CN1214692A - 由hla－b44分子呈递的肿瘤排斥抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了由HLA－B44分子呈递的肿瘤排斥抗原,这些肽可用于诊断和治疗。所述的肿瘤排斥抗原衍生自MAGE肿瘤排斥抗原前体。

Description

由HLA-B44分子呈递的肿瘤排斥抗原及其应用
相关申请
本申请是1995年9月21日申请的08/531,864的部分继续申请，08/531,864是1995年1月17日申请的08/373,636的部分继续申请，08/373,636是1994年6月3日申请的08/253,503(现为美国专利5,589,334)的部分继续申请。所有申请均引入本文作参考。
发明领域
本发明涉及衍生自肿瘤排斥抗原前体并由HLA分子尤其是HLA-B44分子呈递的分离的肽及其应用。此外还涉及鉴别诊断患有特征在于由其异常细胞呈递这些肽与HLA分子复合物的细胞异常病情的个体患者，呈递的肽及其结果的能力。
背景及现有技术
哺乳动物免疫系统识别并与外来异物反应是一复杂过程。该系统的一重要方面是T细胞应答。该应答要求T细胞可识别并与称作人白细胞抗原(HLA)或主要组织相容复合物(MHC)的细胞表面分子与肽的复合物反应。该肽衍生自由也呈递HLA/MHC分子的细胞加工的较大的分子，可参见Male等，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company.1987)，尤其是第6～10章所述。T细胞与HLA/肽复合物的相互作用是受限的，要求一种特异于HLA分子和肽的特定组合的T细胞。如果不存在特异T细胞，即使有相应的配体复合物也不能产生T细胞应答。相似地如果缺乏特异复合物而只有T细胞也不能产生应答。该机制参与免疫系统对外源异物的应答，自身免疫病理及对细胞异常的应答之中。近来有许多工作致力于将蛋白质加工成HLA结合肽的机制的研究。可见Barinage，科学257:880(1992)；Fremont et al.,科学257:919(1992)；Matsumura et al.，科学257:927(1992)；Latron et al.，科学257:964(1992)中的论述。
T细胞识别细胞异常的机制也被应用于癌症疾病。例如，在申请号为PCT/US92/04354，申请日1992年5月22日，公开日1992年11月26日的PCT申请(引入本文作参考)中，揭示了一基因家族，其被加工成在细胞表面表达的肽，其可通过特异的CTLs导致肿瘤细胞的溶解。该基因被称作可编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，且衍生自此的肽被称作“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。可见Traversariet al.，免疫遗传学35:145(1992)；Van der Bruggen et al.，科学254:1643(1991)，其进一步阐述了该基因家族。也可参见美国专利5,342,774(引入本文作参考)。
在美国专利5,405,940(引入本文作参考)中，教导了与HLA-A1分子结合的九肽。该参考文献教导了给出特定的肽对特定的HLA分子的特异性，则可预期特定肽与一种HLA分子而非其它分子相结合。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果是，尽管对作为一特异HLA分子的配体的特定肽的鉴定具有诊断及治疗作用，但是这些仅与那些具有该特定HLA表型的个体相关。由于细胞异常并非限于一种特定的HLA表型，且定向治疗要求对异常细胞的一些表型知识，因此在该领域还需做进一步研究。
酪氨酸酶可催化将酪氨酸转化为脱羟苯丙氨酸或“DOPA”的反应，并似乎在黑色素瘤细胞中选择性表达(Muller et al.,EMBOJ 7:2715(1988))。关于这一人类酶cDNA的早期报道见于Kwon，美国专利4,898,814。稍迟的由Bouchard et al.,J.Exp.Med.169:2029(1989)的报道展示了一略有不同的序列。由于其参与色素沉着类疾病，因而有许多致力于鉴定该酶抑制剂的努力。这类文献的实例包括：Jinbow,WO9116302；Mishima et al.，美国专利5,077,059，及Nazzaropor，美国专利4,818,768。技术人员也熟悉其它教导相似物的参考文献。
美国专利申请08/081,673号，申请日1993年6月23日教导了酪氨酸酶可能以一种与外来抗原或TRAP分子-发现于在某些细胞异常如黑色素瘤中-相似的方式被处理，酪氨酸酶被加工并且由其衍生的肽与在某些异常细胞上的HLA分子形成复合物。发现这些复合物可由胞溶T细胞(CTL)识别，随后胞溶T细胞将呈递细胞溶解。讨论了该令人惊奇的和未预料到的现象的应用。现已发现由HLA-A2分子呈递的也可作为肿瘤排斥抗原的其它肽。可见美国专利申请08/203,054，申请日为1994年2月28日的专利申请所述(该申请引入本文作参考)。
引入本文作参考的美国专利申请08/233,305(申请日1994年4月26日)提示：酪氨酸酶也被加工成由HLA-B44分子呈递的抗原。由于不是所有个体都是HLA-A2+,因而该发现是非常重要的。由于酪氨酸酶表达不是普遍的，所以酪氨酸酶可被加工成HLA-B44呈递的肽这一事实，不能提供通用于所有HLA-B44+肿瘤的诊断和治疗方法。进一步地，酪氨酸酶是通过正常细胞及肿瘤细胞表达这一事实可以提示在治疗领域的一些警示。
人群分析表明大约22～24％的高加索人表达HLA-B44分子。如参见Imanishi,et al.，在Tsuji等人编辑的“HLA 199l,Vol.I，第十一届组织相容性国际专题讨论会”，Oxford牛津大学出版社，1991；Lee,Lee编辑的HLA系统：一个新途径，Springer,pp.141-178(1990)。前期研究已显示大约76％的所有转移性黑色素瘤表达MAGE-3(Brasseur,et al.,Int.J.Cancer 63:375-380(1995))。因此，近17％的高加索人群中的转移性黑色素瘤应在其表面呈递HLA-B44和MAGE-3衍生的肽的复合物，从而可明确应用于诊断和治疗。已鉴别出五种不同的HLA-B44等位基因，这可见于Fleischhauer等，组织抗原37:133-137(1991)；Petersdorf等，组织抗原44:211-216(1994)；Yao等，免疫遗传学40:310；Yao等，人类免疫学，42:54-60(1995)；Yao等，免疫遗传学41:387(1995)。在表达HLA-B44的高加索人群中，61％呈递HLA-B*4402等位基因，36％呈递HLA-B*4403等位基因。见Yao等，人类免疫学42:54-60(1995)。在这两个等位基因中只有一个发生在第156位氨基酸的差异。在HLA-B*4402，该位置是由Asp占据，而HLA-B*4403是Leu。在HLA-B*4402及HLA-B*4403等位基因不同的供体与受体之间已观测到骨髓异体移植排斥反应及移植排斥宿主疾病。由于第156位氨基酸位于α2螺旋中部并延伸至肽结合位点内，所以令人感兴趣的是确定这些不同的HLA-B44等位基因是否呈递不同的肽。
Khanna等，J.Exp.Med.176:169-179(July 1992)揭示了一种HLA-B44结合肽，在下文将进一步阐述。该Khanna肽与本文权利要求的肽不相关。
Kita,et al.,Hepatology 18(5):1039-1044(1993)教导了一种据说与HLA-B44结合并激发溶解的20个氨基酸的肽。
Thorpe,et al.,Immunogenetics 40:303-305(1994)描述了与HLA-B44结合的两种肽的序列对比，并提示一种通用结合基序。Thorpe揭示了在第2位是带负电荷氨基酸，及在第9位的可能是疏水的或带正电荷的氨基酸。
Fleischhauer,et al.,Tissue Antigens 44:31l-317(1994)包含了HLA-B44结合肽的全面评述。
现已发现也表达一种肿瘤排斥抗原前体的MAGE-3被加工成由HLA-B44分子呈递的一种肿瘤排斥抗原。引人兴趣的是该肽与也衍生自MAGE-3的并已知结合HLA-A1的肽不同，不同之处是在N末端加了一个氨基酸。这是以下本发明所揭示的主题。
附图简要说明
图1示出使用三种不同细胞系(LB33-MELcl,LB33 EBV-B及K562)由胞溶T细胞克隆159/5所致铬释放分析结果。该数据以效应器/靶比率对溶解百分率表示。
图2示出鉴定的细胞变体“A-”,“B-”及“A-,B-”的溶解研究结果。再一次应用铬释放分析。细胞系LB33-MELcl是A+B+,如用两种CTL细胞系溶解均呈阳性所示。CTL159/93是抗-A，而CTL159/5是抗-B。
图3示出当变体A-B-用编码HLA-A28,HLA-B44及HLA-Cw7的每种序列转染，与对照细胞系的比较结果。结果以灵敏的TNF释放分析(pg/ml)来描述，其中使用了CTL159/5。
图4示出由CTL 159/5所致的TNF的释放，其中COS细胞用HLA-B44加上本发明的核酸分子转染。
图5A描绘了当与CTL 159/5接触时，在EBV-B细胞中的51Cr释放。
图5B与图5A相似，但使用的是LB33-MEL B-细胞。在图5A和5B中，本发明的抗原肽在与CTL接触前与细胞接触。
图6示出各种自身CTL克隆对衍生自黑素瘤克隆系LB33.MEL.A-1的抗原丧失变体的溶解活性。
图7代表HLA-A24,A28及B13分子经LB33-MEL.A-1抗原丧失变体的表达结果。肿瘤细胞已用抗特定HLA分子的小鼠抗体温育，并随后用荧光标记的羊抗鼠抗体标记。
图8示出通过用各种HLA等位基因转染的抗原丧失变体刺激的、由CTL克隆所致的肿瘤坏死因子(TNF)的产生。使用未转染的LB33-MEL.A-1细胞及抗原丧失变体作为对照。使用的CTL克隆是分别对应于抗-A，抗-B，抗-Ca抗-Cb及抗-D CTL的159/3,159/5及204/26,179c/50和202/1。
图9进一步阐述了图6和图8所述的CTL克隆的胞溶活性相关的数据。经由1988年的外科手术获得LB33-MEL.A细胞系。从1993年的患者体内转移中得到LB33-MEL.B细胞系。
图10A描绘了抗-E CTL克隆LB33-CTL-269/1对自身黑素瘤细胞的溶解活性，而图10B示出在经LB33-MEL.B-1细胞刺激后，由相同CTL克隆产生的TNF。刺激细胞(10,000个/微孔)已用3000个CTLs温育16小时。应用TNF敏感性WEHI-164c13细胞测定由CTLs释放的TNF浓度。通过加入1/100稀释的得自用杂交瘤细胞接种的小鼠的腹水用抗HLA-A24单克隆抗体C7709A2抑制CTL的刺激作用。
图11A和11B示出分析结果，其中用竞争结合分析检测了SEQ IDNO:17,18,19及3。
