CN1197393A - 由hla－b44分子提呈的肿瘤排斥抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了由HLA－B44分子提呈的肿瘤排斥抗原,这些肽可用于诊断和治疗方法中。这些肿瘤排斥抗原不是从酪氨酸酶衍生的,所述的酪氨酸酶在以前已被鉴别为一种能加工成由HLA－B44提呈的抗原的肿瘤排斥抗原前体。
Description
相关申请
本申请是1995年1月17日申请的系列号08/373,636的部分继续申请，而08/373,636是1994年6月3日申请的共同未决申请08/253,503的部分继续申请。所有这些申请均引入本文作参考。
发明领域
本发明涉及从肿瘤排斥抗原前体衍生而来并由HLA分子特别是HLA-B44提呈的分离的肽及其应用。另外，本发明涉及鉴别这样的个体的能力，所述的个体已被诊断患有特征为细胞异常的病情，其异常细胞提呈这些肽和HLA分子的复合物，本发明还涉及所提呈的肽及其应用。
发明背景
哺乳动物免疫系统识别外来物并与其反应的过程是一个复杂的过程，这一系统的一个重要方面是T细胞应答，这种应答需要T细胞识别细胞表面分子(称作人白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合物(“MHC”))与肽的复合物并与之相互作用。所述的肽来自较大的分子，这些较大分子由也提呈HLA/MHC分子的细胞加工。关于这一点参见Male等人，高级免疫学(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽的复合物的相互作用是受限制的，需要特异于HLA分子和肽的特定组合的T细胞。如果不存在特异性T细胞，即使存在其配对复合物也不会有T细胞应答。类似地，如果不存在特异性复合物仅存在T细胞也不会有应答。这一机制参与免疫系统对外来物的应答、参与自身免疫疾病以及参与对细胞异常的应答。最近许多研究工作集中于将蛋白质加工成HLA结合肽的机制，关于这一点参见，Barinaga，科学257：880(1992)；Fremont等人，科学257：919(1992)；Latron等人，科学257：964(1992)。
T细胞识别细胞异常的机制也在癌症中有应用，例如，在1992年5月22日申请、1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(引入本文作参考)中公开了一个基因家族，其被加工成肽，所述肽随即在细胞表面上表达，其可导致肿瘤细胞被特异性CTL溶解，这些基因据称编码“肿瘤排斥抗原前体”或称“TRAP”分子，由其衍生的肽称作“肿瘤排斥抗原”或称“TRA”。关于这一家族基因的进一步信息见Traversari等人，免疫遗传学35：145(1992)；van der Bruggen等人，科学254：1643(1991)，还可参见美国专利5,342,774(引入本文作参考)。
在美国专利5,405,940中(引入本文作参考)教导了一种与HLA-A1分子结合的九肽，这一参考文献指出，如果已知特定肽对特定HLA分子的特异性，则可预期该特定肽与一种HLA分子结合，而不与其它HLA分子结合。这一点是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型，结果是尽管鉴定一种特定肽是一种特异性HLA分子的配对物这一点具有诊断和治疗作用，但是这些仅与具有该特定HLA表型的个体有关。在这一领域需要进一步的研究工作，因为细胞异常不仅限于一种特定HLA表型，定向治疗需要所针对的异常细胞表型的一些知识。
酪氨酸酶催化将酪氨酸转化成脱羟苯丙氨酸或称“DOPA”的反应并似乎选择性地在黑素细胞中表达(Muller等人，EMBO J7：2715(1988))，关于这一人类酶的cDNA的早期报道见Kwon，美国专利4,898,814，由Bouchard等人，实验医学杂志169：2029(1989)的稍晚的报道描述了一略有不同的序列。已进行了许多努力来鉴别此酶的抑制剂，因为其参与色素沉积疾病，这些文献的一些例子包括Jinbow，WO9116302；Mishima等人，美国专利5,077,059以及Nazzaropor，美国专利4,818,768。本领域熟练技术人员熟知教导类似物质的其它参考文献。
1993年6月23日申请的美国专利申请08/081,673(引入本文作参考)教导了酪氨酸酶可以以类似于外来抗原或TRAP分子的方式进行处理，即在某些细胞异常如黑素瘤中发现酪氨酸酶被加工，并且由其衍生的肽与某些异常细胞上的HLA分子形成复合物。发现这些复合物被胞溶性T细胞(“CTL”)识别，随后CTL溶解提呈细胞。已讨论了这一令人惊奇和未预料到的现象的细节。现已发现其它的也能作为由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原的肽，这些均在1994年2月28日申请的系列号08/203,054中有描述(该文献引入本文作参考)。
1994年4月26日申请的美国专利申请系列号08/233,305(该文献引入本文作参考)描述了酪氨酸酶也被加工成由HLA-B44分子提呈的抗原，这一发现是重要的，因为不是所有的个体均是HLA-A2+的。但是，酪氨酸酶被加工成HLA-B44提呈肽这一事实并未提供一种诊断和治疗所有HLA-B44+肿瘤的通用手段，因为酪氨酸酶的表达不是通有的。而且酪氨酸酶由正常细胞及肿瘤细胞表达这一事实也提示在治疗领域需谨慎。
Khanna等人，实验医学杂志176：169-179(1992年7月)公开了一种HLA-B44结合肽，其在上文有进一步讨论。Khanna肽与本申请要求保护的肽不相关。
Kita等人，Hepatology18(5)：1039-1044(1993)教导了一种20个氨基酸的肽，据称其结合HLA-B44并激发溶解。
Thorpe等人，免疫遗传学40：303-305(1994)讨论了两种结合HLA-B44的肽的序列对比，揭示出一通用的结合基序。Thorpe公开文献描述了在2位的带负电荷的氨基酸，以及在9位的可能是疏水性的或带正电荷的氨基酸。
Fleischhauer等人，组织抗原44：311-317(1994)刊登了HLA-B44结合肽的综述。
