CN1175977A - 编码与mhc分子hla－cw*1601形成复合物的肽的分离的核酸分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本文公开了肿瘤排斥抗原前体的一个家族和编码它们的核酸分子。这些肿瘤排斥抗原前体称为BAGE肿瘤排斥抗原前体,编码它们的核酸分子称为BAGE编码分子。本文还描述了这些编码序列和肿瘤排斥抗原前体分子的各种诊断和治疗用途。

Description

编码与MHC分子HLA-Cw*1601形成复合物的肽的 分离的核酸分子及其应用
相关申请的交叉参考
本申请是1994年2月15日申请的共同未决申请08/196.630的部分继续申请，而后者又是1993年6月17日申请的08/079,110的部分继续申请。发明领域
本发明涉及在病理学症状的诊断和治疗中有用的核酸分子，蛋白质和肽。本发明还涉及被加工成由MHC分子HLA-Cw*1601提呈的肽的所说的蛋白质和肽类以及所说的提呈的肽本身。这些肽在诊断和治疗中有用。背景和现有技术
哺乳动物免疫系统识别和与外来或外源物质发生反应的过程是一个复杂的过程。该系统的一个重要方面是T细胞反应。该反应需要T细胞识别细胞表面分子称为人白细胞抗原(″HLA″)或主要组织相容性复合物(″MHC″)和肽的复合物并与其相互作用。所述肽类来自较大的分子，该分子由也提呈HLA/MHC分子的细胞加工。见Male等，现代免疫学(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽的相互作用是受限制的，需要对HLA分子和肽的特定组合具有特异性的T细胞。如果不存在特异性T细胞，即使其配体复合物存在，也无T细胞反应。同样，如果缺乏该特异性复合物，但存在T细胞，也无反应。该机制参与对外来物质的免疫系统反应，参与自身免疫病理学且参与对细胞异常的反应。许多工作集中在将蛋白质加工成HLA结合肽的机制上。见Barinaga，科学，257,880(1992)；Fremont，等，科学257：919(1992)；Matsumura等，科学，257：927(1992)；和Latron等，科学：257：964(1992)。
T细胞识别细胞异常的机制也与癌症有关。例如，在1992年5月22日申请，1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(引用以此参考)中，公开了一个基因家族，它被加工成肽类，随后，在细胞表面表达，并能导致肿瘤细胞被特异性CTL溶解。据说该基因编码″肿瘤排斥抗原前体″或″TRAP″的分子，由此产生的肽类称为“肿瘤排斥抗原”或″TRA″。见Traversari等，免疫遗传学，35：145(1992)；van der Bruggen等，科学，254：1643(1991)中关于该基因家族的进一步的信息，也见美国专利5342774。
在美国专利申请938,334(引用其说明书以供参考)中，教导了由HLA-A1分子提呈的九肽。该文献教导了只要已知特定的肽对特定HLA分子的特异性，就可预期特定的肽结合一种HLA分子，而不是其它分子。这是重要的，因为不同个体具有不同HLA表型。结果，尽管鉴定特定的肽作为特异性HLA分子的配体具有诊断和治疗效果，但仅仅与具有该具体HLA表型的个体有关。在该领域中需要进一步的工作，因为细胞异常并不局限于一个特定的HLA表型，靶向治疗需要对病灶异常细胞的表型有一些了解。
在1993年1月22日申请的并作为参考文献引入本文的美国专利申请008,446中，公开了MAGE-1表达产物被加工成第二种TRA。该第二种TRA由HLA-Cw*1601分子提呈。该说明书指出给定的TRAP可产生许多TRA。
在1992年12月22日申请的并作为参考文献引入本文的美国专利申请994,928中，酪氨酸酶被描述为肿瘤排斥抗原前体。该文献公开了由一些正常细胞(例如，黑色素细胞)产生的分子在肿瘤细胞中加工以产生由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。
在1993年3月18目申请的并作为参考文献引入本文的美国专利申请08/032,978中，教导了不从酪氨酸酶产生的第二种TRA由HLA-A2分子提呈。该TRA来自TRAP，但由非MAGE基因编码。其说明书指出，一个特定的HLA分子可能提呈来自不同来源的TRA。
在1993年6月17日申请的美国专利申请08/079110(本文引用以供参考)中，公开了称为BAGE家族的一个新基因家庭。观察到这些基因也编码肿瘤排斥抗原前体。在该申请中公开了称为HLA-Cw*1601的MHA分子提呈来自BAGE肿瘤排斥抗原前体的肿瘤排斥抗原；然而，未公开肿瘤排斥抗原。肿瘤排斥抗原在1994年2月15日申请的美国专利申请08/196,630(本文引用以供参考)中公开。该申请还公开了来自肿瘤排斥抗原的衍生物以及利用该抗原的治疗和诊断方法。
本申请涉及编码在专利申请08/196,630中描述的BAGE肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸分子。本申请还涉及利用该分离的BAGE核酸分子的治疗和诊断方法。
在下面的说明中进一步详尽描述本发明。附图简要描述
通过参考以下本发明目前优选的(但是举例说明性的)实施方案的详细描述并结合附图将更易于了解上面的简要描述以及本发明的其它目的和特征，其中在附图中：
图1由图1A和图1B组成。图1A显示了CTL克隆82/82对MZ2-MEL亚系MZ2-MEL.3.0，MZ2-MEL.3.1和MZ2-MEL.B.TC.4的溶解活性。图1B显示了CTL克隆82/82对MZ2-MEL亚系MZ-MEL.43和对来自HLA-Cw*1601阳性病人的黑素瘤细胞系MI4024/1-MEL和LB17-MEL的溶解活性。
图2显示了当与用HLA-Cw*1601单独转染，用HLA-Cw*1601与cDNA-AD5组合转染或用AD5单独转染的COS-7细胞接触时，CTL82/82的TNF释放。作为对照，CTL82/82也与MZ2-MEL.43和MZ2-MEL.2.2.5接触。
图3由图3A和图3B组成。图3A显示了由用携带HLA-Cw*1601和cDNA-AD5的表达载体共转染的P1.HTR小鼠细胞的CTL克隆82/82以及未转染的P1.HTR和单独用HLA-Cw*1601转染的P1.HTR产生的溶解。图3B显示了由用HLA-Cw*1601和来自BAGE的九肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)转染的P1.HTR的CTL克隆82/82引起的溶解。
