JP3536179B2 - Ｈｌａ−ａ２分子と複合する腫瘍拒絶抗原前駆体由来の単離ペプチド - Google Patents

Ｈｌａ−ａ２分子と複合する腫瘍拒絶抗原前駆体由来の単離ペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は、1994年３月24日出願の出願番号第07/217,1
86号の一部継続出願である1994年６月17日出願の出願番
号第08/261,160号の一部継続出願である1994年８月15日
出願の出願番号第08/290,381号の一部継続出願である。
本体は、添付する参考文献の全ての出願に対する優先を
主張する。
発明の分野 本発明は、免疫遺伝学とペプチド化学とに関する。詳
しくは、本発明は、免疫源およびHLA−A2分子のための
リガンドとしての使用を含む様々な用途において有用な
デカ及びノナペプチドに関する。詳しくは、本発明は、
腫瘍拒絶抗原前駆体から由来し、かつ、HLA−A2分子に
よって提示されるいわゆる”腫瘍拒絶抗原”に関する。
背景の従来技術 宿主細胞による癌細胞の認識または認識の欠如の研究
は、数多くの方向で行われてきた。この分野の理解に
は、基礎免疫学と腫瘍学との両方についていくらか理解
していることが前提となる。
マウス腫瘍に関する初期の研究によって、これらの腫
瘍が同系の動物に移植されたときに、腫瘍細胞の拒絶に
導く分子を示すことが判った。これらの分子は、受容側
の動物のＴ細胞によって”認識”され、移植された細胞
の溶解を伴う細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発する。この最
初の証拠は、メチルコラントレン等の化学的発癌物質に
よって誘発された腫瘍によって得られた。腫瘍によって
発現されＴ細胞応答を導出する抗原は、腫瘍によって異
なることが判った。化学的発癌物質による腫瘍の誘発と
細胞表面抗原の相違に関する一般的教示内容に関しては
プレーン（Prehn）他,J.Natl.Canc.Inst 18:769〜778
（1957）；クライン（Klein）他,Cancer Res.20:1561
〜1572（1960）；グロス（Gross）,Cancer Res.3:326
〜333（1943），ベイソンブリオ（Basombrio）,Cancer
Res.30:2458〜2462（1970）を参照。この種の抗原
は、”腫瘍特異性移植抗原”即ち"TSTAs"として知られ
るようになった。化学的発癌物質によって誘発された時
におけるそのような抗原の発現が観察された後、腫瘍が
生体外で紫外線照射によって誘発された場合にも類似の
結果が得られた。クリプケ（Kripke）,J.Natl.Canc.Ins
t.53:333〜1336（1974）参照。
上述のタイプの腫瘍に関してはＴ細胞を介した免疫応
答が観察されたが、一方、自然発生性腫瘍は一般的に非
−免疫原性であると教示された。従って、これらは、腫
瘍を有する対象体の腫瘍に対する反応を誘発する抗原を
提示するものではないと考えられた。ヒューイット（He
witt）他,Brit.J.Cancer 33:241〜259（1976）参照。
ここに参考文献としてその開示内容を添付するブーン
（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184〜1193（1980）に記載
されているように、tum-抗原提示細胞系のファミリは、
マウス腫瘍細胞または細胞系の突然変異によって得られ
る免疫原性変異体である。詳述すると、tum-抗原は、同
系のマウス中において免疫応答を起こさず腫瘍を形成す
る腫瘍細胞（即ち、"tum+"細胞）を突然変異させること
によって得られる。これらのtum+細胞が突然変異された
とき、これらは同系マウスによって拒絶され、腫瘍を形
成することができない（従って、"tum-"）。ここに、そ
の開示内容を参考文献として添付するブーン（Boon）
他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:272（1977）参照。こ
れまで多くのタイプの腫瘍がこの現象を示すことが証明
されている。例えば、フロスト（Frost）他,Cancer Re
s.43:125（1983）参照。
tum-変異体は、免疫拒絶システムを導出させるので進
行性腫瘍を形成することができないと考えられる。この
仮説を支持する証拠として、ファン・ペル（Van Pel）
他,Proc.Natl,Acad.Sci.USA 76:5282〜5285（1979）に
よる、通常は腫瘍を形成することがない"tum-"変異体
が、致死下の照射によってその免疫システムを抑制した
場合に、マウス内において腫瘍を形成することが出来る
という観察、および肥満細胞腫P815の腹膜注入tum-細胞
が12〜15日間指数関数的に増殖し、その後、リンパ球と
マクロファージの導入によって僅か数日中に除去される
という観察（ウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他,J.Ex
p.Med.152:1175〜1183（1980））等がある。更に、別の
証拠として、マウスが、後に免疫抑制的な量の照射を受
けて細胞が攻撃されても、その後の同じtum-変異体に対
する攻撃に耐えることができる免疫記憶を得るという観
察がある（ブーン（Boon）他,Proc.Natl,Acad.Sci.USA
74:272〜275（1977）；前述のファン・ペル（Van Pe
l）他,;前述のウィッテンホーヴ（Uyttenhove）他）。
その後の研究によって、自然発生性腫瘍が突然変異を
受けたときに、免疫原性変異体を産生し、これが反応を
起こすことが判った。事実、これらの変異体は、元の腫
瘍に対する免疫防御反応を導出することができた。ファ
ン・ペル（Van Pel）他,J.Exp.Med.157:1992〜2001（1
983）参照。従って、同系拒絶反応の標的である腫瘍に
おいて、いわゆる”腫瘍拒絶抗原”の提示を導出するこ
とが可能であることが示された。異質の遺伝子が自然発
生性腫瘍にトランスフェクションされた場合にも、類似
の結果が得られた。この点に関しては、フィアソン（Fe
arson）他,Cancer Res.48:2975〜1980（1988）を参
照。
腫瘍細胞の表面に提示され、細胞障害性Ｔ細胞に認識
され溶解を起こす１つのクラスの抗原が認識された。こ
の類の抗原を、以下、”腫瘍拒絶抗原”即ち"TRAs"とい
う。TRAsには、抗原反応を導出するものもあるし、導出
しないものもある。これらの抗原は、これまで、生体外
での細胞障害性Ｔ細胞の特性研究、即ち、特定の細胞障
害性Ｔ細胞（以下、"CTL"）サブセットによる抗原の同
定の研究、を通じて行われてきた。このサブセットは、
提示された腫瘍拒絶抗原の認識後に増殖し、そして、そ
の抗原を発現している細胞が溶解される。特性研究によ
って、前記抗原を発現する細胞を特異的に溶解するCTL
クローンが同定された。この研究の具体例としては、レ
ヴィ（Levy）他,Adv.Cancr Res.24:1〜59（1977）；ブ
ーン（Boon）他,J.Exp.Med.152:1184〜1193（1980）；
ブルナー（Brunner）他,J.Immunol.124:1627〜1634（19
80）；マリャンスキー（Maryanski）他,Eur.J.Immunol.
