CN1150805A - Mage肿瘤排斥抗原前体衍生的与hla-a2分子形成复合物的分离肽 - Google Patents

Mage肿瘤排斥抗原前体衍生的与hla-a2分子形成复合物的分离肽 Download PDF

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Abstract

本发明鉴定了衍生于MAGE肿瘤排斥抗原前体的肿瘤排斥抗原。这些“TRAs”结合MHC-I类分子HLA-A2，所得到的复合体刺激溶解呈递细胞的细胞溶解性T细胞的产生。该肽与复合体能用于诊断，治疗，以及作为生产抗体的免疫原，或作为产生细胞溶解性T细胞克隆的靶等多种用途。

Description

MAGE肿瘤排斥抗原前体衍生的与HLA-A2分子形成 复合物的分离肽
相关申请
本发明是1994年8月15日申请的序列号08/290,381的部分继续申请，后者是1994年6月17日申请的序列号08/261,160的部分继续申请，而08/261,160又是1994年3月24日申请的序列号07/217,186的部分继续申请，本案要求所有申请的优先权，所有这些申请引入本文作参考。发明领域
本发明涉及免疫遗传学与肽化学。特别地，它涉及到肽类，尤其是应用于各种方式，包括作为免疫原和HLA-A2分子配位体使用的十肽和九肽。更特别地，它涉及到一种称作“肿瘤排斥抗原”的，来自于肿瘤排斥抗原前体的。并且被HLA-A2分子所呈递的肽。
有关癌细胞被宿主有机体识别或是这种识别作用的丧失的研究已在许多不同的方向上开展起来。对该领域的了解意味着对基础的免疫学及肿瘤学的一些了解。
在小鼠肿瘤方面的早期研究揭示出，这些被呈递的分子能够在把肿瘤细胞移植到同源动物体内时导致对这些肿瘤细胞的排斥作用。这些分子被受体动物的T-细胞“识别”，唤起一种细胞溶解性T-细胞反应，将移植的细胞溶解。这一证据的第一次获得是在体外用化学致癌物质，例如甲基胆蒽诱发的肿瘤中。后来发现由肿瘤所表达的能引起T-细胞反应的抗原在每种肿瘤中是不同的。见以下有关讲授用化学致癌物诱发肿瘤及细胞表面抗原差异的文献：Prehn，etal.，J.Natl.Canc.Inst.18：769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.20：1561-1572(1960)；Gross，Cancer Res.3：326-333(1943)；Basombrio，Cancer Res.30：2458-2462(1970)。这一类抗原后来被称作“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTAS”。在观察到当用化学致癌物诱导时这类抗原的存在以后，当在体外通过紫外照射诱发肿瘤时也得到了类似的结果。见Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53：333-1336(1974)。
当在上述类型的肿瘤中观察到T-细胞介导的免疫反应时，自发性肿瘤通常被认为是非免疫原性的。因而相信在这些肿瘤携带者体内不会出现能引起针对这些肿瘤的反应的抗原。见Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer 33：241-259(1976)。
tum-抗原呈递细胞株家族是通过诱变小鼠肿瘤细胞或细胞株而得到的致免疫性突变体，如Boon et al.，J.Exp.Med.152：1184-1193(1980)所述，该文献引入本文作参考。为了验证，通过突变在同源小鼠中不产生免疫应答并将形成肿瘤的肿瘤细胞(即“tum-”细胞)而获得tum-抗原。当这些tum+细胞被诱变时，它们被同源小鼠排斥，不能形成肿瘤(因而叫“tum-”)。见Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：272(1977)(引入本文作参考)许多种类型的肿瘤已被发现表现出这种现象。见Frost etal.，Cancer Res.43：125(1983)。
因为tum-突变体能产生一个免疫排斥过程，因而它们似乎不能形成进行性的肿瘤。支持该假说的证据包括，不能以正常方式形成肿瘤的“tum-”肿瘤突变体，在其免疫系统被亚致死量射线处理抑制过的小鼠中又恢复了形成肿瘤的能力。见Van Pel et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 76：5282-5285(1979)。还包括观察到的腹腔注射的肥大细胞瘤P815 tum-细胞在以指数级数增殖12-15天后，在注入淋巴细胞及巨噬细胞仅仅几天后就消失了。(Uyttenhove et al.J.Exp.Med.152：1175-1183，1980)。更多的证据包括观察到小鼠获得了一种免疫记忆，这样使得它们能抵抗随后的同种tum-突变体的攻击，即使是在给予同种tum-突变体之前给予免疫抑制量的射线时。见Boon et al.，Proc Natl Acad.Sci.USA 74：272-275(1977)；Van Pel etal.，supra；Uyttenhove et al.，supra。
后期的研究发现，当自发性肿瘤易被诱变时，就生产出能引起反应的致免疫性突变体。确实，这些突变体能够引发一种针对原始肿瘤的免疫保护性反应。见Van Pel et al.，J.Exp.Med.157：1992-2001(1983).由此可见在肿瘤中引起作为同源排斥反应的靶的物的“肿瘤排斥抗原”的呈递是可能的。在外源基因转染到自发性肿瘤中时也得到了类似的结果。见Fearon et al.，Cancer Res.48：2975-1980(1988)。
