DE69737570T2

DE69737570T2 - Agentien zur präsymptomatischen Detektion, Prävention und Behandlung von Brustkrebs in Menschen

Info

Publication number: DE69737570T2
Application number: DE69737570T
Authority: DE
Inventors: Johanna E. Bergmann; Rick E. Preddie
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2017-08-23
Also published as: WO1998007851A3; DE69737570D1; WO1998007851A2; EP0991756A2; EP0991756B1; AU5939898A; CA2183900A1

Description

Gebiet der Erfindung:
Die Erfindung bezieht sich auf Reagenzien mit dem therapeutischen Potential zur Erkennung, der Prävention und der Behandlung von Brust-und Ovarialkrebs beim Menschen. Im Speziellen bezieht sich die Erfindung auf das Gen BREX, das bei der Entstehung von Brustkrebs involviert ist, auf das exprimierte Proteinprodukt und auf die Nutzung dieses Proteins als diagnostische Probe zur präsymptomatischen Erkennung von Brustkrebs sowie assoziierten Krebserkrankungen. Die Erfindung bezieht sich zusätzlich auf Nukleinsäuremoleküle, die die Expression dieses Genes beeinflussen. Die Erfindung bezieht sich zudem auf erst- und zweitgradige medizinische Anwendungen dieser Reagenzien.
Kreuzreferenz zu verwandten Patentanmeldungen:
Diese Patentanmeldung ist verwandt mit PCT/EP94/00651 , WIPO Veröffentlichungsnummer WO 94/21791 .
Hintergrund der Erfindung:
1. Brustkrebs
Brustkrebs trifft eine von zehn Frauen und einen von viertausend Männern. Ungefahr fünf Prozent dieser Fälle bei Frauen (0.025% bei Männern) werden mit vererbbaren Keimzellmutationen assoziiert. Der Rest wird nach allgemeiner Vermutung durch somatische Mutationen an zumeist nicht identifizierten Genen hervorgerufen und wird als „sporadisch" bezeichnet. Als eine Erbeigenschaft ist Brustkrebs eine der häufigsten Genkrankheiten in der industrialisierten Welt. Tatsächlich wird eine von 100 Frauen, die heute leben, aufgrund dieser Vererbung Brustkrebs entwickeln, es sei denn, dass eine Therapie für diese Krankheit gefunden wird. Ungefähr 40% dieser Fälle werden diagnostiziert, bevor der/die Patientin das Alter von 30 Jahren erreicht.
Zur Zeit gibt es weder eine Heilung für Brustkrebs noch eine nicht-invasive Methode zur Früherkennung der Krankheit. Brustkrebs wird derzeit mit chirurgischen Eingriffen, Endokrintherapie und Chemotherapie behandelt (Salmon, S.E., Semin,, 17:50-52 (1990); Hortobagyi, G.N., Breast Cancer Res. Treat 21:3-13 (1992)). Die Endokrintherapie resultiert in der vollständigen oder partiellen Remission bei lediglich 30% der Patienten/innen (Jiang, S.-Y. et al., J. Natl. Canc. Inst. 84:580-591 (1992); Muss, H.B., Breast Cancer Res. Treat 21:15-26 (1992)). Chemotherapie hat trotz der Entwicklung von neuen antineoplastischen Reagenzien nur beschränken Erfolg in der Behandlung von Brustkrebs (Hortobagzi, G.N., Breast Cancer Res. Treat 21:3-13 (1992)). Damit ist derzeit der chirurgische Eingriff die einzige bewährte Behandlung bei Brustkrebs; seine Anwendung war lange Zeit umstritten (Albert, S. et al., Cancer 41:2399-2408 (1978)). Der chirurgische Eingriff wird oft mit endokrintherapeutischen oder chemotherapeutischen Verfahren kombiniert.
Es wurde gefunden, dass biologische Agenzien wie Interferon und Interleukin die Fähigkeit haben, definierte anti-Tumorreaktionen (Antworten) zu produzieren. Leider haben solche Fortschritte noch nicht zu verbesserten Verfahren bei der Behandlung von Brustkrebs geführt (Hortobagyi, G.N., Breast Cancer Res. Treat 21:3-13 (1992)). Monoklonale Antikörper sind auch eingesetzt worden, um dem natürlichen Immunsystem zu helfen. Jedoch haben die derzeit verfügbaren Antikörper weder die Spezifität noch die Sensitivität, um Tumorzellen erfolgreich zu anzugreifen.
Die oben genannten Annäherungsweisen basieren hauptsächlich auf zwei überlappenden Hypothesen über den Ursprung von Brustkrebs. Eine Hypothese ist, dass Brustkrebs seinen Ursprung in der Brust hat und dann schrittweise Metastasen in den Lymphknoten bildet, bevor der ganze restliche Körper befallen wird. Das war der Anlass für die Anwendung von radikaler Mastektomie in Verbindung mit sehr frühzeitiger Diagnose. Die zweite Hypothese besagt, dass die Krankheit sehr früh in den Blutkreislauf eintritt und sich langsam ausbreitet (über 8-10 Jahre), bevor sie in der Brust durch Mammographie oder andere spezialisierte Untersuchungen erkannt wird. Dies gab den Anreiz für die Anwendung der chemischen Adjuvantien-Chemotherapie, die jedoch die Überlebensrate nicht verbesserte. Obgleich diese Überlegungen noch immer die klinischen Ansätze beherrschen, wird es immer offensichtlicher, dass das Zerstören der Tumorzellen nicht die Lösung ist, sondern dass vielmehr die Umgebung der Zellen verändert werden muss. Dies kann im Wesentlichen durch die Entschlüsselung und Manipulation der molekularen Ereignisse erfolgen, die die Expression von bisher unbekannten Genen, welche einen zerstörenden Einfluss auf Zellwachstum und -entwicklung haben, kontrollieren. Ein Krebs hervorrufender Umweltmechanismus besteht in der Zell-Exposition gegenüber „karzinogenen" Chemikalien oder Strahlung. Solche Exposition kann die DNS schädigen, wodurch es entweder zu einer Beeinträchtigung der Expression eines spezifischen Gens oder zur Produktion eines mutierten Gens kommen kann, oder auch zur Expression eines normalerweise lebenslang reprimierten Gens. Es kann dann zur unkontrollierten Proliferation der Zelle mit Tumorbildung in Folge kommen.
Experimentell hat man gefunden, dass zwei Klassen von kritischen Genen durch die erwähnten Bedingungen beeinflusst werden. Eine solche Klasse von Genen bezeichnet man als „Onkogene". Onkogene sind Gene, die normalerweise in einem ,inaktivierten' Zustand sind, die aber zum Beispiel durch Schädigung der DNS konvertiert werden in einen „aktivierten" Zustand und nun fähig sind, Tumorgenese (d.h. Tumorbildung) zu induzieren. Onkogene hat man in 15-20% der menschlichen Tumoren nachweisen können. Die Produkte der Onkogene („Onkoproteine") können je nach ihrem Vorkommen in der Zelle in zwei große Klassen unterteilt werden.
