CN1283652C - 分离的编码癌相关抗原的核酸分子和该抗原本身及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码癌相关抗原的核酸分子(如图示)的分离。本发明还有一个方面是该抗原本身及该核酸分子及其衍生的抗原和肽的用途。

Description

分离的编码癌相关抗原的核酸分子 和该抗原本身及它们的用途
本发明是在此用作参考的1996年10月3日提交的顺序号为08/725182的申请部分继续申请。
本发明涉及与癌症相关的抗原，和编码其的核酸分子，以及它们的应用。
众所周知在许多病理条件下，例如感染、癌症、自体免疫疾病等，其特征在于特定分子的不适宜表达。这些分子因此成为了特导病理或异常状态的“标记”。除去其作为诊断“指标”，即作为诊断这些异常状态时所鉴定的物质的用途之外，它们还可作为反应物来用于生产诊断和/或治疗剂。一个非限制性的实例就是使用癌症标记来产生特异于特定标记的抗体。还有一个非限制性的例子是使用与MHC分子复合的肽来产生异常细胞的溶细胞T细胞。
当然，这些物质的制备是要有先决条件的，那就是必须有用于产生这些物质的反应物的来源。从细胞中纯化是繁重的，这远非进行这种生产的确定方法。另外一种优选的方法是分离编码特定标记的核酸分子，然后用此分离的编码分子来表达所需的分子。
到目前为止，已有两种策略用来在例如人肿瘤中检测这类抗原。这些被称为是遗传方法和生化方法。遗传方法的实例见被在此处用作参考的dePlaen等，Proc.Natl.Sci.USA 85：2275(1988)。在此种方法中，将几百个来自于肿瘤的cDNA文库的质粒库用于转染到受体细胞中，例如COS细胞中，或者用于测试特定抗原表达的肿瘤细胞系的抗原阴性变体中。该生化方法的实例见被在此处用作参考的Kawakami等Nature369：69(1994)中，其首先根据结合到肿瘤细胞的MHC的I型分子上的肽的酸性洗脱物，然后以反相高效液相色谱(HPLC)处理。在其结合到无MHC的I类分子的突变细胞系上(抗原肽在抗原加工中有缺陷)，而且诱导了与细胞毒性T淋巴细胞的特异反应而鉴定抗原肽。这些反应包括CTL增殖的诱导、TNF释放、以及标靶细胞的裂解，它们可在MTT测试或者51Cr释放测试中检测。
这两种分子确定抗原的方法具有下述缺点：首先，这些方法极其繁重、耗时而且费用昂贵；其次，它们依赖于带有预定特性的细胞毒T细胞系(CLTs)的建立。
对两种已知的鉴定和分子定义抗原的方法所固有的问题的最好说明是，这两种方法到目前为止仅仅限制在非常少的人类肿瘤的新抗原上取得了成功。参见，例如，Van der Bruggen等，Science 254：1643-1647(1991)；Brichard等，J.Exp.Med 178：489-495(1993)；Coulie等，J.Exp.Med 180：35-42(1994)；Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3515-3519(1994)。
此外，所述的方法依赖于建立所研究的癌症类型永久细胞系的可行性。而要从某些癌症类型建立细胞系是非常困难的，例如Oettgen等在Immunol.Allerg.Clin.North.Am.10：607-637(1990)中所表明的一样。而且还已知一些上皮细胞类型的癌症在体外对CTLs是非常不敏感的，这使得人们不可能进行常规分析。这些问题都推动着本领域技术人员开发鉴定癌相关抗原的其它方法。
一种关键方法是引入此文作为参考的Sahin等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：11810-11913(1995)中所述的方法。同样，还可参考美国专利申请号08/580,980，及申请号08/479,328，它们分别是1995年7月7日和1996年1月3日提交的。所有这三种参考文献均引入本文作为参考。简言之，该方法涉及原核宿主中cDNA文库的表达(该文库来自于肿癌标本)。然后用吸收和稀释的血清对表达的文库进行了免疫筛选以能够检测那些诱导高滴度体液反应的抗原。这种方法被称之为SEREX方法(S erological identification of antigens by  RecombinantExpression Cloning″)。该方法已用于确证以前鉴定的肿癌相关抗原的表达，并用于检测新的抗原。参见上述参考专利申请及Sahin等，Supra，以及Crew等，EMBO J 144：2333-2340(1995)。
该SEREX方法已被用于食管癌标本，而且目前也已鉴定出了一个抗原，还分离和克隆了编码其的核酸分子。已发现该抗原更广泛地存在于癌症中，但在非癌细胞中却并未发现。此外，这尤其是本发明的目的，这将在下面的公开中进行更详细的描述。
附图简要说明
图1表示NY-ESO-1抗原RNA在不同类型组织中的表达图谱。
图2表示NY-ESO-1 mRNA的Northern印迹分析，该mRNA发现于睾丸和SK-MEL-19细胞系中，但在其它细胞和组织样品中则未见到。
图3表明推论所得的NY-ESO-1氨基酸序列的可能的修饰位置。
图4表明NY-NEO-1的亲水性曲线，显示在其氨基端的亲水结构域及在接近其羧基端的一段长的疏水序列。
图5表明用HLA-A2阳性、NY-NEO-1阳性、二者均阳性或者二者均非阳性的各种细胞进行CTL裂解研究的结果。
图6的数据说明HLA-A2是呈递SEQ ID No.1衍生肽的呈递分子。
优选实施方案的详细描述
实施例1
可用熟知的方法从中度分化的食管的鳞状细胞癌的速冻样品中提取总RNA。这当中的一种方法参见例如Chomzynski，J.Analyt.Biochem.162：156-159(1987)。用该RNA制备cDNA文库，然后再将该文库转染到λZAP噬菌体载体中，方法依照产商说明书。然后将λZAP文库转染到大肠杆菌中，产生了1.6×106初级分离物。
然后采用了在此引作参考的Salin等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11810-11813(1995)的SEREX方法。简言之，通过将血清与用不含食道癌细胞的cDNA克隆的噬菌体λZAP转染的大肠杆菌的裂解物混合从自体血清中去除了大肠杆菌内源分子的抗体。
