ES2283461T3 - Procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente determinando la concentracion de pibf. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento medir la concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona) o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en una muestra tomada del paciente y determinar si la concentración de PIBF en la muestra que está por encima o por debajo de un valor umbral predeterminado, mediante la concentración por encima del valor umbral identifica un paciente con un tumor.

Description

Procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente determinando la concentración de PIBF.

La presente invención se refiere a una proteína recombinante con una actividad de Proteína Inmunomoduladora Inducida por Progesterona (BIFP), una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante con una actividad PIBF, un vector de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, una célula que comprende dicho vector y un procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente.

Para el mantenimiento del embarazo normal, la producción de progesterona -una hormona esteroide con amplio intervalo de efectos inmunosupresores- es absolutamente esencial. Los linfocitos periféricos de mujeres embarazadas sanas expresan receptores nucleares para detectar esta hormona (Szekeres-Bartho y col. J. Reprod. Immunol. 16, 239 (1989); Szekeres-Bartho y col. Cell. Immunol. 125, 273 (1990)), y producen una proteína mediadora llamada el Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona (PIBF) (Szekeres-Bartho y col. Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 9, 15 (1985)). La secuencia del ADNc de PIBF de hígado humano no mostró homología significativa con la de cualquiera de las proteínas conocidas (HSPIBF, Nº Acc. Y09631). La proteína precursora codificada es altamente hidrófila y tiene un peso molecular de 89 kDa. El PIBF de origen natural como se descubrió originalmente es una proteína inmunomoduladora de 34-36 kDa con una longitud de secuencia de 757 aminoácidos.

Se ha determinado que la concentración de PIBF en muestras de orina de personas sanas es de aproximadamente 1-10 ng/ml mientras que la concentración de PIBF en mujeres embarazadas en el 2º trimestre varía de aproximadamente 70-150 ng/ml. Estos elevados niveles vuelven rápidamente a la normalidad después del aborto y parto.

PIBF que media los efectos de la progesterona ha demostrado tener función inmunomoduladora muy potente, tanto in vitro, así como in vivo. De hecho, PIBF ha demostrado ser esencial para el embarazo en un modelo de ratón, ya que PIBF aislado de sobrenadantes de cultivo de linfocitos de ratón protege a los fetos de la resorción inducida por antiprogesteronas. Además, los anticuerpos neutralizantes contra el PIBF de ratón causan la resorción de los embriones y por consiguiente el aborto. El importante papel de PIBF en la reproducción humana también se ha corroborado midiendo bajos niveles en los fluidos corporales de embarazos patológicos. PIBF desempeña un papel importante en el mantenimiento del embarazo muy probablemente inhibiendo los linfocitos natural killer. De forma importante, manipulando experimentalmente la cantidad de PIBF in vitro, se puede modular la actividad de eliminación de los linfocitos de sangre periférica que contienen células NK (natural killer). Se ha determinado que hay al menos dos mecanismos de acción de PIBF sobre las células NK. Uno es una inhibición directa de la actividad de las células NK. Las células NK eliminan sus células diana por exocitosis de gránulos que contienen perforina o serina esterasa en el área de contacto entre las células efectoras y diana. Los linfocitos deciduales -de los que el 60% lleva los marcadores superficiales NK- tienen elevado contenido de perforina, sin embargo, ejercen una baja actividad citotóxica. Aunque las células NK activadas encuentran y se unen a sus dianas en presencia de PIBF, no logran liberar perforina desde los gránulos de almacenamiento, y como resultado, no hay lisis de las células diana. Parece que PIBF paraliza las células NK y mantiene
la maquinaria citotóxica en reposo inhibiendo la desgranulación y por tanto la liberación de sustancias de eliminación.

Hay otro mecanismo indirecto, por el que PIBF ejerce su efecto anti-NK, a través de la expresión alterada de citoquinas. En presencia de PIBF hay una disminución significativa en la producción de TNF\alpha (Factor de Necrosis Tumoral \alpha) por las células NK, que también podría estar implicada en la regulación negativa de la actividad NK. La cantidad de TNF\alpha secretado está inversamente relacionado con la producción de PIBF tanto in vitro como in vivo.

El segundo mecanismo principal de acción de PIBF es la inducción de dominancia de citoquinas T_{H2}. La dominancia T_{H2} contribuye a las respuestas disminuidas mediadas por células y la potenciación de células B, mientras que la dominancia T_{H1} provoca respuestas humorales disminuidas y favorece los mecanismos inmunológicos celulares. El PIBF secretado facilita la producción de citoquinas T_{H2}, tales como IL-3, IL-4 e IL-10, mientras que suprime las citoquinas T_{H1}, tales como IL-12 e IFN\gamma tanto in vitro como in vivo. La neutralización de PIBF por anticuerpos específicos provoca el cambio de T_{H1} in vivo, que también es una característica de los embarazos fallidos. El efecto de PIBF en las respuestas inmunes humorales no es una simple potenciación sino una inducción de la producción de anticuerpos asimétricos. Ésta es una población de anticuerpos (ab) que, debido a la presencia de un resto oligosacárido rico en manosa en uno de los brazos Fab de la molécula, tiene una estructura asimétrica, y no tiene o tiene bajas funciones efectoras; sin embargo, este ab podría funcionar como anticuerpo de bloqueo. La proporción de IgG asimétrica fue significativamente superior en sobrenadantes de células de hibridoma cultivadas en presencia de PIBF que en las cultivadas en ausencia de PIBF. Estudios adicionales revelaron una relación positiva entre el contenido de anticuerpos asimétricos de los sueros y la expresión de PIBF en linfocitos. Además, bloqueando los receptores de progesterona por RU 486 o neutralizando la actividad PIBF endógena por anticuerpos anti-PIBF específicos se redujo significativamente la producción de anticuerpos asimétricos en ratones preñados.

Los tumores malignos, es decir, cánceres, son la segunda causa principal de muerte en todos los países desarrollados después de enfermedad cardíaca y se desarrollan en una de cada tres personas. Una de cada cuatro personas muere de cáncer. El cáncer se caracteriza principalmente por un aumento en la cantidad de células anormales o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan formando una masa tumoral, la invasión de tejidos adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación de células malignas que se propagan mediante la sangre o el sistema linfático hasta los ganglios linfáticos regionales y hasta sitios distantes. El último progreso a la malignidad se conoce como metástasis.

El cáncer puede ser el resultado de una ruptura en la comunicación entre las células neoplásicas y su entorno, incluyendo sus células adyacentes normales. Las señales, tanto estimuladoras del crecimiento como inhibidoras del crecimiento, se intercambian de forma rutinaria entre células en un tejido. Normalmente, las células no se dividen en ausencia de señales estimuladoras y, del mismo modo, dejarán de dividirse en presencia de señales inhibidoras. En un estado canceroso, o neoplásico, una célula adquiere la capacidad de "anular" estas señales y proliferar en condiciones en las que no crecerían células normales.

Las células tumorales adquieren varios rasgos aberrantes diferentes para proliferar. Lo que refleja este requisito es el hecho de que los genomas de ciertos tumores bien estudiados llevan varios genes diferentes alterados independientemente, incluyendo oncogenes activados y genes supresores de tumores inactivados. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser responsable de conferir alguno de los rasgos que, en conjunto, representan el fenotipo neoplásico completo.

Las células tumorales llevan antígenos que pueden reconocerse como extraños para el cuerpo y que es una de las funciones principales del sistema inmune para eliminar dichas células antes de que puedan formar tumores grandes. Esta vigilancia inmune es claramente ineficaz en pacientes con enfermedades malignas progresivas. Hay un conjunto de medidas protectoras identificadas que suprimen la auto-reactividad y pueden representar una barrera principal en la capacidad del sistema inmune para erradicar células tumorales. Hay varios mecanismos ejercidos por las células tumorales tales como 1. ausencia de expresión de moléculas MHC de clase I clásicas y expresión de moléculas MHC de clase I de auto-identificación no clásicas (tales como HLA-G), que reduce el efecto de eliminación de CTL restringidas a MHC de clase I específicas de antígeno (tumor); 2. desviación hacia respuestas T_{H2}, supresión de la función auxiliar T_{H1}, y por consiguiente las respuestas anti-tumorales citotóxicas eficaces; y 3. la producción de factores inmunosupresores que regulan negativamente las respuestas inmunes locales y sistémicas (por ejemplo, la secreción de TGF-\beta disminuye la proliferación celular y la citotoxicidad, la expresión de ligando fas, que induce la apoptosis de CTL.). Como resultado de estos efectos acumulativos, los tumores disfrutan de un estado inmunológicamente privilegiado, y crecen sin o con control restringido del sistema inmune.

Está bastante bien establecido que muchas afecciones patológicas, tales como infecciones, cáncer, trastornos autoinmunes, etc., se caracterizan por la expresión inapropiada de ciertas moléculas. Por tanto estas moléculas sirven como "marcadores" para una afección patológica o anormal particular. Aparte de su uso como "dianas" de diagnóstico, es decir, materiales a identificar para diagnosticar estas afecciones anormales, las moléculas sirven como reactivos que pueden usarse para generar agentes de diagnóstico y/o terapéuticos.

Un objetivo de la presente invención es un nuevo procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente que puede realzarse de forma fácil y segura, no requiriendo dicho procedimiento un equipo de alta tecnología, no causa ningún problema particular para el paciente, que puede realizarse rápidamente y que conduce a resultados que permiten distinguir entre un paciente con un tumor y un paciente sano.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un kit para realizar el procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar una medicina anti-tumoral eficaz.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención para diagnosticar un tumor en un paciente con el que se resuelve el objeto anterior comprende tomar una muestra del paciente, medir la concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona) o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en la muestra y determinar si la concentración de PIBF en la muestra está por encima o por debajo de un valor umbral predeterminado, por el que la concentración por encima del valor umbral identifica un paciente con un tumor.

Durante la caracterización de PIBF como una molécula inmunomoduladora importante para el mantenimiento del embarazo, se ha mostrado sorprendentemente que las células tumorales expresan PIBF o sustancias relacionadas con PIBF, mientras que no se encuentra reactividad PIBF o se encuentra baja reactividad PIBF en los tejido normales adyacentes. Esto indica que PIBF está implicado en el desarrollo y mantenimiento de la tolerancia inmunológica hacia las células transformadas malignas y por lo tanto constituye un marcador útil para células tumorales.

Por lo tanto el procedimiento de acuerdo con la presente invención usa el hecho de que la concentración de PIBF en una muestra tomada del paciente a ensayar es mayor que la concentración de PIBF en una muestra tomada de una persona sana.