Onkogenprodukte, die im Zytoplasma aktiv sind, haben einfach zu identifizierende biochemische oder biologische Aktivitäten (Green, M.R., Cell 56:3 (1989)). Im Zellkern aktive Onkogenprodukte waren schwieriger zu charakterisieren. Einige (wie etwa E1A und myc) haben regulatorische Aktivität bei der Transkription, und man nimmt an, dass sich ihre Aktivität durch die transkriptionelle Aktivierung von zellulären Genen äußert (Kingston, R.E., Cell 41:3-5 (1985). Andere Onkoproteine im Zellkern scheinen eine komplexe Reihe von Aktivitäten zu haben (wie etwa DNS Bindungsaktivität, die Fähigkeit, virale DNS Synthese zu initiieren, ATPase Aktivität, Helicase Aktivität und transkriptionelle Regulationsaktivität (Green, M.R., Cell 56:1-3 (1989)).
Die zweite Klasse der Gene sind anti-Onkogene oder „Tumorsuppressionsgene". In ihrem natürlichen Zustand unterdrücken diese Gene Faktoren, welche Zellproliferation hervorrufen. Eine Schädigung solcher Gene führt zum Verlust dieser Suppressionsaktivität und führt dadurch manchmal zur Tumorgenese. Die Deregulierung des Zellwachstums, ein Haupt-Charakteristikum der Tumorzellproliferation, kann also entweder durch die Aktivierung von Oncogenen oder durch Inaktivierung von Tumorsuppressionsgenen verursacht werden (Weinberg, R.A., Scientific Amer., Sept. 1988, pp 44-51).
Onkogene und Tumorsupressionsgene unterscheiden sich durch eine grundlegende Eigenschaft. Die Onkogene, so weit man sie bisher identifiziert hat, sind ausschließlich in somatischen Zellen in Erscheinung getreten und können daher nicht ihre Wirkung auf die Keimzellen des Wirtes übertragen. Im Gegensatz dazu sind Mutationen in Tumorsuppressionsgenen in Keimzellen identifiziert worden, was bedeutet, dass diese auf die Nachkommen übertragbar sind.
Mutationen in drei Tumorsuppressionsgenen und einem putativen Tumoren unterdrückenden Gen sind vermutlich in vererbtem Brustkrebs involviert. Bis heute wird familiärer Brustkrebs beim Menschen mit Punktmutationen und Deletionen in vier Genen assoziiert, die auf drei verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind. Drei dieser vier Gene, BRCA1 auf Chromosom 17q21-23 (Miki, Yet al., Science, 265:66-71 (1994)), TP53 auf Chromosom 17p13 (Malkin D., et al., Science 250:1233-1237 (1990)) and "BRCA2" auf Chromosom 13q12-13 (Wooster A., et al., Science 265:2088-2090 1994; Nature 579:789-792 (1995)), spielen beim weiblichen Brust- und Ovarialkrebs eine Rolle. Das vierte Gen, der Androgenrezeptor auf Chromosom Xq11-12 (Wooster, A. et al., Nature Genet. 2:132-134 (1992)), and BRCA2 sind beim männlichem Brustkrebs involviert. Das KFLT Gen befindet sich in einer Region in der Nähe von BRCA2 auf Chromosom 13 und ist ein wahrscheinlicher Beteiligungs-Kandidat bei einigen Brustkrebs-Aspekten. Keimzell-Mutationen im Retinoblastomagen (RB Gen) sind bislang nicht mit Brust oder Ovarialkrebs in Verbindung gebracht worden, jedoch sind somatische Mutationen im RB Gen mit sporadischem Brustkrebs assoziiert, und somatische Mutationen im TP53 Gen mit sporadischem Brust-und Ovarialkrebs assoziiert worden (T'Ang, J.M. et al. Science 242:263-265 (1988)). Das Ausschleusen von BRCA1 aus dem Kern (oder die vollständige Abwesenheit) konnte man mit dem Vorkommen von Brustkrebs assoziieren (Chen Y., et al., Science 270:789-791 (1995)). Trotz der Tatsache, dass ungefähr 56 Keimzellmutationen im BRCA1 Gen entdeckt worden sind (Shattuck-Eidens D. et al., JAMA 273:535-541 (1995)), sowie etwa ein Dutzend im BRCA2 Gen (Wooster, et al., Nature 579:789-792 (1995)), scheinen somatische Mutationen in diesen Genen nicht mit Brust und/oder Ovarialkrebs assoziiert zu sein (Futreal A., et al., Science 266:120-122 (1994)).
Die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, Brustkrebs zu entwickeln, kann nicht auf Grund einer Genanalyse vorhergesagt werden, da das Fehlen einer Keimzellmutation keine Garantie dafür ist, nicht doch ein Opfer der Krankheit zu werden. Eine Frau mit normalen BRCA1, TP53 und (soweit bisher bekannt) BRCA2 Genen hat das gleiche Risiko die Krankheit zu bekommen, wie eine Frau mit einer hereditären Mutation in einem dieser Gene, selbst wenn die Krankheit im letzteren Fall ein wenig später im Leben auftritt. Tatsächlich entwickelt eine Person mit Prädisposition zu hereditärer Mutation mit hoher Wahrscheinlichkeit die Krankheit durch einen (bisher unbekannten) Faktor, der nicht mit der Mutation in Zusammenhang steht.
Wie bereits erwähnt haben nur ungefähr 5% alter Brustkrebsopfer Mutationen in wenigstens einem der prädisponierenden Gene. Die anderen 95% von Brustkrebsfällen werden als sporadischen Ursprungs angesehen. Die hohe Rate von sporadischem zu hereditärem Brustkrebs (19 zu 1) und die Tatsache, dass, abgesehen vom Eintrittalter, keine klinischen oder pathologischen Unterschiede zwischen familiärem und sporadischem Brust-und Ovarialkrebs bestehen (Lynch, H.T., et al., Gynecol. Oncol. 36:48-53 (1990), sind klare Indikationen dafür, dass Mutationen in Brustkrebs-assoziierten Genen nicht die direkte Ursache für die pathologischen Symptome der Krankheit sind. Es müssen vielmehr gemeinsame biochemische Faktoren durch einerseits die Mutationen in allen prädisponierenden Genen und andererseits die anderen "sporadischen Ursachen" in Mitleidenschaft gezogen sein. BRCA1 scheint ein allen Formen von Brustkrebs ein gemeinsamer Faktor zu sein, jedoch sind weder die Ausschaltung noch Mutationen der ursächliche Faktor. Der ursächliche Faktor muss an einem Punkt angreifen, der vor der Ausschaltung der Tumorsuppresionsaktivitat von BRCA1/BRCA2 liegt. Diese letztere Aktivität kann im Zusammenhang mit transkriptionellen Aktivitätsfunktionen dieser beiden Gene stehen (Milner, J. et al., Nature 386:772-773 (1997)).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand dieser Erfindung war, natürlich vorkommende Moleküle zu entdecken, welche in einer Krankheits-spezifischen Weise exprimiert werden und als spezifische, universell einsetzbare diagnostische Marker für Brust-und Ovarialkrebs (Brustkrebs) genutzt werden können, und zudem potentielle Zielmoleküle für Therapeutika zur Behandlung von Brustkrebs sind.