然后将耗竭的血清进行稀释，并与含噬菌体斑的硝酸纤维滤膜混合。将噬菌斑在室温下温育过夜。随后进行洗涤，并将滤膜与碱性磷酸酶结合的羊抗人FCγ二级抗体进行温育，然后，通过与5-溴-4氯-吲哚磷酸及氮蓝四唑温育可观察到反应的噬菌斑。总共发现了13个阳性克隆。
实施例2
鉴定之后，通过稀释克隆及用人血清测试，将反应的克隆亚克隆成为单克隆。然后用产商建议纯化这些克隆，在体外切割，并转变成pBK-CMV质粒形式。用EcoRI-XbaI限制图来评价插入的DNA并确定各种插入片段。鉴定了8种不同的插入片段，其大小范围为从约500到1.3kbp。以ABI PRISM自动测序仪对克隆进行测序。
表I总结了结果。一个基因由4个重叠克隆所代表，第二个基因由3个重叠克隆代表，余下的6个仅由一个克隆代表。
同源性检索表明被称之为NY-ESO-2、3、6、7的克隆是已知的。参见Elisei等.J.Endocrin.Invest.16：533-540(1993)；Spritz等Nucl.AcidsRes.15：10373-10391(1987)；Rabbits等Nature Genetics 4：175-180(1993)；Crozat等，Nature 363：640-644(1993)；GenBank H18368和D 25606。此前已表明其中的两个克隆(NY-ESO-3和NY-ESO-6)在各种正常人组织中都有表达。没有发现谱系限制的证据。NY-ESO-6(cDNA)似乎是FUS/TLS基因的3′非翻译部分。在此处未报道的实验中，NY-ESO-6测序和Southern印迹分析未发现癌中有转位或点突变的证据。其中的四个克隆，即NY-ESO-1、4、5和8并未表现出与所检索的数据库中序列有强烈的同源性，因此对它们进行了进一步的研究。
表1  以自身血清通过免疫筛选从食道癌文库中分离的基因
  基因   克隆编号   大小   DNA文库   注*
  NY-ESO-1   E1-5bE1-114bE1-153cE1-50   679bp614bp670bp679bp   没有强烈同源性   在睾丸和卵巢中表达
  NY-ESO-2   E1-71aE1-140E1-31   605bp874bp750bp   U1小核RNP 1同系物   以Ab筛选克隆(甲状腺炎患者)
  NY-ESO-3   E1-141b   517bp   结肠3′同向MboIcDNA；成人脑cDNA   (dpi D25606，gbH18638)未公开
  NY-ESO-4   E1A-10c   400bp   没有强的同源性   正常组织中普遍表达
  NY-ESO-5   E1A-54   670bp   没有强的同源性   在正常食管中表达
  NY-ESO-6   E1B-9b   -1.2kb   人fus mRNA   脂肉瘤中转位t(12；16)
  NY-ESO-7   E1B-20f   -1.0kb   人U1-70k sn RNP   与NY-ESO-2(emblHSU17052，gbM22636)不同
  NY-ESO-8   E1B-20g   -1.3kb   没有强的同源性   在正常组织中普遍表达
实施例3
开展研究以进行NY-ESO-1、4、5和8克隆的mRNA表达。为了达到这个目的，对每个序列设计了特定的寡核苷酸引物，以使得300-400个碱基对的cDNA节段能够得以扩增，从而使引物的解链温度在65-70℃的范围之内。用市场上可买到的试剂和标准程序进行反转录PCR。测试了各种正常和肿瘤细胞。克隆NY-ESO-4和NY-ESO-8是普遍存在的，故未对其作进一步的研究。在原发肿瘤中和正常食管组织中NY-ESO-5有高水平表达，表明它是一种分化标记。
发现NY-ESO-1在肿瘤mRNA和睾丸中有表达，但在正常的结肠、肾脏、肝脏或脑组织中并没有表达。这种表达方式是与其它肿瘤排斥抗原前体是一致的。
实施例4
在一套完全的多的正常和肿瘤组织中对NY-ESO-1以上述建立的RT-PCR方法进行了分析。表2、3和4表明了这些结果。简而言之，发现NY-ESO-1在正常睾丸和卵巢细胞中是高度表达的。在正常的子宫肌层也发现了少量的RT-PCR产物，而在子宫内膜中却并没有、但阳性结果是不一致的。各种细胞类型的鳞状上皮，包括正常食管和皮肤也是阴性的。
当对各种无关的细胞系的肿瘤进行测试时，11个黑素瘤细胞系中的2个有相当强的表达，67个黑素瘤标本中的16个相当强的表达，33个乳腺癌标本有6个，而4个膀胱癌样品中有4个都表现出强烈的表达。在其它类型的肿瘤中也有零星的表达。
表2  正常组织中NY-ESO-1的mRNA分布
  组织   mRNA   组织   mRNA
  食管脑*胎儿脑心脏肺肝脏脾肾胃   ---------   肾上腺胰腺精囊胎盘胸腺淋巴结扁桃体PBLPBL，活化的# ---------
  小肠结肠直肠乳房皮肤 ----   黑素细胞甲状腺子宫睾丸卵巢   --+/-**++
*来自于一些待测部分的组织#用IL-2及PHA
**在有些样品中微弱阳性，Northern印迹为阴性
表3  黑素瘤及乳腺癌细胞系中NY-ESO-1的mRNA分布
  细胞系   NY-ESO-1 mRNA
  MZ2-MEL3.1MZ2-MEL2.2SK-MEL-13SK-MEL-19SK-MEL-23SK-MEL-29SK-MEL-30SK-MEL-31SK-MEL-33SK-MEL-37SK-MEL-179SK-BR-3SK-BR-5734BMDA-MB-231   ---+-----+-----
表4  通过RT-PCR测到的各种人肿瘤中NY-ESO-1 mRNA的表达
  肿瘤类型   mRNA(阳性/总数)   肿瘤类型   mRNA(阳性/总数)
  黑素瘤乳腺癌前列腺癌结肠癌神经胶质瘤胃癌肺癌肾癌淋巴癌*肝细胞瘤    25/7717/434/160/160/150/125/170/100/102/7   卵巢癌甲状腺癌膀胱癌Burkitt淋巴癌基底细胞癌Jejomyosarcoma其它肉瘤胰腺癌精原细胞瘤脊髓瘤   2/82/59/131/20/20/20/20/20/10/1