图12描绘了在51Cr释放分析中，SEQ ID NO:17与天然呈递HLA-B44的细胞结合应用所得结果。
图13概括了51Cr溶解分析的结果，其中靶细胞是天然HLA-B44阳性的，如癌细胞系。
图14示出了以竞争结合分析测试SEQ ID NO:17及3的研究结果。
图15A示出在51Cr释放分析中溶解分析结果，其中得自供体LB816的淋巴细胞对HLA-B*4402呈递细胞进行测试。图15B是使用得自供体LB822 CTL LB822的淋巴细胞与HLA-B*4403呈递细胞进行测试的平行信息。
图16示出证实特异于SEQ ID NO:17及HLA-B44分子复合物的CTL的特异性的数据。
图17示出证实特异于MAGE-3及HLA-B44分子的CTL的特异性的数据。
图18描绘了当天然呈递HLA-B44分子并也表达MAGE-3的细胞经用本申请中揭示的CTL测试时所得结果。
优选实施方案详述实施例1
在以下试验中应用已供研究者使用多年的黑素瘤细胞系LB33-MEL。还使用了衍生自其中的一个克隆，该克隆在后文称作LB33-MELcl。
从LB33患者取含单核血细胞的样品。将黑素瘤细胞系与含单核血细胞的样品接触。观测该混合物的黑素瘤细胞系的溶解，该溶解表明特异于由黑素瘤细胞呈递的肽及HLA分子的复合物的胞溶T细胞(“CTL”)存在于样品中。
所应用的溶解分析是一种铬释放分析法，参见Herin et al.,Int.J.Cancer 39:390-396(1987)中所述(该文引入本文作参考)。本文再次阐述该分析。体外培养靶黑素瘤细胞，然后在补加10mM HEPES及30％FCS(即胎牛血清)的DMEM中以107个细胞/ml将其再悬浮，并在37℃用200μCi/ml的Na(51Cr)O4温育45分钟。用补加10mMHepes的DMEM冲洗标记的细胞三次。将其在补加10mM Hepes及10％FCS的DMEM中再悬浮之后将含103个细胞的100μl等份布于96孔微板。加入在100μl相同培养基中的PBLs样品，分析以双份重复进行。将板在100g离心4分钟，并在37℃含5.5％CO2气氛中温育4小时。
将板再离心，收集并计数上清液的100μl等份。以下式计算51Cr释放百分率：
Figure A9719329900091
其中ER是观测到的实验51Cr释放，SR是经在200μl培养基中温育103个标记细胞所测定的自发释放，MR是经在靶细胞中添加100μl 0.3％TritonX-100所得的最大释放。
将那些呈高CTL活性的单核血样品经有限稀释加以扩增及克隆，并用相同方法再筛选。
用相同方法测试K562靶细胞。当使用EBV-B细胞时，唯一的改变是用补加5％FCS的Hank’s培养基代替DMEM培养基。
这些实验导致CTL克隆LB33-CTL-159/5的分离。图1示出该克隆可溶解肿瘤细胞，而不溶解EBV-B细胞或K562细胞。
根据同样方法分离到第二种CTL克隆即LB33-CTL-159/3。这些细胞系分别被称作“159/5”及“159/3”。该第二种CTL与159/5特异性不同。这可在两种抗原丧失变体分离后确定，其一由159/5而非159/3溶解，其二由159/3而非由159/5溶解。这些变体分别称作A-及B-。
然后将A-变体用159/5免疫筛选，并得到第三种变体，其既不能由159/5也不能由159/3溶解。该变体称作A-B-。图2描绘了导致变体的分离的溶解分析结果。
实施例2
令人感兴趣的是检测变体A-及B-的HLA表达模式。衍生母细胞系LB33-MEL的患者分型为HLA-A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7。当进行PCR表达分析时，会发现LB33-MELcl及B-变体可表达所有六种等位基因；但A-B-变体不能表达HLA-A28,B44及Cw7。结果可断定这些HLA分子中的一种呈递抗原导致经CTLs的溶解。下例进行进一步探索。
实施例3
将A-及B-变体的样品用已经克隆有HLA-A28,HLA-B44或HLA-Cw7其一的质粒pcDNA-Ⅰ/AmpⅠ转染。筛选后，参考Traversari,et al.,Immunogenetics 35:145-152(1992)所述用TNF释放分析法测试细胞。结果示于图3，示出HLA-B44明显参与抗原的呈递。
实施例4
一旦鉴别出HLA呈递分子，则要进行研究以鉴别是呈递的肽来源的后文称作“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”的分子。
为此从LB33-MELcl细胞系中分离总mRNA。应用已熟知技术，使用寡-dT结合试剂盒分离信使RNA。一旦分离出信使RNA，再使用标准方法，将其转录成cDNA。然后将cDNA与EcoRⅠ接头连在一起，并根据生产者指导克隆入pcDNA-Ⅰ/Amp质粒的EcoRⅠ位点。然后将重组质粒电穿孔进DH5αE.coli中(电穿孔条件：2500V,25μ法拉1脉冲)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)筛选转染的细菌，然后分成每库100个细菌的许多库。每库相当于大约50种不同cDNA，分析显示大约50％质粒包含一插入片段。将每库扩增至饱和状态，并经碱溶解，醋酸钾沉淀及苯酚提取分离质粒DNA，参见Maniatis et,al.分子克隆实验手册(Cold Spring Harbon,N.Y.,1982)。未使用铯梯度离心。
扩增的质粒随后被转染进真核细胞。在含有补加10％胎牛血清的DMEM培养基的组织培养平底微孔中以每孔15,000个细胞播种COS-7细胞样品。将细胞在37℃温育过夜，除去培养基，随后用含10％Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖，100μM氯喹及含来自LB33的HLA-B44的cDNA的100ng质粒的DMEM培养基以30μl/孔置换。在37℃温育4小时后，除去培养基并用含10％DMSO的50μl PBS置换。2分钟后除去该培养基并用200μl补加10％FCS的DMEM置换。
经过这种培养基的变化后，在37℃将COS细胞温育48小时。随后弃去培养基，并加入在100μl含10％库集人血清及25μ/ml IL-2的Iscove培养基中的2000个159/5细胞。24小时后取上清液，并以如Traversari et al.,Immunogenetics 35:145-152(1992)(该文引入本文作参考)中所述在WEHI细胞上分析以检测TNF含量。一个库刺激TNF释放高于背景，克隆这些细菌并用于以下试验。
实施例5
提取实施例4中克隆的细菌的质粒DNA，并以前述相同方式转染入一新COS细胞样品中，并再测试159/5对该细胞的刺激作用。在350/2克隆中发现一阳性克隆，数据示于图4A。
为证实所得结果，应用了得自美国典型培养物保藏中心的人绒毛癌细胞系JAR。该细胞系不表达HLA分子，也不能由CTLl59/5识别。当JAR用HLA-B44 cDNA转染时，其也不能由CTL159/5识别。而用HLA-B44及350/2cDNA共转染却导致溶解，见图4B所示。
提取来自阳性克隆的质粒，并用本领域已知技术测序。结果显示质粒插入物有1896碱基对长，并显示出不与数据库中的任何序列同源。该核苷酸序列在本文示为SEQ ID NO:1。
实施例6
为确定是肿瘤排斥抗原的肽，将均分为大约300碱基对的SEQ IDNO:1的片段经PCR扩增，克隆入pcDNA-1/Amp，随后遵循前例方法与编码HLA-B44的质粒共转染入COS细胞。这些实验导致鉴别出相应于SEQ ID NO:1的第683-955位氨基酸残基的区域编码抗原肽。将该区域与Khanna et al.,J.Exp.Med.176:169～176(7/92)所述肽相对比，申请日为1994年4月26日的08/233,305所述肽，即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe(SEQ ID NO:2)相应于这些残基。如此，合成相应于该序列的肽，并用于敏化HLA-B44+细胞系。结果示于图6A和6B，其示出使用EBV转化的B细胞(图6A)及前述B-变体(图6B)的51Cr释放分析结果。在加入CTL 159/5(效应器/靶比率为10∶1)之前，将该细胞在37℃用不同浓度的肽温育30分钟。用100～200μg/ml肽可得到半最大溶解。
实施例7
前述实施例1-6阐述了使用LB33-MELcl细胞系的研究工作。从LB33患者皮肤转移中也衍生了其它细胞系。如此细胞系之一是LB33-MEL.A-1，其被用于以下实施例中。
首先，将该细胞系以本文前述实施例1-6使用细胞系的相同方式进行应用(Herin等，文献同上)。用照射的肿瘤细胞(3/105细胞/孔)在2ml的补加10％库集人血清，天冬酰胺-各氨酰胺-精氨酸(分别为36μg/ml,216μg/ml,116μg/ml),2-巯基乙醇(0.05mM)及5U/ml人IL-4的Iscove培养基中刺激血单核细胞(106/孔)。在培养的第3天加入IL-2(10U/ml)。如前述实施例1检测肿瘤细胞对自身CTL的敏感度。该实验产生82个稳定的衍生自17个独立培养物的胞溶T淋巴细胞。所有这些CTL都是CD8+，其特异于肿瘤细胞，可溶解LB33-MEL.A-1细胞，但不能溶解K562或其自身的EVB转化的细胞。
实施例8
LB33-MEL.A-1可被自身CTL溶解的事实提示了下一实验，其是鉴定由确定的抗原丧失变体识别的抗原。
为此用前述自身CTL克隆LB33-CTL 159/3将细胞系样品筛选4次。每次筛选包括以上述相同方式用相似数目的CTL温育2-3×107个粘附的肿瘤细胞2-6小时。在每一轮中，温育后将CTL洗掉，并在下一轮筛选前将所存活的粘附肿瘤细胞扩增。
该程序可得一抗CTL159/3的克隆，但当用其它自身CTL测试时发现前述CTL 159/5可溶解该丧失变体，其它的包括204/26及202/1的CTL克隆也溶解该变体。见图6，标记为“MEL.A-1.1”的一栏。相似地可建立其它不能由这四种CTL克隆之一溶解但可由其它CTL克隆溶解的细胞系，见图6。这样由于四种截然不同的抗原丧失变体的鉴定可发现有至少4种不同抗原在LB33-MEL.A-1表面呈递，如图6所示，LB33-MEL.A-1抗原表达被认为是“A+B+C+D+”(被CTL159/3,159/5,204/26及202/1溶解)；MEL.A-1.1为A-B+C+D+(不能被159/3溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.2为A+B-C+D+(不能由159/5溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.3为A+B+C-D+(不能由204/26溶解，可被其它溶解)；MEL.A-1.4为A-B+C+D-(不能由202/1或159/3溶解)。进一步地分离到MEL.A-1.1.1细胞系，其为A-B-C+D-(只能由204/26溶解)。
