AT410753B

AT410753B - Pibf für die diagnose von tumoren

Info

Publication number: AT410753B
Application number: AT0199700A
Authority: AT
Original assignee: Biodevelops Verwertung Von Liz
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2000-11-28
Publication date: 2003-07-25
Also published as: US20040142394A1; DE60127442D1; JP2006230407A; EP1337850A1; AU2002224901B2; ATE357662T1; WO2002044734A1; ATA19972000A; JP2004514909A; JP4025645B2; CA2431837A1; DE60127442T2; ES2283461T3; EP1337850B1; AU2490102A

Description


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   Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Protein mit einer Progesteron-induzierten immunmodulierenden Protein-(PIBF)-Aktivität, ein Nukleinsäure-Molekül, das für ein rekombinan- tes Protein mit einer PIBF-Aktivität codiert, einen Nukleinsäure-Vektor, der diese Nukleinsäurese- quenz aufweist, eine Zelle, die diesen Vektor umfasst, und ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten. 



   Zur Aufrechterhaltung einer normalen Schwangerschaft ist die Produktion von Progesteron- einem Steroidhormon mit einem breiten immunsuppressiven Wirkungsspektrum - eine absolute Notwendigkeit. Periphere Lymphozyten gesunder schwangerer Frauen exprimieren nukleare Rezeptoren als Sensoren für dieses Hormon (Szekeres-Bartho et al., J. Reprod. Immunol. 16,239 (1989) ; Szekeres-Bartho et al., Cell. Immunol. 125,273 (1990)), und produzieren ein Vermittler- Protein mit der Bezeichnung Progeste-ron-induzierter Blockierungsfaktor (PIBF) (Szekeres-Bartho et al., Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 9, 15 (1985)). Die Sequenz der PIBF-cDNA aus der menschlichen Leber zeigte keine wesentliche Homologie mit der von irgend einem der bekannten Proteine (HSPIBF, Acc. No. Y09631). Das codierte Vorläuferprotein ist sehr hydrophil und hat ein Molekulargewicht von 89 kDa.

   Natürlich vorkommender PIBF ist, so wie ursprünglich entdeckt, ein 34-36 kDa immunmodulierendes Protein mit einer Sequenzlänge von 757 Aminosäuren. 



   Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des PIBF in Harnproben gesunder Personen et- wa 1-10 ng/ml beträgt, wogegen die Konzentration des PIBF bei schwangeren Frauen ab dem 2. 



  Trimester in einem Bereich von etwa 70-150 ng/ml liegt. Diese hohen Mengen kehren nach einem Abortus oder nach Wehen rasch wieder auf das normale Niveau zurück. 



   Es zeigte sich, dass PIBF, welcher die Auswirkungen von Progesteron vermittelt, eine sehr starke immunmodulierende Funktion sowohl in vitro als auch in vivo aufweist. Tatsächlich erwies sich PIBF als für die Schwangerschaft im Mäusemodell essentiell, da aus den Kulturüberständen von Mauslymphozyten isolierter PIBF Föten vor der durch Antiprogesteron induzierten Resorption schützt. Ausserdem bewirken neutralisierende Antikörper gegen den Maus-PIBF die Resorption von Embryonen und folglich einen Abortus. Die wichtige Rolle des PIBF bei der menschlichen Fort- pflanzung wurde auch durch Messen der geringen Mengen in den Körperflüssigkeiten pathologi- scher Schwangerschaften bestätigt. PIBF spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft, höchst wahrscheinlich dadurch, dass er natürliche Killer-Lymphozyten hemmt. 



  Bedeutsamerweise kann durch experimentelle Manipulation der Menge des PIBF in vitro die Killer- Aktivität der peripheren Blutlymphozyten, die NK (natürliche   KillerZellen   enthalten, moduliert werden. Es wurde festgestellt, dass es mindestens zwei Wirkmechanismen des PIBF auf NK- Zellen gibt : eine ist eine direkte Hemmung der NK-Zellaktivität. NK-Zellen töten ihre Ziel-Zellen durch Exocytose von Perforin und Serin-Esterase enthaltenden Granula in der Kontaktfläche zwischen Effektor- und Ziel-Zellen. Deziduale Lymphozyten - von welchen 60 % NK-   Oberflächenmarker   tragen - besitzen einen hohen Perforingehalt, sie üben jedoch nur eine geringe cytotoxische Aktivität aus.

   Obwohl aktivierte NK-Zellen ihre Ziele finden und in Anwesenheit von PIBF binden, setzen sie jedoch kein Perforin aus den Lagergranula frei, und infolgedessen kommt es zu keiner Lyse der Ziel-Zellen. Es scheint, dass PIBF die NK-Zellen lähmt und den cytotoxi- schen Mechanismus durch Hemmung der Degranulation und dadurch der Freisetzung der Killer- substanzen unter Kontrolle hält. 



   Es gibt einen weiteren indirekten Mechanismus, mittels welchem PIBF seine Anti-NK-Wirkung ausübt, nämlich durch eine veränderte Cytokin-Expression. In Anwesenheit von PIBF kommt es zu einer beträchtlichen Abnahme der TNFa-(Tumor-Nekrose-Faktor a)-Produktion durch NK-Zellen, die auch bei der Niederregulierung der NK-Aktivität eine Rolle spielen könnte. Die Menge an se- zerniertem TNFa steht im umgekehrten Verhältnis zur PIBF-Produktion, und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. 



   Der zweite Hauptwirkungsmechanismus von PIBF ist die Induktion der   TH2-Cytokin-Dominanz.   



  Die TH2-Dominanz trägt zur Verringerung der zellvermittelten Reaktionen und zur Verbesserung der B-Zellen bei, wogegen die TH1-Dominanz zu verringerten humoralen Reaktionen führt und die zellimmunologischen Mechanismen begünstigt. Sezernierter PIBF erleichtert die Produktion von TH2-Cytokinen, wie IL-3, IL-4 und IL-10, wogegen er   TH1-Cytokine,   wie IL-12 und   IFN-y supprimiert,   und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Die Neutralisierung des PIBF durch spezifische Antikör- per führt in vivo zu einer   TH1-Verschiebung,   die auch ein Charakteristikum von fehlgeschlagenen Schwangerschaften ist. Die Auswirkung des PIBF auf humorale Immunreaktionen ist nicht nur eine 

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 einfache Verbesserung, sondern auch die Induktion der Erzeugung asymmetrischer Antikörper. 



  Dies ist eine Population von Antikörpern (ab), die auf Grund des Vorhandenseins eines Mannose- reichen Oligosaccharid-Restes an einem der Fab-Arme des Moleküls eine asymmetrische Struktur    hat, und die keine oder nur geringe Effektorfunktionen hat ; ab könnten jedoch als blockieren-   de Antikörper wirken. Das Verhältnis von asymmetrischem IgG war in Überständen von Hybridom- Zellen, die in Gegenwart von PIBF gezüchtet worden waren, wesentlich höher als in jenen, die in Abwesenheit von PIBF gezüchtet worden waren. Weitere Untersuchungen zeigten ein positives Verhältnis zwischen asymmetrischem Antikörpergehalt der Seren und der PIBF-Expression auf Lymphozyten.

   Weiters verringerte die Blockierung der Progesteron-Rezeptoren durch RU 486 oder die Neutralisierung endogener PIBF-Aktivität durch spezifische anti-PIBF-Antikörper, die Produkti- on asymmetrischer Antikörper bei trächtigen Mäusen ganz wesentlich. 



   Maligne Tumoren, d. h. Krebsarten, sind in allen entwickelten Ländern nach Herzerkrankungen die zweite Haupttodesursache und treten bei einer von drei Personen auf. Eine von je vier Perso- nen stirbt an Krebs. Krebs ist vor allem durch eine Zunahme der Anzahl der abnormalen oder neoplastischen Zellen gekennzeichnet, die von einem normalen Gewebe stammen, welches sich zur Bildung einer Tumormasse vermehrt, durch die Invasion benachbarter Gewebe durch diese neoplastischen Tumorzellen, und durch die Erzeugung maligner Zellen, welche über das Blut oder das Lymphsystem zu regionalen Lymphknoten und zu entfernten Stellen gelangen. Letzteres Fortschreiten zur Malignität wird als Metastase bezeichnet. 



   Krebs kann aus dem Zusammenbrechen der Kommunikation zwischen neoplastischen Zellen und ihrer Umgebung, einschliesslich ihrer normalen Nachbarzellen, entstehen. Sowohl wachstums- stimulierende als auch als wachstumshemmende Signale werden routinemässig zwischen Zellen innerhalb eines Gewebes ausgetauscht. Normalerweise teilen sich Zellen bei Fehlen stimulieren- der Signale nicht, und in gleicher Weise hören sie bei Vorliegen von Hemmsignalen auf, sich zu teilen. Im Krebs- oder neoplastischen Zustand erwirbt eine Zelle die Fähigkeit, sich über diese Signale hinwegzusetzen und sich unter Bedingungen, unter welchen normale Zellen nicht wachsen würden, zu vermehren. 



   Tumorzellen müssen eine Reihe verschiedener fehlerhafter Merkmale erwerben, um sich zu vermehren. Diese Anforderung wird durch die Tatsache belegt, dass die Genome bestimmter gut untersuchter Tumoren mehrere verschiedene, unabhängig voneinander veränderte Gene aufwei- sen, einschliesslich aktivierter Onkogene und inaktivierter Tumor-Suppressor-Gene. Jede dieser genetischen Veränderungen scheint dafür verantwortlich zu sein, einige dieser Merkmale, die insgesamt den kompletten neoplastischen Phänotyp repräsentieren, zu verleihen. 



   Tumorzellen tragen Antigene, die als für den Körper fremd erkannt werden können, und es ist eine der Hauptfunktionen des Immunsystems, solche Zellen zu eliminieren, bevor sie grosse Tumo- ren bilden können. Diese Immunüberwachung ist bei Patienten mit fortschreitend malignen Erkran- kungen deutlich wirkungslos. Eine Reihe von Schutzmassnahmen wurde identifiziert, die eine Eigenreaktivität supprimiert, und die eine Hauptbarriere in der Fähigkeit des Immunsystems, Tu- morzellen auszulöschen, darstellen kann.

   Es gibt eine Reihe von Mechanismen, die von Tumorzel- len ausgeübt werden, wie 1. die Nichtexpression klassischer und die Expression nicht-klassischer, selbstidentifizierender Klasse MHC-Moleküle (wie HLA-G), welche die Tötungswirkung der (Tu-   mor) Antigen-spezifischen Klasse MHC-eingeschränkten CTLs unterminiert ; eine Tendenz zu   
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   nen supprimiert werden ; 3. die Produktion immunsuppressiver Faktoren, die lokale und syste-   mische Immunreaktionen niederregulieren (beispielsweise verringert die Sekretion von TGF-&num; die T-Zellen-Proliferation und die Cytotoxizität die Expression von fas-Ligand, die eine Apoptose von CTLs induziert.). Als Resultat dieser kumulativen Wirkungen haben die Tumoren einen immunolo- gisch privilegierten Zustand und wachsen ohne oder mit einer eingeschränkten Kontrolle durch das Immunsystem. 



   Es ist ziemlich genau erwiesen, dass viele pathologische Zustände, wie Infektionen, Krebs, Au- toimmunerkrankungen, usw. durch die ungünstige Expression bestimmter Moleküle gekennzeich- net sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für einen bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von ihrer Verwendung als diagnostische "Ziele", d. h. Materialien, die zur Diagnose dieser abnormalen Zustände identifizierbar sind, dienen die Moleküle als Rea- gentien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder therapeutische Mittel zu 

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 erzeugen. 



   Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, das leicht und sicher durchführbar ist, welches Verfahren keine Hgh-Tech- Geräte erfordert, dem Patienten keine besonderen Unannehmlichkeiten verursacht, das rasch durchführbar ist und Ergebnisse bringt, die eine Unterscheidung zwischen einem Patienten mit einem Tumor und einem gesunden Patienten erlauben. 



   Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Sets zur Durchführung des Verfahrens zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten. 



   Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer wirksamen Anti- tumormedizin. 



   Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung zur Diagnostizierung eines Tumors bei ei- nem Patienten, mit welchem das obige Ziel erreicht wird, umfasst das Entnehmen einer Probe vom Patienten, das Messen der Konzentration des PIBF (Progesteron-induzierten Blockierungs- Faktors) oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der Probe und das Bestimmen, ob die Konzentration des PIBF in der Probe über oder unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, wobei die Konzentration über dem Schwellenwert einen Patienten mit einem Tumor identifi- ziert. 



   Während der Charakterisierung von PIBF als wichtiges immunmodulierendes Molekül für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zeigte es sich überraschenderweise, dass Tumorzellen PIBF oder PIBF-verwandte Substanzen exprimieren, wogegen bei angrenzenden normalen Gewe- ben keine oder nur eine geringe PIBF-Reaktivität feststellbar ist. Dies deutet darauf hin, dass PIBF bei der Entwicklung oder Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz gegenüber bösartig transformierten Zellen eine Rolle spielt und daher einen nützlichen Marker für Tumorzellen bildet. 



   Daher macht sich das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung die Tatsache zu Nutze, dass die Konzentration von PIBF in einer Probe, die vom zu testenden Patienten genommen worden ist, höher ist als die Konzentration von PIBF in einer Probe, die von einer gesunden Person genommen wurde. 



   Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die vom Patienten genommene Probe jede Art von Probe, die flüssig oder auch nicht ist, sein und kann von praktisch jedem Teil des Körpers stammen. Die Konzentration des PIBF kann gemäss jedem auf diesem Gebiet bekannten Verfah- ren, das die Quantifizierung der Konzentration von PIBF in einer Probe ermöglicht, gemessen werden. Diese kann chemische, mikrobiologische, physikalische Techniken, Färbung etc. auf Flüssigkeiten, Gewebsproben usw. umfassen. Zu den möglichen Methoden zählen in vivo- Bildgebung mittels Computer-Tomograph (CT) und Magnetresonanz-Bild (Magnetic Resonance Image, MRI) nach Markierung mit Radionuklein- bzw. paramagnetischen (z.B. 



  Gadolinium-)Markierungen. 



   Da der PIBF Stoffwechsel- oder anderen Veränderungen im Körper des Patienten unterworfen sein kann, kann der PIBF Modifikationen aufweisen, je nach dem, welche Probe vom Patienten genommen wurde. Der PIBF kann beispielsweise gespalten worden sein, so dass nur ein Frag- ment des PIBF in der vorhandenden Probe vorliegt. Der PIBF kann weiters so modifiziert worden sein, dass ein Derivat des PIBF in dieser Probe vorliegt oder auch ein Fragment dieses Derivats. 