*非Hodgkin、非Burkitt类型
还进行了另外一套实验以确证是否可以通过ELISA来确定在癌症患者的血清中是否存在抗NY-ESO-1抗体。简言之，可用常规方法将通过下面建立的方法产生的重组NY-ESO-1蛋白质包被到固体表面上。血清样品来自于正常患者及患有不同癌症的患者。应将抗NY-ESO-1抗体结合到其上。
然后将它们与羊抗人IgG接触，其以碱性过氧化物酶进行标记，并以底物进行显色。结果见于下表：
  Eso 1+/总测试   ％
  癌症患者黑素瘤卵巢癌肺癌供血者 11/1274/311/240/70 8.712.94.00
实施例5
接着进行Northern印迹来研究NY-ESO-1转录体的大小，并确定组织表达模式。采用的是Ausubel等当代分子生物学方法(Current Protocds InMokcular Biology)(John Wiley & Sons，1995)的方法。具体而言，将总共20微克/泳道的RNA溶于含甲醛和甲酰胺的缓冲液中，加热到65℃，分离于1.2％琼脂糖胺，含3％甲醛，然后转到硝酸纤维滤膜上。用32P标记探针进行杂交，接着进行高度严紧洗涤。最后一次洗涤为0.1×SSC、0.1％SDS、60℃，15分钟。
在前面的实验中对NY-ESO-1表现阳性的来自于睾丸和黑素瘤细胞系(SK-MEL-19)的RNA表现出有0.8-0.9kb的RNA转录物。而食管癌样品则表现出0.4-0.9kb范围内的不清晰的成片电泳条带，说明有部分降解。来自于所测试的其它组织或细胞系的RNA没有表现出转录。
为了得到编码全部转录物的cDNA，对食管cDNA文库进行了再筛选，用噬菌斑杂交而杂交探针是原初cDNA克隆。从3×105个克隆中筛选出来6个阳性克隆。对3个最长的克隆进行了测序。对开放读码框的分析表明这三个全部都含有全长编码区以及不同长度的5′非翻译区。最长的克隆其长度为755碱基对(不包括多聚腺苷酸)，含有543碱基对的编码区，以及5′端的53个非翻译碱基和3′端的151非翻译碱基对。参见SEQ ID No.1(也见于图3)。
长ORF表明NY-ESO-1蛋白质的推定序列是180个氨基酸。单个的免疫阳性克隆含有编码其中的173个的序列。其推定分子量为17995道尔顿。
分析表明在N端部分富含甘氨酸残基(头80个中有30个，其余100个中有4个)。亲水性分析表明在分子的N端一半有亲水的抗原序列，其带有可变的亲水和疏水序列，末端有长的C端疏水尾部(氨基酸152-172)，其后为短的亲水尾。这种形式暗示其有一穿膜结构域。还有几个潜在的N-豆蔻酰化位点、3磷酸化位点，而并没有N-糖基化位点的证据。
实施例6
1995年从一例恶性黑素瘤患者建立了黑素瘤细胞系“NW-MEL-38”。在本研究的整个过程中，从患者取得了血清样品，外周血淋巴细胞以及肿瘤样品并冷冻至进行本文所述的研究。期望在该患者中评测抗肿瘤T细胞反应，将该患者HLA分类为HLA-A1和HLA-A2。
为了确定从此患者得到的黑素瘤是否表达NY-ESO-1，用常规技术从肿瘤样品和细胞系NW-MEL-38中分离到了总RNA。然后，再次通过常规手段将来自于每个样品的两毫克总RNA进行cDNA合成。
然后将cDNA进行RT-PCR实验，所使用的引物为：
5′-CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G′-3′(SEQ ID NO：2)
和
CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG-3′(SEQ ID NO：3)
这些引物应该可以扩增SEQ ID：1的核苷酸271到599之间的节段。
扩增进行35个循环，所用的退火温度为60℃。在1.5％琼脂糖胶上以溴化乙锭染色来观察PCR产物。
结果表明肿瘤和细胞系都表达了SEQ ID No：1。细胞系和肿瘤样品用于下面的实验中。
实施例7
然后用前面讨论过的分离的cDNA分子用于制备重组蛋白质。具体而言，用常规方法通过PCR扩增cDNA，然后克隆到市场上可买到的质粒载体即pQE9中，其中含有His标记。在此处未进行详细描述的研究工作中还使用了另一种载体，即pQE9K。这与pQE9是不同的，因为pQE9K带有卡那霉素抗性，而非氨卡氨苄青霉素抗性。
将质粒载体转到大肠杆菌菌株XL1-Blue中，通过限制图谱和DNA测序识别阳性转化体。以异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的产生，用熟知的方法在Ni2+离子色谱柱上纯化该蛋白质。在以15％SDS-PAGE和银染分析蛋白质时，发现它是一个其分子量大约为22千道尔顿的蛋白质。这与通过其序列推测的分子量大小是一致的。
然后产生真核转染子。为了达到此目的，从前述的pQE9载体中分离NY-ESO-1编码序列，然后克隆到真核表达载体pcDNA 3.1的BamHI-HindIII位点上。接下来，用此载体转染COS-7细胞，方法是将细胞样品与150纳克前面讨论过的质粒以及含有HLA-A 2.1的cDNA或HLA-A1的cDNA的质粒pcDNA1 Amp进行接触，方法用的是周知的DEAE-葡聚糖氯喹法。然后在37℃下将细胞进行温育48小时，然后在CTL刺激测试中进行实验。具体地，该实验方法采用在此处用作参考的Traversari等lmmunogenetics35：145-148(1992)的方法。简而言之，将置于补充有100％人血清以及25V/毫升的重组IL-2的100微升RPMI中的2500CTLs(NW38-1Vs-1，参见后面的实施例9)加到含有COS-7转染子(20000个细胞/孔)的微孔中。在24小时之后，从每个孔中回收50毫升的上清液，以常规方法确定TNF-α的水平，也就是用MTT测定了对WEHI 164克隆13细胞的细胞毒性。在下述实施例描述中，用阳性细胞进行Western印迹分析。
