ES2210252T3 - Acido nucleico que codifica un precursor de antigeno de rechazo de tumores. - Google Patents
Acido nucleico que codifica un precursor de antigeno de rechazo de tumores.Info
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Abstract
EL INVENTO SE REFIERE A MOLECULAS DE ACIDO NUCLEICO CODIFICADAS PARA UN PRECURSOR ANTIGENO DE RECHAZO DE TUMORES. ESPECIFICAMENTE, EL PRECURSOR ANTIGENO DE RECHAZO DE TUMORES, O "TRAP", PROCESADO EN AL MENOS UN ANTIGENO DE RECHAZO DE TUMORES, PRESENTADO POR MOLECULAS HLA-A2. TAMBIEN SE MUESTRAN RAMIFICACIONES DEL DESCUBRIMIENTO.
Description
Ácido nucleico que codifica un precursor de
antígeno de rechazo de tumores.
Esta invención se refiere a una molécula de ácido
nucleico que codifica un precursor de antígeno de rechazo de
tumores. De un modo más particular, la invención se refiere a un
gen, cuyo precursor de antígeno de rechazo de tumores se procesa,
entre otras cosas, en al menos un antígeno de rechazo de tumores que
es presentado por moléculas HLA-A2 en la superficie
de las células.
El proceso por el cual el sistema inmune de los
mamíferos reconoce y reacciona frente a materiales extraños o ajenos
es un proceso complejo. Una faceta importante del sistema es la
respuesta de las células T. Esta respuesta requiere que las células
T reconozcan e interaccionen con complejos de moléculas de la
superficie celular, a los que se hace referencia como antígenos
leucocitarios humanos ("HLA"), o complejos principales de
histocompatibilidad ("MHCs"), y péptidos. Los péptidos se
derivan de moléculas mayores que son procesadas por las células que
presentan también la molécula HLA/MHC. Véase a este respecto Male
et al., Advanced Immunology (J.P. Lipincott Company,
1987), especialmente los capítulos 6-10. La
interacción de las células T y los complejos de HLA/péptido está
restringida, requiriendo una célula T específica para una
combinación particular de una molécula HLA y un péptido. Si no está
presente una célula T específica, no existe respuesta alguna de las
células T aun cuando esté presente su complejo asociado.
Análogamente, no hay respuesta alguna si está ausente el complejo
específico, aunque esté presente la célula T. Este mecanismo está
implicado en la respuesta del sistema inmune a materiales extraños,
en patologías autoinmunes, y en las respuestas a anormalidades
celulares. Recientemente, se han enfocado muchas investigaciones
sobre los mecanismos por los cuales las proteínas se procesan para
producir los péptidos de fijación a HLA. Véase, a este respecto,
Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science
257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992);
Latron et al., Science 257: 964 (1992).
El mecanismo por el cual las células T reconocen
anormalidades celulares ha sido implicado también en el cáncer. Por
ejemplo, en la publicación PCT No. WO 92/20356, publicada el 26 de
noviembre de 1992, se describe una familia de genes, que se
procesan para dar péptidos que, a su vez, se expresan en las
superficies celulares, lo que puede conducir a lisis de las células
tumorales por CTLs específicas. Se dice que los genes codifican
"precursores de antígenos de rechazo de tumores" o moléculas
"TRAP", y se hace referencia a los péptidos derivados de ellos
como "antégenos de rechazo de tumores" o "TRAs". Véase
Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der
Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991), para información
adicional sobre esta familia de genes.
En la solicitud de patente de los Estados Unidos
Número de Serie 938.334, se exponen nonapéptidos que son presentados
por la molécula HLA-A1. La referencia expone que
dada la especificidad conocida de péptidos particulares para
moléculas HLA particulares, sería de esperar que un péptido
particular se fijase a una sola molécula HLA, pero no a otras. Esto
es importante, dado que diferentes individuos poseen diferentes
fenotipos HLA. Como resultado, si bien la identificación de un
péptido particular como asociado para una molécula HLA específica
tiene ramificaciones diagnósticas y terapéuticas, éstas son
solamente relevantes para individuos con dicho fenotipo HLA
particular. Existe necesidad de trabajo adicional en el área, dado
que las anormalidades celulares no están restringidas a un solo
fenotipo HLA particular, y la terapia dirigida requiere cierto
conocimiento del fenotipo de las células anormales en cuestión.
