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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das für einen Tumorantigenvorläufer kodiert.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Gen, dessen Tumorantigenvorläufer, unter
anderem, zu mindestens einem Tumorantigen prozessiert wird, das
auf Zelloberflächen
von HLA-A2-Molekülen
präsentiert
wird.
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Hintergrund und Stand der
Technik
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Der
Prozeß, über den
das Immunsystem eines Säugetieres
fremdes Material erkennt und darauf reagiert, ist sehr komplex.
Eine wichtige Facette dieses Systems ist die T-Zell-Antwort. Diese Antwort
erfordert, daß die
T-Zellen Komplexe von Zelloberflächenmolekülen, die
als menschliche Leukozyten-Antigene
(human leucocyte antigen, "HLA") oder Haupthistokompatibilitätskomplexe
(MHCs") bezeichnet
werden, und Peptide erkennen und mit ihnen Wechselwirken. Die Peptide
leiten sich von größeren Molekülen ab,
die von den Zellen prozessiert werden, die auch die HLA/MHC-Moleküle präsentieren.
Siehe in dieser Hinsicht Male et al., Advanced Immunolgy (J. P.
Lipincott Company, 1987), insbesondere Kapitel 6–10. Die Interaktion zwischen
T-Zelle und den Komplexen aus HLA/Peptid ist beschränkt, da
sie eine für
eine bestimmte Kombination aus HLA-Molekül und Peptid spezifische T-Zelle
benötigt.
Wenn eine spezifische T-Zelle nicht vorhanden ist, erfolgt auch dann
keine T-Zell-Antwort, wenn sein Partner-Komplex vorhanden ist. Entsprechend
erfolgt auch keine Antwort, wenn der spezifische Komplex fehlt,
aber die T-Zelle vorhanden ist. Dieser Mechanismus ist bei der Immunabwehr
gegen fremdes Material, bei Autoimmunerkrankungen und bei Reaktionen
auf zelluläre
Abnormitäten
beteiligt. Kürzlich
haben sich viele Arbeiten auf den Mechanismus konzentriert, mit
dem Proteine zu den HLA-bindenden Peptiden prozessiert werden. Siehe
hierzu Baringa, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science
257: 919 (1992); Matsumura et. Al., Science 257: 927 (1992) Latron
et al., Science 257: 964 (1992).
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Der
Mechanismus, über
den T-Zellen Zellanomalien erkennen, ist auch mit Krebs in Verbindung
gebracht worden. Beispielsweise ist in der PCT Veröffentlichungs-Nr.
WO 92/20356 , veröffentlicht
am 26 November 1992, eine Gen-Familie
offenbart, die zu Peptiden prozessiert wird, die wiederum auf Zelloberflächen exprimiert
werden, was zur Lysis der Tumorzellen durch spezifische CTLs führen kann.
Die Gene sollen für "Tumorantigenvorläufer" oder "TRAP"-Moleküle kodieren
und die Peptide, die man von diesen ableitet, werden als Tumorantigene
oder "TRAB" bezeichnet. Siehe
Traversari et. al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen
et al., Science 254: 1643 (1991) für weitere Informationen über diese
Gen-Familie.
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In
der US-Patentanmeldung Serien-Nummer 938,334, werden Nonapeptide
gelehrt, die durch die HLA-A1-Molekülen präsentiert werden. Diese Quelle
lehrt, daß man,
die bekannte Spezifität
spezieller Peptide für
bestimmte HLA-Moleküle
vorausgesetzt, erwarten sollte, daß ein bestimmtes Peptid ein
bestimmtes HLA-Molekül,
nicht aber andere, bindet. Dies ist wichtig, da unterschiedliche
Individuen unterschiedliche HLA-Phänotypen
besitzen. Obwohl die Identifizierung eines bestimmten Peptids als
Partner eines spezifischen HLA-Moleküls diagnostische
und therapeutische Konsequenzen hat, sind diese folglich nur für Individuen
mit diesem bestimmten HLA-Phänotyp
relevant. Es besteht Bedarf für
weitere Arbeiten auf diesem Gebiet, da Zellanomalien nicht auf einen
bestimmten HLA-Phänotyp
beschränkt
sind und zielgerichtete Therapie einige Kenntnis über den
Phänotyp
der betreffenden anormalen Zellen erfordert.