根据在此处用作参考的Knuth等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3511-3515(1984)的方法制备用作CTLs的CTL NW38-IVS-1。具体而言，建立混合的T淋巴细胞培养物，其方法是将从受试者取得的105个自身NW38-MEL-1肿瘤细胞和106个外周血淋巴细胞混合。加入细胞因子IL-2，将混合培养物在37℃温育一周。除去肿瘤细胞，将5×104个肿瘤细胞的新等分试样与IL-2一起加入。该过程每周重复，只到用51Cr标记的NW-MEL-38细胞测试时能见到强烈的反应。收集效应器T细胞，冷冻待用。
实施例8
进行Westerm印迹分析，所用的血清样品、从细胞系NW-MEL-38得来的细胞裂解物、COS-7转染物和纯化的重组蛋白在前面均有描述。血清样品从患者治疗不同点得来。结果无差异。
在这些实验中，将1微克的重组NY-ESO-1蛋白或5微升任一种细胞裂解物稀释于SDS中并煮沸5分钟，然后在15％SDS胶上电泳。在硝酸纤维上过液杂交之后，用3％BSA封阻，将印迹用血清温育，稀释到1∶1000，1∶10000和1∶100000，或用NY-ESO-1的单克隆抗体稀释至1∶50作为阳性对照。单克隆抗体如下制备。以2-3周的间隔用重组NY-ESO-1对BALB/C小鼠进行5次皮下注射使其免疫。免疫试剂包括佐剂中的50微克重组蛋白。第一次注射使用完全Freund佐剂，其后使用不完全Freund佐剂。脾脏细胞取自免疫后的小鼠，并将其与小鼠黑素瘤细胞系SP2/0融合产生杂交瘤。
一旦产生杂交瘤就将其进行克隆，并用重组蛋白质对其上清进行筛选，用微滴定板标准固相ELISA进行。该实验根据在此处用作参考的Dippold等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：6114-6118(1980)的方法。还用重组NY-ESO-1作为一系列的阴性对照进行了实验。由大肠杆菌按前述方法产生的结合到重组蛋白质上血清抗体，通过羊抗人IgG来显影，IgG用1∶10000稀释度的碱性磷酸酶进行标记，然后用NBT-磷酸进行显影。对照使用未转染的COS-7细胞。来自于健康个体的血清也用作对照。
在血清稀释度降到1∶100000时，发现与重组蛋白有强烈反应性，而且与NW-MEL-38的裂解物也有反应性。未发现有与未转染的COS-7细胞的反应性，与来自于健康个体的血清也不具有反应性。
实施例9
在前述的COS-7转染子测试和本实施例的试验中，使用了细胞溶解T细胞系“NW38-IVS-1”。用肿瘤细胞系NW-MEL-38通过体外刺激前面提到的外周血淋巴细胞产生“CTL”。方法为常规技术。
用CTL进行的细胞毒性测试，这些细胞为NW-MEL-38(HLA-A1，A2为阳性，NY-ESO-1阳性)，以及两个同种异基因细胞系(NY-ESO-1和HLA-A2阳性)(SK-MEL-37和MZ-MEL-19)，一个MHC的I型阴性细胞系(SK-MEL-19)，HLA-A2阳性，但NY-ESO-1阴性细胞系(NW-MEL-145)，以及对照细胞系K562和刺激胚细胞的自身植物凝集素。利用了各种效应器/标靶(effector/target)比率，所测定的指标是15C标记的靶细胞裂解。
结果表明CTL NW38-IVS-1同时裂解了自身细胞系NW-MEL-38和HLA-A2及ESO-1阳性的同种异基因细胞系。因此，该CTL与同种异基因物质反应。参见图6。
实施例10
由于患者NW38是HLA-A1和HLA-A2阳性的，故进行了实验来确定哪一个MHC分子是呈递分子。
进行前述用COS-7细胞的相同实验，只不过在这些实验中小心地确保把已用HLA-A1 cDNA或HLA-A2 cDNA，但不是二者同时转化的共转化子分开。这些结果表明CTL NW38-IVS-1仅裂解了同时包含NY-ESO-1和HLA-A2的COS-7转染子。参见图6。该项工作也确证了CTL的特异性，由于实施例9中所述的NY-ESO-1阴性，HLA-A2阳性细胞对其它已知加工成被HLA-A2分子呈递的肽是阳性的。
实施例11
一旦识别出呈递MHC分子为HLA-A2，则进行NY-ESO-1氨基酸序列的筛选，以鉴别能满足这一基序的所有肽，方法采用在此文中引作参考的D′Amaro等Human Immunol 43：13-18(1995)和Drijfhout等Human Immunol.43：1-12(1995)的方法。从而合成了相应于所有推论所得的氨基酸序列的肽，方法为常规技术，然后将其用于毒性试验，试验方法根据在此处用作参考的Knuth等Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：3511-3515(1984)所述。具体而言，采用细胞系CEMX 721.174.T2(此后为“T2”)，因为它不将抗原加工成MHC复合的肽，因此使其成为了此处所述类型的实验中的理想物质。用常规方法以100微居里的Na(51Cr)O4对T2细胞的样品进行标记，并洗涤三次，随后与10微克/毫升的肽和2.5微克/毫升的β2-微球蛋白一起温育。温育在室温下进行一小时。然后将效应器细胞(100微升的CTL NW38-IVS-1悬浮液)加入，其效应器/靶比率为90∶1，在5％CO2，37℃的水饱和气氛中温育4个小时。然后，将板在200×g下离心5分钟，移去100微升的上清并测定其放射活性。用已知的方法确定51Cr释放百分率，发现肽SLLMWITQCFL(SEQ ID No：4)、SLLMWITQC(SEQ ID No：5)和QLSLLMWIT(SEQ ID No：6)是CTL的三个最佳刺激物。如前面所示，当用NW-MEL-38和细胞系SK-MEL-37和MZ-MEL-19用作靶时得到类似结果。
前面的实施例描述了编码食管癌相关抗原的核酸分子的分离。此处所用的“相关”指的是虽然明确该相关分子是由食管癌表达的，但其它癌，例如黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌和肺癌也表达该抗原。
本发明涉及编码前述的抗原，而且在严紧紧条件下与参考序列SEQ IDNo：1杂交的核酸分子。此处所说的“严紧条件”指的是美国专利号5342774中所指的那些条件，即65℃杂交18个小时，随后以2×SSc和0.1％SDS洗涤4次，每次1个小时，最后一次用0.2×SSc洗涤，更优选以0.1×SSc、0.1％SDS洗涤30分钟，以及其它能给予同样水准的严紧性和更高的严紧性的条件。
