL-1β,IL-6,MCP-1和TNF-α蛋白的WB检测结果；

G为对WB结果的统计，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

图9 ELA13对UUO诱导小鼠肾脏纤维化中通路的影响。

A为小鼠肾脏中p-Smad2/3，Smad2/3，p-ERK1/2和ERK1/2的WB检测结果；

B-C为对WB结果的统计，图中横坐标为动物模型分组，纵坐标为相对蛋白水平。

图10 ELA13对TGF-β诱导NRK-52E细胞纤维化中通路的影响。

A为NRK-52E细胞中p-Smad2/3，Smad2/3，p-ERK1/2和ERK1/2的WB 检测结果；

具体实施方式

本发明通过细胞实验和动物实验，在蛋白和基因水平分别通过一系列实验验证了ELA13在治疗肾脏纤维化中的药理学活性。

一、ELA13的制备

多肽ELA13使用固相合成的方法制备:

A、树脂溶胀：称取1g Wang树脂于一100ml反应器中，加入20ml无水二氯甲烷洗涤3次每次2分钟后，加入二氯甲烷浸泡震荡2小时使其膨胀。

B、氨基酸连接：向反应器中加入10ml含有Fmoc及侧链保护的氨基酸(3eq)、缩合剂HBTU(3eq)、消旋抑制剂HOBt(3eq)和有机碱DIPEA(6eq)的DMF 溶液，并向反应器中充入氩气，室温反应2个小时。

C、Fmoc保护基脱除：超干DMF洗涤树脂3次后，加入10ml含有20％哌啶DMF溶液，室温反应20分钟脱除Fmoc保护基。

D、茚三酮显色：溶剂洗涤后取少量树脂于一试管中加入茚三酮显色剂，加热观察树脂及溶液的颜色，溶液或树脂变蓝说明氨基酸连接成功。

E、裂解树脂：所有氨基酸连接及Fmoc保护基脱除后，甲醇洗涤收缩树脂，干燥后加入裂解液(TFA:TIS:H2O:EDT＝95:2:2:1)震荡反应6个小时后，使用裂解液洗涤树脂并收集所用裂解液于一圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪浓缩所收集的裂解液，将浓缩后的裂解液滴加入冷乙醚溶液中，析出白色絮状固体，离心弃除上清，所得固体即为所需粗肽。

F、粗肽纯化：将粗肽溶于双蒸水中，使用反向高效液相色谱(RP-HPLC) 纯化粗肽，含有1％TFA的MeCN和H2O为流动相，纯化方法为MeCN相 5％-35％，60分钟，收集MeCN在25％的吸收峰，LC-MS确认后，低温冻干即得所需纯肽。

二、细胞实验

本实验以药物研究中广泛应用的大鼠小管上皮细胞NRK-52E为体外模型，通过体外细胞实验对ELA13在治疗肾脏纤维化中的药理学活性进行鉴定。

1.细胞培养

将NRK-52E细胞消化处理，混匀计数，按照每孔100000个细胞的浓度稀释，再按照每孔2mL加入6孔板中，将培养板放入37℃、5％CO₂的恒温培养箱中，培养24小时，吸去培养板中原培养基，PBS缓慢洗涤细胞后，加入无血清培养基，饥饿培养12小时。

2.CCK-8法测定不同浓度ELA13对NRK-52E细胞的增殖作用

分组给药：(1)无处理的对照组；(2)6.25μmol/L ELA13组；(3)12.5μmol/L ELA13组；(4)25μmol/L ELA13组；(5)50μmol/L ELA13组；(6)100μmol/L ELA13 组，每组设10个平行孔，然后继续在培养箱中培养24小时。

实验结果见图1。如图1所示ELA13对NRK-52E细胞未表现出抑制或促进细胞增殖的现象，即使是在高浓度100μmol/L浓度下，细胞生长状态也未表现出显著性的差异。实验结果说明ELA13对NRK-52E细胞的生长状况并无影响，且无毒性。

3.WB检测ELA13对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞纤维化标志物的影响

I型胶原蛋白(Collagen I)、纤维连接蛋白(FN)；α平滑肌动蛋白(α-SMA) 在组织纤维化过程中大量分泌表达，因此这三类蛋白也是鉴定组织纤维化的标志物。

