ES2283461T3 - Procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente determinando la concentracion de pibf. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento medir la concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona) o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en una muestra tomada del paciente y determinar si la concentración de PIBF en la muestra que está por encima o por debajo de un valor umbral predeterminado, mediante la concentración por encima del valor umbral identifica un paciente con un tumor.
Description
Procedimiento para diagnosticar un tumor en un
paciente determinando la concentración de PIBF.
La presente invención se refiere a una proteína
recombinante con una actividad de Proteína Inmunomoduladora Inducida
por Progesterona (BIFP), una molécula de ácido nucleico que codifica
una proteína recombinante con una actividad PIBF, un vector de ácido
nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico, una célula
que comprende dicho vector y un procedimiento para diagnosticar un
tumor en un paciente.
Para el mantenimiento del embarazo normal, la
producción de progesterona -una hormona esteroide con amplio
intervalo de efectos inmunosupresores- es absolutamente esencial.
Los linfocitos periféricos de mujeres embarazadas sanas expresan
receptores nucleares para detectar esta hormona
(Szekeres-Bartho y col. J. Reprod. Immunol. 16, 239
(1989); Szekeres-Bartho y col. Cell. Immunol. 125,
273 (1990)), y producen una proteína mediadora llamada el Factor de
Bloqueo Inducido por Progesterona (PIBF)
(Szekeres-Bartho y col. Am. J. Reprod. Immunol.
Microbiol. 9, 15 (1985)). La secuencia del ADNc de PIBF de hígado
humano no mostró homología significativa con la de cualquiera de las
proteínas conocidas (HSPIBF, Nº Acc. Y09631). La proteína precursora
codificada es altamente hidrófila y tiene un peso molecular de 89
kDa. El PIBF de origen natural como se descubrió originalmente es
una proteína inmunomoduladora de 34-36 kDa con una
longitud de secuencia de 757 aminoácidos.
Se ha determinado que la concentración de PIBF
en muestras de orina de personas sanas es de aproximadamente
1-10 ng/ml mientras que la concentración de PIBF en
mujeres embarazadas en el 2º trimestre varía de aproximadamente
70-150 ng/ml. Estos elevados niveles vuelven
rápidamente a la normalidad después del aborto y parto.
PIBF que media los efectos de la progesterona ha
demostrado tener función inmunomoduladora muy potente, tanto in
vitro, así como in vivo. De hecho, PIBF ha demostrado ser
esencial para el embarazo en un modelo de ratón, ya que PIBF aislado
de sobrenadantes de cultivo de linfocitos de ratón protege a los
fetos de la resorción inducida por antiprogesteronas. Además, los
anticuerpos neutralizantes contra el PIBF de ratón causan la
resorción de los embriones y por consiguiente el aborto. El
importante papel de PIBF en la reproducción humana también se ha
corroborado midiendo bajos niveles en los fluidos corporales de
embarazos patológicos. PIBF desempeña un papel importante en el
mantenimiento del embarazo muy probablemente inhibiendo los
linfocitos natural killer. De forma importante, manipulando
experimentalmente la cantidad de PIBF in vitro, se puede
modular la actividad de eliminación de los linfocitos de sangre
periférica que contienen células NK (natural killer). Se ha
determinado que hay al menos dos mecanismos de acción de PIBF sobre
las células NK. Uno es una inhibición directa de la actividad de las
células NK. Las células NK eliminan sus células diana por exocitosis
de gránulos que contienen perforina o serina esterasa en el área de
contacto entre las células efectoras y diana. Los linfocitos
deciduales -de los que el 60% lleva los marcadores superficiales NK-
tienen elevado contenido de perforina, sin embargo, ejercen una baja
actividad citotóxica. Aunque las células NK activadas encuentran y
se unen a sus dianas en presencia de PIBF, no logran liberar
perforina desde los gránulos de almacenamiento, y como resultado, no
hay lisis de las células diana. Parece que PIBF paraliza las células
NK y mantiene
la maquinaria citotóxica en reposo inhibiendo la desgranulación y por tanto la liberación de sustancias de eliminación.
la maquinaria citotóxica en reposo inhibiendo la desgranulación y por tanto la liberación de sustancias de eliminación.
Hay otro mecanismo indirecto, por el que PIBF
ejerce su efecto anti-NK, a través de la expresión
alterada de citoquinas. En presencia de PIBF hay una disminución
significativa en la producción de TNF\alpha (Factor de Necrosis
Tumoral \alpha) por las células NK, que también podría estar
implicada en la regulación negativa de la actividad NK. La cantidad
de TNF\alpha secretado está inversamente relacionado con la
producción de PIBF tanto in vitro como in vivo.
El segundo mecanismo principal de acción de PIBF
es la inducción de dominancia de citoquinas T_{H2}. La dominancia
T_{H2} contribuye a las respuestas disminuidas mediadas por
células y la potenciación de células B, mientras que la dominancia
T_{H1} provoca respuestas humorales disminuidas y favorece los
mecanismos inmunológicos celulares. El PIBF secretado facilita la
producción de citoquinas T_{H2}, tales como IL-3,
IL-4 e IL-10, mientras que suprime
las citoquinas T_{H1}, tales como IL-12 e
IFN\gamma tanto in vitro como in vivo. La
neutralización de PIBF por anticuerpos específicos provoca el cambio
de T_{H1} in vivo, que también es una característica de los
embarazos fallidos. El efecto de PIBF en las respuestas inmunes
humorales no es una simple potenciación sino una inducción de la
producción de anticuerpos asimétricos. Ésta es una población de
anticuerpos (ab) que, debido a la presencia de un resto
oligosacárido rico en manosa en uno de los brazos Fab de la
molécula, tiene una estructura asimétrica, y no tiene o tiene bajas
funciones efectoras; sin embargo, este ab podría funcionar como
anticuerpo de bloqueo. La proporción de IgG asimétrica fue
significativamente superior en sobrenadantes de células de hibridoma
cultivadas en presencia de PIBF que en las cultivadas en ausencia de
PIBF. Estudios adicionales revelaron una relación positiva entre el
contenido de anticuerpos asimétricos de los sueros y la expresión de
PIBF en linfocitos. Además, bloqueando los receptores de
progesterona por RU 486 o neutralizando la actividad PIBF endógena
por anticuerpos anti-PIBF específicos se redujo
significativamente la producción de anticuerpos asimétricos en
ratones preñados.
Los tumores malignos, es decir, cánceres, son la
segunda causa principal de muerte en todos los países desarrollados
después de enfermedad cardíaca y se desarrollan en una de cada tres
personas. Una de cada cuatro personas muere de cáncer. El cáncer se
caracteriza principalmente por un aumento en la cantidad de células
anormales o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que
proliferan formando una masa tumoral, la invasión de tejidos
adyacentes por estas células tumorales neoplásicas, y la generación
de células malignas que se propagan mediante la sangre o el sistema
linfático hasta los ganglios linfáticos regionales y hasta sitios
distantes. El último progreso a la malignidad se conoce como
metástasis.
El cáncer puede ser el resultado de una ruptura
en la comunicación entre las células neoplásicas y su entorno,
incluyendo sus células adyacentes normales. Las señales, tanto
estimuladoras del crecimiento como inhibidoras del crecimiento, se
intercambian de forma rutinaria entre células en un tejido.
Normalmente, las células no se dividen en ausencia de señales
estimuladoras y, del mismo modo, dejarán de dividirse en presencia
de señales inhibidoras. En un estado canceroso, o neoplásico, una
célula adquiere la capacidad de "anular" estas señales y
proliferar en condiciones en las que no crecerían células
normales.
Las células tumorales adquieren varios rasgos
aberrantes diferentes para proliferar. Lo que refleja este requisito
es el hecho de que los genomas de ciertos tumores bien estudiados
llevan varios genes diferentes alterados independientemente,
incluyendo oncogenes activados y genes supresores de tumores
inactivados. Cada uno de estos cambios genéticos parece ser
responsable de conferir alguno de los rasgos que, en conjunto,
representan el fenotipo neoplásico completo.
Las células tumorales llevan antígenos que
pueden reconocerse como extraños para el cuerpo y que es una de las
funciones principales del sistema inmune para eliminar dichas
células antes de que puedan formar tumores grandes. Esta vigilancia
inmune es claramente ineficaz en pacientes con enfermedades malignas
progresivas. Hay un conjunto de medidas protectoras identificadas
que suprimen la auto-reactividad y pueden
representar una barrera principal en la capacidad del sistema inmune
para erradicar células tumorales. Hay varios mecanismos ejercidos
por las células tumorales tales como 1. ausencia de expresión de
moléculas MHC de clase I clásicas y expresión de moléculas MHC de
clase I de auto-identificación no clásicas (tales
como HLA-G), que reduce el efecto de eliminación de
CTL restringidas a MHC de clase I específicas de antígeno (tumor);
2. desviación hacia respuestas T_{H2}, supresión de la función
auxiliar T_{H1}, y por consiguiente las respuestas
anti-tumorales citotóxicas eficaces; y 3. la
producción de factores inmunosupresores que regulan negativamente
las respuestas inmunes locales y sistémicas (por ejemplo, la
secreción de TGF-\beta disminuye la proliferación
celular y la citotoxicidad, la expresión de ligando fas, que induce
la apoptosis de CTL.). Como resultado de estos efectos acumulativos,
los tumores disfrutan de un estado inmunológicamente privilegiado, y
crecen sin o con control restringido del sistema inmune.
Está bastante bien establecido que muchas
afecciones patológicas, tales como infecciones, cáncer, trastornos
autoinmunes, etc., se caracterizan por la expresión inapropiada de
ciertas moléculas. Por tanto estas moléculas sirven como
"marcadores" para una afección patológica o anormal particular.
Aparte de su uso como "dianas" de diagnóstico, es decir,
materiales a identificar para diagnosticar estas afecciones
anormales, las moléculas sirven como reactivos que pueden usarse
para generar agentes de diagnóstico y/o terapéuticos.
Un objetivo de la presente invención es un nuevo
procedimiento para diagnosticar un tumor en un paciente que puede
realzarse de forma fácil y segura, no requiriendo dicho
procedimiento un equipo de alta tecnología, no causa ningún problema
particular para el paciente, que puede realizarse rápidamente y que
conduce a resultados que permiten distinguir entre un paciente con
un tumor y un paciente sano.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un kit para realizar el procedimiento para diagnosticar
un tumor en un paciente.
Un objeto adicional más de la presente invención
es proporcionar una medicina anti-tumoral
eficaz.
El procedimiento de acuerdo con la presente
invención para diagnosticar un tumor en un paciente con el que se
resuelve el objeto anterior comprende tomar una muestra del
paciente, medir la concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido
por Progesterona) o un derivado del mismo o un fragmento del mismo
en la muestra y determinar si la concentración de PIBF en la muestra
está por encima o por debajo de un valor umbral predeterminado, por
el que la concentración por encima del valor umbral identifica un
paciente con un tumor.
Durante la caracterización de PIBF como una
molécula inmunomoduladora importante para el mantenimiento del
embarazo, se ha mostrado sorprendentemente que las células tumorales
expresan PIBF o sustancias relacionadas con PIBF, mientras que no se
encuentra reactividad PIBF o se encuentra baja reactividad PIBF en
los tejido normales adyacentes. Esto indica que PIBF está implicado
en el desarrollo y mantenimiento de la tolerancia inmunológica hacia
las células transformadas malignas y por lo tanto constituye un
marcador útil para células tumorales.
Por lo tanto el procedimiento de acuerdo con la
presente invención usa el hecho de que la concentración de PIBF en
una muestra tomada del paciente a ensayar es mayor que la
concentración de PIBF en una muestra tomada de una persona sana.
En el alcance de la presente invención, la
muestra tomada del paciente puede ser cualquier tipo de muestra,
fluida o no, de prácticamente cualquier parte del cuerpo. La
concentración del PIBF puede medirse de acuerdo con cualquier
procedimiento conocido en la técnica que posibilite cuantificar la
concentración de PIBF en una muestra. Esto puede comprender técnicas
químicas, microbiológicas, físicas, de tinción, etc. en fluidos,
muestras tisulares, etc. Los posibles procedimientos incluyen la
formación de imágenes in vivo con Tomografía por Ordenador
(CT) e Imagen de Resonancia Magnética (MRI), después de marcar con
marcadores radionucleicos y paramagnéticos (por ejemplo, gadolinio),
respectivamente, etc.