  Daher kann auch ein PIBF-Derivat oder ein Fragment des PIBF oder des PIBF-Derivats oder PIBF- verwandte Substanzen (wie beispielsweise ein gespaltenes Produkt von 34 kDa oder ein alternativ gespleisstes 14 kDa-Produkt) als Indikation der Konzentration des PIBF im Patienten verwendet werden, und daher kann die jeweilige Konzentration für das Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet werden. 



   Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Fragment des PIBF oder des PIBF-Derivats beispielsweise weniger als 715 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 500 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt weniger als 200 Aminosäuren, und am meisten bevorzugt weniger als 50 Amino- säuren, umfassen. 



   Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck "Derivat" beispielsweise alle na- türlichen oder selbst nicht natürlich auftretenden Modifikationen, z. B. Spaltung, Glykosylierungen, Methylierungen, Acetylierungen, Amidierungen, Phosphorylierungen, Sulfatierungen, Deletionen, Substitutionen, etc.. 



   Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch "Schwellenwert" auf einen Konzent- 

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 rationswert, der im Allgemeinen die mittlere Probenkonzentration von PIBF bei gesunden Proben- spendern sein wird. Es ist möglich, eine bekannte allgemeine mittlere PIBF-Konzentration bei gesunden Menschen gemäss der Literatur zu nehmen oder auch die Probenkonzentration von PIBF bei gesunden Spendern bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Der Schwellenwert kann auch bei gesunden (normalen) Proben bestimmt werden, die früher (im ge- sunden Zustand) von derselben Person entnommen wurden. Beispiele für solche Schwellenwerte können beispielsweise zwischen 1 und 10 ng/ml, vorzugsweise zwischen 1 und 5 ng/ml, sein, wobei die Konzentration vom Detektionsverfahren sowie vom Typ des Tumors abhängt. 



   Bei der Bestimmung des Schwellenwertes ist es jedoch wichtig, dass die Probe von der ge- sunden Person nicht von einer schwangeren Frau genommen wird, da die PIBF-Konzentration bei Proben von schwangeren Frauen höher ist als die PIBF-Konzentration in Proben nicht- schwangerer Frauen. 



   Die PIBF-Konzentration, die in der vom Patienten entnommenen Probe gemessen wird, welche über dem vorbestimmten Schwellenwert liegt, identifiziert Individuen mit einem Verdacht auf einen Tumor. Ein "Tumor", wie hierin verwendet, bezeichnet jedes neoplastische Zellwachstum und jede Vermehrung, sei sie bösartig oder gutartig, und alle vor-kanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe. 



   Unter den Ausdruck "Patient" fallen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Patienten mit ei- nem Tumor, jedoch auch ein Patient, bei dem die Möglichkeit besteht, dass er einen Tumor hat, sowie gesunde Menschen, die sich einer allgemeinen Routineuntersuchung unterziehen. 



   Da die Schwangerschaft auch zu erhöhten PIBF-Mengen führt, müssen sexuell aktive Frauen mittels herkömmlicher Schwangerschaftstests (z. B. auf Grund von hCG) getestet werden, bevor sie als Patienten mit einem Tumor angesehen werden. Es bedeutet auch, dass es sehr schwierig ist, diesen Test zur Detektion von Tumorwachstum zu benützen, wenn der Patient eine schwangere Frau ist, die über das erste Trimester hinaus ist. Da jedoch ein beträchtlicher Teil der mit einer Schwangerschaft in Beziehung stehenden Malignitäten mit dem unkontrollierten Wachstum von Schwangerschafts-bezogenen Geweben zu tun hat (wie Trophoblastenzellen bei Mola hydatidosa), könnten extrem hohe PIBF-Mengen ( > 150-200 ng/ml) ein Tumorwachstum mit oder ohne Vorhan- densein eines lebensfähigen Babys anzeigen. 



   Vorzugsweise ist der Tumor, der mit dem Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung diag- nostiziert werden soll, ein epitheliales Carcinom. Da die überwiegende Mehrzahl der Human- Tumoren (bezogen auf die weltweiten Sterblichkeitsdaten) epitheliale Carcinome sind (Lunge, Brust, Colon, usw. ), ist das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung für die Diagnose dieser Art von Tumor besonders vorteilhaft. 



   Das epitheliale Carcinom ist vorzugsweise ein Lungen-Carcinom, Colon-Carcinom, bzw. ein Brust-Carcinom. Die PIBF-Konzentration bei Proben, die von Patienten mit den oben erwähnten Tumoren entnommen wurden, ist besonders hoch im Vergleich zu PIBF-Konzentrationen in Proben von gesunden Patienten. Daher identifiziert, wenn das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfin- dung zur Diagnostizierung eines der oben erwähnten Tumoren verwendet wird, eine Konzentration, die über dem Schwellenwert liegt, Individuen mit einem Verdacht auf einen Tumor. Eine Konzent- ration, die unter dem Schwellenwert liegt, schliesst jedoch nicht unbedingt das Vorhandensein eines Tumors in bestimmten Fällen aus. 



   Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe eine Kcr- perflüssigkeit, vorzugsweise Harn bzw. Serum. Dies ermöglicht eine sehr einfache Art der Proben- nahme vom Patienten, ohne jeglichen chirurgischen Schritt und ohne die Notwendigkeit   spezifi-   scher High-Tech-Instrumente. Die Körperflüssigkeit kann in jedem Labor oder selbst im Heim des Patienten entnommen werden und ist besonders vorteilhaft für eine Routinediagnose, eine Diagno- se bei einem Patienten, der sehr schwach ist, und für regelmässige Überprüfungen des Fortschrei- tens des Tumors bei einem Patienten. Die PIBF-Konzentration kann beispielsweise mittels einer Trockenchemie-Methode, z. B. mit einem Streifen, der seine Farbe je nach der PIBF-Konzentration in einer Probe, in die er eingetaucht wird, ändert, gemessen werden. 



   Alternativ ist die Probe eine Gewebsprobe. Obwohl die Entnahme dieser Art von Probe aus dem Patienten nicht so einfach ist wie das Entnehmen einer Körperflüssigkeit, ermöglicht ein Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung, bei welchem eine Gewebsprobe vom Patienten verwendet wird, die direkte Lokalisierung des Tumors, insbesondere, wenn verschiedene Gewebs- 

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 proben entnommen und miteinander verglichen werden. Weiters ist es möglich, die Progression des Tumors direkt zu verfolgen. Ausserdem kann das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung durch Detektion der Gewebe mit einem Tumor weiters zumindest als ein zusätzliches Verfahren zur Entscheidung, ob Gewebe und welche Teile eines Körpers des Patienten chirurgisch entfernt werden müssen, verwendet werden. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Schwellenwert die Konzentration des PIBF in einer Probe einer gesunden Person. Natürlich ist der Schwellenwert besonders präzise, wenn er die mittlere Konzentration des PIBF einer Mehrzahl von Proben von gesunden Personen ist. 



   Vorzugsweise wird der Schwellenwert durch Messen der Konzentration des PIBF in einer Pro- be mindestens einer gesunden Person parallel zur Bestimmung der Konzentration des PIBF in einer Probe des Patienten bestimmt. Da die gemessene Konzentration vom Verfahren der Mes- sung der PIBF-Konzentration abhängt, ist die Diagnose spezifischer und exakter, wenn das Verfah- ren zur Messung der PIBF-Konzentration in der Probe des Patienten und in der Probe der gesun- den Person identisch ist. Um die Sensitivität des Verfahrens weiters zu erhöhen, werden die Probe des Patienten und die Probe der gesunden Person vorzugsweise parallel gemessen, z. B. zur selben Zeit, um jegliche störende Parameter, z. B. Temperatur, Puffer, etc., die einen Einfluss auf das Ergebnis haben, zu eliminieren. Die Probe der gesunden Person wird vorzugsweise parallel als "Negativprobe" gemessen. 



   Vorteilhaft wird als positive Kontrolle die Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in einer Probe, die eine bestimmte Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon aufweist, parallel zur Bestimmung der PIBF- Konzentration in der Probe des Patienten gemessen. Die Parallel-Messung der positiven Kontrolle ermöglicht es, die Ergebnisse zu kontrollieren und jegliche Divergenz im Verfahren festzustellen. 



   Vorzugsweise wird die PIBF-Konzentration in der Probe immunologisch gemessen. Jedes im- munologische Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, kann angewendet werden. Immunologi- sche Verfahren oder sehr sensitive Verfahren zur Detektion von Molekülen sind daher zur Mes- sung der PIBF-Konzentration in der Probe besonders vorteilhaft. Um das immunologische Verfah- ren durchzuführen, ist es notwendig, mindestens einen anti-PIBF-Antikörper zu haben, der spezi- fisch an PIBF, Derivate davon oder Fragmente davon, bindet. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann weiters rekombinant sein. Weiters können humanisierte monoklona- le oder durch Phagen codierte monoklonale Einzelketten-Antikörper verwendet werden. 



   "Einzelketten-Antikörper" sind strukturell so definiert, dass sie den Bindungsteil eines ersten Polypeptids aus der variablen Region eines Antikörpers in Verbindung mit dem Bindungsteil eines zweiten Polypeptids aus der variablen Region eines Antikörpers umfassen, wobei die beiden Polypeptide durch einen Peptid-Linker verbunden sind, der das erste und das zweite Polypeptid zu einer einzigen Polypeptidkette verbindet. Die einzige Polypeptidkette umfasst somit ein Paar vari- abler Regionen, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden sind. Die Regionen können sich zur Bildung einer funktionalen Antigen-Bindungsstelle verbinden, wie in jenem Fall, in welchem die Regionen ein variables Regionen-Paar mit einer leichten Kette und einer schweren Kette mit entsprechend paarweisen komplementären Bestimmungsregionen (complementary determining regions, CDRs) umfassen. 



   Der Ausdruck "humanisierter Antikörper", wie hierin verwendet, bedeutet Antikörper-Moleküle, in welchen Aminosäuren in den bekannten Antigenbindungsreagenzien zwecks grösserer Ähnlich- keit mit einem humanen Antikörper ersetzt wurden, wobei jedoch die ursprüngliche Bindungsfähig- keit erhalten bleibt. 



   Die Antikörper können unter Verwendung von Verfahren, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erzeugt werden. Zu solchen Antikörpern zählen, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, po- lyklonale, monoklonale, rekombinante, chimäre, Einzelketten-(single chain)-Antikörper, Fab- Fragmente und Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek erzeugt wurden. Neutralisie- rende Antikörper (d. h. jene, die die Dimer-Bildung hemmen) sind zur therapeutischen Verwendung besonders bevorzugt. 



   Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschliesslich Ziegen, Kanin- chen, Ratten, Mäuse, Hühner (Yab), Menschen und andere, durch Injektion mit natürlichem oder rekombinantem PIBF-Protein oder jedem Fragment oder Oligopeptid desselben, das immunogene 

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 Eigenschaften aufweist, oder einer PIBF-DNA (Fragment) immunisiert werden. Je nach der Wirts- Spezies können verschiedene Adjuvantien zur Steigerung der immunologischen Reaktion verwen- det werden. Zu solchen Adjuvantien zählen, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, Freund' sches Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysole- zithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, Aluminium, Polykationen (z. B. polyArg), Peptide, Ölemulsio- nen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) und Dinitrophenol. 



  Unter den bei Menschen verwendeten Adjuvantien sind BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Cory- nebacterium parvum besonders bevorzugt. 



   Es ist bevorzugt, dass die Peptide, Fragmente oder Oligopeptide, die zur Induktion von Anti- körpern gegen PIBF verwendet werden, eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus mindestens fünf Aminosäuren und, mehr bevorzugt, mindestens 10 Aminosäuren besteht. Es ist auch bevor- zugt, dass sie dentisch mit einem Teil der Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins sind. 



  Kurze Abschnitte von PIBF-Aminosäuren können mit jenen eines anderen Proteins, wie dein Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin fusioniert werden, und Antikörper gegen das chimäre Molekül werden erzeugt. 



   Monoklonale Antikörper gegen PIBF können unter Verwendung jeder Technik, die eine Erzeu- gung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht, hergestellt wer- den. Zu diesen zählen die Hybridom-Technik, die Human-B-Zellen-Hybridom-Technik und die EBV- Hybridom-Technik, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein. 



   Ausserdem können Techniken, die für die Herstellung "chimärer Antikörper" entwickelt wurden, das Spleissen von Maus-Antikörper-Genen zu humanen Antikörper-Genen zum Erhalt eines Mole- küls mit entsprechender Antigen-Spezifität und biologischer Aktivität verwendet werden. Alternativ können Techniken, die für die Erzeugung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden, adaptiert werden, wobei Verfahren des Standes der Technik verwendet werden, um PIBF- spezifische Einzelketten-Antikörper zu erzeugen. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch mit einer unterschiedlichen idiotypischen Zusammensetzung, können durch das Mischen von Ketten ("chain shuffling") aus randomisierten kombinatorischen Immunglobulin-Bibliotheken erzeugt werden. 



   Antikörper können auch durch Induktion einer in vivo-Produktion in der Lymphozyten- Population oder durch Screenen rekombinanter Immunglobulin-Bibliotheken oder von Gruppen hoch-spezifischer Bindungs-Reagenzien erzeugt werden. 



   Antikörper-Fragmente, die spezifische Bindungsstellen für PIBF enthalten, können ebenfalls hergestellt werden. Beispielsweise zählen zu diesen Fragmenten, ohne auf diese eingeschränkt zu    sein, die F (ab')2-Fragmente, durch Pepsin-Verdau des Antikörper-Moleküls erzeugt werden   können, und die Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfid-Brücken der F(ab')2-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressions-Bibliotheken konstruiert werden, um eine rasche und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezi- fität zu ermöglichen. 



   Verschiedene Immunoassays können zum Screenen verwendet werden, um Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindungs- oder immunradiometrische Tests unter Verwendung entweder polyklonaler oder monoklonaler Antikör- per mit etablierten Spezifitäten sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Zu solchen Immunoassays gehört typischerweise die Messung der Komplex-Bildung zwischen PIBF und seinem spezifischen Antikörper. Ein Zwei-Stellen-Immunoassay auf monoklonaler Basis unter Verwendung monoklona- ler Antikörper, die gegenüber zwei voneinander unabhängigen PIBF-Epitopen reaktiv sind, ist bevorzugt, doch kann ein kompetitiver Bindungs-Test ebenso verwendet werden. 



   Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration des PIBF in der Probe durch einen kompetitiven Test gemessen. Gemäss diesem Verfahren wird eine feste Phase mit vorzugs- weise rekombinantem Human-PIBF (oder seinen Varianten) mit einer spezifischen Konzentration bedeckt. Markierte anti-PIBF-Antikörper werden zusammen mit den zu messenden Beispielen zugegeben. Je höher die PIBF-Konzentration in der Probe ist, desto niedriger ist der entsprechen- de detektierte Wert. Auf Grund dieser Ablesungen kann die absolute Konzentration des PIBF bestimmt werden. Dies ist ein besonders präzises Verfahren, insbesondere, wenn die Probe eine Körperflüssigkeit ist, und kann beispielsweise mittels ELISA durchgeführt werden. 



   Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Konzentration des 

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 PIBF in einer Probe mittels eines Sandwich-Tests gemessen. Für diesen Test muss man zwei anti- PIBF-Antikörper haben, die jeder an ein anderes Epitop des PIBF-Moleküls binden. Der erste anti- PIBF-Antikörper ist vorzugsweise an einem festen Träger immobilisiert, wonach die zu messende Probe zugegeben wird, so dass der in der Probe vorhandene PIBF an den ersten anti-PIBF- Antikörper bindet. Ein zweiter anti-PIBF-Antikörper, der vorzugsweise markiert ist, wird zugegeben, so dass er an den gebundenen PIBF bindet. Die Menge des gebundenen zweiten anti-PIBF- Antikörpers wird gemessen und als Angabe für die absolute Konzentration des PIBF in der Probe verwendet.

   Auch dieses Verfahren wird vorzugsweise verwendet, wenn die zu messende Probe eine Körperflüssigkeit des Patienten ist, und kann mittels ELISA durchgeführt werden. 



   Gemäss einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Kon- zentration des PIBF in einer Probe mittels Immunfärbung ("immunostaining") gemessen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise dann verwendet, wenn die zu messende Probe eine Gewebsprobe des Patienten ist. Gemäss diesem Verfahren wird der anti-PIBF-Antikörper direkt zur Gewebsprobe des Patienten zugegeben, wo er an den in der Gewebsprobe vorhandenen PIBF bindet. Der ge- bundene Antikörper wird dort durch direkte Anzeige der Konzentration des PIBF in der Gewebs- probe quantifiziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Lokalisierung von PIBF in einer Probe. 



   Vorzugsweise wird die PIBF-Konzentration indirekt gemessen, durch Messung der Konzentra- tion von PIBF-mRNA in der Probe. Dazu können Polynukleotide, einschliesslich Oligonukleotid- Sequenzen, anti-sense-RNA- und -DNA-Moleküle und PNAs verwendet werden. Die Polynukleoti- de können zur Detektion und Quantifizierung der Gen-Expression in Proben verwendet werden, in welchen die Expression von PIBF mit einem Tumor in Verbindung gebracht wird. Demgemäss kann ein Set bereitgestellt werden, welches ein Reagens umfasst, das die oben erwähnten (markierten) Polynukleotide aufweist, um eine PIBF-mRNA-Messung in der bestimmten Probe durchzuführen. 



   Gemäss einem Aspekt kann die Hybridisierung mit Nukleotid-Sonden zur Identifizierung von PIBF-mRNA-Seguenzen verwendet werden. Nukleotid-Seguenzen, die zur PIBF-mRNA komple- mentär sind, können mittels Standardmethoden markiert werden und unter Bedingungen, die für die Bildung von Hybridisierungskomplexen geeignet sind, zu einer Flüssigkeits- oder Gewebsprobe eines Patienten zugegeben werden. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird die Probe gewaschen, und das Signal wird quantifiziert und mit dem Schwellenwert verglichen. 



   Die Spezifität der Sonde, ob sie aus einer hochspezifischen Region oder aus einer weniger spezifischen Region hergestellt ist und die Stringenz der Hybridisierung (maximal, hoch, mittel oder niedrig) bestimmen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende Sequenzen, die für PIBF codieren, Allele, oder verwandte Sequenzen identifiziert. 



   Sonden, die für die Hybridisierung von PIBF-mRNA (verwandten) Sequenzen verwendet wer- den, sollten vorzugsweise eine mindestens 50%, vorzugsweise 70%, noch mehr bevorzugt 90%, Homologie mit der PIBF-codierenden Sequenz oder Fragmenten davon aufweisen. Die Hybridisie- rungssonden der vorliegenden Erfindung können DNA oder RNA sein und von der Nukleotid- Sequenz der SEQ ID. NO 3 (PIBF-cDNA) stammen. 



   Hybridisierungssonden können mittels verschiedenster Marker-Gruppen markiert werden, bei- spielsweise Radionukliden, wie 32P oder 35S, oder enzymatischen Markierungen, wie alkalische Phosphatase, die über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme mit der Sonde gekoppelt ist, u.dgl.. 



   Die für PIBF codierenden Polynukleotid-Sequenzen können weiters bei der Northern Blot-    Analyse, Dot-Blot oder anderen Techniken auf Membran-Basis verwendet werden ; beiDip-Stick-,   Pin, ELISA oder (Mikro) -Chip-Tests unter Verwendung von Flüssigkeiten oder Geweben aus Patienten-Biopsien zur Detektion von PIBF-mRNAs. Solche Methoden sind auf dem Gebiet wohl bekannt. 



   Zusätzlich kann PIBF-mRNA mittels RT-PCR detektiert und gemessen werden: In einem ersten Schritt wird die mRNA durch Revers-Transcriptase in cDNA transkribiert, wonach die cDNA detek- tiert und mittels PCR quantifiziert wird. Die Oligomeren für die PCR können chemisch synthetisiert, enzymatisch erzeugt, oder aus einer rekombinanten Quelle produziert sein. Oligomere bestehen vorzugsweise aus zwei Nukleotid-Sequenzen, einer mit sense- und einer anderen mit antisense- Orientierung, die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung der spezifischen Sequenz verwendet werden. Dieselben beiden Oligomeren, "nested" Sets von Oligomeren oder selbst ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zur Detektion und/oder Quantifizierung nah verwandter Sequenzen verwendet werden. 

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   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der posi- tiven oder negativen Progression eines Tumors in einem Patienten, umfassend das Diagnostizie- ren eines Tumors bei einem Patienten gemäss einer der oben erwähnten Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung, und das Bestimmen, ob die gemessene Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon in der Probe über oder unter mindestens einer zuvor gemessenen Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon in mindes- tens einer zuvor vom selben Patienten entnommenen Probe ist, wobei eine Konzentration über der zuvor gemessenen Konzentration eine positive Progression identifiziert. Da die Konzentration des PIBF in einer Probe direkt proportional zur Progression des Tumors, z. B.

   Grösse, Entwicklung etc. ist, ermöglicht das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung eine direkte Analyse des Krank- heitsverlaufs. Für eine vollständige Charakterisierung der Progression des Tumors ist es natürlich vorteilhaft, über einen Zeitraum viele Proben zu nehmen, insbesondere vor und nach einer spezifi- schen Behandlung, in welchem Fall die Wirksamkeit der spezifischen Behandlung analysiert wer- den kann. Der hierin verwendete Ausdruck "positive Progression" bedeutet, dass sich der Tumor weiterentwickelt. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines anti-PIBF- Antikörpers oder eines Fragments desselben bei einem oben beschriebenen Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung. Wie voranstehend erwähnt, kann der anti-PIBF-Antikörper monoklonal, polyklonal, er kann weiters rekombinant, humanisiert oder ein durch Phagen codierter Einzelketten- Antikörper sein. Wenn nur ein Fragment des Antikörpers verwendet wird, umfasst dieses Fragment das Epitop des anti-PIBF-Antikörpers, welches den PIBF erkennt. 



   Es ist bevorzugt, einen monoklonalen Antikörper zu verwenden, um ein höchst spezifisches und präzises Ergebnis zu erreichen. Der monoklonale Antikörper kann, wie oben erwähnt, herge- stellt werden. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon bei einem der oben erwähnten Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung. Wie bereits voranstehend erwähnt, kann das Fragment ein Fragment des PIBF oder ein Fragment des PIBF-Derivats sein. 



   Vorzugsweise ist der PIBF rekombinant, was bedeutet, dass auch das Derivat oder das Frag- ment rekombinant sein kann. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set, welches ein erstes Reagens, das mindestens einen anti-PIBF-Antikörper oder ein Fragment davon aufweist, und ein zweites Reagens, das PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon in einer bestimmten Konzent- ration aufweist, umfasst. Natürlich sind der anti-PIBF-Antikörper und der PIBF in einer Form vor- handen, die deren Lagerung ermöglicht, z. B. in trockener, lyophilisierter, gefrorener oder gelöster Form. Weiters kann das Set jedwede weitere Puffer, Enzyme, Salze etc. enthalten, die für die Durchführung des oben erwähnten Verfahrens notwendig sind. 



   Vorzugsweise umfasst das Set eine feste Phase, an welche der mindestens eine anti-PIBF- Antikörper oder das Fragment davon oder der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon gebunden, ist. Die feste Phase kann jede dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte feste Phase sein, z. B. jedes unlösliche Material, das ein Substrat darstellen kann, auf welchem man die Proteine oder Peptide immobilisieren kann, beispielsweise in Form eines trockenen Streifens. Zu solchen Substraten können Nylon, Aminosäuren, Glas, Cellulose u.dgl. zählen. Das Set kann vorzugsweise für einen kompetitiven oder für einen Sandwich-Test verwendet werden, wobei das weitere Reagens, das entweder den Antikörper oder den PIBF aufweist, je nachdem, welcher an der festen Phase immobilisiert ist, und die Probe zur festen Phase zugegeben werden. 



   Vorzugsweise ist der im oben erwähnten Set vorhandene PIBF rekombinant, was natürlich be- deutet, dass auch das Derivat davon bzw. das Fragment davon rekombinant sind. 



   Ein bevorzugtes Set umfasst ein weiteres Reagens mit einem zweiten anti-PIBF-Antikörper o- der einem Fragment davon, welches an ein Epitop des PIBF bindet, das von dem vom ersten anti- PIBF-Antikörper oder dessen Fragment erkannte Epitop verschieden ist. Dieses Set ist besonders vorteilhaft, um einen Sandwich-Test durchzuführen. 



   Das oben erwähnte Set gemäss der vorliegenden Erfindung dient vorzugsweise zur Diagnosti- zierung eines Tumors bei einem Patienten bzw. zur Feststellung der Progression eines Tumors bei einem Patienten. Die Verfahren sind dieselben, wie oben beschrieben, wobei das Reagens, das 

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 den PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon in der bestimmten Konzentration auf- weist, entweder als positive Kontrolle, wie oben beschrieben, oder zur Durchführung eines kompe- titiven Tests, wie oben beschrieben, (wobei es in Konkurrenz zum in der Probe des Patienten vorhandenen PIBF verwendet wird, ) oder für beides verwendet wird. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines anti-PIBF- Antikörpers oder eines Fragments davon zur Herstellung eines anti-Tumor-Medikaments. Der anti- PIBF-Antikörper oder das Fragment davon bewirkt eine spezifische Blockierung oder Neutralisie- rung von PIBF, wodurch die PIBF-Aktivität in Tumoren spezifisch eliminiert wird und die Tumoren somit für NK (und potentiell für CD8+ und andere T-Zellen-vermittelte Lyse) empfänglich gemacht werden. Weiters können mono- und bi-spezifische Antikörper PIBF an der Oberfläche von Tumor- zellen spezifisch erkennen und können verwendet werden, um toxische Substanzen an das tumo- röse Kompartiment des Körpers des Patienten abzugeben. Die Hauptstrategie des anti-Tumor- Medikaments ist die Verwendung des Wissens, dass Tumorzellen höhere PIBF-Konzentrationen erzeugen.

   Mit dieser Information, die die Grundlage der vorliegenden Erfindung bildet, können verschiedene Strategien zur Bekämpfung eines Tumors bei einem Patienten entwickelt werden. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler, humanisierter, bzw. Einzelketten-Antikörper. 



   Vorzugsweise hat der Antikörper ein an ihm haftendes Molekül. In diesem Fall wird der anti- PIBF-Antikörper als Ziel- oder Abgabe-Mechanismus verwendet, um ein Molekül, z. B. ein pharma- zeutisches Mittel, zu Zellen oder Geweben zu bringen, die PIBF exprimieren. 



   Der Antikörper, der dem Patienten verabreicht wird, bindet an den PIBF exprimierenden Tumor und bringt dadurch das Molekül, das für den Tumor toxisch ist, in direkten Kontakt mit dem Tumor. 



  Es gibt verschiedene Verfahren und Moleküle, die verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise kann ein toxisches Molekül verwendet werden, das in die Tumorzellen eindringt und beispielsweise in essentielle Stoffwechselschritte eingreift, wodurch es die Zellen tötet. Das toxische Molekül kann auch eine Zell-Lyse induzieren oder als Rezeptor für andere toxische Substanzen oder Enzyme dienen, die die tumorösen Zellen töten. Das Wichtigste ist jedoch, unabhängig von der Art, in welcher das toxische Molekül wirkt, dass das Molekül durch den anti-PIBF-Antikörper spezifisch zu den tumorösen Zellen geleitet wird und in gesunde Zellen nicht eingreift. 



   Das Molekül kann vorzugsweise eine toxische Substanz bzw. ein Prodrug sein, insbesondere ein Radionuklid, ein Toxin bzw. ein chemotherapeutisches Medikament. Durch Abgabe der Sub- stanz an das tumoröse Ziel wird ein wirksames Anti-Tumor-Medikament erhalten. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon für die Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments. Gemäss der vorliegenden Erfindung gibt es zwei Strategien für diese Anti-Tumor-Medikamente: - Ein PIBF-Derivat oder ein Fragment desselben wird als Hemm-Protein oder-Peptid verwen- det, welches in die PIBF-Wirkung eingreift, indem es putative Rezeptoren für PIBF, die an Zellen, z. B. NK-Zellen, vorhanden sind, bindet und dadurch blockiert oder inaktiviert, oder Signal-gebende Komponenten stromabwärts der Rezeptor-Bindung inhibiert. 



   - Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Medikament ein Vakzin. Das PIBF-Derivat oder Fragment davon weist das immunogene Peptid von PIBF auf und kann zur Impfung verwendet werden, entweder um Antigen-spezifische cytotoxische Anti- Tumor-T-Zellen-Reaktionen zu induzieren und/oder um die Produktion neutralisierender Antikörper durch das Immunsystem des Krebspatienten selbst zu stimulieren, was die NK-Zellen von der Suppression durch PIBF befreien würde. 