现已发现MAGE-3也表达一种肿瘤排斥抗原前体，该前体被加工成至少一种由HLA-B44分子提呈的肿瘤排斥抗原。令人感兴趣的是这种肽与也是从MAGE-3衍生的并已知结合HLA-A1的肽不同，其不同之处在于在N-末端有一单一的附加氨基酸。其特别是以下将描述的本发明的主题。
附图简要说明
图1示出使用三种不同细胞系(LB33-MELc1，LB33 EBV-B和K562)以及胞溶性T细胞克隆159/5的铬释放分析的结果，以效应子/靶比率对溶解百分率表示数据。
图2示出鉴别细胞变异体“A-”、“B-”和“A-，B-”的溶解研究的结果，同样使用了铬释放分析。细胞系LB33-MELcl是A+B+，因为用两个CTL细胞系测试均呈阳性溶解，CTL159/93是抗A的，而CTL159/5是抗B的。
图3示出当用HLA-A28、HLA-B44和HLA-Cw7的编码序列转染变异体A-B-时与对照细胞系相比获得的结果。该结果是以灵敏TNF释放分析(pg/ml)描绘的，其中使用了CTL159/5。
图4示出由CTL159/5导致的TNF释放，其中COS细胞用HLA-B44或HLA-B44加本发明的核酸分子转染。
图5A示出了当与CTL159/5接触时EBV-B细胞中的51Cr释放。
图5B类似于图5A，只是其中使用了LB33-MEL B-细胞。在图5A和图5B中，本发明的抗原肽在与CTL接触前与细胞接触。
图6示出了各种自体CTL克隆对从黑素瘤克隆细胞系LB33.MEL.A-1衍生的抗原丧失变异体的溶解活性。
图7表示LB33.MEL.A-1的抗原丧失变异体表达HLA-A24、A28和B13分子的结果。肿瘤细胞与针对各特定HLA分子的小鼠抗体保温，然后用荧光素标记的山羊抗小鼠抗体标记。
图8示出了由抗原丧失变异体刺激的CTL克隆产生的肿瘤坏死因子(TNF)的量，其中所述的抗原丧失变异体被各种HLA等位基因转染。使用未转染的LB33-MEL.A-1细胞作为对照。所用的CTL克隆为159/3、159/5和204/26，分别对应于抗A、抗B和抗C的CTL。
图9给出了从自体混合淋巴细胞-肿瘤细胞培养物中得到的有关淋巴细胞的胞溶活性的数据。血单核细胞是在1990年3月或1994年1月从患者LB33中分离的。细胞系LB33-MEL.A是在1988年手术后获得的，细胞系LB33-MEL.B是在1993年该患者发生的转移中获得的。
图10A示出了抗E的CTL克隆LB33-CTL-269/1对自体黑素瘤细胞的溶解活性，而图10B示出了在由LB33-MEL.B-1细胞刺激后由该CTL克隆产生的TNF的量。刺激细胞(10,000个/孔)与3000个CTL保温16小时。用TNF敏感性WEHI-164c13细胞测定由CTL释放的TNF的浓度。通过添加1/100稀释的得自接种有杂交瘤细胞的小鼠的腹水，用抗HLA-A24单克隆抗体C7709A2抑制CTL刺激。
图11A和图11B示出分析结果，其中SEQ ID NOS：17、18、19和3在竞争结合分析中进行测试。
图12描绘了当SEQ ID NO：17与天然提呈HLA-B44的细胞联合用于51Cr释放分析中时得到的结果。
图13总结了靶细胞为天然HLA-B44阳性如癌细胞系时的51Cr释放分析的结果。
优选实施方案的详细描述
实施例1
在下列实验中使用研究人员已应用许多年的黑素瘤细胞系LB33-MEL，还使用了从该细胞系衍生的一个克隆，该克隆以下称为LB33-MELc1。
从患者LB33取含有单核血细胞的样品，将黑素瘤细胞系与该含有单核血细胞的样品接触，观察混合物中黑素瘤细胞系的溶解，这一溶解指示在样品中存在特异于肽和由黑素瘤细胞提呈的HLA分子的复合物的胞溶性T细胞(CTL)。
所用的溶解分析为Herin等人，国际癌症杂志39：390-396(1987)(该文引入本文作参考)所述的铬释放分析。在此描述一下该分析：体外培养靶黑素瘤细胞，然后以107个细胞/ml重悬于补加10mM HEPES和30％FCS(即胎牛血清)的DMEM中，在37℃与200μCi/ml Na(51Cr)O4保温45分钟。标记的细胞用补加10mMHepes的DMEM洗三次，然后将其重悬于补加10mM Hepes和10％FCS的DMEM中，之后将含103个细胞的100微升等份分加至96孔微滴板。加入在100微升相同培养基中的PBL样品，分析以双份重复进行。在100g离心板4分钟，然后在5.5％CO2气氛下于37℃保温4小时。
再次离心板，收集100微升等份上清并计数。51Cr释放百分率如下计算：
其中ER是观察到的实验51Cr释放，SR是通过将103个标记细胞在200微升培养基中单独保温测得的自发释放，MR是通过将100微升0.3％ Triton X-100加入到靶细胞中得到的最大释放。
通过限制稀释将那些显示高CTL活性的单核血细胞样品进行扩增和克隆，并使用相同方法再次筛选。
用相同的方法测试靶K562细胞。当使用EBV-B细胞时，唯一的改变是用补加5％ FCS的Hank’s培养基代替DMEM培养基。
这些实验导致分离了CTL克隆LB33-CTL-159/5。图1示出这一克隆溶解肿瘤细胞，但不溶解EBV-B细胞或K562细胞。
按照相同的程序分离了第二个CTL克隆，即LB33-CTL-159/3，这些细胞系分别被称为“159/5”和“159/3”。这一第二个CTL的特异性与159/5不同，这一点通过分离了两种抗原丧失变异体而确证，所述的两种抗原丧失变异体为(i)被159/5溶解但不被159/3溶解以及(ii)不被159/5溶解但被159/3溶解。这些变异体分别称为A-和B-。
然后用159/5免疫筛选A-变异体，获得了第三个变异体，其即不被159/5溶解也不被159/3溶解，这一变异体称为A-B-。图2总结了溶解分析的结果，导致变异体的分离。
实施例2
令人感兴趣的是确定变异体A-B-的HLA表达模式。衍生出母细胞系LB33-MEL的患者被分型为HLA-A24、A28、B13、B44、Cw6、Cw7。当进行PCR表达分析时，发现LB33-MELcl和B-变异体均表达所有6个等位基因，而A-B-变异体不表达HLA-A28、B44和Cw7。因此可以得出结论，这些HLA分子中的一个代表能被CTL溶解的抗原。下述实施例进一步探讨了这一点。
实施例3
用质粒pcDNA-I/AmpI转染A-B-变异体的样品，该质粒克隆有HLA-A28、HLA-B44或HLA-Cw7中的一种。筛选后根据Traversari等人，免疫遗传学35：145-152(1992)(该文引入本文作参考)所述在TNF释放分析中测试细胞。结果如图3所示，表明HLA-B44明显地参与抗原的提呈。