已经辩认出一种抗原，它被呈递于肿瘤细胞的表面，并被细胞溶解性T细胞所识别，从而导致溶解。后文中将把这类抗原称作“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs可能也可能不会引起抗体反应。有关这些抗原的进一步的研究是通过体外的细胞溶解性T细胞特征研究，例如通过特定细胞溶解性T细胞亚系(后文中称之为“CTL”)对抗原的鉴定的研究而进行的。该亚系在识别被呈递的肿瘤排斥抗原后增殖，呈递抗原的细胞被溶解。特征性研究已经鉴别出特异性裂解表达该抗原的细胞的CTL克隆。这些工作的实例可见Levy et al.，Adv.Cancer Res.24：1-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.152：1184-1193(1980)；Brunner et al.J.Immunol.124：1627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.124：1627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol 126：406-412(1982)；Palladino et al.，Canc.Res.47：5074-5079(1987)。其它类型的被CTLS识别的抗原也要求进行这类分析，包括次要组织相容性抗原，雄性特异性H-Y抗原，以及在此讨论的被认为是“tum-”抗原的抗原。
以上所述的肿瘤的一个范例是P185。见Deplaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J.9：1041-1050(1990)，以及Sibille et al.，JExp.Med.172：35-45(1990)，所述文献引入本文作参考。P815肿瘤是一种肥大细胞瘤，用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱发，并以体外肿瘤及细胞株形式培养。P815株经过诱变后产生许多tum-突变体，包括P91A(Deplaen，supra)，35B(Szikora，supra)以及P198(Sibille，supra)突变体。与肿瘤排斥抗原形成对照的是-并且这是一个关键性的差别-tum-抗原仅仅在肿瘤细胞被诱变后才呈递。肿瘤排斥抗原呈递于给定的无须诱变的肿瘤细胞。因此，一种细胞株可以是tum+的，例如称作P1的株，也能够被引发而产生tum-突变体。由于tum-的表型与其父代细胞株有差异，因此可以预期这两种细胞株的DNA也会有差别，这种差别就可以被开发来在tum-细胞中定位感兴趣的基因。其结果是，已经发现tum-突变体，例如P91A，35B和P198，其基因与其正常等位基因的差别在于基因的编码区域发生了点突变。见Szikoraand Sibille，supra，以及Lurquin et al.，Cell 58：293-303(1989)。已证明本发明的TRAs不是这种情况。这些文献还阐明了衍生于tum-抗原的肽为了被CTLs识别而被Ld分子呈递。P91A被Ld呈递。P35被Dd以及P198被Kd所呈递。
于1992年5月22日申请的PCT申请PCT/US92/04354，讲授了一个人的肿瘤排斥抗原前体编码基因家族，称作MAGE家族。这些基因中的几个还在以下文献中讨论过：Van der Bruggen et al.，Science 254：1643(1991)。另外参见USP5,342,774，作为公开MAGE基因的文献引入本文作参考。现已清楚MAGE家族的各种基因在肿瘤细胞中表达，并可作为诊断这种肿瘤的标记，并用于该文讨论的各种应用。另外参见Traversari et al.，Immunogenetics 35：145(1992)；Van der Bruggen et al.，Science 254：1643(1991)。有关某蛋白质被修饰及其在细胞表面呈递的机制现在已得到很好的证明。对该领域发展的粗略的了解可参看Barinaga“Getting Some‘Backbone’：How MHC Binds Peptides”，Science 257：880(1992)；Fremont et al.，Science 257：919(1992)；Matsumura etal.，Science 257：927(1992)，Latron etal.，Science 257：964(1992)。这些文献普遍地指出的一个要求是，这些结合到MHC/HLA分子的肽长度为9个氨基酸(一种“九肽”)，而且九肽的第一个和第九个残基很重要。如此处所述，若这一“规则”普遍正确，则MHC-I类分子能结合的肽类的长度还有一些余地。
有关MAGE家族基因的研究现已揭示出，在一些肿瘤细胞的表面确实呈递着某特定的九肽，而且要求呈递分子是HLA-A1。MAGE-1肿瘤排斥抗原(TRAs或九肽)复合物导致呈递它的细胞被细胞溶解生T细胞(“CTLs”)所溶解。
应注意的是，例如Traversari et al.，的申请号08/217,188，申请日1994年3月24日，以及Melief et al.的申请号08/217,187，申请日1994年3月24日中的其它MAGE衍生肽类；
美国专利申请Serial No.07/938,334(1992年8月31日申请)及073,103，(1993年6月7日申请)的研究表明，比较MAGE-1基因中编码相关九肽的区域与各种MAGE基因的同源区域时，有着大量的同源性。实际上，这些观察结果导致本发明的一个方面，即九肽家族中的所有成员具有相同的N-端和C-端氨基酸。这些九肽可用于各种目的，包括用作免疫原，无论是单独使用还是与载体肽偶联。九肽已有足够的大小以构成抗原决定簇，由其而产生的抗体可用来鉴定这些九肽，无论其单独存在，或者作为一个较大的多肽的一部分。
这些文献，尤其是申请号为073,103的申请，显示出在HLA-A1与MAGE-3之间的一种联系；然而，仅仅有大约26％的白人和17％的黑人在其细胞表面呈递HLA-A1分子。因此，寻找一些能被其它类型的MHC分子呈递的肽的信息是极其有用的，这样相当比例的人口将从以上的讨论过的研究工作中受益。
现在已经发现，MAGE-3衍生肽的抗原呈递并非仅仅局限于HLA-A1分子。本发明鉴定出了衍生于MAGE-3及其它MAGE TRAPs的肽类，它们能与MHC一类I分子HLA-A2形成复合物。这一发现的应用，包括在治疗和诊断方面的用途，都在本发明的内容之内并在下文中描述。
图1显示在本文所描述的肽类的初步筛选结果；
图2显示用SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：6所得到的滴定数据。
图3描述了在确定对肽与HLA分子复合物特异的CTLs能否被激活的实验中所得到的结果。X轴表示效应子靶细胞的比例，Y轴通过铬释放表示溶解百分数。
图4A，4B，4C及4D显示了在有限稀释分析实验中得到的四种特异性CTLs中的每一种的溶解百分数；靶细胞是T2细胞。
图5A-5D显示每种CTLs在针对各种转化细胞与非转化细胞以及转染细胞的试验中所得到的结果。