124:1627〜1634（1980）：マリャンスキー（Maryansk
i）他,Eur.J.Immunol.126:406〜412（1982）；パラディ
ーノ（Palladino）他,Canc.Res.47:5074〜5079（1987）
が挙げられる。このタイプの分析は、マイナー組織適合
性抗原、雄特異的Ｈ−Ｙ抗原、"tum-"抗原と称され、こ
こに記載のクラスの抗原などの、CTLsによって認識され
る他のタイプの抗原に必要である。
上述の課題の一例である腫瘍は、P815として知られて
いる。ここに、その開示内容を参考文献として添付する
デプレーン（DePlaen）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
5:2274〜2278（1988）；スジコーラ（Szikora）他,EMBO
Ｊ 9:1041〜1050（1990）及びシビル（Sibille）他,
J.Exp.Med.172:35〜45（1990）参照。このP815腫瘍は、
メチルコラントレンによってDBA/2マウス内で誘発さ
れ、生体外腫瘍と細胞系の両方として培養される肥満細
胞腫である。P815系は、突然変異後において、P91A（前
記デプレーン（DePlaen））、35B（前記スジコーラ（Sz
ikora））及びP198（前記シビル（Sibille））と呼ばれ
る変異体など、これまで数多くのtum-変異体を産生して
きた。腫瘍拒絶抗原とは異なり、そしてこれが重要な相
違点であるが、tum-抗原は、腫瘍細胞が突然変異した後
でしか存在しない。腫瘍拒絶抗原は、突然変異が無くて
も、特定の腫瘍の細胞上に存在する。従って、上記参考
文献によれば、ある細胞系が、"P1"と呼ばれる系などの
tum+であり、これを刺激してtum-変異体を産生すること
ができる。tum-表現体はその親細胞系の表現体と異なっ
ているので、tum-細胞系とそのtum+の親の系のDNAの相
違が予想でき、そしてその相違はtum-細胞中における目
的の遺伝子の位置を特定することに利用できる。その結
果、P91A,35B及びP198等のtum-変異体の遺伝子が、遺伝
子の遺伝コード領域における点突然変異によって、その
正常な対立遺伝子と異なっていることが発見された。前
述のスジコーラ（Szikora）及びジビル（Sibille）、及
びラークウィン（Lurquin）他,Cell 58:293〜303（198
9）参照。しかし、これは本発明のTRAsには当てはまら
ないことが判った。これらの参考文献は、更に、前記tu
m-抗原から誘導されたペプチドが、CTLsによって認識さ
れるLd分子によって提示されるものであることを示し
た。P91Aは、Ldによって提示され、P35はDdによって、
そしてP198はKdによって、それぞれ提示される。
本対象の出願と同じ承継人に承継された1992年５月22
日出願のPCT/US92/04354は、MAGEファミリと称するヒト
腫瘍拒絶抗原前駆体のファミリと、各種腫瘍タイプにお
けるそれらの発現を教示している。肺腺癌はこれらには
含まれていない。これらの遺伝子の内のいくつかは、フ
ァン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他、Sci
ence254:1643（1991）においても記載されている。MAGE
遺伝子を開示する添付の参考文献である、米国特許第5,
342,774号を参照のこと、MAGEファミリの種々の遺伝子
が腫瘍細胞において発現され、これらを、そのような腫
瘍を診断するためのマーカとして、あるいは、ここに記
載するその他の目的のためのマーカとして使用可能であ
ることが今や明らかである。トラヴァーサリ（Traversa
ri）他、Immunogenetics 35:145（1992）；ファン・デ
ア・ブルッゲン（van der Bruggen）他、Sicence 25
4:1643（1991）も参照。タンパク質がプロセッシングさ
れ、細胞表面上に提示されるメカニズムがかなり詳細に
報告されている。当該分野における進展の概略は、バリ
ナガ（Barinaga）,"Getting Some'Backbone';How MHC
Binds Peptides",Science 257:880（1992）；又、
フリーモント（Fremont）他,Science 257 919（199
2）；マツムラ（Matsumura）他、Science 257:927（19
92）；ラトロン（Latron）他,Science 257:964（199
2）に見られる。これらの論文は、一般に、MHC/HLA分子
に結合するペプチドは、９のアミノ酸長（”ノナペプチ
ド”）でなければならないことと、このノナペプチドの
第１番目と第９番目の残基の重要性とを指摘している。
ここに記載するように、この”ルール”は一般に真実で
あるので、MHC−クラスＩ分子が結合するペプチドの長
さにはいくらかの幅がある。
遺伝子のMAGEファミリの研究により、いくつかの場合
において、ノナペプチド腫瘍細胞の表面上に提示される
ことと、このノナペプチドの提示には、その提示分子が
HLA−A1でなければならないこと、とがいま明らかにな
った。MAGE−１腫瘍拒絶抗原（"TRA"又は”ノナペプチ
ド”）の複合体によって、それを提示する細胞が、細胞
傷害性Ｔ細胞（"CTLs"）によって溶解される。
共に他のMAGE由来ペプチドに関する研究を提供してい
る、トラヴァーサリ（Traversari）他の1994年３月24日
出願の出願番号第08/217,188号と、メリーフ（Merief）
他の1994年３月24日出願の出願番号第08/217,187号に注
目されたい。
1992年８月31日出願の米国特許出願第07/938,334号
と、1993年６月７日出願の米国特許出願第073,103号に
提供されている研究において、種々のMAGE遺伝子の相同
領域が、関連するノナペプチドをコードするMAGE−１遺
伝子の領域と比較されたときに、高度なホモロジーの存
在することが示されている。事実、これらの観察によっ
て、すべて同じＮ末端およびＣ末端アミノ酸を有するノ
ナペプチドのファミリという、ここに開示された請求の
範囲に記載されている本発明の一態様が導かれたのであ
る。これらのノナペプチドは、単体またはキャリアペプ
チドとの結合した状態において、免疫源としての利用方
法を含む種々の目的において有用であると記載された。
ノナペプチドは、抗原エピトープを構成するのに十分な
寸法のものであり、これに対して生成される抗体は、前
記ノナペプチドが単体として存在する場合、あるいは、
それがより大なるポリペプチドの一部として存在する場
合において、このノナペプチドを同定するのに有用であ
ると記載されている。
これらの参考文献、特に、出願番号第073,103号は、H
LA−A1とMAGE−３との間の関連性を示した。しかし、コ
ーカソイド人種の僅か26％と、ネグロイド人種の僅か17
％だけが、細胞表面においてHLA−A1分子を提示するに
過ぎない。従って、他のタイプのMHC分子によって提示
されるペプチドに関して追加の情報を得て、適度な割合
の人々が前述した研究から恩恵を受けることかできるよ
うになることが望ましい。
MAGE−３由来ペプチドの抗原提示がHLA−A1分子に限
定されないことが、いま発見された。本発明は、以下の
開示において、MHCクラスＩ分子HLA−A2と複合化するペ
プチドを同定するものである。治療および診断のための
利用を含む、以下に開示される本発明の課題は、この知
見から導かれる様々な派生効果を含むものである。
MAGE−３由来ペプチドの提示が、HLA−A1分子に限定
されないことが今回発見された。以下の開示に示される