实施例4
鉴别出提呈HLA分子后，进行研究以鉴别被称为“肿瘤排斥抗原前体”或称“TRAP”的作为被提呈的肽的来源的分子。
为此，从细胞系LB33-MELc1中分离总mRNA，使用寡dT结合试剂盒根据熟知的技术分离信使RNA。获得信使RNA后将其转录成cDNA，同样应用的是标准方法。然后根据厂商指导将cDNA与EcoRI衔接头连接并克隆进质粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位点。然后将该重组质粒电穿孔进DH5αE.coli(电穿孔条件：25微法拉弟、2500V，1个脉冲)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)筛选转染的细菌，然后分成各100个细菌的集合，每一集合代表约50个不同的cDNA，因为分析显示约50％的质粒含有一插入片段。将每一集合扩增至饱和，根据Maniatis等人，分子克隆实验手册(冷泉港，纽约，1982)所述经碱裂解、醋酸钠沉淀和苯酚抽提分离质粒DNA，未使用铯梯度离心。
然后用扩增的质粒转染真核细胞。用补加10％胎牛血清的Dulbeco’s改良的Eagles培养基(“DMEM”)以15,000个细胞/孔的密度将COS-7细胞的样品接种在平底组织培养微孔中，在37℃培养细胞过夜，除去培养基，然后代之以30μl/孔含10％ Nu血清、400μg/ml DEAE-葡聚糖、100μM氯喹和100ng含来自LB33的HLA-B44的cDNA的质粒的DMEM。37℃保温4小时后除去培养基，代之以50μl含10％DMSO的PBS，两分钟后除去这一培养基，代之以200μl补加10％FCS的DMEM。
如上所述更换培养基后，在37℃保温COS细胞48小时，然后弃去培养基，加入在100μl含10％库集人血清和25U/ml IL-2的Iscove’s培养基中的2000个159/5细胞。24小时后取上清，并根据Traversari等人，免疫遗传学35：145-152(1992)(该文引入本文作参考)所述在WEHI细胞上进行分析而确定TNF含量。一个集合刺激高于背景的TNF释放，克隆这些细菌并用于下述实验中。
实施例5
从实施例4中克隆的细菌中抽提质粒DNA，以上述相同的方式转染进新鲜的COS细胞样品中，再次测试该细胞对159/5的刺激。在克隆350/2中发现一阳性克隆，如图4A总结的数据所示。
为确证这一结果，使用美国典型培养物保藏中心供应的人绒毛膜癌细胞系JAR，这一细胞系不表达HLA分子，也不被CTL 159/5识别。当JAR被HLA-B44 cDNA转染后，其仍不能被CTL 159/5识别，然而用HLA-B44 cDNA和350/2 cDNA共转染却导致溶解，如图4B所示。
从这一阳性克隆中提取质粒，并用本领域已知方法测序，资料表明该质粒插入片段为1896bp长，并与数据库中的任何序列均不同源，这一核苷酸序列列于SEQ ID NO：1。
实施例6
为确定哪一个肽为肿瘤排斥抗原，通过PCR扩增平均约为300bp的SEQ ID NO：1的各个片段，克隆进pcDNA-1/Amp中，然后按照前述实施例的程序与编码HLA-B44的质粒共转染进COS细胞。这些实验的结果是鉴别了相应于SEQ ID NO：1的683-955位氨基酸残基的区域为编码抗原肽的区域，将这一区域与Khanna等人，实验医学杂志176：169-176(7/92)所述的肽相比较，在1994年4月26日申请的系列号08/233,305中描述的肽，即：
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe对应于这些残基。因此，合成了相应于这一序列的肽，并用于敏化HLA-B44+细胞系，结果如图6A和6B所示，这两幅图描绘了使用EBV转化的B细胞(图6A)和上述B-变异体(图6B)的51Cr释放分析的结果。在37℃将细胞与各种浓度的肽保温30分钟，然后加入CTL 159/5(效应子/靶比率为10∶1)。用100-200ng/ml肽获得了半最大溶解。
实施例7
上述实施例1-6描述了使用细胞系LB33-Melc1的研究工作。从患者LB33的皮肤转移中还衍生了其它的细胞系，其中一种为LB33-MEL.A-1，该细胞系用于以下的实施例中。
首先，以实施例1-6的细胞系所使用的相同的方式使用上述细胞系(Herin等人，文献同上)。用在2ml Iscove’s培养基(补加10％库集人血清、天冬氨酸-谷氨酰胺-精氨酸(分别为36mg/ml、216mg/ml、116mg/ml)、2-巯基乙醇(0.05mM)和5U/ml人IL-4)中的辐照过的肿瘤细胞(3/105个细胞/孔)刺激血单核细胞(106个细胞/孔)，在培养的第3天加入IL-2(10U/ml)。如实施例1所述测定肿瘤细胞对自体CTL的敏感性。这一实验得到了82个稳定的胞溶性T淋巴细胞，其是从7个独立的培养物中衍生的。所有这些CTL均是CD8+，它们特异于肿瘤细胞，因为它们溶解LB33-MEL.A-1细胞，但不溶解K562或自体的EBV转化细胞。
实施例8
LB33-MEL.A-1细胞被自体CTL溶解这一事实提示了下一实验，其用来鉴别被所建立的抗原丧失变异体识别的抗原。
为此，如上所述用自体CTL克隆LB33-CTL159/3筛选该细胞系样品4次，每一轮筛选均包括以上述相同的方式将2-3×107个粘附肿瘤细胞与类似数目的CTL保温2-6小时。在每一轮中，保温后将CTL洗掉，扩增存活的粘附肿瘤细胞，然后进行下一轮筛选。
这一程序得到了一个抗CTL 159/3的克隆，然而用其它的自体CTL检测时，发现上述的CTL 159/5确实溶解这一抗原丧失变异体，其它的CTL克隆如204/26和202/1也溶解这一抗原丧失变异体。请参见图6，标为“MEL.A-1.1”的一列。类似地，建立了其它的细胞系，这些细胞系不被这四个CTL克隆中的一个溶解，但被其它三个克隆溶解，见图6。因此，发现至少4个不同的抗原被提呈至LB33-MEL.A-1的表面，因为鉴别了4个独立的抗原丧失变异体。如图6所示，相对于抗原表达，LB33-MEL.A-1被认为是“A+B+C+D+”(被CTL 159/3、159/5、204/26和202/1溶解)；MEL.A-1.1是A-B+C+D+(不被159/3溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.2是A+B-C+D+(不被159/5溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.3是A+B+C-D+(不被204/26溶解，被其它克隆溶解)；MEL.A-1.4是A-B+C+D-(不被202/1或159/3溶解)。另外还分离了细胞系MEL.A-1.1.1，其是A-B-C+D-(仅被204/26溶解)。