En el alcance de la presente invención, la muestra tomada del paciente puede ser cualquier tipo de muestra, fluida o no, de prácticamente cualquier parte del cuerpo. La concentración del PIBF puede medirse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica que posibilite cuantificar la concentración de PIBF en una muestra. Esto puede comprender técnicas químicas, microbiológicas, físicas, de tinción, etc. en fluidos, muestras tisulares, etc. Los posibles procedimientos incluyen la formación de imágenes in vivo con Tomografía por Ordenador (CT) e Imagen de Resonancia Magnética (MRI), después de marcar con marcadores radionucleicos y paramagnéticos (por ejemplo, gadolinio), respectivamente, etc.

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Como PIBF puede someterse a cambios metabólicos u otros cambios en el cuerpo del paciente, el PIBF puede comprender modificaciones dependiendo de qué muestra se haya tomado del paciente. El PIBF puede, por ejemplo, haberse escindido de modo que solamente un fragmento del PIBF esté presente en la muestra dada. El PIBF puede, además, haberse modificado de modo que esté presente un derivado del PIBF en esa muestra o también un fragmento de ese derivado. También se ha mostrado que hay ARNm de PIBF procesados de forma alternativa presentes en células tumorales en una diferente concentración en comparación con células normales, por lo tanto, las proteínas o fragmentos traducidos de estas diferentes formas de moléculas de ARNm o fragmentos de las mismas también están comprendidos por el término "fragmentos". Por lo tanto, puede usarse también el derivado de PIBF, o un fragmento del PIBF o del derivado de PIBF o sustancias relacionadas con PIBF (tales como, por ejemplo, un producto escindido de 34 kDa o un producto de 14 kDa con corte y empalme alternativo) como un indicio de la concentración del PIBF en el paciente y por lo tanto puede usarse la concentración respectiva para el procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente de acuerdo con l presente invención.

En el alcance e la presente invención la expresión "PIBF o fragmentos del mismo" se refiere a -sin limitación- secuencias de acuerdo con las SEC ID Nº 1, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 34 y 36 o fragmentos o derivados de las mismas. Por lo tanto, los ejemplos de PIBF o fragmentos del mismo que pueden detectarse o cuantificarse de acuerdo con la presente invención son estas secuencias mencionadas anteriormente. Como se ha demostrado que los exones 17 y 18 están incluidos en casi todas las formas de ARNm que se han identificado, los fragmentos de PIBF que comprenden los exones 17 y 18 (véanse las figuras) se usan preferiblemente para la detección o cuantificación de PIBF en una muestra.

En el alcance de la presente invención, el fragmento del PIBF o del derivado de PIBF puede comprender por ejemplo menos de 715 aminoácidos, preferiblemente menos de 500 aminoácidos, más preferiblemente menos de 200 aminoácidos, y mucho más preferiblemente menos de 50 aminoácidos.

En el alcance de la presente invención, el término "derivado" comprende por ejemplo cualquier modificación de origen natural o incluso no natural, por ejemplo, escisión, glicosilaciones, metilaciones, acetilaciones, amidaciones, fosforilaciones, sulfataciones, deleciones, sustituciones, etc.

Además, en el alcance de la presente invención, "valor umbral" se refiere a un valor de concentración que generalmente será la concentración en la muestra media de PIBF en donantes de muestras sanos. Es posible tomar una concentración de PIBF media general conocida en gente sana de acuerdo con la bibliografía o también determinar la concentración en la muestra de PIBF en donantes sanos cuando se realiza la presente invención. El valor umbral también puede determinarse en muestras sanas (normales) tomadas anteriormente (en un estado sano) de la misma persona. Los ejemplos de dichos valores umbral pueden ser por ejemplo entre 1 y 10 ng/ml, preferiblemente entre 1 y 5 n/ml, por lo que la concentración depende del procedimiento de detección así como del tipo de tumor. Además, el valor umbral puede ser cero en el caso de que solamente estén presentes productos de ARNm de PIBF procesados de forma alternativa en células tumorales y no en células sanas. Por lo tanto, el valor umbral también depende de la molécula de PIBF y debe determinarse para cada molécula de PIBF específica de forma individual.

Sin embargo, cuando se determina el valor umbral es importante que la muestra de la persona sana no se tome de una mujer embarazada ya que la concentración de PIBF en muestras de mujeres embarazadas es mayor que la concentración de PIBF en muestras de mujeres no embarazadas.

La concentración de PIBF medida en la muestra tomada del paciente que está por encima del valor umbral predeterminado identifica individuos con sospecha de tumor. Un "tumor" como se usa en este documento se refiere a todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos.

Dentro del término "paciente", en el alcance de la presente invención, están comprendidos pacientes con un tumor pero también pacientes susceptibles de tener un tumor así como gente sana que tiene una revisión rutinaria general. Por supuesto, el término "paciente" puede comprender también cualquier animal, en particular un ratón, rata, cobaya, mono, siendo preferiblemente dicho animal un animal de laboratorio usado para análisis, por ejemplo, para detectar tumores específicos, ensayar sustancias anti-tumorales o sustancias carcinogénicas. Además, el animal puede ser un animal modificado genéticamente que tiene una predisposición a desarrollar tumores.

Como el embarazo también provoca elevados niveles de PIBF, las mujeres sexualmente activas deben ensayarse por pruebas de embarazo convencionales (por ejemplo, basadas en hCG) antes de considerarse como pacientes con tumor. También se entiende que es muy difícil usar este ensayo para detectar crecimiento tumoral cuando el paciente es una mujer embarazada más allá del primer trimestre. Sin embargo, como una proporción significativa de las malignidades relacionadas con el embarazo están relacionadas con el crecimiento incontrolado de tejidos relacionados con el embarazo (tales como células trofoblásticas en mola hidatiforme), niveles extremadamente elevados (>150-200 ng/ml) de PIBF podrían indicar crecimiento tumoral con o sin un bebe viable presente.

Preferiblemente, el tumor a diagnosticar por el procedimiento de acuerdo con la presente invención es un carcinoma epitelial. Como la inmensa mayoría de los tumores humanos (en base a los datos de morbilidad mundial) son carcinomas epiteliales (pulmón, mama, colon, etc.) el procedimiento de acuerdo con la presente invención es particularmente ventajoso para el diagnóstico de este tipo de tumor.

El carcinoma epitelial es preferiblemente un carcinoma pulmonar, carcinoma de colon y carcinoma de mama, respectivamente. La concentración de PIBF en muestras tomadas de pacientes con los tumores mencionados anteriormente es particularmente elevada en comparación con la concentración de PIBF en muestras de pacientes sanos. Por lo tanto, si el procedimiento de acuerdo con la presente invención se usa para diagnosticar uno de los tumores mencionados anteriormente, una concentración por encima de un valor umbral identifica individuos con sospecha de tumor. Sin embargo, una concentración por debajo del valor umbral no necesariamente excluye la presencia de un tumor en ciertos casos.

De acuerdo con una realización ventajosa de la presente invención, la muestra es un fluido corporal, preferiblemente orina y suero, respectivamente. Esto posibilita un modo muy simple de tomar la muestra del paciente sin ninguna etapa quirúrgica y sin la necesidad de instrumentos de alta tecnología. El fluido corporal puede tomarse en cualquier laboratorio o incluso en la casa del paciente y es especialmente ventajoso para un diagnóstico de rutina, un diagnóstico en un paciente que está muy débil y para la revisión regular del progreso del tumor en un paciente. La concentración de PIBF puede, por ejemplo, medirse con un procedimiento químico seco, por ejemplo, una tira que cambiará su color de acuerdo con la concentración de PIBF en una muestra en la que se sumerge.

Como alternativa, la muestra es una muestra tisular. Aunque tomar este tipo de muestra del paciente no es tan fácil como tomar un fluido corporal, un procedimiento de acuerdo con la presente invención que usa una muestra tisular del paciente posibilita la localización directa del tumor, especialmente si se toman y comparan diferentes muestras tisulares entre sí. Además, es posible seguir directamente el progreso del tumor. Además, detectando los tejidos con un tumor, el procedimiento de acuerdo con la presente invención puede usarse adicionalmente al menos como un procedimiento adicional para decidir qué tejidos y qué partes de un cuerpo del paciente deben retirarse quirúrgicamente.

De acuerdo con la realización preferida de la presente invención, el valor umbral es la concentración de PIBF en una muestra de una persona sana. Por supuesto, el valor umbral es particularmente preciso si es la concentración media de PIBF de una pluralidad de muestras de personas sanas.

Preferiblemente, el valor umbral se determina midiendo la concentración de PIBF en una muestra de al menos una persona sana en paralelo a la determinación de la concentración de PIBF en una muestra del paciente. Como la concentración medida depende del procedimiento para medir la concentración de PIBF, el diagnóstico es más específico y exacto si el procedimiento para medir la concentración de PIBF en la muestra del paciente y en la muestra de la persona sana son idénticos. Para potenciar adicionalmente la sensibilidad del procedimiento, la muestra del paciente y la muestra de la persona sana preferiblemente se miden en paralelo, por ejemplo, al mismo tiempo para eliminar cualquier parámetro de interferencia, por ejemplo, temperatura, tampones, etc. que tienen influencia sobre el resultado. La muestra de la persona sana preferiblemente se medirá en paralelo como la "muestra negativa".

De forma ventajosa, como control positivo se mide la concentración de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en una muestra que comprende una concentración definida de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en paralelo a la determinación de la concentración de PIBF en la muestra del paciente. La medición en paralelo del control positivo permite controlar los resultados y detectar cualquier divergencia en el procedimiento.

Preferiblemente, la concentración de PIBF en la muestra se mide inmunológicamente, en particular por un ensayo competitivo, por un ensayo de tipo sándwich, por inmunotinción o combinaciones de estos procedimientos. Puede aplicarse cualquier procedimiento inmunológico conocido por los especialistas en la técnica. Los procedimientos inmunológicos son procedimientos altamente sensibles para detectar moléculas y por lo tanto son particularmente ventajosos para medir la concentración de PIBF en la muestra. Para realizar el procedimiento inmunológico es necesario tener al menos un anticuerpo anti-PIBF que se unirá específicamente a PIBF, derivados del mismo o fragmentos del mismo. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser adicionalmente recombinante. Además, pueden usarse anticuerpos monoclonales humanizados o monoclonales de cadena sencilla codificados por fagos.

Los ejemplos de anticuerpos monoclonales recombinantes anti-PIBF humano que pueden usarse como se ha descrito anteriormente están depositados en el banco de células de hibridoma en la University Medical School of Pécs, Departamento de Inmunología y Biotecnología, Hungría, con los Nº de depósito 11 a 14/2001, códigos de línea celular HYB 255-258.