   Vorzugsweise weist das Vakzin ein Adjuvans auf. Ein solches Adjuvans können beispielswei- se, doch nicht ausschliesslich, Freund'sche Mineral-Gele, wie Aluminiumhydroxid und grenzflä- chenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanione, Polykatione (z. B. polyArg), Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin und Dinitrophenol sein. Zu den bei Menschen vorzugsweise verwendeten Adjuvantien gehören BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. 



   Vorzugsweise ist der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon rekombinant bzw. ein chemisch synthetisiertes Molekül. 



   Ein vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Polynukleo- 

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 tids, das für PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon codiert, oder eines PIBF- antisense-Moleküls zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments. 



   Gene, die für PIBF codieren, können durch Transformation einer Zelle oder eines Gewebes mit Expressionsvektoren, die grosse Mengen eines Polynukleotids oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon, das für PIBF codiert, ausgeschaltet werden. Solche Konstrukte können verwendet werden, um untranslatierbare sense- oder antisense-Sequenzen in eine Zelle einzufüh- ren. Selbst wenn keine Integration in die DNA vorliegt, können solche Vektoren weiterhin RNA- Moleküle transkribieren, bis sie durch endogene Nukleasen abgeschaltet werden. Eine vorüberge- hende Expression kann bei einem nicht-replizierenden Vektor einen Monat oder länger dauern und noch länger, wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektor-Systems sind. 



   Modifikationen der Gen-Expression sind durch Entwerfen von anti-sense-Molekülen, DNA, RNA oder PNA, zu den Steuerregionen des für PIBF codierenden Gens, d. h. der Promotoren, Enhancer und Introne, erhältlich. Oligonukleotide, die aus der   Transkriptionsinitiierungsstelle   stammen, z. B. zwischen den Positionen-10 und +10 ab der Start-Stelle, sind bevorzugt. In ähnli- cher Weise kann eine Hemmung unter Verwendung der "Dreifach-Helix"-Basenpaarungs-Methodik erreicht werden. Dreifach-Helix-Paarung ist nützlich, weil es die Hemmung der Fähigkeit der Dop- pelhelix, sich für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulierenden Molekü- len genügend zu öffnen, bewirkt. Die antisense-Moleküle können auch so gestaltet werden, dass sie die Translation der mRNA blockieren, indem sie das Transkript hindern, an Ribosome zu bin- den. 



   Der Ausdruck "antisense", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleotid-Sequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz komplementär sind. Antisense-Moleküle können mit jedem Verfahren hergestellt werden, einschliesslich einer Synthese durch Ligieren des (der) Gens (Gene), an welchem (welchen) ein Interesse besteht, in umgekehrter Orientierung zu einem Virus- Promotor, der die Synthese eines komplementären Stranges ermöglicht. Sobald er in eine Zelle eingeführt ist, vereinigt sich dieser transkribierte Strang mit den natürlichen, von der Zelle produ- zierten Sequenzen, um Duplexe zu bilden. Diese Duplexe blockieren dann entweder die weitere Transkription oder die Translation. 



   Gemäss einem Aspekt können antisense-Moleküle zu dem für PIBF codierenden Polynukleotid in Situationen verwendet werden, in welchen es wünschenswert wäre, die Transkription der mRNA zu blockieren. Insbesondere können Zellen mit Sequenzen transformiert werden, die zu für PIBF codierenden Polynukleotiden komplementär sind. So können antisense-Moleküle verwendet wer- den, um die PIBF-Aktivität zu modulieren, oder um eine Regulierung der Gen-Funktion zu errei- chen. Eine derartige Technik ist auf dem Gebiet wohlbekannt, und sense- oder antisense- Oligomere oder grössere Fragmente können von verschiedenen Orten entlang der Codier- oder Steuerregionen von Sequenzen, die für PIBF codieren, entworfen werden. 



   Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenovirus, Herpes- oder Vaccinia-Viren oder von verschiedenen Bakterien-Plasmiden stammen, können zur Abgabe von Nukleotid-Sequenzen an das angepeilte tumoröse Organ, Gewebe, oder die Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter Vektoren verwendet werden, die antisense-Moleküle exprimieren, welche zu den Polynukleotiden des für den PIBF codierenden Gens komplementär sind. 



   Ribozyme, enzymatische RNA-Moleküle, können ebenfalls zur Katalyse der spezifischen Spal- tung von RNA verwendet werden. Zum Mechanismus der Ribozym-Wirkung gehört die Sequenz- spezifische Hybridisierung des Ribozym-Moleküls an eine komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele, die verwendet werden können, umfassen hergestellte Hammerkopf-Motiv-Ribozym-Moleküle die die endonukleolytische Spaltung von Sequenzen, die für PIBF codieren, spezifisch und effizient katalysieren können. 



   Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb jedes potentiellen RNA-Zieles werden anfangs durch Scannen des Ziel-Moleküls auf Ribozym-Spaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen inkludieren, identifiziert : GUA, GUU und GUC. Sobald sie identifiziert sind, können kurze RNA- Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, entsprechend der Region des Ziel-Gens, das die Spaltstelle enthält, im Hinblick auf sekundäre Strukturmerkmale, die das Oligonukleotid inoperabel machen könnten, bewertet werden. Die Eignung der Anwärter-Ziele kann auch durch Testen der Zugänglichkeit zu einer Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden unter 

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 Verwendung von Ribonuklease-Schutz-Tests evaluiert werden. 



   Antisense-Moleküle und -Ribozyme der Erfindung können mit jedem Verfahren, das auf dem Gebiet für die Synthese von Nukleinsäuremolekülen bekannt ist, hergestellt werden. Zu diesen zählen Techniken zur chemischen Synthetisierung von Oligonukleotiden, wie die chemische Fest- phasen-Phosphoramidit-Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vitro- und in vivo- Transkription von DNA-Sequenzen, die für PIBF codieren, erzeugt werden. Solche DNA- Sequenzen können in vielerlei Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, wie T7 oder SP6, inkorporiert werden. Alternativ können diese cDNA-Konstrukte, die antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingebracht werden. 



   RNA-Moleküle können modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und die Halbwertszeit zu erhöhen. Zu den möglichen Modifikationen zählen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, die Addition von flankierenden Sequenzen am 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder die Verwen- dung von Phosphorthioat oder 2'-O-Methyl anstelle von Phosphodiesterase-Bindungen innerhalb des Molekül-Gerüstes. Dieses Konzept wohnt der Produktion von PNAs inne und kann in allen diesen Molekülen erweitert werden durch den Einschluss nicht-traditioneller Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierter Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von endogenen Endonukleasen nicht so leicht erkannt werden. 



   Viele Methoden zur Einführung von Vektoren in Zellen oder Gewebe sind verfügbar und glei- chermassen zur Verwendung in vivo, in vitro und ex vivo geeignet. Für die ex vivo-Therapie können Vektoren in Stammzellen eingefügt werden, die dem Patienten entnommen wurden und klonal vermehrt wurden zwecks autologer Re-Transplantation in denselben Patienten (allogene Stamm- zellen-Transplantation). Ein Einbringen durch Transfektion und durch Liposom-Injektionen kann unter Verwendung von Verfahren, die auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, erreicht werden. 



   Jedes der oben beschriebenen Anti-Tumor-Medikamente kann an jedem geeigneten Subjekt, einschliesslich beispielsweise Säugern, wie Hunden, Katzen, Kühen, Pferden, Kaninchen, Affen und, am meisten bevorzugt, Menschen, angewendet werden. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patien- ten mit einem Tumor, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines anti- PIBF-Antikörpers oder eines Fragments davon an den Patienten umfasst. 



   In zwei Veröffentlichungen (Szekeres-Bartho et al., Am. J.Reprod. Immuno. 24,105, 1990 ; Szekeres-Bartho et al.,   Cell.lmmunol.177,   194,1997) wurde nachgewiesen, dass die Zugabe von neutralisierendem anti-PIBF-Antikörper bei Mäusen ein erfolgreiches Schwangerschaftergebnis stört. Ausserdem verhinderte PIBF, isoliert aus Kulturüberständen von mit Progesteron behandelten Maus-Lymphozyten bei Injektion in vivo die abortive Wirkung von Anti-Progesteron-Medikamenten. 



  Diese Daten lassen darauf schliessen, dass diese Reagenzien auf ähnliche Weise bei Patienten mit Krebs oder mit Autoimmunerkrankungen wirken könnten. 



   Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, wobei dieses Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon umfasst. 



   Ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behand- lung eines Tumors bei einem Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Polynukleotids, das für PIBF oder für ein Derivat davon oder ein Fragment davon oder für PIBF-antisense-Molekül codiert, umfasst. 



   Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Präparation zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, wobei die Präparation einen anti-PIBF-Antikörper oder ein Fragment davon, PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon, und von Poly- nukleotid codierten PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon bzw. ein PIBF- antisense-Molekül umfasst. 



   Die pharmazeutische Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit mindestens ei- nem anderen Mittel, wie einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, welche in jedem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger verabreicht werden kann, einschliesslich - doch nicht ausschliesslich - Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser. Die pharmazeutischen Präparationen können alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arznei- stoffen oder Hormonen einem Patienten verabreicht werden.

   Die für das Verfahren zur Behandlung 

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 eines Tumors bei einem Patienten verwendeten pharmazeutischen Präparationen können auf zahlreichen Wegen verabreicht werden, einschliesslich - jedoch nicht ausschliesslich - oral, intrave- nös, intramuskulär, intraarteriell, intramedullar, intrathekal,   intraventrikulär,   transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, topisch, sublingual oder rektal. 



   Zusätzlich zu den aktiven Ingredienzien können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger, einschliesslich Exzipienten und Hilfsstoffe, aufwei- sen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparationen, die pharmazeutisch ver- wendet werden können, erleichtern. Die Träger ermöglichen die Formulierung der pharmazeuti- schen Präparationen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Auf- schlämmungen, Suspensionen u.dgl.. 



   Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein rekombinantes Prote- in mit einer PIBF-Aktivität gemäss SEQ. ID.NO 1 und Derivate davon. Dieses PIBF-Protein gemäss der vorliegenden Erfindung besitzt die volle PIBF-Aktivität, vergleichbar natürlichem PIBF (umfas- send die Sequenz gemäss SEQ.ID.NO 2), weist jedoch nicht die exakten Aminosäuren 595 bis 614 sowie die Aminosäure Nr. 333 gemäss der natürlichen PIBF-Seguenz (SEQ.ID.NO 2) auf. Die Proteinsequenz des rekombinanten PIBF-Proteins gemäss der vorliegenden Erfindung (SEQ.ID.NO 1) umfasst 757 Aminosäurereste. Die vorliegende Erfindung sieht daher neue rekom- binante PIBF-Proteine mit der SEQ.ID.NO 1 oder Derivate oder Homologe davon vor.

   Daher un- fasst das rekombinante Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung - die Aminosäure-Sequenz gemäss SEQ.ID.NO 1, oder - eine Aminosäure-Sequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 98% mit der Se- quenz gemäss SEQ.ID.NO 1, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, oder - eine Aminosequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 95% mit der Sequenz von Aminosäurerest 580 bis 630 von SEQ.ID.NO 1, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, und - eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des natürlichen humanen PIBF-Moleküls. 



   Die PIBF-Aktivität kann als NK- oder CTL-Hemmung definiert und quantifiziert werden. Eine NK-Hemmung wird angenommen, wenn in Gegenwart von PIBF die ansonsten effizienten Effektor- Zellen (in Abwesenheit von PIBF getestet) paralysiert sind, d. h. entweder die Erkennung und Bindung (Konjugation) oder die Tötung der Ziel-Zellen als Folge der PIBF-Konzentration verringert ist. Die Aktivität kann als Prozent inhibierung/ g PIBF oder ähnlicher Substanzen im Vergleich zu keinem PIBF ausgedrückt werden. Dies gilt in ähnlicher Weise für CTL-Hemmaktivität (Szekeres- Bartho et al., Cell.lmmunol.177 (1997), 194-199), Szekeres-Bartho et al., Am.J.Reprod.lmmunol. 



  24,105, (1990)). Weiters kann die PIBF-Aktivität als Th2-Verstärkung, die durch Quantifizierung von Th2 (IL-3, IL-4, IL-6, IL-10)- zu Th1 (IL-12, IFN-y)-Lymphokinen entweder auf Protein- oder auf mRNA-Ebene gemessen wird, und nachfolgende Feststellung des Verhältnisses der Th2-Signale zu den Th1-Signalen bestimmt wird, definiert und quantifiziert werden. Eine Zunahme der Th2- und eine gleichzeitige Abnahme der Th1-Cytokine zeigen eine Th2-Verstärkung an. Sie kann als Stei- gerung der Prozentsatzes von Th2-Cytokin-positiven oder eine Abnahme im Prozentsatz von Th1- Cytokin-positiven peripheren mononuklearen Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells,   PMBCs)/pg   PIBF ausgedrückt werden.

   Man kann auch die absoluten Mengen dieser Cytokine (gemäss Standardmethoden aus der Literatur), die in den Kulturüberstand oder in Körperflüssigkei- ten sezerniert werden, als eine Funktion der PIBF-Konzentration zu messen. Die Cytokin-mRNAs können mittels Standard-Quantifizierungstests auf RT-PCR-Basis, Szekeres-Bartho et al., AJRI 35 (1996), 348-351, Szekeres-Bartho et al., Am.J.Reprod.lmmunol. 23,26, (1990), Szekeres-Bartho et al., Am. J.Ob.Gyn. 163,1320 (1990) gemessen werden. 



   Trotz der wesentlichen Unterschiede in der Aminosäuresequenz des PIBF-Proteins gemäss der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur natürlichen humanen PIBF-Sequenz ist es möglich, ein rekombinantes Protein mit einer Sequenz, wie oben definiert (SEQ.ID.NO 1) zu erzeugen, welches rekombinante Protein besonders grosse funktionelle Ähnlichkeiten mit dem natürlichen Protein aufweist. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinan- te Protein eine Aminosäure-Sequenz, wie durch die Aminosäurereste 300 bis 350 in SEQ.ID.NO 1 angegeben, auf. Die Aminosäure Nr. 333 im natürlichen Human-PIBF-Protein (SEQ.ID.NO 2) ist Cys anstelle von Arg im rekombinanten PIBF-Protein gemäss der vorliegenden Erfindung (SEQ.ID.NO 1). Daher weist das rekombinante Protein gemäss der vorliegenden Erfindung 

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 vorzugsweise ein Arg als Aminosäure Nr. 333 gemäss SEQ.ID.NO 1 und eine beträchtliche PIBF- Aktivität ( > 50%) auf.