\newpage
Como PIBF puede someterse a cambios metabólicos
u otros cambios en el cuerpo del paciente, el PIBF puede comprender
modificaciones dependiendo de qué muestra se haya tomado del
paciente. El PIBF puede, por ejemplo, haberse escindido de modo que
solamente un fragmento del PIBF esté presente en la muestra dada. El
PIBF puede, además, haberse modificado de modo que esté presente un
derivado del PIBF en esa muestra o también un fragmento de ese
derivado. También se ha mostrado que hay ARNm de PIBF procesados de
forma alternativa presentes en células tumorales en una diferente
concentración en comparación con células normales, por lo tanto, las
proteínas o fragmentos traducidos de estas diferentes formas de
moléculas de ARNm o fragmentos de las mismas también están
comprendidos por el término "fragmentos". Por lo tanto, puede
usarse también el derivado de PIBF, o un fragmento del PIBF o del
derivado de PIBF o sustancias relacionadas con PIBF (tales como, por
ejemplo, un producto escindido de 34 kDa o un producto de 14 kDa con
corte y empalme alternativo) como un indicio de la concentración del
PIBF en el paciente y por lo tanto puede usarse la concentración
respectiva para el procedimiento para diagnosticar un tumor en un
paciente de acuerdo con l presente invención.
En el alcance e la presente invención la
expresión "PIBF o fragmentos del mismo" se refiere a -sin
limitación- secuencias de acuerdo con las SEC ID Nº 1, 3, 4, 6, 8,
10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 34 y 36 o fragmentos o
derivados de las mismas. Por lo tanto, los ejemplos de PIBF o
fragmentos del mismo que pueden detectarse o cuantificarse de
acuerdo con la presente invención son estas secuencias mencionadas
anteriormente. Como se ha demostrado que los exones 17 y 18 están
incluidos en casi todas las formas de ARNm que se han identificado,
los fragmentos de PIBF que comprenden los exones 17 y 18 (véanse las
figuras) se usan preferiblemente para la detección o cuantificación
de PIBF en una muestra.
En el alcance de la presente invención, el
fragmento del PIBF o del derivado de PIBF puede comprender por
ejemplo menos de 715 aminoácidos, preferiblemente menos de 500
aminoácidos, más preferiblemente menos de 200 aminoácidos, y mucho
más preferiblemente menos de 50 aminoácidos.
En el alcance de la presente invención, el
término "derivado" comprende por ejemplo cualquier modificación
de origen natural o incluso no natural, por ejemplo, escisión,
glicosilaciones, metilaciones, acetilaciones, amidaciones,
fosforilaciones, sulfataciones, deleciones, sustituciones, etc.
Además, en el alcance de la presente invención,
"valor umbral" se refiere a un valor de concentración que
generalmente será la concentración en la muestra media de PIBF en
donantes de muestras sanos. Es posible tomar una concentración de
PIBF media general conocida en gente sana de acuerdo con la
bibliografía o también determinar la concentración en la muestra de
PIBF en donantes sanos cuando se realiza la presente invención. El
valor umbral también puede determinarse en muestras sanas (normales)
tomadas anteriormente (en un estado sano) de la misma persona. Los
ejemplos de dichos valores umbral pueden ser por ejemplo entre 1 y
10 ng/ml, preferiblemente entre 1 y 5 n/ml, por lo que la
concentración depende del procedimiento de detección así como del
tipo de tumor. Además, el valor umbral puede ser cero en el caso de
que solamente estén presentes productos de ARNm de PIBF procesados
de forma alternativa en células tumorales y no en células sanas. Por
lo tanto, el valor umbral también depende de la molécula de PIBF y
debe determinarse para cada molécula de PIBF específica de forma
individual.
Sin embargo, cuando se determina el valor umbral
es importante que la muestra de la persona sana no se tome de una
mujer embarazada ya que la concentración de PIBF en muestras de
mujeres embarazadas es mayor que la concentración de PIBF en
muestras de mujeres no embarazadas.
La concentración de PIBF medida en la muestra
tomada del paciente que está por encima del valor umbral
predeterminado identifica individuos con sospecha de tumor. Un
"tumor" como se usa en este documento se refiere a todo
crecimiento y proliferación celular neoplásica, sea maligno o
benigno, y todas las células y tejidos
pre-cancerosos y cancerosos.
Dentro del término "paciente", en el
alcance de la presente invención, están comprendidos pacientes con
un tumor pero también pacientes susceptibles de tener un tumor así
como gente sana que tiene una revisión rutinaria general. Por
supuesto, el término "paciente" puede comprender también
cualquier animal, en particular un ratón, rata, cobaya, mono, siendo
preferiblemente dicho animal un animal de laboratorio usado para
análisis, por ejemplo, para detectar tumores específicos, ensayar
sustancias anti-tumorales o sustancias
carcinogénicas. Además, el animal puede ser un animal modificado
genéticamente que tiene una predisposición a desarrollar
tumores.
Como el embarazo también provoca elevados
niveles de PIBF, las mujeres sexualmente activas deben ensayarse por
pruebas de embarazo convencionales (por ejemplo, basadas en hCG)
antes de considerarse como pacientes con tumor. También se entiende
que es muy difícil usar este ensayo para detectar crecimiento
tumoral cuando el paciente es una mujer embarazada más allá del
primer trimestre. Sin embargo, como una proporción significativa de
las malignidades relacionadas con el embarazo están relacionadas con
el crecimiento incontrolado de tejidos relacionados con el embarazo
(tales como células trofoblásticas en mola hidatiforme), niveles
extremadamente elevados (>150-200 ng/ml) de PIBF
podrían indicar crecimiento tumoral con o sin un bebe viable
presente.
Preferiblemente, el tumor a diagnosticar por el
procedimiento de acuerdo con la presente invención es un carcinoma
epitelial. Como la inmensa mayoría de los tumores humanos (en base a
los datos de morbilidad mundial) son carcinomas epiteliales (pulmón,
mama, colon, etc.) el procedimiento de acuerdo con la presente
invención es particularmente ventajoso para el diagnóstico de este
tipo de tumor.
El carcinoma epitelial es preferiblemente un
carcinoma pulmonar, carcinoma de colon y carcinoma de mama,
respectivamente. La concentración de PIBF en muestras tomadas de
pacientes con los tumores mencionados anteriormente es
particularmente elevada en comparación con la concentración de PIBF
en muestras de pacientes sanos. Por lo tanto, si el procedimiento de
acuerdo con la presente invención se usa para diagnosticar uno de
los tumores mencionados anteriormente, una concentración por encima
de un valor umbral identifica individuos con sospecha de tumor. Sin
embargo, una concentración por debajo del valor umbral no
necesariamente excluye la presencia de un tumor en ciertos
casos.
De acuerdo con una realización ventajosa de la
presente invención, la muestra es un fluido corporal,
preferiblemente orina y suero, respectivamente. Esto posibilita un
modo muy simple de tomar la muestra del paciente sin ninguna etapa
quirúrgica y sin la necesidad de instrumentos de alta tecnología. El
fluido corporal puede tomarse en cualquier laboratorio o incluso en
la casa del paciente y es especialmente ventajoso para un
diagnóstico de rutina, un diagnóstico en un paciente que está muy
débil y para la revisión regular del progreso del tumor en un
paciente. La concentración de PIBF puede, por ejemplo, medirse con
un procedimiento químico seco, por ejemplo, una tira que cambiará su
color de acuerdo con la concentración de PIBF en una muestra en la
que se sumerge.
Como alternativa, la muestra es una muestra
tisular. Aunque tomar este tipo de muestra del paciente no es tan
fácil como tomar un fluido corporal, un procedimiento de acuerdo con
la presente invención que usa una muestra tisular del paciente
posibilita la localización directa del tumor, especialmente si se
toman y comparan diferentes muestras tisulares entre sí. Además, es
posible seguir directamente el progreso del tumor. Además,
detectando los tejidos con un tumor, el procedimiento de acuerdo con
la presente invención puede usarse adicionalmente al menos como un
procedimiento adicional para decidir qué tejidos y qué partes de un
cuerpo del paciente deben retirarse quirúrgicamente.
De acuerdo con la realización preferida de la
presente invención, el valor umbral es la concentración de PIBF en
una muestra de una persona sana. Por supuesto, el valor umbral es
particularmente preciso si es la concentración media de PIBF de una
pluralidad de muestras de personas sanas.
Preferiblemente, el valor umbral se determina
midiendo la concentración de PIBF en una muestra de al menos una
persona sana en paralelo a la determinación de la concentración de
PIBF en una muestra del paciente. Como la concentración medida
depende del procedimiento para medir la concentración de PIBF, el
diagnóstico es más específico y exacto si el procedimiento para
medir la concentración de PIBF en la muestra del paciente y en la
muestra de la persona sana son idénticos. Para potenciar
adicionalmente la sensibilidad del procedimiento, la muestra del
paciente y la muestra de la persona sana preferiblemente se miden en
paralelo, por ejemplo, al mismo tiempo para eliminar cualquier
parámetro de interferencia, por ejemplo, temperatura, tampones, etc.
que tienen influencia sobre el resultado. La muestra de la persona
sana preferiblemente se medirá en paralelo como la "muestra
negativa".
De forma ventajosa, como control positivo se
mide la concentración de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento
del mismo en una muestra que comprende una concentración definida de
PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en paralelo a
la determinación de la concentración de PIBF en la muestra del
paciente. La medición en paralelo del control positivo permite
controlar los resultados y detectar cualquier divergencia en el
procedimiento.
Preferiblemente, la concentración de PIBF en la
muestra se mide inmunológicamente, en particular por un ensayo
competitivo, por un ensayo de tipo sándwich, por inmunotinción o
combinaciones de estos procedimientos. Puede aplicarse cualquier
procedimiento inmunológico conocido por los especialistas en la
técnica. Los procedimientos inmunológicos son procedimientos
altamente sensibles para detectar moléculas y por lo tanto son
particularmente ventajosos para medir la concentración de PIBF en la
muestra. Para realizar el procedimiento inmunológico es necesario
tener al menos un anticuerpo anti-PIBF que se unirá
específicamente a PIBF, derivados del mismo o fragmentos del mismo.
El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede ser
adicionalmente recombinante. Además, pueden usarse anticuerpos
monoclonales humanizados o monoclonales de cadena sencilla
codificados por fagos.
Los ejemplos de anticuerpos monoclonales
recombinantes anti-PIBF humano que pueden usarse
como se ha descrito anteriormente están depositados en el banco de
células de hibridoma en la University Medical School of Pécs,
Departamento de Inmunología y Biotecnología, Hungría, con los Nº de
depósito 11 a 14/2001, códigos de línea celular HYB
255-258.
"Anticuerpos de cadena sencilla" se definen
estructuralmente como que comprenden la parte de unión de un primer
polipéptido de la región variable de un anticuerpo, asociada con la
parte de unión de un segundo polipéptido de la región variable de un
anticuerpo, estando los dos polipéptidos unidos por un engarce
peptídico que une el primero y el segundo polipéptidos en una cadena
polipeptídica única. La cadena polipeptídica única por tanto
comprende un par de regiones variables conectadas por un engarce
polipeptídico. Las regiones pueden asociarse para formar un sitio de
unión a antígeno funcional, como en el caso en el que las regiones
comprenden un par de regiones variables de cadena ligera y de cadena
pesada con regiones determinantes de complementariedad (CDR)
apropiadamente emparejadas.
La expresión "anticuerpo humanizado" como
se usa en este documento se refiere a moléculas de anticuerpo en las
que los aminoácidos se han reemplazado en los reactivos de unión a
antígeno conocidos para parecerse más estrechamente a un anticuerpo
humano y manteniendo aún la capacidad de unión original.
Los anticuerpos pueden generarse usando
procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Dichos
anticuerpos pueden incluir, aunque sin limitación, policlonales,
monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena sencilla,
fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una biblioteca de
expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizantes (es decir, aquellos
que inhiben la formación de dímeros) son especialmente preferidos
para uso terapéutico.
Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse diversos huéspedes incluyendo cabras, conejos, ratas,
ratones, pollos (Yab), seres humaos, y otros, por inyección con la
proteína PIBF natural o recombinante o cualquier fragmento u
oligopéptido del mismo que tenga propiedades inmunogénicas o un ADN
de PIBF (fragmento). Dependiendo de la especie del huésped, pueden
usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica.
Dichos adyuvantes incluyen, aunque sin limitación, adyuvante de
Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, y
sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles
plurónicos, polianiones, aluminio, policationes (por ejemplo,
poliArg), péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa
californiana, y dinitrofenol. Entre los adyuvantes usados en seres
humanos, son especialmente preferibles BCG (bacilo de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
parvum.
Se prefiere que los péptidos, fragmentos, u
oligopéptidos usados para inducir anticuerpos contra PIB tengan una
secuencia de aminoácidos constituida por al menos cinco aminoácidos,
y más preferiblemente al menos 10 aminoácidos. También es preferible
que sean idénticos a una parte de la secuencia de aminoácidos de la
proteína natural. Pueden fusionarse cortas extensiones de
aminoácidos de PIBF con los de otra proteína tal como hemocianina de
lapa californiana y se producirán anticuerpos contra la molécula
quimérica.
Los anticuerpos monoclonales contra PIBF pueden
prepararse usando cualquier técnica que proporcione la producción de
moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo.
Estas incluyen, aunque sin limitación, la técnica de hibridoma, la
técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma
de EBV.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y
empalme de genes de anticuerpos de ratón con genes de anticuerpos
humanos para obtener una molécula con la especificidad de antígeno y
actividad biológica apropiadas. Como alternativa, las técnicas
descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla
pueden adaptarse, usando procedimientos conocidos en la técnica,
para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos de PIBF.
Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta
composición idiotípica, pueden generarse por arrastre de cadena a
partir de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulina.
Los anticuerpos también pueden producirse
induciendo la producción in vivo en la población de
linfocitos o explorando bibliotecas recombinantes de inmunoglobulina
o paneles de reactivos de unión altamente específica.
También pueden generarse fragmentos de
anticuerpo que contienen sitios de unión específicos para PIBF. Por
ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque sin limitación, los
fragmentos F(ab')2 que pueden producirse por digestión con
pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden
generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos
F(ab')2. Como alternativa, pueden construirse bibliotecas de
expresión de Fab para permitir una identificación rápida y fácil de
fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.
Pueden usarse diversos inmunoensayos para la
exploración para identificar anticuerpos que tienen la especificidad
deseada. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para
ensayos de unión competitiva e inmunorradiométricos usando
anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades
establecidas. Dichos inmunoensayos típicamente implican la medición
de la formación de complejos entre PIBF y su anticuerpo específico.
Se prefiere un inmunoensayo basado en anticuerpos monoclonales, de
dos sitios, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos
epítopes de PIBF no interferentes, pero también puede emplearse un
ensayo de unión competitiva.
En una forma preferida, la concentración de PIBF
en la muestra se mide por un ensayo competitivo. De acuerdo con este
procedimiento, se cubre una fase sólida con PIBF humano
preferiblemente recombinante (o sus variantes) a una concentración
específica. Se añaden anticuerpos anti-PIBF junto
con los ejemplos a medir. Cuanto mayor es la concentración de PIBF
en la muestra menor es el valor detectado correspondiente. En base a
estas lecturas, se puede determinar la concentración absoluta del
PIBF. Éste es un procedimiento particularmente preciso especialmente
cuando la muestra es un fluido corporal y puede realizarse por
ejemplo con un ELISA.
De acuerdo con una realización preferida
adicional de la invención, se mide la concentración de PIBF en una
muestra por un ensayo de tipo sándwich. Para este ensayo es
necesario tener dos anticuerpos anti-PIBF que se
unen cada uno a un epítope diferente de la molécula de PIBF. El
primer anticuerpo anti-PIBF se inmoviliza
preferiblemente en un soporte sólido después de lo cual se añade la
muestra que se tiene que medir de modo que el PIBF presente en la
muestra se une al primer anticuerpo anti-PIBF. Se
añade un segundo anticuerpo anti-PIBF que está
preferiblemente marcado de modo que se une al PIBF unido. La
cantidad del segundo anticuerpo anti-PIBF unido se
mide y se usa como indicio de la concentración absoluta del PIBF en
la muestra. Este procedimiento también se usa preferiblemente cuando
la muestra a medir es un fluido corporal del paciente y se puede
realizar por ELISA.
De acuerdo con otra realización preferida de la
presente invención, la concentración de PIBF en una muestra se mide
por inmunotinción. Este procedimiento se usa preferiblemente cundo
la muestra que se tiene que medir es una muestra tisular del
paciente. De acuerdo con este procedimiento, se añade directamente
anticuerpo anti-PIBF a la muestra tisular del
paciente donde se une a PIBF presente en la muestra tisular. El
anticuerpo unido se cuantifica allí indicando directamente la
concentración de PIBF en la muestra tisular. Este procedimiento
permite la localización de PIBF en una muestra.
Preferiblemente, la concentración de PIBF se
mide indirectamente midiendo la concentración de ARNm de PIBF en la
muestra. Para esto pueden usarse polinucleótidos, incluyendo
secuencias oligonucleotídicas, moléculas de ARN o ADN antisentido, y
PNA. Los polinucleótidos pueden usarse para detectar y cuantificar
la expresión génica en muestras en las que la expresión de PIBF se
correlacionará con un tumor. Por consiguiente, puede proporcionarse
un kit que comprende un reactivo que comprende los polinucleótidos
mencionados anteriormente (marcados) para realizar la medición de
ARNm de PIBF en la muestra dada. De nuevo aquí es preferible medir
adicionalmente la concentración de ARNm procesado de forma
alternativa. Además, la presencia o ausencia de una molécula de ARNm
específica puede dar información con respecto a si las células son o
no son células tumorales.
En un aspecto, puede usarse la hibridación con
sondas nucleotídicas para identificar secuencias de ARNm de PIBF.
Las secuencias nucleotídicas complementarias al ARNm de PIBF pueden
marcarse por procedimientos convencionales, y añadirse a una muestra
de fluido o tisular de un paciente en condiciones adecuadas para la
formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de
incubación adecuado, la muestra se lava y se cuantifica y compara la
señal con el valor umbral.
La especificidad de la sonda, esté hecha a
partir de una región altamente específica o una región menos
específica y la rigurosidad de la sonda (máxima, alta, intermedia, o
baja) determinarán si la sonda identifica solamente secuencias de
origen natural que codifican PIBF, alelos, o secuencias
relacionadas.
Las sondas que se usan para la hibridación de
secuencias de ARNm de PIBF (relacionadas) deben mostrar
preferiblemente al menos el 50%, preferiblemente el 70%, más
preferiblemente el 90%, de homología con la secuencia que codifica
PIBF o fragmentos de la misma. Las sondas de hibridación de la
presente invención pueden ser ADN o ARN y obtenerse de la secuencia
de nucleótidos de la SEC ID Nº 3 ó 5 (ADNc de PIBF).
Los ejemplos de dichas moléculas de ARNm de PIBF
a detectar y/o cuantificar son, por ejemplo, las detectadas por ADN
o ARN obtenido de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 5, 7,
9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 y 37. Como se
ha demostrado que los exones 17 y 18 están incluidos en casi todas
las formas de ARNm que se han identificado, preferiblemente se usa
ADN o ARN obtenido de una secuencia que codifica los exones 17 y 18
(véanse las figuras) para la detección y cuantificación de ARNm de
PIBF en una muestra.
Las sondas de hibridación pueden marcarse por
una diversidad de grupos informadores, por ejemplo, radionucleótidos
tales como 32P o 35S, o marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa
alcalina unida a la sonda mediante sistemas de unión de
avidina/biotina, y similares.
Las secuencias polinucleotídicas que codifican
PIBF pueden usarse adicionalmente en análisis de transferencia de
northern, dot blot, u otras tecnologías basadas en membrana; en
ensayos de varilla, pin, ELISA o (micro) chip utilizando fluidos o
tejidos de biopsias de pacientes para detectar ARNm de PIBF. Dichos
procedimientos son bien conocidos en la técnica.
Además, el ARNm de PIBF puede detectarse y
medirse por RT-PCR: En una primera etapa se
transcribe el ARNm por la transcriptasa inversa en ADNc después de
lo cual se detecta y cuantifica el ADNc por PCR. Los oligómeros para
la PCR pueden sintetizarse químicamente, generarse enzimáticamente,
o producirse a partir de una fuente recombinante. Los oligómeros
estarán preferiblemente constituidos por dos secuencias de
nucleótidos, una con orientación con sentido y otra con orientación
antisentido, empleadas en condiciones optimizadas para la
identificación de la secuencia específica. Pueden emplearse los dos
mismos oligómeros, conjuntos agrupados de oligómeros, o incluso una
combinación degenerada de oligómeros en condiciones menos rigurosas
para la detección y/o cuantificación de secuencias estrechamente
relacionadas.
Una aspecto adicional de la presente invención
se refiere a un procedimiento para determinar el progreso positivo o
negativo de un tumor en un paciente que comprende diagnosticar un
tumor en un paciente de acuerdo con uno de los procedimientos
mencionados anteriormente de acuerdo con la presente invención y
determinar si la concentración medida de PIBF o un derivado del
mismo o un fragmento del mismo en la muestra está por encima o por
debajo de al menos una concentración medida previamente de PIBF o un
derivado del mismo o un fragmento del mismo en al menos una muestra
previamente tomada del mismo paciente, por lo que la concentración
por encima de la concentración previamente medida identifica un
progreso positivo. Como la concentración de PIBF en una muestra es
directamente proporcional al progreso del tumor, por ejemplo,
tamaño, desarrollo, etc., el procedimiento de acuerdo con la
presente invención permite analizar directamente el transcurso de la
enfermedad. Para una caracterización completa del progreso del tumor
es, por supuesto, ventajoso tomar muchas muestras durante un periodo
de tiempo en particular antes y después de un tratamiento
específico, por ejemplo, con una sustancia o retirando un tejido
tumoral completa o parcialmente, en cuyo caso puede analizarse la
eficacia del tratamiento específico. La expresión "progreso
positivo" usada en este documento significa que el tumor se está
desarrollando adicionalmente.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de un anticuerpo anti-PIBF o un
fragmento del mismo en un procedimiento descrito anteriormente de
acuerdo con la presente invención. Como se ha mencionado
anteriormente, el anticuerpo anti-PIBF puede ser
monoclonal, policlonal, puede adicionalmente ser un anticuerpo de
cadena sencilla recombinante, humanizado o codificado en fagos. Si
se usa solamente un fragmento del anticuerpo, este fragmento
comprende el epítope del anticuerpo anti-PIBF que
reconoce el PIBF.
Se prefiere usar un anticuerpo monoclonal para
conseguir un resultado más específico y preciso. El anticuerpo
monoclonal puede producirse como se ha mencionado anteriormente, y
los ejemplos dados anteriormente también se aplican en este
caso.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del
mismo en uno de los procedimientos mencionados anteriormente de
acuerdo con la presente invención. Como ya se ha mencionado
anteriormente, el fragmento puede ser un fragmento del PIBF o un
fragmento del derivado de PIBF. Aquí, se aplican las mismas
definiciones y realizaciones o ejemplos preferidos que se han
mencionado anteriormente.
Preferiblemente, el PIBF es recombinante, que
significa que también el derivado o el fragmento puede ser
recombinante.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a un kit que comprende un primer reactivo que comprende al
menos un anticuerpo anti-PIBF o un fragmento del
mismo y un segundo reactivo que comprende PIBF o un derivado del
mismo o un fragmento del mismo a una concentración definida. Por
supuesto, el anticuerpo anti-PBF y el PIBF están
presentes en una forma que permite su almacenamiento, por ejemplo,
en forma seca, liofilizada, congelada o disuelta. Además, el kit
puede comprender cualquier tampón, enzima, sal etc. adicional, que
son necesarios para el procedimiento mencionado anteriormente a
realizar.