"Anticuerpos de cadena sencilla" se definen estructuralmente como que comprenden la parte de unión de un primer polipéptido de la región variable de un anticuerpo, asociada con la parte de unión de un segundo polipéptido de la región variable de un anticuerpo, estando los dos polipéptidos unidos por un engarce peptídico que une el primero y el segundo polipéptidos en una cadena polipeptídica única. La cadena polipeptídica única por tanto comprende un par de regiones variables conectadas por un engarce polipeptídico. Las regiones pueden asociarse para formar un sitio de unión a antígeno funcional, como en el caso en el que las regiones comprenden un par de regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada con regiones determinantes de complementariedad (CDR) apropiadamente emparejadas.

La expresión "anticuerpo humanizado" como se usa en este documento se refiere a moléculas de anticuerpo en las que los aminoácidos se han reemplazado en los reactivos de unión a antígeno conocidos para parecerse más estrechamente a un anticuerpo humano y manteniendo aún la capacidad de unión original.

Los anticuerpos pueden generarse usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Dichos anticuerpos pueden incluir, aunque sin limitación, policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena sencilla, fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos que inhiben la formación de dímeros) son especialmente preferidos para uso terapéutico.

Para la producción de anticuerpos, pueden inmunizarse diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas, ratones, pollos (Yab), seres humaos, y otros, por inyección con la proteína PIBF natural o recombinante o cualquier fragmento u oligopéptido del mismo que tenga propiedades inmunogénicas o un ADN de PIBF (fragmento). Dependiendo de la especie del huésped, pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, aluminio, policationes (por ejemplo, poliArg), péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol. Entre los adyuvantes usados en seres humanos, son especialmente preferibles BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.

Se prefiere que los péptidos, fragmentos, u oligopéptidos usados para inducir anticuerpos contra PIB tengan una secuencia de aminoácidos constituida por al menos cinco aminoácidos, y más preferiblemente al menos 10 aminoácidos. También es preferible que sean idénticos a una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural. Pueden fusionarse cortas extensiones de aminoácidos de PIBF con los de otra proteína tal como hemocianina de lapa californiana y se producirán anticuerpos contra la molécula quimérica.

Los anticuerpos monoclonales contra PIBF pueden prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, aunque sin limitación, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma de EBV.

Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con la especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas. Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla pueden adaptarse, usando procedimientos conocidos en la técnica, para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de PIBF. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, pueden generarse por arrastre de cadena a partir de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulina.

Los anticuerpos también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o explorando bibliotecas recombinantes de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión altamente específica.

También pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específicos para PIBF. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Pueden usarse diversos inmunoensayos para la exploración para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para ensayos de unión competitiva e inmunorradiométricos usando anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas. Dichos inmunoensayos típicamente implican la medición de la formación de complejos entre PIBF y su anticuerpo específico. Se prefiere un inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales, de dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes de PIBF no interferentes, pero también puede emplearse un ensayo de unión competitiva.

En una forma preferida, la concentración de PIBF en la muestra se mide por un ensayo competitivo. De acuerdo con este procedimiento, se cubre una fase sólida con PIBF humano preferiblemente recombinante (o sus variantes) a una concentración específica. Se añaden anticuerpos anti-PIBF junto con los ejemplos a medir. Cuanto mayor es la concentración de PIBF en la muestra menor es el valor detectado correspondiente. En base a estas lecturas, se puede determinar la concentración absoluta del PIBF. Éste es un procedimiento particularmente preciso especialmente cuando la muestra es un fluido corporal y puede realizarse por ejemplo con un ELISA.

De acuerdo con una realización preferida adicional de la invención, se mide la concentración de PIBF en una muestra por un ensayo de tipo sándwich. Para este ensayo es necesario tener dos anticuerpos anti-PIBF que se unen cada uno a un epítope diferente de la molécula de PIBF. El primer anticuerpo anti-PIBF se inmoviliza preferiblemente en un soporte sólido después de lo cual se añade la muestra que se tiene que medir de modo que el PIBF presente en la muestra se une al primer anticuerpo anti-PIBF. Se añade un segundo anticuerpo anti-PIBF que está preferiblemente marcado de modo que se une al PIBF unido. La cantidad del segundo anticuerpo anti-PIBF unido se mide y se usa como indicio de la concentración absoluta del PIBF en la muestra. Este procedimiento también se usa preferiblemente cuando la muestra a medir es un fluido corporal del paciente y se puede realizar por ELISA.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, la concentración de PIBF en una muestra se mide por inmunotinción. Este procedimiento se usa preferiblemente cundo la muestra que se tiene que medir es una muestra tisular del paciente. De acuerdo con este procedimiento, se añade directamente anticuerpo anti-PIBF a la muestra tisular del paciente donde se une a PIBF presente en la muestra tisular. El anticuerpo unido se cuantifica allí indicando directamente la concentración de PIBF en la muestra tisular. Este procedimiento permite la localización de PIBF en una muestra.

Preferiblemente, la concentración de PIBF se mide indirectamente midiendo la concentración de ARNm de PIBF en la muestra. Para esto pueden usarse polinucleótidos, incluyendo secuencias oligonucleotídicas, moléculas de ARN o ADN antisentido, y PNA. Los polinucleótidos pueden usarse para detectar y cuantificar la expresión génica en muestras en las que la expresión de PIBF se correlacionará con un tumor. Por consiguiente, puede proporcionarse un kit que comprende un reactivo que comprende los polinucleótidos mencionados anteriormente (marcados) para realizar la medición de ARNm de PIBF en la muestra dada. De nuevo aquí es preferible medir adicionalmente la concentración de ARNm procesado de forma alternativa. Además, la presencia o ausencia de una molécula de ARNm específica puede dar información con respecto a si las células son o no son células tumorales.

En un aspecto, puede usarse la hibridación con sondas nucleotídicas para identificar secuencias de ARNm de PIBF. Las secuencias nucleotídicas complementarias al ARNm de PIBF pueden marcarse por procedimientos convencionales, y añadirse a una muestra de fluido o tisular de un paciente en condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación adecuado, la muestra se lava y se cuantifica y compara la señal con el valor umbral.

La especificidad de la sonda, esté hecha a partir de una región altamente específica o una región menos específica y la rigurosidad de la sonda (máxima, alta, intermedia, o baja) determinarán si la sonda identifica solamente secuencias de origen natural que codifican PIBF, alelos, o secuencias relacionadas.

Las sondas que se usan para la hibridación de secuencias de ARNm de PIBF (relacionadas) deben mostrar preferiblemente al menos el 50%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 90%, de homología con la secuencia que codifica PIBF o fragmentos de la misma. Las sondas de hibridación de la presente invención pueden ser ADN o ARN y obtenerse de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 ó 5 (ADNc de PIBF).

Los ejemplos de dichas moléculas de ARNm de PIBF a detectar y/o cuantificar son, por ejemplo, las detectadas por ADN o ARN obtenido de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 y 37. Como se ha demostrado que los exones 17 y 18 están incluidos en casi todas las formas de ARNm que se han identificado, preferiblemente se usa ADN o ARN obtenido de una secuencia que codifica los exones 17 y 18 (véanse las figuras) para la detección y cuantificación de ARNm de PIBF en una muestra.

Las sondas de hibridación pueden marcarse por una diversidad de grupos informadores, por ejemplo, radionucleótidos tales como 32P o 35S, o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina unida a la sonda mediante sistemas de unión de avidina/biotina, y similares.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican PIBF pueden usarse adicionalmente en análisis de transferencia de northern, dot blot, u otras tecnologías basadas en membrana; en ensayos de varilla, pin, ELISA o (micro) chip utilizando fluidos o tejidos de biopsias de pacientes para detectar ARNm de PIBF. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica.

Además, el ARNm de PIBF puede detectarse y medirse por RT-PCR: En una primera etapa se transcribe el ARNm por la transcriptasa inversa en ADNc después de lo cual se detecta y cuantifica el ADNc por PCR. Los oligómeros para la PCR pueden sintetizarse químicamente, generarse enzimáticamente, o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros estarán preferiblemente constituidos por dos secuencias de nucleótidos, una con orientación con sentido y otra con orientación antisentido, empleadas en condiciones optimizadas para la identificación de la secuencia específica. Pueden emplearse los dos mismos oligómeros, conjuntos agrupados de oligómeros, o incluso una combinación degenerada de oligómeros en condiciones menos rigurosas para la detección y/o cuantificación de secuencias estrechamente relacionadas.

Una aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para determinar el progreso positivo o negativo de un tumor en un paciente que comprende diagnosticar un tumor en un paciente de acuerdo con uno de los procedimientos mencionados anteriormente de acuerdo con la presente invención y determinar si la concentración medida de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en la muestra está por encima o por debajo de al menos una concentración medida previamente de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en al menos una muestra previamente tomada del mismo paciente, por lo que la concentración por encima de la concentración previamente medida identifica un progreso positivo. Como la concentración de PIBF en una muestra es directamente proporcional al progreso del tumor, por ejemplo, tamaño, desarrollo, etc., el procedimiento de acuerdo con la presente invención permite analizar directamente el transcurso de la enfermedad. Para una caracterización completa del progreso del tumor es, por supuesto, ventajoso tomar muchas muestras durante un periodo de tiempo en particular antes y después de un tratamiento específico, por ejemplo, con una sustancia o retirando un tejido tumoral completa o parcialmente, en cuyo caso puede analizarse la eficacia del tratamiento específico. La expresión "progreso positivo" usada en este documento significa que el tumor se está desarrollando adicionalmente.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo en un procedimiento descrito anteriormente de acuerdo con la presente invención. Como se ha mencionado anteriormente, el anticuerpo anti-PIBF puede ser monoclonal, policlonal, puede adicionalmente ser un anticuerpo de cadena sencilla recombinante, humanizado o codificado en fagos. Si se usa solamente un fragmento del anticuerpo, este fragmento comprende el epítope del anticuerpo anti-PIBF que reconoce el PIBF.

Se prefiere usar un anticuerpo monoclonal para conseguir un resultado más específico y preciso. El anticuerpo monoclonal puede producirse como se ha mencionado anteriormente, y los ejemplos dados anteriormente también se aplican en este caso.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en uno de los procedimientos mencionados anteriormente de acuerdo con la presente invención. Como ya se ha mencionado anteriormente, el fragmento puede ser un fragmento del PIBF o un fragmento del derivado de PIBF. Aquí, se aplican las mismas definiciones y realizaciones o ejemplos preferidos que se han mencionado anteriormente.

Preferiblemente, el PIBF es recombinante, que significa que también el derivado o el fragmento puede ser recombinante.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un kit que comprende un primer reactivo que comprende al menos un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo y un segundo reactivo que comprende PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo a una concentración definida. Por supuesto, el anticuerpo anti-PBF y el PIBF están presentes en una forma que permite su almacenamiento, por ejemplo, en forma seca, liofilizada, congelada o disuelta. Además, el kit puede comprender cualquier tampón, enzima, sal etc. adicional, que son necesarios para el procedimiento mencionado anteriormente a realizar.