En el documento WO 94/16713, se expone el hecho
de que el producto de expresión MAGE-1 se procesa
para dar un segundo TRA. Este segundo TRA es presentado por
moléculas HLA-C10. La exposición demuestra que un
TRAP dado puede producir una pluralidad de TRAs.
En el documento WO 94/14459, se describe la
tirosinasa como un precursor de antígeno de rechazo de tumores. Esta
referencia expone que una molécula que es producida por algunas
células normales (v.g., melanocitos), se procesa en células
tumorales para producir un antígeno de rechazo de tumores que es
presentado por moléculas HLA-A2.
La materia descrita en los documentos WO 94/16713
y WO 94/14459 forma sólo parte de la técnica anterior concerniente a
esta patente bajo las provisiones del artículo 54(3)
EPC.
Wölfel et al., J. Exp. Med., 1989,
describe la línea de células
SK-MEL-29 que presenta los antígenos
A, B y C, que forman complejos con HLA-A2. Sin
embargo, no se describe la naturaleza de su molécula precursora.
Se ha encontrado ahora que otra molécula de ácido
nucleico codifica un precursor de antígeno de rechazo de tumores que
difiere de los descritos previamente. El TRAP de la invención se
procesa para dar al menos un antígeno de rechazo de tumores que es
presentado por moléculas HLA-A2; sin embargo, el
análisis de la secuencia indica que el TRAP de la invención no es
tirosinasa ni está relacionada con ella. Así pues, la invención se
refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un precursor
de antígeno de rechazo de tumores, o molécula "TRAP". Esta
molécula "TRAP" no es tirosinasa. Adicionalmente, el TRAP de la
invención se procesa para dar al menos un antígeno de rechazo de
tumores, o "TRA", que es presentado por moléculas
HLA-A2. El TRA no está relacionado con la
tirosinasa, y otros TRAs derivados de los TRAPs de la invención
pueden ser presentados por otras moléculas HLA.
La invención, y diversos aspectos de la misma, se
explicarán en detallle en la exposición que sigue.
La Figura 1A presenta resultados de experimentos
de lisis celular que utilizan el clon CTL I/95 contra blastos
LB39-MEL, K562, y LB39.
La Figura 1B muestra la lisis utilizando el clon
CTL I/95 contra SK23-MEL y
SK29-MEL.
La Figura 2 expone los resultados de un ensayo de
liberación de TNF utilizando diversas líneas de células con CTL
I/95.
La Figura 3A muestra la liberación de TNF
inducida por diferentes líneas de células, con inclusión de
transfectantes, cuando se ensayan con el clon CTL I/95.
La Figura 3B presenta datos de liberación de TNF
utilizando el clon CTL IVSB.
La Figura 3C muestra la liberación de TNF
utilizando el clon CTL 10/196.
La Figura 4 presenta un panel de tejidos, líneas
de células y tumores ensayados respecto a la expresión del gen
AaG1c124 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando sondas oligonucleotídicas derivadas de la molécula de
ácido nucleico descrita en esta memoria.
Se estableció una línea de células de melanoma,
"LB-39-MEL", a partir de
células de melanoma obtenidas del paciente LB39, utilizando
metodologías estándar. Una vez que se estableció la línea de
células, se irradió una muestra de la misma, a fin de hacerla
no-proliferativa. Estas células irradiadas se
utilizaron luego para aislar células T citolíticas ("CTLs")
específicas para ellas.
Se tomó una muestra de células mononucleares de
sangre periférica ("PBMCs") del paciente LB39, y se puso en
contacto con las células de melanoma irradiadas. Se observó la
mezcla respecto a lisis de las células de melanoma, lo que indicó
que células CTLs específicas para un complejo de péptido y molécula
HLA presentado por las células de melanoma estaban presentes en la
muestra.