Dementsprechend beschreibt das vorliegende Patent einen Ansatz, den wir entwickelt haben, der Krankheits-spezifische Gene entdeckt. Die Anwendung dieser Vorgehensweise hat zur Entdeckung von einer Anzahl von pathogenen Proteinen (L-Onkoproteinen) geführt, die von L-Onkogenen exprimiert werden. Diese L-Onkogene wurden innerhalb von chromosomalen Orten lokalisiert, die von den oben beschriebenen Tumorsuppressorgenen besetzt werden. Diese Moleküle werden bei Menschen mit der Krankheit, aber nicht bei Menschen, die nicht von Brustkrebs betroffen sind, exprimiert. Im Gegensatz zu Onkogenen, die durch Mutationen aktiviert werden müssen, sind L-Onkogene präaktivierte Onkogene, d.h. sie werden als Antwort auf verschiedene Umweltsignale in der aktivierten Form exprimiert. Die Erfindung, die definiert wird durch die Patentansprüche im Anhang, bezieht sich auf eines dieser Gene, namentlich auf BREX, dessen Sequenz in der SEQ ID NO:28 und 32 angegeben wird, wohingegen sein korrespondierendes Protein die Sequenz SEQ ID NO:29 hat; die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Anwendung dieses Gens als Marker zur Frühdiagnose und als Zielmolekül für Therapieansätze für alle Formen von Brustkrebs beim Menschen. Beschrieben werden auch andere neuartige Proteine, die durch einzigartige Assoziation mit Brustkrebs verbunden sind, sowie Analoge und Derivate dieser Moleküle, und Nukleinsäuremoleküle, die für solche Moleküle kodieren oder deren Expression beeinflussen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
5a (SEQ ID NO:28) zeigt die cDNS von BREX, das kodiert wird von Sequenzen, die homolog sind zu Exon 16 auf dem Antisense-Strang des BRCA1 Gens.
5b (SEQ ID NO:29) zeigt die abgeleitete Proteinsequenz (BREX).
5d (SEQ ID NO:31) zeigt die 5'-regulatorische Region von BREX. Sie enthält drei mit cap-Stellen verbundene TATA Boxen und eine GC Box. Die Sequenz ist homolog zu einer Region auf dem Antisense-Strang von BRCA1 Intron 17.
7e Funktionelle Homologie zwischen der c-terminalen putativen Nukleartransitsequencz von BC531 und den zwei putativen Nukleartransitsequenzen von BRCA1.
7g Domänenhomologie zwischen p53, BREX und FLT4.
7h Homologie zwischen BC532 und BREX.
8 Eine identische Promotersequenz „ATAAAA", die sich in mindestens einem Promotorelement in der regulatorischen Region jedes L-Onkogens findet.
9c Organisation der BREX Gene.
10 Sequenz der Primer, die bei der RT-PCR benutzt wurden, um L-Onkogen mRNS in klinischen Proben zu erkennen.
12a Sequenz der Epitope, gegen die monospezifische polyklonale Kaninchen-Antikörper hergestellt wurden. Die Antikörper wurden benutzt, um die Expression des BREX Proteins in klinischen Proben zu detektieren.
12b Darstellung des ELISA Antigen-Einfang Tests.
12c Darstellung des ELISA Antikörper-Einfang Tests.
12d & e Nachweis von BC531 & BC532 in der von Brusttumoren und normalen Brüsten nicht verwandter Personen erhaltenen Proteinfraktion.
12f & g Nachweis von BC531 & BC532 in der von Primärtumoren nicht verwandter Frauen erhaltenen Proteinfraktion.
12h & i Nachweis von BC531 & BC532 in der Kernfraktion von Proteinen, die von fortgeschrittenen Brusttumoren mit Beteiligung der Lymphknoten isoliert wurden.
12j Nachweis von BC531 & BC532 in Blut, das von 18 Frauen mit Tumoren mit einem Durchmesser von kleiner als 1 cm erhalten wurde.
12o Immunnachweis von BREX und BRCA1 in Brusttumorgewebe derselben Patientin.
DETAILS DER ERFINDUNG
Im Einzelnen liefert die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das substanziell frei von natürlichen Verunreinigungen ist und für das Protein BREX kodiert, dessen Sequenz SEQ ID NO:28 ist.
Die Erfindung liefert auch das BREX Protein, welches substanziell von natürlichen Verunreinigungen ist und ei Sequenz SEQ ID NO:29 hat.
Die Erfindung bezieht sich zudem auf einen Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers, welche fähig sind, an ein Molekül zu binden, das die SEQ ID NO:29 besitzt.
Die Erfindung zeigt auch die Verwendung einer Antisense-RNS spezifisch für BREX mRNS oder für SEQ ID NO:29, oder eines Antikörpers gegen BREX, für die Herstellung eines Medikamentes zur prophylaktischen Behandlung von Brustkrebs.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN WEGE ZUR VERWIRKLICHUNG
Der Erfolg der vorliegenden Erfindung kam hauptsächlich durch unsere Erkenntnis, dass es andere Genen innerhalb der von Tp53 und BRCA1 besetzten Chromosomenorte geben muss, die mit der Biochemie von Brust-und Ovarialkrebs assoziiert sind, und dass zumindest eines dieser Gene auch mit einer Komponente von anderen, mit der Krankheit assoziierten Genen in Bezug stehen muss. Daher haben wir eine Prozedur angewandt, die wir schon erfolgreich für die Entdeckung alternativer Gene benutzt haben, die putativ kausale Faktoren bei anderen „genetischen Krankheiten" sind, um innerhalb des Locus, der das Tp53 Gen auf Chromosom 17 kodiert, solche Gene zu suchen, die sich möglicherweise zusammen mit Brustkrebs verteilen. Wir haben daraufhin das sich in dieser Region befindliche potentielle Gen als Sonde benutzt, um Sequenzen des BRCA1 Gens, des RB Gens, des AR Gens, sowie uns zur Verfügung stehende Sequenzen des vorgeschlagenen „BRCA2"-Locus auf Chromosom 13 auf Sequenzähnlichkeiten zu durchsuchen.
Wir nennen die oben genannten (alternativen Gene) „Huckepack-Gene" (piggy-back genes, pb Gene) und bezeichnen diese Technologie als „disease gene discovery by positional searching" (DGDPS). Nach unserer Arbeitsdefinition können pb Gene in jeder Richtung innerhalb des von anderen charakterisierten funktionellen Genen besetzten chromosomalen Locus transkribiert werden.