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In
der
WO 94/16713 ist
die Tatsache offenbart, daß das
MAGE-1 Expressions-Produkt zu einem zweiten TRA prozessiert wird.
Dieses zweite TRA wird durch HLA-C10-Moleküle präsentiert. Die Offenbarung zeigt, daß ein vorgegebener
TRAF zu einer Vielzahl von TRAB führen kann.
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In
WO 94/14459 wird Tyrosinase
als ein Tumorantigenvorläufer
beschrieben. Diese Veröffentlichung offenbart,
daß ein
Molekül,
das von einigen normalen Zellen produziert wird (z. B. Melanozyten),
in Tumorzellen prozessiert wird und ein Tumorantigen ergibt, das
durch HLA-A2-Moleküle
präsentiert
wird.
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Die
Gegenstände,
die in der
WO 94/16713 und
WO 94/14459 offenbart sind,
stellen nur einen Teil des Standes der Technik dar, der für dieses
Patent gemäß den Vorschriften
des Artikels 54 (3) EPÜ relevant
ist.
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Wölfel et
al., J. Exp. Med., 1989, offenbart die SK-MEL-29-Zellinie, die die Antigene A, B und
C präsentiert,
die mit HLA-A2 komplexieren. Die Natur ihres Vorläufer-Moleküls ist jedoch
nicht offenbart.
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Es
wurde nun herausgefunden, daß ein
anderes Nukleinsäuremolekül für einen
Tumorantigenvorläufer
kodiert, der sich von den vorher beschriebenen unterscheidet. Der
erfindungsgemäße TRAP
wird zu mindestens einem Tumorantigen prozessiert, das durch HLA-A2-Moleküle präsentiert
wird; Sequenzanalysen haben jedoch gezeigt, daß der erfindungsgemäße TRAP
weder Tyrosinase ist, noch mit Tyrosinase verwandt ist. Somit betrifft
die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das für einen
Tumorantigenvorläufer
oder "TRAP"-Molekül, kodiert.
Dieses "TRAP"-Molekül ist nicht
Tyrosinase. Des weiteren wird das erfindungsgemäße TRAF zu mindestens einem
Tumorantigen oder "TRA" prozessiert, das
von HLA-A2-Molekülen
präsentiert
wird. Das TRA ist nicht mit Tyrosinase verwandt, und andere TRAs,
die sich vom erfindungsgemäßen TRAF
herleiten, können
auch von anderen HLA-Molekülen
präsentiert
werden.
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Die
Erfindung und verschiedene Aspekte derselben werden in der folgenden
Beschreibung näher
erläutert.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1A zeigt Ergebnisse von Zell-Lysis-Versuchen
mit dem CTL-Klon I/95- gegen LB39-MEL-, K562- und LB39-Blasten.
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1B zeigt die Lysis bei Verwendung des
CTL Klons I/95 gegen SK23-Mel und SK29-MEL.
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2 legt
weitere Ergebnisse einer TNF-Freisetzungsuntersuchung unter Verwendung
verschiedner Zellinien mit CTL I/95 dar.
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3A zeigt
die durch unterschiedliche Zellinien, einschließlich Transfektanten, induzierte
TNF-Freisetzung bei Tests mit dem CTL-Klon I/95.
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3B zeigt
TNF-Freisetzungsdaten bei Verwendung des CTL-Klons IVSB
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3C zeigt
die TNF-Freisetzung bei Verwendung von CTL-Klon 10/196
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4 zeigt
eine Reihe von Geweben, Zellinien und Tumoren, die unter Einsatz
der Polymerasekettenreaktion (PCR), unter Verwendung von Oligonukleotidsonden,
die vom hier beschriebenen Nukleinsäuremolekül abgeleitet wurden, auf die
Expression des Gens AaG1c124 gestestet wurden.