当在这些细胞系上测试由实施例7鉴别的82个CTL时，鉴别了29个抗A、29个抗B、10个抗C和14个抗D克隆，提示没有其它抗原被提呈。
用抗DCTL克隆202/1筛选导致鉴别了一个细胞系，该细胞系也对抗ACTL克隆(159/3)有抗性，用抗B CTL筛选也是如此(即得到A-B-C+D+细胞系)。这一结果提示A-D-和A-B-D-抗原丧失变异体实际上是HLA丧失变异体，抗原A、B和D共用相同的HLA提呈分子，或者不同的I类分子与抗原丧失变异体一起丧失。下述实验讨论了这一问题。
实施例9
开发出LB33细胞系的患者以前已经血清学分型为HLA-A24、A28、B13、B44、Cw6、Cw7，然后进行研究以确定该细胞系对HLAI类基因的表达。
建立了用于DNA扩增的半定量条件，以评价不同的LB33-MEL肿瘤细胞克隆对6个I类等位基因中每一个的表达。使用由Browning等人提议的耐扩增突变系统(ARMS)PCR方法，该方法基于在引物3’末端需要完全配对的核苷酸以保证DNA扩增的特异性，参见Browning等人，美国科学院院刊90：2842(1993)，该文引入本文作参考。基于在LB33分型时获得的序列，合成等位基因特异性引物(5’引物在先，然后是3’引物)，这些引物能将6个等位基因中的每一个与其它五个区分开。
针对A24的引物：
5’-GCCGGAGTATTGGGACGA和5’-GGCCGCCTCCCACTTGC(SEQ ID NO：5和6)
针对A28的引物：
5’-GGAGTATTGGGACCGGAAG和5’-GGCCGCCTCCCACTTGT(SEQ ID NO：7和8)
针对B13的引物：
5’-CGCCACGAGTCCGAGGAT和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCTA(SEQ ID NO：9和10)
针对B44的引物：
5’-CGCCACGAGTCCGAGGAA和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCGT(SEQ ID NO：11和12)
针对Cw6的引物：
5’-CCGAGTGAACCTGCGGAAA和5’-GGTCGCAGCCATACATCCA(SEQ ID NO：13和14)
针对Cw7的引物：
5’-TACAAGCGCCAGGCACAGG和5’-CTCCAGGTAGGCTCTGTC(SEQ ID NO：15和16)
为进行表达的半定量测量，用每套引物进行27轮反转录RNA的PCR扩增，在所观察的线性范围内发现DNA扩增。用溴乙锭染色的琼脂糖凝胶肉眼评估扩增的DNA量。将这些量与用含来自LB33-MEL.A-1细胞的系列稀释的RNA的RT-PCR扩增产物的标准曲线获得的量比较。通过考虑β-肌动蛋白的表达水平而将样品表达量根据RNA完整性而标准化，结果以相对于LB33-MEL.A-1细胞的表达水平而表示。这一工作的结果见下表1，“+++”表示表达水平高于LB33-MEL.A-1细胞表达水平的一半，“++”表示表达水平在LB33-MEL.A-1细胞表达水平的1/8至1/2之间，“+”表示表达水平低于LB33-MEL.A-1细胞表达水平的1/8，“-”表示无表达。
表1 衍生自LB33-MEL.A-1细胞的抗原丧失变异体对
HLAI类分子的表达下述分子 LB33-MEL.A-1 抗原丧失变异体的表达 A- B- C- A-D- A-B-D-A. 基因表达
A24 +++ +++ +++ - ++ +++
A28 +++ +++ +++ +++ + -
B13 +++ +++ +++ + +++ +++
B44 +++ +++ +++ +++ ++ -
Cw6 +++ +++ +++ + +++ +++
Cw7 +++ ++ +++ +++ + -
如上所示，MEL.A-1细胞和B-变异体均表达类似水平的所有6个HLA等位基因，A-变异体表达Cw7的水平约下降4倍，其余的抗原丧失变异体显示表达三种等位基因的水平下降。对于C-细胞，发现HLA-A24、B13和Cw6的表达水平下降，而A-D-和A-B-D-变异体显示A28、B44和Cw7表达下降，这提示A24-B13-Cw6以及A28-B44-Cw7组成了患者LB33的两种HLA I类单元型，这些单元型的表达降低很可能导致免疫筛选的肿瘤细胞的抗原表达丧失。
实施例10
下一实验设计用来证实HLA基因表达和CTL的溶解之间的相关性。为此，将如上所述测定的给定HLA基因的表达水平与用标准抗体分析获得的结果相比较，仅用特异于A24、A28和B13的鼠抗体测试这些分子(C7709A1抗A24，2.28M1抗A28，T48抗B13)。通过与抗体保温、洗涤、然后与荧光素缀合的山羊抗鼠Ig抗体接触而测定抗体的结合。然后通过一种标准技术即流式细胞计数分析细胞。
表2给出了结果，该结果也示于图7中。在下表2中，标出的HLA表达水平相应于图6中所示的平均荧光强度。以相对于LB33-MEL.A-1细胞中发现的水平表达数值。
从这些结果可以看出，当预计HLA表达水平为LB33-MEL.A-1细胞表达水平的1/8以下时，不能检测到HLA表面分子或者仅达到可检水平，因此提示向CTL提呈抗原对于给定的HLA分子不是必然的。
鉴于此，并假定所选择的C-、A-D-、A-B-D-细胞由于缺乏HLA分子而丧失抗原表达，似乎抗原A的I类提呈分子是A28或Cw7，抗原B的I类提呈分子是B44，抗原C的I类提呈分子是A24或B13或Cw6，抗原D的I类提呈分子是A28或Cw7。
表2下述分子 LB33-MEL.A-1 抗原丧失变异体的表达 A- B- C- A-D- A-B-D-
表面抗原的表达A24 100 33 13 4 41 95A28 100 29 14 3 1 1B13 100 27 22 1 40 230