本实验通过WB方法，检测NRK-52E细胞经ELA13处理后，在TGF-β1 诱导下三种纤维化标志物的表达变化，鉴定ELA13的抗肾脏纤维化作用。

A、分组加药：(1)无处理的正常对照组；(2)5ng/mL TGF-β1模型组； (3)50μmol/LELA13给药组；(4)50μmol/L ELA13+5ng/mL TGF-β1 治疗组。

B、提取蛋白：培养48小时后提取蛋白以检测三种纤维化标志物的表达；提取蛋白后使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。

C、蛋白裂解、变性：将各样本的蛋白浓度用裂解液稀释抑制，加入上样缓冲液后，100℃煮10分钟，使蛋白充分变性。

D、电泳：每个孔道加入总量30μg的蛋白，80V电泳至浓缩胶与分离胶界限处，120V电泳至溴酚蓝到电泳槽下端0.5cm处停止。

E、转膜：250mA转膜1.5小时，转膜完成后，TBST溶液漂洗3次，每次10分钟。

F、封闭：5％脱脂牛奶慢摇封闭1小时。

G、一抗浓度：Collagen I为1:500，FN为1:500，α-SMA为1:1000，GAPDH 为1:1000，于4℃冰箱过夜孵育后，用TBST溶液漂洗3次，每次10 分钟；二抗浓度：1:10000，于室温下孵育1小时；孵育完后，用TBST 溶液漂洗3次，每次10分钟。

H、显影观察分析。

实验结果见图2。结果如图2所示：与正常组相比(图2-A)，TGF-β1诱导后，细胞大量分泌纤维化标志物Collagen I，FN和α-SMA，而且ELA13给药孵育两天后，纤维化标志物表达显著降低；而且在未诱导单独给药组中可明显看出ELA13对纤维化标志物的表达也无影响，而且在统计结果中(图2-B)表现出ELA13的抗纤维化的作用。这些结果说明ELA13在体外条件下对NRK-52E 细胞纤维化具有明显的治疗作用。

在细胞实验中使用PBS缓冲剂溶解ELA13肽首先制成6.25μmol/L、 12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L浓度的稀释溶液检测其细胞毒性，待确定浓度后，选用50μmol/L的浓度滴加入细胞培养基中混合培养后检测细胞相关蛋白。

三、动物实验

1.小鼠建模与给药

使用单侧输尿管结扎(UUO)手术诱导构建小鼠肾脏纤维化模型。

使用6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重为18-20g，将小鼠随机分为4组，每组6只，分别为对照组(Sham手术)、模型组(UUO手术)、给药组(Sham手术+ELA13)和治疗组(UUO手术+ELA13)。

UUO手术：生理盐水配制5％水合三氯乙醛麻醉剂；小鼠称重，以10μl/g 的比例将小鼠麻醉；小鼠麻醉后，将小鼠固定于操作板上，剃除小鼠腹部毛发，并消毒，在腹部中线偏左切开1厘米左右的开口，把小鼠部分肠小心拉出，以便容易找到输尿管；在靠近肾脏和膀胱两端的输尿管上分别打结，后在两结中间将输尿管剪断；将肠小心放回腹腔内，并滴加两滴双抗；缝合开口后，将小鼠小心侧卧放置。

Sham手术：小鼠麻醉后，将小鼠固定于操作板上，剃除小鼠腹部毛发，并消毒；在腹部中线偏左切开1厘米左右的开口，把小鼠部分肠小心拉出，找到输尿管后，将肠小心放回腹腔中，滴加两滴双抗；缝合开口后，将小鼠小心侧卧放置。

手术后第二天皮下给药，给药浓度为1.2μmol/kg，一天两次(10:00，17:00)， 14天后结束。

2.小鼠肾脏组织病理切片结果

将取材的新鲜肾脏组织用4％多聚甲醛固定24小时后，分别使用70％、80％、90％、95％和100％的乙醇依次脱水处理一次，每个浓度脱水1小时。接着采用二甲苯溶液处理30分钟，并重复一次，放入55-65℃已融化的石蜡内浸渍40 分钟，重复一次，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，包埋后在切片机上切成蜡片，于40℃的水中展开，后放置在清洁的载玻片上，置于60℃烤箱中烘烤后，分别进行H&E和Masson染色。