本発明は、MHCクラスＩ分子HLA−A2と複合する、MAGE−
３及びその他のMAGE TRAPSを同定するものである。そ
の治療用途および診断用途を含む、この知見から導かれ
る派生効果も、以下の開示に記載される本発明の課題に
含まれる。
図面の簡単な説明 図１は、ここに記載したペプチドに対する最初のスク
リーニングデータの結果を示す。
図２は、配列認識番号（SEQ ID NO）:2及び配列認
識番号（SEQ ID NO）:6とを使用して得た適定データ
を示す。
図３は、ペプチドとHLA分子との複合体に対して特異
的なCTLsを誘発することが可能であるか否かを判定する
ように構成した実験において得られた結果を示す。Ｘ軸
は、エフェクタ標的細胞の比率を示し、Ｙ軸は、クロム
放出による、溶解の百分率を示す。
図4A,4B,4C及び4Dは、限定希釈アッセイの結果見つけ
られた４種の特定のCTLsのそれぞれで得られた溶解の百
分率を示している。標的はT2細胞であった。
図5A〜5Dは、前記CTLsのそれぞれを、種々の形質転換
および非形質転換細胞、及びトランスフェクション細胞
に対してテストしたときに得られた結果を示す。
図6A及び6Bは、COS−７細胞を、HLA−A2,MAGE−３及
びMAGE−12cDNAの１つまたはそれ以上によってトランス
フェクションした時に得られた結果を示す。使用したア
ッセイは、WEHI−164クローン13細胞を使用した、TNF放
出アッセイであった。コントロール実験においては、HL
A−A2,MAGE−３及びMAGE−12 cDNAの１つのみを使用し
た。図6Aは、CTLクローン279/19でのテストに関し、図6
BはCTLクローン297/22を使用した場合である。
図7A及び7Bは、HLA−A2+/MAGE−3+である細胞を、MAG
E−３又はHLA−A2のいずれか一方に関して陽性である
が、その両方に対しては陽性でない細胞と比較したTNF
放出アッセイにおける結果を示す。図7Aにおいて、CTL2
79/19が使用され、これに対して、図7Bのデータを生成
するためにはCTL297/22が使用される。
図８は、HLA−A2+細胞を、HAL−A2+/MAGE−3+である
細胞（即ち、SK23−MEL,LB43−MEL,LB273−MEL 4.0）
と同様に、配列認識番号（SEQ ID NO）:6（細胞系T
2）と組み合わせて使用した51Cr放出アッセイを示す。
図９は、（ｉ）ノナペプチド Phe Leu Trp Gly
Pro Arg Ala Leu Val（配列認識番号（SEQ ID N
O）:6）又は（ii）Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala
Leu Ile（配列認識番号（SEQ ID NO）:12）のいず
れか１つとインキュベートとしておいたT2細胞の溶解を
示す。
好適実施例の詳細な説明 例１ この一連の実験において使用した方法は、ここにそれ
らの全部を文献として添付する、エルビン（Elvin）
他、J.Imm.Meth.158:161〜171（1993）、タウンゼント
（Townsend）他、Nature 340:443〜448（1989年８月10
日）及びタウンゼント（Townsend）他、Cell 62:285〜
290（1990年７月27日）に記載された方法と類似してい
る。
前述したように細胞系.174を使用した。これは、MHC
クラスＩヘテロダイマーの組立部位である、ペプチドを
小胞に供給する経路が欠失したHLA−A2提示細胞系であ
る。この細胞系は、MHCクラスＩ分子を組立てることが
できるが、これらは不安定であって、細胞溶解すると、
一晩のインキュベーションで、遊離重鎖および軽鎖に分
解される。しかし、前記ヘテロダイマーは、適当なペプ
チドリガンドを添加することによってインヴィトロで安
定化させることが可能である（タウンゼント（Townsen
d）他、Nature 340:443〜448（1989）；タウンゼント
（Townsend）他、Cell 62:285〜295（1990））。従っ
て、安定化された細胞を、MHCクラスＩ分子に対して特
異的な抗体によって免疫沈降させることが可能である。
これらの実験の第１部分において、ペプチドが前記細
胞系においてHLA−A2の組立を促進するか否かをテスト
した。テストしたペプチドは、以下を含むものであっ
た。
細胞を、［35S］メチオニンに対する暴露によってラ
ベル化した（100〜200μCiでラベル化した１〜2x107の
細胞のアリコット、60分間の接触）。次に、これらの細
胞を、一度、リン酸塩緩衝化塩類溶液によって洗浄し、
その後、10mlの溶解緩衝液（0.5％NP40;0.5％ Mega
9,150mM NaCl,5mM EDTA,50mM Tris［pH7.5］,2mM
フェニールメチルスルホニルフルオライド,5mM ヨー化
アセトアミド）中で再懸濁した。次に、その溶解物を、
ペプチド（10μＭ及び20μＭ）と15〜18時間インキュベ
ートした。その後、核をミクロフュージ（microfuge）
でペレット化し、溶解物を、0.2mlの洗浄された10％（w
/v）のブドウ球菌Ａ組織にて一晩、４℃で、予め清澄化
（precleared）した。溶解物を２つのポーションに分割
し、モノクローナル抗体BB7.2を、5ug/mlの最終濃度で
添加した。このmAbは、パーマ（Parham）他、Hum.Immno
l.3:277〜299（1981）によって記載された配座特異的HL
A−A2認識mAbである。これらの混合物を、90分間氷上で
インキュベートし、その後、ウシ血清胚アルブミンを１
％（w/v）、そして、100ulの５％（w/v）タンパク−Ａ
セファローズビーズを添加した。チューブを45分間回転
させ、その後、1mlの洗浄緩衝液（0.5％ NP−40,150mM
NaCl,5mM EDTA,50mM Tris［pH7.5］）で、４回、洗
浄した。サンプルを溶出し、タウンゼント（Townsend）
他、Nature340:443〜448（1989）に従って、12％ポリア
クリルアミドゲル上で分析した。
図１は、陽性の結果のペプチドについてのこれらの実
験結果を示している。これらは、濃色のバンドによって
証明されているように、配列認識番号（SEQ ID NO
S）:2,6,7,8及び10であり、前記ゲル全部に共通のHC
（重鎖）によって示され、電気泳動の前に、前記ペプチ
ドと複合していた免疫沈降したMHC分子（HLA−A2）を表
している。
この図は、左から右に配列認識番号（SEQ ID NO）:
2,6,7,8及び10での研究を示している。縦棒が、配列認
識番号（SEQ ID NO）:10に関する実験を、".174","A2
系”及び",174マトリクス”と記載されたレーンから分
離している。.174は、MHCクラスＩ分子の重鎖に関し
て”陰性”のコントロールである。前述したように、こ
の細胞系は、外因性のペプチド無しでは、安定したMHC
−クラスＩ分子を提示せず、mAb BB7.2は配座特異的で
あるので、これは、非複合化MHC−クラスＩ分子を沈降
させない。"A2"は、デマース（DeMars）他、Hum.Immuno
l.111:77（1984）によって記載されたHLA−A2を提示す
る公知の細胞系を示しているが、安定したHLA−A2分子
を提示するすべての細胞は、同じように作用するであろ
う。".174マトリクス”は、.174細胞系を、インフルエ
ンザウィルスから由来し、HLA−A2によって提示される
ことが知られている、コントロールペプチドGILGFVFTL
（配列認識番号（SEQ ID NO）:11）とともにインキュ
ベートしたときの結果を示している。
これらの結果は、"HC"（重鎖）のバンドがA2と.174マ
