KR19990087064A - Hla-b４４ 분자에 의해 인식되는 종양 거부 항원 및그 용도 - Google Patents

Hla-b４４ 분자에 의해 인식되는 종양 거부 항원 및그 용도 Download PDF

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피에르 쿨리
티에리 분포레
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에드워드 에이. 맥더모트 쥬니어, 로이드 제이. 올드
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Abstract

HLA-B44 분자에 의해 나타타는 종양 거부 항원이 개시되어 있다. 이들 펩티드는 진단 및 치료 방법에 있어서 유용하다. 종양 거부 항원은 MAGE 종양 거부 항원 전구체에서 유래한다.

Description

ＨＬＡ-Ｂ４４ 분자에 의해 인식되는 종양 거부 항원 및 그 용도
포유류의 면역 체계가 외래 또는 이질직인 물질을 인지하고 반응하는 과정은 복잡하다. 그 체계의 한 중요한 면은 T 세포 반응이다. 이 반응은 T 세포가 인간 백혈구 항원 (human leucocyte antigen, "HLA")으로 불리는, 세포 표면 분자 또는, 주 조직적합성 항원 (major hisocompatibility complexes, "MHCs")와 펩티드의 복합체를 인지 및 반응하는 것을 요한다. 펩티드는 또한 HLA/MHC 분자도 나타내는 세포에 의해 처리되는 큰 분자로부터 유래한다. 이런 면에서 문헌 [Male et al, Advanced Immunology (J.P. Lipincott Company, 1987)]특히, 6-10장을 참조하라. HLA 분자와 펩티드의 특정 결합에 특정 T 세포를 요하므로, T 세포와 HLA/펩티드의 복합체간의 상호작용은 제한된다. 만일 특정 T 세포가 존재하지 않으면, 그 상대 복합체가 존재하더라도 T 세포 반응은 없다. 유사하게, 만일 특정 복합체가 없으나, T 세포가 있으면, 반응은 없다. 이러한 메카니즘은 외래 물질에 대한 면역계의 반응, 자가면역 병리학, 및 세포성 이상에 대한 반응과 관계가 있다. 최근에는, 단백질을 HLA 결합 펩티드 내로 처리하는 메카니즘에 대해 많은 연구가 집중되었다. 이런 점에서, 문헌 [Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al, Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Sceince 257: 964 (1992)]를 참조하라.
T 세포가 세포성 이상을 인지하는 메카니즘은 또한 암과 관련이 있다. 예를 들어, 본 명세서의 일부인 PCT 출원 PCT/US92/04354 (1992. 5.22. 출원, 1992.11.26 공개)에는, 펩티드 내로 처리되는 일군의 유전자들이 개시되어 있는데, 이 펩티드는 세포 표면상에 발현하여, 특정 CTL에 의한 종양 세포의 용해가 일어난다. 유전자는 "종양 거부 항원 전구체" 또는 "TRAP" 분자들을 암호화하고, 여기에서 유래된 펩티드들을 "종양 거부 항원" 또는 "TRA" 로 명명한다. 이 유전자 군에 대한 정보가 더 필요하다면, 문헌 [Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); Van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991)]을 참조하라. 또한 본 명세서의 일부인 미국 특허 제5,32,774호를 참조하라.
본 명세서의 일부인, 미국 특허 제5,405,940호에서는, 노나펩티드가 HLA-A1 분자에 결합된다고 기술하고 있다. 여기에는 특정 HLA 분자에 대한 특정 펩티드의 공지된 특이성이 주어지면, 한 HLA 분자를 결합하는 하나의 특정 펩티드를 예상할 수 있다고 기술되어 있다. 상이한 개체는 상이한 HLA 표현형을 가지기 때문에, 이는 중요하다. 그 결과, 특정 HLA 분자에 대한 상대로서 특정 펩티드를 동정하는 것이 진단 및 치료의 결과를 가지는 반면에, 이들은 특정 HLA 표현형을 가지는 개체에 대해서만 관련된다. 세포성 이상은 하나의 특정 HLA 표현형에만 국한되지 않으므로, 이 분야에 대한 연구가 더 필요하고, 목표하는 치료법은 논의대상인 이상 세포의 표현형에 대한 지식을 요한다.
티로시나아제 효소는 티로신을 디히드록시페닐알라닌 또는 "DOPA"로 전환시키는 반응을 촉진시키고, 멜라닌세포(melanocyte)에 선택적으로 발현된다(Muller et al, EMBOJ 7:2715 (1988)). 인간 효소에 대한 cDNA에 대한 초기의 보고가 미국 특허 제4,898,814호에 있다. 이후의 문헌 [Bouchard et al., J. Exp. Med. 169: 2029 (1989)]에는 약간 상이한 서열이 나타나있다. 이 효소에 대한 억제기는, 염색체 질병과 관련이 있으므로, 이를 동정하는데 많은 노력이 들어갔다. 이러한 문헌의 예로는 세계 공보 제WO9116302호 (Jinbow); 미국특허 제5,077,059호 (Mishima et al.); 및 미국특허 제4,818,768호 (Nazzaropor)가 있다. 당업자에게는 유사한 물질에 대한 다른 문헌도 익숙할 것이다.
본 명세서의 일부인 미국 특허 출원 제08/081,673호 (1993. 6.23)에는 티로시나아제를 외래 항원 또는 TRAP 분자와 유사한 방법으로 처리될 수 있음이, 즉 흑색종과 같은 특정 세포성 이상에서는, 티로시나아제가 처리되고 여기에서 유래한 펩티드가 특정 이상 세포상에 HLA 분자와의 복합체를 형성한다고 기술되어 있다. 이들 복합체는 세포용해성 T 세포 ("CTLs")에 의해 인지되고, 이어서 나타나는 세포를 용해한다. 이 놀랍고 예상하지 못한 현상의 분파도 논의하였다. 현재 HLA-A2 분자에 의해 나타나는 종양 거부 항원으로 활동하는 다른 펩티드들도 발견하였다. 이들은 본 명세서의 일부인 출원번호 제08/203,054호 (1994.2.28)에 기술되어 있다.
본 명세서의 일부인, 미국 특허출원 제08/233,305호(1994.4.26)는 티로시나아제가 HLA 분자에 의해 나타나는 항원으로 처리될 수 있음을 개시하고 있다. 이 발견은 매우 중요한데, 왜냐하면 모든 개체가 다 HLA-A2+이지 않기 때문이다. 그러나, 티로시나아제가 HLA-B44 표현 펩티드로 처리된다는 사실이 모든 HLA-B44+종양의 진단 및 치료에 대한 보편적인 접근법을 제공하지는 않는데, 이는 티로시나아제 발현이 보편적이지 않기 때문이다. 더욱이, 티로시나아제가 종양 세포 뿐만 아니라 정상세포에 의해서도 발현된다는 사실은 치료 분야에서 조심할 점이다.
인구 분석결과 코카서스 인종의 약 22-24%가 HLA-B44 분자를 발현한다. 문헌 [Imanishi, et al., in Tsuji et al., ed., "HLA 1991, Vol. I, XIthInternational Histocompatibility workshop and Conference", Oxford University Press, 1991; Lee in Lee, ed., The HLA Syster: A new Approach. Springer, pp. 141-178 (1990)]을 참조하라. 종래기술에 의하면 모든 전이성 흑색종은 MAGE-3을 발현한다 (Brasseur, et al., Int. J. Cancer 63: 375-380 (1995)). 따라서, 코카서스 인종의 전이성 흑색종의 약 17%에는 표면에 HLA-B44와 MAGE-3의 복합체로 유도된 펩티드가 인식된다. 문헌 [Fleischhauer, et al., Tissue Antigens 37: 133-137 (1991); Petersdorf, et al., Tissue Antigens 44: 211-216 (1994): Yao, et al., Immunogenetics 40: 310; Yao, et al., Human Immunol 42: 43-60 (1995); Yao, et al., Immongenetics 41: 387 (1995)]에서 볼수 있는 바와 같이, 5개의 상이한 HLA-B44 대립유전자들이 동정되었다. HLA-B44를 발현하는 코카서스 인종중에서, 61%가 HLA-B+4402 대립유전자를 나타내고, 36%가 대립유전자 HLA-B+4403을 나타낸다(문헌 [Yao, et al., Human Immunol. 42: 54-60 1995]참조). 이 두 대립유전자 간에는 아미노산 156이 다르다. HLA-B44+4402에는, 이 위치에 Asp가 있고, HLA-B44+4403에는 Leu가 있다. 연골 타가이식 거부(bone marrow allograft rejection) 및 이식조직 대 숙주 질병(graft vs host disease)이 HLA-B44+4402 및 HLA-B44+4403에 관해 상이한 제공자와 수령인에서 관찰되었다. 아미노산 156은 α2 나선의 중간에 위치하고 펩티드 결합 부위로 연장되기 때문에, 이들 상이한 HLA-B44 대립유전자가 상이한 펩티드를 나타내는지를 측정하는 것은 흥미로운 일이다.
문헌 [Khanna, et al., J. Exp. Med. 176: 169-179 (1992년 7월)]에는 이하에서 설명할 HLA-B44 결합 펩티드가 개시되어 있다. 칸나의 펩티드는 여기에서 청구하는 펩티드와는 관계가 없다.
문헌 [Kita, et al., Hepatology 18(5): 1039-1044 (1993)]에는, HLA-B44에 결합되고 용해를 자극한다고 주장되는 20개의 아미노산 펩티드가 개시되어 있다.
문헌 [Thorpe, et al., Immunogenetics 40: 303-305 (1994)]에는, HLA-B44에 결합하는 두개의 펩티드의 정렬 및 일반적인 결합 모티브에 대해 논하고 있다. 상기 문헌에는 위치 2에 음전하를 띠는 아미노산, 위치 9에 소수성 또는 양전하의 아미노산에 대해 논하고 있다.
문헌 [Fleischhauer, et al., Tissue Antigens 44:311-317 (1994)]에는 HLA-B44 결합 펩티드에 대한 연구가 실려있다.
종양 거부 항원 전구체를 발현하는 MAGE-3이 HLA-B44 분자에 의해 나타나는 하나의 종양 거부 항원으로 처리된다는 것이 이제 밝혀졌다. 이 펩티드가 역시 MAGE-3로부터 유래하고, N-말단에 첨가된 단일의 아미노산에 의해 HLA-A1에 결합되는 펩티드와 다르다는 것은 흥미있다. 이는 특히 본 발명의 주제이다.
본 출원은 출원번호 제08/253,503호 (1994.6.3 출원, 특허번호 제 5,589,334호)의 CIP 출원인 제08/373,636호 (1995.1.17)의 CIP 출원인 출원번호 제08/531,864호(1995. 9.21)의 CIP 출원이다. 모든 출원은 본 명세서의 일부로 한다.
본 발명은 종양 거부 항원(tumor rejection antigen) 전구체에서 유래되고 HLA 분자, 특히 HLA-B44에 의해 인식되는(presented by HLA-B44), 단리된 펩티드, 및 그 용도에 관한 것이다. 또한, 이는 이상 세포가 이들 펩티드와 HLA 분자의 복합체를 나타내는 세포성 이상 상태로 진단되는 개체를 구별하는 능력, 인식된 펩티드 및 그 분파에 관한 것이다.