图6A与6B显示当COS-7细胞被一种或多种HLA-A2，MAGE-3和MAGE-12cDNA转染后所得到的结果。所用的分析方法是使用了WEHI-164克隆13细胞的一种TNF释放分析方法。在对照实验中，仅使用HLA-A2，MAGE-3以及MAGE-12cDNA的一种。图6A包括使用CTL克隆279/19的试验，而图6B用了CTL克隆297/22。
图7A与7B显示一个TNF释放分析的结果，其中将细胞HLA-A2+/MAGE-3+与MAGE-3或HLA-A2阳性细胞做了比较，但后者未同时使用。在图7A中用了CTL279/19，而图7B中用了CTL297/22来产生数据。
图8表示一个51Cr释放分析，其中HLA-A2+细胞被验证其与SEQ ID NO：6(细胞株T2)的结合，还试验了HLA-A2+/MAGE-3+细胞(即：SK23-MEL，LB43-MEL，LB273-MEL4.0)。
图9显示T2细胞与下述之一温育后的溶解情况(i)九肽Phe LeuTrp Gly Pro Arg Ala Leu Val(SEQ IDNO：6)或(ii)Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile(SEQ ID NO：12)。
实施例1
在这一系列实验中所应用的方法学是根据下述文献中的描述：Elvinet al.，J.Imm.Meth.158：161-171(1993)；Townsend et al.，Nature 340：443-448(August 10，1989)；Townsend et al.，Cell 62：285-290(July 27，1990)，所有文献引入本文作参考。
如同所述使用了细胞株174。它是一种呈递HLA-A2细胞株，在将肽运送到内质网上的MHC-I类杂合二聚体装配位点这一途径有缺陷。该细胞可以装配MHC-I类分子，但它们不稳定，当细胞溶解时，在保温过夜后解离成自由的重链与轻链。然而，在体外通过加上合适的肽类配位体可以使杂合二聚体得到稳定。见Townsend et al.，Nature 340：443-448(1989)；Townsend et al.，Cell 62：285-295(1990)。这样，稳定后的分子可以与对MHC-I类分子有特异性的抗体一起免疫沉淀。
在这些实验的第一部分中，检测肽类以确定它们是否使HLA-A2在细胞株中易于装配。被试验的肽包括：
SEQ ID NO：1 Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu
SEQ ID NO：2 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu
SEQ ID NO：3 Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu
SEQ ID NO：4 ILe Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu
SEQ ID NO：5 His Leu Tyr ILe Phe Ala Thr Cys Leu
SEQ ID NO：6 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
SEQ ID NO：7 Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val
SEQ ID NO：8 Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val
SEQ ID NO：9 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val
SEQ ID NO：10 Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val
细胞通过暴露于[35S]甲硫氨酸中进行标记(1-2×107细胞悬液，用100-200μCi用60分钟接触标记)。然后用磷酸缓冲盐水洗涤细胞一次，再重悬于10ml溶解缓冲液中(0.5％ NP-40；0.5％Mega 9，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5]，2mM  苯基甲基磺酰氟，5mM吲哚乙酰胺)。然后将溶解液与肽(10μM和20μM)保温15-18小时。在微型离心管中沉淀细胞核，溶解液于4℃用0.2ml洗涤过的10％(w/v)的Staphylococcus A预澄清处理过夜。将溶解液分成两部分，加入单克隆抗体BB7.2使其终浓度为5μg/ml。该单抗是一种构象专一性的，HLA-A2识别性单抗，见Parham et al.，Hum Immunol.3：277-299(1981)所述。混合液水浴90分钟，随后加入终浓度为1％(w/v)的牛血清白蛋白，以及100μl 5％(w/v)的蛋白-ASepharose颗粒。转动管子45分钟，然后用1ml洗涤缓冲液(0.5％NP-40，150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris[PH7.5])洗涤颗粒四次。样品洗脱出来后，在12％聚丙烯酰胺凝胶上参照Townsend et al.，Nature 340：443-448(1989)的方法分析。
图1显示了在这些实验中给出阳性结果的肽。它们是SEQ ID NOS：2，6，7，8以及10，在图中显示出黑带，指明在所有的胶中是相同的，并代表着在电泳前与这些肽复合的MHC分子(HLA-A2)的免疫沉淀。
图中按从左到右的顺序显示了有关SEQ ID NOS：2，6，7，8和10的工作。垂直的带将有关SEQ ID NO：10的实验与标有“.174”，“A2 Line”以及“.174 Matrix”的条带分开。174是一个MHC-I类分子重链的“阴性”对照。根据上文所提到的该细胞系在没有外源肽类存在时不呈递稳定的MHC-I类分子，而且由于BB7.2是构象特异性的，它将不能沉淀未复合的MHC-I类分子。“A2”是指一种已知的呈递HLA-A2的细胞株(该细胞株为LBL721，描述于DeMars et al.，Hum.Immunol.11：77(1984)，但任何呈递稳定的HLA-A2分子的细胞将以相同的方式起作用。“.174Matrix”显示当.174细胞与一种对照肽GILGFVFTL(SEQID NO：11)一起保温时的结果，该肽来源于流感病毒，并已知能被HLA-A2呈递。