实验结果见图3。肾脏病理切片H&E染色(图3-A)结果显示对照组小鼠病理切片肾小管清晰，且无明显间隙；然而与对照组对比，模型组肾小管严重萎缩，肾小管间隙明显增大，免疫细胞增多，正常肾脏组织结构被破坏；而对于给药治疗组小鼠组织形态则有明显改善。Masson染色主要用于组织中纤维的染色，其中胶原纤维被染为蓝色，肌纤维被染成红色。从小鼠病理切片的Masson 的染色(图3-B)结果中显示，对照组小鼠切片中主要呈现出红色的肌纤维，其中含有少量蓝色的胶原纤维，表明正常肾脏中胶原纤维占总组织的小部分；然而在模型组小鼠的病理切片染色中，蓝色的胶原纤维占据了肾脏组织的绝大部分，几乎丧失正常的肾脏形态；与模型组对比，给药治疗后的小鼠组织切片染色结果明显得到改善，蓝色胶原纤维占比明显下降，且能看到部分肾脏形态。对组织切片Masson染色中胶原纤维的统计结果(图3-C)中显示出ELA13对胶原纤维明显的抑制作用，说明了ELA13对于UUO手术诱导的小鼠肾脏纤维化的治疗作用。

3.血清学指标检测

血清尿素氮(BUN)和血肌酐(CRE)的定量测试。

尿素氮是人体蛋白质代谢的最终产物，氨基酸代谢产生的NH₃和CO₂经过肝脏合成尿素；肌酐是人体肌肉代谢的产物，在肌肉中，肌酸通过不可逆的非酶脱水反应形成肌酐；二者渗入血液，浸入肾脏后，经过肾小球的过滤和肾小管的重吸收后排出体外，所以临床上检测血清中尿素氮和肌酐的含量是了解肾脏功能的主要方法。

将给药实验结束后的小鼠用乙醚麻醉，从眼眶静脉丛取血，置于已灭菌的 1.5mL离心管中，室温下自然凝固20分钟，室温离心30分钟(12000r/min)，收集上清，根据试剂盒说明书检测计算血清中尿素氮和血肌酐的含量。

实验结果见图4。实验结果如图4所示与对照组相比经过单侧输尿管结扎手术后的小鼠二者检测指标都显著增高而且差异极为显著(P<0.01)，说明小鼠出现了一定程度的肾功能损伤，而给药治疗后的小鼠指标检测得到明显改善具有显著性差异(P<0.05)。从血清学的方面证明ELA13具有改善肾脏功能的作用。

4.免疫组化检测小鼠肾脏中纤维化标志物的表达变化

免疫组化中使用的DAB染色液是一种过氧化物酶(POD)的底物，适用于辣根过氧化物酶HRP标记的免疫印记或免疫组化反应，过氧化物酶与底物发生反应，产生棕色沉淀物。

本实验通过免疫组化方法，检测小鼠经皮下注射ELA13处理后，在单侧输尿管结扎手术诱导后三种纤维化标志物的表达变化，鉴定ELA13的抗肾脏纤维化作用。

A、将取材的新鲜肾脏组织制成切片，置于60℃烤箱中烘烤一个小时。

B、将烘好的切片放入下列溶液中脱蜡水化，二甲苯I(20分钟)，二甲苯 II(20分钟)，无水乙醇I(15分钟)，无水乙醇II(15分钟)，95％乙醇 (10分钟)，90％乙醇(5分钟)，80％乙醇(5分钟)。

C、将组织切片放于盛有柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)的烧杯中，并用锡纸封闭烧杯口，将烧杯放入高压锅中，高温高压修复15分钟。

D、室温冷却后，将切片放入3％双氧水中，室温避光反应5分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS洗三次，每次5分钟。