도 1은 3개의 상이한 세포주 (LB33-MELc1, LB33 EBV-B 및 K562)를 사용한, 세포용해성 T 세포 클론 159/5에 의한 크롬 방출 분석의 결과를 도시한다. 데이타는 효과기(effector)/타게트 비 대 용해 %로 나타낸다.
도 2는 세포 변이체 "A-" "B-" 및 "A-B-"를 동정하는 용해 연구 결과를 도시한다. 다시, 크롬 방출 분석법을 사용하였다. 세포주 LB33-MELc1은 A+B+로서, 이는 CTL 세포주 양쪽에 양성 용해를 나타낸다. CTL 159/93은 항A이고, CTL 159/5는 항B이다.
도 3은 변이체 A-B-가 제어 세포주에 비해, HLA-A28, HLA-B44 및 HLA-Cw7 각각의 부호 서열로 감염되었을 때 얻어지는 결과를 도시한다. 결과는, CTL 159/5를 사용하고, 민감성 TNF 방출 분석 (pg/ml)으로 표시한다.
도 4는 CTL 159/5에 의한 TNF 방출량을 도시하며, 여기서 COS 세포는 HLA-B44, 또는 HLA-B44 및 본 발명에 따른 핵산 분자로 감염되었다.
도 5A는 CTL 159/5와 접촉하였을 때, EBV-B 세포에서의51Cr 방출을 도시한다.
도 5B는 유사하나, LB33-MEL B-세포를 사용한 경우이다. 도 5A 및 5B에 있어서, 본 발명의 항원성 펩티드는 CTL과 접촉하기 전에 세포와 접촉한다.
도 6은 흑색종 클론주 LB33.MEL.A-1로부터 유래한 항원 손실 변이체에 대한 각종 자가조직 CTL 클론의 용해 활동도를 도시한다.
도 7은 항원 손실 변이체 LB33.MEL.A-1에 의한 HLA-A24, A28 및 B13 분자의 발현 결과를 도시한다. 특정 HLA 분자에 대해 종양 세포를 쥐의 항체와 함께 배양한 후, 플루오레세인이 부착된 양의 항쥐 항원으로 표지하였다.
도 8은 항원 손실 변이체로 자극되고, 각종 HLA 대립유전자로 감염된 CTL 클론에 의한 종양 괴사 인자(TNF)의 생산량을 나타낸다. 감염되지 않은 LB33-MEL.A-1 세포는 제어군으로 사용하고, 항원 손실 변이체도 마찬가지이다. 사용한 CTL 클론은 각각, 항A, 항B, 항Ca, 항Cb, 항D CTL에 대응되는 159/3, 159/5 및 204/26, 179c/50 및 202/1이다.
도 9는 도 6 및 8에서 설명한 CTL 클론의 세포용해성 활동도에 관한 추가의 데이타를 나타낸다. 세포주 LB33-MEL.A는 1988년 외과수술에서 얻어졌다. 세포주 LB33-MEL.B는 1993년 환자에게서 발병된 전이로부터 얻어졌다.
도 10A는 자가조식의 흑색종 세포에 대한 항E CTL 클론 LB33-CTL-269/1의 용해 활동도를 도시하고, 도 10B는 LB33-MEL.B-1 세포에 의한 자극 이후에 동일한 CTL 클론에 의한 TNF의 생산량을 나타낸다. 자극기 세포(10,000/미세웰)은 3000개의 CTL과 함께 16시간동안 배양하였다. CTL에 의해 방출된 TNF의 농도는 TNF 민감성 WEHI-164c13 세포를 사용하여 측정하였다. 하이브리도마 세포로 접종한 쥐로부터 얻어진 복수액의 1/100 희석액을 첨가하여, 항 HLA-A24 단항체 C7709A2를 사용하여 CTL 자극을 억제하였다.
도 11A 및 11B는 서열번호 17, 18, 19 및 3을 경쟁적 결합 분석물에서 시험한 분석 결과물을 도시한다.
도 12는51Cr 방출 분석법에서, 서열번호 17을 자연적으로 HLA-B44를 나타내는 세포와 접촉시켜 사용할 결과를 나타낸다.
도 13은 타게트 세포가 암 세포주와 같은, 자연적으로 HLA-B44 양성일 때의51Cr 용해 분석의 결과를 요약한다.
도 14는 경쟁적 결합 분석법에서 서열번호 17 및 3을 시험한 연구 결과를 나타낸다.
도 15A는51Cr 방출 분석시, 용해 분석의 결과를 나타내는데, 여기서 제공자 LB816으로부터 얻어진 임파구는 HLA-B*4402를 나타내는 세포에 대해 시험하였다. 도 15B는 제공자 LB822 CTL LB822로부터 얻어지는 임파구를 사용하여 HLA-B*4403을 나타내는 세포와 대등한 정보를 나타낸다.
도 16은 서열번호17 및 HLA-B44 분자의 복합체에 특이적인 CTL의 특성을 보여주는 데이타를 나타낸다.
도 17은 MAGE-3 및 HLA-B44에 특이적인 CTL의 특성을 보여주는 데이타를 나타낸다.
도 18은 자연적으로 HLA-B44 분자들을 나타내고 또한 MAGE-3을 발현하는 세포를 본 출원에서 논한 CTL과 함께 시험할 결과의 요약이다.
<실시예 1>
수년간 연구자들이 이용한 흑색종(melanoma) 세포주 LB33-MEL을 이하의 실험에 사용하였다. 또한 여기에서 유래한 클론도 사용하였다. 이하에서 상기 클론을 LB33-MELc1이라고 한다.
단핵성 혈구를 포함하는 샘플을 환자의 LB33에서 수거하였다. 흑색종 세포주를 샘플을 포함하는 단핵성 혈구에 접촉시켰다. 흑색종 세포주가 용해되는 동안 혼합물을 관찰한 결과, 이 용해로 인해 흑색종 세포에 의해 펩티드와 HLA 분자의 복합체에 특이적인 세포용해성 T 세포(cytolytic T cell, "CTLs")이 샘플에 존재함이 나타났다.
채용된 용해 분석물은 문헌 [Herin et al., Int. J. Cancer 49:390-396 (1987)](상기 문헌은 본 명세서의 일부로 한다)에 따른 크롬 방출 분석물이었다. 그러나, 상기 금속물은 여기에 개시되어 있다. 타게트 흑색종 세포를 시험관(in vitro)에서 성장시킨 다음, 107세포/ml의 DMEM에 재현탁시키고, 10 mM HEPES 및 30% FCS에서 (즉, 소 태아의 혈청에서) 보충한 다음, 37℃에서 200 μCi/ml의 Na(51Cr)O4로 45분간 배양하였다. 표지된 세포를 DMEM으로 세번 세정하고, 10 mM Hepes로 보충하였다. 이어서 이들을 10 mM Hepes와 10% FCS로 보충된 DMEM에서 재현탁한 다음, 103개의 세포를 포함하는 100 ㎕ 분획을 웰 플레이트 96개에 분배시켰다.
PBL 샘플을 동일한 배지 100 ㎕에 첨가시키고, 분석을 2회 행하였다. 혈소판을 4분간 100 g에서 원심분리한 다음, 37℃의 5.5% CO2분위기에서 4시간동안 배양하였다.
혈소판을 한번 더 원심분리하고, 상층액 분획물 100 ㎕를 수집한 후 계산하였다.51Cr의 방출 백분율은 다음과 같이 계산한다:
%51Cr 방출량 = (ER-SR)/(MR-SR) × 100
여기서, ER은 관찰된, 실험51Cr 방출량이고, SR은 200 ㎕의 단독 배지 내에 103개의 표시된 세포를 배양함으로써 측정된 자발적 방출량이고, MR은 타게트 세포에 0.3% 트리톤(Triton) X-100 100 ㎕를 첨가함으로써 얻어지는, 최대 방출량이다.
높은 CTL 활동도를 보이는 이들 단핵성 혈액 샘플을 제한 희석(limiting dilution)을 통해 증량 및 클로닝하고, 동일한 방법으로 다시 스크리닝하였다.
동일한 방법을 타게트 K562 세포를 시험하는데 사용하였다. EBV-B 세포를 사용할 때, DMEM 배지를 5% FCS로 보충된 행크 배지로 대체하는 것이 유일한 변화이다.
이들 실험에 의해 CTL 클론 LB33-CTL-159/5를 단리시켰다. 도 1은 이 클론이 EBV-B 세포 또는 K562 세포가 아니라, 종양 세포를 용해시켰음을 보여준다.
같은 방법으로, 2차 CTL 클론, 즉, LB33-CTL-159/3을 단리시켰다. 이들 주들은 "159/5" 및 "159/3"으로 각각 명명한다. 이 2차 CTL은 159/5와 다른 특이성을 갖는다. 이는 (ⅰ)은 159/3이 아니라 159/5에 의해 용해되고 (ⅱ)는 159/5가 아니라 159/3에 의해 용해되는 2개의 항원 손실 변이체의 단리에 의해 동정되었다. 이들 변이체들을 각각 A-와 B-로 명명한다.
이어서 변이체 A-를 159/5와 면역선별하고, 3차 변이체를 얻는데, 이는 159/5 또는 159/3 어느 것에 의해서도 용해되지 않는다. 이 변이체를 A-B-라고 한다. 도 2에는 변이체가 단리되는 용해 분석 결과가 요약되어 있다.
<실시예 2>
변이체 A-B-의 HLA 발현 패턴을 측정하는 것이 목적이다. 모체주 LB33-MEL을 제공한 환자는 A28, B13, B44, Cw6, Cw7로 유형화된다. PCR 발현 분석을 수행하였을 때, LB33-MELc1과 변이체 B-모두 6개의 대립 유전자를 발현한다:그러나, 변이체 A-B-는 HLA-A28, B44 및 Cw7을 발현하지 않는다. 그 결과, 이들 HLA 분자들중 하나는 CTLs로 용해하는 항원을 나타낸다고 결론을 내렸다. 이하의 실시예에서 이를 더 연구한다.
<실시예 3>
변이체 A-B-의 샘플들을 HLA-A28, HLA-B44 또는 HLA-Cw7중 하나로 클로닝된 플라스미드 pcDNA-I/AmpI으로 감염시켰다. 선별 후, 세포들을 문헌 [Traversari, et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992)]에 따른 TNF 방출 분석법으로 테스트하였다. 결과는 도 3에 요약되어 있으며, 이는 HLA-B44가 항원의 등장과 명백한 관련이 있음을 보여준다.
<실시예 4>
HLA 분자의 존재가 밝혀진 다음에는, 이하에서 "종양 거부 항원 전구체 (tumor rejection antigen precursor)"로 명명되는 분자 또는 펩티드의 원천인 "TRAP" 분자를 밝혀내기 위한 연구를 수행하였다.
이를 위하여, 세포주 LB33-MELc1으로부터 전체 mRNA를 단리하였다. 전령 RNA는 올리고-dT 바인딩 키트를 사용하여 단리하였다. 전령 RNA를 확보한 다음, 다시 표준 방법을 사용하여 cDNA로 전사하였다. 이어서, 제품 설명에 따라 cDNA를 EcoRI 어뎁터(adaptor)에 결찰하고 플라스미드 pcDNA-I/Amp의 EcoRI 부위로 클로닝하였다. 이어서 재조합 플라스미드를 DH5αE.coli(전기천공 조건: 25μfarads, 2500V에서 1펄스)내로 전기 천공하였다.