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Ausführliche
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
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Beispiel 1
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Unter
Einsatz von Standard-Methoden wurde aus Melanomzellen des Patienten
LB39 eine Melanom-Zellinie, "LB-39-MEL", etabliert. Von
der etablierten Zellinie wurde eine Probe bestrahlt, um sie nicht-proliferierend
zu machen. Diese bestrahlten Zellen wurden dann verwendet, um hierzu
spezifische zytolytische T-Zellen ("CTLs")
zu isolieren.
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Eine
Probe von peripheren mononukleären
Blutzellen ("PBMCs") wurde vom Patienten
LB39 entnommen und mit den bestrahlten Melanomzellen in Kontakt
gebracht. Diese Mischung wurde auf Lysis der Melanomzellen hin untersucht,
was darauf hindeutete, daß spezifische
CTLs für
einen von den Melanomzellen präsentierten
Komplex aus Peptid und HLA-Molekül in der
Probe vorhanden waren.
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Der
eingesetzte Lysis-Test war ein Chrom-Freisetzungs-Test nach Herin
et al., Int. J Cancer 39: 390–396
(1987).
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Der
Test wird jedoch hier beschrieben. Die Ziel-Melanomzellen wurden
in vitro angezogen und dann zu 107 Zellen/ml in DMEM, versetzt mit
10 mM HEPES und 30% FCS, resuspendiert und dann 45 min bei 37°C mit 200 μCi/ml Na(51Cr)O4
inkubiert. Die markierten Zellen wurden dreimal mit DMEM, versetzt
mit 10 mM Hepes, gewaschen. Diese wurden dann in DMEM, versetzt
mit 10 mM Hepes und 10% FCS, resuspendiert, wonach Teilmengen von
100 μl,
die mit 103 Zellen enthielten, auf 96-Loch-Mikroplatten verteilt wurden. Proben von
PBLs wurden in 100 μl
desselben Mediums zugegeben und die Tests wurden in zwei Parallelansätzen durchgeführt. Die
Platten wurden für
4 Minuten bei 100 g zentrifugiert und dann für 4 Stunden bei 37°C in einer 80%igen
CO2-Atmosphäre
inkubiert.
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Die
Platten wurden erneut zentrifugiert und 100-μl-Teilmengen des Überstandes
wurden gesammelt und gezählt.
Der Prozentsatz der 51Cr-Freisetzung wurde wie folgt berechnet:
wobei ER die beobachtete,
experimentelle 51Cr-Freisetzung ist, SR die spontane Freisetzung
ist, gemessen durch Inkubieren von 103 markierten Zellen in 200 μl des Mediums
allein, und MR die maximale Freisetzung ist, die durch Zugabe von
100 μl 0.3%
Triton X-100 zu den Zielzellen erhalten wird.
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Die
mononukleären
Blutproben, die eine hohe CTL-Aktivität zeigten, wurden expandiert
und mittels serieller Verdünnung
("limiting dilution") geklont, und wurden
dann erneut mit der selben Methodik "gescreent". Der CTL-Klon LB39-CTL I/95 wurde auf
diese Weise isoliert.
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Dasselbe
Verfahren wurde benutzt, um K562-Ziel-Zellen zu testen, ebenso wie
autologe PHA-induzierte T-Zell-Blasten. Diese Ergebnisse, dargestellt
in 1A, zeigen, daß dieser CTL-Klon die Melanomzellinie
erkennt und lysiert, aber keine der K562 oder der T-Zell-Blasten.
Die CTL, LB39-CTL I/95, wurde dann gegen die Melanomzellinien SK23-MEL
und SK29-MEL in derselben Weise wie oben beschrieben getestet. Zellen
von beiden Linien wurden ebenfalls lysiert. Diese Linien wurden
beide von Patienten isoliert, die wie LB39 als HLA-A2 typisiert
wurden. Dies legte nahe, daß der
CTL-Klon LB39-CTL I/95 ein durch HLA-A2 präsentiertes Antigen erkannte.
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Beispiel 2
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Weitere
Studien wurden durchgeführt,
um festzustellen, ob LB39-CTL I/95 auch Tumor-Nekrose-Faktor ("TNF") produzierte, wenn
er mit den Zielzellen in Kontakt gebracht wurde. Die dazu verwendete
Methode war die von Traversari et al., Immunogenetics 35: 145–152 (1992)
beschriebene, deren Offenbarung hier durch Inbezugnahme aufgenommen
wird. Kurz gesagt, wurden Proben der CTL-Linie mit Proben von interessierenden
Zielzellen in Kulturmedium kombiniert. Nach 24 Stunden wurde der Überstand
der Kulturen entfernt und dann bei TNF-sensiblen WEHI-Zellen getestet.