El ensayo de lisis empleado fue un ensayo de
liberación de cromo conforme a Herin et al., Int. J. Cancer
39: 390-396 (1987). El ensayo, sin embargo, se
describe en esta memoria. Las células diana de melanoma se dejaron
crecer in vitro, y se resuspendieron luego en una relación
de 10^{7} células/ml en DMEM, complementado con HEPES 10 mM y FCS
al 30%, y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC con 200 \muCi/ml
de Na(^{51}Cr)O_{4}. Las células marcadas se
lavaron tres veces con DMEM, complementado con Hepes 10 mM. Éstas se
resuspendieron luego en DMEM complementado con Hepes 10 mM y FCS al
10%, después de lo cual se distribuyeron partes alícuotas de 100
\mul que contenían 10^{3} células en microplacas de 96
pocillos. Se añadieron muestras de PBLs en 100 \mul del mismo
medio, y los ensayos se realizaron por duplicado. Las placas se
centrifugaron durante 4 minutos a 100 g, y se incubaron durante 4
horas a 37ºC en una atmósfera con 80% de CO_{2}.
Las placas se centrifugraron nuevamente, y se
recogieron y contaron partes alícuotas de 100 \mul de
sobrenadante. El porcentaje de liberación de ^{51}Cr se calculó
como sigue:
% \ liberación \ ^{51}Cr =
\frac{(ER - SR)}{(MR - SR)} \ x \
100
donde ER es la liberación experimental observada
de ^{51}Cr, SR es la liberación espontánea medida por incubación
de 10^{3} células marcadas en 200 \mul de medio solo, y MR es
la liberación máxima, obtenida por adición de 100 \mul de Triton
X-100 al 0,3% a las células
diana.
Aquellas muestras de sangre mononuclear que
exhibían actividad de CTL alta se expandieron y clonaron por
dilución limitante, y se exploraron nuevamente, utilizando la misma
metodología. De este modo se aisló el clon CTL
LB39-CTL I/95.
Se utilizó el mismo método para ensayar células
diana K562, así como blastos autólogos de células T inducidas por
PHA. Estos resultados, presentados en la Figura 1A, muestran que
este clon CTL reconoce y lisa la línea de células de melanoma, pero
no las células K562 ni los blastos de células T. Se ensayó luego el
CTL, LB39-CTL I/95 contra las líneas de células de
melanoma SK23-MEL y SK29 MEL, de la misma manera
descrita arriba. Se lisaron también células procedentes de estas
dos líneas Estas líneas se aislaron ambas de pacientes que se
tipificaron como HLA-A2, al igual que LB39. Esto
sugería que el clon CTL LB39- CTL I/95 reconocía un antígeno
presentado por HLA-A2.
Se realizaron estudios adicionales para
determinar si LB39-CTL I/95 producía también factor
de necrosis de tumores ("TNF") cuando estaba en contacto con
las células diana. El método utilizado fue el descrito por
Traversari et al., Immunogenetics 35:
145-152 (1992), cuya descripción se incorpora por
referencia. De forma resumida, se combinaron muestras de la línea
CTL con muestras de una célula diana de interés, en medio de
cultivo. Después de 24 horas, se retiró el sobrenadante de los
cultivos, y se ensayó luego en células WEHI sensibles a TNF. Además
de LB39-MEL y SK23-MEL, descritas
anteriormente, se ensayaron otra línea HLA-A2, a
saber, SK29-MEL.1, una variante con pérdida de
HLA-A2, a saber, SEK29- MEL1.22, y una línea
distinta de HLA-A2, a saber,
MZ2-MEL, que es HLA-A1.
Los resultados, presentados en términos del
porcentaje de células WEHI que morían después de la exposición al
sobrenadante, se muestran en la Figura 2. Estos resultados
demuestran que la variante con pérdida de HLA-2
SK29-MEL.1.22 ya no es capaz de estimular el clon
CTL, confirmando así que el antígeno reconocido por
LB39-CTL-I/95 es presentado por
HLA-A2.
Los resultados del Ejemplo 2 indicaron que SK
MEL29.1 presentaba el antígeno diana de interés. Como tal, se
utilizó el mismo como fuente de mRNA total para preparar una
genoteca de cDNA.
El RNA total se aisló de la línea de células. El
mRNA se aisló utilizando un estuche de fijación de
oligo-dT, siguiendo técnicas bien reconocidas. Una
vez obtenido el mRNA, se transcribió el mismo en cDNA, utilizado de
nuevo metodologías estándar. El cDNA se ligó después a adaptadores
EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI del plásmido
pcDNA-I/Amp, de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los plásmidos recombinantes se sometieron luego a
electroporación en E. coli JM101 (condiciones de
electroporación: 1 pulso a 25 \mufaradios, 2500 V).