감염된 박테리아를 앰피실린(50 μg/ml)으로 선별하고, 이어서 이를 각각 100개의 박테리아로 된 집합들로 나누었다. 각 집합은 약 50개의 상이한 cDNA를 나타내며, 분석에 의하면 약 50%의 플라스미드는 삽입물을 함유하고 있었다. 각 집합을 포화상태로 증량시키고, 문헌[Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Labooratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 1982)]에 따른 알카리성 용해, 아세트산칼륨 침전 및 페놀 추출 방법으로 플라스미드 DNA를 단리하였다. 세슘 구배 원심분리법은 사용하지 않았다.
이어서 증량된 플라스미드를 진핵 세포에 감염시켰다. 15,000 세포/웰의COS-7 세포 샘플을 10%의 소 태아 혈청으로 보강된 "DMEM"(Dulbeco's modified Eagles Medium)내에서 바닥이 평평한 조직 배지 미세웰내에 접종시켰다. 세포들을 37℃에서 밤새 배양하고, 배지를 제거한 다음 10% Nu 혈장을 함유하는 30 ㎕/ml의 DMEM 배지, 400 ㎍/ml의 DEAE-덱스트란, 클로로퀸 100 μM 및 LB33으로부터 HLA-B44의 cDNA를 함유하는 플라스미드 100 ng으로 치환하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후에, 배지를 제거하고 DMSO 10%를 함유하는 PBS 50㎕로 치환하였다. 이어서 배지를 버린 다음, 159/5의 세포 2000개를 10%의 인간 혈장 및 25 U/ml IL-2를 함유하는 이스코브(Iscove's) 배지 100㎕ 내에 첨가하였다. 24시간 후에 상층액을 제거하고, 문헌 [Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992)](상기 개시사항을 본 명세서의 일부로 한다)에 기술된 바에 따라, WEHI 세포상의 분석물에서 TNF 함량을 측정하였다. 상기의 배경에서 한 집단이 TNF 방출을 자극하였고, 이들 박테리아를 클로닝하여 이하의 실험에서 사용하였다.
<실시예 5>
실시예 4에서 클로닝된 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, 앞에서 설명한 방법대로 COS 세포의 새로운 샘플에 감염시켜, 세포들을 다시한번 159/5의 자극 실험을 하였다. 도 4에 요약된 데이타에 의해 인식된 바와 같이, 클론 350/2내에서 양성 클론이 발견되었다.
여기서 얻어진 결과를 동정하기 위해서, [American Type Culture Collection]에서 용이하게 입수할 수 있는, 인간 맥락막암 세포주 JAR을 사용하였다. 이 세포주는 HLA 분자를 발현하지 않고, CTL 159/5에 의해 인지되지도 않는다. JAR가 HLA-B44 cDNA로 감염되었을 때, 이는 여전히 CTL 159/5에 의해 인지되지 않았다. 그러나, HLA-B44 및 350/2 cDNAs에 함께 감염되었을 때는 도 4B에 도시된 바와 같이 용해가 일어났다.
양성 클론으로부터의 플라스미드를 제거하고, 이하의 공지된 기술에 따라 서열화되었다. 정보에 의하면 플라스미드 삽입물의 길이는 염기쌍이 1896개이고, 데이타 뱅크내의 어떤 서열과도 상동관계를 보이지 않았다. 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 나타나 있다.
<실시예 6>
종양 거부 항원인 펩티드를 동정하기 위해서, 평균 약 300 염기쌍을 가지는 서열번호 1 단편을, 이전의 실시예의 방법에 따라, PCR을 통해 증량시키고, pcDNA-1/Amp로 클로닝하고, 이어서 HLA-B44를 암호화하는 플라스미드와 함께 COS 세포를 감염시켰다. 이들 실험에서, 항원 펩티드를 암호화하면서 서열번호 1의 683-955 아미노산 잔기에 해당하는 영역을 밝혀내었다. 이 영역을 문헌 [Khanna, et al., J. Exp: Med. 176: 169-176 (7/92)]에 기술된 펩티드 및 출원명세서 제08/233,305호(1994,4,26)에 기술된 펩티드(즉: Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe (서열번호 2)가 이 잔기에 해당)와 비교하였다. 이와 같이, 이 서열에 해당하는 펩티드를 합성하고, 이를 HLA-B44+세포주를 항원에 민감하게 하는데 사용하였다. 결과를 도 6A 및 6B에 도시하여, EBV 형질전환된 B 세포 (도 6A) 및 위에서 설명한 변이체 B-(도 6B)를 사용한51Cr 방출 분석 결과를 나타내었다. CTL 159/5 (효과기/타게트 비 = 10:1)을 첨가하기 전에, 세포를 펩티드 농도를 변화시키면서 37℃에서 30분간 배양하였다. 펩티드 100-200 ng/ml에서 최대의 1/2의 용해량을 얻었다.
<실시예 7>
위에서 설명한, 실시예 1-6은 세포주 LB33-Melc1을 사용하여 연구한 것이다. 또다른 세포주들은 모체 LB33으로부터의 피하 전이로부터 유래하였다. 이러한 세포주 중의 하나는 LB33-MEL. A-1으로서 이하의 실시예에서 사용한다.
우선, 실시예 1-6의 세포주를 사용한 방법(상기 문헌 [Herin et al])과 동일한 방법으로 세포주를 사용하였다. 인간 혈장, 아스파라긴-글루타민-아르기닌 (각각 36 mg/ml, 216 mg/ml, 116 mg/ml), 2-머캅토에탄올 (0.05 mM) 및 5 U/ml의 인간 혈장 IL-4의 집합물 10%로 보강된 이스코브 배지 2 ml내에 단핵성 혈구 (106/웰)를 조사된 종양 세포 (3/105세포/웰)로 자극하였다. 자가조직의 CTL에 대한 종양 세포의 감도를 상기의 실시예 1과 같이 측정하였다. 실험결과 7개의 독립 배지로부터 82개의 안정한 세포용해성 T 임파구를 얻었다. 이들 CTL 모두 CD8+이었다. 이들은 K562가 아니라, LB33-MEL.A-1 세포, 또는 자가조직의, EBV 형질전환된 세포를 용해한다는 점에서 종양 세포에 특이적이었다.
<실시예 8>
LB33-MEL.A-1 세포가 자가조직의 CTL에 의해 용해된다는 사실은 다음 실험, 즉 항원 손실 변이체에 의해 인식되는 항원을 동정하는 실험을 제안하였다.
이를 위하여, 세포주 샘플을 상기에서 설명한 자가조직의 CTL 클론 LB33-CTL 159/3과 함께 4번 선별하였다. 각 선별시에는 유사한 수의 CTL를 구비한 2-3 x107개의 부착 종양세포를 상기에서 설명한 것과 같은 방식으로 2-6시간동안 배양하였다. 각 선별시에는, 배양후 CTL들을 씻어내고, 남아있는 부착 종양 세포들을 다음 선별 이전에 증량시켰다.
이 과정의 결과 CTL 159/3에 저항력이 있는 클론이 생산되었다; 그러나, 추가의 자가조직의 CTL로 시험한 결과, 상기 설명한 CTL 159/5는, 204/26 및 202/1을 포함한 추가의 CTL 클론과 같이 손실 변이체를 용해하였음이 밝혀졌다. 도 6의 "MEL.A-1.1"로 표시된 칼럼을 참조하라. 유사하게, 이들 4개의 CTL 클론 중 어느것에도 용해되지 않았으나, 다른 것들에 의해 용해되는 추가의 세포주들이 밝혀졌다. 도 6을 참조하라. 따라서, 적어도 4개의 상이한 항원들이 LB33-MEL.A-1의 표면에 존재함이 밝혀졌는데, 이는 4개의 특이적인 항원-손실 변이체를 동정하였기 때문이다. 이어서, 도 6에서 나타나듯이, LB33-MEL.A-1은 항원 발현이 "A+B+C+D+"이고(CTL 159/3, 159/5, 204/26 및 202/1 모두에 의해 용해됨); MEL/A-1.1은 A-B=C+D+이고(159/3에는 용해되지 않고; 다른 것들에 의해 용해됨), MEL/A-1.2는 A+B-C+D+이고(159/5에는 용해되지 않고; 다른 것들에 의해 용해됨), MEL/A-1.3은 A+B=C-D+이고(204/26에는 용해되지 않고; 다른 것들에 의해 용해됨), MEL/A-1.4는 A-B=C+D-이다(202/1 또는 159/3에는 용해되지 않고; 다른 것들에 의해 용해됨). 더욱이, 세포주 MEL.A-1.1.1을 단리하였는데, 이는 A-B-C+D-이었다(204/26에 의해서만 용해됨).
실시예 7을 통하여 밝혀진 82개의 CTL을 이들 세포주상에서 테스트한 결과, 항A 클론 29개, 항B 클론 29개, 항C 클론 10개 및 항D 클론 14개를 동정하였고, 이는 더 이상의 다른 항원은 존재하지 않음을 시사한다.
항D CTL 클론 202/1로 선별한 결과 항A CTL 클론 (159/3)에도 저항적인 세포주를 동정하였고, 이는 항B CTL로 선별할 때도 마찬가지였다(즉, 결과 A-B-C+D-세포주). 이 결과는 A-D-및 A-B-D-항원 손실 변이체는, 동일한 HLA가 존재하는 분자를 공유하는 항원 A, B 및 D를 구비한, 실제적으로 HLA 손실 변이체임을, 또는 상이한 군 I의 분자들은 항원 손실 변이체와 함께 손실되었음을 시사한다. 이하의 실험들은 이 사실을 추적하였다.
<실시예 9>
LB33 세포주가 성장하는 모체를 미리 HLA-A24, A28, B13, B44, Cw6, Cw7로, 혈청학적으로 유형화하였다. 이어서 세포주에 의한 HLA 군 I 유전자의 발현을 측정하였다.
상이한 LB33-MEL 종양 세포주에 의해 6개의 군 I 대립 유전자의 발현을 평가하기 위해 PCR에 의한 DNA 증량의 어느정도 수량적인 조건을 세웠다. DNA 증량의 특이성을 동정하기 위해 프라이머의 3' 말단에 완전히 맞는 뉴클레오티드에 의존하는, 브라우닝등에 의해 제안된 ARMS(Amplification Refractory Mutation System) PCR 방법을 사용하였다. 본 명세서의 일부로 하는 문헌 [Browning et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2842 (1993)]을 참조하라. LB33을 유형화하는 과정에서 얻어신 서열에 기초하여, 6개의 대립 유전자 각각을 나머지 5개와 구별할 수 있는 대립유전자-특이적인 프라이머(3' 프라이머 이후에 5' 프라이머)를 합성하였다.