Preferiblemente, el kit comprende una fase sólida a la que se une al menos un anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo o el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento del mismo. La fase sólida puede ser cualquier fase sólida conocida para los especialistas en la técnica, por ejemplo, cualquier material insoluble que pueda proporcionar un sustrato sobre el que inmovilizar proteínas o péptidos, por ejemplo, en forma de una tira seca. Dichos sustratos pueden incluir nylon, aminoácidos, vidrio, celulosa o similares. Este kit puede usarse preferiblemente para un ensayo competitivo o de tipo sándwich por lo que se añaden a la fase sólida el reactivo adicional que comprende el anticuerpo o el PIBF, dependiendo del que se inmovilice en la fase sólida, y la muestra.

Preferiblemente, el PIBF presente en el kit mencionado anteriormente es recombinante lo que significa que, por supuesto, también el derivado del mismo y el fragmento del mismo, respectivamente, son recombinantes.

Un kit preferido comprende un reactivo adicional que comprende un segundo anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo que se une a un epítope del PIBF que es distinto del epítope reconocido por el primer anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo. Este kit es particularmente ventajoso para realizar un ensayo tipo sándwich.

El kit mencionado anteriormente de acuerdo con la presente invención es preferiblemente para diagnosticar un tumor en un paciente y para determinar el progreso de un tumor en un paciente, respectivamente. Los procedimientos son iguales a los descritos anteriormente, por lo que se usa el reactivo que comprende el PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo a la concentración definida como control positivo como se ha descrito anteriormente o para realizar un ensayo competitivo como se ha descrito anteriormente (por lo que se usa en competición con el PIBF presente en la muestra del paciente) o ambos.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo para la preparación de una medicina anti-tumoral. El anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo bloquea específicamente o neutraliza PIBF, por lo que se elimina específicamente la actividad PIBF en tumores volviendo de este modo al tumor susceptible a NK (y potencialmente la lisis mediada por células CD8+ y otras células T). Además, anticuerpos mono y biespecíficos pueden reconocer específicamente PIBF en una superficie de las células tumorales y pueden usarse para suministrar sustancias tóxicas a los compartimientos tumorales del cuerpo del paciente. La estrategia principal de la medicina anti-tumoral es el uso del conocimiento de que las células tumorales producen concentraciones más elevadas de PIBF. Con esta información que es la base de la presente invención, pueden desarrollarse diversas estrategias para combatir un tumor en un paciente.

De acuerdo con una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, humanizado, y de cadena sencilla, respectivamente. Los anticuerpos depositados mencionados anteriormente también pueden usarse para este aspecto de la presente invención.

Preferiblemente, el anticuerpo tiene unido al mismo una molécula. En este caso, el anticuerpo anti-PIBF se usa como un mecanismo de dirección o suministro para llevar una molécula, por ejemplo, un agente farmacéutico, a células o tejidos que expresan PIBF. El anticuerpo que se administra al paciente se une al tumor que expresa PIBF y por lo tanto pone la molécula que es tóxica para el tumor en contacto directo con el tumor. Hay diversos procedimientos y moléculas se que usan que son conocidos para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, puede usarse una molécula tóxica que entrará en las células tumorales e impedirá por ejemplo las etapas metabólicas esenciales eliminando de este modo las células. Además, la molécula tóxica puede inducir la lisis celular o actuar como un receptor para otras sustancias tóxicas o enzimas que eliminarán las células tumorales. Sin embargo, independientemente del modo en que funcione la molécula tóxica, el punto principal es que la molécula se dirige específicamente a las células tumorales por el anticuerpo anti-PIBF y no interfiere con células sanas.

La molécula preferiblemente puede ser una sustancia tóxica y un profármaco, respectivamente, en particular un radionúclido, una toxina y un fármaco quimioterapéutico, respectivamente. Suministrando la sustancia a los tumores diana se consigue una medicina anti-tumoral eficaz.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo para la preparación de una medicina anti-tumoral. Hay dos estrategias para estas medicinas anti-tumorales de acuerdo con la presente invención:

- Se usa un derivado de PIBF o un fragmento del mismo como proteína o péptido inhibidor que impide la acción de PIBF a través de la unión y por lo tanto el bloqueo o la inactivación de receptores putativos para PIBF presentes en las células, por ejemplo, células NK, o inhibe los componentes de señalización aguas debajo de la unión al receptor.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la medicina es una vacuna. El derivado de PIBF o el fragmento del mismo comprende el péptido inmunogénico de PIBF y puede usarse para la vacunación para inducir respuestas de células T citotóxicas anti-tumorales específicas de antígeno y/o para estimular la producción de anticuerpos neutralizantes por el sistema inmune del propio paciente con cáncer que liberaría las células NK a partir de la supresión por PIBF.

Preferiblemente, la vacuna comprende un adyuvante. Dicho adyuvante puede ser, aunque sin limitación, por ejemplo geles minerales de Freund tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, policationes (por ejemplo, poliArg), péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol. Entre los adyuvantes preferiblemente usados en seres humanos están BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento del mismo es una molécula recombinante o sintetizada químicamente, respectivamente.

Un aspecto ventajoso de la presente invención se refiere al uso de un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o molécula antisentido de PIBF para la preparación de una medicina anti-tumoral. En el alcance de la presente solicitud la expresión "polinucleótido que codifica PIBF" o "secuencias de nucleótidos complementarias a ARNm de PIBF" se refiere a una secuencia derivada de una secuencia preferiblemente seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37 o fragmentos o derivados de las mismas.

Los genes que codifican PIBF pueden apagarse transformando una célula o tejido con vectores de expresión que expresan elevados niveles de un polinucleótido o un derivado del mismo o un fragmento del mismo que codifica PIBF. Dichas construcciones pueden usarse para introducir secuencias con sentido o antisentido traducibles en una célula. Incluso en ausencia de integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar transcribiendo moléculas de ARN hasta que se inutilicen por endonucleasas endógenas. La expresión transitoria puede durar mes o más con un vector no replicante e incluso más tiempo si los elementos de replicación apropiados son parte del sistema de vector.

Pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando moléculas, ADN, ARN, o PNA antisentido a las regiones de control del gen que codifica PIBF, es decir, los promotores, potenciadores, e intrones. Se prefieren oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De forma similar, la inhibición puede conseguirse usando metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil porque causa la inhibición de la capacidad de que la doble hélice se abra lo suficiente para la unión de las polimerasas, factores de transcripción, o moléculas reguladoras. Las moléculas antisentido también pueden diseñarse para bloquear la traducción del ARNm evitando que el transcrito se una a los ribosomas.

El término "antisentido" como se usa en este documento se refiere a secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. Las moléculas antisentido pueden producirse por cualquier procedimiento incluyendo síntesis por ligamiento del gen o genes de interés en una orientación inversa a un promotor viral que permite la síntesis de una cadena complementaria. Una vez introducida en una célula esta cadena transcrita se combina con las secuencias naturales producidas por la célula para formar dúplex. Estos dúplex después bloquean la transcripción o traducción adicional.

En un aspecto, las moléculas antisentido para el polinucleótido que codifica PIBF pueden usarse en situaciones en las que sería deseable bloquear la transcripción del ARNm. En particular, las células pueden transformarse con secuencias complementarias a polinucleótidos que codifican PIBF. Por tanto, pueden usarse moléculas antisentido para modular la actividad PIBF, o para conseguir la regulación de la función génica. Dicha tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y pueden diseñarse oligómeros o fragmentos más grandes con sentido o antisentido a partir de diversas localizaciones a lo largo de las regiones codificantes o de control de secuencias que codifican PIBF.

Los vectores de expresión derivados de retrovirus, adenovirus, herpes virus o virus vaccinia, o de diversos plásmidos bacterianos pueden usarse para suministrar secuencias de nucleótidos al órgano, tejido o población celular tumoral diana. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos para los especialistas en la técnica para construir vectores recombinantes que expresarán moléculas antisentido complementarias a los polinucleótidos del gen que codifica PIBF.

También pueden usarse ribozimas, moléculas de ARN enzimático, para catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de la acción de las ribozimas implica hibridación específica de secuencia de la molécula ribozima al ARN diana complementario, seguido por escisión proteolítica. Los ejemplos que pueden usarse incluyen moléculas de ribozima con motivo de cabeza de martillo modificadas que pueden catalizar específica y eficazmente la escisión endonucleotídica de secuencias que codifican PIBF.

Los sitios de escisión específicos de ribozima en cualquier ARN diana potencial se identifican inicialmente por exploración de la molécula diana para los sitios de escisión por ribozimas que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificados, pueden evaluarse cortas secuencias de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión para características de estructura secundaria que pueden volver al oligonucleótido inoperativo. Lo adecuado de las dianas candidatas también puede evaluarse ensayando la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasas.

Las moléculas antisentido y ribozimas de la invención pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Estas incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos tales como síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN por transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican PIBF. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia diversidad de vectores con promotores para la ARN polimerasa adecuados tales como T7 o SP6. Como alternativa, estas construcciones de ADNc que sintetizan ARN antisentido de forma constitutiva o inducible pueden introducirse en líneas celulares, células, o tejidos.

Pueden modificarse moléculas de ARN para aumentar la estabilidad intracelular o semi-vida. Las posibles modificaciones incluyen, aunque sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato o 2'O-metilo en lugar de enlaces con fosfodiesterasa en la estructura de la molécula. Este concepto es inherente en la producción de PNA y puede extenderse en todas estas moléculas por la inclusión de bases no tradicionales tales como inopina, queosina, y wybutosina, así como formas modificadas con acetilo, metilo, tio, y de forma similar, de adenina, citidina, guanina, timina, y uridina que no se reconocen tan fácilmente por las endonucleasas endógenas.

Están disponibles muchos procedimientos para introducir vectores en células o tejidos y son igual de adecuadas para su uso in vivo, in vitro, y ex vivo. Para terapia ex vivo, pueden introducirse vectores en células madre tomadas del paciente y propagarse clonalmente para el transplante autólogo de nuevo en el mismo paciente (transplante de células madre alogénicas). El suministro por transfección y por inyecciones de liposomas puede conseguirse usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica.

Puede aplicarse cualquier medicina anti-tumoral descrita anteriormente para cualquier sujeto adecuado incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y más preferiblemente, seres humanos.

Un aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para tratar a un paciente con un tumor, comprendiendo dicho procedimiento administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo.