图4列出了BAGE肿瘤排斥抗原前体的核苷酸和氨基酸序列。方框内的区段是来自前体的肿瘤排斥抗原；
图5代表从黑素瘤细胞系MZ2-MEL.3.0，来自病人MZ2的血液淋巴细胞和小鼠细胞系P1.HTR提取的DNA的Southern印迹；
图6代表在MZ2-MEL.43细胞中BAGE表达的Norther印迹分析；
图7代表来自黑素瘤细胞系，肿瘤和正常样品的cDNA以及来自亚系MZ2-MEL.43的基因组DNA的PCR扩增；
图8代表与BAGE编码的肽AARAVFLAL(SEQ ID NO：3)或与九肽ARAVFLALF(SEQID No：4)或MAARAVFLA(SEQ ID No：5)一起培养的淋巴母细胞细胞系MZ2-EBV的CTL82/82溶解。发明的详细描述实施例1
使用标准方法从病人MZ2获得黑素瘤细胞系MZ2-MEL。该细胞系在1992年5月22日申请的，1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(本文引用以供参考)中描述。一旦建立该细胞系，便辐射其样品以便使其变为非增殖性。从MZ2-MEL获得许多亚克隆。具体地说，经限制性稀释从MZ2-MEL获得克隆细胞系MZ2-MEL.3.0。然后进一步培养MZ2-MEL.3.0培养物，经过超过150代培养后，获得命名为MZ2-MEL.3.1的新亚细胞系，发现MZ2-MEL.3.1对大部分对MZ2-MEL.3.0具有强溶解活性的自源性CLT克隆有抗性。测定MZ2-MEL.3.1丢失了编码HLA-A29，B44和Cw*1601的基因(见Van der Bruggen等，Eur.J.Immun01，24：2134-2140(1994)。本文引用以供参考)。
经有限稀释从诱变处理中存活的MZ2-MEL.3.0细胞产生亚细胞系MZ2-MEL.43(Van den Eynde等，Int.J.Caner，44：634-640(1989))。不表达抗原MZ2-E的克隆亚系MZ2-MEL.2.2从具有自源性抗-MZ2-E CTL克隆的亚克隆MZ2-MEL.3.1中选择(Van den Eynde等，出处同上)。亚细胞系MZ2-MEL.2.2.5选自具有抗MZ2-F CTL克隆的亚细胞系MZ2-MEL.2.2。经过将HLA-Cw*1601基因转染进亚系MZ2-MEL.2.2.5获得MZ2-MEL.B.TC.4(Van der Bruggen等，出处同上)。黑素瘤细胞系按以前Vanden Eynden，出处同上和Traversari等，免疫遗传学，35：145-152(1992)所述进行生长。
使用照射的MZ2-MEL细胞获得对细胞系MZ2-MEL具有特异性的胞溶性T细胞克隆(″CTL″)。具体地说，从病人MZ2取外周血单核细胞(″PBMC″)的样品且与照射的黑素瘤细胞接触。观察混合物中的黑素瘤细胞的溶解，该溶胞表明由黑素瘤细胞提呈的对肽和HLA分子的复合物具特异性的CTL存在于样品中。
使用的溶解试验根据Herin等，Int.J.Cancer，39：390-396(1987)(本文引用以供参考)的铬释放试验进行。然而，该试验在本文中描述。靶黑素瘤细胞体外生长，然后以4×107细胞/ml重悬于加有含10mM HEPES和50％FCS之DMEM的DMEM中并在37℃与200μCi/ml的Na(51Cr)O4培养60分钟。用加有10mM HEPES的DMEM洗涤标记的细胞3次。然后重悬于加有10mM HEPES和10％FCS的DMEM中，然后将含103细胞的100μl等分试样分配到96孔微量板上。PBL样品加入到100μl相同的培养基中，试验以一式二份进行，平板以100g离心4分钟并在8％CO2空气中37℃培养4小时。
平板再次离心，收集100μl的上清等分试样并计数。51Cr释放的百分率按下式计算：
其中ER是观察的实验51Cr的释放，SR是经过在200μl单独的培养基中培养103个标记的细胞测量的自发释放，MR是最大释放，经过向靶细胞中加入100μl0.3％Triton X-100获得。
经过限制性稀释扩增并克隆显示出高CTL活性的那些单核血样品并使用相同的方法再筛选。由此分离CTL克隆MZ2-CTL 82/82。该克隆下文称为″82/82″。
将MZ2-MEL亚细胞系和其它黑素瘤细胞系与CTL克隆82/82接触并经过测量铬释放测量溶解活性。4小时后测量铬释放。图1A显示了MZ2-MEL.3.0和MZ2-MEL.B.TC.4的溶解。亚细胞系MZ2-MEL.3.1不被CTL82/82溶解。另外，携带HLA-Cw*1601等位基因的黑素瘤细胞系MI4024/1-MEL和LB17-MEL被CTL82/82溶解。实施例2
鉴定了编码被CTL82/82识别的抗原的基因。如本文所述，该基因经过共转染HLA-Cw*1601 cDNA与一个cDNA文库鉴定。由于CTL82/82对MZ2-MEL.43的特异性，该细胞系的cDNA用于构建cDNA文库。为了从MZ2-MEL.43构建cDNA文库，使用mRNA提取试剂盒从MZ2-MEL.43细胞提取poly-A+RNA。使用随机引物将mRNA转变成cDNA，按标准技术连接到衔接头上并插入含有SV40复制起点的表达载体pcD-SRα的EcoRI位点上。重组质粒电穿孔进入大肠杆菌JM101并用氨苄青霉素选择(50μg/ml)。该文库含有66,000个插入序列并分成400个细菌的87组(pool)和200个细菌的297组。每组大约分别包含280或240个不同的cDNA，大约70％的质粒携带插入片段。各细菌组扩增至饱和且用熟知的碱裂解方法提取质粒DNA。
用HLA-Cw*1601 cDNA转染质粒pcD-SRα。然后将cDNA组与含HLA-Cw*1601cDNA的pcD-SRα质粒共转染进一式2份的COS-7细胞微生物培养物中。用DEAE-葡聚糖-氯喹方法进行转染(Seed等，美国科学院学报，84：3365-3369(1987)；Brichard等，Annal.Biochem.162：156-159(1993)；Coulie等，J.Exp.Med.，180：35-42(1994))。简单地说，用100ng含HLA-Cw*1601 cDNA的质粒pcD-SRα和100ng的cDNA文库组或100ng的cDNA克隆转染1.5×104COS-7细胞。从用亚细胞系MZ2-MEL.43提取的RNA制备的cDNA文库中分离HLA-Cw*1601 cDNA(Van der Brugen等，出处同上)。