トリクスとについて得られる結果と同等であるという事
実によって、MHC−クラスＩ分子の安定化を示すもので
ある。事実、MHC分子は、前記還元ゲルによって損傷さ
れているが、重鎖分子は、もしも還元の前に安定化され
るならば、前記配座特異性mAbによって結合されるであ
ろう。これは、事実、前記ゲルが示していること、即
ち、前述したペプチドがHLA−A2分子に結合しそれらを
安定化させたということである。
例２ 結合ペプチドの同定後、一連の適正実験を行った。こ
れらの実験において、ここに参考文献として添付する、
タウンゼント（Townsend）他、Cell 62:285〜295（199
0年７月27日）の293に従って、種々の濃度のペプチド
を、上述した細胞系の溶解物に添加し、免疫沈降させ
て、ペプチドの結合のために最前の濃度を判定した。
図２は、前記ペプチドの内の２つ、即ち、配列認識番
号（SEQ ID NO）:2及び６についての結果を示してい
る。これらのペプチドを、公知のHLA−A2結合ペプチド
配列認識番号（SEQ ID NO）:11に対して、20μＭから
始めて10倍希釈で、2,0.2そして0.002μＭまでの適定を
行った。
これらのペプチド（即ち、配列認識番号（SEQ ID N
O）:2及び６）で実験した。配列認識番号（SEQ ID N
O）:2の場合、ここでは報告されない実験において、ペ
プチドは５〜10nMまで適定された。これは、前記コント
ロール（配列認識番号（SEQ ID NO:11）と同等であっ
た。
例３ 前記ペプチド配列認識番号（SEQ ID NO）:6が、こ
のペプチドの複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔリン
パ球（"CTLs"）と、同様にこのような複合体を溶解する
HLA−A2とを誘発する能力を示すために一連の実験を行
った。これらの実験の第１工程を、ここに記載する。
末梢血液リンパ球（"PBLs"）を、正常なドナー、即
ち、癌腫瘍をなんら有さないドナーから採取した。"LB7
05"と称するこのドナーは、HLA−A1,A2,B8,B27と分類さ
れた。開始時（第０日目）において、前記ドナーからの
PBLsを、106cells/mlの割合で、Iscove's培地と10％胎
児ウシ血清と"AAG"（アスパラギン＋アルギニン＋グル
タミン）、及び20ug/mlのラビット非ヒトIgM抗体と、20
ng/mlの組換えヒトIL−４（"r−hu−IL4"）と、0.005％
のパンソルビン（Pansorbin）細胞との中で懸濁させ
た。この混合物を、24−ウェル組織培養プレート（ウェ
ル当り2ml）に分配した。
第３日目、前記細胞を、遠心分離に掛け、Iscove's培
地と、10％ヒト血清とAAGと20ngmlのｒ−hu−IL−４と
の中で再懸濁させた。
さらに２日後、即ち、第５日目に、前記細胞を再度遠
心分離にかけ、新しいIscove's培地と、10％のヒト血清
とAAGと20ng/mlのｒ−hu−IL−４と、20U/mlの組換えヒ
トγ−インターフェロンとの中で再懸濁させた。
第６日目、前記細胞を、再度、遠心分離に掛け、5x10
6cells/mlの割合で、血清無しのIscove's培地と、50ug/
mlの配列認識番号（SEQ ID NO）:6の前記ペプチド
と、2.5ug/mlのヒトβ２ミクログロブリン中にて再懸濁
させた。これらの細胞を、この混合物中にて、４時間37
℃でインキュベートし、その後、50Gyで照射した。次
に、これらの細胞を再度、遠心分離に掛け、Iscove's培
地と10％のヒト血清＋AAGとの中で再懸濁させた。その
後、これらの細胞を、24ウェル組織培養プレートの個々
のウェル、各ウェル当り１百万の細胞の割合で投入し
た。
次に、応答細胞を添加した。これらは、同様にドナー
LB705から得たCD8+T細胞であった。CD8+細胞の断片は、
Ｔ細胞断片を単離する周知の技術を使用して、前記ドナ
ーのPBSsから入手していたものである。前記応答細胞
を、5x106Cells/wellの割合で、前記各ウェルに添加し
た。最終容量は2mlであった。前記細胞の添加後、1000U
/mlの組換えヒトIL−６（"r−hu−IL−6"）と、10ng/ml
の組換えヒトIL−12（"r−hu−IL−12"）とを添加し
た。
７日後、即ち、第13日目に、前記応答細胞、即ち、CD
8+細胞を再活性化した。これは、上述した混合培地を、
10U/mlのｒ−hu−IL−２と2ng/mlのｒ−hu−IL−７と共
に、自己由来の付着した（adherent）細胞に移すことに
よって行われた。前記自己由来付着細胞は、LB705から
の5x106の照射済み（50Gy）PBLsを、1mlのIscove's培地
＋10％ヒト血清＋AAGとの中で、37℃で２時間インキュ
ベートすることによって準備されたものであった。付着
していない細胞をすべて除去し、50ng/mlの配列認識番
号（SEQ ID NO）:6のペプチドと、2.5ug/mlのヒトβ
２ミクログロブリンとを、0.5mlの無血清培地中で添加
した。この混合物を、２時間37℃でインキュベートし、
次に洗浄した。その後、前記応答CD8+細胞をそれらに添
加した。
第21日目、前記応答細胞の別の活性化を、50Gyで照射
され、無血清培地＋50ug/mlヒトβ２ミクログロブリン
＋50ug/mlの配列認識番号（SEQ ID NO）:6との中で２
時間インキュベートし、その後洗浄しておいた2x106のP
BLsを添加することによって行った。
このプロトコルによって、配列認識番号（SEQ ID N
O）:6ZSHLA−A2との複合体に対して特異的なCTLsが産生
され、これを次の例に示す。
例４ 本発明によるペプチドが、HLA−A2分子と複合化され
た時に、CTLsによる溶解を誘発するか否かを調べるた
め、28日目に一連の実験を行った。
系52の細胞を使用した。この細胞系は、その表面上に
HLA−A2分子を提示するが、外因性ペプチドを提示する
能力の増大をもたらす抗原プロセッシング欠陥を有して
いる。セルンドロ（Cerundolo）他、Nature 345:449
（1990）を参照。これはこの細胞系について記載してい
る。他の同等の細胞系も使用可能である。
T2細胞のサンプルを、放射性クロム（51Cr）でラベル
化し、1umの配列認識番号（SEQ ID NO）:6のペプチド
とともにインキュベートした。CTLsの導入の前に、プレ
インキュベーションを１時間行った。T2細胞のコントロ
ールサンプルは、ペプチドとインキュベートしなかっ
た。
CTLsは、CD8+細胞を、前述した例３に従って、21日
間、配列認識番号（SEQ ID NO）:6のペプチドとプレ
インキュベートしておいた、自己由来APCsによって活性
化することによって準備した。
図３は、その結果を示している。Ｘ軸は、エフェクタ
／標的細胞の比を示し、Ｙ軸は、ここにその全部を参考
文献として添付するブーン（Boon）他、Exp.Med.152:11
84（1980）に従って、クロム放出を測定することによっ
て測定される特異的溶解の百分率を示している。各テス
トウェルにおいて、非特異的溶解を、50,000のK562細胞
を、使用した1,000の51Crラベル化T2標的細胞に添加す
ることによって除去した。前記K562細胞は、この系を選
択的に溶解するナチュラルキラー、即ち、"NK"細胞とし
て、非特異的溶解除去する作用をする。
前記ペプチドが、HLA−A2によって提示されたとき
に、T2細胞の溶解を誘発することは明白である。
例５ 例４に記載した作業によって、配列認識番号（SEQ I
D NO）:6とその提示HLA−A2分子の複合体に対して特異
的なCD8+T細胞と、非特異的CTLsとの混合培地が産生さ