A24: 5'-GCCGGAGTATTGGGCGA 및 5'-CGCCGCCTCCCACTTGC (서열번호 5 및 6)
A28: 5'-GGAGTATTGGGACCGGAAG 및 5'-GGCCGCCTCCCACTTGT (서열번호 7 및 8)
B13: 5'-CGCCACGAGTCCGAGGAT 및 5'-CCTTGCCGTAGGCTA (서열번호 9 및 10)
B44: 5'-CGCCACGAGTCCGAGGAA 및 5'-CCTTGCCGTCGTAGGCGT (서열번호 11 및 12)
Cw6: 5'-CCGAGTGAACCTGCGGAAA 및 5'-GGTCGCAGCCAT ACATCCA (서열번호 13 및 14)
Cw7: 5'-TACAAGCGCCAGGCACAGG 및 5'-CTCCAGGTAGGCTCTGTC (서열번호 15 및 16)
발현을 어느 정도 수량적으로 측정하기 위해, 각 프라이머 세트에 역전사 RNA의 PCR 증량을 27회 수행하였고, DNA 증량은 관찰한 선형 범위 내에 있음이 밝혀졌다. 증량된 DNA의 양은 브롬화 에티듐으로 착색된 아가로스 겔로 시각적으로 평가하였다. 이들 양을 LB33-MEL.A-1 세포의 연속적 희석물의 RT-PCR 증량 산물을 함유하는 표준 곡선에서 얻어진 것에 비유하였다. 샘플의 발현을 β-액틴 유전자의 발현율을 고려함으로써 RNA 통합성에 대해 규준화하였다. 그 결과를 LB33-MEL.A-1 세포에 의한 발현율로 표현하였다. 이 연구의 결과를 이하의 표 1에 나타내었다. "+++"는 LB33-MEL.A-1 세포에 의한 발현율의 반이상을 나타내고, "++"는 LB33-MEL.A-1 세포에 의한 발현율의 1/8 내지 1/2를 의미하고, "+"는 LB33-MEL.A-1 세포에 의한 발현율의 1/8 미만을 의미하고, "-"는 발현이 없었음을 의미한다.
LB33-MEL.A-1 세포로부터 유래한 항원 손실 변이체에 의한 HLA 군 I의 발현
발현 LB33-MEL.A-1 LB33-MEL.A 종양 세포항원-손실 변이체
A- B- C- A-D- A-B-D-
A 유전자 발현
A24 +++ +++ +++ - ++ +++
A28 +++ +++ +++ +++ + -
B13 +++ +++ +++ + +++ +++
B44 +++ +++ +++ +++ ++ -
Cw6 +++ +++ +++ + +++ +++
Cw7 +++ ++ +++ +++ + -
도시된 바와 같이, MEL.A-1 세포와 B-변이체는 6개의 HLA 대립유전자의 발현율이 유사하였다. A-변이체는 Cw7의 발현이 약 4배나 감소하였다. 나머지 항원 손실 변이체는 3개의 대립유전자 세트의 발현이 감소하였다. A-D-및 A-B-D-변이체는 A28, B44 및 Cw7 발현이 감소된 반면에, C-세포에서는 HLA-A24, B13 및 Cw6의 발현율이 감소되었다. 이는 A24-B13-Cw6 및 A28-B44-Cw7이 모체 LB33의 HLA 군 I 단일형 2개를 구성하고, 이들 단일형의 발현의 감소는 아마도 면역선별된 종양세포에 의한 항원 발현의 손실로서 설명이 됨을 시사한다.
<실시예 10>
다음 실험은 HLA 유전자 발현과 CTL에 의한 용해간의 상관관계를 동정하기 위한 것이다. 이를 위하여, 상기에서 설명한 것과 같이, 주어진 HLA 유전자의 발현을 표준 항체 분석범을 사용하여 얻어진 결과와 비교하였다. A24, A28 및 B13만을, 여기에 특이적인 쥐의 항체(A24에는 C7709A1; A28에는 2.28M1, B13에는 TUE 48)를 사용하여 테스트하였다. 항체를 배양하고, 세정한 후 플루오레세인에 결합된 양의 항쥐 Ig항체와 접촉하여 항체의 결합을 측정하였다. 이어서 세포를 표준 기술인, 유동 혈구계산법으로 분석하였다.
표 2에 결과를 요약하였고, 도 7에도 도시하였다. 이하의 표 2에서는, HLA 발현율이 도 6에 도시한 평균 형광 강도와 일치한다. 측정치는 LB33-MEL.A-1 세포에서 발견되는 발현율에 대해 표시하였다.
이들 결과로부터 HLA 발현율이 LB33-MEL.A-1 세포의 발현율의 1/8 이하로 측정될 때는, HLA 표면 분자는 검출되지 않거나 극소량 검출되며, 이는 주어진 HLA 분자에서는 CTL에 항원이 나타나지 않음을 시사한다.
이런 점과, C-, A-D-및 A-B-D-선택 세포가 HLA 분자가 결여되어서 항원의 발현이 상실되었음을 가정할 때, 항원 A에 대한 군 I의 분자는 A28, 또는 Cw7이고, 항원 B는 B44이고, 항원 C는 A24 또는 B13 또는 Cw6이며, 항원 D에는 A28 또는 Cw7이 해당된다.
발현 LB33-MEL.A-1 항원-손실 변형체
A- B- C- A-D- A-B-D-
유전자 발현
A24 100 33 13 4 41 95
A28 100 29 14 3 1 1
B13 100 27 22 1 40 230
<실시예 11>
상기 실험 결과 이후에 LB33-MEL.A 세포에 의해 발현된 항원 분자를 명확히 측정하기 위한 부가적 작업을 행하였다. 이를 위하여, 특정 HLA 군 I 분자의 발현을 상실한 종양 세포를 고전적인 인산 칼슘 침전 방법을 사용하여, 특정 군 I cDNA가 클로닝된 발현 벡터 pcDNA3으로 감염시켰다. 이 벡터는 네오R을 포함한다. 감염제는 G418 1.5 mg/ml로 선택하여, 상기의 실시예들에서 사용한 TNF 분석 세트를 사용하여 CTL 클론을 자극하는데 사용하였다.
도 8은 이들 결과를 도시한다. 항원 B는 HLA-A28 또는 HLA-Cw7을 함유하는 플라스미드가 아니라, HLA-B44를 수반하는 플라스미드로 감염시킴으로써 A-B-D-세포내에서 다시 발현되었다. 항원 C는 HLA B13으로 감염시킴으로써 C-세포내에서 다시 발현되었다. 4개의 다른 항C CTL 클론 또한 C-세포를 인식하였으나, 기술된 CTL 179C/50을 포함하는 5개의 다른 항C CTL 클론은 그렇지 않았다; 오히려, 이들 CTL들은 HLA-Cw6로 감염된 C-세포를 인식하였다. 따라서, 2군의 항C CTL 클론이 있다고 결론지을 수 있다. 하나는 HLA-B13에 의해 인식된 항원을 인식하고, 다른 하나는 HLA-Cw6에 의해 인식된 항원을 인식한다. 항원 D에 대해서는, A-D-세포들울 HLA-A28로 감염시켜 A-D+로 회복시켰다. 비록 항원이 HLA-군 I 분자들에 의해 명확히 나타기는 하나, 항A CTL에 의한 용해는 항군 I 단일클론성 항체 W6/32에 의해 완전히 억제되므로, cDNA 중 어느 하나도 항원 A(즉, 시험한 HLA A28, B44, Cw7)를 다시 발현시키지는 못하였다. 이 항원이 A-D-, A-B-D-세포내의 A28-B44-Cw7 단일형과 함께, 두개의 대립유전자가 모체 lB33에 존재하며, 이중의 하나는 손실된, 비-A, B, C 군 I 분자에 의해 나타나는 것은 가능하다.
항원 C에 대한 결과는 명명법에 변화를 가져왔다. 이하에서, 항원 Ca 및 항원 Cb로 불리는 두개의 항원이 있다.
<실시예 12>
이하의 실험은 LB33-MEL.B 세포주가 자가조직의 세포주에 의해 인식될 수 있는지 여부에 관한 것이다.
자가조직의 임파구를 자극하기 위하여, 상기와 (Herin 등) 동일한 방법을 사용하였다. 임파구는 1990 또는 1994년에 모체 LB33으로부터 취득한 것이다.
오직 1994년의 임파구만 LB33-MEL.B-1 세포를 용해하였다; 그러나, 이들은 LB33-MEL.A 세포는 용해하지 않았다. 따라서, LB33-MEL.B-1 세포주는 LB33-MEL.A상에서 발견되지 않는 항원을 나타낸다.
여기에서 설명한 실험은 상기의 실험과 유사하고, 이전의 실험에서와 같이 다른 CD8+CTL 클론의 패널이 만들어졌다. CTL 269/1의 반응성 패널을 도 10A에 도시하였다. "MEL.A-1"이 아니라, "MEL.B-1"과의 반응을 주목하라. 여기에서 정의되는 새로운 항원을 LB33-E라고 명명한다.
항체 억제력 실험에서는, mAbs 내지 HLA-A24가 용해를 억제하였다. 이를 도 10B에 나타낸다. 따라서, "E" 항원은 HLA-A24에 의해 나타낸다.
<실시예 13>
본 명세서의 일부인 문헌 [Fleischhauer et al., Tissue Antigens 44: 311-317 (1994)]에는 HLA-B44 결합의 모티프 교감이 실려있다. 이 모티프는, 위치 2에 Glu가 우세하고, 마지막 위치(위치 9 또는 10)에 Tyr 또는 Phe가 현존하고, Met와 같은 소수성 잔기가 위치 3에 있는, 9 또는 10개의 아미노산 폴리펩티드이다.
MAGE-3 TRAP 아미노산 서열은 위치 167-176에, 이 모티프에 해당하는 아미노산의 스트레치를 포함한다. 아미노산 서열은:
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (서열번호 17)이다.
HLA-B44 모티프는 적어도 두개의 주 특수형 HLA-B*4402 및 HLA-B*4403을 포함한다고 알려져 있다. MHC 분자는 모든 코카서스 인종중 23%에 나타난다. 이 특징과 표준 흑색종 분석결과를 합하여 볼 때, 코카서스 인종의 흑색종 모체의 14%가 흑색종 세포의 표면상에 HLA-B44가 인식된다고 결론낼 수 있다. 따라서, 만일 서열번호 17 또는 관련 분자들이 실제 HLA-B44 세포들을 동정하고, MHC 분자에 결합된 후에 용해를 촉진하기 위해 사용될 수 있는지를 측정하는 것은 상당히 흥미있는 일이다. 이전의 예에서도 알려진 바와 같이, 서열번호 2 펩티드는 HLA-B44 양성 세포를 결합하였다. 위치 8에 Ala를 가지는 것을 제외하고, 서열번호2와 유사한 펩티드를 제조하였다. 이 새로운 펩티드는:
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe
(서열번호 18)로서, 서열번호 2를 구비하는 경쟁 분석법으로 시험하였다. 이 펩티드를 여기에 기록되지 않은 실험에서 얻어진 결과를 고려하여 사용하였다. 간단히, 서열번호 2의 유도체를 제조하였는데, 상기 유도체는 서열번호 2내의 Ala에 의해 점령되지 않은 위치에 Ala를 포함하였다. CTL 클론 159/5는 서열번호 2보다 서열번호 18을 함유하는 복합체를 더 잘 인식하여, 경쟁 분석법에 탁월한 제제이다. 경쟁은, 문헌 [Storkus et al., J. Immunol 138:1657-1659 (1987)]에 기술된, CIR 세포를 사용하여 수행하였다. 이들 CIR 세포들은 MHC 군 I 음성의 임파아구 세포(lymphoblastoid cell)이다. 상기와 같은 방법을 사용하여, 상기 CIR 세포를 HAL-B*4402용 cDNA 또는 HLA-B*4403용 게놈 DNA로 감염시켰다.