本发明的另一部分涉及以可操作的连接本发明的核酸分子掺入到启动子上的表达载体。构建这样的载体的方法在本领域是成熟的，跟产生编码目的分子的真核细胞系或者原核细胞系株的细胞的转化或转染一样。以此方式使用的宿主细胞的实例是COS细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞(例如Spodoptera frugiperda)、UIH 3T3细胞等等。原核细胞，例如大肠杆菌及其它细菌也是可用的。
本发明的另一部分还包括此处所述的抗原，原始肽形式和翻译后修饰形式均可。该分子足够大从而在不经过翻译后修饰即会具有抗原性，因此它当与佐剂(或没有也可)结合时，可以使用前体和转录化修饰两种形式用作免疫原。用该抗原产先的抗体是单克隆或多克隆的，同样也是本发明的一个组成部分，制备单克隆抗体的杂交也是本发明的内容之一。其可以全蛋白或如上述讨论部分用于治疗。本发明的另外部分还包括这些抗原的抗体，多克隆的和单克隆的，活性片段，例如Fab，F(ab)’2及其它片段，以及嵌合体、人源化抗体、重组产生的抗体，诸如此类。
从本公开中可明白，人们可将本发明的蛋白质或核酸分子用于诊断。此处所述的SEREX方法学的前提是病理相关抗原的免疫反应。因此，人们可以通过例如检测受试者的体液标本例如血清来测定与抗原本身的相关病理学反应性。反应性可看作是可能的病理学出现的指标，因此人们也可以通过本领域熟知的常规核酸杂交方法来测定抗原的表达，这些核酸杂交方法没有必要在此详述。人们还可以用免疫测试法来测试受试分子的抗体。
对SEQ ID No：1的分析表明其上有5′和3′非编码区，本发明涉及至少包含编码节段，即核苷酸54-593的，以及可能含有SEQ ID No：1的核苷酸1-53和/或594-747任何或全部的分离的核酸分子。
如前面所述的进一步的分析表明该分子是被加工成通过溶细胞T细胞诱发裂解的肽。实施例7表明了这种类型的基序分析是如何可以为HLA-A2分子进行的。在各种MHC或HLA分子的基序方面已进行大量的工作，这些在这里也是适用的。因此，本发明的另一方面是一种治疗方法，其中将结合到患者肿瘤细胞表面上的HLA分子上的一种或多种肽对患者进行给药，其量足以使肽结合到MHC/HLA分子上，并通过T细胞诱发裂解。前面给出的HLA-A2分子的实例并非是可用的这种给药的唯一方式。可以使用这些肽的任何组合。可以单独或组合起来给药的这些肽，以及全蛋白或其免疫活性部分也可以对需要它们的患者进行给药，给药方法可以是常规给药方法中的任何一种，包括静脉内、皮内、皮下、经口、经直肠以及透皮给药。常规的药物载体，佐剂，例如皂苷，GM-CSF以及白介素等等都可以使用。而且，这些肽或蛋白质可以用所列物质，如树状细胞或其它可呈递相关MHC/肽复合物的细胞配成疫苗。
类似地，本发明设计了治疗方法，其中编码NY-ESO-1的核酸分子被掺入到了载体中，例如基于腺病毒的载体，使其可转染到真核细胞中，例如人细胞。类似地可将编码一条或多条肽的核酸分子掺入到这些载体中，然后其是核酸基治疗的主要成分。
这些实验中的任何一个试验也可用于进展/退化研究中。人们可以使用前面建立的所有方法中的任一种仅通过监测蛋白质水平，其表达等来监测涉及NY-ESO-1表达的异常过程。
应当明确的是这些方法可以用来研究某种治疗方法的有效性。一般而言，人们可以使用前述的任何方法确定一个NY-ESO-1蛋白的基准值，可用某种特定的治疗剂给药，然后检测给药后的蛋白质水平，观察作为该方法的有效性的ESO-1水平的变化。
如同上面所说的，本发明尤其还涉及对NY-ESO分子的“整套”免疫反应的识别。其中一个方面就是其检测癌症治疗的过程的能力。在该方法中，让一名需要这种治疗的受试者接受了此处所述的一种接种，该方法是本发明的一部分。这种接种导致了例如对呈递HLA/肽复合物的细胞的T细胞反应。该反应还包括抗体反应，这可能是通过T细胞对细胞的裂解释放诱发抗体的蛋白质的结果。因此，我们可以通过检测抗体反应来检测疫苗的效应。如同前面所说的，可将抗体滴度的增加看作是疫苗的进步的指标，反之亦然。所以，本发明的另一方面是一种监测疫苗有效性的方法，方法是在以其给药后来确定受试者中对疫苗本身有特异性的或对疫苗所在的大分子特异性的抗体的水平。
牵涉一些病理条件例如癌症的NY-ESO-1蛋白质的鉴定也提示了在前面所述的治疗方法之外的一些其它的治疗方法。前面所建立的实验表明抗体的产生是对应于蛋白质的表达的。因此本发明的进一步的实施方案是通过抗体，例如人源化抗体，抗体片段等的给药来对其特征是NY-ESO-1蛋白的异常水平的疾病的治疗。它们可以用适当的细胞静止或细胞毒性试剂进行标记。
也可以用T细胞进行给药。同样应注意到用免疫反应细胞例如树状细胞、淋巴细胞或任何其它免疫反应细胞在体外诱导T细胞，然后对所治疗的受试者进行再灌注。
应注意到T细胞和/或抗体的产生可以伴随对细胞给药，优选处理使其不增殖，其呈递反应的相关T细胞或B细胞的表位，例如前面所述的表位。
本治疗方法还可包括反义治疗，其中将反义分子，优选其长度为10到100个核苷酸长度，对受试者“净”或于载体中进行给药，这些载体例如脂质体，其作用是便于掺入细胞，然后抑制蛋白质的表达。这种反义序列也可以掺入到适当的疫苗中，例如病毒载体(例如痘苗)、细菌构建体、例如已知BCG疫苗的变体等等。
本发明的再一部分是肽，它们可以是具有下面核心序列：LLMWIT(SEQ ID No：7)的九聚物、十聚物或十一聚物，其在第一个L残基末端至少有一个额外的残基，优选丝氨酸，而且可以多至三个，其中丝氨酸连到L上形成-SL-，而且在C端有0-4个额外的氨基酸，如前面所示，它们结合到HLA-A2分子上，从而诱导CTL反应。这些肽可以用于治疗，其方法是将其对HLA-A2阳性的患者进行给药，该患者表达出与病状相关的NY-ESO-1；而且该肽也可用于诊断，即确定是否存在HLA-A2阳性细胞或相关的CTLs，等等。