   Es kann jedoch entweder an einem oder an beiden Enden weitere Aminosäu- rereste aufweisen, die mit den Aminosäureresten in SEQ.ID.NO 1 identisch, homolog zu diesen oder von diesen verschieden sind, solange das rekombinante Protein eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des natürlichen Human-PIBF-Moleküls hat. 



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinan- te Protein eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 580 bis 630 in SEQ.ID.NO 1 angegeben, und eine beträchtliche PIBF-Aktivität ( > 50%) auf. Dieses rekombinante Protein weist daher die richtige Sequenz des PIBF zwischen den Aminosäureresten 580 bis 630 in SEQ.ID.NO 1 auf. Es kann weiters entweder an einem oder an beiden Enden weitere Aminosäurereste aufwei- sen, die mit den Aminosäureresten in   SEQ.ID.NO.1  identisch, homolog zu diesen oder von diesen verschieden sind, solange das rekombinante Protein eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% eines natürlichen Human-PIBF-Moleküls hat. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäure-Molekül vor, das für das oben beschriebene rekombinante Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäss der vorlie- genden Erfindung codiert. Es ist natürlich weiters möglich, dass das Nukleinsäure-Molekül eine zusätzliche Sequenz aufweist, die für mindestens ein zweites Protein, das ein anderes als das PIBF-Protein ist, codiert, wodurch eine Nukleinsäure-Sequenz vorgesehen wird, die für ein Fusi- onsprotein codiert, das mindestens in einem Teil ein Peptid mit PIBF-Aktivität aufweist. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Nukleinsäure-Vektor, der eine Nukleinsäure-Sequenz aufweist, die für das oben erwähnte rekombinante Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung codiert, und ein geeignetes Regulierungs- element aufweist, das die Transkription eines komplementären Nukleinsäure-Moleküls von mindes- tens der für die PIBF-Aktivität codierenden Nukleinsäure-Sequenz der vorliegenden Erfindung ermöglicht. 



   Wenn der oben erwähnte Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, wird mRNA produziert, die einen RNA-Strang für die Translation eines rekombi- nanten Proteins mit PIBF-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung vorsieht. 



   Das Regulierungselement kann jedes geeignete Element sein, das dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, insbesondere ein spezifischer Promotor, der gemäss dem spezifischen Wirt, in welchen der Vektor eingeführt werden soll, ausgewählt wird, um eine maximale Produktion an rekombinantem Protein zu erreichen. Das Regulierungselement kann weiters Enhancer aufweisen, die die Transkription verstärken. 



   Vorzugsweise weist der Nukleinsäure-Vektor einen Selektionsmarker auf. Der Selektionsmar- ker kann jeder geeignete Marker sein, der dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, um Zellen oder Wirtsorganismen zu selektieren, in welche der Vektor eingeführt worden ist. Ein solcher Selektionsmarker kann beispielsweise jedes Gen sein, das für ein eine Antibiotika-Resistenz vermittelndes Protein codiert, oder ein Gen, das für ein für den Zellstoffwechsel notwendiges Protein codiert, wobei die Zellen oder Wirtsorganismen, in die der oben erwähnte Vektor eingeführt werden soll, einen Mangel an diesem Protein aufweisen. Der Selektionsmarker kann weiters jedes Gen sein, das den Phänotyp der Zelle oder des Wirtsorganismus, die (der) den oben erwähnten Vektor aufgenommen hat, verändert, z. B. die Farbe. 



   Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, welche den oben erwähnten Vektor gemäss der vorliegenden Anmeldung aufweist. Der Vektor kann in das Genom der Zelle integriert sein oder auch als exogene DNA im Cytoplasma vorhanden sein, solange die Transkription des komplementären Nukleinsäure-Moleküls vorgesehen ist. Im Rahmen der vorlie- genden Erfindung umfasst der Ausdruck "Zelle" jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle. 



  Diese Zellen werden vorzugsweise zur Herstellung rekombinanter Proteine mit PIBF-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese hergestellten rekombinanten Proteine können gemäss auf diesem Gebiet gut bekannter Verfahren isoliert und gereinigt und weiter verwendet werden, z. B. zur Herstellung pharmazeutischer Präparationen, die rekombinante Proteine mit PIBF-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung aufweisen. 



   Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren genauer beschrieben, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. 



   Fig. 1 zeigt die Ausrichtung rekombinanter und (natürlicher) Maus-PIBF-Aminosäure- 

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 Sequenzen, 
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Exons und Introns in der PIBF-Gen-Region auf Chromosom 13, 
Fig. 3 zeigt einen Northern Blot zur Detektion von PIBF-mRNA in verschiedenen Geweben. 



   Fig. 4 zeigt die immunhistochemische Analyse eines humanen Primär-Tumors. 



   Fig. 5A - 5D zeigen den Einfluss der anti-PIBF-Behandlung auf NK-Zell-Ziel-Tötung von Tu- morzellen. 



   Die Fig. 6A - 6 C zeigen die Wirkung des rekombinanten PIBF auf IL-10- und IL-12-Expression von Nicht-Schwangerschafts-Lymphozyten. 



   Fig. 1 zeigt die Ausrichtung von rekombinantem (humanem) und Maus-(natürlichem) PIBF, wobei A die rekombinante Sequenz ist, B die IC-Maus-Sequenz (aus einer Maus-Hodenbibliothek kloniert) ist, C die EST-Maus, zusammengesetzt aus dEST-Bibliotheken auf Basis der Human- Sequenzen, ist und D die bovine Sequenz ist. X repräsentiert die Signal-Sequenz gemäss der PSG- Voraussagemethode, y die Signal-Sequenz gemäss der GvH-Voraussage, z das ER-Membran- Retentionssignal, w das Leucin-Zipp-Muster-DNA-Bindungsmotiv, v das peroxisomale Targeting- Signal und u das nukleare Lokalisations-Signal. 



   Das PIBF-Gen befindet sich auf Chromosom 13. Eine Anzahl von Introns sind im PIBF-Gen vorhanden (vgl. Fig. 2), wobei in Intron 2 mehrfache Kopien des Alu-repeat-Elements vorhanden sind, das als Stelle für alternatives Spleissen dient. A zeigt eine Lücke zwischen genomischen "contigs". 



   Fig. 3 zeigt einen Northern Blot zur Detektion von PIBF-mRNA in verschiedenen normalen Geweben : Magen (A), Schilddrüse (B), Rückenmark (C), Lymphknoten (D), Luftröhre (E), Neben- niere (F), Knochenmark (G), Milz (H), Thymus (I), Prostata (J), Hoden (K), Uterus (L), Dünndarm (M), Kolon (N), PBL (0), Herz (P), Gehirn (Q, Plazenta (R), Lunge (S), Leber (T), Skelettmuskel (U), Niere (V), Pankreas (W). Die Pfeile in Fig. 4 zeigen 3 verschiedene mRNA-Formen an. 



   Beispiel 1 : ESTs expressed sequence tags-Eintraqungen. die zur humanen PIBF-Sequenz   passen   
EST-Eintragungen in Human-cDNA-Bibliotheken wurden gesucht, die zur humanen PIBF- Sequenz passen. 43 Eintragungen mit PIBF-Sequenzen wurden aus 2,2 Millionen dESTs, die in 3776 Human-cDNA-Bibliotheken abgelegt waren, gefunden. Diese 43 Eintragungen gehören zu 27 verschiedenen Bibliotheken. 7 der 27 (25%) Bibliotheken stammen von normalen Geweben (von nicht-schwangeren Erwachsenen, ohne Tumor). Wichtig ist, dass Hoden, welcher ein immun- privilegiertes Gewebe ist, häufig die Anwesenheit von PIBF-mRNA anzeigt. 13 der 27 Bibliotheken enthalten mRNAs, die in tumorösen Geweben exprimiert wurden   (-50%).   Der Rest stammt von fötalem oder Schwangeren-Geweben.

   Dies zeigt, dass PIBF vorzugsweise während der Entwick- lung, Schwangerschaft und Malignität exprimiert wird. Die Anzahl der passenden ESTs kann jedoch mit dem mRNA-Überfluss in Wechselbeziehung stehen, hängt jedoch sehr von der Qualität der Bibliothek ab. Aus diesem Grund kann man sie nicht direkt als Mass für die Expressionsmenge ansehen (vgl. Tabelle I). 



   TABELLE I 
 EMI14.1 
 
<tb> ACC&num; <SEP> Ursprung <SEP> der <SEP> cDNA-
<tb> 
<tb> 
<tb> ACC# <SEP> Bibliothek
<tb> 
<tb> 
<tb> Organ <SEP> embryonal, <SEP> normal <SEP> , <SEP> Tumor <SEP> zusammenpas-
<tb> 
<tb> 
<tb> sende <SEP> Teile
<tb> 
<tb> 
<tb> (nt)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> AA099685 <SEP> Uterus <SEP> normal, <SEP> schwanger <SEP> 860-1321
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI188926 <SEP> Plazenta, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> normal, <SEP> 8. <SEP> -9. <SEP> Schwanger- <SEP> 2409-2763(87)
<tb> 
<tb> 
<tb> 2 <SEP> schaftswoche
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 
<tb> ACC&num;

   <SEP> Ursprung <SEP> der <SEP> cDNA-
<tb> 
<tb> 
<tb> Bibliothek
<tb> 
<tb> 
<tb> Organ <SEP> embryonal, <SEP> normal <SEP> , <SEP> Tumor <SEP> zusammenpas-
<tb> 
<tb> 
<tb> sende <SEP> Teile
<tb> 
<tb> 
<tb> (nt)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI200713 <SEP> Plazenta, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> normal, <SEP> 8. <SEP> -9. <SEP> Schwanger- <SEP> 2418-2763(86)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3 <SEP> schaftswoche
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> N27300 <SEP> Plazenta, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> normal, <SEP> 8. <SEP> -9. <SEP> Schwanger- <SEP> 2367-2763(84)
<tb> 
<tb> 
<tb> 4 <SEP> schaftswoche
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> N40036 <SEP> Plazenta, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> Normal, <SEP> 8. <SEP> -9.

   <SEP> Schwanger- <SEP> 1657-2089(20)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5 <SEP> schaftswoche
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6 <SEP> AA251149 <SEP> Tonsillen, <SEP> Keimzentrum <SEP> normal <SEP> - <SEP> B-Zellen-angerei- <SEP> 2440-2763(84)
<tb> 
<tb> 
<tb> chert
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7 <SEP> AA251594 <SEP> Tonsillen, <SEP> Keimzentrum <SEP> normal <SEP> - <SEP> B-Zellen-angerei- <SEP> 307-633
<tb> 
<tb> chert
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8 <SEP> AA806027 <SEP> Tonsillen, <SEP> Keimzentrum <SEP> normal <SEP> - <SEP> B-Zellen-angerei- <SEP> 1644-2025
<tb> 
<tb> 
<tb> chert
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9 <SEP> AA610068 <SEP> Hoden <SEP> normal <SEP> 2455-2763(86)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> AI126269 <SEP> Hoden <SEP> normal <SEP> 2385-2763(91)
<tb> 
<tb> 
<tb> 11 <SEP> AI758409 <SEP> Niere, <SEP> Gewebemasse <SEP> normal <SEP> 2491-2763 <SEP> (83)

  
<tb> 
<tb> Kid11
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 12 <SEP> H64996 <SEP> Nase <SEP> (Olfac-Epithel) <SEP> normal <SEP> (weiblich) <SEP> (75) <SEP> 1669-
<tb> 
<tb> 
<tb> 837 <SEP> (98)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 13 <SEP> AW793587 <SEP> Uterus <SEP> (exp. <SEP> ORFs) <SEP> L <SEP> erwachsen <SEP> (224)1989-2346
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 14 <SEP> AW818553 <SEP> Magen <SEP> ORF <SEP> erwachsen <SEP> 2544-2667(8)
<tb> 
<tb> 
<tb> 15 <SEP> BE165549 <SEP> Kopf-Nacken <SEP> erwachsen <SEP> 1881-2264
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 16 <SEP> AA913693 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2501-2763(8)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 17 <SEP> AA971010 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2531-2763(102)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 18 <SEP> AI014561 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> (41)

  1616-2116
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 19 <SEP> AI222385 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2361-2763(8)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 20 <SEP> A1809069 <SEP> Lunge-Hoden-B <SEP> -Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 1644-2179
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 21 <SEP> AW085186 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2328-2763(86)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 22 <SEP> AW269537 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2376-2763(83)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 23 <SEP> AW572968 <SEP> Lunge-Hoden-B-Zelle <SEP> normal <SEP> + <SEP> fötal <SEP> (Lunge) <SEP> 2515-2616
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 24 <SEP> A1350620 <SEP> Gesamtkörper <SEP> Fötus <SEP> (8-9 <SEP> Wochen) <SEP> 2565-2763(87)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 25 <SEP> D31319 <SEP> Lunge,

   <SEP> Gewebemasse <SEP> fötal <SEP> 1394-1765
<tb> 
<tb> 
<tb> AA004593 <SEP> Leber <SEP> + <SEP> Milz <SEP> fötal <SEP> (20 <SEP> Wochen) <SEP> (175)900-
<tb> 
<tb> 
<tb> 26 <SEP> 1019(54)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI741044 <SEP> 5 <SEP> gepoolte <SEP> Bibliothe- <SEP> fötal, <SEP> Plazenta, <SEP> Tumor <SEP> 2349-2763(95)
<tb> 
<tb> 
<tb> 27 <SEP> ken <SEP> *
<tb> 
<tb> 
<tb> AI808795 <SEP> 5 <SEP> gepoolte <SEP> Bibliothe- <SEP> fötal, <SEP> Plazenta, <SEP> Tumor <SEP> 2406-2725(146)
<tb> 
<tb> 
<tb> 28 <SEP> ken <SEP> #
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 
<tb> ACC&num;