HAL-B*4402용 cDNA는 문헌 [Fleischhauer, et al, Tissue Antigens 44: 311-317 (1994)]에 설명되어 있고, HLA-B*4403용 게놈 DNA는 문헌 [Fleischhauer, et al. (1990) New Eng. J. Med 323:1818-1822 (1990)]에 나타나 있다. 양 문헌 모두 본 명세서의 일부로 한다.
세포들을 항HLA 군 I 단항체 W6/32(하이브리도마 세포 배지 30% (v/v))의 존재하에서, 37℃에서 1시간동안51Cr으로 표지하였다. 이는 항원성 펩티드를 T 세포에 나타내는 세포의 능력을 향상시킨다.
표지된 세포들을 세정하고 20℃의 혈장이 없는 배지에서, 각종 농도의 경쟁 펩티드와 함께 배양하였다. 이들 펩티드는:
상기에서 논의한 바와 같이, HLA-B44 분자에 결합한
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
(서열번호 3),
EBV 유전자 EBNA-3A로 암호화되고, HLA-B8에 결합하는,
Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu
(서열번호 19) (문헌 [Burrows, J. Exp Med 171:345-349 (1990)),
및, 서열번호 17을 포함하였다.
이어서 서열번호 18 펩티드를 최종 농도 45 ng/ml (C1R-B4402+세포) 또는 160 ng/ml (C1R-B4403+세포)로 혈장이 없는 배양배지에 첨가하였다. 세포를 20℃에서 30분간 배양하고, 이스코브 배지 및 2%의 소 태아 혈장에서 두번 세정하였다. 이스코브 배지 및 10% 인간 혈장에 CTL 클론 LB33-CTL 159/5를 20의 E:T의 비율로 첨가하였다. 3시간 후에51Cr 방출을 측정하고, C1R-B4402+세포 및 C1R-B4403+세포의 그것을 도 11A 및 11B에 도시하였다. 도 11에 도시된 데이타는 경쟁에 대한 명확한 증거를 보여준다.
<실시예 14>
실시예 13에 설명한 실험에 이어 추가 실험을 행하였다.
세포용해성 T 세포 클론(CTLs)를 2명의 피검자로부터 얻어내어, 이를 각각 LB 816 및 LB 822라고 명명하였다. 이 피검자들은 암이 명백히 없었다.
농도 구배 원심분리법을 사용하여, 피검자로부터 단핵성 혈구 세포 (BMCs)를 단리하였다. BMC내의 T 임파구를 아미노에틸이소티오우로늄 브로마이드로 처리한 양 적혈구 세포를 사용한 로제트법(rosetting)에 의해 정제하고, 이어서 자기 미세비즈(microbeads)에 부착성 항CD8 단항체로 표지하였다. CD8+세포를 자기장을 통과시켜 정렬하고, 10% 인간 혈장, L-아르기닌 116 mg/l, L-아스파라긴 36 mg/ml 및 L-글루타민 216 mg/l, 2-머캅토에탄올 0.05 mM 및 DMSO 10%로 보강된 -80℃의 이스코브 배양 배지 내에 저장하였다.
로제팅하지 않은 BMC는 37℃의 조직 배지 플레이트상에 부착된 상태로 2시간동안 방치하였다. 부착되지 않은 세포는 버리고, 부착성 세포들은 IL-4 (50 U/ml) 및 GM-CSF (100 ng/ml)내에서 7일동안 배양하였다. 결과 개체군들은 항원성을 나타내는 세포들("APCs": 이경우, 수지상 세포 또는 대식세포)이 풍부하였다. 이어서, 이들 셀 5x105내지 106개를, 인간 β2 마이크로글로불린 및 서열번호 17 펩티드 50 ㎍/ml로 보강된, 37℃의 400 ㎕의 이스코브 배지 내의 웰 2 ml내에서 4시간동안 배양하였다. 이어서, 부착성 펩티드로 충만한(pulsed with) 세포들을 5000 rads에서 조사시킨 후에, 세정하였다. 다음으로, IL-6 1000 U/ml 및 IL-12 5 ng/ml로 보강된 배양배지 내에서 자가조직의 CD8+T 세포 2x106개를 첨가하였다.
7일 후에, 임파구를 상기와 같이, 펩티드에 의해 되는, 부착성 자가조직의 BMC로 재자극하였다. 상기와 같이 BMC 5x106개를 β2 -마이크로글로불린 및 서열번호 17로 보강된, 37℃의 400 ㎕의 이스코브 배지 내에서 2시간동안 부착상태로 방치하였다. 이어서, 펩티드로 충만한, 부착성 세포들을 조사시키고 세정하였다. 이어서, IL-2 10 U/ml 및 IL-7 5 ng/ml로 보강된 배양배지 내에서 반응기 세포를 첨가하였다.
14일째 되는날, 임파구를 서열번호 17로 충만한 자가조직의 BMC로 재자극하였다. BMC를 2x107세포/웰의, B2-마이크로글로불린 및 서열번호 17을 포함하는 이스코브 배지 내에서 배양시켰다. 2시간동안 배양(20℃)한 다음, 펩티드로 충만한 BMC를 상기와 같이 조사, 세정한 후, IL-2 및 IL-7로 증대된, 2x106세포/웰의 배양배지 내에서 재현탁시켰다. 이들 자극기 세포들의 샘플 (2x106)을 반응기 세포를 함유하는 각 웰에 첨가하였다.
반응 임파구들을 21일째 되는 날에 클로닝하였다. IL-2 50 U/ml 및 IL-4 5 U/ml로 보강된 배양배지 내의 미세웰내에서 10 내지 0.3 세포/웰을 접종하였다. 이어서 이들을 알로제닉(allogenic) EBV 형질전환된 B 세포 (LG2-EBV-B)를 첨가함으로써 자극시키고, 10,000 rads에서 20,000 세포/웰에서 조사하였고, (ⅰ) 펩티드로 충만한 HLA-B4402+세포, 또는 (ⅱ) 펩티드로 충만한 HLA-B4403+세포중 하나를 조사하였다. (ⅰ) 또는 (ⅱ)는, 15,000 rads, 8000 세포/웰에서 조사시켰다.
21일째 되는 날과 같은 방법으로 미세배지를 매주 재자극하였다. 유일한 변화는, 21일째 20,000 세포/웰 첨가한 것에 비해, 28일 및 35일째에 EBV-B 세포를 각각 웰당 40,000 및 60,000개 첨가하였다.
41일 내지 52일 사이에, 증식 미세배지 분획물을 바닥이 V형인 미세웰에 옮겨, 서열번호 17로 충만한 경우 및 안된 경우에, HLA-B4402+또는 HLA-B4403+타게트 세포에 대한 용해 활성도를 시험하였다.
항펩티드 용해 활성도를 모인 미세배지를 IL-2 50 U/ml 및 IL-4 5 U/ml로 증대된 배양 배지 800 ㎕ 내에서, 조사되고 펩티드로 충만한 HLA-B4402+또는 HLA-B4403+5x104개 및 LG2-EBV-B 세포 5X105개로 재자극하였다.
7일후에, 상기와 같은 방법으로 CTL 클론을 조사되고 펩티드로 충만한 HLA-B4402+또는 HLA-B4403+2x104개 및 LG2-EBV-B 세포 106개로 매주 재자극하였다. 이런 방법으로, LB 816-CTL-340 A/1 및 LB822-CTL-346A/1을 제조하였다. 이들 제조는 서열번호 17과 HLA-B*4402 또는 HLA-B4403 중 어느 하나와의 복합체에 특이하다.
<실시예 15>
여기서는, MAGE-3을 발현하지 않는 HLA-B4402+또는 HLA-B4403+EBV로 형질전환된 B 세포를 단항체 W6/32의 존재하에서 1시간동안51Cr으로 표지하였다(문헌 [Brodsky, et al, J. Immunol 128:129-135 (1982)]). 각종 농도의 서열번호 17을 사용하여, 세포들을 세정하고, 혈장이 없는 20℃의 배지 내에서 30분간 배양하였다. 실시예 14에서 설명한 각 CTL을, 4시간 후에 크롬 방출량을 측정하는51Cr 방출 분석법으로 시험하였다.
도 12에 도시된 결과는 펩티드가 실제로 용해를 자극하였음을 보인다.
<실시예 16>
이하의 실험에서는, HLA-B44 양성인 추가의 종양 세포주를 검사하였다.
검사된 모든 세포주를 37℃에서 1시간동안51Cr으로 표지하였다. 이어서 이스코브 배지 및 2%의 소태아 혈장내에서, 이를 각종의 실시예 14에서 논의한 2개의 CTL 클론에 첨가하였다. 4시간 후에 방출된51Cr 양을 측정하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 대조군 또한 사용되었다. 분석전에 48시간동안, 세포주 LB33-MEL이 IFN-γ (50 U/ml)로 배양되었음을 명심하라.
이들 실험 결과를 도 13에 도시하였다. CTL 클론 LB816-CTL-340 A/1 및 LB22-CTL-346 A/1은 MAGE-3을 발현하는 종양 세포를 용해하였으나, MAGE 유전자를 발현하지 않는 LB33-EBV 세포를 용해하지는 않았다. CTL 클론 LB822-346 A/1은 MAGE-3을 발현하는 종양 세포 HLA-B*4403+를 용해하였으나, 항원 손실 변이체 MZ2-MEL.61.2D-를 용해하지는 않았다.
<실시예 17>
HLA-B44와의 복합체의 펩티드 서열번호 17이 CTL을 자극하는지를 측정하는 마지막 시험으로써, 종양 괴사 인자 방출이 자극되는지를 측정하는 실험을 하였다.
우선, 문헌 [Gaugler, et al, J. Exp. Med 179:921-930 (1994)]에 따라, COS-7 세포를, 발현 벡터 pcDNA-1/AMP, 및 벡터 pcDNA3내로 클로닝된 HLA-B*4402 또는 pcDNA1/AMP내로 클로닝된 HLA-B*4403중 하나 내에서, MAGE-3을 암호화하는 cDNA로 감염시켰다. 문헌 [Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369 (1987)]의 DEAE 덱스트란 클로로퀴논 방법을 사용하였다.
감염체(transfectant)를 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 3000 CTLs/웰을 첨가하였다. 이를 37℃에서 18시간동안 배양하였다. 이어서 상층액을 수집하고, 문헌 [Espevik et al, J. Immunol. Meth 95:99-105 (1986)]에 따라 TNF 민감성 WEHI-16 클론 13 세포에 대한 세포용해성 효과를 시험함으로써 TNF 함량을 측정하였다.