Preferiblemente, el kit comprende una fase
sólida a la que se une al menos un anticuerpo
anti-PIBF o el fragmento del mismo o el PIBF o el
derivado del mismo o el fragmento del mismo. La fase sólida puede
ser cualquier fase sólida conocida para los especialistas en la
técnica, por ejemplo, cualquier material insoluble que pueda
proporcionar un sustrato sobre el que inmovilizar proteínas o
péptidos, por ejemplo, en forma de una tira seca. Dichos sustratos
pueden incluir nylon, aminoácidos, vidrio, celulosa o similares.
Este kit puede usarse preferiblemente para un ensayo competitivo o
de tipo sándwich por lo que se añaden a la fase sólida el reactivo
adicional que comprende el anticuerpo o el PIBF, dependiendo del que
se inmovilice en la fase sólida, y la muestra.
Preferiblemente, el PIBF presente en el kit
mencionado anteriormente es recombinante lo que significa que, por
supuesto, también el derivado del mismo y el fragmento del mismo,
respectivamente, son recombinantes.
Un kit preferido comprende un reactivo adicional
que comprende un segundo anticuerpo anti-PIBF o un
fragmento del mismo que se une a un epítope del PIBF que es distinto
del epítope reconocido por el primer anticuerpo
anti-PIBF o el fragmento del mismo. Este kit es
particularmente ventajoso para realizar un ensayo tipo sándwich.
El kit mencionado anteriormente de acuerdo con
la presente invención es preferiblemente para diagnosticar un tumor
en un paciente y para determinar el progreso de un tumor en un
paciente, respectivamente. Los procedimientos son iguales a los
descritos anteriormente, por lo que se usa el reactivo que comprende
el PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo a la
concentración definida como control positivo como se ha descrito
anteriormente o para realizar un ensayo competitivo como se ha
descrito anteriormente (por lo que se usa en competición con el PIBF
presente en la muestra del paciente) o ambos.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de un anticuerpo anti-PIBF o un
fragmento del mismo para la preparación de una medicina
anti-tumoral. El anticuerpo
anti-PIBF o el fragmento del mismo bloquea
específicamente o neutraliza PIBF, por lo que se elimina
específicamente la actividad PIBF en tumores volviendo de este modo
al tumor susceptible a NK (y potencialmente la lisis mediada por
células CD8+ y otras células T). Además, anticuerpos mono y
biespecíficos pueden reconocer específicamente PIBF en una
superficie de las células tumorales y pueden usarse para suministrar
sustancias tóxicas a los compartimientos tumorales del cuerpo del
paciente. La estrategia principal de la medicina
anti-tumoral es el uso del conocimiento de que las
células tumorales producen concentraciones más elevadas de PIBF. Con
esta información que es la base de la presente invención, pueden
desarrollarse diversas estrategias para combatir un tumor en un
paciente.
De acuerdo con una realización preferida, el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, humanizado, y de cadena
sencilla, respectivamente. Los anticuerpos depositados mencionados
anteriormente también pueden usarse para este aspecto de la presente
invención.
Preferiblemente, el anticuerpo tiene unido al
mismo una molécula. En este caso, el anticuerpo
anti-PIBF se usa como un mecanismo de dirección o
suministro para llevar una molécula, por ejemplo, un agente
farmacéutico, a células o tejidos que expresan PIBF. El anticuerpo
que se administra al paciente se une al tumor que expresa PIBF y por
lo tanto pone la molécula que es tóxica para el tumor en contacto
directo con el tumor. Hay diversos procedimientos y moléculas se que
usan que son conocidos para los especialistas en la técnica. Por
ejemplo, puede usarse una molécula tóxica que entrará en las células
tumorales e impedirá por ejemplo las etapas metabólicas esenciales
eliminando de este modo las células. Además, la molécula tóxica
puede inducir la lisis celular o actuar como un receptor para otras
sustancias tóxicas o enzimas que eliminarán las células tumorales.
Sin embargo, independientemente del modo en que funcione la molécula
tóxica, el punto principal es que la molécula se dirige
específicamente a las células tumorales por el anticuerpo
anti-PIBF y no interfiere con células sanas.
La molécula preferiblemente puede ser una
sustancia tóxica y un profármaco, respectivamente, en particular un
radionúclido, una toxina y un fármaco quimioterapéutico,
respectivamente. Suministrando la sustancia a los tumores diana se
consigue una medicina anti-tumoral eficaz.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere al uso de PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del
mismo para la preparación de una medicina
anti-tumoral. Hay dos estrategias para estas
medicinas anti-tumorales de acuerdo con la presente
invención:
- Se usa un derivado de PIBF o un fragmento del
mismo como proteína o péptido inhibidor que impide la acción de PIBF
a través de la unión y por lo tanto el bloqueo o la inactivación de
receptores putativos para PIBF presentes en las células, por
ejemplo, células NK, o inhibe los componentes de señalización aguas
debajo de la unión al receptor.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, la medicina es una vacuna. El derivado de PIBF o
el fragmento del mismo comprende el péptido inmunogénico de PIBF y
puede usarse para la vacunación para inducir respuestas de células T
citotóxicas anti-tumorales específicas de antígeno
y/o para estimular la producción de anticuerpos neutralizantes por
el sistema inmune del propio paciente con cáncer que liberaría las
células NK a partir de la supresión por PIBF.
Preferiblemente, la vacuna comprende un
adyuvante. Dicho adyuvante puede ser, aunque sin limitación, por
ejemplo geles minerales de Freund tales como hidróxido de aluminio y
sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles
plurónicos, polianiones, policationes (por ejemplo, poliArg),
péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y
dinitrofenol. Entre los adyuvantes preferiblemente usados en seres
humanos están BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum. Preferiblemente, el PIBF o el
derivado del mismo o el fragmento del mismo es una molécula
recombinante o sintetizada químicamente, respectivamente.
Un aspecto ventajoso de la presente invención se
refiere al uso de un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado
del mismo o un fragmento del mismo o molécula antisentido de PIBF
para la preparación de una medicina anti-tumoral. En
el alcance de la presente solicitud la expresión "polinucleótido
que codifica PIBF" o "secuencias de nucleótidos complementarias
a ARNm de PIBF" se refiere a una secuencia derivada de una
secuencia preferiblemente seleccionada entre el grupo constituido
por las SEC ID Nº 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26,
28, 30, 33, 35, 37 o fragmentos o derivados de las mismas.
Los genes que codifican PIBF pueden apagarse
transformando una célula o tejido con vectores de expresión que
expresan elevados niveles de un polinucleótido o un derivado del
mismo o un fragmento del mismo que codifica PIBF. Dichas
construcciones pueden usarse para introducir secuencias con sentido
o antisentido traducibles en una célula. Incluso en ausencia de
integración en el ADN, dichos vectores pueden continuar
transcribiendo moléculas de ARN hasta que se inutilicen por
endonucleasas endógenas. La expresión transitoria puede durar mes o
más con un vector no replicante e incluso más tiempo si los
elementos de replicación apropiados son parte del sistema de
vector.
Pueden obtenerse modificaciones de la expresión
génica diseñando moléculas, ADN, ARN, o PNA antisentido a las
regiones de control del gen que codifica PIBF, es decir, los
promotores, potenciadores, e intrones. Se prefieren oligonucleótidos
derivados del sitio de inicio de la transcripción, por ejemplo,
entre las posiciones -10 y +10 del sitio de inicio. De forma
similar, la inhibición puede conseguirse usando metodología de
apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de
triple hélice es útil porque causa la inhibición de la capacidad de
que la doble hélice se abra lo suficiente para la unión de las
polimerasas, factores de transcripción, o moléculas reguladoras. Las
moléculas antisentido también pueden diseñarse para bloquear la
traducción del ARNm evitando que el transcrito se una a los
ribosomas.
El término "antisentido" como se usa en
este documento se refiere a secuencias de nucleótidos que son
complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. Las
moléculas antisentido pueden producirse por cualquier procedimiento
incluyendo síntesis por ligamiento del gen o genes de interés en una
orientación inversa a un promotor viral que permite la síntesis de
una cadena complementaria. Una vez introducida en una célula esta
cadena transcrita se combina con las secuencias naturales producidas
por la célula para formar dúplex. Estos dúplex después bloquean la
transcripción o traducción adicional.
En un aspecto, las moléculas antisentido para el
polinucleótido que codifica PIBF pueden usarse en situaciones en las
que sería deseable bloquear la transcripción del ARNm. En
particular, las células pueden transformarse con secuencias
complementarias a polinucleótidos que codifican PIBF. Por tanto,
pueden usarse moléculas antisentido para modular la actividad PIBF,
o para conseguir la regulación de la función génica. Dicha
tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y pueden diseñarse
oligómeros o fragmentos más grandes con sentido o antisentido a
partir de diversas localizaciones a lo largo de las regiones
codificantes o de control de secuencias que codifican PIBF.
Los vectores de expresión derivados de
retrovirus, adenovirus, herpes virus o virus vaccinia, o de diversos
plásmidos bacterianos pueden usarse para suministrar secuencias de
nucleótidos al órgano, tejido o población celular tumoral diana.
Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos para los
especialistas en la técnica para construir vectores recombinantes
que expresarán moléculas antisentido complementarias a los
polinucleótidos del gen que codifica PIBF.
También pueden usarse ribozimas, moléculas de
ARN enzimático, para catalizar la escisión específica del ARN. El
mecanismo de la acción de las ribozimas implica hibridación
específica de secuencia de la molécula ribozima al ARN diana
complementario, seguido por escisión proteolítica. Los ejemplos que
pueden usarse incluyen moléculas de ribozima con motivo de cabeza de
martillo modificadas que pueden catalizar específica y eficazmente
la escisión endonucleotídica de secuencias que codifican PIBF.
Los sitios de escisión específicos de ribozima
en cualquier ARN diana potencial se identifican inicialmente por
exploración de la molécula diana para los sitios de escisión por
ribozimas que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC.
Una vez identificados, pueden evaluarse cortas secuencias de ARN de
entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen
diana que contiene el sitio de escisión para características de
estructura secundaria que pueden volver al oligonucleótido
inoperativo. Lo adecuado de las dianas candidatas también puede
evaluarse ensayando la accesibilidad a la hibridación con
oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de
ribonucleasas.
Las moléculas antisentido y ribozimas de la
invención pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en
la técnica para la síntesis de moléculas de ácido nucleico. Estas
incluyen técnicas para sintetizar químicamente oligonucleótidos
tales como síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Como
alternativa, pueden generarse moléculas de ARN por transcripción
in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican
PIBF. Dichas secuencias de ADN pueden incorporarse en una amplia
diversidad de vectores con promotores para la ARN polimerasa
adecuados tales como T7 o SP6. Como alternativa, estas
construcciones de ADNc que sintetizan ARN antisentido de forma
constitutiva o inducible pueden introducirse en líneas celulares,
células, o tejidos.
Pueden modificarse moléculas de ARN para
aumentar la estabilidad intracelular o semi-vida.
Las posibles modificaciones incluyen, aunque sin limitación, la
adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la
molécula o el uso de fosforotioato o 2'O-metilo en
lugar de enlaces con fosfodiesterasa en la estructura de la
molécula. Este concepto es inherente en la producción de PNA y puede
extenderse en todas estas moléculas por la inclusión de bases no
tradicionales tales como inopina, queosina, y wybutosina, así como
formas modificadas con acetilo, metilo, tio, y de forma similar, de
adenina, citidina, guanina, timina, y uridina que no se reconocen
tan fácilmente por las endonucleasas endógenas.
Están disponibles muchos procedimientos para
introducir vectores en células o tejidos y son igual de adecuadas
para su uso in vivo, in vitro, y ex vivo. Para
terapia ex vivo, pueden introducirse vectores en células
madre tomadas del paciente y propagarse clonalmente para el
transplante autólogo de nuevo en el mismo paciente (transplante de
células madre alogénicas). El suministro por transfección y por
inyecciones de liposomas puede conseguirse usando procedimientos que
son bien conocidos en la técnica.