实施例11
以上详细描述的实验之后继续进行研究工作以明确地确定由LB33-MEL.A细胞表达的抗原的提呈分子。为此，用其中已克隆了特定的I类cDNA的表达载体pcDNA3经常规的磷酸钙沉淀法转染已丧失了该特定HLAI类分子的表达的肿瘤细胞，这一载体含有neo标记。用1.5mg/ml G418筛选转染子，然后将其用于刺激CTL克隆，所用方法为前述实施例所述的TNF分析。
图8给出了这些结果。通过用携带HLA-B44的质粒转染在A-B-D-细胞中恢复了抗原B的表达，而用含HLA-A28或HLA-Cw7的质粒转染未在A-B-D-细胞中恢复抗原B的表达。用HLA B13转染在C-细胞中恢复了抗原C的表达，4个其它抗C CTL克隆也识别C-细胞，但包括所示的CTL 179C/50在内的5个其它抗C CTL克隆不识别C-细胞，反而这些CTL识别用HLA-Cw6转染的C-细胞。因此，可能可以得出结论，即存在两组抗C CTL克隆，其中一组识别由HLA-B13提呈的抗原，另一组识别由HLA-Cw6提呈的抗原。对于抗原D，通过用HLA-A28转染使A-D-细胞恢复成A-D+细胞。尽管很清楚抗原A由HLA I类分子提呈，但是没有一种cDNA(即所测的A28、B44、Cw7)恢复抗原A的表达，因为抗A CTL的溶解作用被抗I类单克隆抗体W6/32完全抑制。可能是这一抗原被非A、B、C的I类分子所提呈，其中两种等位基因存在于患者LB33中，其中一种丧失，具有A-D-细胞、A-B-D-细胞中的A28-B44-Cw7单元型。
针对抗原C的尽管导致了命名学的改变，以下将两种抗原称为抗原Ca和抗原Cb。
实施例12
在进一步的实验中，提出了这一问题，即是否LB33-MEL.B细胞系可被自体细胞系识别。
以上述文献相同的方式(Herin等人)使用照射过的LB33-MEL.B.1细胞，以刺激自体淋巴细胞。在1990年或1994年从患者LB33中取淋巴细胞。
如图9所示，仅有1994年的淋巴细胞溶解LB33-MEL.B-1细胞，然而它们不溶解LB33-MEL.A细胞。因此LB33-MEL.B-1细胞系提呈一种在LB33-MEL.A中未发现的抗原。
本文描述的实验与上述文献描述的实验是平行的，在以前的实验中建立了另一组CD8+CTL克隆。图10A中显示了CTL 269/1的反应性。注意是与“MEL.B-1”反应，而非与“MEL.A-1”反应。由此鉴定的新抗原命名为LB33-E。
在抗体抑制实验中，针对HLA-A24的单克隆抗体抑制溶解，见图10B所示，因此“E”抗原由HLA-A24提呈。
实施例13
Fleischhauer等人，组织抗原44：311-317(1994)(该文献引入本文作参考)教导了一种用于HLA-B44结合的共有基序，据描述这一基序为九个氨基酸或十个氨基酸的多肽，其中在第二位为Glu，在最后一位(第9或10位)为Tyr或Phe，在第三位为疏水氨基酸残基如Met。
MAGE-3TRAP氨基酸序列在167-176位含有一段与这一基序相对应的氨基酸，这一氨基酸序列为：
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO：17)
已知HLA-B44基序含有至少两种主要亚型，称为HLA-B*4402和HLA-B*4403，这一MHC分子在23％的白种人中出现。当将这一数字与黑素瘤的标准分析结合时，得出结论：15％的白种黑素瘤患者应在其黑素瘤细胞表面提呈HLA-B44。因此特别感兴趣的是确定是否SEQ ID NO：17的肽或相关分子确实能用于识别HLA-B44细胞并在与MHC分子结合后能激发其溶解。如在以前的实施例中描述的，显示SEQ ID NO：2的肽能结合HLA-B44阳性细胞。设计一种类似于SEQ ID NO：2的肽，只是在第8位为Ala而非Leu，在一与SEQ ID NO：17的竞争分析中测试了这一新肽，即
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO：18)参照未在本文报道的实验中获得的结果使用此肽。简单地说，制备SEQ ID NO：17的衍生物，其中每种衍生物在未被SEQ ID NO：17中的Ala占据的位置含有一Ala。CTL克隆159/5识别含SEQ IDNO：18的复合物要比识别含SEQ ID NO：17的复合物稍好，从而使其成为竞争分析的极佳试剂。如Storkus等人，免疫学杂志138：1657-1659(1987)所述用ClR细胞进行竞争试验，这些ClR细胞是MHC I类阴性的淋巴母样细胞。根据上述文献给出的相同方法，用HLA-B*4402或HLA-B*4403的cDNA转染ClR细胞，HLA-B*4402的cDNA由Fleischhauer等人，组织抗原44：311-317(1994)描述，HLA-B*4403的cDNA由Fleischhauer等人，(1990)新英格兰医学杂志323：1818-1822(1990)给出，两篇论文均引入本文作参考。
在抗HLA I类单克隆抗体W6/32(30％(v/v)杂交瘤细胞培养物培养基)存在下，用51Cr在37℃标记细胞1小时，这能增强细胞提呈抗原肽给T细胞的能力。
洗涤标记细胞并在无血清培养基中与各种浓度的竞争肽在20℃保温30分钟。这些肽包括：上述文献描述的结合HLA-B44分子的肽Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO：3)；由EBV基因EBNA-3A编码的与HLA-B8结合的肽Phe Leu Arg Gly ArgAla Tyr Gly Leu(SEQ ID NO：19)(Burrows，实验医学杂志171：345-349(1990))以及SEQ ID NO：17。
然后将SEQ ID NO：18的肽加入到无血清培养基中至终浓度为45ng/ml(ClR-B4402+细胞)或160ng/ml(ClR-B4403+细胞)，将细胞在20℃保温30分钟，在Iscove’s培养基加2％胎牛血清中洗两次。以E∶T比率为20加入在Iscove’s培养基和10％人血清中的CTL克隆LB33-CTL 159/5，三小时后测量51Cr释放，结果示于图11A和图11B，分别相应于ClR-B*4402细胞和ClR-B*4403细胞。图11中的数据清楚地证明有竞争作用。
实施例14
实施例13实验进行完毕后进行下列实验。