이하의 표 3에서는, TNF 방출이 pg/ml로 표현된 결과를 도시한다. LB33-MEL 및 LB494-MEL을 분석전 24시간 동안 100 U/ml에서 IFNγ와 함께 배양하였다. 종양 세포주 LB33-MEL, LB494-MEL 및 MZ2-MEL 또한 시험하였다. 이들 세포주 모두 MAGE-3 cDNA 및 HLA-B*4402+(LB33-MEL, LB494-MEL) 또는 HLA-B*4403+(MZ2-MEL)중 어느 하나를 발현한다. 따라서, 이들 세포들은 감염(transfection)이 필요하지 않다. 이 결과는 TNF가 방출됨을 나타낸다. 따라서, 서열번호 16은 HLA-B33 MHC 분자에 의해 나타나고, 이들 복합체를 CTL 활성도를 자극한다.
항MAGE-3.B44 CTL 클론의 TNF 생산량
CTL 클론 자극기 세포 TNG(pg/ml)
A LB816-CTL-340A/1(B4402) COSCOS+MAGE-3COS+HLA-B4402COS+HLA+B4402+MAGE-3LB33-MEL (B4402, MAGE-3+++)LB494-MEL (B4402, MAGE-3+++) 0.70.60.533.774.932.3
B LB822-CYL0346A/1(B4403) COSCOS+MAGE-3COS+HLA-B4403COS+HLA+B4403+MAGE-3MZ2-MEL (B4403, MAGE-3+++) 1.211.226.667.3
<실시예 18>
이상의, 예를 들어, 문헌 [Brichard, et al., Eur. J. Immunol. [CITE] (1995); Buseyne, et al., J. Virol 67: 694-702 (1993); Coulie, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105-2109 (1994); DiBrino, et al., Biochemistry 34: 10130-10138 (1995); Fleischhauer, et al., Tissue Antigens 44: 311-317 (1994); Khanna, et al., J. Exp. Med. 176: 169-176 (1992); Kita, et al., Hepatology 18: 1039-1044 (1993)]에 나타난 데이타를 수집한 결과, HLA-B44 분자에 결합된 펩티드는 종종 위치 2에 Glu, 및 마지막 위치에 Tyr 또는 Phe 중 어느 하나를 포함한다. MAGE-3 서열을 분석한 결과 4개의 펩티드 서열은 이들 조건을 만족한다, 즉:
Gln Glu Glu Gly Pro Ser Thr Phe (서열번호 20);
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr (서열번호 17);
Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (서열번호 21);
Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe (서열번호 22).
이들 펩티드들을 표준 고체상 기술을 사용하여 합성하였고, 이어서 이들이 HLA-B44 MHC 분자에 결합되는지를 측정하는 실험에 사용하였다.
실험에서 사용한 세포들은 엡스타인 바 바이러스 (Epstein Barr Virus, EBV)로 형질전환된 C1R 세포이었다. 이들 세포들은 MAGE-3 유전자를 발현한다는 점에서 다른, EBV로 형질전환된 B 세포와 다르다. 이들은 또한, MHC 음성으로서, MHC 분자를 암호화하는 유전자로 감염용 피검체로 사용될 수 있다. 본 명세서의 일부인 문헌 [Fleischhauer, et al., Tissue Antigens 44: 311-317 (1994) 또는 Fleischhauer, et al., N. Eng. J. Med 323: 1828-1822 (1990) ]에 따라 샘플들을 HLA-B*4402를 암호화하는 cDNA 분자 또는, HLA-B*4403을 암호화하는 게놈 DNA로 형질전환시켰다.
경쟁 분석법에서, HLA-B44를 결합한다고 알려진 펩티드
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe (서열번호 18)
를 사용하였다. 본 명세서의 일부인 문헌 [Coulie, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7976-7980 (1995)]을 참조하라. 세포용해성 T 세포 클론 LB33-CTL-159/5 또한 그 표면에 펩티드와 HLA-B44의 복합체를 나타내는 세포들을 인식 및 용해한다고 알려져 있다. 이 클론을, 서열번호 18 일정량과 각 서열번호 20, 17, 21, 22 각각 변화량 및 제어 펩티드:
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe (서열번호 3)
및
Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu (서열번호 19)
와 함께, 분석에 사용하였다.
분석을 행하기 위해, 감염된 C1R (C1R-B*4402, C1R-B*4403)로 형질전환된 세포들을 37℃에서 한시간동안, 항인간 군-I MHC 단항체 W6/32 (하이브리도마 세포의 배양 배지 30% v/v)의 존재하에서,51Cr 표지하고, 3번 세정하였다. 표지된 세포들 (80㎕ 내의 세포 1000개)을, 혈장이 없는 X-VIVO 10 배지내의 20℃의 V-바닥 미세웰 내에서 30분간 배양하였다. 아래에 설명한 대로 각종 농도의 시험 펩티드를 첨가한 후에, C1R-B*4402용 X-VIVO 10 배지 40 ㎕에는 펩티드
Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Ala Phe (서열번호 18)
50 ng/ml을, C1R-B*4403용으로는 160 ng/ml를 첨가하였다. 이 펩티드는 C1R-B*4402 및 C1R-B*4403 알로타이프(allotype)를 결합한다고 알려져 있다(문헌 [Coulie, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7976-7980 (1995)]참조). 서열번호 18로 자극된 세포들을 20℃에서 30분간 배양한 후, 2%의 소태아 혈장을 함유하는 이스코브 배지내에서 세정하였다. 이어서, 서열번호 18 및 HLA-B44의 복합체를 표면에 나타내는 세포들을 인식 및 용해한다고 쿨리에 등(Coulie et al)에 의해 설명되는, CTL 클론 LB33-159/5를 10%의 인간 혈장으로 보강된 이스코브 배지 150 ㎕내에서 20,000 세포 첨가하였다.
CTL 159/5에 의한 용해가 50% 정도 억제될 때까지, 경쟁 펩티드를 농도를 변화시키면서 첨가하였다. 상기에 설명한 식을 사용하여 용해를 측정하였다. 경쟁자 펩티드를 사용하지 않았을 때, C1R-B*4402 형질전환체의 용해는 58%이었고, C1R-B*4403의 용해는 72%이었다.
이하의 표에서는, 제어군으로 서열번호 3 및 19를 사용하였다. 전자, 즉:
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe (서열번호 3)
은 티로시나아제로부터 유래되고 HLA-B*4402 및 HLA-B*4403 모두에 결합된다고 알려져 있고 (문헌[Brichard, et al., Eur. J. Immunol. (1995)], 후자, 즉:
Phe Leu Arg Gly Arg Ala Tyr Gly Leu (서열번호 19)
는 HLA-A8에 결합된다 (문헌[Burrows, et al., J. Exp. Med. 171: 345-349 (1990)]). 아래의 결과는 서열번호 18로 민감해진 C1R-B44 세포의 용해를 억제하는데 필요한 펩티드의 농도를 μM로 설명한다.
<표>
펩티드 C1R-B*4402 C1R-B*4403
서열번호 20 60 15
서열번호 17 2 1
서열번호 21 80 7
서열번호 22 20 4
서열번호 3 1 〈1
서열번호 19 〉100 〉100
서열번호 17, 20, 21 및 22는 C1R-B44 세포의 용해를 억제하였으며, 이는 이들이 HLA-B44 분자에 결합됨을 나타낸다. 서열번호 17 펩티드는 HLA-B*4402와 HLA-B*4403에 가장 잘 결합된다. 이는 도 14에 도시되어 있고, 여기서 서열번호 17, 19 및 3은 용해 대 경쟁 펩티드의 농도의 함수로 나타나 있다.
여기에 기재되지 않은 실험에서는, 서열번호 17에 상동이고, MAGE-1, 2, 4, 6 및 12의 아미노산서열로부터 유래한 펩티드를 또한 시험하였으며, HLA-B44 분자에 결합됨이 밝혀졌다.
<실시예 19>
각종 펩티드가 실제로 HLA-B44 알로타이프에 결합됨이 명백하여졌으므로, 펩티드가 펩티드와 MHC 분자의 복합체에 특이적인 세포용해성 T 세포를 자극하는데 사용되는지를 측정하는 것이 흥미있다.
이를 측정하기 위해서는, LB816로 불리고, 암에 걸린 적이 었고, HLA-B*4402 양성인 제공자로부터 부착성 말단 단핵성 혈구 세포를 단리하였다.
밀도 구배 원심분리기를 사용하여, 말단 단핵성 혈구 세포 ("PBMCs") 샘플로부터 시큐어링(securing) 하여 부착성 세포들을 단리하였다. 본 명세서의 일부인 문헌 [Mikamo, J. Immunol. Meth. 107: 189-196 (1988)]에 따라 2-아미노에틸-이소티오우로늄 브로마이드 히드로브로마이드 처리된 양 적혈구를 사용하여, 로제팅하고, 자기 미세비즈에 결합된 항CD8 단항체로 표지하고, 자기장에 통과시켜 CD8+세포를 정렬하여, 샘플로부터 T-임파구를 정제하였다. 이렇게 단리된 세포들을 냉동 보관하였다. 비부착성 세포들은 버리고, 37℃에서 2시간동안 비로제팅 PBMC를 NUNC 조직 배양 웰에 부착된 상태로 놓아 두었다.
이어서 부착성 세포를, 10% FCS로 보강된 RPMI 배지 내에서, IL-4 (50 U/ml) 및 GM-CSF (100 ng/ml)의 존재하에서, 7일동안 배양하였다. GM-CSF 및 IL-4를 사용하여 배지내에 수지상세포의 비율을 증량시켰다. 문헌 [Romani, et al., J. Exp. Med. 180:83-93 (1994); Sallusto, et al., J. Exp. Med. 179: 1109-1118 (1994)]을 참조하라. 세포 집단을 분석한 결과, 제공자 LB816으로부터의 세포 대부분은 CD11c+및 CD14+이고, 제공자 LB822로부터의 세포는 대부분 CD11c+및 CD14-이었다.
이어서 총 5x105내지 5x106개의 이들 항원성을 나타내는 세포들을 인간 β2 마이크로글로불린 (2.5 ㎍/ml) 및 서열번호 17 50 ㎍/ml로 보강한 이스코브 배지 400 ㎕ 내의 2ml 웰내에서, 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 이 이후에, 세포를 50 Gy에서 조사한 후, 세정하였다. 이어서 이들 세포들을 상기에 논의한 자가조직의 CD8+세포상의 자극기 세포로 사용하였다.
자가조직의 CD8*웰로된 6개 배지를 만들었다. 각 배지에, 2x106개의 CD8+세포들을 배양배지(이스코브 배지와 10% 인간 혈장, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-글루타민, 2-머캅토에탄올 0.05 mM, IL-6 1000 U/ml 및 IL-12 5 ng/ml)에 결합시켰다. 7일 및 14일째에, 이들 반응기 세포들을 자극기 세포로 자극하였다. 이를 위하여, 7일 째에 PBMCs (5x106)을 상기에 설명한, β2 마이크로글로불린 및 서열번호 17을 포함하는 37℃의 이스코브 배지 400㎕내에서, 2시간동안 부착상태로 두었다. 부착상태의 세포를, 상기에서 설명한 대로 조사 및 세정하였다. IL-2 10 U/ml 및 IL-7 5 ng/ml로 보강된 배양 배지 내에 반응기 임파구 (즉, CD8+세포)를 첨가하였다. 14일 째에, 임파구를 펩티드로 충만한 PBMC로 재자극하였다. 이 재자극에서, ml당 2x107개의 PBMC들을 상기에 설명한 β2 마이크로글로불린 및 서열번호 17 펩티드로 보강된 20℃의 이스코브 배지 내에서 2시간동안 배양하였따. 다시, 이들 PBMC들을 조사, 세정 및 IL-2 및 IL-7로 보강된 배양 배지 내에서, 2x106세포/웰의 비율로 재현탁하고, 다시 설명한 대로, 반응기에 첨가하였다.