Zusätzlich
zu den oben beschriebenen LB39-MEL und SK23-MEL wurden eine weitere
HLA-A2-Linie, d. h., SK29-MEL.1, eine HLA-A2 Verlust-Variante, d.
h. SEK29-MEL1.22 und eine Nicht-HLA-A2-Linie, d. h. MZ2-MEL, die
HLA-A1 ist, getestet.
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Die
Ergebnisse, dargestellt als Prozentsatz von WEHI-Zellen, die starben,
als sie dem Überstand
ausgesetzt wurden, sind in 2 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die
HLA-A2-Verlust-Variante
SK 29-MEL.1.22 nicht mehr fähig
ist, den CTL-Klon zu stimulieren, wodurch sich bestätigt, daß das durch LB39-CTL-I/95
erkannte Antigen von HLA-A2 präsentiert
wird.
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Beispiel 3
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Die
Ergebnisse von Beispiel 2 deuteten darauf hin, daß SK MEL
29.1 das interessierende Ziel-Antigen präsentierte. Daher wurde es als
Quelle für
Gesamt-mRNA verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen.
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Gesamt-RNA
wurde aus der Zellinie isoliert. Die mRNA wurde nach allgemein anerkannten
Techniken unter Verwendung eines Oligo-dT-Bindungs-Kits isoliert.
Nachdem die mRNA gesichert war, wurde sie zu cDNA transkribiert,
ebenfalls unter Nutzung von Standard-Methoden. Die cDNA wurde dann
nach Herstellerangaben mit EcoRI-Adaptoren ligiert und dann in die EcoRI-Stelle
des Plasmids pcDNA-I/Amp geklont. Die rekombinanten Plasmide wurden
dann in E. coli JM101 elektroporiert (Elektroporationsbedingungen:
1 Impuls bei 25 μFarad,
2500 V).
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Die
transfizierten Bakterien wurden mit Ampicillin (50 μg/ml) selektiert
und dann in 800 Pools mit je 100 Klonen aufgeteilt. Jeder Pool repräsentierte
etwa 50 verschiedene cDNAs, da Analysen zeigten, daß etwa 50% der
Plasmide eine Insertion enthielten. Jeder Pool wurde nach Maniatis
et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor,
N. Y., 1982) bis zur Sättigung
amplifiziert und die Plasmid-DNA wurde mit alkalischer Lysis, Kaliumacetat-Fällung ohne
Phenolextraktion isoliert.
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Beispiel 4
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Im
Anschluß an
die Herstellung der in Beispiel 3 beschriebenen Bibliothek wurde
die cDNA in eukaryotische Zellen transfiziert. Die hier beschriebenen
Transfektionen wurden in zwei Parallelansätzen durchgeführt. Proben
mit COS-7-Zellen
wurden zu 15000 Zellen/Loch in Gewebekultur-Flachboden-Mikrolöcher in Dulbecos modifiziertem
Eagle-Medium ("DMEM"), versetzt mit 10%
fötalem
Kälberserum,
ausgesät.
Die Zellen wurden über
Nacht bei 37 inkubiert, das Medium wurde entfernt und dann durch
30 μl/Loch
DMEM Medium ersetzt, das 10%-Nu-Serum, 400 μg/ml DEAE-Dextran, 100 μM Chloroquin,
100 ng Plasmid pcDNA-I/Amp-A2 und 100 ng der DNA aus einem Pool
der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek enthielt. Das Plasmid pcDNA-I/Amp-A2
enthält
das HLA-A2-Gen von SK29-MEL. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das
Medium entfernt und durch 50 μl
PBS, enthaltend 10% DMSO, ersetzt. Dieses Medium wurde nach 2 Minuten
entfernt und durch 200 μl
DMEM, versetzt mit 10% FCS, ersetzt.