れた。所望の特異性のCTLクローンを単離するために、
参考文献として添付するが、ここに要約されるヘリン
（Herin）他、Int.J.Cancer 39:390〜396（1987）に従
って、限界希釈を行った。
第29日目、上述のヘリン（Herin）他に従って、MAGE
−３とHLA−A2とを発現することが知られている照射済
みSK23−MEL細胞を、支持細胞（feeder cells）として
作用するLG2−EBV細胞とともに、前記CTL混合培地と組
み合わせた。更に、50U/mlのIL−２と5U/mlのIL−４と
を、前記混合物に添加した。これによって、CTLクロー
ン297/19,CTL297/22,CTL297/27及びCTL297/36が産生さ
れた。
例６ 例４において、一定量のペプチドを可変のエフェクタ
／標的比で使用することによって、配列認識番号（SEQ
ID NO）:6のペプチドを提示する細胞の溶解の誘発が
証明された。これらの実験において、エフェクタ／標的
比を一定に保ち、ペプチドの量を変化させた。ここで
も、例４の51Cr放出アッセイを使用し、更に、例４のT2
細胞とCTLsとを使用した。例５の４つの異なったCTLsを
使用した。
図4A,4B,4C及び4Dは、これらの結果を示し、溶解の或
る程度の投与量依存性を示している。T2細胞がペプチド
とインキュベートされなかった場合は、溶解は、常に、
２％以下であった。
例７ 別の一連の実験において、配列認識番号（SEQ ID N
O）:6のペプチドの溶解効果を、宿主細胞が本来的にHLA
−A2を発現しないモデルにおいてテストした。
細胞系COS−７のサンプルを使用した。これらの細胞
を、（ｉ）HLA−A2.01のゲノムDNAとMAGE−３のcDNA、
（ii）HLA−A2.01のゲノムDNAのみ、あるいは（iii）MA
GE−３のcDNAのみ、のいずれか１つとトランスフェクシ
ョンした。各ケースにおいて、トランスフェクションベ
クターは、pcDNA/Amp Iであり、前記DNAはEcoR Iアダプ
タに結合され、製造業者の指示に従って、前記プラスミ
ドのEcoR I部位にクローン化された。受容細胞を、15,0
00cells/wellの割合で、10％胎児ウシ血清を添加したDu
lbecco's modified Eagle Medium（"DMEM"）中の組
織培養平底マイクロウェルに接種した。細胞を一晩イン
キュベートし、培地を除去し、これを、10％Nu血清と、
400ug/ml DEAEデクストランと、100μＭクロロキニン
と、100ngの前述した要領で作ったプラスミドとを含有
する30ul/wellのDMEMによって置換した。更に別のコン
トロールとして、HLA−A2のみでトランスフェクション
したCOS−７細胞（pcDNA−Amp I中でHLA−A2.01を介し
て）を、上述した例４に従って、１μＭの配列認識番号
（SEQ ID NO）:6のペプチドと、１時間プレインキュ
ベートした。
更に、MAGE−３を発現することが知られており、か
つ、HLA−A2+であるメラノーマ細胞系を使用した。これ
らの細胞系は、図中、LB373,LB43,LB24クローン409及び
SK23として示されている。細胞系MZ2−MEL.43は、HLA−
A2-である。更に別のテストにおいて、前記系を、pcDNA
/Amp I中でHLA−A2遺伝子ともトランスフェクションし
た。
ここに参考文献として添付するが、下記に要約すると
ころのトラヴァーサリ（Traversari）他、Immunogeneti
cs 35:145〜152（1992）に従って、かつ、それを改変
した、TNF放出アッセイを使用した。具体的には、1500
のCTLsを、30,000の標的細胞と組み合わせた（CTLsは、
上述したクローンの１つであった）。これらの細胞を、
25U/mlのIL−２の存在下において、共に培養した。24時
間後、前記培地からの上清を、TNFに対して感応性の、W
EHI 164クローン13細胞に対してテストした。ベイヤー
ト（Beyart）他、PNAS 86:9494〜9498（1989）に記載
されているように、LiClを前記WEHI164クローン13細胞
に添加することによって感度が増大した。
これらの結果は、図5A〜5Dに図示されている。各図
は、個々のCTLクローンと、トランスフェクタントと
（各図における上方パネル）、腫瘍細胞系（下方パネ
ル）とのTNF放出（pg/ml）を表している。これらの図
は、MAGE−３トランスフェクションのみでは溶解を誘発
するのに不十分であり、又、HLA−A2トランスフェクシ
ョンのみでも不十分であることを示している。MAGE−３
とHLA−A2との両方のトランスフェクションで十分であ
り、これは予想通りであった。しかし、予想外であった
のは、ペプチド配列認識番号（SEQ ID NO）:6を、HLA
−A2のみでトランスフェクションした細胞に添加した場
合の溶解の増加である。第２バネルのこのパータンにも
注目されたい。ここには、"MZ2−MER.43/HLA−A2＋１μ
Ｍ配列認識番号（SEQ ID NO）:6"の、他のすべてに対
して優れた溶解が示されている。これらのパターンは、
既に示したように、テストしたすべてのCTLクローンに
おいて繰り返されている。
例８ 前記ペプチドのクロム放出アッセイに於ける腫瘍細胞
に対する溶解効果をテストするために更に別の一連の実
験を行った。前述した例６のTNFアッセイの方がクロム
放出アッセイよりも感度が高いことから、後者を使用す
ればTNFアッセイの結果が確認されるであろう。
前記51Cr放出アッセイの性質については、前述した、
ブーン（Boon）他、Exp.Med.152:1184〜1193（1980）に
記載されている。同じアッセイを使用して、HLA−A2陽
性であることが知られている一連の標的細胞とともに、
CTLクローン297/19と297/22とを使用した。前記細胞系L
B43とSK23とも、MAGE−３を発現することが知られてい
る。細胞系T2は、HLA−2+であり、MAGE−3-である。
下記の表は、種々のエフェクタ／標的細胞比において
得られたデータを示している。しかし、これらの比率は
すべて非常に低い。これらのデータは、それぞれ４時間
後と20時間後における細胞溶解の百分率として表されて
いる。
低いE/T比においても、かなりの溶解が有り、溶解を
誘発する能力を示している。
例９ 例７に記載して作業手順に従って実験を行った。
HLA−A2遺伝子を含有するpcDNA I/Ampと、MAGE−12又は
MAGE−３をコードするcDNAの１つとでトランスフェクシ
ョンされたCOS−７細胞による、CTLクローン297/19及び
297/22の活性化をテストした。コントロールとして、細
胞を、HLA−A2,MAGE−３又はMAGE−12cDNAの内の１つと
トランスフェクションした。HLA−A2の発現ためのコン
トロールを提供するために、トランスフェクションされ
たCOS細胞のサンプルを、配列認識番号（SEQ ID N
O）:6のペプチドと１時間プレインキュベートした。全
部で1500のCTLsを、トランスフェクタントに添加し、上
清のTNF含有量を、24時間後、上述した要領で、WEHI−1
64クローン13細胞に対する毒性をアッセイすることによ
って推定した。
図6A及び6Bに示されているように、MAGE−３とMAGE−
12とは、同じあるように見える腫瘍拒絶抗原にプロセッ
シングされた。MAGE−12腫瘍拒絶抗原前駆体の予想アミ
ノ酸配列は、配列認識番号（SEQ ID NO:6と同じ一区
間（stretch）のアミノ酸を有している。従って、多数
のMAGE TRAPsの１つが同じ腫瘍拒絶抗原を生成するか
もしれないということが出来る。