E、将切片放入湿盒内，用1％的BSA覆盖组织，37℃孵育60分钟以封闭非特异性抗体。

F、一抗浓度：Collagen I为1:200，FN为1:200，α-SMA为1:500，于4℃ 冰箱过夜孵育后，用TBST溶液漂洗3次，每次10分钟；二抗浓度：1:500，于室温下孵育1小时；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次 10分钟。

G、将DAB显色液滴加在切片组织上，同种抗体每张片子显色时间必须相同。显色后，将切片放入烧杯中，自来水冲洗10分钟后，放入蒸馏水中涮洗5-10次。

H、将组织切片浸泡入苏木素染色液染色后，自来水冲洗5分钟，以使细胞核染蓝，1％盐酸乙醇中分化后，自来水冲洗。

I、将组织切片依次放入下列溶液中浸泡以脱水透明：75％乙醇(1秒钟)， 85％乙醇(1秒钟)，95％乙醇(1秒钟)，无水乙醇(1秒钟)，二甲苯I (1分钟)，二甲苯II(5分钟)。切片晾干后，盖玻片树胶封片。

J、显微镜下拍照后，ImageJ分析软件对组织切片进行统计分析。

实验结果见图5。在Collagen I，FN和α-SMA的免疫组化染色中，DAB染色液可将Collagen I，FN和α-SMA染成棕色(图5-A,B,C)。在免疫组化的结果图中可以看出对照组小鼠组织切片中几乎没有被染成棕色，而在模型组图中可以看到在肾小管位置处被染成棕色，以此也可说明在纤维化过程中，肾小管实质细胞被破坏，纤维集聚占据，使得肾小管丧失功能，进而形成不可逆转肾损伤；与模型组小鼠相比，给药治疗后的小鼠在组织切片的染色中明显可以看出定位于三种纤维化标志物的棕色沉淀较少表现出优秀的治疗结果；对切片中的棕色沉淀的占有面积进行统计(图5-D)，其结果表明ELA13在抑制纤维化标志物的产生中发挥重要作用。

5.WB检测小鼠肾脏中纤维化标志物及TGF-β1的表达变化

许多研究表明，在进行性肾脏疾病中，TGF-β1的表达和激活增加，而且广泛的动物研究已经确定TGF-β1是驱动肾小球和肾小管间质纤维化的主要致病因子。

本实验通过WB方法，检测小鼠经皮下注射ELA13处理后，在单侧输尿管结扎手术诱导后三种纤维化标志物和TGF-β1的蛋白表达变化，鉴定ELA13的抗肾脏纤维化作用。

A、实验动物取材后，称取小鼠肾脏组织30mg，加入裂解液使用匀质器破碎混匀，12000r/min离心后，取上清，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。

实验步骤B-F同细胞实验3。

G、一抗浓度：Collagen I为1:500，FN为1:500，α-SMA为1:1000，TGF-β1 为1:1000，GAPDH为1:1000，于4℃冰箱过夜孵育后，用TBST溶液漂洗3次，每次10分钟；二抗浓度：1:10000，于室温下孵育1小时；孵育完后，用TBST溶液漂洗3次，每次10分钟。

H、显影观察分析

实验结果见图6。如图6-A所示，与对照组相比，经单侧输尿管结扎手术后小鼠肾脏组织中Collagen I、FN、α-SMA和TGF-β1的蛋白表达量显著升高，而经过皮下注射ELA13后，这四类蛋白的表达水平得到明显的抑制；而且对 WB显影结果进行统计分析结果(图6-B)同样表明ELA13不仅对三类纤维化标志物具有明显的抑制作用，而且对促纤维化因子TGF-β1的表达也有显著的抑制作用。

6.q-PCR检测小鼠肾脏中纤维化标志物及TGF-β1的表达变化

本实验通过q-PCR方法，检测小鼠经皮下注射ELA13处理后，在单侧输尿管结扎手术诱导后三种纤维化标志物和TGF-β1的基因表达变化，鉴定ELA13 的抗肾脏纤维化作用。