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Nach
diesem Medium-Wechsel wurden die COS Zellen für 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
Das Medium wurde dann verworfen und 1000 CTL-I/95-Zellen wurden
in 100 μl
Iscove-Medium mit 10% gepooltem Humanserum, versetzt mit 25 U/ml
IL-2, zugegeben. Der Überstand
wurde nach 24 Stunden entfernt und der TNF-Gehalt wurde in dem Test
auf WEHI-Zellen bestimmt, wie bei Traversari et al., oben, vorher
durch Inbezugnahme aufgenommen, beschrieben.
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Von
den 800 getesteten Pools stimulierten 99% die TNF-Freisetzung, zu einer
Konzentration von 3–6 pg/ml
in dem Überstand.
Zwei Pools ergaben einen Ertrag von über 8 pg/ml, mit einem Parallel-Loch,
das ebenfalls mehr als 8 pg/ml ergab.
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Beispiel 5
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Die
beiden Pools, die hohe Erträge
an TNF im Überstand
zeigten, wurden für
weitere Studien ausgewählt.
Insbesondere wurden die Bakterien geklont, und 800 Bakterien wurden
von jedem Pool getestet. Plasmid-DNA wurde daraus extrahiert, in
der gleichen Weise wie oben beschrieben in eine neue Probe von COS-Zellen
transfiziert, und die Zellen wurden erneut auf Stimulation des LB39-CTL-Klons
I/95 getestet. Ein positiver Klon wurde gefunden, der als AaG1c124
bezeichnet wird. Ein überzeugender
Beweis dafür,
daß die transfizierten
Zellen von CTLs erkannt wurden, wurde durch die Ausführung eines
Vergleichstests mit COS Zellen, die mit cDNA vom positiven Klon
und dem HLA-A2 Gen transfiziert wurden, COS-Zellen, die nur mit HLA-A2
transfiziert wurden und der Linie SK29-MEL erhalten. Die TNF-Freisetzung
im CTL-Überstand
wurde durch dessen Testung auf WEHI-Zellen gemessen, wie oben beschrieben.
Die optische Dichte der überlebenden
WEHI-Zellen wurde unter Verwendung von MTT gemessen. 3A zeigt
die Ergebnisse, die mit dem CTL-Klon I/95 erhalten wurden.
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Weitere
Tests zeigten, daß das
Peptid, das von den HLA-A2 in den transfizierten Zellen präsentiert wurde,
sich von dem vorher beschriebenen, d. h. einem von Tyrosinase abgeleiteten
Peptid, unterschied. Der CTL-Klon IVSB ist spezifisch für Komplexe
aus tyrosinaseabgeleiteten Peptiden und HLA-A2. Wenn dieser CTL-Klon
mit Zellen in Kontakt gebracht wurde, die mit Aag1c124 und HLA-A2
transfiziert waren, war die TNF-Freisetzung
minimal, wie 3B zeigt.
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Beispiel 6
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Die
cDNA von dem positiven Klon wurde entfernt und nach in der Fachwelt
bekannten Techniken sequenziert. Eine Sequenz-Recherche zeigte, daß die Plasmid-Insertion keine
Homologie zu bekannten Genen oder Proteinen zeigte. SEQUENZ ID NO:
1 stellt cDNA-Nukleotid-Informationen dar, die ein großes offenes Leseraster
von Positionen 75 bis 431, entsprechend einem Proteinprodukt von
119 Aminosäuren,
zeigen. SEQUENZ ID NO: 2 stellt die erweiterte Sequenz dar, von
der die SEQ ID NO: 1 ein Teil ist.
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Beispiel 7
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In
derselben Weise, in der der CTL-Klon LB39-CTL I/95 isoliert wurde,
wurden eine Probe von PBMCs und eine vom Patienten SK29 (AV) entwickelte
Melanom-Zellinie zur Isolierung des CTL-Klons SK29-CTL 10/196 verwendet.
Diese neue Zellinie wurde in der gleichen Weise getestet wie in
Beispiel 5 dargelegt. Die Ergebnisse der Tests, dargestellt in 3C,
zeigen, daß das
Tumorantigen, das durch AaG1c124 (im folgenden als Antigen "LB39-Aa" bezeichnet) kodiert
wird, ebenfalls durch diesen CTL-Klon erkannt wird. Diese Versuche
zeigen, daß andere
Patienten CTLs, die spezifisch für
dieses Antigen sind, hervorbringen können und dies in der Tat auch
tun.