当在这些细胞系上测试经实施例7鉴定的82个CTL时，鉴定出29个抗-A,29个抗-B,10个抗-C及14个抗-D克隆，提示没有其它抗原被呈递。
用抗-D CTL克隆202/1的筛选导致鉴定出一种对抗-A CTL克隆(159/3)也有抗性的的细胞系，用抗-B CTL筛选也是如此(即得到A-B-C+D-细胞系)。该结果提示A-D-和A-B-D-抗原丧失变体实际上是HLA丧失变体，抗原A,B和D共享相同的HLA呈递分子，或不同的I类分子与抗原丧失变体一起丧失。以下实验继续探讨该问题。
实施例9
衍生LB33细胞系的患者已经血清学分型为HLA-A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7。然后进行研究以检测细胞系对HLA I类基因的表达。
建立由PCR对DNA扩增的半定量条件以评价由不同LB33-MEL肿瘤细胞克隆对6种I类等位基因中每一种的表达。使用了Browning等人所提出的扩增回复突变系统(ARMS)PCR方法，该方法依赖在引物的3’末端完全配对的核苷酸以保证DNA扩增的特异性。参见Browning et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2842(1993)(引入本文作参考)。基于LB33分型时所得序列，合成能将6种等位基因的每一种与其它五种区别出的等位基因特异性引物(5’引物后接3’引物)。对A24:5’-GCCGGAGTATTGGGACGA和5’-GGCCGCCTCCCACTTGC(SEQ ID NO:5和6)对A28:5’-GGAGTATTGGGACCGGAAG和5’-GGCCGCCTCCCACTTGT(SEQ ID NO:7和8)对B13:5’-CGCCACGAGTCCGAGGAT和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCTA(SEQ ID NO:9和10)对B44:5’-CGCCACGAGTCCGAGGAA和5’-CCTTGCCGTCGTAGGCGT(SEQ ID NO:11和12)对Cw6:5’-CCGAGTGAACCTGCGGAAA和5’-GGTCGCAGCCATACATCCA(SEQ ID NO:13和14)对Cw7:5’-TACAAGCGCCAGGCACAGG和5’-CTCCAGGTAGGCTCTGTC(SEQ ID NO:15和16)
为进行表达的半定量测定，用每套引物进行27轮逆转录RNA的PCR扩增，发现DNA扩增在观测到的线性范围内。扩增的DNA量可用经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶目视估计。将该量与含来自LB33-MEL.A-1细胞的系列稀释的RNA的RT-PCR扩增产物的标准曲线相对比。考虑到β-肌动蛋白基因的表达水平，将样品的表达对RNA的完整性进行标准化。结果以相对于LB33-MEL.A-1细胞的表达水平表示。结果见下表1所示。“+++”表示表达相当于大于LB33-MEL.A-1细胞表达水平-半的表达，“++”指表达在LB33-MEL.A-1的表达的1/8～1/2之间，“+”指表达低于LB33-MEL.A-1的表达的1/8，“-”指没有表达。
表1衍生自LB33-MEL.A-1细胞的抗原丧失变体对I类HLA的表达
        LB33-        LB33-MEL.A-1肿瘤细胞抗原丧失变体
        MEL.A-1下述分子的表达
                     A-   B-   C-  A-D- A-B-D-A．         基因表达A24         +++          +++    +++    -     ++      +++A28         +++          +++    +++    +++   +       -B13         +++          +++    +++    +     +++     +++B44         +++          +++    +++    +++   ++      -Cw6         +++          +++    +++    +     +++     +++Cw7         +++          ++     +++    +++   +       -
由此可见，MEL.A-1细胞及B-变体对6种HLA等位基因的表达水平相似。A-变体显示对Cw7的表达近4倍的降低。其余抗原丧失变体显示三种等位基因表达降低。可发现C-细胞对HLA-A24,B13及Cw6表达水平降低，而A-D-及A-B-D-变体对A28,B44及Cw7表达水平降低。它提示A24-B13-Cw6及A28-B44-Cw7构成LB33患者的两种HLAI类单元型，且这些单元型的表达降低可能是由免疫筛选的肿瘤细胞对抗原表达的丧失的原因。
实施例10
以下实验设计用来证实在HLA基因表达及由CTL的溶解之间的相互关系。为此将以上所确定的HLA基因的表达与使用标准抗体分析获得的结果相比较。只有A24,A28及B13用特异于其的鼠抗体进行了测试(C7709A1特异于A24；2.28M1特异于A28,T48特异于B13)。抗体结合的检测是经用抗体温育，漂洗然后与荧光素缀合的山羊抗鼠Ig抗体接触来进行的。将细胞随后用标准技术流式细胞计数进行分析。
表2总结了该结果，也可见于图7。在下表2，所表明的HLA表达水平相当于示于图6的平均荧光强度。数值以相对于发现于LB33-MEL.A-1细胞中的水平表示。
结果显示当HLA表达水平估计在LB33-MEL.A-1细胞表达水平的1/8以下范围时，发现HLA表面分子水平为检测不到或勉强可检测，因此提示对于该特定HLA分子CTL的抗原呈递是不可能发生的。
鉴于此，并假定C-,A-D-及A-B-D-筛选的细胞由于缺乏HLA分子已丧失抗原的表达，似乎抗原A的I类呈递分子是A28或Cw7,B44是抗原B的I类呈递分子，A24或B13或Cw6是抗原C的I类呈递分子，而A28或Cw7是抗原D的I类呈递分子。
表2
        LB33-MEL.A-1    抗原丧失变体下述分子                    A-  B-  C- A-D-  A-B-D-的表达      表面抗原的表达A24         100             33    13    4    41      95A28         100             29    14    3    1       1B13         100             27    22    1    10      230
实施例11
上述实验随后的其它研究工作是明确地确定由LB33-MEL.A-1细胞表达的抗原的呈递分子。为此用传统磷酸钙沉淀法将已丧失特定HLA I类分子表达的肿瘤细胞用表达载体pcDNA3转染，该载体已克隆有特定的I类cDNA。该载体包含neoR标记。用1.5mg/ml的G418筛选转染子，然后将转染子用于刺激CTL克隆，使用的是如前例阐述的TNF分析法。
图8示出该结果。经用携带HLA-B44的质粒转染，抗原B的表达重建于A-B-D-细胞中但用含HLA-A28或HLA-Cw7的质粒转染不重建。用HLA-B13转染抗原C的表达重建于C-细胞中。4种其它抗-C CTL克隆也识别C-细胞，但5种其它抗-C CTL克隆包括CTL 179c/50不能识别；但这些CTL可识别用HLA-Cw6转染的C-细胞。这样可以推断有两组抗-C CTL克隆。一种识别由HLA-B13呈递的抗原，而另一种识别由HLA-Cw6呈递的抗原。对抗原D，经用HLA-A28转染，A-D-细胞重建为A-D+。尽管抗原A明显地由HLA I类分子呈递，(因为由抗-A CTL的溶解完全被抗-I类单克隆抗体W6/32所抑制)，但是没有一种cDNA重建抗原A的表达(即测试的HLA-A28,B44,Cw7)。可能是该抗原由非-A、B、C的I类分子呈递，其中有两种等位基因存在于LB33患者体内，其一与A28-B44-Cw7单元型一起在A-D-,A-B-D-细胞中丧失。
对抗原C的研究结果引起命名的改变。后文中有两种抗原，分别称作抗原Ca及抗原Cb。
实施例12
在进一步实验中，阐述了LB33-MEL.B细胞系的细胞能否由自身细胞系识别的问题。
以前述使用相同方式(Herin等)将照射的LB33-MEL.B.1细胞用于刺激自身淋巴细胞。该淋巴细胞在1990年或1994年取自LB33患者。
只有取自1994年的淋巴细胞溶解LB33-MEL.B-1细胞；但其不能溶解LB33-MEL.A细胞。因此LB33-MEL.B-1细胞系呈递一种在LB33-MEL.A-1上未发现的抗原。
本文所述实验与前述那些实验平行，并且正如在以前实验中一样建立了另一组CD8+CTL克隆。该CTL 269/1组的反应性见于图10A。注意到与“MEL.B-1”而不是“MEL.A-1”反应。由此确定的新抗原称作“LB33-E”。
在抗体抑制实验中，HLA-A24的mAbs抑制溶解。见图10B所示。因此“E”抗原由HLA-A24呈递。
实施例13
Fleischhauer et al.,Tissue Antigens 44:311～317(1994)(引入本文作参考)中教导了用于HLA-B44结合的共有基序。该基序被描述为一种9或10个氨基酸多肽，其中Glu主要在第二位，Tyr或Phe在最后一位(9或10位)，且疏水残基如Met在第三位。
MAGE-3 TRAP氨基酸序列在第167～176位包含一段相当于该基序的氨基酸序列。该氨基酸序列是Met Glu Val Asp Pro Ile Gly HisLeu Tyr(SEQ ID NO:17)。
已知HLA-B44基序含有至少两种重要亚型，称作HLA-B*4402及HLA-B*4403。该MHC分子在23％的高加索人中呈现。当将该数字与黑素瘤标准分析组合时，可推断15％高加索人黑素瘤患者应在其黑素瘤细胞表面呈递HLA-B44。这样令人大感兴趣的是确定SEQ ID NO:17的肽或其相关分子是否确实可用于鉴定HLA-B44细胞，并在与MHC分子结合后诱发其溶解。如前述实施例所述，SEQID NO:2的肽可与HLA-B44阳性细胞结合。设计一种肽，除了在第8位是Ala而不是Leu之外，与SEQ ID NO:2肽相似。将该新肽即Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQ ID NO:18)用SEQ IDNO:2进行竞争分析测试。参考得自本文未报道的实验结果而使用该肽。概括地，制备SEQ ID NO:2的衍生物，其中每个衍生物在未被SEQ ID NO:2中Ala占据的位置含有一个Ala。克隆159/5识别含SEQ ID NO:18的复合物比识别含SEQ ID NO:2的复合物稍好一些，使之成为优异的竞争分析试剂。如Storkus et al.,J.Immunol138:1657～1659(1987)所述，使用C1R细胞进行竞争。这些C1R细胞是MHC I类阴性的淋巴母样细胞。将C1R细胞如前述相同方法用HLA-B*4402的cDNA或HLA-B*4403的基因组DNA转染。该HLA-B*4402的cDNA见Fleischhauer等在Tissue Antigens 44:311～317(1994)中所阐述，而HLA-B*4403的基因组DNA见Fleischhauer等(1990)New Eng.J.Med 323:1818-1821(1990)所述。两文章均作为参考。