通过重链(HC)条带与那些从A2和.174Matrix中得到的条带的比较所得的事实，表明了MHC-I类分子的稳定化。事实上，MHC分子已被还原性胶所破坏；但是，若在被还原前是稳定的，其重链分子将仍然与构象特异性的单克隆抗体结合在一起。这就是事实上凝胶所显示的，即所述的肽类结合到HLA-A2分子上，并使之稳定。实施例2
一旦结合的肽类被鉴别出来，就进行一系列的滴定实验。此时，根据文献Townsend et al.，Cell 62：285-295(July27，1990)中293页(引入本文作参考)，各种不同浓度的肽类，被加入到上文所述的细胞溶解液中，根据免疫沉淀的发生情况以确定这些肽发生结合时的最佳浓度。
图2显示了从两种肽SEQ ID NO：2和6中得到的结果。对照一种已知的HLA-A2结合肽SEQ ID NO：11滴定这些肽，从20μM开始进行10倍的稀释，浓度降至2，0.2和0.002μM。
使用这些肽(即SEQ ID NO：2和6)进行了实验。在SEQ ID NO：2实验中，此处未报道的是该肽在5-10nM滴定，这个浓度与对照(SEQ ID NO：11)相当。实施例3
进行了一系列的实验，来显示肽SEQ ID NO：6诱导对该肽与HLA-A2的复合物有特异性并能溶解这类复合物的细胞溶解性T淋巴细胞(“CTLs)的能力。在此描述这些反应中的第一个步骤。
外周血液淋巴细胞(“PBLs”)取自于正常的供给者，即没有任何癌症肿瘤的个体。该称之为“LB705”的供给者，分类为HLA-A1，A2，B8，B27。在开始时(“O日”)，从供给者中得到的PBLs以106细胞/ml的浓度悬浮于Iscove’s培养基以及10％胎牛血清和“AAG”(Asp＋Arg＋Glu)、20ug/ml的兔抗人IgM抗体，20ng/ml重组人IL-4(“r-hu-IL4”)以及0.005％Pansorbin细胞中。该混合液分到24孔组织培养板中(每孔2ml)。
在第3日，将细胞离心并重悬于Iscove’s培养基和10％人血清与AAG及20ng/ml r-hu-IL4中。
两天以后，即第5日，再次离心细胞，并重悬于新鲜的Iscove’s培养基与10％人血清和AAG以及20ng/ml r-hu-IL4，20u/ml重组人γ干扰素中。
在第6日，将细胞再次离心，以5×106细胞/ml浓度重悬于无血清Iscove’s培养基以及50μg/ml的肽SEQ ID NO：6中，并加入2.5ug/ml的人β2微球蛋白。该混合液中的细胞于37℃培养4小时，然后以50Gy放射线处理。再次离心细胞，重悬于Iscove’s培养基和10％人血清+AAG。然后将细胞放入24孔组织培养板的每个孔中，每孔1百万个细胞。
然后加入应答细胞，它们是同样取自于供给者LB705的CD8+T细胞，使用公知的分离T细胞部分的技术从供给者的PBLs中获得了CD8+细胞，应答细胞以5×106细胞/孔的浓度加到孔中。最终的体积是2ml。在加完细胞之后，随之加入1000U/ml的重组人IL-6(“r-hu-IL-6”)，10ng/ml的重组人IL-12(“r-hu-1L-12”)。
七天以后，即在第十三日，重新刺激应答细胞即CD8+细胞。该步骤的完成是通过将上述混合培养物转移到自粘连细胞中并加入10U/ml r-hu-IL-2及5ng/ml的r-hu-IL-7而实现的。自粘连细胞预先如下制备，培养5×106放射处理过(50Gy)的从LB705中得来的PBLs，于37℃在1ml Iscove′s培养基+10％人血清+AAG中培养2小时。移弃任何非粘连细胞，并加入溶于0.5ml无血清培养基中的50μg/ml的肽SEQ ID NO：6和2.5μg/ml的人β2微球蛋白。该混合液于37℃培养2小时，然后洗涤。随后将应答CD8+细胞加入其中。
在第21天，再刺激一次应答细胞，即加入2×106PBLs，后者于50Gy放射线处理，并已在无血清培养基+50μg/ml人β2微球蛋白+50μg/ml SEQ ID NO：6中培养2小时，随后并洗涤过。
该程序的结果是产生了对SEQ ID NO：6和HLA-A2的复合物有专一性的CTLs，如下面的实施例中所显示。实施例4
这些实验在第28天进行以确定根据本发明的肽类分子当其与HLA-A2复合时，是否会激起被CTLs溶解的反应。
使用了T2细胞系。该细胞系在其表面呈递HLA-A2分子，但它在抗原加工上有缺陷因此有着增强了的呈递外源肽类的能力。见Cerundolo，et al.，Nature 345：449(1990)，该文描述了这个细胞系。其它等价的细胞系也是可以接受的。
T2细胞样品用放射性铬(51Cr)标记，并与1μM的肽SEQ IDNO：6一起培养。在引入CTLs之前预培养进行一个小时。T2细胞的对照样品不与肽一起培养。
根据上文中实施例3，制备CTLs，使用自发APCs刺激CD8+细胞，并与SEQ ID NO：6肽一起预培养21天。
图3显示了结果。X轴表示效应细胞/靶细胞的比例，而Y轴表示特异性溶解的百分数。该百分比通过测定铬的释放确定，参看文献Boon，et al.，J.Exp.Med 152：1184(1980)，引入本文作参考。在每一试验小孔中，通过在使用的1,000个51Cr标记的T2靶细胞中加入50,000个K562细胞，可消除非特异性溶解的影响。K562细胞之所以能消除非特异性溶解，是因为其作为天然杀伤细胞或称“NK”的细胞优先溶解该细胞株。
可以清楚地看到该肽被HLA-A2分子呈递时，能够激发T2细胞的溶解。实施例5
在实施例4中所描述的工作产生了一种混合培养物，其中有对SEQ IDNO：6与其呈递的HLA-A2分子形成的复合物具有特异性的CD8+T细胞，还有非特异性CTLs。为了分离出具有所要特异性的CTL克隆，参照简述于此的Herin et al.，Int.J.Cancer 39：390-396(1987)上的方法(该文引入本文作参考)，进行一种有限稀释分析。
在第29日，参照上述的Herin et al的方法用已知可表达MAGE-3和HLA-A2的射线处理过的SK23-MEL细胞，与作为饲养细胞(feeder cells)的LG2 EBV细胞一起，与CTLs混合培养物结合。同时加入到混合物中的还有50U/ml的IL-2，5U/ml的IL-4。结果产生了CTL克隆297/19，CTL297/22，CTL297/27，以及CTL297/36。实施例6