A、取少量组织(约20mg)于灭菌1.5ml离心管中，加入1ml TransZol Up，向每个离心管中加入一颗无菌钢珠进行匀浆2分钟，匀浆频率为70Hz 后，用移液枪反复吹打数次，室温静置5分钟。

B、每使用1ml TransZol Up需要加入0.2ml氯仿，剧烈震荡30秒，室温孵育3分钟。

C、1200rpm 4℃离心15分钟，此时样品分为3层，无色的水相(上层)，白色的泡沫(中间层)，粉红色的有机相(下层)，RNA主要存在于水相中，用移液枪小心吸取上层清液(体积约为TransZol Up的一半)于另一新离心管中。

D、每使用1ml TransZol Up需要加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温孵育 10分钟。

E、1200rpm 4℃离心10分钟，去上清，在管侧和管底形成胶状白色沉淀。

F、每使用1ml TransZol Up需要加入1ml 75％乙醇(使用DEPC水配制)，剧烈震荡。

G、1200rpm 4℃离心5分钟后，弃上清，室温晾干。沉淀溶于50-100μl RNA溶解液中，-80℃可长期保存样品。

H、使用TransGen Biotech目录号为AE311-02的试剂盒，将所提组织全 RNA反转为cDNA。

I、使用TransGen Biotech的目录号为AQ141-01的试剂盒，进行q-PCR步骤。

J、数据统计分析：副孔结果取平局值，目的基因的Ct值减去内参基因的 Ct值，计算阴性对照组的平均值，计算2^(平局值-差值)，并将其除以阴性对照组，将阴性对照组归一化处理，计算其他组与阴性对照组的倍数关系。

实验结果见图7。实验结果可以看出在正常小鼠中Collagen I和FN(图7-A, B)基因的表达量很低，而对小鼠进行UUO手术后二者表达急剧增加，给药治疗后表达下降，说明二者可能在基因表达方面也受ELA13的影响，在α-SMA的 RNA表达上ELA13依然表现出显著性抑制作用(图7-C)。事实证明，肾小球过度分泌的转化生长因子β是肾小球硬化和肾间质纤维化发生的关键细胞因子，并刺激系膜细胞，也可能是上皮-间质转化最有效的诱导因子。TGF-β的激活通过增加蛋白质合成和减少基质蛋白降解，导致基质沉积的自我循环，从而导致持续性组织损伤。我们对TGF-β1的基因表达进行检测(图7-D)，结果表示对照组小鼠表达正常，模型组小鼠TGF-β1表达急剧增加，而给药后其表达得到显著的抑制，这也提示ELA13可能是通过抑制TGF-β1的生成来抑制肾脏纤维化。

7.ELA13对UUO诱导肾纤维化中炎症标志物的影响

炎症可以促进组织纤维化的过程，靶向炎症途径可能减缓肾脏疾病的进展，我们接下来在动物模型中研究了ELA13是否抑制肾脏炎症。

本实验通过免疫组化、q-PCR和WB三种方法，检测小鼠经皮下注射ELA13 处理后，在单侧输尿管结扎手术诱导后多种炎症标志物的表达变化，鉴定ELA13 在肾脏疾病中的抗炎作用。

免疫组化、q-PCR和WB三种方法的实验步骤同之前相似。

实验结果见图8。首先对CD68进行了免疫组化检测(图8-A，B)，从图中可以看出模型组棕色沉淀明显增加，而给药治疗后得到改善，对其进行统计分析可得出ELA13对CD68有显著的抑制作用；接下来我们对IL-1β，IL-6和MCP-1 进行了q-PCR的检测(图8-C-E)，结果表明在UUO手术后三种炎症因子的 mRNA的表达都急剧增加，给药治疗后都能得到显著性的抑制；对这几类炎症因子进行WB检验(图8-F，G)，实验结果与前面检测结果一致，以此可以说明ELA13在炎症反应中也具有一定的抑制作用。