在抗-HLA I类单克隆抗体W6/32存在条件下(30％(v/v)杂交瘤细胞的培养基)，在37℃用51Cr将细胞标记一小时。这可提高细胞对T细胞呈递抗原肽的能力。
洗涤标记的细胞，并在无血清培养基中与各种浓度的竞争肽一起在20℃温育30分钟。这些肽包括：Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:3)，如前述其与HLA-B44分子结合；Phe Leu Arg GlyArg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)其由EBV基因EBNA-3A编码并与HLA-B8(Burrows,J.Exp Med 171:345-349(1990))结合；及SEQ ID NO:17。
然后加入在无血清培养基中的SEQ ID NO:18肽至终浓度为45ng/ml(C1R-B4402+细胞)或160ng/ml(C1R-B4403+细胞)。将细胞在20℃温育30分钟并用Iscove’s培养基加2％胎牛血清洗二次。以E∶T=20的比率加入在Iscove’s培养基及10％人血清中的CTL克隆LB33-CTL 159/5。3小时后检测C1R-B*4402及C1R-B*4403细胞51Cr的释放，见图11A和11B所示。图11所示数据明显示出竞争的证据。
实施例14
在实施例13所述之后进行另外的实验。
胞溶T细胞克隆(CTLs)衍生自两个受试者，分别称作LB816及LB822。这些受试者示出无癌症迹象。
使用密度梯度离心法从受试者中分离血单核细胞(BMCs)。使用已经用溴化氨乙基异硫脲翁处理的绵羊红血细胞将BMCs中的T淋巴细胞经rosetting提纯，然后用与磁性微珠缀合的抗-CD8单克隆抗体标记。经过磁场选出CD8+细胞，然后在-80℃贮于补加10％人血清，116mg/l L-精氨酸，36mg/ml L一天冬酰胺，216mg/ml L-谷氨酰胺，0.05mM 2-巯基乙醇及10％DMSO的Iscove培养基中。
将任何非rosetting的BMC在37℃在组织培养板上粘附2小时。弃去未粘附细胞，并将粘附的细胞在有IL-4(50U/m1)及GM-CSF(100ng/ml)的条件下培养7天。所得群体富集了抗原呈递细胞(“APCs”，在此处为树状细胞或巨噬细胞)。然后将5×105-5×106的这些细胞在400μl补加2.5μg/ml人β2微球蛋白及50μg/ml SEQID NO:17肽的Isove’s培养基中，在2ml孔中于37℃温育4小时。然后将粘附的、肽脉冲细胞以5000rads照射并洗涤。接着加入在补加1000U/ml IL-6及5ng/ml IL-12的培养基中的2×106个自身CD8+T细胞。
7天后，如上所述用粘附的自身BMCs再次刺激淋巴细胞并用肽脉冲。将5×106个BMCs在400μl上述含β2-微球蛋白和SEQ IDNO:17的Iscove’s培养基中于37℃粘附2小时。照射所有肽脉冲的粘附细胞并洗涤。然后加入在补加10U/ml IL-2及5ng/ml IL-7的培养基中的应答细胞。
在第14天，用自身BMCs再刺激淋巴细胞并用SEQ ID NO:17脉冲。将BMCs在含β2-微球蛋白及SEQ ID NO:17的Iscove’s培养基中以2×107细胞/ml温育。温育(20℃)2小时后，肽脉冲的BMCs被照射，洗涤并在补加IL-2及IL-7的培养基中以2×106细胞/ml重悬。将这些刺激细胞(2×106)样品加入含应答细胞的每个孔中。
在第21天克隆应答淋巴细胞，在已补加50U/ml IL-2及5U/ml IL-4的培养基中以10～0.3个细胞/孔播种在微孔中。然后通过加入同种异型EBV转化的B细胞(LG2-EBV-B)进行刺激，并在10,000rads，以每孔20,000个细胞照射，并加入(ⅰ)肽脉冲的HLA-B4402+细胞，或(ⅱ)肽脉冲的HLA-B4403+细胞。对(ⅰ)或(ⅱ)，以15,000rads，每孔8000个细胞进行照射。
以同在第1天相同方式将微培养物每周再刺激一次。一个改变是在第28及35天，每孔分别加入40,000及60,000个EBV-B细胞，而第21天加入20,000个细胞。
在第41-52天之间，增殖的微培养物等份被转至V-底微孔中以测试对经SEQ ID NO:17脉冲或未脉冲的HLA-B4402+或HLA-B4403+靶细胞的溶解活性。
将呈抗肽溶解活性的微培养物用5×104个照射的、肽脉冲的B4402+或B4403+细胞，在800μl补加50U/ml IL-2及5U/ml IL-4的培养基中再刺激。
7天后，将CTL克隆每周用2×105个照射的肽脉冲的B4402+或B4403+细胞与106个照射的LG2-EBV-B细胞一起再刺激。由此得到CTLs LB816-CTL-340A/1及LB822-CTL-346A/1。这些克隆分别特异于SEQ ID NO:17与HLA-B*4402或HLA-B4403的复合物。
实施例15
在一套进一步实验中，将不表达MAGE-3的HLA-B4402+或HLA-B4403+EBV转化的B细胞用51Cr在有单克隆抗体W6/32存在下，在37℃标记1小时，见Brodsky,et al.,J.Immunol 128:129-135(1982)。洗细胞并使用不同浓度的SEQ ID NO:17在无血清培养基中在20℃温育细胞30分钟。用51Cr释放分析测试实施例14所述的每个CTL,4小时后测定铬释放。
结果示于图12，示出该肽确实可激发溶解。
实施例16
在以下实验中，检测的是HLA-B44阳性的其它肿瘤细胞系。
所有测试的细胞系都用51Cr在37℃标记1小时。然后将其在Iscove’s培养基加2％胎牛血清中加入到各种数目的实施例14所述的两个CTL克隆中。4小时后测51Cr释放。还使用了对照组，见图13所示。需指出的是在分析前将LB33-MEL细胞系用IFN-γ2(50U/ml)温育48小时。
这些实验结果示于图13。CTL克隆LB816-CTL-340A/1和LB822-CTL-346A/1可溶解表达MAGE-3的肿瘤细胞，但不能溶解不表达MAGE基因的LB33-EBV-B细胞。CTL克隆LB822-346-A/1可溶解表达MAGE-3的HLA-B*4403+肿瘤细胞系MZ2-MEL，但不能溶解抗原丧失变体MZ2-MEL.61.2D-。
实施例17
为最终检测SEQ ID NO:17肽与HLA-B44的复合物是否刺激CTL，进行实验以检测肿瘤坏死因子的释放是否被刺激。
首先，用在表达载体pcDNA-1/AMP中的编码MAGE-3的cDNA(见Gaugler等，J.Exp.Med 179:921～930(1994))转染COS-7细胞，一种HLA-B*4402 cDNA克隆入载体pcDNA3，或将HLA-B*4403 cDNA克隆入载体pcDNA1/AMP。使用如Aruffo,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 84:3365～3369(1987)所述DEAE葡聚糖氯喹法。
在37℃将转染子温育24小时，后加入3000个CTLs/孔。在37℃将其温育18小时，然后收集上清液，并参见Espevik等J.Immunol.Meth.95:99-105(1986)所述经测试对TNF敏感的WEHI-16克隆13细胞的胞溶作用来确定TNF含量。
下表2示出该结果，其中TNF释放以pg/ml表示。在分析前将LB33-MEL及LB494-MEL用100U/ml IFNγ温育24小时。同样也测试了肿瘤细胞系LB33-MEL,LB494-MEL及MZ2-MEL。这些细胞系都表达MAGE-3 cDNA，并且是HLA-B*4402+(LB33-MEL,LB494-MEL)或HLA-B*4403+(MZ2-MEL)。这样就不需对这些细胞转染。结果显示有TNF释放，因此可推断SEQ IDNO:17由HLA-B44 MHC分子呈递，并且这些复合物可激发CTL活性。
表2抗MAGE-3.B44 CTL克隆的TNF产生CTL克隆              刺激细胞                           TNF(pg/ml)LB816-CTL-340A/1     COS                                0.7(B4402)              COS+MAGE-3                         0.6
                 COS+HLA-B4402                      0.5
                 COS+HLA+B4402+MAGE-3               33.7
                 LB33-MEL(B4402, MAGE-3+++)         74.9
                 LB494-MEL(B4402, MAGE-3+++)       32.3LB822-CTL-346A/1     COS                                1.2(B4403)              COS+MAGE-3                         1
                 COS+HLA-B4403                      1.2
                 COS+HLA-B4403+MAGE-3               26.6
                 MZ2-MEL(B4403,MAGE-3+++)          67.3
实施例18
前面呈现的结果结合如Brichard，等在Eur.J.Immunol.[CITE](1995)；Buseyne，等在J.Virol 67:694～702(1993)；Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci USA91:2105～2109(1994)；DiBrino等在Biochemistry34:10130～10138(1995)；Fleischhauer等在Tissue Antigens 44:311～317(1994)；Khanna等在J.Exp.Med.176:169～176(1992)；Kita等在Hepatology 18:1039～1044(1993)所述数据可示出：与HLA-B44分子结合的肽通常在第2位包含Glu，而在最后一位是Tyr或Phe。对MAGE-3序列分析揭示有4种肽序列符合这些限制要求，即：