Las bacterias transfectadas se seleccionaron con
ampicilina (50 \mug/ml), y se dividieron luego en 800 agrupaciones
de 100 clones cada una. Cada agrupación representaba aproximadamente
50 cDNAs diferentes, dado que el análisis demostró que
aproximadamente el 50% de los plásmidos contenían una inserción.
Cada agrupación se multiplicó hasta saturación, y se aisló el DNA
plasmídico por lisis alcalina, precipitación con acetato de potasio
sin extracción con fenol, conforme a Maniatis et al., en
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.,
1982).
Después de la preparación de la genoteca descrita
en el Ejemplo 3, el cDNA se transfectó en células eucariotas. Las
transfecciones, descritas en esta memoria, se llevaron a cabo por
duplicado. Se sembraron muestras de células COS-7, a
15.000 células/pocillo en micropocillos de cultivo de tejidos con
fondo plano, en Medio Eagles Modificado por Dulbecco ("DMEM")
complementado con suero de ternero fetal al 10%. Las células se
incubaron durante una noche a 37ºC, se retiró el medio y se
reemplazó luego por 30 \mul/pocillo de medio DMEM que contenía
suero Nu al 10%, 400 \mug/ml de DEAE-dextrano,
cloroquina 100 \muM, 100 ng del plásmido
pcDNA-I/Amp-A2 y 100 ng de DNA de
una agrupación de la genoteca de cDNA descrita arriba. El plásmido
pcDNA-I/Amp-A2 contiene el gen
HLA-A2 de SK2-MEL. Después de 4
horas de incubación a 37ºC, se retiró el medio, y se reemplazó por
50 \mul de PBS que contenía 10% de DMSO. Este medio se retiró al
cabo de 2 minutos y se reemplazó por 200 \mul de DMEM
complementado con 10% de FCS.
Después de este cambio de medio, se incubaron
células COS durante 48 horas a 37ºC. Se desechó luego el medio, y se
añadieron 1000 células de CTL I/95, en 100 \mul de medio Iscove
que contenía 10% de suero humano agrupado, complementado con 25
U/ml de IL-2. Se retiró el sobrenadante después de
24 horas, y se determinó el contenido de TNF en el ensayo sobre
células WEHI, como ha sido descrito por Traversari et al.,
supra, incorporado previamente por referencia.
De las 800 agrupaciones ensayadas, el 99%
estimulaban la liberación de TNF, a una concentración comprendida
entre 3 y 6 pg/ml en el sobrenadante. Dos agrupaciones daban
rendimientos superiores a 8 pg/ml, produciendo también un pocillo
duplicado más de 8 pg/ml.
Las dos agrupaciones que presentaban rendimientos
elevados de TNF en el sobrenadante se seleccionaron para estudio
ulterior. Específicamente, se clonaron las bacterias, y se
ensayaron 800 bacterias de cada agrupación. Se extrajo de ellas DNA
plasmídico, se transfectó a una nueva muestra de células COS de la
misma manera descrita anteriormente, y las células se ensayaron de
nuevo respecto a estimulación del clon LB39-CTL
I/95. Se encontró un solo clon positivo, que se designó AaG1c124.
Se obtuvo una evidencia convincente de que las células
transfectadas eran reconocidas por CTLs realizando un ensayo
comparativo de células COS transfectadas con cDNA proceente del clon
positivo y el gen HLA-A2, células COS transfectadas
solamente con HLA-A2, y la línea
SK29-MEL. La liberación de TNF en el sobrenadante de
CTL se midió por ensayo del mismo en células WEHI, como se ha
expuesto anteriormente. La densidad óptica de las células WEHI
supervivientes se midió utilizando MTT. La Figura 3A muestra los
resultados obtenidos con el clon CTL I/95.