在实施例4中，使用固定量的肽及变化的效应子/靶细胞比例，显示出了呈递肽SEQ ID NO：6的细胞溶解的诱导作用。而在本例的这些实验中，效应子/靶细胞的比率保持恒定，改变的是肽的数量。如同实施例4中对T2细胞及CTLs做的一样，进行一次51Cr释放分析。使用的是实施例5中的四种不同的CTLs。
图4A，4B，4C和4D显示了这些结果，指出溶解作用有一定的剂量依赖性。当T2细胞未与肽温育过时，溶解总是低于2％。实施例7
在另外一套实验中，在一个宿主细胞本身不表达HLA-A2的模型中检验了肽SEQ ID NO：6的溶解效应。
使用细胞株COS-7。该细胞用以下之一转染：(i)HLA-A2.01的染色体DNA和MAGE-3的cDNA；(ii)仅仅是HLA-A201的染色体DNA或(iii)仅仅是MAGE-3的cDNA。在每种情况中，转染载体都是pcDNA/AmpI，其中DNA连接在EcoRI人工接头上，并根据厂商指导被克隆到质粒的EcoRI位点中。受体细胞以15,000个细胞/孔的浓度接种于装有DMEM＋10％胎牛血清的培养基的组织培养平板底部的小孔内。细胞过夜培养后，弃掉培养基，再加入30μl/孔的含有10％Nu血清，400μg/ml DEAE葡聚糖，100μM氯喹以及100ng按此处所述制备的质粒的DMEM。作为又一个对照，COS-7细胞单独用HLA-A2转染(通过在pcDNA/AmPI中的HLA-A2.01)，并根据实施例4，与1μM的肽SEQ ID NO：6预先培育1小时。
另外，还使用了已知可以表达MAGE-3的并且属于HLA-A2+的黑素瘤细胞株。在图中这些细胞分别是LB373，LB43，LB24克隆409，以及SK23。细胞株MZ2-MEL.43是HLA-A2-的。在附加试验中该细胞株也用pcDNA/AmpI中的HLA-A2基因转染。
参照Traversari et al.，Immunogenetics 35：145-152(1992)中的方法(引入本文作参考)，并做了一些改变后，进行了TNF释放分析。具体地，1500个CTLs与30,000个靶细胞结合(CTLs是以上讨论过的一种克隆)，细胞在有25U/ml的IL-2存在下共同培养。24小时以后，培养上清用对TNF敏感的WEHI164克隆13细胞进行检验。在WEHI164克隆13中加入了LiCl以提高其敏感性(20mM)，参看Beyart，et al，PNAS86：9494-9498(1989)。
这些实验的结果描述于图5A-5D。每张图中表示的是不同的CTL克隆中，转染过细胞(图的上条带)以及肿瘤细胞(图的下条带)分别具有的TNF释放值(pg/ml)。图中表明单独用MAGE-3或是用HLA-A2转染，都不足以激起溶解反应，而并不让人吃惊的是，用MAGE-3和HLA-A2共同转染则足以激起反应。然而，真正出乎意料的是，当把肽SEQ ID NO：6加入到用HLA-A2单独转染的细胞中后，促成了溶解的升高。图中的第二条带也注意到这种模式，表示“MZ2-MEL.43/HLA-A2＋1μM SEQ NO：6”的数据证明了相对于其它所有的来说的超常的溶解。这种模式，正如所指示出的，在所有被检验的CTL克隆中都是重复出现的。实施例8
进行了另外一套实验来试验在肿瘤细胞铬释放分析中该肽的溶解效应。实施例6中的TNF分析比铬释放分析要敏感得多，所以后者将能更加确证TNF分析的结果。
有关51Cr释放分析的描述可见Boon，et al.，J.ExpMed.152：1184-1193(1980)。使用同样的分析方法，并使用了CTL克隆297/19和297/22，以及一系列已知是HLA-A2阳性的靶细胞。细胞株LB4和SK23也已知能表达MAGE-3。而细胞株T2是HLA-A2+及MAGE-3-的。
下表中列出了在不同的效应子/靶细胞比率中得到的数据。但是，该比率都很低。数据表示为在4小时及20小时后细胞溶解的百分数。表1 HLA-A2＋MAGE-3＋细胞的溶解在收集上清前将铬标记的靶细胞与CTL保温4小时或20小时
效应细胞 E/T         靶细胞温育   LB-43   LB-43   SK23   SK23   T2     T24b      20b     4b    20b    4b     20b
PENNA 297/19PENNA297/22    10310,30,10,0310310,30,10,03           15      73      6     30     0      814      72      8     50     4      016      64      6     31     1      97       59      3     11     0      83       21      1     7      0      104       26      1     3      1      719      83      10    31     0      116      74      12    40     2      317      82      13    52     3      922      63      3     25     1      178       48      1     11     0      116       11      1     1      1      6
                     最小  124    467    64    275   64   213
                     最大  871    830    734   720   352  338
             自发释放(％)  12％   35％   8％   28％  15％ 39％
即使是在低的E/T(效应子/靶细胞)比值下，仍然有显著的溶解发生，显示出诱导溶解的能力。实施例9
延续着实施例7中的工作路线进行了一个实验。检验了用含有HLA-A2基因，以及编码MAGE-12或MAGE-3的cDNA中的一种的pcDNA/Amp转染的COS-7细胞对CTL克隆297/19和297/22的刺激作用。作为对照的细胞用HLA-A2，MAGE-3或MAGE-12cDNA中的一种转染。为了提供一个表达HLA-A2的对照，一个转染的COS-7细胞样品与肽SEQ ID NO：6预先保温了1个小时。总量为1500的CTLs加到转染子中，24小时后，按前述的方法，通过分析其对WEHI-164克隆13细胞的毒性，测得上清中的TNF水平。