HLA-A2分子是I型MHC分子，对肽和I型分子的复合物发生应答的细胞一般是CD8+细胞。另外一个T细胞亚群即CD4+细胞，其应答的是II型MHC分子和肽的复合物；对黑素瘤患者中检测到自身培养树状细胞所呈递的重组NY-ESO-1发生应答的是II型MHC限制的CD4+T细胞。具体而言，在此处未描述的结果中，可用已知的方法将CD4+细胞与其它自PBLs或血清样品的CD4+细胞分离开来。然后，将其与已和NY-ESO-1蛋白脉冲过的树状细胞混合。观察到CD4+细胞的增殖，并形成了此处所述的整套免疫反应的另一个方面。因此，本发明的另一方面是这些CD4T细胞，结合到II型MHC分子上的肽，以及它们在治疗中的应用。
本领域技术人员对本发明的其它特征和应用了然于胸而无需在此赘述。
所用的术语和表达都仅表示是描述性的，而非是限制性的，但这些术语和表达的运用其用意并不在于排除任何具有所述特征或其部分的等同用法，而且应当认识到在本发明范围之内可以有各种变动。
(1)基本信息
   (i)申请人：Yao-Tseng Chen；Scanlan，Matthew；Gure，Ali；Old，Lloyd；
      Knuth，Alexander；Jager，Elke；Drijfhout，Jan W.
   (ii)发明题目：编码食管癌相关抗原的分离的核酸分子，抗原本身以及
       它们的应用
   (iii)序列数：7
   (iv)通信地址：
       (A)收信人：Felfe & Lynch
       (B)街：第三大道805
       (C)城市：纽约市
       (D)州：纽约
       (E)美国
       (F)ZIP：10022
   (V)计算机可读形式：
      (A)介质类型：软盘、3.5英寸、144kb存储
      (B)计算机：IBM
      (C)操作系统：PC-DOS
      (D)软件：Wordperfect
   (vi)当前申请数据：
      (A)申请号：
      (B)申请日：
   (vii)在先申请数据
        (A)申请号：US 08/752,182
        (B)申请日：1996年10月3日
        (C)分类：935
   (viii)律师/代理人信息
         (A)姓名：Hanson，Norman D.
         (B)登记号：30,946
         (C)参考/案卷号：LUD 5466.1-PCT
   (ix)电讯信息：
       (A)电话：(212)688-9200
      (B)传真：(212)838-3884
(2)SEQ ID No：1的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：752碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID No：1
ATCCTCGTGG GCCCTGACCT TCTCTCTGAG AGCCGGGCAG AGGCTCCGGA GCC      53
ATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC ACA GGG GGT TCG ACG GGC GAT GCT     98
Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala
                  5                  10                  15
GAT GGC CCA GGA GGC CCT GGC ATT CCT GAT GGC CCA GGG GGC AAT    143
Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn
                  20                 25                  30
GCT GGC GGC CCA GGA GAG GCG GGT GCC ACG GGC GGC AGA GGT CCC    188
Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Aly Pro
                  35                 40                  45
CGG GGC GCA GGG GCA GCA AGG GCC TCG GGG CCG GGA GGA GGC GCC    233
Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala
                  50                 55                  60
CCG CGG GGT CCG CAT GGC GGC GCG GCT TCA GGG CTG AAT GGA TGC    278
Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys
                  65                 70                  75
TGC AGA TGC GGG GCC AGG GGG CCG GAG AGC CGC CTG CTT GAG TTC    323
Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe
                  80                 80                  90
TAC CTC GCC ATG CCT TTC GCG ACA CCC ATG GAA GCA GAG CTG GCC    368
Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala
                  95                100                 105