Im Folgenden ist die DGDPS Vorgehensweise beschrieben
Die Vorgehensweise hat gegenüber einer von Genom- oder cDNS-Bibliotheken ausgehenden Genlokalisierung durch Klonieren den Vorteil, dass sie drei Hauptschwierigkeiten überwindet, (1) dass einige DNS-Sequenzen mit konventionellen Methoden möglicherweise nicht geklont werden können, (2) dass einige mRNS-Sequenzen nur in so geringer Menge vorhanden sind, dass sie in einer cDNS-Bibliothek nicht repräsentiert werden, und (3) dass die Produkte einiger geklonter Sequenzen höchst toxisch für bakterielle oder andere Wirte sind.
Im Allgemeinen haben wir zunächst ein Gen identifiziert, das mit einem Gen, welches bereits genetisch mit einer bestimmten Krankheit in Verbindung gebracht wurde, in engem Bezug steht, haben dann die von dem Gen transkribierte mRNS aus Krankheitsgewebe oder von Patientenblut isoliert, haben des weiteren die cDNS aus der isolierten mRNS mittels reverser Transkriptase synthetisiert und die neue cDNS mit Hilfe die gesamte Kodierungsregion der cDNS flankierenden spezifischen Primern amplifiziert, haben sodann die cDNS nach einer Eletrophorese im Agarosegel aufgrund der Größe identifiziert, und haben schliesslich die einzigartige cDNS aus dem Agarosegel isoliert. Das hat uns erlaubt, das gewünschte Molekül, wenn es exprimiert war, herauszufiltern, ohne einige Hunderttausend cDNS-Klone testen zu müssen.
Die vorliegende Erfindung leitet sich von der Entdeckung und der Klonierung eines neuartigen Gens, BREXL, her, wobei die obige Vorgehensweise Anwendung fand. Im Folgenden werden einige Beispiele des positionellen Suchens beschrieben, so wie es in der vorliegenden Erfindung angewendet wurde:

(1) wir haben die sequenzierten Regionen innerhalb der p53- und BRCA1-Orte auf Chromosom 17 untersucht und potentielle vollständige „orfs" ausgewählt, d.h. offene Leserahmen (orfs) mit akzeptierten Translationsinitiationssequenzen (siehe Kozak, M, Nucleic Acid Res. 12:857-872 (1984)) sowie Translationsterminations-Stopkodons (TAA, TAG oder TGA) in der richtigen Position,
(2) anschließend haben wir die Methode von Sucher et al., J. Mol. Biol. 212:563-578 (1990) angewandt, um putative Promoterregionen zu identifizieren, welche mit dem orf assoziiert sind und innerhalb von 100-1000 bp 5'-sequenz-aufwärts von der Translationsinitiationssequenz liegen, und haben potentielle poly-A-Additionssignale (die Konsens-Poly-A-Additionssequenz ist „AATAAA") innerhalb einer Region von 1000 bp 3'-sequenzabwart vom Translations-Stopkodon des potentiellen orfs identifiziert,
(3) danach wurden die orfs, die die oben genannten Charakteristika erfüllten, unter Zuhilfenahme des Universalcodes in putative Proteinsequenzen übersetzt,
(4) wir haben dann die putativen Proteine mit Hilfe unserer ,propriety computer assisted Protein finger printing'-Technologie analysiert und erhielten so Informationen über potentielle biochemische Eigenschaften der deduzierten Proteine,
(5) als nächstes wurden die biochemischen Eigenschaften der Proteine mit bekannten biochemischen Charakteristika von Brustkrebs verglichen,
(6) im Folgenden wurde die RNS, die für Proteine mit Korrelation zu Krankheitscharakteristika kodiert, als potentielle Kandidaten mit Krankheitsbezug ausgewählt,
(7) anschließend wurde die Transkription der selektierten Sequenzen in klinischem Material untersucht. [der Gegenwartsnachweis für transkribierte mRNS-Sequenzen, die für Proteine in einer Zelle kodieren, kann mit allen zur Detektion von mRNS geeigneten Methoden erfolgen]. In dieser Erfindung wurde Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) mit dem Stratagene RAP-PCR RT-PCR Kit entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt und es wurden unmarkierte Primer verwendet, um in aus gefrorenen Brustkrebstumoren, normalen Brustgeweben und Lymphozyten isolierte RNS die für die deduzierten Proteine kodierende cDNA nachzuweisen. RNS wurde aus gefrorenem Gewebe extrahiert, indem etwa 20 mg gefrorenes Brustgewebe in einem Gewebehomogenisator in der Gegenwart von Diethylpyrocarbonat (DECP) zerrieben wurde. Gesamt-RNS wurde mit Hilfe des Stratagene Micro RNS Isolierung-Kits, und Poly(A)+ unter Benutzung des Strategene Poly(A)+ Quick mRNS Isolierung-Kits entsprechend den Angaben des Herstellers isoliert. Die isolierte RNS wurde mit 10 Einheiten (units) RNAse-freier DNAse bei 37°C für 15 Minuten behandelt. DNAse wurde durch 2-minütige Behandlung bei 100°C inaktiviert. cDNS Synthese wurde mit mRNS als Templat nach dem im Kit mitgelieferten Erststrang-Protokoll ausgeführt, und RT-PCR wurde unter den vom Hersteller empfohlenen Zyklisierungsbedingungen durchgeführt. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer wurden zu den die gesamte Proteinkodierungsregion des orfs von dem ausgewählten Protein flankierenden Regionen präpariert (siehe Tabelle 1 für die Primersequenzen und die Grösse des erwarteten Amplifikationsproduktes). Die amplifizierte cDNS wurde auf Agarosegelen elektrophoretisiert und die Grösse wurde mit Hilfe von DNS Größenmarkern bestimmt, die parallel im Gel mit-elektrophoretisiert wurden. Um die Sequenz der cDNS zu verifizieren, wurde die Region in der Agarose, die die cDNS mit der erwünschten Größe enthielt, in H₂O extrahiert, mit Äthanol präzipitiert und ein Teil unter Benutzung der Primer in „12" und der Perkin Elmer ampli-taq in einem Perkin Elmer 376 A DNA-Sequenzierer nach einer nicht-radioaktiven Methode, wie beschrieben bei Liu, C. et al. Nucl. Acid. Res. 21:333-334 (1993), zyklisch sequenziert,
(8) als Nächstes wurde bestimmt, ob die Proteine tatsächlich exprimiert wurden: um das zu erreichen, wurden mit Hilfe der Methode von Hopp, T.P. and Woods, K.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828 (1981) innerhalb der Aminosäuresequenz der deduzierten Proteine Epitope identifiziert und ihre Sequenz mit Sequenzen in Datenbanken verglichen; es wurden Epitope ausgewählt (siehe Tabelle 2), die keine Homologie mit Sequenzen in öffentlichen Datenbanken hatten. Monospezifische polyklonale Kaninchen Antikörper gegen diese Epitope wurden präpariert und mittels Immunaffinitätschromatographie mit Pharmacia LKB, CNBr-activated Sepharose 4B entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (siehe Sektion #11 in Immunology, in Current Protocol in Molecular Biology (Vol 1) Ausubel, F.M. et al. (ed) John Wiley & Sons NY. NY. 1991) gereinigt. Enzyme-basierte Immunassay-Formate (ELISAs) wurden unter Benutzung eines kolorimetrischen Tests mit Horseradish Peroxidasekonjugiertem IgG als zweitem Antikörper und Orthophenylen-Diamin (OPD) als Substrat (siehe „ELISA and other Solid Phase Immunoassays", Kemeny, D.M. et al. (eds), John Wiley & Sons, NY, NY 1988) durchgeführt. Zwei ELISA-Versionen wurden benutzt, um die Gegenwart spezifischer brustkrebsverwandter Proteine in Körperflüssigkeiten (Blut, Serum, Speichel) von Brustkrebspatienten zu bestimmen, ebenso wie die Gegenwart eines endogenen IgGs, das bei allen Brustkrebspatienten/innen gegen diese Proteine produziert wurde. Um die Expression der deduzierten Proteine in menschlichem Material nachzuweisen, wurden Proteine aus Brust-Tumoren und normalem Gewebe isoliert durch Präzipitation aus homogenisiertem Gewebe mittels >80% Ammoniumsulfat und anschließender Dialyse gegen SDS PAGE Puffer (die Pufferbedingungen sind beschrieben bei Laemmli, U.K. Nature 227:680-685 (1970). Die dialysierten Proteine wurden in SDS PAGE Puffer gekocht und entweder in einem 17.5% Acrylamidgel elektrophoretisiert mit anschliessendem Transfer der Proteine auf Nylon Membran nach der Western-Blot Methode und Behandlung mit affinitätsgereinigtem Antikörper, oder direkt auf positiv geladene Membranen gespottet und behandelt wie oben beschrieben. Interaktion des Antikörpers mit membrangebundenem Protein wurde durch mit einem von BioRad Inc. gekauften Chemilumineszenz-Kit nach den Angaben des Herstellers visualisiert (siehe auch Blake, M.S. et al., Anal. Biochem. 136:175-179 (1984)). Wechselwirkungen des Antikörpers mit Proteinen, die innerhalb von Zellen in Brust- und Ovarialgewebe von Patienten lokalisiert waren, erfolgte durch Visualisierung mit immunhistochemischen Methoden.