En dos publicaciones (Szekeres-Bartho y col., Am. J. Reprod. Immuno. 24, 105, 1990; Szekeres-Bartho y col., Cell. Immunol. 177, 194, 1997) se demostró que la adición de un anticuerpo anti-PIBF neutralizante impide un resultado de embarazo exitoso en ratones. Además, PIBF aislado de sobrenadantes de cultivo de linfocitos murinos tratados con progesterona cuando se inyectan in vivo, evitaba el efecto abortivo de los fármacos anti-progesterona. Estos datos sugieren que estos reactivos podrían actuar de un modo similar en pacientes con cáncer o enfermedades
autoinmunes.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un tumor en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad eficaz de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo.

Otro aspecto preferido de la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un tumor en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad eficaz de un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o molécula antisentido de PIBF.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para el tratamiento de un tumor en un paciente, comprendiendo dicha preparación un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo, PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo, y un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o molécula antisentido de PIBF, respectivamente. Por supuesto, de nuevo aquí, se aplican las mismas definiciones y realizaciones preferidas mencionadas anteriormente.

La preparación farmacéutica puede administrarse sola o en combinación con al menos un agente diferente tal como un compuesto estabilizante que puede administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril incluyendo aunque sin limitación solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Las preparaciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Las preparaciones farmacéuticas utilizadas para el procedimiento para el tratamiento de un tumor en un paciente pueden administrarse por cualquiera de varias vías incluyendo aunque sin limitación por un medio oral, intravenoso, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmico, subcutáneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópico, sublingual o rectal.

Además de los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Los vehículos posibilitan que las preparaciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere a una proteína recombinante con una actividad PIBF de acuerdo con la SEC ID Nº 1 y derivados de la misma. Esta proteína PIBF de acuerdo con la presente invención tiene actividad PIBF completa comparable con PIBF natural (que comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 2) pero no muestra los aminoácidos 595 a 614 exactos así como el aminoácido Nº 333 de acuerdo con la secuencia de PIBF natural (SEC ID Nº 2). La secuencia proteica de la proteína PIBF recombinante de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº 1) comprende 757 restos aminoacídicos. La presente invención, por lo tanto, proporciona nuevas proteínas PIBF recombinantes que tienen la secuencia de la SEC ID Nº 1 o derivados u homólogos de las mismas. Por lo tanto, la proteína recombinante con una actividad PIBF de acuerdo con la presente invención comprende

- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 1 o

- una secuencia de aminoácidos con una identidad de aminoácidos de al menos el 98% con la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A o

- una secuencia de aminoácidos de identidad de aminoácidos de al menos el 95% con la secuencia de los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A y

- una actividad PIBF de al menos el 50% de la molécula de PIBF humana natural.

La actividad PIBF puede definirse y cuantificarse como inhibición de NK o CTL. La inhibición de NK se considera cuando en presencia de PIBF las demás células efectoras eficaces (ensayadas en ausencia de PIBF) se paralizan, es decir el reconocimiento y unión (conjugación) o eliminación de las células diana, se reduce como una función de la concentración de PIBF. La actividad puede expresarse como porcentaje de inhibición/\mug de PIBF o sustancias similares en comparación con la ausencia de PIBF. Esta similitud se aplica a la actividad inhibidora de CTL (Szekeres-Bartho y col., Cell. Immunol. 177 (1997), 194-199), Szekeres-Bartho y col., Am. J. Reprod. Immunol. 24, 105, (1990)). Además, la actividad PIBF puede definirse y cuantificarse como potenciación de Th2 que se mide cuantificando las linfoquinas Th2 (IL-3, IL-4, IL-6, IL-10) frente a Th1 (IL-12, IFN-\gamma), a nivel proteína o a nivel ARNm, y después tomando la proporción de las señales Th2 frente a Th1. Un aumento en las citoquinas Th2 y una disminución concomitante en las citoquinas Th1 indican una potenciación de Th2. Puede expresarse como un aumento en el porcentaje de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) positivas a citoquinas Th2 o una disminución en el porcentaje de las positivas a citoquinas Th1/\mug de PIBF. También es apropiado medir las cantidades absolutas de estas citoquinas (de acuerdo con procedimientos convencionales de la bibliografía) secretadas en el sobrenadante de cultivo o en fluidos corporales como una función de la concentración de PIBF. Los ARNm de citoquinas pueden medirse por ensayos basados en RT-PCR cuantitativa convencional, Szekeres-Bartho y col., AJRI 35 (1996), 348-351, Szekeres-Bartho y col., Am. J. Reprod. Immunol. 23, 26, (1990), Szekeres-Bartho y col., Am. J. Ob. Gyn. 163, 1320,
(1990).

A pesar de las diferencias significativas en la secuencia de aminoácidos de la proteína PIBF de acuerdo con la presente invención en comparación con la secuencia de PIBF humana natural es posible producir una proteína recombinante con una secuencia definida anteriormente (SEC ID Nº 1) mostrando dicha proteína recombinante similitudes funcionales particularmente elevadas con la proteína natural.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención la proteína recombinante comprende una secuencia de aminoácidos dada a partir de los restos aminoacídicos 300 a 350 en la SEC ID Nº 1. El aminoácido Nº 333 en la proteína PIBF humana natural (SEC ID Nº 2) es Cys en lugar de Arg en la proteína PIBF recombinante de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº 1). Por lo tanto, la proteína recombinante de acuerdo con la presente invención comprende preferiblemente una Arg como aminoácido Nº 333 de acuerdo con la SEC ID Nº 1 y una actividad PIBF considerable (>50%). Sin embargo, puede comprender en uno o ambos extremos restos aminoacídicos adicionales que son idénticos a, homólogos a o diferentes de los restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1 siempre que la proteína recombinante muestre una actividad PIBF de al menos el 50% de la molécula PIBF humana natural.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención la proteína recombinante comprende una secuencia de aminoácidos dada a partir de los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1 y una actividad PIBF considerable (>50%). Esta proteína recombinante, por lo tanto, comprende la secuencia del PIBF de la invención entre los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1. Puede comprender adicionalmente en uno o ambos extremos restos aminoacídicos adicionales que son idénticos a, homólogos a o diferentes de los restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1 siempre que la proteína recombinante muestre una actividad PIBF de al menos el 50% de una molécula de PIBF humana natural.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una proteína con actividad PIBF que comprende

- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 4 o

- un aminoácido con una identidad de aminoácido de al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente el 99%, con la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 4 como se determina por el algoritmo FAST/A

Esta proteína ha demostrado ser una proteína de 89 kDa con una actividad PIBF aislada de un ratón. Esta secuencia de aminoácidos es particularmente ventajosa con respecto a aspectos para detectar, diagnosticar y analizar tumores, sustancias anti-tumorales, sustancias carcinogénicas en ratones pero también otros animales de laboratorio. Además, con la ayuda de esta proteína de la invención se pueden realizar ensayos en animales, por ejemplo, ratones, cobayas, hámster, ratas, con una predisposición a un tumor. Otro aspecto se refiere a animales, en particular ratones, en los que esta proteína está inhibida o está bloqueada su actividad. Esto puede realizarse, por ejemplo, proporcionando análogos de patrones de unión de esta proteína.

Un aspecto preferido de la presente invención se refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% como se determina por el algoritmo FAST/A con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 y 36, siendo dicha proteína una proteína PIBF procesada de forma alternativa. Se ha demostrado que las moléculas de ARNm procesadas de forma alternativa están presentes en diferentes tejidos y por lo tanto expresan también proteínas procesadas de forma alternativa. Sorprendentemente, estas proteínas procesadas de forma alternativa están presentes en tejidos tumorales a otra concentración en comparación con tejidos sanos. Esto puede usarse ventajosamente para detectar y analizar tumores en una muestra por lo que se prefieren particularmente las SEC ID Nº 6 y 8 ya que éstas son dos formas de PIBF más pequeñas encontradas en tumores primarios humanos, la SEC ID Nº 6 en adenocarcinoma gástrico y la SEC ID Nº 8 en adenocarcinoma endometrial. Los equivalentes tisulares normales de los mismos pacientes no expresaban niveles detectables de estas variantes de corte y empalme de ARNm de PIBF. Sin embargo, también se ha demostrado que los exones 17 y 18 están incluidos en casi todas las formas identificadas. Por lo tanto, los péptidos que comprenden estos exones son particularmente ventajosos. La expresión "proteínas PIBF con corte y empalme alternativo" se refiere a proteínas que se obtienen de proteínas con actividad PIBF.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la proteína recombinante descrita anteriormente con una actividad PIBF de acuerdo con la presente invención. Por supuesto, adicionalmente es posible que la molécula de ácido nucleico comprenda una secuencia adicional que codifica al menos una segunda proteína diferente a la proteína PIBF, proporcionando de este modo una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende al menos en una parte un péptido con actividad PIBF.

Con respecto a la molécula de ácido nucleico de ratón, por ejemplo, la SEC ID Nº 5 o un fragmento de la misma, se usa preferiblemente para producir ratones knock out, por ejemplo, ratones en los que la expresión del gen de PIBF o un fragmento del mismo está bloqueado o inhibido. Por ejemplo, esto se realizará proporcionando un ácido nucleico de PIBF de ratón antisentido o fragmento del mismo, que es una estrategia que se ha descrito anteriormente. Otro aspecto de la presente invención, por lo tanto, se refiere a ratones knock out que muestran una expresión inhibida o reducida de la proteína PIBF activa.

Preferiblemente, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PIBF procesada de forma alternativa que comprende una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% con una secuencia elegida entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 y 37 o

- una secuencia que híbrida en condiciones rigurosas con una de las secuencias anteriores o

- una secuencia que está degenerada debido al código genético, de una de las secuencias anteriores.

Éstas son secuencias de ácido nucleico que corresponden a moléculas de ARNm con corte y empalme alternativo encontradas en diversos tejidos por lo que particularmente la SEC ID Nº 7 y la SEC ID Nº 9 se refieren a moléculas de ARNm con corte y empalme alternativo que se encontraron solamente en tejidos tumorales, sin embargo, los tejidos normales no comprendían estas secuencias de ARNm. Por lo tanto, particularmente éstas son ventajosas cuando se detectan o analizan tumores así como células y tejidos sanos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención.

Cuando se introduce el vector mencionado anteriormente de acuerdo con la presente invención en un ARNm huésped adecuado, se produce una cadena de ARN que proporciona la traducción de la proteína recombinante con actividad PIBF de acuerdo con la presente invención o una proteína de la invención.

El elemento regulador puede ser cualquier elemento adecuado conocido para los especialistas en la técnica, en particular, un promotor específico que se elige de acuerdo con el huésped específico en el que tiene que introducirse el vector para conseguir una producción máxima de proteína recombinante. El elemento regulador puede comprender adicionalmente potenciadores que potencian la transcripción.