Puede aplicarse cualquier medicina
anti-tumoral descrita anteriormente para cualquier
sujeto adecuado incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como
perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y más
preferiblemente, seres humanos.
Un aspecto adicional de la presente invención es
un procedimiento para tratar a un paciente con un tumor,
comprendiendo dicho procedimiento administrar al paciente una
cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PIBF o un
fragmento del mismo.
En dos publicaciones
(Szekeres-Bartho y col., Am. J. Reprod. Immuno. 24,
105, 1990; Szekeres-Bartho y col., Cell. Immunol.
177, 194, 1997) se demostró que la adición de un anticuerpo
anti-PIBF neutralizante impide un resultado de
embarazo exitoso en ratones. Además, PIBF aislado de sobrenadantes
de cultivo de linfocitos murinos tratados con progesterona cuando se
inyectan in vivo, evitaba el efecto abortivo de los fármacos
anti-progesterona. Estos datos sugieren que estos
reactivos podrían actuar de un modo similar en pacientes con cáncer
o enfermedades
autoinmunes.
autoinmunes.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para el tratamiento de un tumor en un paciente,
comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad eficaz de
PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo.
Otro aspecto preferido de la presente invención
se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un tumor en un
paciente, comprendiendo dicho procedimiento administrar una cantidad
eficaz de un polinucleótido que codifica PIBF o un derivado del
mismo o un fragmento del mismo o molécula antisentido de PIBF.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una preparación farmacéutica para el tratamiento de un tumor en un
paciente, comprendiendo dicha preparación un anticuerpo
anti-PIBF o un fragmento del mismo, PIBF o un
derivado del mismo o un fragmento del mismo, y un polinucleótido que
codifica PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o
molécula antisentido de PIBF, respectivamente. Por supuesto, de
nuevo aquí, se aplican las mismas definiciones y realizaciones
preferidas mencionadas anteriormente.
La preparación farmacéutica puede administrarse
sola o en combinación con al menos un agente diferente tal como un
compuesto estabilizante que puede administrarse en cualquier
vehículo farmacéutico biocompatible estéril incluyendo aunque sin
limitación solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y
agua. Las preparaciones farmacéuticas pueden administrarse a un
paciente solas o en combinación con otros agentes, fármacos u
hormonas. Las preparaciones farmacéuticas utilizadas para el
procedimiento para el tratamiento de un tumor en un paciente pueden
administrarse por cualquiera de varias vías incluyendo aunque sin
limitación por un medio oral, intravenoso, intramuscular,
intra-arterial, intramedular, intratecal,
intraventricular, transdérmico, subcutáneo, intraperitoneal,
intranasal, enteral, tópico, sublingual o rectal.
Además de los ingredientes activos, estas
composiciones farmacéuticas pueden comprender vehículos
farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y
auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos
en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Los vehículos
posibilitan que las preparaciones farmacéuticas se formulen como
comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes,
pastas, suspensiones y similares.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención también se refiere a una proteína recombinante con una
actividad PIBF de acuerdo con la SEC ID Nº 1 y derivados de la
misma. Esta proteína PIBF de acuerdo con la presente invención tiene
actividad PIBF completa comparable con PIBF natural (que comprende
la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº 2) pero no muestra los
aminoácidos 595 a 614 exactos así como el aminoácido Nº 333 de
acuerdo con la secuencia de PIBF natural (SEC ID Nº 2). La secuencia
proteica de la proteína PIBF recombinante de acuerdo con la presente
invención (SEC ID Nº 1) comprende 757 restos aminoacídicos. La
presente invención, por lo tanto, proporciona nuevas proteínas PIBF
recombinantes que tienen la secuencia de la SEC ID Nº 1 o derivados
u homólogos de las mismas. Por lo tanto, la proteína recombinante
con una actividad PIBF de acuerdo con la presente invención
comprende
- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
SEC ID Nº 1 o
- una secuencia de aminoácidos con una identidad
de aminoácidos de al menos el 98% con la secuencia de acuerdo con la
SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A o
- una secuencia de aminoácidos de identidad de
aminoácidos de al menos el 95% con la secuencia de los restos
aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1 como se determina por el
algoritmo FAST/A y
- una actividad PIBF de al menos el 50% de la
molécula de PIBF humana natural.
La actividad PIBF puede definirse y
cuantificarse como inhibición de NK o CTL. La inhibición de NK se
considera cuando en presencia de PIBF las demás células efectoras
eficaces (ensayadas en ausencia de PIBF) se paralizan, es decir el
reconocimiento y unión (conjugación) o eliminación de las células
diana, se reduce como una función de la concentración de PIBF. La
actividad puede expresarse como porcentaje de inhibición/\mug de
PIBF o sustancias similares en comparación con la ausencia de PIBF.
Esta similitud se aplica a la actividad inhibidora de CTL
(Szekeres-Bartho y col., Cell. Immunol. 177 (1997),
194-199), Szekeres-Bartho y col.,
Am. J. Reprod. Immunol. 24, 105, (1990)). Además, la actividad PIBF
puede definirse y cuantificarse como potenciación de Th2 que se mide
cuantificando las linfoquinas Th2 (IL-3,
IL-4, IL-6, IL-10)
frente a Th1 (IL-12, IFN-\gamma),
a nivel proteína o a nivel ARNm, y después tomando la proporción de
las señales Th2 frente a Th1. Un aumento en las citoquinas Th2 y una
disminución concomitante en las citoquinas Th1 indican una
potenciación de Th2. Puede expresarse como un aumento en el
porcentaje de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
positivas a citoquinas Th2 o una disminución en el porcentaje de las
positivas a citoquinas Th1/\mug de PIBF. También es apropiado
medir las cantidades absolutas de estas citoquinas (de acuerdo con
procedimientos convencionales de la bibliografía) secretadas en el
sobrenadante de cultivo o en fluidos corporales como una función de
la concentración de PIBF. Los ARNm de citoquinas pueden medirse por
ensayos basados en RT-PCR cuantitativa convencional,
Szekeres-Bartho y col., AJRI 35 (1996),
348-351, Szekeres-Bartho y col., Am.
J. Reprod. Immunol. 23, 26, (1990), Szekeres-Bartho
y col., Am. J. Ob. Gyn. 163, 1320,
(1990).
(1990).
A pesar de las diferencias significativas en la
secuencia de aminoácidos de la proteína PIBF de acuerdo con la
presente invención en comparación con la secuencia de PIBF humana
natural es posible producir una proteína recombinante con una
secuencia definida anteriormente (SEC ID Nº 1) mostrando dicha
proteína recombinante similitudes funcionales particularmente
elevadas con la proteína natural.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la proteína recombinante comprende una secuencia
de aminoácidos dada a partir de los restos aminoacídicos 300 a 350
en la SEC ID Nº 1. El aminoácido Nº 333 en la proteína PIBF humana
natural (SEC ID Nº 2) es Cys en lugar de Arg en la proteína PIBF
recombinante de acuerdo con la presente invención (SEC ID Nº 1). Por
lo tanto, la proteína recombinante de acuerdo con la presente
invención comprende preferiblemente una Arg como aminoácido Nº 333
de acuerdo con la SEC ID Nº 1 y una actividad PIBF considerable
(>50%). Sin embargo, puede comprender en uno o ambos extremos
restos aminoacídicos adicionales que son idénticos a, homólogos a o
diferentes de los restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1 siempre que
la proteína recombinante muestre una actividad PIBF de al menos el
50% de la molécula PIBF humana natural.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención la proteína recombinante comprende una secuencia
de aminoácidos dada a partir de los restos aminoacídicos 580 a 630
de la SEC ID Nº 1 y una actividad PIBF considerable (>50%). Esta
proteína recombinante, por lo tanto, comprende la secuencia del PIBF
de la invención entre los restos aminoacídicos 580 a 630 de la SEC
ID Nº 1. Puede comprender adicionalmente en uno o ambos extremos
restos aminoacídicos adicionales que son idénticos a, homólogos a o
diferentes de los restos aminoacídicos de la SEC ID Nº 1 siempre que
la proteína recombinante muestre una actividad PIBF de al menos el
50% de una molécula de PIBF humana natural.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención se proporciona una proteína con actividad PIBF
que comprende
- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
SEC ID Nº 4 o
- un aminoácido con una identidad de aminoácido
de al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, más
preferiblemente el 99%, con la secuencia de acuerdo con la SEC ID Nº
4 como se determina por el algoritmo FAST/A
Esta proteína ha demostrado ser una proteína de
89 kDa con una actividad PIBF aislada de un ratón. Esta secuencia de
aminoácidos es particularmente ventajosa con respecto a aspectos
para detectar, diagnosticar y analizar tumores, sustancias
anti-tumorales, sustancias carcinogénicas en ratones
pero también otros animales de laboratorio. Además, con la ayuda de
esta proteína de la invención se pueden realizar ensayos en
animales, por ejemplo, ratones, cobayas, hámster, ratas, con una
predisposición a un tumor. Otro aspecto se refiere a animales, en
particular ratones, en los que esta proteína está inhibida o está
bloqueada su actividad. Esto puede realizarse, por ejemplo,
proporcionando análogos de patrones de unión de esta proteína.
Un aspecto preferido de la presente invención se
refiere a una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
con una identidad de al menos el 85%, preferiblemente al menos el
90%, más preferiblemente al menos el 95% como se determina por el
algoritmo FAST/A con una secuencia seleccionada entre el grupo
constituido por las SEC ID Nº 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25,
27, 29, 31, 32, 34 y 36, siendo dicha proteína una proteína PIBF
procesada de forma alternativa. Se ha demostrado que las moléculas
de ARNm procesadas de forma alternativa están presentes en
diferentes tejidos y por lo tanto expresan también proteínas
procesadas de forma alternativa. Sorprendentemente, estas proteínas
procesadas de forma alternativa están presentes en tejidos tumorales
a otra concentración en comparación con tejidos sanos. Esto puede
usarse ventajosamente para detectar y analizar tumores en una
muestra por lo que se prefieren particularmente las SEC ID Nº 6 y 8
ya que éstas son dos formas de PIBF más pequeñas encontradas en
tumores primarios humanos, la SEC ID Nº 6 en adenocarcinoma gástrico
y la SEC ID Nº 8 en adenocarcinoma endometrial. Los equivalentes
tisulares normales de los mismos pacientes no expresaban niveles
detectables de estas variantes de corte y empalme de ARNm de PIBF.
Sin embargo, también se ha demostrado que los exones 17 y 18 están
incluidos en casi todas las formas identificadas. Por lo tanto, los
péptidos que comprenden estos exones son particularmente ventajosos.
La expresión "proteínas PIBF con corte y empalme alternativo"
se refiere a proteínas que se obtienen de proteínas con actividad
PIBF.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención proporciona una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la proteína recombinante descrita anteriormente con una actividad
PIBF de acuerdo con la presente invención. Por supuesto,
adicionalmente es posible que la molécula de ácido nucleico
comprenda una secuencia adicional que codifica al menos una segunda
proteína diferente a la proteína PIBF, proporcionando de este modo
una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión
que comprende al menos en una parte un péptido con actividad
PIBF.
Con respecto a la molécula de ácido nucleico de
ratón, por ejemplo, la SEC ID Nº 5 o un fragmento de la misma, se
usa preferiblemente para producir ratones knock out, por ejemplo,
ratones en los que la expresión del gen de PIBF o un fragmento del
mismo está bloqueado o inhibido. Por ejemplo, esto se realizará
proporcionando un ácido nucleico de PIBF de ratón antisentido o
fragmento del mismo, que es una estrategia que se ha descrito
anteriormente. Otro aspecto de la presente invención, por lo tanto,
se refiere a ratones knock out que muestran una expresión inhibida o
reducida de la proteína PIBF activa.
Preferiblemente, se proporciona una molécula de
ácido nucleico que codifica una proteína PIBF procesada de forma
alternativa que comprende una secuencia de ácido nucleico con una
identidad de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más
preferiblemente al menos el 95% con una secuencia elegida entre el
grupo constituido por las SEC ID Nº 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21,
22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 y 37 o
- una secuencia que híbrida en condiciones
rigurosas con una de las secuencias anteriores o
- una secuencia que está degenerada debido al
código genético, de una de las secuencias anteriores.