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Von
den beschriebenen Sequenzen wurden Oligonukleotidsonden abgeleitet
und in Standard-Polymerasekettenreaktions-Verfahren verwendet, um die Expression
des Gens in normalen Geweben, Tumoren und Tumorzellinien zu bestimmen.
Diese Ergebnisse sind in 4 dargestellt und zeigen, daß neben
getesteten normalen Geweben nur Melanozyten das Gen exprimieren.
Beachte die Expression in allen getesteten Tumorproben und/oder
Melanom-Zellinien.
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Die
vorstehenden Experimente beschreiben eine neu isolierte Nukleinsäuresequenz,
die für
einen Tumorantigenvorläufer,
ein "TRAP"-Molekül, kodieren.
Das Molekül
wird intrazellulär
in einer Weise prozessiert, die zur Bildung von mindestens einem
Tumorantigen, oder "TRA", führt, das
durch HLA-A2-Moleküle
präsentiert
wird. Während
es vorher beobachtet wurde, daß HLA-A2-Moleküle von Tyrosinase
abgeleitete Peptide präsentieren,
kodieren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
nicht für
Tyrosinase und die TRAB sind nicht von Tyrosinase abgeleitet.
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Die
Erfindung beinhaltet daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für einen
Tumorantigenvorläufer,
oder "TRAF", kodiert, mit der
Maßgabe,
daß der
TRAF nicht Tyrosinase ist. Der kodierte TRAF wird zu mindestens
einem Tumorantigen, oder TRA, prozessiert, das durch ein HLA-A2-Molekül auf Zelloberflächen präsentiert
wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können z.
B. genomische DNA, ("gDNA"), komplementäre DNA ("cDNA") oder eine Art von
RNA sein. Die Erfindung schließt
auch isolierte Nukleinsäuremoleküle ein,
die zu den oben beschriebenen Molekülen komplementär sind.
Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist ein Molekül, das die
Sequenz enthält,
die in der SEQ ID NO: 1 wiedergegeben ist.
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Ebenfalls
von der Erfindung umfaßt
sind Vektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, funktionsfähig mit
einem Promotor verbunden, enthalten. Die Vektoren können auch
ein Molekül,
das für HLA-A2
kodiert, enthalten. Da diese beiden Moleküle, d. h. HLA-A2 und der TRAF,
erforderlich sind, um eine Antwort zytolytischer T-Zellen hervorzurufen,
umfaßt
die Erfindung auch Expressionssysteme, bei denen Nukleinsäuremoleküle, die
für TRAF
und für
HLA-A2 kodieren, als separate Teile, z. B. in einem Kit, präsentiert werden.
Die Erfindung umfaßt
auch Zellinien, die mit den hier beschriebenen Vektoren transfiziert
sind, seien dies prokaryotische Zellen wie z. B. E. coli oder eukaryotische
Zellen wie z. B. Zellen aus Ovarien chinesischer Hamster ("CHO"-Zellen) oder COS-Zellen.
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Wie
angegeben, provozieren die Komplexe aus TRA und HLA-A2 eine Antwort
zytolytischer T-Zellen, und als solche sind isolierte Komplexe aus
dem Tumorantigen und einem HLA-A2-Molekül ebenfalls von der Erfindung
umfaßt,
wie auch isolierte Tumorantigenvorläufer, die von den vorstehend
beschriebenen Nukleinsäuresequenzen
kodiert werden.