Ensayos ulteriores demostraron que el péptido
presentado por HLA-A2 en las células transfectadas
era diferente del observado previamente, es decir, un péptido
derivado de tirosinasa. El clon CTL IVSB es específico para los
complejos del péptido derivado de tirosinasa y
HLA-A2. Cuando este clon CTL se puso en contacto
con células transfectadas con AaG1c124 y HLA-A2, la
liberación de TNF era mínima, como se muestra en la Figura 3B.
Se extrajo el cDNA procedente del clon positivo,
y se secuenció siguiendo métodos conocidos en la técnica. Una
investigación de la secuencia reveló que la inserción del plásmido
no exhibía homologia alguna con genes o proteínas conocidos. La
SECUENCIA ID NO: 1 presenta información de los nucleótidos de cDNA,
mostrando un gran marco de lectura abierta desde las posiciones 75 a
431, correspondiente a un producto proteínico de 119 aminoácidos.
La Secuencia ID NO: 2 expone la secuencia extendida de la cual es
una parte SEQ ID NO: 1.
De la misma manera que se aisló el clon CTL
LB39-CTL I/95, se utilizaron una muestra de PBMCs y
una línea de células de melanoma obtenida del paciente
SK29(AV) para aislar el clon CTL SK29-CTL
10/196. Esta nueva línea de células se ensayó de la misma manera
que se indica en el Ejemplo 5. Los resultados de los ensayos,
representados en la Figura 3C muestran que el antígeno de rechazo de
tumores codificado por AaG1cl24 (al que se hace referencia como
antígeno "LB39-Aa" en lo sucesivo), es
reconocido también por este clon CTL. Estos experimentos indican
que otros pacientes pueden generar, y de hecho generan, CTLs
específicas para este antígeno.
Se derivaron sondas oligonucleotídicas de las
secuencias descritas, y se utilizaron en metodologías estándar de
la reacción en cadena de la polimerasa para determinar la expresión
del gen en tejidos normales, tumores, y líneas de células
tumorales. Estos resultados se presentan en la Figura 4, y
demuestran que entre los tejidos normales ensayados, únicamente los
melanocitos expresaban el gen.
Obsérvese la expresión en todas las muestras de
tumor y/o líneas de células de melanoma ensayadas.
Los experimentos que anteceden describen una
secuencia de ácido nucleico recién aislada codificante de un
precursor de antígeno de rechazo de tumores, una molécula
"TRAP". La molécula es procesada intracelularmente de una
manera que conduce a la producción de al menos un antígeno de
rechazo de tumores, o "TRA", que es presentado por moléculas
HLA-A2. Si bien se ha observado previamente que las
moléculas HLA-A2 presentan péptidos derivados de
tirosinasa, las secuencias de ácido nucleico de la invención no
codifican tirosinasa, y los TRAs no se derivan de tirosinasa.
Así pues, la invención implica una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica un precursor de antígeno de
rechazo de tumores, o "TRAP", con la salvedad de que el TRAP
no es tirosinasa. El TRAP codificado es uno que se procesa para dar
al menos un antigeno de rechazo de tumores, o TRA, que es
presentado por moléculas HLA-A2 en las superficies
celulares. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden
ser, v.g., DNA genómico ("gDNA"), DNA complementario
("cDNA"), o una forma de RNA. La invención implica también
moléculas aisladas de ácido nucleico que son complementarias para
las moléculas descritas anteriormente. Una forma especialmente
preferida de la invención es una molécula que contiene la secuencia
expuesta en SEQ ID NO: 1.
La invención abarca también vectores que
contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención, enlazadas
operativamente a un promotor. Los vectores pueden incluir también
una molécula codificante de HLA-A2. Dado que estas
dos moléculas, a saber, HLA-A2 y el TRAP son
necesarias para generar una respuesta citolítica de las células T,
la invención abarca también sistemas de expresión en los cuales
moléculas de ácido nucleico codificantes de TRAP y de
HLA-A2 se presentan como porciones separadas en,
v.g., un estuche. La invención abarca también líneas de células
transfectadas por los vectores descritos en esta memoria, sean
éstos células procariotas, tales como E. coli, o células
eucariotas, tales como células de ovario de hámster chino
("CHO") o células COS.
Como se ha indicado, los complejos de TRA y
HLA-A2 provocan una respuesta citolítica de las
células T, y como tales complejos aislados de antígeno de rechazo
de tumores y una molécula HLA-A2 están abarcados
también por la invención, como lo están los precursores de antígeno
de rechazo de tumores aislados codificados por las secuencias de
ácido nucleico descritas previamente.