例10 更に別の一連の実験において、前記CTLクローン297/1
9及び297/22を、予めHAL−A2+でMAGE−3+であると分類
されていたメラノーマ細胞系とテストした。これらの実
験には、１つの共同培地（coculture）として組み合わ
せた、30,000の腫瘍細胞（標的細胞）と、1500のCTLs
（エフェクタ細胞）を使用した。この共同培地へのTNF
放出を、WEHI−164クローン13系を使用して、上述した
方法によって測定した。
それぞれCTL297/19とCTL297/22とに対応する、図7A及
び7Bは、HLA−A2+でMAGE−3+であったCTL系は溶解され
るが、片方に関しては陽性であるが他方に関しては陰性
である系は溶解されないことを示している。HLA−A2+/M
AGE−3+である細胞系MZ2−MEL.43/HLA−A2が、HLA−A2
とトランスフェクションされたMA2−MEL.43、（HLA−A2
-、MAGE−3+）であることに注目されたい。
例11 更に別の実験において、HLA−A2+/MAGE−3+メラノー
マ細胞系のCTLクローン297/22による溶解をテストし
た。これらの実験において、前記標的メラノーマ細胞系
は、100u/mlのIFN−γと1ng/mlのTNFαとで72時間プレ
インキュベートされ、上述した要領で、51Crによってラ
ベル化された。これらのラベル化細胞を、種々の比率
で、エフェクタ細胞とインキュベートした。51Cr放出量
を、５時間後に測定した。
その結果は、図８に示されている。ここでも、前記腫
瘍細胞がCTLsによって溶解される、HLA−A2と配列認識
番号（SEQ ID NO）:6のペプチドとの複合体を提示し
ていることが示されている。
例12 細胞系COS−７を、HLA−A2をコードするDNA及び／又
は、MAGE−1,MAGE−2,MAGE−3,MAGE−４及びMAGE−12を
コードするcDNAの１つとトランスフェクションした。
これらの実験において、15,000のCOS−７細胞を、上
述したDEAE−デクストラン−クロロキン法を使用して、
（ａ）100ngのプラスミドpcDNA I/Amp（HLA−A2コード
化ゲノムDNAを含有）と、（ｂ）100ngのプラスミドpcD
−SRαと、（ｃ）MAGE−1,MAGE−2,MAGE−3,MAGE−４又
はMAGE−12のいずれか１つのcDNAを含有する100ngのpcD
NA I/Amp、のいずれか１つ、又は（ｄ）として（ａ）と
（ｃ）との両方でトランスフェクションした。その結果
得られたトランスフェクタントを、１日後に、上述した
TNF放出アッセイにより、細胞傷害性Ｔ細胞系CTL297/22
を使用して、テストした。前記TNFアッセイを行うため
に、1,500のCTLsを、10％ヒト血清と20U/mlの組換えヒ
トIL−２とを含有する100ulのIscove's培地中に添加し
た。24時間後、上清を収集し、TNF放出量を、MTTカラリ
メトリックアッセイを使用して、TNF感応WEHI−164クロ
ーン13細胞に対する細胞毒性をテストすることによって
測定した。ここですべての工程は、前述したものと同じ
であった。これらの実験のために、6pg/mlのTNF−βに
よって、WEHI−164クローン13細胞の50％の死亡率が得
られた。
次の表２にその結果を示す。
MAGE−３とMAGE−12での成功は、これらは共に配列認
識番号（SEQ ID NO）:6のペプチドにプロセッシング
されることから、予想外ではなかった。配列認識番号
（SEQ ID NO）:6のペプチドは、MAGE−６によっても
コードされる。従って、CTL297/22は、配列認識番号（S
EQ ID NO）:6のプロセッシングから派生する、HLA−A
2と配列認識番号（SEQ ID NO）:6との複合体を認識す
るものと予想される。しかし、MAGE−２での成功は、別
のナノペプチドが関連していることを示唆するものであ
った。MAGE−２は配列認識番号（SEQ ID NO）:12、即
ち、 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile に対応する配列を有しているが、配列認識番号（SEQ I
D NO）:6に対応する配列は有していない。
例13 例12の結果に基づき、配列認識番号（SEQ ID NO:12
に対応するペプチドを合成し、これを、上述した51Cr放
出アッセイでテストした。E/T比を異ならせて、種々の
濃度のペプチドを使用した。ここで使用したすべてのパ
ラメータは、上述したものであった。
図９が示すように、配列認識番号（SEQ ID NO）:12
のノナペプチドは、事実、それを提示する細胞を溶解す
ることができた。
以上、MHCクラスＩ分子HLA−A2と相互作用する、MAGE
腫瘍拒絶抗原前駆体由来のペプチドの同定を記載した。
特に興味深く、また、本発明の課題の一部を構成するの
は、配列認識番号（SEQ ID NOS）:1〜10及び12によっ
て表されるペプチドである。これらのペプチドは、メリ
フィールド（Merrifield）合成法、又はその他のペプチ
ド合成法によって容易に合成される。
特に興味深いのは、以下の式を満たすペプチドであ
る。即ち、 （Xaa）１（Xaa）2-7（Xaa）８（Xaa）９ （配列認識番号（SEQ ID NO）:13） より具体的には、 Xaa Leu Xaa Gly（Xaa）nLeu （配列認識番号（SEQ ID NO）:14） そして、 Xaa Leu Xaa Gly（Xaa）nVal （配列認識番号（SEQ ID NO）:15） ここで、ｎは４又は５であり、Xaaはアミノ酸であ
る。（配列認識番号（SEQ ID NO）:13において、（Xa
a）１は、好ましくは、Ala,Leu,Ile,又はCysであり、最
も好ましくは、Gly又はPheである。（Xaa）2-7の６つの
アミノ酸は、（Xaa）2-7又は（Xaa）３の第２級アミノ
酸がAspでなくてもよいことを条件として、どのような
アミノ酸であってもよい。（Xaa）８は、ロイシン、メ
チオニン又はプロリンのいずれであってよく、（Xaa）
９はどのようなアミノ酸であってもよい。特に好ましい
のは、これらのすべてのクラスの例である、配列認識番
号（SEQ ID NO）:6等のペプチドである。
又、以下のようなペプチドも好ましい。即ち、 Phe（Xaa）2-7Leu Xaa （配列認識番号（SEQ ID NO）:16） ここで、Xaaは、どのようなアミノ酸であってもよい、
あるいは、 Gly（Xaa）2-7Leu Xaa （配列認識番号（SEQ ID NO）:17） ここでも、Xaaは、上述したように、（Xaa）３において
制限を受ける、どのようなアミノ酸であってもよい。こ
れらのグループは、他のMAGE遺伝子における配列認識番
号（SEQ ID NO）:6と配列認識番号（SEQ ID NO）:1
2との位置に対応するノナペプチドを含む。このような
ペプチドの例としては、Phe Leu Leu Phe Lys Tyr
Gln Met Lys（配列認識番号（SEQ ID NO）:18）;
Phe Ile Glu Gly Tyr Cys Thr Pro Glu（配列
認識番号（SEQ ID NO:19）;Gly Leu Glu Gly Ala
Gln Ala Pro Leu（配列認識番号（SEQ ID NO:2
0）；そして、Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Gl
u Leu（配列認識番号（SEQ ID NO:2、前述）があ
る。これらのノナペプチドは、HLA−A2に結合されるこ
とが強く期待される。従って、HLA−２陽性である細胞
を判定する薬剤として有用である。特に好ましいのは、