20일째에는, 서열번호 17로 민감해진 LB816 세포 (HLA-B*4402 양성 세포)의 용해 활성도를 평가하였다. 용해 활동도는 상기에 설명한51Cr 방출 분석법을 사용하여 측정하였다. 결과를 도 15A에 도시하였다. 효과기 세포를 비표지의 K562 타게트 세포(50,000 세포/웰)과 함께 45분동안 배양하여, NK-같은 효과기에 의한 용해를 억제하였다.51Cr-표지된 타게트 세포 (1000 세포/웰)을 서열번호 17 1μM와 함께(●) 또는 없이(○) 배양하였다. 4시간 후에51Cr 방출을 측정하였다. 자가조직의 CD8+배지 6개중 오직 하나만이 우선적으로 타게트 세포를 용해하였다.
유사하게, HLA-B*4403 양성 세포 (LB822)를 시험하였다. 도 15B에 나타난 결과는 5개의 배지중 하나가 우선적으로 세포를 용해함을 보여준다.
이 결과에 기초하여, 항서열번호 17/HLA-B44 세포의 전구체의 빈도는 매 107개의 CD8+임파구중 1이다.
양성 배지의 임파구를 제한 희석법에 의해 클로닝하였다. 특히, 21일째에, 이들 세포들은 IL-2 50 U/ml 및 IL-4 5 U/ml로 보강된 배양 배지 내에서 배양하였다. LB816 세포들을, 서열번호 17 1 ㎍/ml와 함께 20℃에서 1시간동안 배양한, 조사된 C1R-B*4402 세포들 (150 Gy, 8000 세포/웰)로 자극한 후, 세정하였다. LB822 클론을 HLA-B*4403 양성 흑색종 세포 (100 Gy, 8000 세포/웰)인 조사된 MZ2-MEL 세포들로 재자극하였다. 조사된 알로제닉 LG2-EBV 세포 (100 Gy, 20,000 세포/웰)을 공급기 세포로 첨가하였다. 미세배지를 매주 자극하였다. CTL 클론 LB816-CTL-340/1 및 LB822-CTl-346/8을 이 방법으로 단리하였다.
<실시예 20>
상기에 설명한 CTL 클론을 2 ml의 웰 내에서, 서열번호 17 펩티드 1 ㎍/ml와 함께 20℃에서 한시간동안 배양한 2x105개의 조사된 C1R-B*4492 또는 C1R-B*4403 세포로 매주 자극한 후, 세정하고, 이전과 같이 IL-2 및 IL-4로 보강된 모든 배양 배지 내에, 106개의 조사된 LG2-EBV 세포들을 첨가하였다.
이렇게 단리된 CTL 클론이 서열번호 17과 HLA-B44의 양 알로타이프와의 복합체를 인지함을 동정하기 위해서, 각 CTL 클론 (웰당) 10,000 세포들을, 서열번호 17의 농도를 변화하면서, 20℃의 혈장이 없는 배지내에서 30분간51Cr으로 표지된 임파아구 B 세포 (LB33-EBV, HLA-B*4402 양성) 1000 세포(웰당)와 결합한 후, 세정하였다. 2시간 후에51Cr 방출을, 여기에 기술된 방법을 사용하여 측정하였다.
도 16에 나타난 결과는, CTL 340/1에서는, 최대치의 1/2의 용해가 약 40 nM에서 얻어진 반면, CTL 346/8에서는, 최대치의 1/2의 용해가 약 100 nM에서 얻어졌다.
여기에 요약된 실험에선, 서열번호 17과 상동이나, 위치 9가 다른(류신이 발린으로 대체됨) 펩티드를 시험하였다. 이 펩티드는 MAGE-6로부터 나온것이다. 비록, 특이적 CTL 클론이 이를 인지하지는 못하나, 이는 두개의 HLA-B44 아유형 모두에 부착되었다. 따라서, HLA-B44 분자를 결합할때, 9번 위치는 중요하지 않다.
<실시예 21>
서열번호 17이 MAGE-3 유전자를 발현하는 세포상에 자연적으로 존재하는지를 측정하기 위해 실험을 하였다.
이를 측정하기 위해, COS-7 세포 (15,000/웰)를, MAGE-3용으로 cDNA를 포함하는 pcDRNI/Amp 50 ng, 및 HLA-B*4403용으로 cDNA를 포함하는 pcDRNI/Amp 50 ng, 또는 HLA-B*4402용으로 cDNA를 포함하는 pcDRN3/Amp 50 ng으로 공감염시켰다. 공감염은 문헌 [Seed, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3365-3369(1987)]의 공지된 방법에 따라 수행하였다. 또한, NA8-MEL 흑색종 세포를 공감염시켰다. 이들 세포들은 HLA-B44 또는 MAGE-3 분자중 어느것도 발현하지 않았다. NA8-MEL (30,000 세포/웰)을 공감염시키기 위해서 LIPOFECTAMINE을 사용하여 상기의 플라스미드 샘플 100 ng을 사용하였다.
공감염 이후에, 세포를 37℃에서 36시간동안 배양하고, 상기에 설명한 CTL 클론 340/1 및 346/8의 존재하에서 종양 괴사 인자 (TNF)의 생산을 자극하는 능력을 시험하였다. TNF 생산은 본 명세서의 일부로 하는 문헌 [Lehmann et al., Eur. J. Immunol. 25: 340-347 (1995)]에 따라 측정하였다. 이 실험에서, 3000개의 CTL을 10% 인간 혈장 및 IL-2 25 U/ml로 보강된 이스코브 배지 100 ㎕내에 첨가하였다. 20시간 후에, 상층액을 수집하고, 문헌 [Espevik et al., J. Immunol. Meth. 95:99-105 (1986)]에 따라, WEHI 164c13 세포에 대한 세포붕해도를 측정함으로써 TNF 생산량을 측정하였다. 도 17에 요약된, 이들 실험에서는, 단일의 감염 (MAGE-3 또는 HLA-B*4402 또는 HLA-B*4403 중 어느 하나)을 사용하여 제어군을 제조하였다.
도 17은 두개의 플라스미드로 공감염된 세포가 TNF 방출을 자극하는 반면, 하나의 플라스미드로 감염된 세포의 경우는 그렇지 않음을 도시한다. 이 결과는 양 세포형 및 양 CTL 모두에서 관찰되었다. MADE-3/HLA-B44 복합체의 인지는, NA8-MEL 연구에서 보여지는, COS-7 세포에 의해 제공되는 많은 복제 수를 요하지 않았다.
<실시예 22>
이어서, 상기에 설명한 CTL, 즉 340/1 및 346/8의 HLA-B44를 나타내는 종양 세포 용해능력을 시험하였다. 사용한 세포들에는 LB33-MEL-A-1, LB373-MEL, LB494-MEL, LB831-BLC, LG2-MEL 및 MZ2-MEL.43이 포함되는데, 이는 MAGE-3을 발현한다고 알려진 세포주로서, LB831-BLC만 제외하고는 흑색종 세포로서 방광암에서 유래한 세포주이다. 세포주 MZ2-MEL.61.2는 MAGE-3의 발현을 상실한 흑색종 세포주이다. 이하의 도 18에서는, 이 세포를 폐쇄원("●")이 아니라 개방원 ("○")으로 표시한다. MZ2-MEL.43, MZ2-MEL.61.2 및 LG2-MEL을 제외한 모든 세포를51Cr 방출 분석법에서 사용하기 전에, IFN-γ 50 U/ml의 존재하에서, 48시간 이상 배양하였다. 각 경우, RT-PCR 방법을 사용하여, HLA-B*4402, 또는 HLA-B*4403 및 MAGE-3의 발현을 시험하였다.
도 18에서 설명하는 결과는, CTL이 이들 자연적으로 MAGE-2/HLA-B44를 발현하는 세포를 인지 및 용해함을 보여준다.
이하의 실험에서는 종양 거부 항원 전구체, "TRAP" 분자를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 설명한다. 이들 부호가 HLA-B44 분자에 의해 나타나는, 적어도 하나의 종양 거부 항원, 또는 "TRA"의 제조방법에 따라 내세포적으로 처리되는 단백질 분자. HLA-B44 분자가 티로시나아제로부터 유래한 펩티드를 나타내는 것이 종전에 관찰된 반면에, 본 발명의 핵산 분자를 티로시나아제를 암호화하지 않고, TRA는 티로시나아제로 유도되지 않는다.
본 발명의 종양 거부 항원은 2번째 위치에 Glu 잔기를 가지고, 9 또는 10번째 위치에 Phe 또는 Tyr 잔기를 가지는 단리된 노나펩티드이다. 특히 바람직하게는 이하의 식을 만족시키는 펩티드이다:
Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr (서열번호 23)
또는
Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr (서열번호 24)
여기서 Xaa는 여하한 아미노산이다. 이들 유전자 식들은 상기에서 설명한 바와 같이 역시 HLA-B44 분자에 결합하는 상이한 MAGE 단백질로부터 유래한 상동 단백질 뿐만 아니하 서열번호 17을 받아들인다. 이들 상동체는 :
Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr (서열번호 25);
Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr (서열번호 26);
Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr Tyr (서열번호 27);
Met Glu Ala Asp Pro Thr Ser Asn Thr Tyr (서열번호 28);
Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr (서열번호 29)
및
Val Glu Val Val Arg Ile Gly His Leu Tyr (서열번호 30)을 포함한다. 이들은 MAGE-1, 2, 4, 5, 6 및 12의 대응위치에 각각 발견된다는 점에서 상동 서열번호 17의 펩티드 서열과 일치한다. 이들의 HLA-B44 분자에 결합하는 능력으로 인하여 이들은 표면에 HLA-B44 분자를 나타내는 세포를 동정하는데 특히 유용하다.
본 발명의 펩티드는 출원번호 제 08/233,305호(본 출원의 출원인과 동일)에 개시된 펩티드와 유사하다. 즉:
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
(서열번호 3)
상기의 칸나등(Khanna, et al.)은 데카머 즉:
Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe
(서열번호 4)
를 나타내나, 데카머의 변형이 효과적인 노나머를 이끄는 방법에 대해서는 설명이 없다.
따라서 본 발명은 HLA-B44 분자에 결합하고, 이어서 CTL에 의해 용해를 자극하는 종양 거부 항원에 관련된다.
나타난 바와 같이, TRA와 HLA 분자의 복합체를 세포용해성 T 세포 반응을 자극하고, 이렇게 단리된 종양 거부 항원 및 HLA-B44 분자의 복합체 또한 본 발명에 포함되며, 이미 설명한 핵산 분자에 의해 암호화되는 단리된 종양 거부 항원 전구체 또한 마찬가지이다.