La invención que se describe en esta memoria
tiene numerosas aplicaciones, algunas de las cuales se describen a
continuación. En primer lugar, la identificación de un antígeno de
rechazo de tumores que es presentado específicamente por moléculas
HLA-A2, así como una molécula de ácido nucleico
codificante de su precursor de antígeno de rechazo de tumores
paralelo permite a los expertos diagnosticar un trastorno
caracterizado por la expresión del TRAP. Estos métodos implican
determinar la expresión del gen TRAP, y/o TRAs derivados del mismo,
tales como TRA presentado por HLA-A2. Otros TRAs
pueden derivarse también de los TRAPs de la invención y ser
presentados por diferentes moléculas HLA. En la primera situación,
dichas determinaciones pueden llevarse a cabo por cualquier ensayo
estándar de determinación de ácido nucleico, con inclusión de la
reacción en cadena de la polimerasa, o ensayos con sondas de
hibridación marcadas. En la última situación, es especialmente
preferido el ensayo con parejas de fijación para los complejos de
TRA y HLA, tales como anticuerpos.
El aislamiento del gen TRAP hace posible también
aislar la molécula TRAP propiamente dicha, especialmente moléculas
TRAP que contienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Estas moléculas aisladas, una vez presentadas como el TRA, o como
complejos de TRA y HLA, tales como HLA-A2, pueden
combinarse con materiales tales como adyuvantes para producir
vacunas útiles en el tratamiento de trastornos caracterizados por
la expresión de la molécula TRAP. Adicionalmente, pueden prepararse
vacunas a partir de células que presentan los complejos
TRA-HLA en su superficie, tales como células de
cáncer no proliferativas, transfectantes no proliferativos,
etcétera. En todos los casos en que se utilizan células como
vacuna, éstas pued en ser células transfectadas con secuencias
codificantes de uno o ambos de los componentes necesarios para
demostrar una respuesta de CTL, o pueden ser células que expresan
ambas moléculas sin transfección. Adicionalmente, la molécula TRAP,
sus TRAs asociados, así como complejos de TRA y HLA, pueden
utilizarse para producir anticuerpos, utilizando métodos estándar
bien conocidos en la técnica.
Cuando se utiliza en esta memoria el término
"trastorno", el mismo hace referencia a cualquier condición
patológica en la cual se expresa el precursor de antígeno de
rechazo de tumores. Un ejemplo de un trastorno de este tipo es el
melanoma canceroso en particular.
Los métodos terapéuticos basados en la presente
exposición están basados en una respuesta del sistema inmune de un
individuo, que conduce a la lisis de las células presentadoras de
TRA, tales como las células HLA-A2. Un método de
este tipo es la administración de CTLs específicas para el complejo
a un individuo que presenta células anormales del fenotipo en
cuestión. Está dentro de la experiencia del especialista
desarrollar tales CTLs in vitro. Específicamente, una
muestra de células, tales como células de la sangre, se ponen en
contacto con una célula presentadora del complejo y capaz de
provocar la proliferación de una CTL específica. La célula diana
puede ser un transfectante, tal como una célula COS del tipo
descrito anteriormente. Estos transfectantes presentan el complejo
deseado en su superficie y, cuando se combinan con una CTL de
interés, estimulan su proliferación. Las células COS, tales como
las utilizadas en esta memoria, están ampliamente disponibles, al
igual que otras células huésped adecuadas.
Para detallar la metodología terapéutica, a la
que se hace referencia como transferencia adoptiva (Greenberg, J.
Immunol. 136(5): 1917 (1986); Reddel et al., Science 257:
238 (7-10-92); Lynch et al.,
Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410 (1991); Kast et
al., Cell 59: 603-614
(11-17-89)), las células que
presentan el complejo deseado se combinan con CTLs conduciendo a la
proliferación de las CTLs específicas de ellas. Las CTLs
proliferadas se administran luego a un individuo que presenta una
anormalidad celular que se caracteriza por ciertas de las células
anormales que presentan el complejo particular. Las CTLs lisan luego
las células anormales, alcanzando con ello la meta terapéutica
deseada.