前述した構造的要件を満たし、かつ、HLA−A2分子に結
合し、そのノナペプチドとHLA分子との複合体に対して
特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の溶解を誘発するノナペプチ
ドである。
これらのペプチドは、すでに示したように、HLA−A2
分子と複合化する。そして、これらの複合体が免疫沈降
されて、本発明の更に別の特徴、即ち、HLA−A2分子と
これらのペプチドの１つとの単離複合体が導かれたので
ある。
前記ペプチドと複合体とは、共に、種々の用途におい
て有用である。既に示したように、これらのペプチド
は、HLA−A2分子に結合する。従って、HLA−A2提示細胞
がサンプル中に存在するか否かを判断するアッセイにお
いて有用である。ペプチドは、ラベル化ペプチド（放射
性ラベル、発光団ラベル等）や、あるいは、カラム又は
アガロース又はセファローズビーズ等のなんらかの測定
可能な形状で、対象のサンプルに接触され、それに対す
る細胞の結合を、標準的分析方法を使用して判定する。
これらペプチドと複合体とは、共に、前述した複合体
に対して特異的なモノクローナル抗体または細胞傷害性
Ｔ細胞クローンの産生に使用することができる。当業者
にとって、これを達成するのに必要な方法は周知であ
り、細胞傷害性Ｔ細胞クローンの産生については前に例
示した。ある種の癌細胞は、配列認識番号（SEQ ID N
OS）:2,6,7,8,10及び12等のMAGE−３由来ペプチドと、H
LA−A2との複合体を提示するので、これらのモノクロー
ナル抗体および細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、癌の診断
に有用な試薬として作用する。というのは、正常、即
ち、非腫瘍化細胞でそのような複合体を提示するものは
まったく発見されていないからである。上述したクロム
放出アッセイは、対象の標的を判定するのにCTLsを使用
するアッセイの一例であり、当業者にとって、イムノア
ッセイやそれらを行う方法は周知である。
このように派生された細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、
養子移入などの治療環境において有用である。ここに、
これらのすべてを参考文献として添付する、グリーンバ
ーグ（Greenberg）他、J.Immunol.136（５）:1917（198
6）；レッデル（Reddel）他、Science 257:238（199
2）、リンチ（Lynch）他、Eur.J.Immunol.21:1403（199
1）；カスト（Kast）他、Cell 59:603（1989）を参
照。この方法において、上述したペプチドは、抗原提示
細胞（"APCs"）と組み合わされて安定した複合体を形成
する。このような方法の多くは、例えば、ここに参考文
献として添付する、ロイシャー（Leuscher）他、Nature
351:72〜74（1991）；ロメロ（Romero）他、J.Exp.Me
d.174:603〜612（1991）；ロイシャー（Leuscher）他、
J.Immunol.148:1003〜1011（1992）；ロメロ（Romero）
他、J.Immunol.150:3825〜3831（1993）；ロメロ（Rome
ro）他、J.Exp.Med.177:1247〜1256（1993）に開示され
ているもの等から知られている。この後、前記提示細胞
を、細胞傷害性Ｔ細胞源と接触させ、対象の複合体に対
して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞クローンを産生する。好
ましくは、これは、例えば、CTLsによって治療されるべ
き患者から採取された、血液サンプル中に見つかる自己
由来Ｔ細胞クローンを使用することによって行われる。
CTLsが産生されると、これらを、対象体に再注入（repe
rfused）して、癌細胞を溶解することによって、その増
殖を抑制する、等により、その癌状態を改善する。
前記例に示した本発明の更に別の特徴構成は、Ｔ細
胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するために、IL−
６とIL−12とを組み合わせて使用することである。ここ
でいう”活性化”とは、Ｔ細胞に対してその意図された
機能を果たさせる能力をいう。CTLsの場合には、もちろ
ん、これは、その表面上に、ペプチドとMHC分子との適
当な組合せを提示する細胞の認識と溶解である。その
後、活性化されたＴ細胞を、例えば、特定のペプチド/M
HC組合せが、テストサンプル中の細胞のサブポピュレー
ションに存在するか否かの判断などの、診断用に使用す
ることができる。又、組合せられたサイトカインを使用
することによって特定のCTLsの同定を容易にすることが
できる。CTLサンプル中において、ある１つのMHC/ペプ
チド組合せに対して特異的な利用可能なサブポピュレー
ションは非常に小さいことが知られている。前記サイト
カインを、所望の組合せを提示するサンプルと組み合わ
せて使用することによって、例えば、溶解による活性化
を判定し、それを、そのサンプルがなんら追加物質と混
合されていないことを除いては、すべての条件を一定に
保つことによって得られるコントロール値と比較するこ
とができる。これによって、必要なコントロール値が提
供される。
本発明の更に別の特徴構成は、Ｔ細胞の活性化に有用
なキットであり、このキットは、インターロイキン−６
とインターロイキン−12とを別々のポーションとして有
し、これらポーションは、１つの容器手段内に収納され
ている。この対象のキットには、更に、例えば、提示さ
れるべきペプチドの別のポーション及び／又は、MHC分
子のためのベクター又はコード領域、あるいは、前記MH
C分子と前記ペプチドとの両方をコードするベクター又
はコード領域とを有していてもよい。例えば、前記ペプ
チドは、配列認識番号（SEQ ID NO）:6であってよ
い。前記ベクターには、HLA−A2コード化領域、あるい
は、HLA−A2と配列認識番号（SEQ ID NO）:6との組合
せを含めてもよい。本発明の更に別の特徴構成は、CTLs
等のＴ細胞を活性化するのに十分な量のIL−６及びIL−
12から実質的に構成される組成物である。
ここでいう"IL−６と"IL−12"とは、天然産生のも
の、あるいは、組換えによって産生されるもの、ヒト、
ネズミ又はその他の種由来のもの、更に、IL−６及びIL
−12と同じ活性化特性を有する分子のすべてのバリエー
ションをも含む、あらゆる形状のこれらの分子のことを
指している。
IL−６とIL−12の量は様々である。しかしながら、約
500〜約1000u/mlのIL−６と、約１〜約10ng/mlのIL−12
とを使用することが好ましい。但し、これらの量は、当
業者の知見によって可変である。
本発明その他の態様は、当業者にとって明白であろ
う。従って、ここでそれらを繰り返すことは避ける。
ここに使用した用語および表現は、記載のための用語
であって限定のためのものではなく、このような用語お
よび表現を使用するに当たって、ここに図示され記載さ
れた特徴構成またはその一部の均等物を除外する意図は
無く、本発明の範囲内において様々な改変が可能である