   <SEP> Ursprung <SEP> der <SEP> cDNA-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Bibliothek
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Organ <SEP> embryonal, <SEP> normal <SEP> , <SEP> Tumor <SEP> zusammenpas-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> sende <SEP> Teile
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> (nt)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 29 <SEP> AW978222 <SEP> Colon <SEP> Tumor, <SEP> Metastase <SEP> 1656-2135
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI254231 <SEP> Colon <SEP> Adenocarcinom <SEP> (140)2482-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 30 <SEP> 763(101)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 31 <SEP> AA307364 <SEP> Colon, <SEP> Zelllinie <SEP> Carcinom <SEP> (HCC) <SEP> 2017-2391 <SEP> (55) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 32 <SEP> AA603710 <SEP> Keimzelle <SEP> Misch-Tumoren <SEP> 2404-2763(84)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 33 <SEP> AI350870 <SEP> Keimzelle <SEP> Mischtyp-Tumoren <SEP> ( <SEP> 3 <SEP> ) <SEP> 2511-2763 <SEP> (84)

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 34 <SEP> A1990811 <SEP> Keimzelle <SEP> (GC¯6) <SEP> gepoolte <SEP> Tumoren <SEP> 2283-2763(96)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 35 <SEP> AI278790 <SEP> Lunge <SEP> , <SEP> neuroendokrin <SEP> karzinoid <SEP> 2514-2763(92)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI554801 <SEP> Uterus, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> Ut3 <SEP> Endometrium-Carcinom <SEP> 2407-2763(88)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 36
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI915158 <SEP> Uterus, <SEP> gepoolt <SEP> (3) <SEP> (ut2) <SEP> seröses <SEP> Papill. <SEP> cc. <SEP> starkes <SEP> 1714-1837(109)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 37 <SEP> Wachstum.
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 



  AW273347 <SEP> Uterus, <SEP> gepoolt <SEP> (2) <SEP> seröses <SEP> Papill. <SEP> cc. <SEP> starkes <SEP> 1785-2311 <SEP> (50) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 38 <SEP> Wachstum
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AW169084 <SEP> Uterus, <SEP> gepoolt <SEP> (3) <SEP> (ut2) <SEP> Endometrium-Carcinom <SEP> 2200-2763(84)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 39
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AI769755 <SEP> Niere, <SEP> Pool <SEP> von <SEP> 2 <SEP> Kid12 <SEP> Tumor, <SEP> hellzellig <SEP> 2671-2763(403)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 40
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> AW769371 <SEP> Niere <SEP> (Pool <SEP> von <SEP> 2) <SEP> Kid13 <SEP> Wilms'-Tumor <SEP> (Pr. <SEP> + <SEP> Meta.

   <SEP> ) <SEP> 2310-2763(102)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 41
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> N59340 <SEP> Gehirn <SEP> (männlich) <SEP> Multiple <SEP> Sklerose-Läsion <SEP> (102)2506-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 42 <SEP> 2763 <SEP> (83)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 43 <SEP> N77149 <SEP> Gehirn <SEP> (männlich) <SEP> Multiple <SEP> Sklerose-Läsion <SEP> 1858-2175(12)
<tb> 
 *Gewebemasse, Pool von 5 Geweben: alternde Fibroblasten, Plazenta, gesamter Fötus, Pa- rathyreoid-Tumor, Eierstock-Tumor, Erhebungen abgezogen 
Beispiel 2 : Bestimmung der PIBF-Konzentration in Harnproben von Krebspatienten 
Ein kompetitiver Test auf ELISA-Basis wurde zur Messung von PIBF im Harn von Krebspatien- ten erstellt. ELISA-Platten wurden mit rekombinantem Human-PIBF mit einer Konzentration von 2  g/ml beschichtet.

   Mit Biotin markiertes polyklonales   anti-PIBF-IgG   wurde zusammen mit den Proben, deren PIBF-Gehalt bestimmt werden sollte, zugegeben. Je höher die PIBF-Konzentration in der Probe, desto niedriger ist der entsprechende ELISA-Wert. Auf Grund dieser ELISA- Ablesungen kann die absolute PIBF-Konzentration bestimmt werden. 



   Harnproben von Krebspatienten wurden genommen und frisch verwendet oder kurz nach der Probennahme gefroren und bei -20 C bis zur Analyse gelagert. Es wurde zuvor bestimmt, dass die PIBF-Mengen im Serum bei gesunden schwangeren Frauen bedeutend höher sind als die Mengen bei nicht-schwangeren Frauen oder bei pathologischen Schwangerschaften. Um den Test an Harn- PIBF von Krebspatienten auszuwerten, dienten Harnproben von gesunden schwangeren Frauen 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 und von normal gesunden, nicht-schwangeren Individuen als positive bzw. negative Kontrollen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst. Normale (gesunde, nicht-schwangere) Individuen haben niedrige Harn-PIBF-Konzentrationen (5 ng/ml). Der Harn schwangerer Frauen war durch eine durchschnittliche PIBF-Konzentration von 110 ng/ml gekennzeichnet.

   Es ist wichtig, dass hohe PIBF-Mengen nach einem Abortus oder Wehen rasch auf das normale Mass zurückkehrten. 



  Eine Analyse der Harnproben von 65 Tumor-Patienten zeigte deutlich, dass Patienten mit einem Tumor eine wesentlich höhere Menge an PIBF in ihrem Harn aufwiesen als gesunde, nicht- schwangere Individuen, und zwar im Bereich von 5 bis 180 ng/ml. Patienten mit fortgeschrittenem Krebs (grosser Primär-Tumor und/oder Metastasen) schienen höhere Werte zu haben, wofür als Beispiel die Daten von Harnproben von Patienten mit Lungentumor mit einer durchschnittlichen Konzentration von 28 gegenüber 43 ng/ml mit bzw. ohne Metastasen dienen. 



   Diese Daten zeigen, dass die PIBF-Konzentration in Beziehung zur Tumormasse steht, und der Nachweis von PIBF im Harn kann zur Überwachung der Krankheitsprogression und von Rück- fällen verwendet werden. Der Anstieg der Harn-PIBF-Konzentration als Folge der Anwesenheit eines PIBF-produzierenden Tumors ist noch stärker, da nicht alle Tumor-Typen PIBF-positiv sind (-70-80% der bisher getesteten Tumoren). 



   Der am meisten vorherrschende Tumor-Typ unter den Patienten war Lungenkrebs mit 23 Fäl- len. Die meisten der Lungenkrebs-Patienten wiesen eine hohe PIBF-Konzentration auf. Das Fehlen von hohem PIBF im Harn konnte mit dem klinischen Krankheitsstatus in Korrelation gesetzt wer- den, es waren nämlich die PIBF-Konzentrationen nach Entfernen des Primär-Tumors und im Remissionsstadium wesentlich niedriger oder sogar normal. 



   TABELLE 11 
 EMI17.1 
 
<tb> Kontrolle <SEP> Schwanger <SEP> Drohende <SEP> vorzei- <SEP> Tumor-Patienten
<tb> 
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> tige <SEP> Wehen <SEP> (c) <SEP> (e)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> n=48 <SEP> n=23 <SEP> n=19 <SEP> n=65
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> x=5,5+/-1,8 <SEP> x=110+/-36 <SEP> x=6+/-4,7 <SEP> x=27,7+/-5,3
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Lunge <SEP> (n=23) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> a-b <SEP> p < 0,001 <SEP> b-c <SEP> < 0,002 <SEP> ohne <SEP> Met- <SEP> mit <SEP> Me- <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> tastasen <SEP> tastasen
<tb> 
<tb> 
<tb> (n=12) <SEP> (n=11)
<tb> 
<tb> 
<tb> 29,4 <SEP> 43,1
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> a-c <SEP> NS <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> a-d <SEP> p < 0,001
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> a-e <SEP> p < 0,001
<tb> 
 
Beispiel 3 :

   Detektion von PIBF in   Tumorqeweben   
Nach dem Nachweis der PIBF-Expression mittels der MCF-7 (humanes MammaEpithelcarcinom)-Zelllinie wurde eine Reihe von humanen Primär-Tumoren auf die Expression von PIBF untersucht. Es zeigte sich, dass PIBF im Kulturüberstand von MCF-7-Zellen auftritt, was nahe legt, dass dieses Protein auf ähnliche Weise exprimiert und sezerniert wird, was man bei Kulturen von Lymphozyten von Schwangeren oder aktivierten Lymphozyten feststellte. Gemäss einer proteomischen Analyse erkennen anti-PIBF-Antikörper Proteine mit zwei verschiedenen Grössen im Zelllysat durch 2D-Western-Analyse. Ein 34-kDa-Spot entspricht vermutlich der sezernierten Form. 



  Ein weiteres grosses, 60-62 kDa-Doublett wird nachgewiesen, welches die Zell-assoziierte HauptPIBF-Form sein könnte. 



   Eine Vielfalt von mit Formalin fixierten humanen Primär-Tumoren wurde ex vivo immunhistologisch untersucht unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das durch Immunisie 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 rung mit humanem, natürlichem PIBF (34-kDa) oder rekombinantem PIBF (89-kDa) erzeugt wor- den war. Die Ergebnisse zeigen, dass viele der getesteten Tumor-Typen PIBF oder PIBF- verwandte Substanzen, z.B. PIBF-Moleküle verschiedener Länge, PIBF-Moleküle aus unterschied- lich gespleisster mRNA, trunkierte Moleküle, Fusionsproteine usw. exprimieren (Tabelle 111). 15 der 27 Tumoren (55%) zeigten eine stark positive Färbung. Das Fehlen einer spezifischen Immunfär- bung der Normalgewebe-Gegenstücke beweist, dass transformierte Tumor-Zellen PIBF differentiell exprimieren (vgl. Fig. 4).

   In der in Fig. 4 linken, mit "A" bezeichneten Spalte ist das Normalgewebe gezeigt, in der rechten, mit "B" bezeichneten Spalte sind Tumorgewebe gezeigt. In der ersten (mit "1" bezeichneten) Reihe ist Lungenkrebs (kleine Zellen), in der zweiten (mit "2") bezeichneten Reihe ist Harnblasencarcinom (Übergangszelle), und in Reihe "3" ist Magenkrebs (Adenocarcinom) gezeigt. Diese Daten belegen auch, dass die PIBF-Positivität ein Ergebnis der Expression durch die Tumorzellen selbst ist, und nicht der Bindung von PIBF aus dem extrazellulären Fluid (von infiltrierenden Lymphozyten sezerniert). 



   TABELLE 111 
 EMI18.1 
 
<tb> Organ <SEP> Gewebs- <SEP> und <SEP> Tumor- <SEP> Anzahl <SEP> PIBF-Positi
<tb> 
<tb> 
<tb> Typ <SEP> ver
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> (Anzahl <SEP> der <SEP> Getes
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> teten)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Magen <SEP> Adenocarcinom <SEP> 1 <SEP> (2) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Gallenblase <SEP> Adenocarcinom <SEP> 0(1)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Prostata <SEP> Adenocarcinom <SEP> 0(1)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Colon <SEP> Adenocarcinom <SEP> 1 <SEP> (1) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Primär-Tumor
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Ovarium <SEP> Cystadenocarcinom <SEP> 2 <SEP> (3)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Schilddrüse <SEP> Carcinoma <SEP> papillare <SEP> 2 <SEP> (2)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Brust <SEP> Invasives <SEP> duktales <SEP> 1(1)

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Carci <SEP> nom <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Brust <SEP> Invasives <SEP> lobuläres <SEP> 1 <SEP> (1) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Carcinom
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Uterus <SEP> Cc. <SEP> endometrioides <SEP> 0 <SEP> (1)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Uterus <SEP> stromales <SEP> Carcinom <SEP> 0(1)
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<tb> Uterus <SEP> Leiomyosarkom <SEP> 0(1)
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<tb> Septum <SEP> nasi <SEP> Leiomyosarkom <SEP> 0(1)
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<tb> Haut <SEP> Melanom <SEP> 0(2)
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<tb> Haut <SEP> epitheliales <SEP> Carci <SEP> 1(1)
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<tb> nom
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<tb> Lunge <SEP> epitheliales <SEP> Carci <SEP> 2(2)
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<tb> nom
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<tb> Speiseröhre <SEP> Adenocarcinom <SEP> 1 <SEP> (1)

   <SEP> 
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<tb> Harnblase <SEP> Übergangszellen- <SEP> 1 <SEP> (1) <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Carcinom
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<tb> Metastase <SEP> (Haut) <SEP> hellzelliges <SEP> Nie- <SEP> 0(1)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> rencarcinom
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<tb> Metastase <SEP> (Lymphkno- <SEP> Plattenepithel <SEP> 1(1)
<tb> 
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<tb> ten)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 
 EMI19.1 
 
<tb> Organ <SEP> Gewebs- <SEP> und <SEP> Tumor- <SEP> Anzahl <SEP> PIBF-Positi
<tb> 
<tb> 
<tb> Typ <SEP> ver
<tb> 
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<tb> (Anzahl <SEP> der <SEP> Getes
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<tb> Metastase <SEP> (Lymphkno- <SEP> Adenocc.

   <SEP> coli <SEP> 1(2)
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<tb> ten)
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Auf Grund der oben erwähnten Ergebnisse ist die PIBF-Produktion ein ganz allgemeines Phä- nomen des malignen oder undifferenzierten Zustands, und folglich kann PIBF als Tumor-Marker dienen. 



    Beispiel 4 : der NK-Aktivität durch die Anwesenheit von PIBF   
Wenn man alle Daten hinsichtlich der potentiellen Bedeutung von PIBF bei der Suppression von anti-Tumor-Reaktionen zusammennimmt, ist es plausibel, dass durch Tumorzellen erzeugter PIBF - sezerniert oder an der Zelloberfläche exprimiert - die Killerzellen-Aktivität systemisch oder lokal inhibieren wird. Es ist seit langem bekannt, das es Zelllinien gibt, die bei NK-Tests gute Ziele sind, wogegen andere dies nicht sind. Die Human-Tumor-Zelllinie MCF-7 gehört zur Kategorie der schlechten Ziele. Es ist daher eine Möglichkeit, dass die niedrige Tötungsaktivität gegen diese Zellen das Ergebnis einer PIBF-Produktion ist, die die NK-Aktivität inhibiert, da die MCF-7-Zelllinie erwiesenermassen PIBF produziert.

   Um diese Möglichkeit zu testen, wurden PIBF-exprimierende MCF-7-Zellen als Ziele in einem 4-stündigen Einzelzellen-Cytotoxizitäts-Test gemäss Grimm und   Bonavida "Frequency determination of killer cells by a single-cell cytotoxic assay" ; Enzy-   mol. 93,270 (1983) verwendet. In Fig. 5 ist gezeigt, dass die anti-PIBF-Behandlung die gezielte Tötung von Tumorzellen durch NK-Zellen verstärkt : Das Minus und das Plus bedeuten die Behand- lung mit oder ohne   anti-PIBF-IgG,   die Zahlen sind die Prozent der NK-Aktvität für Fig. 5A und 5B und die Prozent der Hemmung der NK-Aktivität für Fig. 5C und 5D. Die Quelle der NK-Zellen waren frisch isolierte PBMCs von gesunden Individuen.