La terapia que antecede supone que al menos
algunas de las células anormales del individuo presentan el complejo
HLA/TRA. Esto puede determinarse muy fácilmente, dado que la
técnica está muy familiarizada con métodos para identificar células
que presentan una molécula HLA particular, así como el modo de
identificar células que expresan DNA que contiene las secuencias
indicadas. Una vez aisladas, tales células pueden utilizarse con
una muestra de células anormales de un individuo para determinar la
lisis in vitro. Si se observa lisis, entonces el uso de CTLs
específicas en una terapia de este tipo puede aliviar la condición
asociada con las células anormales. Una metodología menos compleja
examina las células anormales para determinar el fenotipo de HLA,
utilizando ensayos estándar, y determina la expresión por
multiplicación utilizando, v.g., PCR.
La transferencia adoptiva no es la única forma de
terapia que está disponible de acuerdo con la invención. Las CTLs
pueden provocarse también in vivo, utilizando diversos
métodos. Un método, a saber, el uso de células no proliferativas
que expresan el complejo, se ha detallado anteriormente. Las
células utilizadas en este método pueden ser aquéllas que expresan
normalmente el complejo, tales como células de melanoma irradiadas
o células transfectadas con uno o ambos de los genes necesarios
para presentación del complejo. Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 110-114 (enero, 1991) ilustra este enfoque,
demostrando el uso de células transfectadas que expresan péptidos
HPVE7 en un régimen terapéutico. Pueden utilizarse diversos tipos
de células. Análogamente, se pueden utilizar vectores que son
portadores de uno o ambos de los genes de interés. Se prefieren
especialmente vectores víricos o bacterianos. En estos sistemas, el
gen de interés es transportado por, v.g., un virus Vaccinia o
la bacteria BCG, y los materiales "infectan" de hecho células
huésped. Las células que resultan presentan el complejo de interés,
y son reconocidas por CTLs autólogas, las cuales proliferan
entonces. Un efecto similar puede conseguirse por combinación de
antígeno de rechazo de tumores o el precursor del mismo con un
adyuvante para facilitar la incorporación en células presentadoras
de HLA-A2 que presentan la molécula HLA de interés.
El TRAP se procesa para producir el socio peptídico de la molécula
HLA mientras que el TRA se presenta sin necesidad de procesamiento
ulterior. Otros aspectos de la invención estarán claros para el
técnico experto y no precisan ser repetidos aquí.
Los términos y expresiones que se han empleado se
utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no se
tiene intención alguna en el uso de dichos términos y expresiones
de excluir cualesquiera equivalentes de las características
indicadas y descritas o porciones de las mismas, reconociéndose que
son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la
invención.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Brichard, Vincent, Van Pel, Aline, Traversari, Catia, Wölfel, Thomas, Boon-Falleur, Thierry, De Plaen, Etienne
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIA AISLADA DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN PRECURSOR DE ANTÍGENO DE RECHAZO DE TUMORES PROCESADO PARA AL MENOS UN ANTÍGENO DE RECHAZO DE TUMORES PRESENTADO POR HLA-A2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Felfe & Lynch
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 805 Third Avenue
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: New York City
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10022
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete, 5,25 pulgadas (13,1 cm), 360 kb de almacenamiento
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: WordPerfect
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/032.978
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-marzo-1993
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hanson, Norman D.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.946
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: LUD 309
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 688-9200
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 838-3884
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 354 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 676 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
Claims (20)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica o que es complementaria para una molécula de ácido
nucleico que codifica un precursor de antígeno de rechazo de
tumores, en la cual dicho precursor de antígeno de rechazo de
tumores está procesado a un antígeno de rechazo de tumores
presentado por moléculas HLA-A2 y comprende la
secuencia de aminoácidos expresada en SEQ ID NO: 1.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 1, en la cual dicha molécula es
DNA.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 2, en la cual dicha molécula de ácido
nucleico es cDNA.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
5. Un vector de expresión recombinante, que
comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1-4, que codifica un
precursor de antígeno de rechazo de tumores, enlazado operativamente
a un promotor.
6. Un vector de expresión recombinante de acuerdo
con la reivindicación 5, que comprende adicionalmente una molécula
de ácido nucleico que codifica HLA-A2.