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Die
beschriebene Erfindung weist eine Anzahl von Verwendungen auf, von
denen einige hier beschrieben sind. Die Identifizierung eines spezifisch
durch HLA-A2-Moleküle
präsentierten
Tumorantigens sowie eines Nukleinsäuremoleküls, das für seinen parallelen Tumorantigenvorläufer kodiert,
erlaubt es dem Fachmann vor allem, eine Erkrankung, die durch Expression
des TRAP gekennzeichnet ist, zu diagnostizieren. Diese Verfahren
beinhalten die Bestimmung der Expression des TRAP-Gens, und/oder
davon abgeleiteter TRAs, wie z. B. durch HLA-A2-präsentiertes
TRA. Andere TRAB können
von den erfindungsgemäßen TRAPs
abgeleitet sein und durch verschiedene HLA-Moleküle präsentiert werden. In der ersteren
Situation können
solche Bestimmungen mit Hilfe jedes Standardtests zur Bestimmung
von Nukleinsäuren
durchgeführt
werden, einschließlich
der Polymerasekettenreaktion, oder Tests mit markierten Hybridisierungssonden.
In der letzteren Situation ist die Untersuchung mit Bindungspartnern
für Komplexe
aus TRA und HLA, wie beispielsweise Antikörpern, besonders bevorzugt.
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Die
Isolierung des TRAP-Gens ermöglicht
es auch, das TRAP-Molekül selbst
zu isolieren, insbesondere TRAP-Moleküle, die die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 1 enthalten. Diese isolierten Moleküle können, wenn
sie als das TRA oder Komplexe aus TRA und HLA, wie beispielsweise
HLA-A2, präsentiert
werden, mit Materialien wie z. B. Adjuvanzien kombiniert werden,
um Impfstoffe herzustellen, die zur Behandlung von Erkrankungen
verwendbar sind, die durch Expression des TRAP-Moleküls gekennzeichnet
sind. Darüber
hinaus können
Impfstoffe aus Zellen, die die TRA/HLA-Komplexe auf ihren Oberflächen präsentieren,
wie beispielsweise nicht-proliferierenden
Krebszellen, nicht-proliferierenden Transfektanten etcetera, hergestellt
werden. In allen Fällen,
in denen Zellen als Impfstoff verwendet werden, können dies
Zellen sein, die mit kodierenden Sequenzen für eine oder beide der Komponenten,
die zur Untersuchung einer CTL-Antwort erforderlich sind, transfiziert
sind, oder Zellen sein, die beide Moleküle ohne Transfektion exprimieren.
Weiter können
das TRAP-Molekül,
seine zugehörigen
TRAs sowie Komplexe aus TRA und HLA unter Anwendung von dem Fachmann
wohlbekannten Standardtechniken zur Herstellung von Antikörpern verwendet
werden.
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Wenn
der Begriff "Erkrankung" hier verwendet wird,
bezieht er sich auf jeden pathologischen Zustand, bei dem der Tumorantigenvorläufer exprimiert
wird. Ein Beispiel für
eine solche Erkrankung ist insbesondere Krebs-Melanom.
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Therapeutische
Ansätze,
die auf der Offenbarung beruhen, beruhen auf einer Antwort durch
das Immunsystem einer Person, die zur Lysis von TRA-präsentierenden
Zellen, wie z. B. HLA-A2-Zellen,
führt.
Ein solcher Ansatz ist die Verabreichung von CTLs, die dem Komplex
gegenüber
spezifisch sind, an eine Person mit anomalen Zellen des betreffenden
Phänotyps.
Es liegt innerhalb des Fachkönnens
des Fachmanns, solche CTLs in vitro zu entwickeln. Insbesondere
wird eine Probe von Zellen, wie beispielsweise Blutzellen, mit einer Zelle
in Kontakt gebracht, die den Komplex präsentiert und in der Lage ist,
die Proliferation einer spezifischen CTL zu provozieren. Die Zielzelle
kann ein Transfektant wie beispielsweise eine COS-Zelle des oben beschriebenen
Typs sein. Diese Transfektanten präsentieren den gewünschten
Komplex auf ihrer Oberfläche
und stimulieren, wenn sie mit einer interessierenden CTL zusammengebracht
werden, deren Proliferation. COS-Zellen, wie die, die hier verwendet
werden, sind, wie andere geeignete Wirtszellen auch, allgemein erhältlich.
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Zur
genaueren Beschreibung der therapeutischen Vorgehensweise, die als
adoptiver Transfer (Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917 (1986);
Reddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch et al., Eur. J.