胞溶性T细胞克隆(CTL)是从两个个体LB816和LB822衍生的，这些个体没有癌症。
用密度梯度离心从这些个体分离血单核细胞(BMC)，通过使用绵羊血红细胞经花结试验(rosetting)纯化BMC中的T淋巴细胞，然后用与磁微珠偶联的抗CD8单克隆抗体标记，其中所述的绵羊血红细胞已用aminoethylisothiouronium bromide处理。通过流经磁化区分选CD8+细胞，然后在补加10％人血清、116mg/ml L-精氨酸、36mg/ml L-天冬氨酸和216mg/ml L-谷氨酰胺、0.05M 2-巯基乙醇和10％ DMSO的Iscove’s培养基中于-80℃保存。
其余未花结试验的BMC在37℃于组织培养平板上粘附2小时，弃去未粘附的细胞，在IL-4(50U/ml)和GM-CSF(100ng/ml)存在下培养粘附细胞7天。富集得到的细胞群中的抗原提呈细胞(“APC”，在此例中为树状细胞或巨噬细胞)，然后将5×105-106个这些细胞在2毫升孔中的400μl补加2.5μg/ml人β2微球蛋白和50μg/ml SEQ ID NO：17的肽的Iscove’s培养基中于37℃培养4小时。然后在5000rad照射粘附的肽脉冲的细胞并洗涤。接着加入在补加1000U/ml IL-6和5ng/ml IL-12的培养物培养基中的2×106个自体CD8+T细胞。
7天后，用如上所述肽脉冲的粘附的自体BMC再刺激淋巴细胞。5×106个BMC在37℃下于400μl含β2微球蛋白和SEQ ID NO：17的肽的Iscove’s培养基中如上所述粘附2小时，照射所有肽脉冲的粘附细胞并洗涤，然后加入在补加10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的培养物培养基中的应答细胞。
在第14天，用经SEQ ID NO：17脉冲的自体BMC再刺激淋巴细胞，以2×107个细胞/ml在如上所述的补加后的Iscove’s培养基(但不含10％DMSO)中保温BMC，保温(20℃)2小时后，照射肽脉冲的BMC并洗涤，以2×106个细胞/ml重悬于如上所述的补加IL-2和IL-7的培养基中。将这些刺激细胞(2×106)的样品加入到含有应答细胞的每个孔中。
在第21天克隆应答淋巴细胞，在补加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的培养基中将细胞以10-0.3个细胞/孔的密度接种在微孔中，然后通过加入同种EBV转化的B细胞(LG2-EBV)刺激这些细胞，在10000rad以每孔20000个细胞照射下述细胞中的一种：(i)同种EBV转化的B细胞，(ii)肽脉冲的HLA-B4402+细胞，或(iii)肽脉冲的HLA-B4403+细胞。对于(ii)或(iii)，照射在15000rad，以每孔8000个细胞进行。
每周均按在第21天相同的方式再刺激微培养物，一点改变是在第28和35天，每孔分别加入40000和60000个EBV-B细胞，而非第21天的20000个细胞。
在第41天和52天之间，将增殖的微培养物等份样品转移至V型底微孔中以测试针对用SEQ ID NO：17脉冲或未脉冲的HLA-B4402+或HLA-B4403+靶细胞的溶解活性。
在补加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的800μl培养基中，用5×104个照射的肽脉冲的B4402+或B4403-细胞加5×105个照射的LG2-EBV-B细胞再刺激任何显示有抗肽溶解活性的微培养物。
7天后，每周用2×105个照射的肽脉冲的B4402+或B4403+细胞与106个照射的LG2-EBV-B细胞如上所述再刺激CTL克隆。以这种方式获得了CTL LB 816-CTL-340 A/1和LB822-CTL-346A/1，这些CTL分别特异于SEQ IDNO：17和HLA-B*4402或HLA-B4403的复合物。
实施例15
在一系列进一步的实验中，根据Brodsky等人，免疫学杂志128：135(1982)所述，在单克隆抗体W6/32存在下，在37℃用51Cr标记不表达MAGE-3的HLA-B4402+或HLA-B4403+EBV转化的B细胞，标记时间为1小时。洗涤细胞并在无血清培养基中用各种浓度的SEQ ID NO：17于20℃保温30分钟。在51Cr释放分析中测试实施例14中所述的每个CTL，4小时后测量铬释放。
图12所示结果显示该肽确实激发溶解。
实施例16
在下述实验中，检测了另外的HLA-B44阳性肿瘤细胞系。
在37℃用51Cr标记所有被测细胞系1小时，然后将这些细胞以Iscove’s培养基加2％胎牛血清加入到各种数量的实施例14中所述的两个CTL克隆中。4小时后测量51Cr释放量。如图13所示，还使用了对照。注意在分析前将细胞系LB33-MEL用IFN-γ(50U/ml)保温48小时。
这些实验的结果示于图13。CTL克隆LB816-CTL-340A/1和LB822-CTL-346 A/1溶解表达MAGE-3的肿瘤细胞，但不溶解不表达MAGE基因的LB33-EBV B细胞。CTL克隆LB822-346 A/1溶解表达MAGE-3的HLA-B*4403+肿瘤细胞系MZ2-MEL，但不溶解抗原丧失变异体MZ2-MEL.61.2D-。
实施例17
为最终确定与HLA-B44形成复合物的SEQ ID NO：17的肽是否刺激CTL，进行实验以确定肿瘤坏死因子释放是否被刺激。
首先，根据Gaugler等人，实验医学杂志179：921-930(1994)所述，用在表达载体pcDNA-1/AMP中的编码MAGE-3的cDNA转染COS-7细胞，其中HLA-B*4402 cDNA克隆在载体pcDNA3中，HLA-B4403 cDNA克隆在pcDNA1/AMP中，使用的是Aruffo，美国科学院院刊84：3365-3369(1987)所述的DEAE葡聚糖氯喹法。
在37℃保温转染子24小时，然后加入3000个CTL/孔，在37℃保温这些实验材料18小时，之后收集上清，根据Espevik等人，免疫学方法杂志95：99-105(1986)所述方法，通过测试在TNF敏感性WEHI-16克隆13细胞上的溶胞效果而确定TNF含量。