在动物实验中使用PBS缓冲剂溶解ELA13肽制成浓度为1.2μmol/kg稀释溶液注射试剂，对小鼠进行皮下注射治疗。

ELA13肌肉注射用冻干粉的制备

工艺：按制备冻干粉的常规工艺操作，共制成冻干粉剂1000支，每支含 ELA13冻干粉60-70mg，避光保存。

上述非特异性蛋白稳定剂、冻干保护剂优选甘露醇，赋形剂优选乳酸，渗透压调节剂优选氯化钠，pH调节剂优选柠檬酸或Tris-HCl缓冲液。

四、对ELA13的作用通路的探讨

1.ELA13对UUO诱导小鼠肾纤维化中通路的影响

大量证据表明TGF-β/Smad2/3和ERK1/2信号在纤维化中起着关键作用。我们发现ELA13降低了UUO诱导的肾纤维化中TGF-β1的表达(图6,7)。为探讨上述信号通路是否参与ELA13的作用，采用WB检测小鼠的相关蛋白，包括 Smad2/3和ERK1/2的磷酸化和总蛋白表达水平。

WB方法的实验步骤同之前相似。

实验结果见图9。结果如图9所示，UUO诱导的p-Smad2/3和p-ERK1/2水平显著升高，而使用ELA13治疗后的表达水平相对降低。根据这些发现，提示ELA13是通过TGF-β/Smad2/3和ERK1/2途径抑制肾纤维化。

2.ELA13对TGF-β诱导的NRK-52E细胞纤维化通路的影响

为了进一步肯定前面的体内研究中ELA13对TGF-β/Smad2/3和ERK1/2通路的影响，我们使用WB实验检验ELA13对TGF-β1诱导的NRK-52E细胞中 TGF-β/Smad2/3和ERK1/2通路的影响。

WB方法的实验步骤同之前相似。

实验结果见图10。实验结果如图10所示：经过TGF-β1诱导后磷酸化的 Smad2/3和磷酸化的ERK1/2表达明显升高，而ELA13孵育后显著降低，得到明显的抑制作用。此结果进一步验证了ELA13对TGF-β/Smad2/3和ERK1/2通路的影响，也提示了ELA13是通过TGF-β/Smad2/3和ERK1/2通路抑制肾脏纤维化。

五、实验结论

综上所述，本发明化学合成Elabela片段13肽ELA13后，进行体外细胞实验和体内动物实验，通过模型细胞中ELA13作用后肾纤维化相关因子的表达检测和作用通路，和对模型动物经过ELA13治疗后组织切片染色、血清学指标、参与肾脏纤维化重要因子的表达水平检测，并且在体内和体外实验中探讨了 ELA13对肾脏纤维化的作用通路。实验结果表明ELA13具有有效的抗纤维化和抗炎的作用，而且ELA13在体内和体外都可通过抑制TGF-β/Smad2/3和ERK1/2 的信号通路来改善肾脏纤维化。

六、ELA13口服制剂的制备

工艺：按制备胶囊剂的常规工艺制成1000粒，每粒胶囊含ELA13有效成分50mg，对胶囊采用肠溶材料丙烯酸树脂包衣，制成肠溶衣制剂。填充剂、黏合剂、润滑剂等辅料均为药剂学常规辅料。

除此之外，口服制剂还可将上述填充剂、黏合剂、润滑剂等辅料由聚酯材料包裹制成微球、微囊和毫微球，由壳聚糖包裹制备成脂质体或纳米粒，加入胆固醇、磷酸和游离脂肪酸制备成微乳制剂等。各剂型的制备工艺均为药剂学常规工艺。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 多肽片段13肽及其用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 多肽ELA13(ELA13)

<400> 1

Arg Arg Cys Met Pro Leu His Ser Arg Val Pro Phe Pro

1 5 10

Claims

1.多肽ELA13，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

2.多肽ELA13在制备治疗肾脏纤维化药物中的应用。

3.含有权利要求1所述的多肽ELA13的药物，其特征是以ELA13为活性成分，加入药剂学的至少一种辅料，制成冻干粉剂。

4.含有权利要求1所述的多肽ELA13的药物，其特征是以ELA13为活性成分，加入药剂学的至少一种辅料，制成口服制剂。

5.根据权利要求3或4所述的药物，其特征在于其制剂为粉剂、肠溶衣制剂、微球、微囊、毫微球、脂质体、纳米粒或微乳制剂中的任一种。