CGC AGG AGC CTG GCC CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG CCA GGG    413
Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly
                  110                115                120
GTG CTT CTG AAG GAG TTC ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT ATC    458
Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile
                  125               130                 135
CGA CTG ACT GCT GCA GAC CAC CGC CAA CTG CAG CTC TCC ATC AGC    503
Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser
                  140               145                 150
TCC TGT CTC CAG CAG CTT TCC CTG TTG ATG TGG ATC ACG CAG TGC    548
Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
              155                   160                 165
TTT CTG CCC GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC TCA GGG CAG AGG CGC    593
Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg
                  170               175                 180
TAA GCCCAGCCTG GCGCCCCTTC CTAGGTCATG CCTCCTCCCC TAGGGAATGG        646
TCCCAGCACG AGTGGCCAGT TCATTGTGGG GGCCTGATTG TTTGTCGCTG GAGGAGGACG 706
GCTTACATGT TTGTTTCTGT AGAAAATAAA ACTGAGCTAC GAAAAA                752
(2)SEQ ID No：2的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：31碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑学：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID No：2
CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G                                31
(2)SEQ ID No：3的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：32碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑学：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID No：3
       CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG                           32
(2)SEQ ID No：4的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：11个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑学：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID No：4
       Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu
                        5                   10
(2)SEQ ID No：5的信息：
   (i)序列特征：
    (A)长度：9个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑学：线性
(xi)序列描述：SEQ ID No：5
    Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
                     5
(2)SEQ ID No：6的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：9个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑学：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID No：6
       Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr
                        5
(2)SEQ ID No：7的信息：
   (i)序列特征：
      (A)长度：6个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑学：线性
   (xi)序列描述：SEQ ID No：7
       Leu Leu Met Trp Ile Thr