Gln Glu Glu Gly Pro Ser Thr Phe (SEQ ID NO:20)
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (SEQ ID NO:17)
Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (SEQ ID NO:21)
Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (SEQ ID NO:22)
应用标准的固相技术合成这些肽，然后用于实验以检测它们是否与HLA-B44 MHC分子结合。
用于实验的是已经用Epstein Barr病毒(EBV)转化的C1R细胞。这些细胞与其它EBV转化的B细胞的不同之处在于其可表达MAGE-3基因。它们还是MHC阴性的，因此能作为用编码MHC分子的基因转染的主体。用编码HLA-B*4402的cDNA分子或用编码HLA-B*4403的基因组DNA转染样品，参见Fleischhauer等在TissueAntigens 44:311～317(1994)或Fleischhauer等在N.Eng.J.Med.323:1828～1822(1990)所述。将转染子在已补加10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养基中培养。
在竞争分析中，使用肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe(SEQID NO:18)，因为其已经报道可与HLA-B44结合，例见Coulie等在Proc.Natl.Acad Sci.USA 92:7976～7980(1995)中所述(该文引入本文作参考)。同样也报道了胞溶T细胞克隆LB33-CTL-159/5可识别并溶解在表面呈递肽与HLA-B44复合物的细胞。将该克隆与恒量SEQ ID NO:18及变化量的SEQ ID NO:20,17,21,22中的每种及以下对照肽：Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ IDNO:3)及Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)一起用于分析。
为进行该分析，将转染的C1R(C1R-B*4402,C1R-B*4403)转化的细胞在37℃用51Cr在有抗人I类MHC单克隆抗体W6/32存在下(30％w/v的杂交瘤细胞的培养基)标记1小时并洗3次。在20℃在无血清X-VIVO10培养基中于V形底微孔中将标记的细胞(80μl中1000个细胞)温育30分钟。如前所述以各种浓度加入受试肽，随后对C1R-B*4402以50 ng/ml，对C1R-B*4403以160ng/ml加入在40μl X-VIVO10培养基中的肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val AlaPhe(SEQ ID NO:18)。该肽已知可与HLA-B*4402及HLA-B*4403同型结合(例见Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7976～7980(1995)所述)。将已用SEQ ID NO:18刺激的细胞在20℃温育30分钟并随后在含2％胎牛血清的Iscove’s培养基中洗涤。然后将Coulie等所述可识别并溶解在其表面呈递SEQ ID NO:18和HLA-B44复合物的细胞的CTL克隆LB33-159/5，以20,000个细胞在150μl补加10％人血清的Iscove’s培养基中加入。
以各种浓度加入竞争肽，直至由CTL 159/5所致溶解被抑制50％。使用前述公式确定溶解。当不使用竞争肽时，C1R-B*4402转化子的溶解为58％，而C1R-B*4403的溶解为72％。
在下表中，SEQ IDNO:3及19用作对照。前者即：Ser Glu Ile TrpArg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:3)衍生自酪氨酸酶，并已知与HLA-B*4402及HLA-B*4403都可结合(Brichard et al.,Eur.J.Immunol.(1995))，而后者即Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu(SEQ ID NO:19)可与HLA-B8结合(Burrows,et al.,J.Exp.Med171:345～349(1990))。以下所示结果示出抑制由SEQ ID NO:8敏化的C1R-B44细胞溶解所需肽的浓度，以μM表示。肽              C1R-B*4402   C1R-B*4403SEQ ID NO:20    60            15SEQ ID NO:17    2             1SEQ ID NO:21    80            7SEQ ID NO:22    20            5SEQ ID NO:3     1             ＜1SEQ ID NO:19    ＞100         ＞100
可以看出，SEQ ID NO:17,20,21及22都可抑制C1R-B44细胞的溶解，这表明它们都可与HLA-B44分子结合。SEQ ID NO:17肽是HLA-B*4402及HLA-B*4403两者的最佳结合者。见图14所示，其中SEQ ID NO:17,19及3被描绘为对竞争肽浓度的溶解的函数。
在本文未报道的实验中，也测试了与SEQ ID NO:17同源的，衍生自MAGE-1,2,4,6及12的氨基酸序列的肽，并发现它们与HLA-B44分子结合。
实施例19
一旦明了各种肽确实可与HLA-B44同型结合，感兴趣的是检测该肽是否能用于激发特异于该肽与MHC分子复合物的胞溶T细胞克隆。
为检测此点，从称作LB816的供体内分离出粘附的周围血单核细胞，该供体未患癌症且是HLA-B*4402阳性的。
使用密度梯度离心法将粘附细胞首先从周围血单核细胞(“PBMCs”)样品中分离出。使用2-氨乙基-异硫脲翁溴化物处理的绵羊红血细胞经rosetting将T淋巴细胞从样品中提纯，参见Mikamo,J.Immunol.Meth.107:189～196(1988)所述，然后用与磁性微珠结合的抗-CD8单克隆抗体标记，随后通过磁场选出CD8+细胞。将这样分离的细胞冷冻贮存。未rosetting的PBMC在NUNC组织培养孔上在37℃粘附2小时，弃去未粘附的细胞。
然后将粘附的细胞在补加10％FCS，含有IL-4(50U/ml)及GM-CSF(100ng/ml)的RPMI培养基中培养7天。使用GM-CSF和IL-4是为提高培养物中树状细胞的比例。见Romain等在J.Exp.Med.180:83～93(1994)；Sallusto等在J.Exp.Med.179:1109～1118(1994)中所述。当分析细胞群时，发现那些取自供体LB816的大部分细胞是CD11C+及CD14+，而取自供体LB822的细胞多是CD11C+和CD14-。
5×105-5×106个这些抗原呈递细胞随后在2ml孔中在37℃,400μl补加入β2微球蛋白(2.5μg/ml)及50μg/ml SEQ ID NO:17的Iscove’s培养基中温育4小时。在此之后以50Gy照射细胞并洗涤。随后这些细胞如前所述用作自身CD8+细胞的刺激细胞。
建立6个自身CD8+细胞培养物。在每个培养物中，2×106个CD8+细胞与培养基结合(Iscove’s培养基加10％人血清，L-精氨酸，L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，0.05mM 2-巯基乙醇，1000U/ml IL-6和5ng/ml IL-12)。在第7和第14天，用刺激细胞刺激这些应答细胞。为此如上所述在第7天将5×106个PBMC在37℃,400μl含β2-微球蛋白及SEQ ID NO:17肽的Iscove’s培养基中粘附2小时。如同前述照射粘附的细胞并洗涤。加入在已补加10U/ml IL-2和5ng/ml IL-7的培养基中的应答淋巴细胞(如CD8+细胞)。在第14天，用已经肽脉冲的PBMC再刺激该淋巴细胞。在此再刺激中，将2×107/ml PBMCs在20℃，如前述含β2微球蛋白及SEQ ID NO:17肽的Iscove’s培养基中温育2小时。再一次将这些PBMCs照射，洗涤，并以2×106细胞/ml在补加IL-2和IL-7的培养基中再悬浮，随后再如前述加入到应答细胞中。
在第20天评价对已用SEQ ID NO:17敏化的LB816细胞(HLA-B*4402阳性细胞)的溶解活性。应用前述51Cr释放分析检测溶解活性。结果示于图15A。用未标记的K562靶细胞(50,000个细胞/孔)将效应细胞温育45分钟以抑制由类NK效应细胞所致的溶解。用1μM的SEQ ID NO:17(实心圆)或不用该肽(空心圆)将51Cr标记的靶细胞(1000个细胞/孔)温育。4小时后测51Cr释放。该6个自身CD8+培养物只有-个较好溶解靶细胞。
相似地，测试了HLA-B*4403阳性细胞(LB822)。结果见图15B所示，可见受试的5个培养物中有一个可较好溶解细胞。
基于以上这些结果，可推断抗-SEQ ID NO:17/HLA-B44细胞的前体的出现率是每107个CD8+淋巴细胞中出现1个。
该阳性培养物的淋巴细胞经有限稀释克隆。具体地，在第21天将这些细胞在补加50U/ml IL-2和5U/ml IL-4的培养基中培养。用已与1μg/ml SEQ ID NO:17在20℃温育1小时的照射的C1R-B*4402细胞(150Gy,8000个细胞/孔)刺激LB816细胞，并洗涤。LB822克隆用是HLA-B*4403阳性黑素瘤细胞的照射的MZ2-MEL细胞(100Gy,8000细胞/孔)刺激。将照射的同种异体LG2-EBV细胞(100Gy,20,000细胞/孔)作为饲养细胞加入。每周刺激一次微培养物。由这种方式分离出CTL克隆LB816-CTL-340/1和LB822-CTL-346/8。
实施例20
前述CTL克隆每周在2ml孔内用2×105个已用1μg/ml SEQ IDNO:17在20℃温育1小时的照射的C1R-B*4402或C1R-B*4403细胞刺激，然后洗涤，再加入照射的LG2-EBV细胞，所有细胞均在补加IL-2及IL-4的培养培养基中，参见前述。
为证实这样分离的CTL克隆可识别SEQ ID NO:17和HLA-B44的两种同种异型(allotypes)的复合物，将每种CTL克隆的10,000个细胞(每孔)与1000个/孔51Cr标记的淋巴母样B细胞(LB33-EBV,HLA-B*4402阳性的)合并，该淋巴母样B细胞已经在无血清培养基中与各种浓度的SEQ ID NO:17于20℃温育30分钟，然后洗涤。4小时后使用本文所述方法测51Cr的释放。