Preferiblemente, el vector de ácido nucleico comprende adicionalmente un marcador de selección. El marcador de selección puede ser cualquier marcador adecuado que es bien conocido para los especialistas en la técnica para seleccionar células u organismos huésped en los que se ha introducido el vector. Dichos marcadores de selección pueden ser, por ejemplo, cualquier gen que codifique una proteína que confiere resistencia a antibióticos, o un gen que codifique una proteína necesaria para el metabolismo celular, por lo que las células u organismos huésped en los que tiene que introducirse el vector mencionado anteriormente muestra una deficiencia para esta proteína. El marcador de selección puede ser adicionalmente cualquier gen que cambiará el fenotipo de la célula u organismo huésped que ha captado el vector mencionado anteriormente, por ejemplo, el color.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una célula que comprende el vector mencionado anteriormente de acuerdo con la presente solicitud. El vector puede integrarse en el genoma de la célula o también estar presente como ADN exógeno en el citoplasma siempre que se proporcione la transcripción de la molécula de ácido nucleico complementaria. En el alcance de la presente invención, el término "célula" comprende cualquier célula procariota o eucariota. Estas células se usarán preferiblemente para producir proteínas recombinantes con actividad PIBF de acuerdo con la presente invención. Estas proteínas recombinantes producidas pueden aislarse y purificarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica y usarse adicionalmente, por ejemplo, para la producción de preparaciones farmacéuticas que comprenden proteínas recombinantes con actividad PIBF de acuerdo con la presente invención.

La invención se describirá con mayor detalle por los siguientes ejemplos y figuras pero por supuesto la invención no se limita a los mismos.

La Figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de PIBF recombínate y de ratón (natural).

La Figura 2 muestra una representación esquemática de los exones e intrones de la región del gen de PIBF en el cromosoma 13.

La Figura 3 muestra una transferencia de northern para la detección de ARNm de PIBF en diferentes tejidos.

La Figura 4 muestra el análisis inmunohistoquímico de tumores primarios humanos.

Las Figuras 5A-5D muestran la influencia del tratamiento anti-PIBF en la eliminación dirigida por células NK de células tumorales.

Las Figuras 6A-6C muestran el efecto del PIBF recombinante sobre la expresión de IL-10 e IL-12 de linfocitos en estado sin embarazado.

La Figura 7 muestra los niveles de PIBF en muestras de orina de pacientes con tumores que no son adenocarcinoma y tumores que no son sólidos.

La Figura 8 muestra la detección de niveles elevados de PIBF con la ayuda de anticuerpos monoclonales y policlonales.

La Figura 9 muestra la normalización de los niveles de PIBF después de cirugía o quimioterapia.

La Figura 10 muestra los diferentes ARNm de PIBF sobreexpresados en tumores primarios humanos.

La Figura 11 muestra la unión de PIBF a PBC humanas.

La Figura 12 muestra ARNm de PIBF con corte y empalme alternativo.

La Figura 1 muestra el alineamiento de PIBF recombinante (humano) y de ratón (natural), siendo A la secuencia recombinante, B la secuencia de ratón IC (clonada a partir de una biblioteca de testículo de ratón), siendo C EST de ratón, en trozos juntos de bibliotecas de dEST en base a las secuencias humanas, y siendo D la secuencia bovina. X representa la secuencia de señal de acuerdo con el procedimiento de predicción de PSG, y la secuencia de señal de acuerdo con la predicción de GvH, z la señal de retención de membrana ER, w el motivo de unión a ADN con patrón de cremallera de leucina, v la señal de dirección peroxisomal, y u la señal de localización nuclear.

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El gen de PIBF está localizado en el cromosoma 13. Hay varios intrones presentes en el gen de PIBF (véase la Figura 2), por lo que en el intrón 2 hay múltiples copias del elemento de repetición Alu que sirve como un sitio para el corte y empalme alternativo. Se muestra un hueco entre los contig genómicos.

La Figura 3 muestra una transferencia de northern para la detección de ARNm de PIBF en diversos tejidos normales: estómago (A), glándula tiroides (B), médula espinal (C), ganglio linfático (D), tráquea (E), glándula suprarrenal (F), médula ósea (G), bazo (H), timo (I), próstata (J), testículo (K), útero (L), intestino delgado (M), colon (N), PBL (O), corazón (P), cerebro (Q), placenta (R), pulmón (S), hígado (T), músculo esquelético (U), riñón (V), páncreas (W). Las flechas de la Figura 4 indican 3 diferentes formas de ARNm.

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Ejemplo 1 Entradas de EST que coinciden con la secuencia de PIBF humana

Se buscaron entradas de EST en bibliotecas de ADNc humano que coincidieran con la secuencia de PIBF humana. Se encontraron 43 entradas que tienen secuencias de PIBF entre 2,2 millones de dEST depositadas en 3776 bibliotecas de ADNc humano. Estas 43 entradas pertenecen a 27 bibliotecas diferentes. De las 27 bibliotecas 7 (25%) están originadas de tejidos normales (adulta sin tumores, no embarazada). Es importante observar que, el testículo, que es un tejido inmunoprivilegiado, frecuentemente indica la presencia de ARNm de PIBF. De las 27 bibliotecas 13 contienen ARNm expresado en tejidos tumorales (\sim50%). El resto es de tejido fetal o embarazo. Esto muestra que PIBF se expresa preferentemente durante el desarrollo, el embarazo y enfermedad. Sin embargo, la cantidad de EST coincidentes puede correlacionarse con la abundancia de ARNm pero depende enormemente de la calidad de la biblioteca. Por esa razón no se puede tomar como una medición del nivel de expresión directamente (véase la tabla I).

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TABLA I

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1

2

Ejemplo 2 Determinación de la concentración de PIBF en muestras de orina de pacientes con cáncer

Se estableció un ensayo basado en ELISA competitivo para medir PIBF en la orina de pacientes con cáncer. Se revistieron las placas de ELISA con PIBF humano recombinante a una concentración de 2 \mug/ml. Se añadió IgG policlonal anti-PIBF marcado con biotina junto con las muestras a determinar para el contenido de PIBF. Cuanto mayor es la concentración de PIBF en la muestra, menor es el valor de ELISA correspondiente. En base a estas lecturas de ELISA se puede determinar la concentración absoluta de PIBF.

Se recogieron muestras de orina de pacientes con cáncer, y se usaron recientes o congeladas poco después de la recogida y almacenadas a -20ºC hasta el análisis. Se determinó previamente que los niveles de PIBF en el suero son significativamente mayores en mujeres embarazadas sanas con relación a niveles sin embarazo o embarazo patológico. Para validar el ensayo de PIBF en orina de pacientes con cáncer, las muestras de orina de mujeres embarazadas sanas e individuos no embarazados sanos normales sirvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. Los resultados se resumen en la Tabla II. Los individuos normales (sanos, no embarazados) tienen concentraciones bajas de PIBF en la orina (5 ng/ml). La orina de mujeres embarazadas se caracterizó por un promedio de concentración de 110 ng/ml de PIBF. Es importante observar que los elevados niveles de PIBF vuelven rápidamente a la normalidad después del aborto o parto. El análisis de muestras de orina de 65 pacientes con tumor mostró claramente que pacientes que tienen tumor tenían una cantidad significativamente mayor de PIBF en su orina, que individuos no embarazados sanos, que varía de 5 a 180 ng/ml. Los pacientes con cáncer avanzado (tumor primario de gran tamaño y/o metástasis) parecieron tener valores mayores, ejemplificados por los datos sobre muestras de orina de pacientes con tumor pulmonar que tienen un promedio de concentración de 28 frente a 43 ng/ml con o sin metástasis, respectivamente.

Estos datos indican que la concentración de PIBF está relacionada con la masa tumoral, y la detección de PIBF en la orina puede usarse para controlar el progreso y las recidivas de la enfermedad. La elevación en la concentración de PIBF en la orina como consecuencia de la presencia de un tumor que produce PIBF es incluso más pronunciada, ya que no todos los tipos de tumores son positivos a PIBF (\sim70-80% de los tumores ensayados hasta ahora).

El tipo de tumor más dominante entre los pacientes era cáncer pulmonar con 23 casos. La mayoría de los pacientes con cáncer pulmonar tenían elevada concentración de PIBF. La ausencia de elevado PIBF en la orina podría correlacionarse con una patología clínica, concretamente después de la retirada del tumor primario y en la remisión las concentraciones de PIBF fueron significativamente inferiores o incluso normales.

TABLA II

3

Ejemplo 3 Detección de PIBF en tejidos tumorales

Después de la demostración de la expresión de PIBF por la línea celular MCF-7 (carcinoma del epitelio mamario humano), se investigó una serie de tumores primarios humanos para la expresión de PIBF. Llegó a ser obvio que PIBF aparece en el sobrenadante de cultivo de células MCF7, lo que sugiere que esta proteína se expresa y secreta de forma similar a lo que se encontró con linfocitos en estado de embarazo o activados en cultivo. De acuerdo con el análisis proteómico, los anticuerpos anti-PIBF reconocen proteínas con dos tamaños diferentes en el lisado celular por análisis de Western en 2D. Una mancha de 34-kDa probablemente se corresponde a la forma secretada. Se detecta otro doblete principal de 60-62 kDa, que podría se la forma de PIBF principal asociada a las células.

Se analizó una diversidad de tumores primarios humanos fijados con formalina ex vivo por inmunohistología usando anti-suero policlonal de conejo generado por inmunización con PIBF natural humano (34-kDa) o PIBF recombinante (89-kDa). Los resultados muestran que muchos tipos de tumores ensayados expresan PIBF o sustancias relacionadas con PIBF, por ejemplo moléculas de PIBF de diferentes longitudes, moléculas de PIBF de ARNm con corte y empalme diferente, moléculas truncadas, proteínas de fusión, etc. (Tabla III). De los 27 tumores 15 (55%) mostraron fuerte tinción positiva. La carencia de inmunotinción específica de los equivalentes de tejido normal demuestra que las células transformadas expresan PIBF diferencialmente (véase la Figura 4). En la Figura 4 columna izquierda, indicado "A", se muestra el tejido normal, en la derecha indicado "B", se muestran tejidos tumorales. En la primera fila (indicada "1") se muestra cáncer pulmonar (microcítico), en la segunda fila (indicada "2") carcinoma de vejiga (células transitorias), y en la fila "3" cáncer de estómago (adenocarcinoma). Estos datos también corroboran que PIBF es positivamente un resultado de expresión por las propias células tumorales, y no la unión de PIBF del fluido extracelular (secretado por linfocitos infiltrantes).

TABLA III

4

En base a los resultados mencionados anteriormente la producción de PIBF es un fenómeno bastante general del estado maligno o indiferenciado, y como consecuencia, PIBF puede servir como un marcador tumoral.