DIE MOLEKÜLE DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, unter Verwendung der DGDPS Prozedur, eines pb-Gens (L-Onkogens), dessen Sequenz und SEQ ID oben angegeben ist, sowie auf die Proteinprodukte dieses Gens (L-Onkoproteine), deren Sequenz und SEQ ID ebenfalls oben angegeben sind. Die Transkription des L-Onkogens wird durch innerhalb der in 5D (BREXL) gezeigten Sequenz lokalisierte Promoterelemente programmiert. Der chromosomale Ort und ausgewählte potentielle, biologische Eigenschaften des L-Onkoproteines, welche bezüglich einer Rolle bei Brust und Ovalrialkrebs relevant sein könnten, werden in den Beispielen unten und in Tabelle 1 dargelegt. Die Organisation dreier weiterer Gene, genannt BC531L, BC532L und BC533L und abgeleitet durch unser ebenfalls in diesem Antrag beschriebenes Suchverfahren, ist in den 9a und 9b gezeigt, und die des BREX Gens ist in 9c gezeigt.
Beispiel 1
BREX (SEQ ID NO:29) ist ein Tachykinin-ähnliches Polypeptid-Hormon, das viele intrazelluläre Systeme beeinflussen kann, einschließlich der Aktivierung der Expression der anderen, hierin beschriebenen L-Onkogene, sowie der FLT4 Tyrosinkinase. Wie in 7H gezeigt wird, hat es eine signifikante Homologie zu Domänen in p53 und FLT4. Es enthält eine Domäne, die identisch mit einer ähnlichen Domäne in BRCA1 ist, die Teil einer oder zweier BRCA1 Sulfatierungs-Stellen ist. Dieselbe Domäne ist auch zu 100% homolog (70% Ähnlichkeit) zu einer Domäne in BRCA2, die an eine bevorzugte Glykosylierungsstelle angrenzt. Tyrosinsulfatierung ist für Proteine wichtig, die in die Golgivesikel eindringen, um dort glycosyliert zu werden. BRCA1/BRCA2 sind glycosylierte Granin-artige Proteine, die ausgeschleust werden. Glycosylierung erfolgt hauptsächlich in den Golgivesikeln und ist für die funktionelle Integrität dieser Proteine notwendig. Folglich kann BREX in der Lage sein, die Reifung und die Transportaktivität von BRCA1/BRCA2 zu beeinträchtigen. Diese und andere durch Daten untermauerte Rückschlüsse haben zu der Schlussfolgerung geführt, dass BREX bei den frühesten Stadien von Brustkrebs involviert ist, wohingegen die anderen L-Onkoproteine wahrscheinlich eher bei den späteren Stadien der Krankheit beteiligt sind.
Eine Region der Sequenz, die ein potentielles L-Onkogen enthält, wurde durch die Verwendung von BC532 als „evolutionäre Verwandtschaftssonde" ausgewählt. Die evolutionäre Verwandtschaft zwischen den L-Onkogenen und den L-Onkoproteinen wurde nach der Methode von Higgins D.G. und Sharp P.M., CABIOS 5:151-153 (1989) hergestellt. Der Verwandtschaftsgrad zwischen den L-Onkogenen und zwischen den L-Onkoproteinen ist in den 6a und 6b dargestellt.
In einer anderen Ausführung der Erfindung wurde entdeckt, dass alle L-Onkogene mindestens ein Promotor Element in der 5'-regulatorischen Region enthalten, welches eine konservierte 6 bp Promotorsequenz beinhaltet, wie in 8 zu sehen ist. Das deutete an, dass mindestens ein Promotor für jedes L-Onkogen von demselben Transkriptionsfaktor/Mechanismus oder derselben Auswahl von Faktoren beeinflusst wird. Das Blockieren eines solchen Faktors könnte ausreichen, um die Transkription all dieser L-Onkogene zu stoppen.
Weiterhin ist laut dieser Erfindung die Kombination von fehlender Expression in normalen Zellen und der Komplexizität des in der 5'-regulatorischen Region befindlichen Promotersystems, ein Anzeichen dafür, dass der Promoter durch eine Anzahl von Faktoren wahrscheinlich in einer Gewebe-spezifischen Weise reguliert werden kann. Das Verhindern der Aktivierung von selektiven L-Onkogen Promotern ist damit eine ideale Methode, um die Expression der Transkription von L-Onkogenen und damit die Expression von L-Onkoproteinen zu verhindern.
Beispiel 2
Detektion von BREX mRNS in Patienten mit Brustkrebs und gesunden Patienten. mRNS wurde isoliert und wie beschrieben zu cDNS konvertiert. PCR wurde mit dem geeigneten Primerpaar durchgeführt wie in 12 gezeigt. Ein von der Größe her korrektes Fragment wurde aus dem Material von allen fünf Brustkrebspatienten, nicht aber aus den drei getesteten gesunden Proben, amplifiziert.