下述表2显示了结果，其中TNF的表达以pg/ml计。在分析前将LB33-MEL和LB494 MEL与100U/ml的IFNγ保温24小时。还测试了肿瘤细胞系LB33-MEL、LB494-MEL和MZ2-MEL，这些细胞系均表达MAGE-3 cDNA，并且是HLA-B*4402+(LB33-MEL，LB494-MEL)或HLA-B*4403+(MZ2-MEL)，因此不需对这些细胞进行转染。结果显示有TNF释放。因此可以得出结论，SEQ ID NO：17被HLA-B44 MHC分子提呈，并且这些复合物激发CTL活性。
表2 抗MAGE-3.B44 CTL克隆的产生
CTL克隆 刺激细胞 TNF(pg/ml)A LB816-CTL-340A/1 COS 0.7
(B4402) COS+MAGE-3 0.6
COS+HLA-B44020.5
COS+HLA-B4402+MAGE-3 33.7
LB33-MEL(B4402，MAGE-3+++) 74.9
LB494-MEL(B4402，MAGE-3+++) 32.3B LB822-CTL-346A/1 COS 1.2
(B4403) COS+MAGE-3 1
COS+HLA-B44031.2
COS+HLA-B4403+MAGE-3 26.6
MZ2-MEL(B4403，MAGE-3+++) 67.3
上述实验描述了编码肿瘤排斥抗原前体“TRAP”分子的分离的核酸分子，这些核酸分子编码的蛋白分子在细胞内以这样的方式被加工，以至于产生至少一种被HLA-B44分子提呈的肿瘤排斥抗原或称“TRA”。尽管以前已观察到HLA-B44分子提呈由酪氨酸酶衍生的肽，但是本发明的核酸分子不编码酪氨酸酶，并且所述的TRA不是酪氨酸酶衍生的。
本发明的肿瘤排斥抗原是分离的九肽，其在第2位为Glu残基，在第9或10位为Phe或Tyr残基。特别优选的是SEQ ID NO：2的九聚体，即：
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe
以及下述九聚体：
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO：18)
和十聚体：
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO：17)。
其它有用的是这样的九聚体，即除了在第2位和第9或10位具有所需的残基外，还具有一或多个如下定义的残基：
位置1：Glu或Met
位置3：Lys或Val
位置4：Leu或Asp
位置5：Ile或Pro
位置6：Val或Ile
位置7：Val或Gly
位置8：Leu，Ala或His
位置9：Leu(当肽为十聚体时)
特别感兴趣的是满足某些特定基序的肽，这些基序包括：
Xaa Glu(Xaa)3 Val(Xaa)2 Phe
和
Xaa Glu(Xaa)4 Val Xaa Phe
其中Xaa是任意氨基酸，这些基序还包括下述共有基序
Xaa Glu(Xaa)2.3 Ile(Xaa)3 Xaa
其中第1、2和3种Xaa指任意氨基酸，第4种Xaa即羧基端氨基酸代表酪氨酸或苯丙氨酸。特别优选的是SEQ ID NOS：17和18的肽，以及上述讨论的各种变化。
本发明的肽类似于已转让给本申请的受让人的美国专利系列号08/233,305中公开的肽，即：
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO：3)
Khanna等人，文献同上教导了一种十聚体，即
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO：4)但是没有讨论如何修饰该十聚体而得到有效的九聚体。
因此，本发明涉及与HLA-B44分子结合并激发CTL的溶解作用的肿瘤排斥抗原。
如上所述，TRA和HLA分子的复合物激发胞溶性T细胞应答，因此肿瘤排斥抗原和HLA-B44分子的分离的复合物也包含在本发明范围内，由以前描述的核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体也属于本发明的范围。如果已知结合特异性，则还可使用肽简便地鉴别HLA-B44阳性细胞。
本发明有许多用途，在此描述其中一些用途。首先，对由HLA-B44分子特异提呈的肿瘤排斥抗原以及编码其平行肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的鉴定使得本领域技术人员能够诊断以该TRAP的表达为特征的疾病，这些方法包括确定TRAP基因的表达，和/或由此衍生的TRA(如由HLA分子提呈的TRA)的表达。从本发明的TRAP也可衍生其它的TRA并由不同的HLA分子提呈。在前一种情况下，可以经任何标准核酸确定分析进行确定，包括聚合酶链反应，或用标记杂交探针分析。在后一种情况下，特别优选的是用TRA和HLA的复合物的结合配对物如抗体进行分析。
对TRAP基因的分离也使得能分离TRAP分子本身，特别是含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的TRAP分子。当被提呈为TRA或TRA和HLA-B44的复合物时，这些分离的分子的肽片段可以与佐剂等材料联合生产疫苗，用于治疗以该TRAP分子的表达为特征的疾病。另外，可以从在其表面提呈TRA/HLA复合物的细胞如非增殖性癌细胞、非增殖性转染子等制备疫苗。在细胞用作疫苗的所有情况下，这些细胞可以是用保证CTL应答所需的两种组分或其中一种组分的编码序列转染的细胞，或者是不需转染而表达两种分子的细胞。另外，TRAP分子、其相关TRA以及TRA和HLA的复合物可以用于经本领域熟知的标准技术生产抗体。
本文所用术语“疾病”是指任何表达肿瘤排斥抗原前体的病理状态，这种疾病的一个例子是癌症，特别是黑素瘤。
基于本发明的治疗途径是以个体的免疫系统应答为前提，从而导致溶解TRA提呈细胞，如提呈相关HLA分子的细胞。一种治疗途径是给予具有异常细胞表型的个体以特异于该复合物的CTL，体外开发这种CTL属于本领域技术人员的技术范畴内。具体地说，将细胞样品如血细胞与提呈复合物并能激发特异CTL增殖的细胞接触，靶细胞可以是转染子，如上述的COS细胞类型，这些转染子在其表面提呈所需的复合物，并且当与感兴趣的CTL合并时能残基其增殖。本文所用的COS细胞和其它合适的宿主细胞是广泛可得的。