   Tatsächlich steigerte die Behandlung dieser Tumor-Zellen mit   anti-PIBF-lgGs   ihre Empfindlichkeit gegenüber einer durch NK vermittelten Lyse drastisch, etwa 8-10fach (Fig. 5A). Die grundlegende Tötungsaktivität gegen MCF-7-Zellen ist sehr niedrig (1-2%), wogegen hohe Werte (50-80%) messbar sind, wenn K562-Zellen als Zielzellen in Paralleltests verwendet werden. Dieselbe anti-PIBF-Behandlung, die zur Steigerung der Zielakti- vität von Tumorzellen wirksam zu sein scheint, hatte jedoch keine Wirkung auf eine Nicht-Tumor- Zelllinie (McCoy, Human-Embryo-Fibroblasten) (Fig. 5B). Durch Charakterisierung repräsentativer Mitglieder (gute im Vergleich zu schlechten Zielen) beider Gruppen kann man eine Wechselbezie- hung zwischen der Expression von PIBF- und NK-Zellaktivität aufstellen.

   Ausserdem ermöglicht dieser Test die Untersuchung der Wirksamkeit von exogenem PIBF zur Verringerung der PIBF- Zielzellen-Tötung, und, was noch wichtiger ist, zur Beurteilung der Stärke neutralisierender anti- PIBF-Antikörper zur Stimulierung der Lyse von PIBF+ Tumorzellen. Neutralisierende Kaninchen- anti-Human- und auch-anti-Maus-Antiseren werden hergestellt, wobei diese polyklonalen Antikör- per natürlichen PIBF in vitro (Human-Leukozyten-Kulturen im NK-Test) oder in vivo (trächtige Mäuse, als Tiermodell) inaktivieren können. Durch Zugeben von rekombinantem PIBF zu K562- Zellen (als Ziele) und PBMCs (als Quelle für NK-Zellen) war es möglich, die grundlegende Tö- tungsaktivität um 60-70% zu verringern (Fig. 5C).

   Antikörper, die gegen den rekombinanten PIBF erzeugt wurden, schalteten diese Inhibierung der Tötungsaktivität beinahe vollständig aus (Fig. 5D) 
 EMI19.2 
 
Einer der Hauptmechanismen der die Schwangerschaft fördernden Wirkung von PIBF ist die Induktion der TH2-Cytokine. Es gibt nun Beweise dafür, dass die rekombinante Form von PIBF auch wirksam ist, die Cytokin-Expression durch periphere Blutlymphozyten in vitro zu modulieren. 



  Um die Funktionalität des rekombinanten Human-PIBF, der in E. coli exprimiert und mittels GST- Markierung gereinigt worden war, zu testen, wurde   rPIBF   zu von Nicht-Schwangeren stammenden peripheren Lymphozyten, die mittels Ficoll-Paque-Gradient isoliert und mit einer 106/ml-Zelldichte 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 gezüchtet worden waren, zugegeben. Die Erzeugung des Prototyps TH2-Lymphokin, IL-10, wurde durch Detektion und Zählen der Anzahl IL-10-positiver Lymphozyten (mittels Immunhistochemie auf Cytospins) nach 24 h Behandlung gemessen. Die Prozent IL-10-positiver Lymphozyten nahm in Abhängigkeit von der PIBF-Konzentration von 0,35 +/- 0,15 auf 3,5 +/- 1,5% zu. Bei der höchs- ten rPIBF-Konzentration (10  g/ml) waren 10x mehr IL-10-positive Lymphozyten vorhanden als in Kontroll-Kulturen (Fig. 6A).

   Die entgegengesetzte Wirkung war auf   IL-12(THrLymphokin)-   produzierenden Lymphozyten durch dieselbe Behandlung zu sehen. Die Anzahl IL-12-positiver Lymphozyten nahm in Abhängigkeit der PIBF-Konzentration ab, was zu einer etwa 8-fachen Ver- ringerung bei der höchsten Menge an PIBF führte. Die Neutralisierung der Wirkung natürlichen PIBFs auf die Cytokin-Produktion war ebenso erfolgreich. Die 3-stündige Behandlung der Lympho- zyten einer Schwangerschaft (PIBF produzierend) mit anti-PIBF-lgGs führte zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl IL-10-positiver und einer signifikanten Zunahme der Anzahl IL-12-positiver Zellen (Fig. 6B und C). Diese Ergebnisse beweisen, dass die rekombinante PIBF-Form aktiv zur Induktion von TH2-Cytokin-Expression ist.

   Von noch grösserer Wichtigkeit ist, dass neutralisierende Antikörper aktiven PIBF, der durch Zellen in vivo erzeugt ist, entfernen und folglich TH1-CYTOKINE verstärken können. 



   SEQUENZPROTOKOLL < 110 > Cistem Biotechnologies/InterCell < 120 > PIBF < 130 > R 36444 < 140 > < 141 > < 160 > 3 < 170 > Patentin Ver. 2.1    < 210 > 1   < 211 > 757 < 212 > PRT < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der künstlichen Sequenz :rekombinantes   Protein < 400 > 1   
Met Ser Arg Lys lle Ser Lys Glu Ser Lys Lys Val Asn Ile Ser Ser   1 5 10 15   
Ser Leu Glu Ser Glu Asp lle Ser Leu Glu Thr Thr Val Pro Thr Asp 
20 25 30 
Asp lle Ser Ser Ser Glu Glu Arg Glu Gly Lys Val Arg lle Thr Arg 
35 40 45 
Gin Leu Ile Glu Arg Lys Glu Leu Leu His Asn lle Gin Leu Leu Lys 
50 55 60 
Ile Glu Leu Ser Gin Lys Thr Met Met lle Asp Asn Leu Lys Val Asp 
65 70 75 80 
Tyr Leu Thr Lys Ile Glu Glu Leu Glu Glu Lys Leu Asn Asp Ala Leu 
85 90 95 
His Gin Lys Gin Leu Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asn Gin Leu Ala Phe 
100 105 110 

  

 <Desc/Clms Page number 21> 

 Gin Gln Lys Asp Ala Ser Lys Tyr Gin Glu Leu Met Lys Gln Glu Met 
115 120 125 Glu Thr Ile Leu Leu Arg Gin Lys Gin Leu Glu Glu Thr Asn Leu Gln 
130 135 140 Leu Arg Glu Lys Ala Gly Asp Val Arg Arg Ser Leu Arg Asp Phe Glu 
145 150 155 160 Leu Thr Glu Glu Gin Tyr lle Lys Leu Lys Ala Phe Pro Glu Asp Gln 
165 170 175 Leu Ser lle Pro Glu Tyr Val Ser Val Arg Phe Tyr Glu Leu Val Asn 
180 185 190 Pro Leu Arg Lys Glu lle Cys Glu Leu Gln Val Lys Lys Asn lle Leu 
195 200 205 Ala Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Asn Gln Leu Lys Gln Leu Thr Glu 
210 215 220 Thr Tyr Glu Glu Asp Arg Lys Asn Tyr Ser Glu Val Gln lle Arg Cys 225 230 235 240 Gln Arg Leu Ala Leu Glu Leu Ala Asp Thr Lys Gin Leu lle Gln Gln 
245 250 255 Gly Asp Tyr Arg Gin Glu Asn Tyr Asp Lys Val Lys Ser Glu Arg Asp 
260 265 270 Ala Leu Glu Gln Glu Val lle Glu Leu Arg Arg Lys His Glu lle Leu 
275 280 285 Glu Ala 

  Ser His Met lle Gln Thr Lys Glu Arg Ser Glu Leu Ser Lys 
290 295 300 Glu Val Val Thr Leu Glu Gln Thr Val Thr Leu Leu Gin Lys Asp Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Leu Asn Arg Gln Asn Met Glu Leu Ser Val Arg Cys Ala His 
325 330 335 Glu Glu Asp Arg Leu Glu Arg Leu Gln Ala Gln Leu Glu Glu Ser Lys 
340 345 350 Lys Ala Arg Glu Glu Met Tyr Glu Lys Tyr Val Ala Ser Arg Asp His 
355 360 365 Tyr Lys Thr Glu Tyr Glu Asn Lys Leu His Asp Glu Leu Glu Gln lle 
370 375 380 Arg Leu Lys Thr Asn Gln Glu lle Asp Gin Leu Arg Asn Ala Ser Arg 385 390 395 400 Glu Met Tyr Glu Arg Glu Asn Arg Asn Leu Arg Glu Ala Arg Asp Asn 
405 410 415 Ala Val Ala Glu Lys Glu Arg Ala Val Met Ala Glu Lys Asp Ala Leu 
420 425 430 Glu Lys His Asp Gin Leu Leu Asp Arg Tyr Arg Glu Leu Gin Leu Ser 
435 440 445 Thr Glu Ser Lys Val Thr Glu Phe Leu His Gln Ser Lys Leu Lys Ser 
450 455 460 Phe Glu Ser Glu Arg Val Gin Leu Leu Gln Glu Glu 

  Thr Ala Arg Asn 465 470 475 480 Leu Thr Gln Cys Gln Leu Glu Cys Glu Lys Tyr Gin Lys Lys Leu Glu 
485 490 495 Val Leu Thr Lys Glu Phe Tyr Ser Leu Gln Ala Ser Ser Glu Lys Arg 
500 505 510 lle Thr Glu Leu Gln Ala Gin Asn Ser Glu His Gin Ala Arg Leu Asp 
515 520 525 lle TyrGlu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Asp Glu Ile lle Met Gin Thr 
530 535 540 Ala Glu lle Glu Asn Glu Asp Glu Ala Glu Arg Val Leu Phe Ser Tyr 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 545 550 555 560 Gly Tyr Gly Ala Asn Val Pro Thr Thr Ala Lys Arg Arg Leu Lys Gln 
565 570 575 Ser Val His Leu Ala Arg Arg Val Leu Gin Leu Glu Lys Gln Asn Ser 
580 585 590 Leu lle Leu Lys Asp Leu Glu His Arg Lys Asp Gln Val Thr Gln Leu 
595 600 605 Ser Gin Glu Leu Asp Arg Ala Asn Ser Leu Leu Asn Gln Thr Gln Gln 
610 615 620 Pro Tyr Arg Tyr Leu lle Glu Ser Val Arg Gln Arg Asp Ser Lys lle 625 630 635 640 Asp Ser Leu Thr Glu Ser lle Ala Gln Leu Glu Lys Asp 

  Val Ser Asn 
645 650 655 Leu Asn Lys Glu Lys Ser Ala Leu Leu Gln Thr Lys Asn Gin Met Ala 
660 665 670 Leu Asp Leu Glu Gln Leu Leu Asn His Arg Glu Glu Leu Ala Ala Met 
675 680 685 Lys Gln lle Leu Val Lys Met His Ser Lys His Ser Glu Asn Ser Leu 
690 695 700 Leu Leu Thr Lys Thr Glu Pro Lys His Val Thr Glu Asn Gln Lys Ser 705 710 715 720 Lys Thr Leu Asn Val Pro Lys Glu His Glu Asp Asn lle Phe Thr Pro 
725 730 735 Lys Pro Thr Leu Phe Thr Lys Lys Glu Ala Pro Glu Trp Ser Lys Lys 
740 745 750 Gln Lys Met Lys Thr 
755    < 210 > < 211 > 758   < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 400 > 2 Met Ser Arg Lys Ile Ser Lys Glu Ser Lys Lys Val Asn lle Ser Ser   1 5 10 15   Ser Leu Glu Ser Glu Asp lle Ser Leu Glu Thr Thr Val Pro Thr Asp 
20 25 30 Asp lle Ser Ser Ser Glu Glu Arg Glu Gly Lys Val Arg lle Thr Arg 
35 40 45 Gln Leu lle Glu Arg Lys Glu Leu Leu His Asn lle 

  Gln Leu Leu Lys 
50 55 60 lle Glu Leu Ser Gln Lys Thr Met Met lle Asp Asn Leu Lys Val Asp 65 70 75 80 Tyr Leu Thr Lys lle Glu Glu Leu Glu Glu Lys Leu Asn Asp Ala Leu 
85 90 95 His Gin Lys Gin Leu Leu Thr Leu Arg Leu Asp Asn Gin Leu Ala Phe 
100 105 110 Gin Gin Lys Asp Ala Ser Lys Tyr Gin Glu Leu Met Lys Gin Glu Met 
115 120 125 Glu Thr lle Leu Leu Arg Gln Lys Gln Leu Glu Glu Thr Asn Leu Gin 
130 135 140 Leu Arg Glu Lys Ala Gly Asp Val Arg Arg Ser Leu Arg Asp Phe Glu 145 150 155 160 Leu Thr Glu Glu Gin Tyr lle Lys Leu Lys Ala Phe Pro Glu Asp Gin 

 <Desc/Clms Page number 23> 

 
165 170 175 Leu Ser Ile Pro Glu Tyr Val Ser Val Arg Phe Tyr Glu Leu Val Asn 
180 185 190 Pro Leu Arg Lys Glu lle Gys Glu Leu Gin Val Lys Lys Asn Ile Leu 
195 200 205 Ala Glu Glu Leu Ser Thr Asn Lys Asn Gln Leu Lys Gin Leu Thr Glu 
210 215 220 Thr Tyr Glu Glu Asp Arg Lys Asn Tyr Ser Glu Val Gln lle Arg Cys 

  225 230 235 240 Gln Arg Leu Ala Leu Glu Leu Ala Asp Thr Lys Gin Leu lle Gln Gin 
245 250 255 Gly Asp Tyr Arg Gin Glu Asn Tyr Asp Lys Val Lys Ser Glu Arg Asp 
260 265 270 Ala Leu Glu Gln Glu Val lle Glu Leu Arg Arg Lys His Glu Ile Leu 
275 280 285 Glu Ala Ser His Met lle Gln Thr Lys Glu Arg Ser Glu Leu Ser Lys 
290 295 300 Glu Val Val Thr Leu Glu Gln Thr Val Thr Leu Leu Gln Lys Asp Lys 
305 310 315 320 Glu Tyr Leu Asn Arg Gln Asn Met Glu Leu Ser Val Cys Cys Ala His 
325 330 335 Glu Glu Asp Arg Leu Glu Arg Leu Gln Ala Gln Leu Glu Glu Ser Lys 
340 345 350 Lys Ala Arg Glu Glu Met Tyr Glu Lys Tyr Val Ala Ser Arg Asp His 
355 360 365 Tyr Lys Thr Glu Tyr Glu Asn Lys Leu His Asp Glu Leu Glu Gin lle 
370 375 380 Arg Leu Lys Thr Asn Gln Glu lle Asp Gin Leu Arg Asn Ala Ser Arg 385 390 395 400 Glu Met Tyr Glu Arg Glu Asn Arg Asn Leu Arg Glu Ala Arg Asp Asn 
405 410 415 Ala Val Ala Glu Lys Glu 