Beispiel 3
Nachweis des BREX Proteins und des BREX Proteins im Komplex mit humanem IgG im Serum von Patienten mit fortgeschrittenem Brustkrebs unter Verwendung der in 12b/c beschriebenen ELISA Tests. Serum von allen Patienten mit Brust- und Ovarialkrebs war positiv für BREX; Serum von vier aus fünf Kontrollpatienten war negativ für BREX, und Serum von 11 aus 14 Patienten mit anderen Epithelzellkrebsformen und entzündlichen Krankheiten waren negativ für BREX. Das Serum eines Patienten mit Pankreas Krebs, eines Patienten mit Magenkrebs und zweier Patienten mit benignem Brustkrebs waren positiv für BREX.
Beispiel 4
Nachweis von BRCA1 und BREX in Tumorextrakten der/desselben Patienten/in. Das Serum einer Brustkrebs-Patientin wurde mit nicht-SDS kationischer Polyacrylamid Gelektrophorese gefolgt von Western Blot und Immunreaktion unter Verwendung von affinitätsgereingtem Epitop-spezifischem polyklonalem anti-BREX IgG zur Erkennung von BREX (12p) und anti-BRCA1 monoklonalem Antikörper zur Erkennung von BRCA1 (12q) analysiert. Die immunspezifischen Banden wurden mit einem speziesspezifischen chemilumineszenz-markierten monoklonalen IgG bestimmt.
Es ist 1t. dieser Erfindung daher möglich, unter Verwendung von PCR-Primern und monospezifischen Antikörpern, die gegen L-Onkoproteinepitope gerichtet sind, mit hohem Konfidenzgrad Brust-und Ovarialkrebs beim Menschen nachzuweisen. Da L-Onkoproteine gemeinsame sowie individuelle biologische Eigenschaften haben, welche viele biochemische Charakteristika hervorrufen, die von Epithelzellen herrührenden Krebsarten zu Eigen sind, könnte die Eliminierung dieser Moleküle zum Stillstand dieser Symptome fuhren; somit sind L-Onkoproteine geeignete Zielmoleküle, gegen die therapeutische Reagenzien gerichtet werden können, um Brustkrebs im Menschen zu stoppen.
Biochemische Aktivität von L-Onkogenen mit Relevanz für eine Rolle bei der Brust- und Ovarialkrebsbildung: Wie L-Onkogene möglicherweise Brust-und Ovarialkrebs initiieren.
Wie vom Expressionsprofil von L-Onkogenen in Tumorzellen ersichtlich ist, gezeigt in Tabelle 2a, war BREXL auch in allen getesteten Proben vorhanden; anti-BREX Antikörper detektierte auch BREX in allen Brustkrebstumoren, die untersucht wurden (Ergebnisse sind nicht gezeigt). In immunhistochemischen Experimenten (Ergebnisse werden nicht hier gezeigt), bei denen ein von anderen Forschern zur Verfügung gestellter anti-BRCA1 Antikörper verwendet wurde, reagierten anti-BRCA1 und anti-BREXab1 Antikörper mit, wie es erschien, denselben Strukturen im Zytoplasma von Brustkrebszellen, wohingegen anti-BC531 hauptsächlich im Kern und über das Zytoplasma verteilt erschien. Während anti-BRCA1 hauptsächlich in den Zellkern von normalem Brustgewebe lokalisiert war, reagierten weder anti-BC531 noch anti-BREX mit Zellen aus gesundem Brustgewebe. Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass BRCA1 und BREX eng mit Strukturen im Zytoplasma von Brustkrebszellen assoziiert sind (Chen, Y. et al., Science 270:789-791 (1995) haben schlüssig gezeigt, dass BRCA1 bei allen normalen Zellen im Kern gefunden wird, es in Brust-und Ovarialkrebszellen aber fast ausschließlich im Zytoplasma vorkommt), während BC531 mit dem Kern von Brusttumorzellen assoziiert ist. Letzteres wird durch die in 12h und 12 dargestellten Ergebnisse unterstützt, in denen gezeigt wird, dass BC531 in der aus dem Kernpellet von Tumorzellen isolierten Proteinfraktion nach Behandlung mit Triton X-100 nachweisbar war. Bezüglich BRCA2 wurden keine ähnlichen Experimente durchgeführt, da uns kein für BRCA2 spezifischer Antikörper zur Verfügung stand.
Zusammenfassend befasst sich diese Erfindung mit der Entdeckung eines Gens (BREX), das innerhalb einer für das BRCA1 Gen kodierenden Region auf Chromosom 17 exprimiert wird. BREX kodiert für ein Protein, das als endogenes Pathogen klassifiziert werden kann, da das menschliche Immunsystem einen endogenen anti-BREX Antikörper gegen dieses Protein produziert. Die pathogene Aktivität von BREX rührt von seiner Fähigkeit her, BRCA1 und BRCA2 kompetitiv von Sulfatierungs- und Glycosylierungsstellen in der Golgimembran zu verdrängen, sowie dem Potential, Aktivitäten von physiologisch aktiven Peptiden vom Tachykinintyp nachzuahmen. Der Verlust von BRCA1/BRCA2 führt zu einer Aktivierungskaskade einer Reihe von Genen, die normalerweise beim Menschen reprimiert sind. Die Proteine, die von einigen dieser Gene exprimiert werden, können womöglich an Stellen in der chromosomalen DNS binden und die Aktivierung von Genen beeinflussen, die für die Entwicklung und das Wachstum kritisch sind, sowie von anderen pathogenen Genen, die normalerweise im menschlichen Genom reprimiert sind; mindestens eines dieser pathogenen Gene könnte bei der Inhibierung der Tyrosinkinase-Phosphorylierung involviert sein.
Die Anwendung der Moleküle aus der vorliegenden Erfindung
A. Diagnostische Anwendung
Da BREX in gesunden Zellen nicht in nachweisbaren Mengen exprimiert ist, zeigt die Detektion dieses Moleküls in Gewebe oder Flüssigkeit (wie etwa eine Biopsie, Blut, Urin oder Speichel), dass Brust- oder Ovarialkrebs bei einer Person vorhanden ist.
In dieser Erfindung haben wir zwei Arten immunologischer Ansätze zur Detektion des BREX Genprodukts in menschlichem Material angewendet; der Nachweis dieser Moleküle kann allerdings durch irgendeine einer Vielzahl immunologischer Methoden erfolgen; eine große Anzahl geeigneter Immunassayformate sind beschrieben worden (Polken, R.H., Rev. Infect. Dis. 4:35 (1982); Collins, W.P., In: Alternative Immunoassays, John Wiley & Sons, NY (1985); Ngo, T.T. et al., In: Enzyme Mediated Immunoassay, Plenum Press, NY (1985)), die hiermit durch Referenz im Antrag eingefügt sind. Unter Anwendung von Epitop-spezifischen, zweifach affinitätsgereinigten, monospezifischen Antikörpern, wie in den Beispielen und den 12A und 12B gezeigt, wird die Gegenwart eines Zielmoleküls durch eine immunpositive Reaktion angezeigt; die Intensität der Reaktion ist proportional zur Konzentration des vom Zielmolekül gebundenen Antikörpers.