Éstas son secuencias de ácido nucleico que
corresponden a moléculas de ARNm con corte y empalme alternativo
encontradas en diversos tejidos por lo que particularmente la SEC ID
Nº 7 y la SEC ID Nº 9 se refieren a moléculas de ARNm con corte y
empalme alternativo que se encontraron solamente en tejidos
tumorales, sin embargo, los tejidos normales no comprendían estas
secuencias de ARNm. Por lo tanto, particularmente éstas son
ventajosas cuando se detectan o analizan tumores así como células y
tejidos sanos.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a un vector de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico de la invención.
Cuando se introduce el vector mencionado
anteriormente de acuerdo con la presente invención en un ARNm
huésped adecuado, se produce una cadena de ARN que proporciona la
traducción de la proteína recombinante con actividad PIBF de acuerdo
con la presente invención o una proteína de la invención.
El elemento regulador puede ser cualquier
elemento adecuado conocido para los especialistas en la técnica, en
particular, un promotor específico que se elige de acuerdo con el
huésped específico en el que tiene que introducirse el vector para
conseguir una producción máxima de proteína recombinante. El
elemento regulador puede comprender adicionalmente potenciadores que
potencian la transcripción.
Preferiblemente, el vector de ácido nucleico
comprende adicionalmente un marcador de selección. El marcador de
selección puede ser cualquier marcador adecuado que es bien conocido
para los especialistas en la técnica para seleccionar células u
organismos huésped en los que se ha introducido el vector. Dichos
marcadores de selección pueden ser, por ejemplo, cualquier gen que
codifique una proteína que confiere resistencia a antibióticos, o un
gen que codifique una proteína necesaria para el metabolismo
celular, por lo que las células u organismos huésped en los que
tiene que introducirse el vector mencionado anteriormente muestra
una deficiencia para esta proteína. El marcador de selección puede
ser adicionalmente cualquier gen que cambiará el fenotipo de la
célula u organismo huésped que ha captado el vector mencionado
anteriormente, por ejemplo, el color.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a una célula que comprende el vector mencionado
anteriormente de acuerdo con la presente solicitud. El vector puede
integrarse en el genoma de la célula o también estar presente como
ADN exógeno en el citoplasma siempre que se proporcione la
transcripción de la molécula de ácido nucleico complementaria. En el
alcance de la presente invención, el término "célula" comprende
cualquier célula procariota o eucariota. Estas células se usarán
preferiblemente para producir proteínas recombinantes con actividad
PIBF de acuerdo con la presente invención. Estas proteínas
recombinantes producidas pueden aislarse y purificarse de acuerdo
con procedimientos bien conocidos en la técnica y usarse
adicionalmente, por ejemplo, para la producción de preparaciones
farmacéuticas que comprenden proteínas recombinantes con actividad
PIBF de acuerdo con la presente invención.
La invención se describirá con mayor detalle por
los siguientes ejemplos y figuras pero por supuesto la invención no
se limita a los mismos.
La Figura 1 muestra un alineamiento de las
secuencias de aminoácidos de PIBF recombínate y de ratón
(natural).
La Figura 2 muestra una representación
esquemática de los exones e intrones de la región del gen de PIBF en
el cromosoma 13.
La Figura 3 muestra una transferencia de
northern para la detección de ARNm de PIBF en diferentes
tejidos.
La Figura 4 muestra el análisis
inmunohistoquímico de tumores primarios humanos.
Las Figuras 5A-5D muestran la
influencia del tratamiento anti-PIBF en la
eliminación dirigida por células NK de células tumorales.
Las Figuras 6A-6C muestran el
efecto del PIBF recombinante sobre la expresión de
IL-10 e IL-12 de linfocitos en
estado sin embarazado.
La Figura 7 muestra los niveles de PIBF en
muestras de orina de pacientes con tumores que no son adenocarcinoma
y tumores que no son sólidos.
La Figura 8 muestra la detección de niveles
elevados de PIBF con la ayuda de anticuerpos monoclonales y
policlonales.
La Figura 9 muestra la normalización de los
niveles de PIBF después de cirugía o quimioterapia.
La Figura 10 muestra los diferentes ARNm de PIBF
sobreexpresados en tumores primarios humanos.
La Figura 11 muestra la unión de PIBF a PBC
humanas.
La Figura 12 muestra ARNm de PIBF con corte y
empalme alternativo.
La Figura 1 muestra el alineamiento de PIBF
recombinante (humano) y de ratón (natural), siendo A la secuencia
recombinante, B la secuencia de ratón IC (clonada a partir de una
biblioteca de testículo de ratón), siendo C EST de ratón, en trozos
juntos de bibliotecas de dEST en base a las secuencias humanas, y
siendo D la secuencia bovina. X representa la secuencia de señal de
acuerdo con el procedimiento de predicción de PSG, y la secuencia de
señal de acuerdo con la predicción de GvH, z la señal de retención
de membrana ER, w el motivo de unión a ADN con patrón de cremallera
de leucina, v la señal de dirección peroxisomal, y u la señal de
localización nuclear.
\newpage
El gen de PIBF está localizado en el cromosoma
13. Hay varios intrones presentes en el gen de PIBF (véase la Figura
2), por lo que en el intrón 2 hay múltiples copias del elemento de
repetición Alu que sirve como un sitio para el corte y empalme
alternativo. Se muestra un hueco entre los contig genómicos.
La Figura 3 muestra una transferencia de
northern para la detección de ARNm de PIBF en diversos tejidos
normales: estómago (A), glándula tiroides (B), médula espinal (C),
ganglio linfático (D), tráquea (E), glándula suprarrenal (F), médula
ósea (G), bazo (H), timo (I), próstata (J), testículo (K), útero
(L), intestino delgado (M), colon (N), PBL (O), corazón (P), cerebro
(Q), placenta (R), pulmón (S), hígado (T), músculo esquelético (U),
riñón (V), páncreas (W). Las flechas de la Figura 4 indican 3
diferentes formas de ARNm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se buscaron entradas de EST en bibliotecas de
ADNc humano que coincidieran con la secuencia de PIBF humana. Se
encontraron 43 entradas que tienen secuencias de PIBF entre 2,2
millones de dEST depositadas en 3776 bibliotecas de ADNc humano.
Estas 43 entradas pertenecen a 27 bibliotecas diferentes. De las 27
bibliotecas 7 (25%) están originadas de tejidos normales (adulta sin
tumores, no embarazada). Es importante observar que, el testículo,
que es un tejido inmunoprivilegiado, frecuentemente indica la
presencia de ARNm de PIBF. De las 27 bibliotecas 13 contienen ARNm
expresado en tejidos tumorales (\sim50%). El resto es de tejido
fetal o embarazo. Esto muestra que PIBF se expresa preferentemente
durante el desarrollo, el embarazo y enfermedad. Sin embargo, la
cantidad de EST coincidentes puede correlacionarse con la abundancia
de ARNm pero depende enormemente de la calidad de la biblioteca. Por
esa razón no se puede tomar como una medición del nivel de expresión
directamente (véase la tabla I).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se estableció un ensayo basado en ELISA
competitivo para medir PIBF en la orina de pacientes con cáncer. Se
revistieron las placas de ELISA con PIBF humano recombinante a una
concentración de 2 \mug/ml. Se añadió IgG policlonal
anti-PIBF marcado con biotina junto con las muestras
a determinar para el contenido de PIBF. Cuanto mayor es la
concentración de PIBF en la muestra, menor es el valor de ELISA
correspondiente. En base a estas lecturas de ELISA se puede
determinar la concentración absoluta de PIBF.
Se recogieron muestras de orina de pacientes con
cáncer, y se usaron recientes o congeladas poco después de la
recogida y almacenadas a -20ºC hasta el análisis. Se determinó
previamente que los niveles de PIBF en el suero son
significativamente mayores en mujeres embarazadas sanas con relación
a niveles sin embarazo o embarazo patológico. Para validar el ensayo
de PIBF en orina de pacientes con cáncer, las muestras de orina de
mujeres embarazadas sanas e individuos no embarazados sanos normales
sirvieron como controles positivos y negativos, respectivamente. Los
resultados se resumen en la Tabla II. Los individuos normales
(sanos, no embarazados) tienen concentraciones bajas de PIBF en la
orina (5 ng/ml). La orina de mujeres embarazadas se caracterizó por
un promedio de concentración de 110 ng/ml de PIBF. Es importante
observar que los elevados niveles de PIBF vuelven rápidamente a la
normalidad después del aborto o parto. El análisis de muestras de
orina de 65 pacientes con tumor mostró claramente que pacientes que
tienen tumor tenían una cantidad significativamente mayor de PIBF en
su orina, que individuos no embarazados sanos, que varía de 5 a 180
ng/ml. Los pacientes con cáncer avanzado (tumor primario de gran
tamaño y/o metástasis) parecieron tener valores mayores,
ejemplificados por los datos sobre muestras de orina de pacientes
con tumor pulmonar que tienen un promedio de concentración de 28
frente a 43 ng/ml con o sin metástasis, respectivamente.
Estos datos indican que la concentración de PIBF
está relacionada con la masa tumoral, y la detección de PIBF en la
orina puede usarse para controlar el progreso y las recidivas de la
enfermedad. La elevación en la concentración de PIBF en la orina
como consecuencia de la presencia de un tumor que produce PIBF es
incluso más pronunciada, ya que no todos los tipos de tumores son
positivos a PIBF (\sim70-80% de los tumores
ensayados hasta ahora).
El tipo de tumor más dominante entre los
pacientes era cáncer pulmonar con 23 casos. La mayoría de los
pacientes con cáncer pulmonar tenían elevada concentración de PIBF.
La ausencia de elevado PIBF en la orina podría correlacionarse con
una patología clínica, concretamente después de la retirada del
tumor primario y en la remisión las concentraciones de PIBF fueron
significativamente inferiores o incluso normales.
Después de la demostración de la expresión de
PIBF por la línea celular MCF-7 (carcinoma del
epitelio mamario humano), se investigó una serie de tumores
primarios humanos para la expresión de PIBF. Llegó a ser obvio que
PIBF aparece en el sobrenadante de cultivo de células MCF7, lo que
sugiere que esta proteína se expresa y secreta de forma similar a lo
que se encontró con linfocitos en estado de embarazo o activados en
cultivo. De acuerdo con el análisis proteómico, los anticuerpos
anti-PIBF reconocen proteínas con dos tamaños
diferentes en el lisado celular por análisis de Western en 2D. Una
mancha de 34-kDa probablemente se corresponde a la
forma secretada. Se detecta otro doblete principal de
60-62 kDa, que podría se la forma de PIBF principal
asociada a las células.
Se analizó una diversidad de tumores primarios
humanos fijados con formalina ex vivo por inmunohistología
usando anti-suero policlonal de conejo generado por
inmunización con PIBF natural humano (34-kDa) o PIBF
recombinante (89-kDa). Los resultados muestran que
muchos tipos de tumores ensayados expresan PIBF o sustancias
relacionadas con PIBF, por ejemplo moléculas de PIBF de diferentes
longitudes, moléculas de PIBF de ARNm con corte y empalme diferente,
moléculas truncadas, proteínas de fusión, etc. (Tabla III). De los
27 tumores 15 (55%) mostraron fuerte tinción positiva. La carencia
de inmunotinción específica de los equivalentes de tejido normal
demuestra que las células transformadas expresan PIBF
diferencialmente (véase la Figura 4). En la Figura 4 columna
izquierda, indicado "A", se muestra el tejido normal, en la
derecha indicado "B", se muestran tejidos tumorales. En la
primera fila (indicada "1") se muestra cáncer pulmonar
(microcítico), en la segunda fila (indicada "2") carcinoma de
vejiga (células transitorias), y en la fila "3" cáncer de
estómago (adenocarcinoma). Estos datos también corroboran que PIBF
es positivamente un resultado de expresión por las propias células
tumorales, y no la unión de PIBF del fluido extracelular (secretado
por linfocitos infiltrantes).