Ejemplo 4 Modulación de la actividad NK por la presencia de PIBF

Tomados todos los datos en conjunto sobre la importancia potencial de PIBF en la supresión de las respuesta anti-tumorales, es plausible que PIBF producido -secretado o expresado en la superficie celular- por células tumorales inhibirá la actividad celular de eliminación sistémica o localmente. Desde tiempo se ha sabido que hay líneas celulares que son buenas dianas en ensayos de NK, otras no. La línea celular tumoral humana, MCF-7 pertenece a la categoría de malas dianas. Ciertamente una posibilidad es que la baja actividad de eliminación contra estas células es el resultado de la producción de PIBF, que inhibe la actividad NK, ya que la línea celular MCF-7 ha demostrado producir PIBF. Para ensayar esta posibilidad, se usaron células MCF-7 que expresan PIBF como dianas en un ensayo de citotoxicidad celular sencillo de 4 horas, de acuerdo con Grimm y Bonavida "Frequency determination of killer cells by a single cell cytotoxic assay"; Methods Enzymol 93, 270 (1983). En la Figura 5 se muestra que el tratamiento anti-PIBF potencia la eliminación dirigida por células NK de células tumorales: El menos y el más indican el tratamiento con o sin IgG anti-PIBF, los números son el porcentaje de actividad NK para las Figuras 5A y 5B y el porcentaje de inhibición de actividad NK para las Figuras 5C y 5D. La fuente de células NK eran PBMC recién aisladas de individuos sanos. De hecho, el tratamiento de estas células tumorales con IgG anti-PIBF aumentó drásticamente su sensibilidad a la lisis mediada por NK, aproximadamente 8-10 veces (Figura 5A). La actividad de eliminación básica contra células MCF-7 es muy baja (1-2%), mientras que elevados valores (50-80%) puede medirse cuando se usan células K562 como células diana en ensayos paralelos. El mismo tratamiento anti-PIBF, que parece ser eficaz para aumentar la actividad diana de las células tumorales, sin embargo, no tuvo efecto sobre una línea celular no tumoral (McCoy, fibroblasto embrionario humano) (Figura 5B). Caracterizando miembros representativos (dianas buenas frente a malas) de ambos grupos, se puede hacer una correlación entre la expresión de PIBF y la actividad de células NK. Además, este ensayo permite ensayar la eficacia de PIBF exógeno para reducir la eliminación de células dirigida por PIBF, y más importante, para evaluar la potencia de anticuerpos neutralizantes anti-PIBF en la estimulación de la lisis de células tumorales PIBF+. Se generan anti-sueros neutralizantes de conejo anti-humano y también anti-ratón por lo que estos anticuerpos policlonales son capaces de inactivar PIBF natural in vitro (cultivos de linfocitos humanos en ensayo de NK) o in vivo (ratones preñados, como modelo animal). Por la adición de PIBF recombinante a células K562 (como dianas) y PBMC (como fuente de células NK), fue posible reducir la actividad de eliminación basal en un 60-70% (Figura 5C). Los anticuerpos generados contra PIBF recombinante retiraron esa inhibición sobre la actividad de eliminación casi completamente (Figura 5D).

Ejemplo 5 Modulación del equilibrio de citoquinas

Un mecanismo principal de la acción promotora del embarazo de PIBF es la inducción de las citoquinas T_{H2}. Ahora hay evidencias de que de que la forma recombinante de PIBF también es activa para modular la expresión de citoquinas por linfocitos de sangre periférica in vitro. Para ensayar la funcionalidad del PIBF humano recombinante que se expresó en E. coli y se purificó por la marca GST, se añadió rPIBF a linfocitos periféricos en estado sin embarazo aislados por gradiente de Ficoll-Paque y se cultivaron a 10^{6}/ml de densidad celular. La producción de la linfoquina T_{H2} prototipo, IL-10, se midió detectando y contando la cantidad de linfocitos positivos a IL-10 (por inmunohistoquímica en cytospins) después de 24 horas de tratamiento. El porcentaje de linfocitos positivos a IL-10 aumentó como función de la concentración de rPIBF de 0,35+/-0,15 a 3,5+/-1,5%. A la concentración más elevada de rPIBF (10 \mug/ml) 10x había presentes más linfocitos positivos a IL-10 que en cultivos de control (Figura 6A). Se observó el efecto opuesto en linfocitos que producen IL-12 (linfoquina T_{H1}) por el mismo tratamiento. La cantidad de linfocitos positivos a IL-12 disminuyó como función de la concentración de PIBF produciendo una reducción de aproximadamente 8 veces a la cantidad más elevada de PIBF. La neutralización del efecto de PIBF natural sobre la producción de citoquinas también fue exitosa. El tratamiento de linfocitos en estado de embarazo (que producen PIBF) con IgG anti-PIBF durante 3 horas produjo una disminución significativa en la cantidad de células positivas a IL-10 y un aumento significativo en la cantidad de células positivas a IL-12 (Figuras 6B y C). Estos resultados demuestran que la forma recombinante de PIBF es activa para inducir la expresión de citoquinas T_{H2}. Más importante, los anticuerpos neutralizantes pueden retirar PIBF activo producido por células in vivo y por consiguiente potenciar las citoquinas T_{H1}.

Ejemplo 6 Ensayo de diagnóstico

El valor diagnóstico de los niveles de PIBF en orina en malignidades se ejemplifica adicionalmente usando muestras de orina de pacientes con tumores que no son adenocarcinoma y tumores que nos son sólidos (Figura 7); los puntos representan resultados con sueros individuales. Se muestra las cantidades promedio. N significa número de
pacientes.

Ejemplos

Se caracterizan diferentes malignidades hematológicas, especialmente linfomas (LY, N: 36), y también leucemias (Leu, N=18), plasmacitomas (PL, N=11) y enfermedades mieloproliferativas (MOP, N=7), por una concentración más elevada de lo normal (control C, N=86) de PIBF de la orina (Figura 7A); A = todos los tumores). Otros ejemplos son tumores de cabeza y cuello (Figura 7C) y las malignidades del tracto urinario (Figura 7B) + = con metástasis, N = 15; - = sin metástasis, N = 14. También es obvio que la masa del tumor - que es enfermedad con o sin metástasis, retirada del tumor - afecta enormemente a la concentración de PIBF (Figura 7B, C).

Los anticuerpos policlonales se reemplazan en un ensayo de tipo sándwich de captura de antígeno similar con un par de anticuerpos monoclonales (ab) producidos en ratones usando rPIBF N-terminal de 48-kDa como antígeno. Se ensayaron aproximadamente veinte clones de hibridoma diferentes, después cuatro clones estables y buenos productores seleccionados para el ensayo de ELISA, y también para otros procedimientos de diagnóstico (inmunohistoquímica). Estos clones de hibridoma se depositan en el Hybridoma Cell Bank at the University Medical School of Pécs. (Los números de depósito son 11-14/2001, los códigos de línea celular: HYB255-258). Los elevados niveles de PIBF en muestras de orina de pacientes con tumor se detectan con los pares de anticuerpos monoclonales de forma similar a los anticuerpos policlonales (Figura 8), por lo que C = control, A = todos los tumores hematológicos, L = linfoma, Leu = leucemia, P = plasmacitoma, N = no definido; Nº = número de pacientes; POLI = ab policlonal, MONO = ab monoclonal.

La gran cantidad de datos también potencia no sólo el diagnóstico, sino especialmente el potencial de control de tumores de un ELISA de PIBF en orina y suero. El ensayo es capaz de detectar y predecir el éxito y fallo terapéutico, ya que se muestra por la normalización de los niveles de PIBF después de cirugía o quimioterapia, y una elevación significativa en los pacientes con recidiva (Figura 9A: tumores hematológicos, B: del tracto urinario) ambos con los anticuerpos policlonales y monoclonales anti-PIBF, por lo que C = control, B = antes del tratamiento, REC = recidiva, REM = remisión.

Ejemplo 7 Diferentes formas de PIBF

Además del PIBF humano de longitud completa, se identificó el ARNm de PIBF de ratón de longitud completa y la secuencia proteica (SEC ID Nº 4, 5). El PIBF de ratón también se organiza en 18 exones, y muestra una homología de aminoácidos del 89%.

Durante el intento de comparar los niveles de ARNm de PIBF en tejidos normales y tumorales con RT-PCR, se descubrieron varias formas de ARNm de PIBF con corte y empalme alternativo. La estructura de los ARNm con corte y empalme alternativo y los productos proteicos correspondientes se resumen en la Tabla IV. Todas las formas identificadas en una especie pueden existir y pueden tener funciones similares en otra especie. Se ejemplifica por las formas proteicas homólogas de PIBF de 35-kDa. Con la excepción de una forma de ARNm que contiene un ADN con un exón 14' alternativo que es una secuencia intrónica en el pre-ARNm predominante, todos ellos se generaron saltando exones perfectos perdiendo varios exones con relación a la longitud completa. Las secuencias de los exones 17 y 18 se incluyen en casi todas las formas identificadas. Se sugiere que las secuencias de aminoácidos codificadas por estos exones son esenciales para la función de PIBF. Además, varias formas de ARNm con diferentes secuencias producen secuencias diferentes en este mismo polipéptido PIBF C-terminal con un peso molecular predicho de 10-kDa. Las formas truncadas de PIBF identificadas por análisis por RT-PCR de muestras de ARN se aislaron de diferentes tejidos y líneas celulares humanas (SEC ID Nº 6, Nº 10-20) y de ratón (SEC ID Nº 8, 9, 23-37).

Las diferentes formas de PIBF se expresan de forma diferencial y tienen diferentes tributos funcionales.

Ejemplos

El ARNm de longitud completa (exones 1-18) codifica una proteína nuclear de 89-kDa. La bioinformática predice una compartimentalización nuclear basada en las dos señales de localización nuclear de los exones 7 y 13, y un dominio de unión a ácido nucleico de los exones 14-16. De acuerdo con el fraccionamiento celular y la transferencia de Western con anticuerpos monoclonales anti-PIBF, la proteína de 89-kDa de hecho se localiza exclusivamente en las fracciones nucleares. Hay formas de peso molecular más pequeño en las fracciones citosólica y secretada de diferentes tumores primarios humanos y de ratón, embriones y líneas celulares.