称为过继转移的治疗方法(Greenberg，免疫学杂志136(5)：1917(1986)；Reddel等人，科学257：238(7-10-92)；Lynch等人，欧洲免疫学杂志21；1403-1410(1991)；Kast等人，细胞59：603-614(11-17-89))是将提呈所需复合物的细胞与CTL合并，导致特异于该细胞的CTL增殖，然后将增殖的CTL给予具有细胞异常的个体，所述的细胞异常是以某些提呈该特定复合物的异常细胞为特征。随后CTL溶解异常细胞，由此达到所需的治疗目的。
上述疗法假定个体的至少某些异常细胞提呈HLA/TRA复合物，这一点很容易确定，因为本领域很熟悉鉴别提呈特定HLA分子的细胞的方法，以及鉴别表达含所指序列的DNA的细胞的方法。一旦分离了这些细胞，可以将这些细胞与个体的异常细胞样品一起应用以体外确定溶解作用，如果观察到溶解作用，则将特异性CTL用于这种疗法可以减轻与该异常细胞相关的病症。一种不太复杂的方法能够用标准分析检测异常细胞以分析HLA表型，并经PCR扩增确定表达。
过继转移不是本发明的疗法的唯一形式，还可以用一些方法体内激发CTL。其中一种方法即使用表达复合物的非增殖性细胞已在上文有描述，用于这种方法的细胞可以是正常表达复合物的细胞，如照射的黑素瘤细胞，或者是用提呈复合物所需的一种基因或两种基因转染的细胞。Chen等人，美国科学院院刊88：110-114(1991年1月)描述了这一方法，其在治疗方案中使用了表达HPVE7肽的转染细胞。可以使用各种类型的细胞，类似地携带一种或两种感兴趣基因的载体也可应用，特别优选的是病毒或细菌载体。在这些系统中，感兴趣的基因由例如痘苗病毒或细菌BCG携带，这些材料“感染”宿主细胞，得到的细胞提呈感兴趣的复合物并被自体CTL识别，这些CTL随后增殖。通过将肿瘤排斥抗原或前体与能有助于掺入提呈感兴趣的HLA分子的细胞的佐剂联合应用也能达到类似的效果。TRAP需加工产生HLA分子的肽配对物，而TRA不需进一步加工而被提呈。
本发明的其它方面对于本领域熟练技术人员是清楚的，不需在此重复。
本文所采用的术语和表达法是描述性的而非限制性的，使用这些术语和表达法无意排除任何所示和所述特征或其部分的等价物，应理解的是在本发明范围内可以有各种修饰。
序列表(1)一般信息(i)申请人：皮埃尔·库利，蒂尔瑞·博恩-法勒尔(ii)发明名称：由HLA-B44分子提呈的肿瘤排斥抗原及其应用(iii)序列数目：19(iv)通信地址：
(A)收信人：Felfe&Lynch
(B)街道：805第三大道
(C)城市：纽约市
(D)州：纽约
(E)邮政编码：10022(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘，3.5英寸，360kb存储量
(B)计算机：IBM
(C)操作系统：PC-DOS
(D)软件：Wordperfect(vi)当前申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：435(vi)在先申请数据：
(A)申请号：08/531,864
(B)申请日：1995年9月21日(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Hanson，Norman D.
(B)登记号：30,946
(C)档案号：LUD 5378.3-PCT(ix)电讯资料：
(A)电话：(212)688-9200
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5
权利要求书
按照条约第19条的修改
1、与HLA-B44分子结合的九肽或十肽，该肽具有选自如下一组的氨基酸序列：
Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，
Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Phe，
Xaa Glu Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，
Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Tyr，和
Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Phe其中，Xaa是任意氨基酸。
2、权利要求1所述的分离肽，由SEQ ID NO：17组成。
3、权利要求1所述的分离肽，由SEQ ID NO：18组成。
4、特异于HLA-B44和权利要求1的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
5、特异于HLA-B44和权利要求2的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
6、特异于HLA-B44和权利要求3的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
7、一种用于鉴定样品中的HLA-B44阳性细胞的方法，所述的方法包括将所述的样品与权利要求1的分离的肽接触，确定所述肽的结合以确定所述样品中HLA-B44阳性细胞。
Claims (7)
1、与HLA-B44分子结合的分离的肽，该肽由以下氨基酸序列组成：
Xaa Glu(Xaa)2.3Ile(Xaa)3Xaa其中，第一、第二和第三个Xaa是任意氨基酸，末端Xaa是酪氨酸或苯丙氨酸，所述的肽是九聚体或十聚体。
2、权利要求1所述的分离肽，由SEQ ID NO：17组成。
3、权利要求1所述的分离肽，由SEQ ID NO：18组成。
4、特异于HLA-B44和权利要求1的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
5、特异于HLA-B44和权利要求2的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
6、特异于HLA-B44和权利要求3的分离肽的复合物的分离的胞溶性T细胞系。
7、一种用于鉴定样品中的HLA-B44阳性细胞的方法，所述的方法包括将所述的样品与权利要求1的分离的肽接触，确定所述肽的结合以确定所述样品中HLA-B44阳性细胞。
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