En base a los resultados mencionados
anteriormente la producción de PIBF es un fenómeno bastante general
del estado maligno o indiferenciado, y como consecuencia, PIBF puede
servir como un marcador tumoral.
Tomados todos los datos en conjunto sobre la
importancia potencial de PIBF en la supresión de las respuesta
anti-tumorales, es plausible que PIBF producido
-secretado o expresado en la superficie celular- por células
tumorales inhibirá la actividad celular de eliminación sistémica o
localmente. Desde tiempo se ha sabido que hay líneas celulares que
son buenas dianas en ensayos de NK, otras no. La línea celular
tumoral humana, MCF-7 pertenece a la categoría de
malas dianas. Ciertamente una posibilidad es que la baja actividad
de eliminación contra estas células es el resultado de la producción
de PIBF, que inhibe la actividad NK, ya que la línea celular
MCF-7 ha demostrado producir PIBF. Para ensayar esta
posibilidad, se usaron células MCF-7 que expresan
PIBF como dianas en un ensayo de citotoxicidad celular sencillo de 4
horas, de acuerdo con Grimm y Bonavida "Frequency determination of
killer cells by a single cell cytotoxic assay"; Methods Enzymol
93, 270 (1983). En la Figura 5 se muestra que el tratamiento
anti-PIBF potencia la eliminación dirigida por
células NK de células tumorales: El menos y el más indican el
tratamiento con o sin IgG anti-PIBF, los números son
el porcentaje de actividad NK para las Figuras 5A y 5B y el
porcentaje de inhibición de actividad NK para las Figuras 5C y 5D.
La fuente de células NK eran PBMC recién aisladas de individuos
sanos. De hecho, el tratamiento de estas células tumorales con IgG
anti-PIBF aumentó drásticamente su sensibilidad a la
lisis mediada por NK, aproximadamente 8-10 veces
(Figura 5A). La actividad de eliminación básica contra células
MCF-7 es muy baja (1-2%), mientras
que elevados valores (50-80%) puede medirse cuando
se usan células K562 como células diana en ensayos paralelos. El
mismo tratamiento anti-PIBF, que parece ser eficaz
para aumentar la actividad diana de las células tumorales, sin
embargo, no tuvo efecto sobre una línea celular no tumoral (McCoy,
fibroblasto embrionario humano) (Figura 5B). Caracterizando miembros
representativos (dianas buenas frente a malas) de ambos grupos, se
puede hacer una correlación entre la expresión de PIBF y la
actividad de células NK. Además, este ensayo permite ensayar la
eficacia de PIBF exógeno para reducir la eliminación de células
dirigida por PIBF, y más importante, para evaluar la potencia de
anticuerpos neutralizantes anti-PIBF en la
estimulación de la lisis de células tumorales PIBF+. Se generan
anti-sueros neutralizantes de conejo
anti-humano y también anti-ratón por
lo que estos anticuerpos policlonales son capaces de inactivar PIBF
natural in vitro (cultivos de linfocitos humanos en ensayo de
NK) o in vivo (ratones preñados, como modelo animal). Por la
adición de PIBF recombinante a células K562 (como dianas) y PBMC
(como fuente de células NK), fue posible reducir la actividad de
eliminación basal en un 60-70% (Figura 5C). Los
anticuerpos generados contra PIBF recombinante retiraron esa
inhibición sobre la actividad de eliminación casi completamente
(Figura 5D).
Un mecanismo principal de la acción promotora
del embarazo de PIBF es la inducción de las citoquinas T_{H2}.
Ahora hay evidencias de que de que la forma recombinante de PIBF
también es activa para modular la expresión de citoquinas por
linfocitos de sangre periférica in vitro. Para ensayar la
funcionalidad del PIBF humano recombinante que se expresó en E.
coli y se purificó por la marca GST, se añadió rPIBF a
linfocitos periféricos en estado sin embarazo aislados por gradiente
de Ficoll-Paque y se cultivaron a 10^{6}/ml de
densidad celular. La producción de la linfoquina T_{H2} prototipo,
IL-10, se midió detectando y contando la cantidad de
linfocitos positivos a IL-10 (por inmunohistoquímica
en cytospins) después de 24 horas de tratamiento. El porcentaje de
linfocitos positivos a IL-10 aumentó como función de
la concentración de rPIBF de 0,35+/-0,15 a 3,5+/-1,5%. A la
concentración más elevada de rPIBF (10 \mug/ml) 10x había
presentes más linfocitos positivos a IL-10 que en
cultivos de control (Figura 6A). Se observó el efecto opuesto en
linfocitos que producen IL-12 (linfoquina T_{H1})
por el mismo tratamiento. La cantidad de linfocitos positivos a
IL-12 disminuyó como función de la concentración de
PIBF produciendo una reducción de aproximadamente 8 veces a la
cantidad más elevada de PIBF. La neutralización del efecto de PIBF
natural sobre la producción de citoquinas también fue exitosa. El
tratamiento de linfocitos en estado de embarazo (que producen PIBF)
con IgG anti-PIBF durante 3 horas produjo una
disminución significativa en la cantidad de células positivas a
IL-10 y un aumento significativo en la cantidad de
células positivas a IL-12 (Figuras 6B y C). Estos
resultados demuestran que la forma recombinante de PIBF es activa
para inducir la expresión de citoquinas T_{H2}. Más importante,
los anticuerpos neutralizantes pueden retirar PIBF activo producido
por células in vivo y por consiguiente potenciar las
citoquinas T_{H1}.
El valor diagnóstico de los niveles de PIBF en
orina en malignidades se ejemplifica adicionalmente usando muestras
de orina de pacientes con tumores que no son adenocarcinoma y
tumores que nos son sólidos (Figura 7); los puntos representan
resultados con sueros individuales. Se muestra las cantidades
promedio. N significa número de
pacientes.
pacientes.
Se caracterizan diferentes malignidades
hematológicas, especialmente linfomas (LY, N: 36), y también
leucemias (Leu, N=18), plasmacitomas (PL, N=11) y enfermedades
mieloproliferativas (MOP, N=7), por una concentración más elevada de
lo normal (control C, N=86) de PIBF de la orina (Figura 7A); A =
todos los tumores). Otros ejemplos son tumores de cabeza y cuello
(Figura 7C) y las malignidades del tracto urinario (Figura 7B) + =
con metástasis, N = 15; - = sin metástasis, N = 14. También es obvio
que la masa del tumor - que es enfermedad con o sin metástasis,
retirada del tumor - afecta enormemente a la concentración de PIBF
(Figura 7B, C).
Los anticuerpos policlonales se reemplazan en un
ensayo de tipo sándwich de captura de antígeno similar con un par de
anticuerpos monoclonales (ab) producidos en ratones usando rPIBF
N-terminal de 48-kDa como antígeno.
Se ensayaron aproximadamente veinte clones de hibridoma diferentes,
después cuatro clones estables y buenos productores seleccionados
para el ensayo de ELISA, y también para otros procedimientos de
diagnóstico (inmunohistoquímica). Estos clones de hibridoma se
depositan en el Hybridoma Cell Bank at the University Medical School
of Pécs. (Los números de depósito son 11-14/2001,
los códigos de línea celular: HYB255-258). Los
elevados niveles de PIBF en muestras de orina de pacientes con tumor
se detectan con los pares de anticuerpos monoclonales de forma
similar a los anticuerpos policlonales (Figura 8), por lo que C =
control, A = todos los tumores hematológicos, L = linfoma, Leu =
leucemia, P = plasmacitoma, N = no definido; Nº = número de
pacientes; POLI = ab policlonal, MONO = ab monoclonal.
La gran cantidad de datos también potencia no
sólo el diagnóstico, sino especialmente el potencial de control de
tumores de un ELISA de PIBF en orina y suero. El ensayo es capaz de
detectar y predecir el éxito y fallo terapéutico, ya que se muestra
por la normalización de los niveles de PIBF después de cirugía o
quimioterapia, y una elevación significativa en los pacientes con
recidiva (Figura 9A: tumores hematológicos, B: del tracto urinario)
ambos con los anticuerpos policlonales y monoclonales
anti-PIBF, por lo que C = control, B = antes del
tratamiento, REC = recidiva, REM = remisión.
Además del PIBF humano de longitud completa, se
identificó el ARNm de PIBF de ratón de longitud completa y la
secuencia proteica (SEC ID Nº 4, 5). El PIBF de ratón también se
organiza en 18 exones, y muestra una homología de aminoácidos del
89%.
Durante el intento de comparar los niveles de
ARNm de PIBF en tejidos normales y tumorales con
RT-PCR, se descubrieron varias formas de ARNm de
PIBF con corte y empalme alternativo. La estructura de los ARNm con
corte y empalme alternativo y los productos proteicos
correspondientes se resumen en la Tabla IV. Todas las formas
identificadas en una especie pueden existir y pueden tener funciones
similares en otra especie. Se ejemplifica por las formas proteicas
homólogas de PIBF de 35-kDa. Con la excepción de una
forma de ARNm que contiene un ADN con un exón 14' alternativo que es
una secuencia intrónica en el pre-ARNm predominante,
todos ellos se generaron saltando exones perfectos perdiendo varios
exones con relación a la longitud completa. Las secuencias de los
exones 17 y 18 se incluyen en casi todas las formas identificadas.
Se sugiere que las secuencias de aminoácidos codificadas por estos
exones son esenciales para la función de PIBF. Además, varias formas
de ARNm con diferentes secuencias producen secuencias diferentes en
este mismo polipéptido PIBF C-terminal con un peso
molecular predicho de 10-kDa. Las formas truncadas
de PIBF identificadas por análisis por RT-PCR de
muestras de ARN se aislaron de diferentes tejidos y líneas celulares
humanas (SEC ID Nº 6, Nº 10-20) y de ratón (SEC ID
Nº 8, 9, 23-37).
Las diferentes formas de PIBF se expresan de
forma diferencial y tienen diferentes tributos funcionales.
El ARNm de longitud completa (exones
1-18) codifica una proteína nuclear de
89-kDa. La bioinformática predice una
compartimentalización nuclear basada en las dos señales de
localización nuclear de los exones 7 y 13, y un dominio de unión a
ácido nucleico de los exones 14-16. De acuerdo con
el fraccionamiento celular y la transferencia de Western con
anticuerpos monoclonales anti-PIBF, la proteína de
89-kDa de hecho se localiza exclusivamente en las
fracciones nucleares. Hay formas de peso molecular más pequeño en
las fracciones citosólica y secretada de diferentes tumores
primarios humanos y de ratón, embriones y líneas celulares.
El ARNm de longitud completa puede encontrarse
en casi todos los tejidos en base a los análisis de Northern (Figura
3) y RT-PCR (Figura 10), sin embargo, en diferentes
cantidades. Se realizó una RT-PCR
semi-cuantitativa sobre pares coincidentes de tejido
tumoral/normal. Se amplificó la misma cantidad de ARN con pares de
cebadores del exón1/exón 18 (Figura 10A) y exón 2/exón 18
específicos de PIBF (Figura 10B) o con cebadores específicos de la
proteína ribosomal S9 (para control de carga) de las mismas
muestras. Las muestras son: 1 = ADNc de placenta, 2 = tumor de
estómago, 3 = estómago normal, 4 = tumor de útero, 5 = útero normal,
6 = Ctrl. Neg.: sin molde. Las células de crecimiento rápido, por
ejemplo en tumores y embriones, células de tejidos inmunes
privilegiados (testículo, placenta) contienen más ARNm de PIBF de
longitud completa. El análisis por RT-PCR de tumores
primarios humanos y la posterior clonación y secuenciación de ADN
del ADNc de PIBF revela que las formas de ARNm de PIBF procesadas de
forma alternativa se expresan de forma diferente. Se ejemplifica por
dos formas de PIBF más pequeñas encontradas en tumores primarios
humanos. La expresión de la forma de los exones
(1-5)-(17-18) en adenocarcinoma
gástrico y la de la forma de los exones 1-(13-18) en
adenocarcinoma endometrial se restringe a los tejidos tumores, ya
que los equivalentes de tejido normal de los mismos pacientes no
expresan niveles detectables de estas variantes de corte y empalme
de ARNm de PIBF. Es importante observar que tanto estos como otros
ARNm de PIBF procesados de forma alternativa también se encuentran
en tejidos de privilegio inmune (placenta, embrión, testículo) y en
células inmunes.