と理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０８／２９０，３８１ (32)優先日 平成６年８月15日(1994．8．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (73)特許権者 999999999 ザ・チャンセラー・マスターズ・アン ド・スカラーズ・オブ・ザ・ユニバーシ ティ・オブ・オックスフォード イギリス国 オックスフォード オーエ ックス１ ２ジェイディ ウェリント ン・スクウェア （無番地） ユニバー シティ・オフィスィズ (73)特許権者 999999999 ユニバーシティ・オブ・ライデン オランダ国 2300 アールエイ ライデ ン スタシオンスヴェーク 46 (72)発明者 タウンゼント，アラン イギリス国 オックスフォード オーエ ックス３ ９ディユー ヘッディントン （無番地) (72)発明者 バスティン，ジュディ イギリス国 オックスフォード オーエ ックス３ ９ディユー ヘッディントン （無番地) (72)発明者 ブーン−ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ファン・デア・ブルッゲン，ピアース ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 クーリ，ピエール ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ガジェヴスキー，トーマス ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 メリーフ，コーネリス，ジェイ，エム オランダ国 エヌエル−2333 アーアー ライデン レインスブルガーヴェーク 10 ビルディング １ エー３−０ (72)発明者 ヴィッセレン，エム，ダブリュ オランダ国 エヌエル−2333 アーアー ライデン レインスブルガーヴェーク 10 ビルディング １ エー３−０ (72)発明者 カスト，ダブリュ，エム オランダ国 エヌエル−2333 アーアー ライデン レインスブルガーヴェーク 10 ビルディング １ エー３−０ (56)参考文献 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．152, Ｎｏ．１（1994，Ｊａｎ．），ｐ．163 −175 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．150, Ｎｏ．５（1993），ｐ．1763−1771 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87（Ｍａｒ．15, 1994），ｐ．2105−2109 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/06 - 7/08 C12N 15/00 - 15/90 ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】HLA−A2分子と特異的に結合する、以下か
    らなるグループから選択される単離ペプチド、 配列認識番号（SEQ ID NO）:2, 配列認識番号（SEQ ID NO）:6, 配列認識番号（SEQ ID NO）:7, 配列認識番号（SEQ ID NO）:8, 配列認識番号（SEQ ID NO）:10,そして 配列認識番号（SEQ ID NO）:12。
  2. 【請求項２】配列認識番号（SEQ ID NO）:2として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  3. 【請求項３】配列認識番号（SEQ ID NO）:6として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  4. 【請求項４】配列認識番号（SEQ ID NO）:7として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  5. 【請求項５】配列認識番号（SEQ ID NO）:8として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  6. 【請求項６】配列認識番号（SEQ ID NO）:10として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  7. 【請求項７】配列認識番号（SEQ ID NO）:12として指
    定される請求項１の単離ペプチド。
  8. 【請求項８】HLA−A2と、請求項１の単離ペプチドとの
    単離複合体。
  9. 【請求項９】請求項８の単離複合体であって、前記ペプ
    チドは配列認識番号（SEQ ID NO）:6と指定される。
  10. 【請求項１０】請求項８の単離複合体であって、前記ペ
    プチドは配列認識番号（SEQ ID NO）:12である。
  11. 【請求項１１】HLA−A2と、配列認識番号（SEQ ID N
    O）:6及び配列認識番号（SEQ ID NO）:12とからなる
    グループから選択されるペプチドとの複合体に対して特
    異的な単離細胞傷害性Ｔ細胞クローン。
  12. 【請求項１２】HLA−A2と、配列認識番号（SEQ ID N
    O）:2,配列認識番号（SEQ ID NO）:6,配列認識番号
    （SEQ ID NO）:7,配列認識番号（SEQ ID NO）:8,配
    列認識番号（SEQ ID NO）:10及び配列認識番号（SEQ
    ID NO）:12とからなるグループから選択されるペプ
    チドとの複合体に対して特異的に結合するモノクローナ
    ル抗体。
  13. 【請求項１３】その表面において、HLA−A2と、配列認
    識番号（SEQ ID NO）:6及び配列認識番号（SEQ ID
    NO）:12とからなるグループから選択されるペプチドと
    の複合体を提示する癌細胞によって特徴付けられる癌状
    態を有する対象体を治療するための薬剤であって、前記
    薬剤は、請求項11の単離細胞傷害性Ｔ細胞クローンを含
    有し、かつ、前記癌細胞を溶解するのに、十分な量、投
    与される、薬剤。
  14. 【請求項１４】癌状態を有する対象体を検出する方法で
    あって、前記対象体からのサンプルを、体外で、HLA−A
    2と、配列認識番号（SEQ ID NO）:2,配列認識番号（S
    EQ ID NO）:6,配列認識番号（SEQ ID NO）:7,配列
    認識番号（SEQ ID NO）:8,配列認識番号（SEQ ID N
    O）:10及び配列認識番号（SEQ ID NO）:12とからなる
    グループから選択されるペプチドとの複合体に対して特
    異的な試薬に接触させる工程と、前記試薬の前記サンプ
    ル中の細胞との反応を、癌状態の判定として検出する工
    程とを有する方法。
  15. 【請求項１５】請求項14の方法であって、前記試薬はHL
    A−A2と、配列認識番号（SEQ ID NO）:6及び配列認識
    番号（SEQ ID NO）:12とからなるグループから選択さ
    れるペプチドとの複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ
    細胞クローンである。
  16. 【請求項１６】請求項14の方法であって、前記試薬は、
    HLA−A2と、配列認識番号（SEQ ID NO）:2,配列認識
    番号（SEQ ID NO）:6,配列認識番号（SEQ ID NO）:
    7,配列認識番号（SEQ ID NO）:8,配列認識番号（SEQ
    ID NO）:10及び配列認識番号（SEQ ID NO）:12と
    からなるグループから選択されるペプチドとの複合体に
    対して特異的に結合する、モノクローナル抗体である。
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