结果示于图15，示出对CTL340/1而言在大约40nM得到半最大溶解，而对CTL346/8而言在大约100nM得到半最大溶解。
在只在此处总结的实验中，测试了与SEQ ID NO:17同源的，但在9位氨基酸不同，以Val代替Leu的肽。该肽来自MAGE-6。尽管所讨论的特异性CTL克隆不能识别该肽，但其可有效地与HLA-B44亚型结合。因此，对于结合HLA-B44分子之目的，第9位是非关键的。
实施例21
进行进一步实验以检测SEQ ID NO:17是否可在表达MAGE-3基因的细胞上被天然呈递。
为检测此点，将COS-7细胞(15,000个/孔)用50ng的含MAGE-3的cDNA的pcDNAI/Amp及50ng的含HLA-B*4403的cDNA的pcDNAI/Apm或50ng含HLA-B*4402的cDNA的pcDNA3/Amp共转染，共转染可参见如Seed,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3365～3369(1987)所述已熟知的方法进行。同样也将NA8-MEL黑素瘤细胞共转染。这些细胞既不表达HLA-B44也不表达MAGE-3分子。为共转染NA8-MEL(30,000个细胞/孔)，应用LIPOFECTAMINE使用前供质粒的100ng样品。
共转染后，将细胞在37℃温育36小时，然后测试其在有CTL克隆340/1及346/8存在下对肿瘤坏死因子(TNF)产生的刺激能力。可参考在此简述的Lehman等在Eur.J.Immunol.25:340～347(1995)(引入本文作参考)所述方法检测TNF的产生。在这些实验中，将3000个CTL在含10％人血清及25U/ml IL-2的100μl Iscove’s培养基中加入。20小时后，收集上清液，并参考Espevik等在J.Immunol.Meth.95:99～105(1986)所述，通过测试其对WEHI 164 c13细胞的胞毒性来检测TNF的含量。在这些实验中，如图17所示，用单转染(MAGE-3或HLA-B*4402或HLA-B*4403)制备对照物。
图17示出，用两种构建物共转染的细胞刺激TNF释放，而用一个质粒转染的细胞则不能。该结果在两种细胞类型及两种CLT中均观察到。对MAGE-3/HLA-B44复合物的识别不需由COS-7细胞提供的高拷贝数，如对NA8-MEL研究所示。
实施例22
接着测试前述CTL即340/1及346/8的溶解呈递HLA-B44肿瘤细胞的能力。所用细胞包括已知可表达MAGE-3的细胞系，包括LB-33-MEL-A-1,LB373-MEL,LB494-MEL,LB831-BLC,LG2-MEL及MZ2-MEL.43，除LB831-BLC外均是黑素瘤细胞，LB831-BLC细胞是膀胱癌衍生的细胞系。MZ2-MEL.61.2是已丧失MAGE-3表达的黑素瘤细胞系。在图18中，如下所述，该细胞以空心圆(“○”)而不是实心圆(“●”)表示。除MZ2-MEL.43，MZ2-MEL.61.2及LG2-MEL之外，所有细胞在用于51Cr释放分析之前，在有50U/ml IFN-γ存在下温育48小时以上。在每种情况下，用在此不再重复的RT-PCR方法测试HLA-B*4402，或HLA-B*4403及MAGE-3的表达。
示于图18的结果示出：CTLS可识别并溶解这些天然表达MAGE-3/HLA-B44的细胞。
前述实验阐述了编码肿瘤排斥抗原前体即“TRAP”分子的分离的核酸分子。由此编码的蛋白质分子以一种产生至少一种由HLA-B44分子呈递的肿瘤排斥抗原或“TRA”的方式在细胞内被加工。尽管以前已明显观测到HLA-B44分子呈递衍生自酪氨酸酶的肽，但本发明的核酸分子不编码酪氨酸酶，且TRA不是酪氨酸酶衍生的。
本发明的肿瘤排斥抗原是在第2位为Glu，在第9或第10位为Phe或Tyr残基的分离的九肽。尤其优选的是具有下式的肽：Xaa GluXaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:23)或Xaa Glu Xaa ValXaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:24)，其中Xaa是任何氨基酸。这些通式包括SEQ IDNO:17及衍生自不同MAGE蛋白质且也与HLA-B44分子结合的同源肽。这些同源肽包括：
Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr (SEQ ID No:25)；
Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (SEQ ID No:26)；
Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (SEQ ID No:27)；
Met Glu Ala Asp Pro Thr Set Asn Thr Tyr (SEQ ID No:28)；
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (SEQ ID No:29)；
及Val Glu Val Val ArgIle Gly His Leu Tyr(SEQ ID No:30)。
这些肽相应于与SEQ ID NO:17同源的肽序列，分别发现于MAGE-1,2,4,5,6及12的相应位置。它们与HLA-B44分子结合的能力使其特别可用于鉴别在其表面呈递HLA-B44分子的细胞。
本发明的肽与已转让给本申请的受让人的美国申请08/233,305所揭示的肽相似，该肽为Set Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ IDNO:3)。Khanna等(前述)教导了一个十聚体即：Glu Glu Asn Leu LeuAsp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO:4)，但未讨论怎样修饰该十聚体才可产生有效的九聚体。
因此本发明包含可与HLA-B44分子结合然后激发CTL所致溶解的肿瘤排斥抗原。
如上所示，TRA和HLA分子的复合物可诱导胞溶T细胞应答，且如此的肿瘤排斥抗原和HLA-B44分子的分离的复合物也包含在本发明内，由前述核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体也包含在本发明内。给定结合特异性，肽也可用于方便地鉴别HLA-B44阳性细胞。
本发明还有许多用途，在此阐述其中一部分。首先，由HLA-B44分子特异性呈递的肿瘤排斥抗原及编码其平行肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的鉴别可使得技术人员能诊断特征在于TRAP表达的疾病。这些方法包括检测TRAP基因的表达和/或衍生自其中的TRA如由HLA分子呈递的TRA。其它TRA也可衍生自本发明的TRAP并由不同HLA分子呈递。在前者情况下，可以通过一些标准核酸检测分析进行检测，包括聚合酶链反应，或用标记的杂交探针分析。在后者情况下特别优选使用TRA与HLA复合物的结合配体如抗体进行分析。
TRAP基因的分离使得能分离TRAP本身，尤其是含SEQ ID NO:1氨基酸序列的TRAP分子。这些分离的分子的肽片段当作为TRA或TRA与HLA的复合物呈递时，可与佐剂等物质组合以生产对治疗特征在于TRAP分子的表达的疾病有用的疫苗。另外可从在表面呈递TRA/HLA复合物的细胞如非增殖性癌细胞，非增殖性转染子等中制备疫苗。在将细胞用作疫苗的所有情况下，它们可以是用编码诱导CTL应答所需的一种或两种组分的序列转染的细胞，或是不用转染而表达该两种分子的细胞。进一步地，TRAP分子，其相关TRA及TRA与HLA的复合物可用本领域熟知技术用于产生抗体。
本文中“疾病”意指任何肿瘤排斥抗原前体被表达的病理状态。该疾病的一实例是癌症，尤其是黑素瘤。
基于本文的治疗方法的前提是患者免疫系统的应答，导致TRA呈递细胞如呈递相关HLA分子的细胞的溶解。一种如此方法是将特异于复合物的CTL给予具有异常细胞表型的患者。体外开发这种CTL在本领域技术人员范围内。具体地，将如血细胞的细胞样品与呈递复合物并能诱发特异性CTL增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染子，如前述COS细胞。这些转染子在其表面呈递所需的复合物，并且当与相应CTL结合时刺激其增殖。如那些本文所用的COS细胞及其它合适的宿主细胞是广泛可得的。
称作过继转移的治疗方法(Greenberg,J.Immunol.136(5):1917(1986)；Reddel et al.,Seience 257:238(7-10-92)；Lyhch et al.,Eur.J.Immunol.21:1403-1410(1991)；Kast et al.,Cell 59:603-614(11-17-891)，是将呈递所需复合物的细胞与CTL结合以导致特异性CTLs的增殖。然后将增殖的CTL给予其特征在于呈递特定的复合物的某些异常细胞的细胞异常疾病患者。该CTL随后溶解异常细胞，从而达到所需治疗目的。
前述的治疗假定至少一些患者的异常细胞呈递HLA/TRA复合物。这非常容易被检测，因为本领域非常熟知鉴别呈递一特定的HLA分子的细胞的方法，及怎样去鉴别表达含指定序列的DNA的细胞的方法。一旦分离出，如此细胞与患者异常细胞样品一起用于检测在体外溶解。如果观测到溶解，则在如此治疗中使用特异性CTL会缓解与异常细胞相关的病症。一种更简便的方法是使用标准分析检测异常细胞的HLA表型并经如PCR扩增检测表达。
过继转移不是根据本发明的唯一治疗方式。也可在体内使用多种方式激发CTL。一种方法是如前述使用表达复合物的非增殖性细胞。用于该方法的细胞可以是那些正常表达复合物的细胞，如照射过的黑素瘤细胞或用一种或两种呈递复合物所需基因转染的细胞。Chen等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:110-114(January,1991)中举例说明了该方法，示出在治疗方法中使用表达HPVE 7肽的转染的细胞。可使用许多细胞类型。相似地可使用携带一种或两种相应基因的载体。尤其优选病毒或细菌载体。在这些系统中，相应的基因由如痘苗病毒或BCG菌携带，且该类物质“感染”宿主细胞。所得细胞呈递相应复合物并由随后增殖的自身CTL识别。通过将肿瘤排斥抗原或其前体与一种促进掺入呈递相应HLA分子的细胞中的佐剂合并可得到相似功效。TRAP被加工产生HLA分子的肽配体，而TRA不需进一步加工而被呈递。
本领域技术人员将清楚本发明的其它方面，在这里不需重复。