24或48小时后试验共转染子经CTL刺激肿瘤坏死因子(TNF)生产的能力(Traversari等，免疫遗传学，235：145-152(1992))。将存在于100μl含10％人血清和20U/ml r-hu-IL-2的Iscove培养基(Gibco BRL)中的1500个CTL加入到含靶细胞的微滴孔中。24小时后，收集上清液，经过试验其对WEHI-164克隆13细胞的胞毒效应测定其TNF含量(Espevik等，J.Immunol，Methods，95：99-105(1996))，试验在MTT比色分析中进行(Hansen等，J.cancer，39：390-396(1989)和Traversari等，出处同上)。
在转染的384组cDNA中(200个细菌的297组，400个细菌的87组)，2个产生含大于40pg/ml TNF的阳性上清，而在所有用其它组转染的微生物培养物中TNF浓度低于5pg/ml。从含400个独立的细菌的cDNA组中的一个亚克隆了800个细菌。从其每一个中提取质粒DNA并与上面描述的HLA-Cw*1601构建体一起转染进COS-7细胞。12个克隆能被CTL82/82识别。用命名为cDNA-AD5的其中的一个获得的结果在图2中表示。
图2显示了用cDNA-AD5和HLA-Cw*1601 cDNA共转染的或用这些cDNA之一转染的COS-7细胞刺激CTL82/82的结果。按上面所述将cDNA插入表达载体pcD-SRα中。转染1天后加入CTL82/82样品，一天后经过试验其对WEHI-164克隆13细胞的毒性评价上清中的TNF浓度。用MZ2-MEL.43和MZ2-MEL.2.2.5细胞建立阳性和阴性对照。
为了证实在瞬时转染中用cDNA-AD5获得的结果，也制备了稳定的转染子。使用磷酸钙沉淀法用HLA-Cw*1601和cDNA-AD5两者转染P1.HTR，一种来自小鼠肿瘤细胞系p815的高度可转染的变异体(Van Pel等，Som Cell Genet，11：467-475(1985))，用质粒pSVtkneoβ提供庆大霉素抗性(Nicolas等，CSH Conferences CellProlif，10：469-485(1983))，转染用单独的HLA-Cw*1601或HLA-Cw*1601和cDNA-AD5两者来进行。按上面所述将有关cDNA插入表达载体pcD-SRα中。从具有庆大霉素抗性的转染的群体分离克隆亚细胞系。当与CTL82/82接触时，转染的细胞经CTL82/82溶解，表明该抗原也能在这些小鼠细胞中加工。图3A显示了用携带HLA-Cw*1601和cDNA-AD5的表达载体共转染的P1.HTR小鼠细胞被CTL克隆82/82溶解。还试验了未转染的P1.HTR和单独的HLA-Cw*1601转染的P1.HTR。实施例3
经过用合成的寡核苷酸特异性引物进行cDNA-AD5的DNA序列分析。SEQ ID No：1代表本文称为″BAGE″的鉴定的基因的cDNA核苷酸信息。用双脱氧-链终止法(T7测序试剂盒，Pharmacia Uppsala Sweden，ΔTAqTM Cycle-测序试剂盒，USB，Cleveland，Ohio)进行测序反应。用程序FASTA@EMBL-Heidelberg和blast@ncbi.nlm.nih.gov..进行了针对序列同源性的计算机检索。该序列与目前在数据库中记录的任何其它序列(除了位于编码区外的Alu重复(核苷酸385至484)外)无明显的相似性。实施例4
测定了编码HLA-Cw*1601提呈的抗原的BAGE区域。为了鉴定该区域，生产了许多截短的BAGE cDNA克隆。经过在各种保温时间内用核酸外切酶III消化BAGE，产生从3′开始的逐渐缺失。将截短的变异体再连接进pcDNA I/Amp，电穿孔进入大肠杆菌菌株DH5αF′IQ，经氨苄青霉素选择(50μg/ml)。以这种方式获得438个克隆。
从这些438个克隆获得质粒DNA并与HLA-Cw*1601一起转染进COS-7细胞以试验其编码该抗原的能力。在TNF释放试验中试验转染子，如上面所述。阳性克隆是那些被CTL82/82刺激TNF释放的克隆。
一旦细胞被分成阳性和阴性转染子，测定5个阳性和5个阴性转染子的质粒DNA的序列。克隆19C2(一个阳性克隆)含有上面所述BAGE基因的部分开放阅读框，即从核苷酸201到核苷酸267。与此相反，克隆17G12(一个阴性转染子)，含有核苷酸201-206。这表明抗原性肽由开放阅读框的前67个核苷酸编码。
图4显示了BAGE的序列，也显示了由最大的开放读框编码的43个氨基酸的推定的蛋白质。该蛋白质被鉴定为含有所提呈的肽的序列。43个氨基酸的蛋白质，本文称为SEQ ID No：2，序列如下：
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser
Ala Gln Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu
Glu Ser Pro Val Val Ser Trp Arg Leu Glu Pro
Glu Asp Gly Thr Ala Leu Cys Phe Ile Phe相应于与HLA-Cw*1601相联系的由MZ2-CTL 82/82识别的肽的序列在方框中表示。该序列本文称为SEQ ID No：3：Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu。用于PCR扩增的引物VDB85(SEQ ID No：6)(有义链)和VDB86(SEQ ID No：7)(反义链)的序列正如在实施例4中所讨论的用带箭头的下划线表示。
以此为基础制备了一些合成的肽。使用Atherton等，J.Chem.Soc.Lond.Perkin Trans.，1：538-546(1981)所述的F-moc进行瞬时NH2-末端保护在固相上合成肽并经质谱仪鉴定。经分析性HPLC显示所有肽具有＞90％的纯度。冻干的肽以20mg/ml溶于DMSO，在10mM乙酸中稀释成2mg/ml并贮存于80℃。在CTL刺激试验中用HLA-Cw*1601转染COS-7细胞并与肽一起培养来试验该肽。也用铬释放试验来试验它们，如前所述(Boon等，J.Exp.Med.，152：1184-1193(1980))。在该肽的致敏试验中，靶细胞在37℃进行51Cr标记1小时并充分洗涤。然后在加入CTL 82/82细胞前在各种浓度的肽存在的条件下在96孔微滴板上37℃培养1000个靶细胞30分钟。4小时后在37℃下测量铬释放。