如图6A和6B所示，MAGE-3和MAGE-12被加工成似乎相同的肿瘤排斥抗原。给出的MAGE-12肿瘤排斥抗原的氨基酸序列含有一段与SEQ ID NO：6相同的氨基酸顺序。因此可以说，许多MAGE-TRAPS中的一个能够产生相同的肿瘤排斥抗原。实施例10
在另外一套实验中，用以前已经被鉴定分类为HLA-A2+和MAGE-3+的黑素瘤细胞检验了CTL克隆297/19和297/22。实验中应用了30,000个肿瘤细胞(靶细胞)，1500个CTLs(效应细胞)，共同培养使其结合。通过以上所述的方法及WEHI-164克隆13细胞测定了释放到共培养液中的TNF。
分别对应于CTL297/19和CTL297/22的图7A和7B，显示CTLs可以溶解那些HLA-A2+及MAGE-3+的细胞，但不溶解那些仅仅表现为一种阳性的细胞。注意HLA-A2+/MAGE-3+的细胞MZ2-MEL.43/HLA-A2，它是由MZ2-MEL.43(HLA-A2-，MAGE-3+)被HLA-A2转染而得到的。实施例11
在此实施例中检验了HLA-A2+/MAGE-3+的黑素瘤细胞被CTL克隆297/22溶解的情况。在这些实验中，靶细胞黑素瘤细胞与100U/ml IFN-γ和1ng/ml TNFα一起预先培养72小时，并用与上述相同的方法用51Cr标记。标记后的细胞与不同比例的效应细胞一起培养。5个小时以后测量51Cr的释放。
结果描绘于图8中，再一次显示出呈递HLA-A2与肽SEQ IDNO：6的复合物的肿瘤细胞被CTLs所溶解。实施例12
进行了一系列的实验，其中的COS-7细胞样品用编码HLA-A2的DNA和/或编码MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4和MAGE-12的cDNA中的一种转染。
在这些实验中，使用前述的DEAE-葡聚糖-氯喹方法，使用以下之一的DNA转染15,000个COS-7细胞：(a)100ng的质粒pcDNAI/Amp(含有编码HLA-A2的染色体DNA)，(b)100ng的质粒pcD-SRα，(c)100ng的质粒pcDNAI/Amp，含有MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4或MAGE-12的cDNA中的一种；或者是(d)，(a)和(c)一起转染。
在一天以后，使用胞溶性T细胞系CTL297/22及前述的TNF释放分析方法，检验得到的转染子。进行TNF释放分析时，在100μl的含有10％人血清及20U/ml的重组人IL-2的Iscove’s培养基中，加入了1500个CTLs。24小时以后，收集上清，按前述的操作步骤，使用一种MTT比色分析法，通过检验其对TNF敏感性WEHI-164克隆13细胞的毒性效应来确定TNF的水平。这些实验中的50％死亡的WEHI-164克隆13细胞是用6pg/ml的TNF-β得到的。
表2列出了结果。
                表2
LB705-CTL297/22对经HLA-A2基因和MAGE-2，
MAGE-3或MAGE-12 cDNA中的一种转染后的COS-7
细胞的识别用下述材料转染的COS-7细胞   由LB705-CTL297/22
                        释放的TNF(pg/ml)
      no DNA                      6
      HLA-A2                      2
      MAGE-1                      5
      MAGE-2                      4
      MAGE-3                      6
      MAGE-4                      3
     MAGE-12                      5HLA-A2＋MAGE-1                      7HLA-A2＋MAGE-2                     56HLA-A2＋MAGE-3                     93HLA-A2＋MAGE-4                      5HLA-A2＋MAGE-12                     80
15000个COS-7细胞通过DEAE-葡聚糖-氯喹方法用100ng的质粒pcDNA1/Amp(含有HLA-A2基因)与100ng质粒pcD-SRα或pcDNA1/Amp(含有MAGE-1，2，3，4或12的cDNA)转染。
转染子一天后通过LB705-CTL294/22检验其刺激TNF产生的能力。
在含有靶细胞的小孔中，于含10％的人血清和20U/ml r-hu-IL2的100μl Iscove培养基(Gibco BRL)中加入1,500个LB705-CTL297/22细胞。
24小时以后，收集上清，在一个MTT比色分析中检测其对WE HI-164克隆13细胞的细胞毒性以确定上清中TNF的含量。
在此实验中，通过6pg/ml的TNFβ得到50％致死的WEHI-164克隆13细胞。
MAGE-3和MAGE-12的成功是不出意料的，因为它们都加工为肽SEQ ID NO：6。肽SEQ ID NO：6也被MAGE-6编码。因此，可以预期的是，CTL297/22应该能识别源于SEQ ID NO：6的加工的HLA-A2和SEQ ID NO：6的复合体。而MAGE-2的成功，则暗示还有其它的九肽参与。MAGE-2包括一段与SEQ IDNO：12相对应的序列，即Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile但不是SEQ ID NO：6。实施例13
根据实施例12给出的结果，合成了一个与SEQ ID NO：12相对应的肽，然后在一个按前述方法进行的51Cr释放分析实验中进行了验证。使用不同浓度的肽，并用了不同比例的E/T，所有其它参数如前述。
如图9中所示，九肽SEQ ID NO：12确实能够激起呈递它的细胞的溶解反应。
前面描述了来源于MAGE肿瘤排斥抗原前体并能够与MHC-I类分子HLA-A2相互作用的肽类的鉴定。特别感兴趣的并且是本发明的一部分的，是由SEQ ID NO：1-10和12所代表的肽类。这一些肽类很容易用Merrifield合成法或者是其它肽类合成方法来合成。
具有特殊兴趣的肽是符合下列公式的肽：