여기에서 설명되는 본 발명은 각종 용도를 포함하고 있으며, 이들 중 일부는 여기에서 설명된다. 우선, 상응하는 종양 거부 항원 전구체를 암호화하는 핵산 분자 및, 특히 HLA-B44 분자에 의해 나타나는 종양 거부 항원의 동정은 당업자로 하여금 TRAP의 발현으로 특징지워지는 질병을 진단할 수 있게 한다. 이들 방법은 TRPA 유전자의 발현, 및/또는 HLA 분자에 의해 나타나는 TRA와 같은, 여기에서 유래하는 TRA들을 측정하는 것에 관련된다. 다른 TRA들도 본 발명의 TRAP로부터 유래할 수 있으며, 다른 HLA 분자에 의해 나타날 수도 있다. 전자의 경우, 그러한 측정은 폴리메라제 연쇄 반응법을 포함한, 어떠한 표준 핵산 측정 분석법 또는, 표지된 하이브리다이제이션 프로브(hybridization probe)에 의한 분석법에 의해 이루어진다. 후자의 경우, 항체와 같은, TRA 및 HLA의 복합체의 결합 상대가 특히 바람직하다.
TRAP 유전자의 단리는 또한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 TRAP 분자등, TRAP 분자 자체를 단리하는 것을 가능하게 한다. TRA 또는 TRA와 HLA-B44의 복합체로 나타나는, 이들 단리된 분자의 펩티드 단편은 TRAP 분자의 발현이 특징인 질병을 치료하는데 유용한 백신을 생산하는 아쥬번트(adjuvants) 같은 물질과 함께 사용할 수 있다. 더욱이, 백신은 비증식성 암세포, 비증식성 감염체 등과 같은, 표면에 TRA/HLA 복합체를 나타내는 세포로부터 제조할 수 있다. 세포가 백신으로 사용되는 모든 경우에서, 이들은 CTL 반응을 증명하는데 필요한 성분들 하나 또는 양쪽 모두에 대한 암호화 서열로 감염된 세포들이거나, 감염 없이 양 분자를 발현하는 세포들이다. 더욱이, TRA 및 HLA의 복합체 뿐만 아니라, TRAP 분자들, 관련된 TRA들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여, 항체를 생산하는데 사용된다.
여기에서 사용한 "질병"이란, 종양 거부 항원 전구체가 발현하는 모든 병리학적 상태를 말한다. 이러한 질병의 예로는, 암, 특히 흑색종이 있다.
공지 문헌에 기초한 치료적 접근은, 피검자의 면역 체계에 의한 반응을 전제로 하고, 관련 HLA 분자를 나타내는 세포와 같은, TRA를 나타내는 세포의 용해에 관련된다. 이러한 접근중 하나는 복합체에 특이적인 CTL을 계쟁중인 표현형의 이상 세포를 가지는 피검자에게 투여하는 것이다. 이러한 CTL을 시험관(in vitro)에서 개발하는 것은 당업자의 기술 영역 범위내이다. 구체적으로는, 혈구세포와 같은 세포 샘플을 복합체를 나타내고 특정 CTL의 증식을 자극할 수 있는 세포에 결합시킨다. 타게트 세포는 상기에서 설명한 형태의 COS 세포와 같은 감염체일 수 있다. 이들 감염체들은 표면에 복합체를 나타내고, 주요 CTL과 결합하면, 그 증식이 자극된다. 여기에서 사용한 것과 같은 COS 세포들은 다른 적절한 숙주 세포와 같이 광범위하게 유용하다.
채용 전이라고 불리는 치료 방법을 더 자세히 설명하자면, (문헌 [Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917 (1986); Reddel et al, Science 257: 238 (7-10-92): Lynch et al, Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410 (1991); Kast et al, Cell 59: 603-614 (11-17-89)]), 원하는 복합체를 나타내는 세포들은 CTL과 결합되어 거기에 특이적인 CTL들을 증식한다. 이어서 증식된 CTL들을 특정 복합체를 나타내는 이상 세포들에 의해 특징지워지는 세포 이상을 가지고 있는 피검자에게 투여한다. 이때, CTL들은 이상 세포를 용해하여, 목적하던 치료가 이루어진다.
상기의 치료는 피검자의 이상 세포중 적어도 일부는 HLA/TRA 복합체를 나타낸다는 가정을 하고 있다. 특정 HLA 분자를 나타내는 세포를 동정하는 방법 및 지적된 서열을 포함하는 DNA를 발현하는 세포를 동정하는 것은 업계에서 공지되어 있으므로, 이는 매우 쉽게 측정될 수 있다. 일단 단리되면, 이러한 세포들은 피검자의 이상 세포 샘플과 함께 사용하여 시험관 내에서 용해를 측정한다. 용해가 관찰되면, 이러한 치료법에서 특정 CTL의 사용은 이상 세포와 관련된 조건을 완화할 수 있다. 관련성이 덜한 한 방법에서는 표준 분석법을 사용하여, HLA 표현형에 대한 이상 세포를 검사하고, 예를 들어 PCR을 사용한 증량을 통해 발현을 측정한다.
채용 전이는 본 발명에 따른 유용한 치료법중 유일한 형태는 아니다. 수많은 방법을 사용하여, CTL을 생체내에서 자극할 수도 있다. 한 방법, 즉 복합체를 발현하는 비증식성 세포의 사용이 상기에 설명되고 있다. 이 방법에서 사용한 세포들은 조사된 흑색종 세포 또는 복합체의 제조에 필요한 유전자 하나 또는 양쪽 모두에 의해 감염된 세포와 같은 복합체를 발현하는 것들이다. 문헌 [Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110-114 (January, 1991)]에서 이 방법을 예로 들어, 치료방법에서 HPVE7 펩티드를 발현하는 감염된 세포의 사용을 보이고 있다. 각종 형태의 세포들을 사용할 수 있다. 유사하게, 관심사인 유전자 하나 또는 양쪽 모두를 수반하는 벡터를 사용한다. 특히 바이러스 또는 박테리아 벡터가 바람직하다. 이들 체계에서는, 관심 대상 유전자는 예를 들어 우두종 바이러스 또는 박테리아 BCG에 의해 수송되고, 물질들을 실제로 숙주 세포를 "감염"시킨다. 현재의 복합체를 야기하고, 자가조직의 CTL에 의해 인지되는 세포들이, 이제 증식한다. 종양 거부 항원 또는 전구체 그 자체를 아쥬번트와 결합하여 관심 HLA 분자를 나타내는 세포에 삽입하는 것을 용이하게 함으로써 유사한 효과를 얻을 수 있다. TRA가 나타나는데 더 이상의 처리가 필요하지 않은 반면에, TRAP는 처리되어 HLA 분자의 펩티드 상대를 생산한다.
본 발명의 다른 면은 당업자에게 명백하므로 여기에서 반복할 필요가 없다.
사용한 용어 및 표현은 설명을 하기 위함이며 제한할 목적이 아니고, 이러한 용어 및 표현을 사용하여 보여지고 설명된 특징 또는 그 부분들의 등가물을 배제하려는 의도는 없으며, 각종 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능함을 인지하여야 한다.
(1) 일반 정보:
(ⅰ) 출원인: Herman, Jean; Coulie, Pierre; Boon-Falleur, Thierry; van der Bruggen, Pierre; Leuscher, Immanuel.
(ⅱ) 발명의 명칭: HLA-B44 분자에 의해 나타나는 종양 거부 항원 및 그 용도
(ⅲ) 서열 수: 30
(ⅳ) 서신 주소:
(A) 수신인: Felfe & Lynch
(B) 거리: 805 3번 가
(C) 도시: 뉴욕시
(D) 주: 뉴욕
(E) 우편번호: 10022
(ⅴ) 컴퓨터 가독 형태:
(A) 매채 형태: 디스켓, 3.5 인치, 360 kb 스토리지
(B) 컴퓨터: IBM
(C) 작동 시스템: PC-DOS
(D) 소프트웨어; 워드퍼펙
(ⅵ) 현 출원 정보:
(A) 출원번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(ⅶ) 종전 출원 정보:
(A) 출원번호: 08/602,506
(B) 출원일: 1996.2.20
(ⅶ) 종전 출원 정보:
(A) 출원번호: 08/531,864
(B) 출원일: 95.9.21
(ⅶ) 종전 출원 정보:
(A) 출원번호: 08/373,636
(B) 출원일: 95.1.17
(ⅶ) 종전 출원 정보:
(A) 출원번호: 08/253,503
(B) 출원일: 94..6.3
(ⅷ) 변호사/대리인 정보:
(A) 이름: Hanson, Norman D.
(B) 등록번호: 30,946
(C) 참조/도케트 번호: LUD 5436-PCT
(ⅸ) 통신정보:
(A) 전화: (212) 688-9200
(B) 팩스: (212) 838-3884
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 염기쌍 1986
(B) 유형: 핵산
(C) 스트랜드성(strandedness): 단일
(D) 형태: 선형
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 2의 정보:
(ⅰ) 서열 특징
(A) 길이: 아미노산 잔기
(B) 유형: 9개의 아미노산
(C) 형태: 선형
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 3에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 9개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): HLA-B44 결합 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 4에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): 칸나(Khanna) 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 5에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 6에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 17개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 7에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 19개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 8에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 9에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 11에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 12에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 19개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 14에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 19개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 15에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 19개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 16에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 18개의 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 핵산
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): PCR 프라이머
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 17에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-3 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 18에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 9개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key):
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 19에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 9개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-3 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 20에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 8개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-3 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 21에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-3 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 22에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 9개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-3 펩티드
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 23에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): HLA-B44 모티프
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 24에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): HLA-B44 모티프
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 25에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-1/HLA-B44
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 26에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-2/HLA-B44
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 27에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-4/HLA-B44
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 28에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-5/HLA-B44
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 29에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-6/HLA-B44
(?) 서열 기재:
(2) 서열번호 30에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 10개의 아미노산
(B) 유형: 핵산
(C) 형태: 선형
(ⅱ) 분자 유형: 단백질
(ⅸ) 특징:
(A) 이름/양식(key): MAGE-12/HLA-B44
(?) 서열 기재:

Claims (6)

  1. 아미노산 서열:
    Xaa Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr (서열번호 23)
    또는 아미노산 서열
    Xaa Glu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr (서열번호 24)로 구성되고(단, 상기 펩티드는 서열번호 17이 아님) HLA-B44 분자에 결합되는 단리된 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 단리 펩티드는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 펩티드.
  3. 샘플을 제1항의 단리된 펩티드와 접촉시키는 단계 및 상기 샘플내 HLA-B44 양성 세포의 측정으로서 상기 펩티드의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 샘플내 HLA-B44 양성 세포의 동정 방법.
  4. 서열번호 17과 HLA-B44 분자의 복합체에 특이적인 단리된 세포용해성 T 세포 클론.
  5. 제4항에 있어서 상기 HLA-B44 분자가 HLA-B*4402 분자인 단리된 세포용해성 T 세포 클론.
  6. 제4항에 있어서, 상기 HLA-B44 분자가 HLA-B*4403 분자인 단리된 세포용해성 T 세포 클론.
KR1019980706450A 1996-02-20 1997-02-05 Hla-b４４ 분자에 의해 인식되는 종양 거부 항원 및그 용도 KR19990087064A (ko)

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