图8显示了与BAGE编码的肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)培养的淋巴母细胞系MZ-EBV被CTL82/82溶解，显示了在用CTL培养靶细胞的过程中肽的最终浓度。箭头表示MZ2-MEL.43细胞溶解的百分数。用九肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)(氨基酸2-10，图4)观察了致敏病人MZ2淋巴母细胞系被CTL 82/82的溶解。以30nM浓度的肽获得了1/2最大溶胞(图8)。不包括N-末端Ala的九肽ARAVFLALF(SEQ ID No：4)或不包括C-末端Leu的九肽MAARAVFLA(SEQ ID No：5)不能致敏靶细胞以使其溶解。用HLA-Cw*1601转染P1.HTR细胞并与九肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)一起培养。用CTL 82/82溶解转染的细胞。图3B显示了用HLA-Cw*1601转染的P1.HTR用1μMBAGE编码的九肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)培养后被CTL克隆82/82溶解。4小时后试验铬标记的细胞的溶解。
从用病人MZ2的不同血样品建立的2个MLTC，产生识别BAGE/HLA-Cw*1601抗原的6个CTL克隆。在用HLA-Cw*1601和BAGE cDNA-AD5共转染的COS-7细胞存在下，它们产生TNF。它们也与用HLA-Cw*1601转染的并与九肽AARAVFLAL(SEQ ID No：3)培养的细胞发生反应。似乎至少3个不同的CTL前体可识别该BAGE抗原。CTL克隆82/1表达Vα2，Vα3和Vβ13，而CTL克隆25/244表达Vα8和Vβ8，CTL克隆82/82表达Vα3，Vα4和Vβ13。按下面所述测定Vα和Vβ的表达：经过使用RNAzol*B(Cinna/Biotex，Friendswood，TX)从不同的CTL克隆制备总RNA。用oligo(dT)和莫洛尼氏白血病毒产生的无RNA酶H活性的逆转录酶进行单链cDNA合成。经过用Genevee等，Eur.J.Immunol.，22：1261-1269(1992)所述的与TCR可变区(Vα1-W29，Vβ1-W24)和恒定区(Cα，Cβ)序列互补的寡核苷酸引物经TCR-α和-βcDNA的扩增进行PCR。经Southern印迹和用32P-标记的Cα或Cβ寡核苷酸内部序列与扩增所用的序列杂交评价TCR Vα和VβPCR扩增的特异性。实施例5
经过逆转录和嵌套式PCR试验BAGE在组织中的表达(Van der Bruggen等，出处同上)。经PCR从黑素瘤细胞系，肿瘤和正常组织样品扩增cDNA，从亚细胞系MZ2-MEL.43扩增基因组DNA。用Davis等，分子生物学中的基本方法，PP.130-135(New York，Elsevier，1986)所述的异硫氰酸胍方法提取总RNA。在含4μl5X逆转录酶缓冲液，2μl 20mM Oligo(dT)15引物溶液，20U RNA酶蛋白抑制剂，2μl的0.1M二硫苏糖醇和200U MoMLV逆转录酶加1μl各10mM dNTP的溶液的20μl反应体积中对2μg总RNA进行逆转录。反应物在42℃培养60分钟。然后向1/20的cDNA产物中加入5μl10X热稳定性DNA聚合酶缓冲液，1μl dNTP各10mM的溶液，1μl引物各25μM的溶液，1U的DynaZymeTM并加水至终体积为50μl。PCR引物是5′-TGGCTCGTCTCACTCTGG-3′(SEQ ID NO：6)(VDB85，有义链，核苷酸100至117)和5′-CCTCCTATTGCTCCTGTTG-3′(SEQ ID NO：7)(VDB86，反义链，核苷酸367至385)。PCR进行30个循环(94℃1分钟，62℃2分钟，73℃2分钟)。10μl PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上进行大小分离。经过用引物5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′(SEQ ID No：8)(外显子4，有义链)和5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′(SEQ ID No：9)(外显子6，反义链)以AmpliTaq DNA聚合酶对入β-肌动蛋白cDNA进行PCR扩增21个循环(94℃1分钟，68℃2分钟，72℃2分钟)试验RNA制剂的质量。
在用溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶上观察PCR产物。除了在精巢外在正常成人组织中没有发现基因BAGE表达(见下面图7和表1)。该基因在胎盘和脐带以及在大于20周的胎儿各种组织样品中也是静止的。在所试验的12个EBV转化的淋巴母细胞系中没有发现BAGE表达，在用植物凝集素刺激的血淋巴细胞中也没有发现。
              表1
基因BAGE在正常成人和胎儿组织中的表达成人组织                        表达肾上腺                           -骨髓                             -大脑                             -乳房                             -小脑                             -结肠                             -心脏                             -肾                               -肝脏                             -肺                               -黑素细胞                         -肌肉                             -卵巢                             -前列腺                           -皮肤                             -精子                             -脾细胞                           -胃                               -精巢                             +胸腺细胞                         -膀胱                             -子宫                             -胎盘                             -脐带                             -良性痣                           -胎儿组织                         -成纤维细胞                       -大肠                             -肝脏                             -脾                               -胸腺                             -精巢                             -