  Arg Ala Val Met Ala Glu Lys Asp Ala Leu 
420 425 430 Glu Lys His Asp Gin Leu Leu Asp Arg Tyr Arg Glu Leu Gin Leu Ser 
435 440 445 Thr Glu Ser Lys Val Thr Glu Phe Leu His Gin Ser Lys Leu Lys Ser 
450 455 460 Phe Glu Ser Glu Arg Val Gin Leu Leu Gin Glu Glu Thr Ala Arg Asn 465 470 475 480 Leu Thr Gin Cys Gin Leu Glu Cys Glu Lys Tyr Gin Lys Lys Leu Glu 
485 490 495 Val Leu Thr Lys Glu Phe Tyr Ser Leu Gin Ala Ser Ser Glu Lys Arg 
500 505 510 lle Thr Glu Leu Gin Ala Gin Asn Ser Glu His Gin Ala Arg Leu Asp 
515 520 525 lle Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Glu Leu Asp Glu lle lle Met Gin Thr 
530 535 540 Ala Glu lle Glu Asn Glu Asp Glu Ala Glu Arg Val Leu Phe Ser Tyr 545 550 555 560 Gly Tyr Gly Ala Asn Val Pro Thr Thr Ala Lys Arg Arg Leu Lys Gin 
565 570 575 Ser Val His Leu Ala Arg Arg Val Leu Gin Leu Glu Lys Gin Asn Ser 
580 585 590 Leu lle Xaa Lys Arg Ser Gly Thr Ser Lys Gly Pro Ser Asn Thr Ala 

  
595 600 605 

 <Desc/Clms Page number 24> 

 Phe Thr Arg Ser Leu Thr Glu Ala Asn Ser Leu Leu Asn Gln Thr Gln 
610 615 620 Gin Pro Tyr Arg Tyr Leu lle Glu Ser Val Arg Gln Arg Asp Ser Lys 625 630 635 640 lle Asp Ser Leu Thr Glu Ser lle Ala Gln Leu Glu Lys Asp Val Ser 
645 650 655 Asn Leu Asn Lys Glu Lys Ser Ala Leu Leu Gln Thr Lys Asn Gln Met 
660 665 670 Ala Leu Asp Leu Glu Gln Leu Leu Asn His Arg Glu Glu Leu Ala Ala 
675 680 685 Met Lys Gln lle Leu Val Lys Met His Ser Lys His Ser Glu Asn Ser 
690 695 700 Leu Leu Leu Thr Lys Thr Glu Pro Lys His Val Thr Glu Asn Gln Lys 705 710 715 720 Ser Lys Thr Leu Asn Val Pro Lys Glu His Glu Asp Asn lle Phe Thr 
725 730 735 Pro Lys Pro Thr Leu Phe Thr Lys Lys Glu Ala Pro Glu Trp Ser Lys 
740 745 750 Lys Gln Lys Met Lys Thr 
755    < 210 > 3 < 211 > 2715    < 212 > DNA < 213 > Künstliche Sequenz < 220 > < 223 > Beschreibung der 

  künstlichen Sequenz:rekombinante 
DNA < 400 > 3 cgtgttttgc tttccgctcc tcggaacatc cgggagagtt gacttccggc ggcttgtggg 60 agtgctggtt ctgtcctcct tgcgggtgcg gagatggttg tcttggttac gggtcctaac 120 ggtcccctgc cttgaaatcc cttgttgagg gcctgcaacc ttgtgcttcc gactggagac 180 gcctttggtc cctcggtgtc tgcactggct gctggtcaag gcttcagtgt ggacgaattg 240 acactttcga gaatattaaa atcaaattag agaagaaaac tgatccataat taataaaaat 300 gtctcgaaaa atttcaaagg agtcaaaaaa agtgaacatc tctagttctc tggaatctga 360 agatattagt ttagaaacaa cagttcctac ggatgatatt tcctcatcag aagagcgaga 420 gggcaaagtc agaatcacca ggcagctaat tgaacgaaaa gaactacttc ataatattca 480 gttactaaaa attgagctat cccagaaaac tatgatgatc gacaatttga aagtggatta 540 tcttacaaag attgaagaat tggaggagaa acttaatgat gcacttcacc agaagcagct 600 actaacattg agattagaca accaattggc ttttcaacag aaagatgcca gcaaatatca 660 agaattaatg aaacaagaa tggaaaccat tttgttgaga cagaaacaac tagaagagac 720 

  aaatcttcag ctaagagaaa aagctggaga tgttcgtcga agcctgcgtg actttgagtt 780 gacagaagag caatatatta aattaaaagc ttttcctgaa gatcagcttt ctattcctga 840 atatgtatct gttcgcttct atgagctagt gaatccatta agaaaggaaa tctgtgaact 900 acaagtgaaa aagaatatcc tagcagaaga attaagtaca aacaaaaacc aactgaagca 960 gctgacagag acatatgagg aagatcgaaa aaactactct gaagttcaaa ttagatgtca 1020 acgtttggcc ttagaattag cagacacaaa acagttaatt cagcaaggtg actaccgtca 1080 agagaactat gataaagtca agagtgaacg tgatgcactt gaacaggaag taattgagct 1140 taggagaaaa catgaaatac ttgaagcctc tcacatgatt caaacaaaag aacgaagtga 1200 attatcaaaa gaggtagtca ccttagagca aactgttact ttactgcaaa aggataaaga 1260 atatcttaat cgccaaaaca tggagcttag tgttcgctgt gctcatgaag aggatcgcct 1320 tgaaagactt caagctcaac tggaagaaag caaaaaggct agagaagaga tgtatgaaaa 1380 atatgtagca tccagagacc attataaaac agaatatgaa aataaactac atgatgaact 1440 agaacaaatc agattgaaaa ccaaccaaga aattgatcaa 

  cttcgaaatg cctctaggga 1500 

 <Desc/Clms Page number 25> 

 aatgtatgaa cgagaaaaca gaaatctccg agaagcaagg gataatgctg tggctgaaaa 1560 ggaacgagca gtgatggctg aaaaggatgc tttagaaaaa cacgatcagc tcttagacag 1620 gtacagagaa ctacaactta gtacagaaag caaagtaaca gaatttctcc atcaaagtaa 1680 attaaaatct tttgaaagtg agcgtgttca acttctgcaa gaggaaacag caagaaatct 1740 cacacagtgt caattggaat gtgaaaaata tcagaaaaaa ttggaggttt taaccaaaga 1800 attttatagt ctccaagcct cttctgaaaa acgcattact gaacttcaag cacagaactc 1860 agagcatcaa gcaaggctag acatttatga gaaactggaa aaagagcttg atgaaataat 1920 aatgcaaact gcagaaattg aaaatgaaga tgaggctgaa agggttcttt tttcctacgg 1980 ctatggtgct aatgttccca caacagccaa aagacgacta aagcaaagtg ttcacttggc 2040 aagaagagtg cttcaattag aaaaacaaaa ctcgctgatt ttaaaagatc tggaacatcg 2100 aaaggaccaa gtaacacagc tttcacaaga gcttgacaga gccaattcgc tattaaacca 2160 gactcaacag ccttacaggt atctcattga atcagtgcgt 

  cagagagatt ctaagattga 2220 ttcactgacg gaatctattg cacaacttga gaaagatgtc agcaacttaa ataaagaaaa 2280 gtcagcttta ctacagacga agaatcaaat ggcattagat ttagaacaac ttctaaatca 2340 tcgtgaggaa ttggcagcaa tgaaacagat tctcgttaag atgcatagta aacattctga 2400 gaacagctta cttctcacta aaacagaacc aaaacatgtg acagaaaatc agaaatcaaa 2460 gactttgaat gtgcctaaag agcatgaaga caatatattt acacctaaac caacactctt 2520 tactaaaaaa gaagcacctg agtggtctaa gaaacaaaag atgaagacct agtgttttgg 2580 atgggaagca cctgtagacc attatatact cctgaagttc tttttctgat ggaaaacaaa 2640 attcagctta atcgtgtact cagcattttt taaataacaa tgtttatttg aactaatatt 2700 aaattaacaa attcg 2715 
Literaturstellen 
1. Szekeres-Bartho, J., Kinsky, R., Kapovic, M., Vargan P., Chaouat, G. Immuno-endocrine networks in pregnancy. In: Gergely et. al Ed. Progress in Immunology X. Springer Verlag 1993 S. 861 
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   PATENTANSPRÜCHE: 
1. Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, welches Verfahren ge- kennzeichnet ist durch das Bereitstellen einer Probe vom Patienten, das Messen der Kon- zentration von PIBF (Progesteroninduzierter Blockierungs-Faktor) oder eines Derivats da- von oder Fragments davon in der Probe und die Bestimmung, ob die PIBF-Konzentration in der Probe über oder unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, wobei die Kon- zentration über dem Schwellenwert einen Patienten mit einem Tumor identifiziert.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Epithel- Carcinom, insbesondere ein Lungen-Carcinom, ein Colon-Carcinom oder ein Brust- Carcinom ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Körper- flüssigkeit, insbesondere Harn oder Serum ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine <Desc/Clms Page number 27> Gewebsprobe ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwel- lenwert die Konzentration des PIBF in einer Probe einer gesunden Person ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwel- lenwert durch Messen der PIBF-Konzentration in mindestens einer gesunden Person pa- rallel zur Bestimmung der PIBF-Konzentration in einer Probe des Patienter bestimmt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als positive Kontrolle die Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments da- von in der Probe, die eine festgelegte Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon aufweist, gemessen wird, parallel zur Bestimmung der Kon- zentration des PIBF in der Probe des Patienten.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die PIBF- Konzentration in der Probe immunologisch, durch einen konkurrierenden Test, durch einen Sandwich-Test, durch Immunfärbung oder durch Kombinationen dieser Methoden gemes- sen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die PIBF- Konzentration in der Probe indirekt, durch Messung der Konzentration der PIBF-mRNA in der Probe, gemessen wird.

10. Verfahren zur Bestimmung der positiven oder negativen Progression eines Tumors bei ei- nem Patienten, welches gekennzeichnet ist durch die Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten gemäss einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Fest- stellung, ob die gemessene Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der Probe über oder unter mindestens einer zuvor gemessenen Kon- zentration von PIBF oder einem Derivat davon oder einem Fragment davon in mindestens einer zuvor vom selben Patienten genommenen Probe liegt, wobei eine über der zuvor gemessenen Konzentration liegende Konzentration eine positive Progression identifiziert.

11. Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments davon bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10.

12. Verwendung von PIBF oder einem Derivat davon oder einem Fragment davon bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF ein rekombinan- ter PIBF ist.

14. Set, gekennzeichnet durch ein erstes Reagens, das mindestens einen anti-PIBF- Antikörper oder ein Fragment desselben aufweist, und ein zweites Reagens, das PIBF o- der ein Derivat davon oder ein Fragment davon mit einer bestimmten Konzentration auf- weist.

15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es eine feste Phase aufweist, an die der mindestens eine anti-PIBF-Antikörper oder das Fragment davon oder das PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon gebunden ist.

16. Set nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF rekombinant ist.

17. Set nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Reagens umfasst, welches einen zweiten anti-PIBF-Antikörper oder ein Fragment davon aufweist, der (das) an ein Epitop des PIBF bindet, welches von dem vom ersten anti-PIBF-Antikörper oder seinem Fragment erkannten Epitop verschieden ist.

18. Set nach einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Pa- tienten bzw. zur Feststellung der Progression eines Tumors bei einem Patienten.

19. Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen anti-PIBF- Antikörpers, insbesondere eines humanisierten anti-PIBF-Antikörpers oder eines Frag- ments davon zur Herstellung eines anti-Tumor-Medikaments.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Einzel- ketten-Antikörper ist.

21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein an ihm haftendes Molekül aufweist.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine toxische Substanz ist, insbesondere ein Radionuklid, ein chemotherapeutischer Arzneistoff oder ein <Desc/Clms Page number 28> Toxin, bzw. ein Prodrug.

23. Verwendung von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon zur Her- stellung eines Anti-Tumor-Medikaments.

24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Vak- zin ist.

25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Vakzin weiters ein Ad- juvans aufweist.

26. Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon rekombinant ist.

27. Verwendung nach Anspruch 23 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon ein chemisch synthetisiertes Molekül ist.

28. Verwendung eines Polynukleotids, das für PIBF oder ein Derivat davon oder Fragment da- von oder für ein PIBF-antisense-Molekül codiert, zur Herstellung eines Anti-Tumor- Medikaments. EMI28.1 in(PIBF-)-Aktivität, welches - die Aminosäuresequenz gemäss SEQ.ID.NO 1 oder - eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 98% mit der Sequen gemäss SEQ.ID.NO 1, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, oder - eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 95% mit der Sequenz von Aminosäurerest 580 bis 630 von SEQ.ID.NO 1, wie mittels FAST/A- Algorithmus bestimmt, und - eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des ratürlichen Human-PIBF-Moleküls auf- weist.

30. Rekombinantes Protein nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Amino- säuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 300 bis 350 in SEQ.ID.NO 1 angegeben, aufweist.

31. Rekombinantes Protein nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 580 bis 630 in SEQ.ID.NO 1 ange- geben, aufweist.

32. Nukleinsäure-Molekül, das für ein rekombinantes Protein mit einer PIBF-Aktivität nach e- nem der Ansprüche 29 bis 31 codiert.

33. Nukleinsäure-Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für ein rekombinantes Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäss einem der Ansprüche 29 bis 31 codiert, und ein ge- eignetes Regulierungselement, das eine Transkription eines komplementären Nukleinsäu- re-Moleküls mindestens dieser für PIBF-Aktivität codierenden Nukleinsäuresequenz er- möglicht, aufweist.

34. Nukleinsäure-Vektor nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass er weiters einen Selektions-Marker aufweist.

35. Zelle, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 32 bis 34.

HIEZU 8 BLATT ZEICHNUNGEN