(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9
                             (SEQ ID NO：13)
更为特别的是
Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)n Leu
                          (SEQ ID NO：14)以及
Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)n Val
                         (SEQ ID NO：15)其中n＝4或5，Xaa为任一氨基酸。在SEQ ID NO：13中，(Xaa)1优选的是Ala，Leu，Ile或Cys，最优选的是Gly或Phe。在(Xaa)2-7中的六个氨基酸可以是任意氨基酸，条件是(Xaa)2-7中的第二个氨基酸，或(Xaa)3，不能是Asp，(Xaa)3可以是Leu，Met或Pro，而(Xaa)9是任一氨基酸。特别优选的是像SEQ IDNO：6这样的肽，它是所有这些种类中的例子。
同样优选的还有以下形式的肽：Phe (Xaa)2-7 Leu Xaa(SEQ ID NO：16)其中Xaa是任一氨基酸，或是：Gly (Xaa)2-7 Leu Xaa(SEQ ID NO：17)同样其中的Xaa是任意氨基酸，除了(Xaa)3有前面所述的限制。这些组合包括在其它的MAGE基因中与SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：12相应的九肽。这样的肽的例子有：Phe Leu Leu PheLys Tyr Gln Met Lys(SEQ ID NO：18)；Phe Ile Glu Gly Tyr Cys Thr Pro Glu(SEQ ID NO：19)；Gly Leu Glu  Gly AlaGln Ala Pro Leu(SEQ ID NO：20)；以及Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu(SEQ ID NO：2，见前述)。这些九肽预期有强的结合HLA-A2的能力，因此可以用做确定某细胞是否HLA-A2阳性的试剂。尤其优选的是那些能满足前述的结构标准，并能结合HLA-A2，以及能激发对九肽和HLA分子复合物特异的细胞溶性T细胞的溶解反应的九肽。
正如所指出的，这些肽能与HLA-A2结合，这些复合体己被免疫沉淀，导致了本发明的另一方面，即分离的由这些肽中的任何一个与HLA-A2分子形成的复合体。
这些肽及其复合体在多个方面都是有用的。正如所显示出来的，这些肽与HLA-A2可结合，因而它们可用来分析在一个样品中是否存在HLA-A2呈递细胞。肽可以以某种可确定的形式与感兴趣的样品接触，例如一种被标记的肽(放射性标记、显色标记、等等)，或结合到固相支持物上，例如一种柱子或琼脂糖或SEPHAROSE微粒上，以及使用标准的分析方法，结合待确定的细胞。
这些肽及其分离的复合体均可用于生产对前面所提到的复合体有特异性的单克隆抗体或细胞溶解性T细胞克隆。完成此工作所需的方法对本领域熟练技术人员来说很熟悉，而且有关细胞溶解性T细胞克隆的生产在前面已有例子。由于某些癌症细胞呈递MAGE-3衍生肽如SEQ ID NOS：2，6，7，8，10和12与HLA-A2的复合体，这些单克隆抗体和细胞溶解性T细胞克隆可做为试剂用于诊断癌症，因为没有发现正常的细胞即非致癌细胞呈递这些复合体。上述的铬释放分析是用CTLs确定感兴趣的靶细胞的一种分析方法的范例，而且现有技术非常熟悉免疫分析及其操作方法。
如此衍生而来的细胞溶解性T细胞可用于诸如过继转移等方案。见Greenberg et al.，J.Immunol.136(5)：1917(1986)；Reddel et al.，Science 257：238(1992)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.21：1403(1991)；Kast et al.，Cell 59：603(1989)所有文献引入本文作参考。在这种方法中，前面所列举出的肽与抗原呈递细胞(“APCS”)结合形成稳定的复合体。已知许多这类方法，例如，披露于Leuscher et al.，Nature 351：72-74(1991)；Rometo et al.，J.Exp.Med.174：603-612(1991)；Leuscher et al.，J.Immunol.148：1003-1011(1992)；Romeroet al.，J.Immunol.150：3825-3831(1993)；Romero et al.，J.Exp.Med.177：1247-1256(1993)等文献上的方法(所有文献引入本文作参考)。随后，使呈递细胞接触细胞溶解性T细胞(源)，产生对感兴趣的复合体有特异性的细胞溶解性T细胞克隆。较好的做法是使用发现于待用CTLs治疗的患者血样中的一种自体性T细胞克隆。CTLs产生之后，就重注入待治疗的对象体内，其剂量应足以改善癌变的状况，如抑制其繁殖，或是通过溶解癌细胞。
如实施例中所表明的，本发明的另一方面，是联合使用IL-6和IL-12来激活T细胞，特别是细胞溶解性T细胞。同在此处的术语“激活”，指的是促使T细胞行使其预定功能的能力。当然，对于CTLs来说，就是识别与溶解在其表面呈递合适的肽与MHC分子的结合体的细胞。激活的T细胞可以用于诊断，如，确定某特定肽/MHC结合体，是否存在于其试验样品的某一细胞亚群中。使用结合的细胞因子也能使某特定CTLs的鉴别变得容易。已知在一CTL样品中，仅仅只有很小的一个亚群是可能对某一MHC/肽结合体有特异性的。通过在与呈递所需结合体的样品的结合中使用细胞因子，并通过溶解反应，比较其与对照值，就可确定激活与否。对照中，除了样品中未混有附加的材料外，其它都保持不变。它提供必不可少的对照值。
本发明的另一方面是一种用于T细胞激活作用的药盒。该药盒包括两个独立的组分：白介素-6和白介素-12，两个独立的组分包装于一个容器之内。感兴趣的药盒还可以包括：例如一份分开的待呈递的肽，和/或一种载体或HMC的编码区域，甚而或者是一种载体或MHC分子与该肽两者编码的序列。例如，该肽可能是SEQ ID NO：6。载体可能包含有一个HLA-A2编码区或是HLA-A2与SEQ ID NO：6的联合。本发明的另一个方面是一种基本上由IL-6和IL-12组成的组合物，其数量足以激活T细胞，例如CTLs。