BAGE似乎在包括黑素细胞的正常成人组织(除精巢外)中是静止的。由于经逆转录和PCR试验了其表达，在正常组织中缺乏可检测的产物表明表达水平低于在肿瘤MZ2-MEL中观察到的0.1％。实施例6
也测定了BAGE基因在肿瘤样品和细胞系中的表达。分析了600个各种组织来源的肿瘤样品中BAGE的表达。如下面表2所示，BAGE基因主要在黑素瘤(22％)，膀胱癌(15％)，乳腺癌(10％)和头颈扁平细胞癌(8％)中表达。在肉瘤(6％)和非小细胞肺癌(6％)中发现更小部分的阳性样品。在直肠，结肠和前列腺癌，白血病或淋巴瘤中发现无BAGE表达。除了极少数例外情况外，表达BAGE的肿瘤样品一般也表达上面所讨论的MAGE基因之一。
                      表2
          基因BAGE在肿瘤样品中的表达
组织类型                   BAGE阳性肿瘤数*
黑素瘤                     40/178
    原始病灶                   3/38
    转移病灶                   37/140
膀胱癌                     9/62
    表面肿瘤                   0/32
    浸润肿瘤                   9/30
乳腺癌                     8/79
头颈扁平细胞癌             4/53
肺癌NSCLC°                                   4/64
肌肉瘤                     1/18
肾肉瘤                     0/50
结肠癌                     0/42
前列腺癌                   0/22
白血病和淋巴瘤             0/22
*用图4中所示的引物经RT-PCR扩增总RNA试验基因BAGE的表达。
°NSCLC＝非小细胞肺癌。
BAGE在黑素瘤的转移病灶中(26％)比在原始病灶中(8％)更频繁地表达。在膀胱移行细胞癌中，30％的侵润性肿瘤表达BAGE，而在表面肿瘤中观察不到表达。BAGE在肿瘤细胞系比在肿瘤样品中以更高的比例表达：32/60黑素瘤(53％)和3/15结肠癌细胞系(20％)为阳性。用MAGE基因也观察到该结果，可能是由于肿瘤细胞系更易于从转移肿瘤中产生。实施例7
HLA-Cw*1601(BAGE抗原提呈的分子)不能在血清学试验中鉴定，因为不能得到有用的抗体。然而，经过逆转录和嵌套式PCR可试验其表达。发现大约7％(7/99)的白种人表达该HLA等位基因(van der Brugg en等，出处同上)。据报道细胞表面HLA-C分子的浓度大约比HLA-A和B低10倍，很可能是由于与β2-微球蛋白结合的效率较低(Neefjes等，Eur.J.Immnol.，18：801-810(1988))。然而已测定了编码识别HLA-C分子的肽的BAGE，表明HLA-C分子在提呈抗CTL的抗原中也起显著的作用。实施例8
用从病人MZ2血淋巴细胞和从黑素瘤细胞系MZ2-MEL.3.0提取的DNA制备Southern印迹。为了进行Southern印迹分析，用EcoRI或Hind III消化来自黑素瘤细胞系MZ2-MEL.3.0，病人MZ2的PBL和小鼠细胞系P1.HTR的DNA。经过在Zeta-ProbeR膜上(Bio-Rad)的碱印迹进行DNA毛细转移。转移后，膜在2x SSC中冲洗，在80℃烘烤1小时并在6×SSC，10×Denhardt氏溶液中60℃预处理30分钟。然后膜在3.5×SSC，1×Denhardt氏溶液，25mM NaH2PO4pH7.0，0.5％SDS，2mM EDTA，100μg/ml鲱精DNA和PCR产生的2×106cpm/ml 121bp32P标记的探针(SEQ IDNO：1的核苷酸211至331)中65℃杂交18小时。然后在2×SSC，0.5％SDS中65℃洗涤膜15分钟，再在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤15分钟，放射自显影10天。
当该印迹与上面所述的121bp的探针杂交时，在含有EcoRI消化的DNA的泳道中观察到4条带和Hind III消化后的6条带(图5)。考虑到探针的长度短且考虑到在编码序列中缺乏EcoRI和Hind III限制性位点，这些结果表明BAGE属于几个相关基因的一个家族。实施例9
用亚细胞系MZ2-MEL.43的poly-A+RNA制备的North ern印迹与包括SEQ ID No：1的核苷酸100至385的286bp BAGE探针杂交。为了进行Northern印迹分析，使用mRNA提取试剂盒从MZ2-MEL.43制备poly-A+RNA。以Davis等(出处同上)所述的异硫氰酸胍方法从小鼠肾组织提取总RNA。在寡聚-dT柱上从总RNA纯化poly-A+RNA。为进行Northern印迹分析，来自亚系MZ2-MEL.43的5μg poly-A+RNA和来自小鼠肾细胞的5μg poly-A+RNA在含0.66M甲醛的1％琼脂糖凝胶上分离并转移到10×SSC的膜上。
将膜在10％的硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl中60℃预杂交15分钟并在含有2×106cpm/ml 286bp32P-标记的探针的相同溶液中杂交过夜。在0.2×SSC中室温下洗涤膜10分钟，然后在加有0.1％SDS的0.2×SSC中60℃洗涤2×20分钟，放射自显影15小时。用小鼠β-肌动蛋白探针在相同膜上进行对照杂交。
图6显示了该实验的结果，各泳道含有5μg来自MZ2-MEL.43细胞的poly-A+RNA，用β-肌动蛋白探针在相同膜上进行对照杂交。观察到大约1和2.4kb的2条带。