本文使用的术语及表达法是用作叙述术语而非限制性的，且在使用这些术语及表达法时没有排除使用任何同义词语的目的，同样也可在本发明范围内做各种修改。
序列表
(1)一般信息
  (ⅰ)申请人：让·赫尔曼，皮埃尔·库利，蒂尔瑞·博恩-法勒尔，皮埃尔·范德布鲁根，伊曼努尔·吕舍尔
  (ⅱ)发明名称：由HLA-B44分子呈递的肿瘤排斥抗原及其应用
  (ⅲ)序列数：30
  (ⅳ)通讯地址：
      (A)收信人：Felfe & Lynch
      (B)街道：805 Third Avenue
      (C)城市：纽约市
      (D)州：纽约州
      (E)国家：美国
      (F)邮编：10022
  (ⅴ)计算机可读形式
      (A)媒介类型：3.5英寸软盘，360kb存储
      (B)计算机：IBM
      (C)操作系统：PC-DOS
      (D)软件：Wordperfect
  (ⅵ)本申请资料：
      (A)申请号：
      (B)申请日
      (C)分类
  (ⅶ)在先申请资料：
      (A)申请号：08/602,506
      (B)申请日：1996年2月20日
  (ⅶ)在先申请资料：
      (A)申请号：08/531,864
      (B)申请日：1995年9月21日
  (ⅶ)在先申请资料：
      (A)申请号：08/373,636
      (B)申请日：1995年1月17日
  (ⅶ)在先申请资料：
      (A)申请号：08/253,503
      (B)申请日：1994年6月3日
  (ⅷ)律师/代理人信息
      (A)姓名：Norman D.Hanson
      (B)注册号：30,946
      (C)卷号：LUD 5436-PCT
  (ⅸ)电讯信息：
      (A)电话：(212)688-9200
      (B)电传：(212)838-3884
(2)SEQ ID NO:1的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：1896bp
       (B)类型：核酸
       (C)链性：单链
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1GCGGCGGTGG CGGAGGCGGA CACATTGGCG TGAGACCTGG GAGTACGTTG TGCCAAATCA    60TTGCCACTTG CCACATGAGT GTAAATGATG GCGGATGCAA GTATGTCCTC TGCCGATGGG   120AAAAGCGATT ATGGCCTGCG AAGGTGACAG CCATTATTCT GTAACTTCAG GACTTAGAAA   180TGACTTTCGG GTGACAAGTA AAATCTTGAT CAGGAGATAC CTAGGATTTG CTTCAGTGAA   240ATAATTGAGC CAGAACACGG TTGGCACTGA TTCTCGTTCC CCATTTAATG GGGTTTTGGT   300CTAGTGCTTC CAAGGTTACA CTTCCAGAAA TGTCTTTTTT TTTTCACACT AAAAAAAAAA   360AAAAGAATCA GCTGTAAAAA GGCATGTAAG GCTGTAACTC AAGGAAAGAT CTGGCAAGCA   420GCCCTGTGAT AGTAAATTAT GGTCGTGTTC AGGGAATGCT TTCCAGCAAT TCAGTAGACA   480GTGCTCAGCT GCAATGCAAA AGCCCAGGTC CTTGTCTTTG TCTGCCACTG GCCTCTCATG   540CCTCAGTTTC CCCATCTGTG AAACAATGGG GATTGGACCA AATATCTGAA ATCCCATGGT   600TATAGGCCTT CAGGATTACC TGCTGCATTT GTGCTAAAGT TTGGCACTGT TTCTCACTGT   660CAGCTGTTGT AATAACAAGG ATTTTCTTTT GTTTTAAATG TAGGTTTTGG CCCGAACCGC   720GACTTCAACA AAAAATAAGA GAAGAAAGGA ATATTTTCTA GCTGTGCAAA TCCTCTCCCT   780AGAGGAAAAG TTAATTGTTG TGTTGTTTTA ATACTGTTTT TTCCCGTGTA GATTTCTGAT   840ACTTCAATCC CCTACTCCCC CAAAACAGTT GAAGCCCAGC CCACTCTTAA TGGGCTTATT   900CACCATTTGT GTAATTCATT AATGCTCATA ATAACCTCAT GAGAAAGCAA CTAGTTTGAT   960TTTATGTCAG TTTGGAAGCT GAAGATCCAA ACGAGGCATT CTGTGAGATC TATGGAGAGA  1020TTGGTACAAA CACTGAATAC ATGTAAATTA TACTCAGGGT AGACCCTATT TGTGGTTAAA  1080ATAGGGATAT TTCCTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTGACTGT TTCTTAATCA GTGCCATGCC  1140AGGAAAATAG GGATGTTTCC TTCCCAGAGA TCTGTGTGTC TTTTTTCAGA AACGTCTGTG  1200ACAGGCCCAT CAATTTTGAA ATATTTGGTT TTTGAGCCTG TCACTCTAAA CCAGCGTTTA  1260ACGTTCAAAA GGCAAATAAC TGATGACCAG GCGGCACATT GTTCTGCTCC GTGAGTGTCT  1320GGCACTGGGA AAGGTGTAGA TTGTCTAGAA TGACAGCAAT TCCGACGCCC CAGTCAGTCC  1380TGCGTGATTG TGGCGAGGGC GCGTCTGGCA CCGGGAAGGT GTAGATCATC TAGAATGACG  1440GCGATTCCGA CGCCCCGGTC AGTCCTGCGT GATTGGCGAG GGTGCATCTG TCGTGAGAAT  1500TCCCAGTTCT GAAGAGAGCA AGGAGACTGA TCCCGCGTAG TCCAAGGCAT TGGCTCCCCT  1560GTTGCTCTTC CTTGTGGAGC TCCCCCTGCC CCACTCCCTC CTGCCTGCAT CTTCAGAGCT  1620GCCTCTGAAG CTCGCTTGGT CCCTAGCTCA CACTTTCCCT GCGGCTGGGA AGGTAATTGA  1680ATACTCGAGT TTAAAAGGAA AGCACATCCT TTTAAACCAA AACACACCTG CTGGGCTGTA   1740AACAGCTTTT AGTGACATTA CCATCTACTC TGAAAATCTA ACAAAGGAGT GATTTGTGCA   1800GTTGAAAGTA GGATTTGCTT CATAAAAGTC ACAATTTGAA TTCATTTTTG CTTTTAAATC   1860CAGCCAACCT TTTCTGTCTT AAAAGGAAAA AAAAAA                             1896
(2)SEQ ID NO:2的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：9个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe
               5
(2)SEQ ID NO:3的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：9个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：HLA-B44结合肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
               5
(2)SEQ ID NO:4的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：10个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：Khanna肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe
             5                   10
(2)SEQ ID NO:5的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5
GCCGGAGTAT TGGGACGA                                        18
(2)SEQ ID NO:6的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：17bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6
GGCCGCCTCC CACTTGC                                         17
(2)SEQ ID NO:7的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：19bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7
GGAGTATTGG GACCGGAAG                                       19
(2)SEQ ID NO:8的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8
GGCCGCCTCC CACTTGT                                         18
(2)SEQ ID NO:9的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9
CGCCACGAGT CCGAGGAT                                        18
(2)SEQ ID NO:10的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10