La función de PIBF también depende de la
estructura de la forma proteica madura. Una de las formas más
interesantes está codificada por el ARNm de los exones
2-3-4-5-17-18
frecuentemente encontrado en tejidos humanos y de ratón, tales como
placenta humana y de ratón, linfocitos humanos, embrión de ratón y
tumor gástrico humano. Codifica un polipéptido de 298 y 297
aminoácidos de longitud con un peso molecular predicho de
35-kDa. (SEC ID Nº 6, 7 para seres humanos, SEC ID
Nº 8, 9 para ratón). Las dos proteínas son un 86% homólogas. El
análisis FACS revela que la forma de 35-kDa se une
específicamente a células inmunes humanas (Figura 11): tinción por
FACS de PBMC humanas con PIBF de 35-kDa y
anticuerpos contra \alpha-PibF
(anti-FITC de conejo). Las células se muestran en la
región de células monocitos (Figura 11A) y en la zona de linfocitos
(Figura 11B). M es la cantidad de células en la zona de
fluorescencia aumentada expresada en porcentaje (%), los números se
refieren a: 1 = PBMC + anti-exón 17 de PIBF, 2 =
PMBC + PIBF-35 kDa (1 \mug) +
anti-exón 17, 3 = PBMC + PIBF-35 kDa
(5 \mug) + anti-exón 17, 4 = PBMC +
PIBF-35 kDa (15 \mug) + anti-exón
17. La unión a linfocitos y monocitos humanos sugiere un receptor de
PIBF en estas células inmunes. Una versión truncada de rPIBF que
tiene el exón 1-9 (48-kDa), que
tiene la parte N-terminal de esta forma de PIBF
funcional y que carece de la parte C-terminal (exón
17-18) no es funcional en términos de unión a
células inmunes (datos no mostrados).
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\newpage
Las Figuras 12A a 12Q muestran las proteínas
PIBF procesadas de forma alternativa por lo que los exones se
representan esquemáticamente:
La Figura 12A muestra el PIBF de
89-kDa de longitud completa de ratón (SEC ID Nº 4),
la Figura 12B muestra los exones
(1-5)-(17-18) que se encuentran en
tumor de estómago, placenta terminal humana, linfocitos masculinos y
femeninos, linfocitos femeninos en estado de embarazo (SEC ID Nº 6),
la Figura 12C muestra los exones
(1-5)-(17-18), encontrados en
placenta y embrión de ratón (SEC ID Nº 8), la Figura 12D muestra los
exones 1-(13-18) (SEC ID Nº 11), la Figura 12E
muestra los exones 1-(15-18), encontrados en células
MCF-7 y linfocitos en estado de embarazo (SEC ID Nº
12), la Figura 12F muestra parte del intrón 14 y los exones
15-18, encontrados en una biblioteca de ADNc de
leucocitos (SEC ID Nº 13), la Figura 12G muestra los exones 1 +
(9-10) + (12-15) +
(17-18), encontrados en células
MCF-7 y linfocitos en embarazo (SEC ID Nº 14), la
Figura 12H muestra los exones 1 + (3-7) +
(9-10) + 12 + (17-18), encontrados
en células MCF-7 - línea de células de tumor de mama
humano (SEC ID Nº 17), la Figura 12I muestra los exones
(1-7) + (9-15) +
(17-18), encontrados en células
MCF-7 - línea de células de tumor de mama humano
(SEC ID Nº 19), la Figura 12J muestra los exones
(1-7) + (9-10) + 12 +
(17-18), encontrados en células
MCF-7 -línea de células de tumor de mama humano (SEC
ID Nº 22), la Figura 12K muestra los exones
(1-2)-(17-18) encontrados en embrión
y placenta de ratón (SEC ID Nº 23), la Figura 12L muestra los exones
(1-4)-(16-18) encontrados en
placenta de ratón (SEC ID Nº 25), la Figura 12M muestra los exones
(1-2)-(15-18) encontrados en
testículo de ratón (SEC ID Nº 27), la Figura 12N muestra los exones
1-11 18 encontrados en embrión de ratón (SEC ID Nº
29), la Figura 12O muestra los exones
(1-11)-18 encontrados en embrión de
ratón (SEC ID Nº 31), la Figura 12P muestra los exones
1-(8-14)-(17-18) encontrados en
embrión de ratón (SEC ID Nº 34) y la Figura 12Q muestra los exones
(1-1)-(15-18) encontrados en
testículo de ratón (SEC ID Nº 36).
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<141>
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<160> 37
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>757
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 758
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2715
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 756
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ratón
\newpage
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 2719
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> ratón
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 957
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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<210> 8
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<211> 297
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 1173
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 87
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 983
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 689
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 12
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 118
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 70
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 1173
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 185
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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fragmento
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<223> Descripción de Secuencia Artificial:
fragmento
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<213> Secuencia Artificial
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fragmento
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<400> 37
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Claims (38)
1. Un procedimiento para diagnosticar un tumor
en un paciente, comprendiendo dicho procedimiento medir la
concentración de PIBF (Factor de Bloqueo Inducido por Progesterona)
o un derivado del mismo o un fragmento del mismo en una muestra
tomada del paciente y determinar si la concentración de PIBF en la
muestra que está por encima o por debajo de un valor umbral
predeterminado, mediante la concentración por encima del valor
umbral identifica un paciente con un tumor.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 caracterizado porque el tumor es un
carcinoma epitelial, especialmente un carcinoma pulmonar, un
carcinoma de colon o un carcinoma de mama.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 caracterizado porque la muestra es un
fluido corporal, especialmente orina o suero.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2 caracterizado porque la muestra es una
muestra tisular.
5. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque
el valor umbral es la concentración de PIBF en una muestra de una
persona sana.
6. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque
el valor umbral se determina midiendo la concentración de PIBF en al
menos una persona sana en paralelo a la determinación de la
concentración de PIBF en una muestra del paciente.
7. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque
como control positivo se mide la concentración de PIBF o un derivado
del mismo o un fragmento del mismo en la muestra que comprende una
concentración definida de PIBF o un derivado del mismo o un
fragmento del mismo en paralelo a la determinación de la
concentración de PIBF en la muestra del paciente.
8. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque
la concentración de PIBF en la muestra se mide de forma
inmunológica, en particular por un ensayo competitivo, por un ensayo
de tipo sándwich, por inmunotinción o combinaciones de estos
procedimientos.
9. El procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque
la concentración de PIBF en la muestra se mide indirectamente
midiendo la concentración de ARNm de PIBF en la muestra.
10. Un procedimiento para determinar el progreso
positivo o negativo de un tumor en un paciente que comprende
diagnosticar un tumor en un paciente de acuerdo con un procedimiento
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y
determinar si la concentración medida de PIBF o un derivado del
mismo o un fragmento del mismo en la muestra está por encima o por
debajo de al menos una concentración medida previamente de PIBF o un
derivado del mismo o un fragmento del mismo en al menos una muestra
previamente tomada del mismo paciente, mediante la concentración por
encima de la concentración previamente medida identifica una
progresión positiva.
11. Uso de un anticuerpo
anti-PIBF, preferiblemente un anticuerpo monoclonal,
o un fragmento del mismo en un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
12. Uso de PIBF o un derivado del mismo o un
fragmento del mismo en un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12
caracterizado porque el PIBF es un PIBF recombinante.
14. Un kit que comprende un primer reactivo que
comprende al menos un anticuerpo anti-PIBF o un
fragmento del mismo y un segundo reactivo que comprende PIBF o un
derivado del mismo o un fragmento del mismo a una concentración
definida.
15. El kit de acuerdo con la reivindicación 14
caracterizado porque comprende una fase sólida a la que se
une el al menos un anticuerpo anti-PIBF o el
fragmento del mismo o el PIBF o el derivado del mismo o el fragmento
del mismo.
16. El kit de acuerdo con la reivindicación 14 ó
15 caracterizado porque el PIBF es recombinante.
17. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16 caracterizado porque comprende un
reactivo adicional que comprende un segundo anticuerpo
anti-PIBF o un fragmento del mismo que se une a un
epítope del PIBF que es distinto al epítope reconocido por el primer
anticuerpo anti-PIBF o el fragmento del mismo.
18. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17 para diagnosticar un tumor en un paciente y
para determinar la progresión de un tumor en un paciente,
respectivamente.
19. Uso de un anticuerpo
anti-PIBF, preferiblemente un anticuerpo monoclonal
anti-PIBF, especialmente anticuerpo
anti-PIBF humanizado, o un fragmento del mismo para
la preparación de una medicina anti-tumoral.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19
caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de cadena
sencilla.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 19 ó
20 caracterizado porque el anticuerpo tiene unida al mismo
una molécula.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21
caracterizado porque la molécula es una sustancia tóxica,
especialmente un radionúclido, un fármaco quimioterapéutico o una
toxina, y un profármaco, respectivamente.
23. Uso de PIBF o un derivado del mismo o un
fragmento del mismo para la preparación de una medicina
anti-tumoral.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23
caracterizado porque la medicina es una vacuna.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24
caracterizado porque la vacuna comprende adicionalmente un
adyuvante.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 ó
24 caracterizado porque el PIBF o el derivado del mismo o el
fragmento del mismo es recombinante.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 a
24 caracterizado porque el PIBF o el derivado del mismo o el
fragmento del mismo es una molécula sintetizada químicamente.
28. El uso de un polinucleótido que codifica
PIBF o un derivado del mismo o un fragmento del mismo o una molécula
antisentido de PIBF para la preparación de una medicina
anti-tumoral.
29. Proteína recombinante con una actividad de
Proteína Inmunomoduladora Inducida por Progesterona (PIBF), que
comprende
- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
SEC ID Nº 1 o
- una secuencia de aminoácidos con un identidad
de aminoácidos de al menos el 98% con la secuencia de acuerdo con la
SEC ID Nº 1 como se determina por el algoritmo FAST/A o
- una secuencia de aminoácidos con una identidad
de aminoácidos de al menos el 95% con la secuencia de los restos
aminoacídicos 580 a 630 de la SEC ID Nº 1 como se determina por el
algoritmo FAST/A y
- una actividad PIBF de al menos el 50% de la
molécula PIBF humana natural.
30. Proteína recombinante de acuerdo con la
reivindicación 29, caracterizada porque comprende una
secuencia de aminoácidos dada desde los restos aminoacídicos 300 a
350 de la SEC ID Nº 1.
31. Proteína recombinante de acuerdo con la
reivindicación 29 ó 30, caracterizada porque comprende una
secuencia de aminoácidos dada desde los restos aminoacídicos 580 a
630 de la SEC ID Nº 1.
32. Proteína con una actividad PIBF que
comprende
- la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la
SEC ID Nº 4 o
- un aminoácido con una identidad de aminoácido
de al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, más
preferiblemente al menos el 99%, con la secuencia de acuerdo con la
SEC ID Nº 4 como se determina por el algoritmo FAST/A.
33. Proteína caracterizada porque
comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos
el 85%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al
menos el 95% como se determina por el algoritmo FAST/A con una
secuencia seleccionada entre el grupo constituido por las SEC ID Nº
6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 y 36,
siendo dicha proteína una proteína PIBF procesada de forma
alternativa.
34. Molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína recombinante con una actividad PIBF de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32.
35. Molécula de ácido nucleico que codifica una
proteína PIBF procesada de forma alternativa caracterizada
porque comprende una secuencia de ácido nucleico con una identidad
de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más
preferiblemente al menos el 95% con
- una secuencia seleccionada entre el grupo
constituido por las SEC ID Nº 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24,
26, 28, 30, 33, 35 y 37 o
- una secuencia que híbrida en condiciones
rigurosas con una de las secuencias anteriores o
- una secuencia que está degenerada debido al
código genético respecto a una de las secuencias anteriores.
36. Vector de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 34 ó 35
y un elemento regulador adecuado.
37. Vector de ácido nucleico de acuerdo con la
reivindicación 36, caracterizado porque comprende
adicionalmente un marcador de selección.
38. Célula, que comprende un vector de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36.
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