至此，在人黑素瘤上已发现二类主要的被自源性CTL识别的抗原。第一类抗原由在肿瘤中非常特异性表达的基因编码。由基因MAGE-1编码的抗原是第一个例子(van der Bruggen等，科学，254：1643-1647(1991)，随后的其它抗原由基因MAGE-1和MAGE-3编码(Gaugler等，J.Exp.Med；179：921-930(1994)；Van derBruggen等，出处同上)。在小鼠肥大细胞瘤P815中观察到的肿瘤排斥抗原也来自在除精巢外的所有正常成人组织中静止的基因的激活(Van den eynde等，J.Exp.Med.，173：1373-1384(1991))。第二类抗原代表由仅在黑素细胞和黑素瘤中表达的基因编码的分化抗原。由酪氨酸酶编码的抗原是这类抗原的第一个例子(Brichard等，生物化学年鉴，162：156-159(1993)；Robbins等，肿瘤研究，54：3124-3126(1994)：Wolfel等，欧洲免疫学杂志，24：759-764(1994))，它也包含由Melan-A/MART-1编码的抗原(Coulie等，实验医学杂志180：35-42(1994)；Kawakami等，美国科学院学报，91：3515-3519(1994))和gp100/pmel 17(Bakker等，实验医学杂志，179：1005-1009(1994)：Cox等，科学，264-719(1994))。
上面的实施例显示了编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的分离。然而，这种“TRAP”编码分子不与上面提及的参考文献中所述的任何以前公开的MAGE编码序列同源。因此，本发明的一个方面是包含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的一种分离的核酸分子，该序列不是MAGE编码序列，这可经过将它与参考文献中所述的任何MAGE基因的序列进行比较看出。本发明还有一部分是也编码非MAGE肿瘤排斥抗原前体但在严格条件下与含所述核苷酸序列的核酸分子杂交的那些核酸序列。本文使用的术语“严格条件”指本领域熟悉的参数，更具体地说，本文使用的严格条件指在3.5×SSC，1×Denhardt氏溶液，25mM磷酸钙缓冲液(pH7.0)，0.5％SDS，和2mM EDTA下65℃杂交18小时，接着在2×SSC，0.5％SDS中洗涤滤膜2×15分钟4次，在0.2×SSC，0.1％SDS中65℃下洗1×15分钟。还有其它可使用并产生相同严格程度的条件，试剂等。本领域的技术人员对这些条件是熟悉的，因此在本文中不再提及。
从这些实施例还可看出本发明包括将这些序列用于表达载体，以及转化或转染宿主细胞和细胞系，包括原核细胞株(例如，大肠杆菌)和真核细胞(例如，CHO或COS细胞)。表达载体需要将序列有效连接到启动子上，表达载体也可包括编码HLA-Cw*1601的核酸序列。如果载体含有两个编码序列，它可用于转染正常情况下不表达其中一个的细胞，例如，当宿主细胞已表达HLA-Cw*1601时，可单独使用肿瘤排斥抗原前体编码序列。当然，对可使用的具体宿主细胞没有限制。如果需要，含有两个编码序列的载体可用于提呈HLA-Cw*1601的细胞，同样，肿瘤排斥抗原前体的基因可用于不表达HLA-Cw*1601的宿主细胞。
本发明还包括使得技术人员可以制备所需表达载体的表达试剂盒。该表达试剂盒包括至少部分以前讨论的各编码序列，可以按需要加入其它成份，只要包括所需的上面提及的序列。
为了区分本发明的核酸分子和TRAP与以前描述的MAGE家族，本发明应称为基因的BAGE家族和TRAP。“BAGE”指由以上描述的序列编码的肿瘤排斥抗原前体。“BAGE编码分子”和相似术语用于描述核酸分子本身。
本发明还涉及肽，例如SEQ ID No：3的肽，它可用于鉴定提呈MHC分子HLA-Cw*1601的那些细胞。例如，施用携带可检测信号的肽，接着鉴定已结合肽的细胞是实现该用途的一种方式。实现该用途的另一种方式是使用固相结合的肽，提呈HLA-Cw*1601的细胞结合于其上，从而从试验的样品中去掉它们。
另外，本发明使得技术人员可以诊断一种以表达TRAP为特征的疾病。这些方法包括测定TRAP基因的表达，和/或由其产生的TRA，如由HLA-Cw*1601提呈的TRA。在前一情况下，该测定可经过任何标准核酸测定试验进行，包括聚合酶链式反应或标记杂交探针试验。在后一种情况下，特别优选用TRA和HLA复合物的结合配体进行试验，如用抗体。用于测定的另一个方法是上面所述类型的TNF释放试验。
TRAP基因的分离也使分离TRAP分子本身，特别是含有SEQ ID No：1编码的氨基酸序列的TRAP分子成为可能。当以TRA或以TRA与HLA，如HLA-Cw*1601的复合物提呈时，这些分离的分子可与诸如佐剂的物质结合以产生在治疗特征为TRAP分子表达的疾病中有用的疫苗。另外，疫苗可从在其表面提呈TRA/HLA复合物的细胞制备，如非增殖性癌细胞和非增殖性转染子。可采取针对BAGE和MAGE两个抗原的免疫。在细胞用作疫苗的所有情况下，可以是用一个或两个提供CTL反应所必需的成份的编码序列转染的细胞或可以是未转染的表达两种分子的细胞。而且，TRAP分子，其相关的TRA以及TRA和HLA的复合物可用于使用本领域技术人员熟知的标准技术生产抗体。
本文使用的“疾病”指表达肿瘤排斥抗原前体的任何病理状态，该疾病的一个例子特别是黑素瘤。
以本说明书为基础的治疗研究的前提是受试者免疫系统的应答导致提呈TRA的细胞，如HLA-Cw*1601溶解。一个这类研究是给具有所述表型异常细胞的受试者施用对复合物具特异性的CTL。在技术人员技术范围内的是体外形成该CTL。具体地说，诸如血细胞的细胞样品与提呈复合物并能促进特异性CTL增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染子，如上面所述的COS细胞类型，这些转染子在其表面提呈所需复合物，且当与目的CTL结合时刺激其增殖。与其它合适的宿主细胞一样，本文使用的COS细胞是公众可获得的。
为了详述称为过继转移的治疗方法(Greenberg，免疫学杂志，136(5)：917(1986)Reddel等，科学，257：238(7-10-92)；Lynch等，欧洲免疫学杂志21：1403-1410(1991)；Kast等，细胞，59：603-614(11-17-89))，将提呈所需复合物的细胞与CTL结合导致对其特异性的CTL增殖。然后将增殖的CTL施用给具有特征为某些异常细胞提呈特定复合物的细胞异常的受试者。然后CTL溶解异常细胞，从而实现所述的治疗目的。