7. Una cepa de células procariotas o línea de
células eucariotas transformada o transfectada con una molécula de
ácido nucleico aislada de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, o un vector de expresión
recombinante de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6.
8. Una cepa de células procariotas o línea de
células eucariotas de acuerdo con la reivindicación 7, transfectada
con un vector de expresión recombinante o molécula de ácido
nucleico que codifica HLA-A2.
9. Un método para diagnosis del melanoma, que
comprende poner en contacto una muestra de un individuo con una
célula T citolítica, o un anticuerpo específico para un complejo de
una molécula HLA-A2 y un antígeno de rechazo de
tumores y determinar interacción entre dicho complejo y dicha célula
T citolítica, o anticuerpo como una determinación del melanoma, en
el cual dicho antígeno de rechazo de tumores se procesa a partir de
un precursor de antígeno de rechazo de tumores que comprende la
secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1.
10. Un método para diagnosis del melanoma, que
comprende poner en contacto una muestra de un individuo con un ácido
nucleico capaz de fijar la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 en
condiciones estándar de la reacción en cadena de la polimerasa o un
anticuerpo específico para la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1 o
un producto de expresión del mismo, y determinar interacción entre
dicho ácido nucleico capaz de fijar la secuencia indicada en SEQ ID
NO: 1 en condiciones estándar de la reacción en cadena de la
polimerasa o anticuerpo y dicha secuencia o dicho producto de
expresión como una determinación de melanoma.
11. Un precursor de antígeno de rechazo de
tumores aislado codificado por una molécula de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha molécula de ácido
nucleico codifica dicho precursor de antígeno de rechazo de
tumores.
12. Un anticuerpo aislado que se fija
específicamente a un precursor de antígeno de rechazo de tumores de
acuerdo con la reivindicación 11.
13. Una célula T citolítica específica de un
complejo de un HLA y un antígeno de rechazo de tumores que se
procesa a partir del precursor de antígeno de rechazo de tumores
que es codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en
SEQ ID NO: 1, para uso en un método de tratamiento del melanoma.
14. Una célula no proliferativa que expresa un
complejo de un HLA y un antígeno de rechazo de tumores que se
procesa a partir del precursor de antígeno de rechazo de tumores
que es codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en
SEQ ID NO: 1, para uso en un método de tratamiento del melanoma.
15. Un vector de expresión recombinante que
comprende una molécula de ácido nucleico como se indica en SEQ ID
NO: 1, que codifica un precursor de antígeno de rechazo de tumores,
enlazado operativamente a un promotor, para uso en un método de
tratamiento del melanoma.
16. Una composición que comprende un precursor de
antígeno de rechazo de tumores que comprende la secuencia de
aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1, o un antígeno de rechazo de
tumores procesado a partir de dicho precursor de antígeno de
rechazo de tumores, y un adyuvante, para uso en un método de
tratamiento del melanoma.
\newpage
17. Uso de una célula T citolítica específica
para un complejo de un HLA y un antígeno de rechazo de tumores que
se procesa a partir del precursor de antígeno de rechazo de tumores
que es codificado por la secuencia de ácido nucleico indicada en
SEQ ID NO: 1, en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento terapéutico del melanoma.
18. Uso de una célula no proliferativa que
expresa un complejo de un HLA y un antígeno de rechazo de tumores
que se procesa a partir del precursor de antígeno de rechazo de
tumores que es codificado por la secuencia de ácido nucleico
indicada en SEQ ID; NO: 1, en la fabricación de un medicamento para
el tratamiento terapeútico del melanoma.
19. Uso de un vector de expresión recombinante
que comprende una molécula de ácido nucleico como se indica en SEQ
IDNO: 1, que codifica un precursor de antígeno de rechazo de
tumores, enlazado operativamente a un promotor, en la fabricación
de un medicamento para el tratamiento terapéutico del melanoma.
20. Uso de una composición que comprende un
precursor de antígeno de rechazo de tumores que comprende la
secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 1, o un antígeno de
rechazo de tumores procesado a partir de dicho precursor de
antígeno de rechazo de tumores, y un adyuvante, en la fabricación de
un medicamento para el tratamiento terapéutico del melanoma.
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