用于此处时，“IL-6”和“IL-12”指的是这些分子的所有形式，它们可能是天然产生的也可能是重组生产的，人类的，鼠类的，或任何其它种属的，以及其它所有具有IL-6和IL-12的相同的激活性质的不同分子。
所用的IL-6和IL-12的量可以不同；然而，优选的方案是从约500-约1000U/ml的IL-6，以及从约1-约10ng/ml的IL-12，当然根据技术人员的发现，这些范围可以不同。
本发明的其它方面对于熟练技术人员很清楚，在此无须重述。
在此处所用的一些术语与表达仅是出于描述的需要而非限制，并且这些术语和表达的使用不排除任意等价的被显示或描述的特征或其部分，在本发明的范畴之内各种修改是可能的。

Claims (36)

1.选自以下一组的分离的肽
       SEQ ID NO：2
       SEQ ID NO：6
       SEQ ID NO：7
       SEQ ID NO：8
       SEQ ID NO：10
       以及SEQ ID NO：12。
2.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：2。
3.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：6。
4.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：7。
5.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：8。
6.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：10。
7.权利要求1的分离的肽，被命名为SEQ ID NO：12。
8.具有通式
(Xaa)1(Xaa)2-7(Xaa)8(Xaa)9
                  (SEQ ID NO：13)
的分离的肽，其中(Xaa)1指的是任一氨基酸，(Xaa)2-7是任意六个氨基酸，条件是所说的六个氨基酸中的第二个不能是Asp，(Xaa)8是Leu，Met，或Pro，(Xaa)9是任一氨基酸。
9.权利要求8的分离的肽，具有通式
(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Leu
                  (SEQ ID NO：14)。
10.权利要求8的分离的肽，具有通式
(Xaa)1Leu(Xaa)3Gly(Xaa)5-8Val
                (SEQ ID NO：15)。
11.权利要求8的分离的肽，其中(Xaa)1是Ala，Leu，Ile，Cys，Phe，或Gly。
12.权利要求11的分离的肽，其中(Xaa)1是Phe或Gly。
13.权利要求8的分离的肽，其中(Xaa)1是Phe，(Xaa)8是Leu。
14.权利要求8的分离的肽，其中(Xaa)1是Gly，(Xaa)8是Leu。
15.权利要求11的分离的肽，选自由
                 SEQ ID NO：18，
                 SEQ ID NO：19，和
                 SEQ ID NO：20′
组成的一组。
16.HLA-A2和权利要求1的分离的肽的分离的复合体。
17.权利要求16的分离的复合体，其中所说的肽被命名为SEQ ID NO：6。
18.权利要求16的分离的复合体，其中所说的肽是SEQ ID NO：12。
19.分离的细胞溶解性T细胞克隆，它对HLA-A2与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：12一组的肽形成的复合体有特异性。
20.单克隆抗体，它特异性地结合HLA-A2与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：12一组的肽形成的复合体。
21.治疗带有癌变的患者的方法，所述癌变的特征是在其表面呈递HLA-A2与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：12一组的肽形成的复合体的癌细胞，所述方法包括对所说的患者给予足以溶解所说癌细胞的量的权利要求16的分离的细胞溶解性T细胞克隆。
22.鉴定处于癌变状况的患者的方法，包括使从所说患者中取得的样品于体外接触对HLA-A2与选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQID NO：10以及SEQ ID NO：12一组的肽形成的复合体有特异性的试剂，确定由所说的试剂与所说样品中的细胞的反应来确定癌变症状。
23.权利要求22的方法，其中所说的试剂是细胞溶解性T细胞克隆。
24.权利要求22的方法，其中所说的试剂是单克隆抗体。
25.激活T细胞的方法，包括使T细胞接触足以激活所说T细胞的数量的IL-6和IL-12的结合物。
26.权利要求25的方法，其中所说的T细胞是细胞溶解性T细胞。
27.权利要求25的方法，其中所说的IL-6的给药量从大约500-1000u/ml，所说的IL-12的给药量从约1-10ng/ml。
28.用于激活T细胞的药盒，包括分开的IL-6和IL-12各一份，其量足以激活T细胞，以及包装这两个独立成分的容器。
29.权利要求28的药盒，还包括一份分开的肽。
30.权利要求28的药盒，还包括一种编码MHC分子的核酸分子。
31.权利要求28的药盒，还包括一种编码MHC分子以及被所说的MHC分子呈递的肽的核酸分子。
32.权利要求28的药盒，还包括一种编码肿瘤排斥抗原前体或肿瘤排斥抗原的核酸分子。
33.权利要求28的药盒，还包括一种编码MHC分子以及能加工成被所说的MHC分子呈递的肿瘤排斥抗原的肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。
34.基本上由其量足以刺激T细胞的IL-6及IL-12组成的组合物。
35.权利要求34的组合物，其中所说的IL-6的数量范围从大约500ug/ml到大约1000ug/ml。
36.权利要求34的组合物，其中所说的IL-12的数量范围从大约1ng/ml到大约10ng/ml。
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