El ARNm de longitud completa puede encontrarse en casi todos los tejidos en base a los análisis de Northern (Figura 3) y RT-PCR (Figura 10), sin embargo, en diferentes cantidades. Se realizó una RT-PCR semi-cuantitativa sobre pares coincidentes de tejido tumoral/normal. Se amplificó la misma cantidad de ARN con pares de cebadores del exón1/exón 18 (Figura 10A) y exón 2/exón 18 específicos de PIBF (Figura 10B) o con cebadores específicos de la proteína ribosomal S9 (para control de carga) de las mismas muestras. Las muestras son: 1 = ADNc de placenta, 2 = tumor de estómago, 3 = estómago normal, 4 = tumor de útero, 5 = útero normal, 6 = Ctrl. Neg.: sin molde. Las células de crecimiento rápido, por ejemplo en tumores y embriones, células de tejidos inmunes privilegiados (testículo, placenta) contienen más ARNm de PIBF de longitud completa. El análisis por RT-PCR de tumores primarios humanos y la posterior clonación y secuenciación de ADN del ADNc de PIBF revela que las formas de ARNm de PIBF procesadas de forma alternativa se expresan de forma diferente. Se ejemplifica por dos formas de PIBF más pequeñas encontradas en tumores primarios humanos. La expresión de la forma de los exones (1-5)-(17-18) en adenocarcinoma gástrico y la de la forma de los exones 1-(13-18) en adenocarcinoma endometrial se restringe a los tejidos tumores, ya que los equivalentes de tejido normal de los mismos pacientes no expresan niveles detectables de estas variantes de corte y empalme de ARNm de PIBF. Es importante observar que tanto estos como otros ARNm de PIBF procesados de forma alternativa también se encuentran en tejidos de privilegio inmune (placenta, embrión, testículo) y en células inmunes.

La función de PIBF también depende de la estructura de la forma proteica madura. Una de las formas más interesantes está codificada por el ARNm de los exones 2-3-4-5-17-18 frecuentemente encontrado en tejidos humanos y de ratón, tales como placenta humana y de ratón, linfocitos humanos, embrión de ratón y tumor gástrico humano. Codifica un polipéptido de 298 y 297 aminoácidos de longitud con un peso molecular predicho de 35-kDa. (SEC ID Nº 6, 7 para seres humanos, SEC ID Nº 8, 9 para ratón). Las dos proteínas son un 86% homólogas. El análisis FACS revela que la forma de 35-kDa se une específicamente a células inmunes humanas (Figura 11): tinción por FACS de PBMC humanas con PIBF de 35-kDa y anticuerpos contra \alpha-PibF (anti-FITC de conejo). Las células se muestran en la región de células monocitos (Figura 11A) y en la zona de linfocitos (Figura 11B). M es la cantidad de células en la zona de fluorescencia aumentada expresada en porcentaje (%), los números se refieren a: 1 = PBMC + anti-exón 17 de PIBF, 2 = PMBC + PIBF-35 kDa (1 \mug) + anti-exón 17, 3 = PBMC + PIBF-35 kDa (5 \mug) + anti-exón 17, 4 = PBMC + PIBF-35 kDa (15 \mug) + anti-exón 17. La unión a linfocitos y monocitos humanos sugiere un receptor de PIBF en estas células inmunes. Una versión truncada de rPIBF que tiene el exón 1-9 (48-kDa), que tiene la parte N-terminal de esta forma de PIBF funcional y que carece de la parte C-terminal (exón 17-18) no es funcional en términos de unión a células inmunes (datos no mostrados).

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TABLA IV

5

6

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Las Figuras 12A a 12Q muestran las proteínas PIBF procesadas de forma alternativa por lo que los exones se representan esquemáticamente:

La Figura 12A muestra el PIBF de 89-kDa de longitud completa de ratón (SEC ID Nº 4), la Figura 12B muestra los exones (1-5)-(17-18) que se encuentran en tumor de estómago, placenta terminal humana, linfocitos masculinos y femeninos, linfocitos femeninos en estado de embarazo (SEC ID Nº 6), la Figura 12C muestra los exones (1-5)-(17-18), encontrados en placenta y embrión de ratón (SEC ID Nº 8), la Figura 12D muestra los exones 1-(13-18) (SEC ID Nº 11), la Figura 12E muestra los exones 1-(15-18), encontrados en células MCF-7 y linfocitos en estado de embarazo (SEC ID Nº 12), la Figura 12F muestra parte del intrón 14 y los exones 15-18, encontrados en una biblioteca de ADNc de leucocitos (SEC ID Nº 13), la Figura 12G muestra los exones 1 + (9-10) + (12-15) + (17-18), encontrados en células MCF-7 y linfocitos en embarazo (SEC ID Nº 14), la Figura 12H muestra los exones 1 + (3-7) + (9-10) + 12 + (17-18), encontrados en células MCF-7 - línea de células de tumor de mama humano (SEC ID Nº 17), la Figura 12I muestra los exones (1-7) + (9-15) + (17-18), encontrados en células MCF-7 - línea de células de tumor de mama humano (SEC ID Nº 19), la Figura 12J muestra los exones (1-7) + (9-10) + 12 + (17-18), encontrados en células MCF-7 -línea de células de tumor de mama humano (SEC ID Nº 22), la Figura 12K muestra los exones (1-2)-(17-18) encontrados en embrión y placenta de ratón (SEC ID Nº 23), la Figura 12L muestra los exones (1-4)-(16-18) encontrados en placenta de ratón (SEC ID Nº 25), la Figura 12M muestra los exones (1-2)-(15-18) encontrados en testículo de ratón (SEC ID Nº 27), la Figura 12N muestra los exones 1-11 18 encontrados en embrión de ratón (SEC ID Nº 29), la Figura 12O muestra los exones (1-11)-18 encontrados en embrión de ratón (SEC ID Nº 31), la Figura 12P muestra los exones 1-(8-14)-(17-18) encontrados en embrión de ratón (SEC ID Nº 34) y la Figura 12Q muestra los exones (1-1)-(15-18) encontrados en testículo de ratón (SEC ID Nº 36).

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<110> Cistem Biotechnologies GMBH

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<120> PIBF

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> R 38719

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211>757

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: proteína recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 758

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2715

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: ADN recombinante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 756

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

18

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2719

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

21

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 957

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 983

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 689

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1257

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1596

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1880

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmentos

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 875

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 908

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 512

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

54

55

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1806

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 569

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

59

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1963

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

64

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 641

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

67

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: fragmento

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<400> 37

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Claims (38)

1. Un procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento medir la concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona) o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en una muestra tomada del paciente y determinar si la concentración de PIBF en la muestra que está por encima o por debajo de un valor umbral predeterminado, mediante la concentración por encima del valor umbral identifica un paciente con un tumor.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque el tumor es un carcinoma epitelial, especialmente un carcinoma pulmonar, un carcinoma de colon o un carcinoma de mama.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizado porque la muestra es un fluido corporal, especialmente orina o suero.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 caracterizado porque la muestra es una muestra tisular.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el valor umbral es la concentración de PIBF en una muestra de una persona sana.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el valor umbral se determina midiendo la concentración de PIBF en al menos una persona sana en paralelo a la determinación de la concentración de PIBF en una muestra del paciente.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque como control positivo se mide la concentración de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en la muestra que comprende una concentración definida de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en paralelo a la determinación de la concentración de PIBF en la muestra del paciente.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque la concentración de PIBF en la muestra se mide de forma inmunológica, en particular por un ensayo competitivo, por un ensayo de tipo sándwich, por inmunotinción o combinaciones de estos procedimientos.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque la concentración de PIBF en la muestra se mide indirectamente midiendo la concentración de ARNm de PIBF en la muestra.

10. Un procedimiento para determinar el progreso positivo o negativo de un tumor en un paciente que comprende diagnosticar un tumor en un paciente de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y determinar si la concentración medida de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en la muestra está por encima o por debajo de al menos una concentración medida previamente de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en al menos una muestra previamente tomada del mismo paciente, mediante la concentración por encima de la concentración previamente medida identifica una progresión positiva.

11. Uso de un anticuerpo anti-PIBF, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12 caracterizado porque el PIBF es un PIBF recombinante.

14. Un kit que comprende un primer reactivo que comprende al menos un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo y un segundo reactivo que comprende PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo a una concentración definida.

15. El kit de acuerdo con la reivindicación 14 caracterizado porque comprende una fase sólida a la que se une el al menos un anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo o el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento del mismo.

16. El kit de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15 caracterizado porque el PIBF es recombinante.

17. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 caracterizado porque comprende un reactivo adicional que comprende un segundo anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del mismo que se une a un epítope del PIBF que es distinto al epítope reconocido por el primer anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo.

18. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para diagnosticar un tumor en un paciente y para determinar la progresión de un tumor en un paciente, respectivamente.

19. Uso de un anticuerpo anti-PIBF, preferiblemente un anticuerpo monoclonal anti-PIBF, especialmente anticuerpo anti-PIBF humanizado, o un fragmento del mismo para la preparación de una medicina anti-tumoral.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19 caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20 caracterizado porque el anticuerpo tiene unida al mismo una molécula.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 caracterizado porque la molécula es una sustancia tóxica, especialmente un radionúclido, un fármaco quimioterapéutico o una toxina, y un profármaco, respectivamente.

23. Uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo para la preparación de una medicina anti-tumoral.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 caracterizado porque la medicina es una vacuna.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 caracterizado porque la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.

26. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 ó 24 caracterizado porque el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento del mismo es recombinante.

27. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 a 24 caracterizado porque el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento del mismo es una molécula sintetizada químicamente.

28. El uso de un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o una molécula antisentido de PIBF para la preparación de una medicina anti-tumoral.

29. Proteína recombinante con una actividad de Proteína Inmunomoduladora Inducida por Progesterona (PIBF), que comprende

- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 1 o

- una secuencia de aminoácidos con un identidad de aminoácidos de al menos el 98% con la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A o

- una secuencia de aminoácidos con una identidad de aminoácidos de al menos el 95% con la secuencia de los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A y

- una actividad PIBF de al menos el 50% de la molécula PIBF humana natural.

30. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos dada desde los restos aminoacídicos 300 a 350 de la SEC ID Nº 1.

31. Proteína recombinante de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos dada desde los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1.

32. Proteína con una actividad PIBF que comprende

- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID Nº 4 o

- un aminoácido con una identidad de aminoácido de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 99%, con la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 4 como se determina por el algoritmo FAST/A.

33. Proteína caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% como se determina por el algoritmo FAST/A con una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 y 36, siendo dicha proteína una proteína PIBF procesada de forma alternativa.

34. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína recombinante con una actividad PIBF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.

35. Molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PIBF procesada de forma alternativa caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico con una identidad de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% con

- una secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 y 37 o

- una secuencia que híbrida en condiciones rigurosas con una de las secuencias anteriores o

- una secuencia que está degenerada debido al código genético respecto a una de las secuencias anteriores.

36. Vector de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35 y un elemento regulador adecuado.

37. Vector de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende adicionalmente un marcador de selección.

38. Célula, que comprende un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36.