Immunol. 21: 1403–1410
(1991); Kast et al., Cell 59: 603–614 (11-17-89)) bezeichnet
wird: es werden Zellen, die den gewünschten Komplex präsentieren,
mit CTL kombiniert, was zur Proliferation der hierfür spezifischen
CTLs führt.
Die proliferierten CTLs werden dann an eine Person mit einer Zellanomalität, die dadurch
gekennzeichnet ist, daß bestimmte
anomale Zellen den bestimmten Komplex präsentieren, verabreicht. Die
CTLs lysieren dann die anomalen Zellen, und erreichen dadurch das
gewünschte
therapeutische Ziel.
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Die
vorstehende Therapie setzt voraus, daß zumindest einige der anomalen
Zellen der Person den HLA-TRA-Komplex präsentieren. Dies kann sehr leicht
festgestellt werden, da die Fachwelt sehr vertraut ist mit Verfahren
zur Identifizierung von Zellen, die ein bestimmtes HLA-Molekül präsentieren
sowie damit, Zellen zu identifizieren, die DNA exprimieren, die
die angegebenen Sequenzen enthalten. Einmal isoliert, können solche
Zellen mit einer Probe der anomalen Zellen der Person verwendet
werden, um die Lysis in vitro zu bestimmen. Wenn Lysis beobachtet
wird, kann die Verwendung der spezifischen CTLs in einer solchen
Therapie den Zustand, der mit den anomalen Zellen verbunden ist,
lindern. Eine weniger aufwendige Vorgehensweise untersucht die anomalen
Zellen unter Anwendung von Standardtests auf HLA-Phänotypisierung
und bestimmt die Expression mittels Amplifikation, z. B. unter Verwendung
von PCR.
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Adoptiver
Transfer ist nicht die einzige Art von Therapie, die in Übereinstimmung
mit der Erfindung erhältlich
ist. CTLs können
auch in vivo durch Einsatz verschiedener Ansätze in vivo provoziert werden.
Ein Ansatz, d. h. die Verwendung von nicht-proliferierenden Zellen,
die den Komplex exprimieren, ist oben ausgeführt worden. Die in diesem Ansatz
verwendeten Zellen können
jene sein, die den Komplex normalerweise exprimieren, wie beispielsweise
bestrahlte Melanom-Zellen oder Zellen, die mit einem oder mehreren
der Gene, die für
die Präsentierung
des Komplexes erforderlich sind, transfiziert sind. Chen et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110–114 (Januar, 1991) belegen
diesen Ansatz, in dem sie die Verwendung von transfizierten Zellen,
die HPVE7-Peptide exprimieren, in einem Therapieschema zeigen. Verschiedene
Zelltypen können
verwendet werden. Genauso können
auch Vektoren, die eines oder mehrere der interessierenden Gene
tragen, verwendet werden. Virale oder bakterielle Vektoren sind
besonders bevorzugt. In diesen Systemen wird das interessierende
Gen durch z. B. ein Vaccinia-Virus oder BCG-Bakterien getragen, und die Materialien "infizieren" die Wirtszellen
de facto. Die resultierenden Zellen präsentieren den interessierenden
Komplex und werden durch autologe CTLs erkannt, die dann proliferieren.
Ein ähnlicher
Effekt kann erreicht werden durch Kombinieren des Tumorantigens
oder des Vorläufers
Selbst mit einem Adjuvans, um die Aufnahme in HLA-A2-präsentierende
Zellen zu erleichtern, die das interessierende HLA-Molekül präsentieren.
Der TRAP wird prozessiert und ein Peptidpartner des HLA-Moleküls erhalten,
während
das TRA präsentiert
wird, ohne daß eine
weitere Prozessierung erforderlich ist.
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Andere
Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann klar sein und müssen hier
nicht wiederholt werden.
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Die
Begriffe und Ausdrücke,
die hier verwendet wurden, werden als Begriffe zur Beschreibung
und nicht der Beschränkung
verwendet, und in der Erkenntnis, daß verschiedene Modifikationen
innerhalb des Bereichs der Erfindung möglich sind, bei der Verwendung
solcher Begriffe und Ausdrücke
nicht die Absicht besteht, irgendwelche Äquivalente der gezeigten und
beschriebenen Merkmale, oder Teilen davon, auszuschließen.
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