上述的疗法假定至少一些受试者的异常细胞提呈有关HLA/TRA复合物。这可非常容易地测定，因为本领域对于鉴定提呈特定HLA分子的细胞的方法以及如何鉴定表达有关序列的DNA(在本例子中是BAGE序列)的细胞非常熟悉。一旦经过上述筛选方法鉴定了提呈有关复合物的细胞，它们就可与来自病人的样品(其中该样品含有CTL)结合。如果提呈复合物的细胞被混合的CTL样品溶胞，那么可假定提呈了来自BAGE的肿瘤排斥抗原，受试者是上面提到的用于治疗研究的合适的候选者。
根据本发明过继转移不是可得到的治疗的唯一形式。使用许多方法也可体内刺激CTL。一种方法，即使用表达复合物的非增殖性细胞已在上面描述。用于本方法的细胞可以是那些正常表达该复合物的细胞，如照射的黑素瘤或用一种或两种对于提呈该复合物所必需的基因转染的细胞。Chen等，美国科学院学报，88：110-114(1991)例证了该方法，显示了表达HPVE7肽的转染细胞在治疗方案中的应用。可使用各种细胞类型。同样地，可使用携带一种或两种目的基因的载体，特别优选病毒或细菌载体。在这些系统中，目的基因被(例如)疫苗病毒或细菌BCG携带，且事实上这些物质“感染”宿主细胞。导致提呈目的复合物的细胞被自源性CTL识别，然后进行增殖。经过将肿瘤排斥抗原或其前体与一种佐剂结合以利于掺入提呈目的HLA分子的提呈HLA-Cw*1601的细胞可实现相似的效果。加工TRAP产生HLA分子的肽配体，而TRA不需进一步加工就能提呈。
尽管本文参考具体实施方案描述了本发明，但应理解这些实施例仅仅是本发明各方面的举例。因此，应明白在举例性实施方案中可进行各种修改，且可设计其它的方法而不偏离本发明的实质和范围。
               序列表(1)一般信息
(i)申请人：van der Bruggen等人
(ii)发明名称：编码与MHC分子HLA-Cw*1601形成复合物的肽的分离的核酸分子及其应用
(iii)序列数：9
(iv)联系地址：
  (A)联系人：Felfe & Lynch
  (B)街道：805 Third AVenue
  (C)城市：New York
  (D)州：New York
  (E)国家：USA
  (F)邮编：10022
(v)计算机可读形式
  (A)媒体类型：3.5英寸1.44Mb存储量软盘
  (B)计算机：IBM PS/2
  (C)操作系统：PC-DOS
  (D)软件：Wordperfect
(vi)本申请资料：
  (A)申请号：
  (B)申请日：
  (C)分类号：435
(vii)在先申请资料：
  (A)申请号：08/196,630
  (B)申请日：1994年2月15日
(vii)在先申请资料
  (A)申请号：08/079,110
  (B)申请日：1993年6月17日
(viii)律师/代理人信息：
  (A)姓名：Pasqualini，Patricia A
  (B)登记号：34,894
  (C)参考/文档号：LUD 5310.2
(ix)电信资料
  (A)电话：(212)688-9200
  (B)电传：(212)838-3884(2)SEQ ID No：1信息
(i)序列特征
  (A)长度：1004
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：1CGCCAATTTA GGGTCTCCGG TATCTCCCGC TGAGCTGCTC TGTTCCCGGC TTAGAGGACC      60AGGAGAAGGG GGAGCTGGAG GCTGGAGCCT GTAACACCGT GGCTCGTCTC ACTCTGGATG     120GTGGTGGCAA CAGAGATGGC AGCGCAGCTG GAGTGTTAGG AGGGCGGCCT GAGCGGTAGG     180AGTGGGGCTG GAGCAGTAAG ATG GCG GCC AGA GCG GTT TTT CTG GCA TTG TCT     233
                  Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser
                                   5                   10GCC CAG CTG CTC CAA GCC AGG CTG ATG AAG GAG GAG TCC CCT GTG GTG       281Ala Gln Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu Glu Ser Pro Val Val
         15                  20                  25AGC TGG AGG TTG GAG CCT GAA GAC GGC ACA GCT CTG TGC TTC ATC TTC       329Ser Trp Arg Leu Glu Pro Glu Asp Gly Thr Ala Leu Cys Phe Ile Phe
    30                   35                  40TGAGGTTGTG GCAGCCACGG TGATGGAGAC GGCAGCTCAA CAGGAGCAAT AGGAGGAGAT     389GGAGTTTCAC TGTGTCAGCC AGGATGGTCT CGATCTCCTG ACCTCGTGAT CCGCCCGCCT     449TGGCCTTCCA AAGTGCCGAG ATTACAGCGA TGTGCATTTT GTAAGCACTT TGGAGCCACT     509ATCAAATGCT GTGAAGAGAA ATGTACCCAG ATGTATCATT ATCCTTGTGC TGCAGGAGCC     569GGCTCCTTTC AGGATTTCAG TCACATCTTC CTGCTTTGTC CAGAACACAT TGACCAAGCT     629CCTGAAAGAT GTAAGTTTAC TACGCATAGA CTTTTAAACT TCAACCAATG TATTTACTGA     689AAATAACAAA TGTTGTAAAT TCCCTGAGTG TTATTCTACT TGTATTAAAA GGTAATAATA     749CATAATCATT AAAATCTGAG GGATCATTGC CAGAGATTGT TGGGGAGGGA AATGTTATCA     809ACGGTTTCAT TGAAATTAAA TCCAAAAAGT TATTTCCTCA GAAAAATCAA ATAAAGTTTG     869CATGTTTTTT ATTCTTAAAA CATTTTAAAA ACCACTGTAG AATGATGTAA ATAGGGACTG     929TGCAGTATTT CTGACATATA CTATAAAATT ATTAAAAAGT CAATCAGTAT TCAACATCTT     989TTACACTAAA AAGCC                                                     1004(3)SEQ ID No：2信息