                        5

Claims (43)

1.编码癌相关抗原的分离的核酸分子，该分离的核酸分子具有这样的核苷酸序列，即在严紧条件下与该核酸分子杂交的其互补序列由SEQ ID NO：1的核苷酸54-593的核苷酸序列组成。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其由SEQ ID NO：1的核苷酸54-593组成。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其由SEQ ID NO：1的核苷酸1到核苷酸747之间任何一段组成，前提是所述的分离的核酸分子至少含有SEQ ID NO：1的核苷酸54-593。
4.表达载体，含有权利要求1的分离的核酸分子，其与启动子可操作地相连。
5.表达载体，含有权利要求3的分离的核酸分子，其与启动子可操作地相连。
6.用权利要求4的表达载体转化或转染的、分离且纯化的真核细胞系或原核细胞株。
7.用权利要求5的表达载体转化或转染的、分离且纯化的真核细胞系或原核细胞株。
8.分离的癌相关抗原，含有SEQ ID NO：1的核苷酸54-593所编码的氨基酸序列的部分或全部。
9.用权利要求1的分离的核酸分子转化或转染的、分离且纯化的真核细胞系或原核细胞株。
10.权利要求9的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的细胞系还转染编码细胞因子的核酸分子。
11.权利要求10的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的细胞系进一步转染编码HLA分子的核酸分子。
12.权利要求10的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的细胞因子是白介素。
13.权利要求12的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的白介素是IL-2、IL-4和IL-12。
14.权利要求9的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的细胞系已变成非增殖性的。
15.权利要求9的分离且纯化的真核细胞系，其中所述的细胞系是成纤维细胞系。
16.表达载体，含有突变或减毒病毒和权利要求1的分离的核酸分子。
17.权利要求16的表达载体，其中的病毒是腺病毒。
18.权利要求4的表达载体，其进一步含有编码MHC或HLA的核酸分子。
19.权利要求4的表达载体，其进一步含有编码细胞因子的核酸分子。
20.权利要求4的表达载体，其中所述的细胞因子是白介素。
21.权利要求20的表达载体，其中所述的白介素是IL-2、IL-4或IL-12。
22.权利要求16的表达载体，其中所述的病毒是痘苗病毒。
23.用于转染细胞的表达系统，其包含(1)含有编码权利要求8的分离的癌相关抗原的核酸分子的第一个载体以及(2)选自下列的第二个载体：(a)含有编码呈递来自所述癌相关抗原的抗原的MHC或HLA分子的核酸分子的载体和(b)含有编码白细胞介素的核酸分子的载体。
24.分离的癌相关抗原，其含有由序列SEQ ID NO：1的核苷酸54-593所编码的氨基酸序列。
25.免疫原性组合物，含有权利要求24的分离的抗原和可药用佐剂。
26.权利要求25的免疫原性组合物，其中所述的佐剂是细胞因子、皂苷或GM-CSF。
27.免疫原性组合物，含有由权利要求24的分离的癌相关抗原中彼此相连的8-12个氨基酸形成的氨基酸序列组成的至少一种肽和可药用佐剂。
28.权利要求27的免疫原性组合物，其中的佐剂是皂苷、细胞因子或GM-CSF。
29.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述的组合物包含与特异性MHC分子复合在一起的多种肽。
30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述的MHC分子是HLA-A2。
31.由SEQ ID NO：1所编码氨基酸序列所衍生的分离的肽，其中所述的分离的肽结合到HLA分子上，该肽是九聚物、十聚物或十一聚物，而且它还含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列、1-3个额外的N末端氨基酸以及多至4个额外的C末端氨基酸。
32.权利要求31的分离的肽，其中所述的HLA分子是HLA-A2。
33.权利要求31的分离的肽，选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
34.免疫原性组合物，含有编码由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列所衍生的肽的至少一个表达载体和佐剂或载体。
35.权利要求34的免疫原性组合物，其中所述的至少一种载体编码多种肽。
36.用于治疗癌症患者的疫苗，包含权利要求11的分离的细胞系以及药用佐剂。
37.权利要求36的疫苗，其中所述分离的细胞系已变成非增殖性的。
38.权利要求37的疫苗，其中所述分离的细胞系是人细胞系。
39.用于治疗癌症的组合物，包含表面上表达由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列衍生的肽的分离的非增殖性细胞系。
40.权利要求39的组合物，其中所述分离的细胞系是人细胞系。
41.用于治疗癌症的组合物，包含(i)由SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列衍生的肽，(ii)MHC或HLA分子，以及(iii)可药用的载体。
42.特异于权利要求24的抗原的分离的抗体。
43.权利要求42的分离的抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。
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