Der andere für die Diagnose von Brust-und Ovarialkrebs anwendbare Ansatz, ist der Nachweis der Expression von L-Onkogen mRNS BREXL in einer/m Brustkrespatientin/en oder in einer zufällig ausgewählten Population, wie in den oben beschriebenen Beispielen. Die Diagnose basiert wie beschrieben auf dem Nachweis der mRNS, die für diese Proteine in Gewebe und biologischen Flüssigkeiten kodiert. Somit können mit solchen Molekülen hybridisierende Nukleinsäuresonden (DNS oder RNS) zur Diagnose von Brust- und Ovarialkrebs verwendet werden.
In einer Ausführung können die Assays auf aus Blut, Zellen oder Gewebe extrahierter RNS angewendet werden, wie in den Spezifikationen beschrieben.
Wenn die Konzentration einer mRNS in einer Probe in für den Nachweis zu niedrig ist, kann solch eine mRNS nach einer Reihe von Amplifikationsprotokollen spezifisch amplifiziert werden, wie zum Beispiel mit PCR (Mullis, K.B., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Mullis, K. et al., U.S. Patent 4,683,202 : Erlich, H., U.S. Patent 4,582,788 ; Saiki, R. et al., U.S. Patent 4,683,194 und Mullis, K.B. et al., Meth. Enzymol. 155:335-350 (1987)) oder mit transcriptionsbasierten Amplifikationssystemen (Kwoh, D. t al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1173 (1989); Gingeral, T.R. et al., PCT appl. WO 88/10315 ; Davey, C. et al., Europäische Patentanmeldung 329,822 ).
B. Prognostische Anwendung
Die vorliegende Erfindung liefert zusätzlich eine sensitive und spezifische Methode zur Überwachung einer möglichen Wiederkehr der Krankheit in einem Individuum, das als von Brust- oder Ovarialkrebs geheilt gilt. Somit kann jeder der vorher beschriebenen Assays bei asymptomatischen Individuen durchgeführt werden, um festzustellen, ob es einen Wiederbeginn dieser Krankheiten gibt.
C. Therapeutische Anwendung
Bedeutenderweise liefert die vorliegende Erfindung Wege zur Behandlung von Brustkrebs. Solche Behandlungswege können entweder „prophylaktisch" sein: sie werden bereit gestellt, bevor sich irgendwelche klinischen Brustkrebssymptome zeigen, um die Krankheit entweder zu verhindern oder den Verlauf abzuschwächen; oder eine therapeutische Behandlung sein: diese wird bereit gestellt, nachdem Brustkrebssymptome begonnen haben, was zu einer Verringerung der eigentlichen Symptome verhelfen sollte.
Die Behandlung wird mittels der Gabe einer effektiven Menge eines Antikörpers an den Patienten vorgenommen, beziehungsweise eines Antikörperfragments (F(ab')), F(ab')2, oder Einzelkettenantikörpers, oder pseudo-homologen Antikörpers einschließlich "humanisierter" Antikörper, oder einer Kombination all der genannten, die in der Lage sind, BREX zu neutralisieren. In dieser Erfindung bedeutet eine effektive Menge eine Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Änderung in der Schwere der Symptome, oder eine klinisch signifikante Verzögerung beim Beginn der Symptome zu bewirken.
Dieses können monospezifische polyklonale oder monklonale Antikörper (oder Fragmente derer) sein, die zur Anwendung kommen. Vorzugsweise sollten solche Moleküle nicht-immunogener Natur sein. Dieses können pseudohomologe (d.h. humanisierte) Moleküle sein, die per rekombinanter oder anderer Technologie hergestellt wurden. Solche Antikörper sind Äquivalente zu den monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, sind aber weniger immunogen und damit besser verträglich für den Patienten.
Humanisierte anti-BREX Antikörper können z.B. durch Ersetzen eines immnunogen Teils eines jeden Antikörpers mit einem korrespondieren aber nicht-immunogenen Teil hergestellt werden (d.h. chimäre Antikörper). Die Herstellung von humanisierten Antikörpern sind im Detail in den folgenden Referenzstellen beschrieben (Robinson, R.R. et al., Internationale Patentveröffentlichung PCT/US8/6/02269 ; Akira, K. et al., Europäische Patentanmeldung 184,187 ; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496 ; Morrison, S.L. et al., Europäische Patentanmeldung 173,494 ; Neuberger, M.S. et al., PCT Anmeldung WO 86/01533 ; Cabilly, S. et al., Europäische Patentanmeldung 125,023 ; Retter, M. et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu, A.Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443 (1987); Liu, A.Y. et al., J. Immunol. 139:3521-3526 1987); Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:214-218 (1987); Nishimura, Y. et al., Canc. Res. 47:999-1005 (1987); Wood, C.R. et al., Nature 314:446-449 (1985); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988); Morrison, S.L., Science 229:1202-1207 (1985); Oi, V.T. et al., BioTechniques 4:214 (1986); Jones, P.T. et al., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239:1534 (1988); Beidler, C.B. et al., J. Immunol. 141:4053-4060 (1988)).
In einer anderen Ausführung kann die gewünschte Therapie erzielt werden, indem Nukleinsäuremoleküle, speziell die Promotorsequenzen BREXP4 dieser Erfindung, mit „Antisens-"Nukleinsäuremolekülen (Antisens-Oligonukleotiden) angesteuert werden. Um als ein solches Antisens-Oligonukleotid zu wirken, muss das Nukleinsäuremolekül in der Lage sein, an den Bereich des Moleküls zu binden oder mit ihm zu hybridisieren, der die Translation der Ziel-mRNS ermöglicht. Antisens-Oligonukleotide sind in den Europäischen Patentanmeldungs-Veröffentlichungen Nrn. 263,740 ; 335,451 ; und 329,882 , wie auch in PCT Veröffentlichung Nr. WO90/00624 veröffentlicht.
Wie in dieser Erfindung verwendet, ist ein „Antisens-Oligonukleotid" eine Nukleinsäure (entweder DNS oder RNS), dessen Sequenz komplementär zur Sequenz von BREXLP aus dieser Erfindung ist, sodass sie fähig ist, an eine endogene Promotor- oder Heatshock-Sequenz zu binden oder mit ihnen zu hybridisieren, und das in einer Weise, die ausreicht, um deren Transkription zu behindern und ihre Aktivität in der Zelle in bedeutendem Maße zu reduzieren, und damit die Übersetzung zum Protein zu beeinträchtigten (d.h. zu verringern oder zu verhindern).
Die Antisense-Oligonukleotide können mittels des Protein-Polykation Konjugat-Systems (Beug, H. et al., United States Patent 5,354,844 , 11/10, 1994) in einer geeigneten pharmazeutischen Verbindung in die Zelle transportiert werden.
Antisense-Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung eines viralen oder retroviralen Vectors entsprechend der Methoden der „Gentherapie" verabreicht werden. Dieses Gebiet ist ausführlich behandelt in: Biotechnology, A Comprehensive Treatise, volume 7B, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, pp 399-458 (1989).