CCTTGCCGTC GTAGGCTA                                        18
(2)SEQ ID NO:11的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11
CGCCACGAGT CCGAGGAA                                        18
(2)SEQ ID NO:12的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12
CCTTGCCGTC GTAGGCGT                                        18
(2)SEQ ID NO:13的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：19bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13
CCGAGTGAAC CTGCGGAAA                                       19
(2)SEQ ID NO:14的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：19bp
      (B)类型：核酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14
GGTCGCAGCC ATACATCCA                                       19
(2)SEQ ID NO:15的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：19bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15
TACAAGCGCC AGGCACAGG                                       19
(2)SEQ ID NO:16的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：18bp
       (B)类型：核酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：核酸
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：PCR引物
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16
CTCCAGGTAG GCTCTGTC                                        18
(2)SEQ ID NO:17的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：10个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：Mage-3肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:17
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:18的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：9个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe
               5
(2)SEQ ID NO:19的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：9个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19
Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu
                5
(2)SEQ IDNO:20的信息：
   (ⅰ)序列特征：
       (A)长度：8个氨基酸
       (B)类型：氨基酸
       (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
       (A)名称/关键：Mage-3肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20
Gln Glu Glu Gly Pro Ser Thr Phe
               5
(2)SEQ ID NO:21的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-3肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21
Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe
              5                   10
(2)SEQ ID NO:22的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：9个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-3肽
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22
Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe
              5
(2)SEQ ID NO:23的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：HLA-B44基序
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23
Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:24的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：HLA-B44基序
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24
Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:25的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-1/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25
Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:26的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-2/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26
Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:27的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-4/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:27
Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:28的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-5/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:28
Met Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:29的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-6/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:29
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr
              5                   10
(2)SEQ ID NO:30的信息：
   (ⅰ)序列特征：
      (A)长度：10个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓朴结构：线性
   (ⅱ)分子类型：蛋白质
   (ⅸ)特征：
      (A)名称/关键：Mage-12/HLA-B44
   (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:30
Val Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr
               5                   10

Claims (6)

1、与HLA-B44分子结合的分离的肽，其包括如下氨基酸序列：
Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:23)，
或氨基酸序列：
Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr(SEQ ID NO:24)，
条件是所述肽不是SEQ ID NO:17。
2、如权利要求1的分离的肽，选自由SEQ ID No:25,SEQ ID No:26,SEQ ID No:27,SEQ ID No:28,SEQ ID No:29及SEQ ID No:30组成的一组。
3、在样品中鉴别HLA-B44阳性细胞的方法，包括将所述样品与权利要求1的肽接触，并检测所述肽的结合作为对在所述样品中存在HLA-B44阳性细胞的指征。
4、分离的、特异于SEQ ID NO:17与HLA-B44分子的复合物的胞溶T细胞克隆。
5、权利要求4的分离的胞溶T细胞克隆，其中所述HLA-B44分子是HLA-B*4402分子。
6、权利要求4的分离的胞溶T细胞克隆，其中所述HLA-B44分子是HLA-B*4403分子。
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