(i)序列特征
  (A)长度：43
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：2Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Leu Gln
             5                   10                  15Ala Arg Leu Met Lys Glu Glu Ser Pro Val Val Ser Trp Arg Leu Glu
         20                  25                  30Pro Glu Asp Gly Thr Ala Leu Cys Phe Ile Phe
     35                  40(4)SEQ ID No：3信息
(i)序列特征
  (A)长度：9
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：3
Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu
                 5(5)SEQ ID No：4信息
(i)序列特征
  (A)长度：9
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：4
Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Phe
                 5(6)SEQ ID No：5信息
(i)序列特征
  (A)长度：9
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：5
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala
                 5(7)SEQ ID No：6信息
(i)序列特征
  (A)长度：18
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：6
TGGCTCGTCT CACTCTGG                          18(8)SEQ ID No：7信息
(i)序列特征
  (A)长度：19
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：7
CCTCCTATTG CTCCTGTTG                         19(9)SEQ ID No：8资料
(i)序列特征
  (A)长度：19
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：8
GGCATCGTGA TGGACTCCG                         19(10)SEQ ID No：9信息
(i)序列特征
  (A)长度：19
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓朴学：线型
(xi)序列描述：SEQ ID No：9
GCTGGAAGGT GGACAGCGA                         19

Claims (16)

1、一种分离的核酸分子，该分子由SEQ ID N0：1所示的核苷酸序列组成。
2、一种分离的核酸分子，它在严格条件下与SEQ ID N0：1所示的核酸分子杂交并编码肿瘤排斥抗原前体，其中所说的分离的核酸分子不编码MAGE肿瘤排斥抗原前体。
3、一种与权利要求1的核酸分子互补的分离的分子，其中所说的分子是mRNA或DNA。
4、一种用权利要求1的核酸分子转染或转化的宿主细胞。
5、一种用权利要求2的核酸分子转染或转化的宿主细胞。
6、一种表达载体，其包含与启动子有效连接的权利要求1的分离的核酸分子。
7、一种表达载体，其包含与启动子有效连接的权利要求2的分离的核酸分子。
8、权利要求4的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是表达HLA-Cw*1601的哺乳动物细胞。
9、权利要求5的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是表达HLA-Cw*1601的哺乳动物细胞。
10、权利要求6的表达载体，该载体还包含编码HLA-Cw*1601的核酸分子。
11、权利要求7的表达载体，该载体还包含编码HLA-Cw*1601的核酸分子。
12、一种表达试剂盒，包含以下分开的各部分：
(i)权利要求1的分离的核酸分子，以及
(ii)编码HLA-Cw*1601的核酸分子。
13、一种表达试剂盒，包含以下分开的各部分：
(i)权利要求2的分离的核酸分子，和
(ii)编码HLA-Cw*1601的核酸分子。
14、一种治疗患有以在包含SEQ ID NO：1序列的细胞表面存在HLA分子与SEQ ID NO：3的肽的复合物为特征之疾病的患者的方法，该方法包含给所说的患者施用足以减轻所说疾病的量的特异于HLA分子和所说肽的复合物的胞溶性T细胞。
15、一种治疗患有以在细胞表面存在HLA分子与SEQ ID NO：3的肽的复合物为特征之疾病的患者的方法，该方法包含给所说的患者施用足以刺激针对提呈所说复合物的细胞的免疫反应的量的药剂，该药剂刺激针对HLA和所说肽的复合物的免疫反应。
16、用于诊断以在细胞表面存在HLA分子和SEQ ID NO：3的肽的复合物为特征之疾病的方法，该方法包括将来自患者的样品与特异于由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的肿瘤排斥抗原的药剂接触，并测定所说药剂和所说序列或所说表达产物之间的相互作用作为所说疾病的测定尺度。
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