Obgleich, wie oben angegeben, eine solche Gentherapie einem Rezipienten zur Behandlung (d.h. Unterdrückung oder Abschwächung) eines vorliegenden Zustandes verabreicht werden kann, so sind die Prinzipien dieser Erfindung auch als prophylaktische Gentherapie bei Individuen anwendbar, deren Risiko als hoch eingeschätzt wird diese Krankheit zu entwickeln.
Administration der Moleküle aus dieser Erfindung
Wie in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) dargelegt, können zusätzliche Nukleinsäuremoleküle zur Kontrolle der Wirkdauer einer jeden therapeutischen Substanz in einen Patienten verabreicht werden.
Nachdem nun generell die Erfindung durch Referenzen und Beispiele in einer Art beschrieben wurde, dass sie leicht von jedem mit einer ausreichenden Fachausbildung verstanden werden kann, muss ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass die Erfindung nicht auf diese Referenzen und Beispiele limitiert ist, außer wenn dies ausdrücklich so spezifiziert ist.
Legenden zu 1-5

über – & unterstrichen = CAATT Promotorelement
unterstrichen = TATA Promotorelement
überstrichen = Cap Stelle
doppelt unterstrichen = Bipartit-Kerntransportsequenz#
eingekastet = Transmembranhelix
x---Fe⁺⁺--x = Häm-Eisenbindungsstelle

Legende zu 12

A. Sequenz der zur Herstellung monospezifischer polyklonaler Antikörper gegen L-Onkogene benutzter Epitope.
B. ELISA Test zur Detektion von L-Onkoproteinen in Körperflüssigkeiten des Menschen.
C. ELISA Test zur Detektion von endogenen anti-L-Onkoprotein-Antikörper in Körperflüssigkeiten des Menschen.
D. Nachweis von BC531 mit BC531ab1 in metastatischen Brusttumoren und normaler Brust, A1 = normale Brust
E. Nachweis von BC532 mit BC532ab1 wie in D beschrieben.
F. Nachweis von BC531 in der Proteinfraktion von 15 nachgewiesenen und 3 vermuteten Brust-Primärtumoren mit BC531ab1. B1 und B4 zeigen normale Brust, A2, B2 und C2 die vermuteten Tumore.
G. Nachweis von BC532 mit BC532ab1. A1 und B1 = normale Brust, A2, B2 und C2 = vermutete Tumore.
H. Identifizierung von Tumorgewebe unter gemischten normalem und Brustkrebs-Gewebe unter Verwendung von BC531ab1. A1, B1, C1, A2 und B2 wurden korrekt als kanzeröses Brustgewebe identifiziert; C2, D1 und D2 waren normal.
I. Nachweis von BC532 unter Verwendung von BC532ab1, die gleiche Identifizierung wie in H.
J. Nachweis von BC531 in Kern- und Zytoplasmafraktionen von Brusttumoren unter Verwendung von BC531ab1. A = Brustkrebs-Zytoplasmafraktion, B = Brustkrebs-Kernfraktion, C = normale Kernfraktion und D = normale Zytoplasmafraktion.
K. Nachweis von BC532 unter Verwendung von BC532ab1, gleiche Beschreibung wie in J.
O. Nachweis von BREX in Tumorgewebe einer/s metastatischen Brustkrebspatientin/en: der Proteinextrakt wurde der kationischen nicht-SDS (nativen) PAGE unterzogen; BREX wurde auf einem Western Blot, gefolgt von einer Reaktion mit anti-BREX1 ab und einem Chemilumineszenz-Maus-anti-Kaninchen IgG monoklonalem Antikörper, nachgewiesen. Nachweis von BRCA1 in denselben Tumorextrakten wie in Q. Das BRCA1-Protein wurde mit anti-BRCA1 und einem Chemilumineszenz-markierten Maus-anti-Kaninchen IgG monoklonalem Antikörper detektiert.

LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Bin Nukleinsäuremolekül frei von natürlichen Kontaminationen und ausgewählt aus einer Gruppe, die aus brex und brex Promotor besteht, deren Sequenzen SEQ ID NR:28 bzw. SEQ ID NR:31 sind.
Ein Proteinmolekül frei von natürlichen Kontaminationen, bestehend aus BREX, dessen Sequenz SEQ ID NR:29 ist.
Bin Antikörper mit Spezifität für BREX, wobei die Sequenz von BREX SEQ ID NR:29 ist
Der Antikörper von Anspruch 3, wobei der Antikörper durch Iimmunisieren eines geeigneten Tiers mit Polypeptiddomänen von BREX hergestellt wird.
Der für BREX spezifische Antikörper von Anspruch 3, wobei der Antikörper endogen in einem Menschen produziert wird.
Ein Antikörper oder ein Antiköper-Fragment, oder Einzelketten-Antikörper, oder eine Kombination aus diesen, welche spezifisch an BREX binden kam, zur Verwendung in der Prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Brustkrebs.
Der Gebrauch eines Antikörpers oder eines Antikörper-Fragments, oder eines Einzelketten-Antikörpers, oder einer Kombination aus diesen, welche spezifisch an BREX binden können, zur Herstellung eines Medikaments für die prophylaktische Behandlung von Brustkrebs.
Bin Antikörper wie in Anspruch 6 definiert, wobei der Antikörper ein monospezifischer polyklonaler Antiköper oder ein monoklonaler Antikörper oder ein rekombinanter Antkörper oder ein humanisierter Antikörper ist.
Eine Gegensinn-(antisense) RNS mit Spezifität für das Molekül mit der komplementären Sequenz zu SEQ ID NR:28, d.h. für brex mRNS oder brex Promotor, dessen Sequenz die SEQ ID NR:31 ist.
Die Verwendung einer Gegensinn-RNS von Anspruch 9, welche spezifisch an brex mRNS oder brex Promotor binden kann, für die Herstellung eines Medikamentes zur prophylaktischen Behandlung von Brustkrebs.
Eine Methode zur Diagnose oder präsymptomatischen Diagnose von Brustkrebs, bestehend aus dem Nachweis eines durch SEQ ID NR:29 definierten Proteins in einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe, oder bestehend aus dem Nachweis von brex mRNS wie definiert durch seine cDNS mit der Sequenz SEQ ID NR:28.
Eine Methode zur Diagnose oder präsymptomatischen Diagnose von Brustkrebs, bestehend aus dem Nachweis eines Antikörpers in einer Flüssigkeitsprobe, welcher Spezifität für das BREX Protein wie definiert durch SEQ ID NR:29 hat.
Ein Antikörper wie definiert in den Ansprüchen 6 oder 8, wobei die Krankheit Brustkrebs oder von Brustkrebs herrührender Epithelzellkrebs ist.
Die Verwendung wie definiert in Anspruch 7, wobei der Antikörper ist wie in Anspruch 8 definiert
Die Verwendung wie definiert in den Ansprüchen 11 oder 12, wobei die Krankheit ist wie in Anspruch 13 definiert.