JP3256749B2 - Ｈｌａ―ｂ４４分子によって提示される腫瘍拒絶抗原とその利用方法 - Google Patents

Ｈｌａ―ｂ４４分子によって提示される腫瘍拒絶抗原とその利用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は、現在米国特許第5,589,334号となってい
る、1994年６月３日出願の同時係属出願第08/253,503号
の一部継続出願である、1995年１月17日出願の第08/37
3,636号の一部継続出願である、1995年９月21日出願の
第08/531,864号の一部継続出願である。これらのすべて
の出願は、参考文献として本出願にその内容が合体され
る。
発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体由来で、HLA分子、特
にHLA−B44によって提示される単離ペプチドと、その利
用方法に関する。更に、本発明は、その異常細胞がこれ
らのペプチオとHLA分子との複合体を提示する、細胞異
常によって特徴付けられる病気であると診断される個体
を同定する能力と、前記提示されるペプチド、およびそ
の効果とに関する。
背景および従来技術 哺乳類の免疫系が外来のまたは異質の物質を認識し
て、それらと反応するプロセスは複雑なものである。こ
のシステムの重要な局面は、Ｔ細胞応答である。この応
答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“HLA"）、または、
主要組織適合遺伝子複合体（“MHC"）と称される細胞表
面分子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、その複
合体と相互作用することを必要とする。前記ペプチド
は、HLA/MHC分子も提示する細胞によってプロセシング
されるより大きな分子に由来する。この点に関しては、
メール（Male）他,Advanced Immunology（J.P.Lipincot
t Company,1987），特にその６−10章を参照。Ｔ細胞と
HLA/ペプチド複合体の相互作用は制限されたものであ
る。即ち、HLA分子とペプチドとの特定の組み合わせに
対して特異的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ
細胞が存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が
存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細
胞が存在していても、それに特異的な複合体が存在しな
ければ応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対
する免疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対
する応答に関与している。最近、タンパク質がHLA結合
ペプチドへとプロセシングされるメカニズムに関して多
くの研究がなされてきている。この事については、バリ
ナガ（Barinaga）,Science 257:880（1992）；フリーモ
ント（Fremont）他,Science 257:919（1992）：マツム
ラ（Matsumura）他,Science 257:927（1992）；ラトロ
ン（Latron）他,Science 257:964（1992）を参照。
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムはガンにも関
係している。たとえば、1992年５月22日出願、1992年11
月26日公表で、参考文献として本出願にその内容を合体
させるPCT出願PCT/US92/04354には、一つの遺伝子ファ
ミリーが開示されており、それらはプロセシングされて
ペプチドとなり、次に細胞表面に発現され、特異的なCT
Lによって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができる。
これら遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体”即ち“TRAP"
分子をコードするものであると言われ、これら分子に由
来するペプチドは、“腫瘍拒絶抗原”即ち“TRA"と称さ
れる。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴ
ァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics 35:145（19
92）；ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）
他,Science 254:1643（1991）を参照、又、参考文献と
して本出願にその内容を合体させる米国特許第5,342,77
4号も参照。
その開示内容を本出願に参考文献として合体させる米
国特許第5,405,940号において、HLA−A1分子に係合する
ノナペプチドが教示されている。前記参考文献は、特定
のHLA分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれ
ば、ある特定のペプチドは一つのHLA分子に対して結合
するが、他のHLA分子に対しては結合しないであろうと
推測される、ということを教示している。これは重要な
ことである。なぜなら、異なる個体は異なるHLA表現型
を有するからである。そのため、ある特定のペプチド
が、ある特定のHLA分子に対するパートナーであると同
定されたことが、診断上および治療上の効果を有してい
るとしても、その効果はその特定のHLA表現型を有する
個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一
つの特定のHLA表現型に限られるものではないため、ま
た、標的化療法（targeted therapy）には、問題の異常
細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、
この分野において更なる研究を行う必要がある。
酵素チロシナーゼは、チロシンをジヒドロキシフェニ
ルアラニン、即ち“DOPA"に変換する反応を触媒し、メ
ラノサイトに選択的に表現されるように思われる（マラ
ー（Muller）他,EMBO J7:2715（1988））。前記ヒト酵
素に対するcDNAの初期の報告は、クウォン（Kwon）の米
国特許第4,898,814号に見られる。ブチャード（Bouchar
d）他,J.Exp.Med.169:2029（1989）によるそれより後の
報告では、わずかに異なる配列を示している。それが色
素異常症に関連付けられていることから、この酵素に対
する阻害剤を同定することに多大な労力が投じられてき
た。この文献のいくつかの具体例としてジンバウ（Jinb
ow）,WO9116302;ミシマ（Mishima）他，米個特許第5,07
7,059号、およびナザロポール（Nazzaropor）、米国特
許第4,818,768号がある。当業者には、類似の物質を教
示するその他の参考文献も周知であろう。
1993年６月23日出願で、参考文献として本出願にその
内容を合体させる米国特許出願第08/081,673号は、チロ
シナーゼが、外来性の抗原またはTRAP分子と同様に処理
され得ることを教示している。即ち、メラノーマ等のあ
る種の細胞異常において、チロシナーゼがプロセシング
され、それに由来するペプチドがある種の異常細胞上に
おいてHLA分子と複合体を形成することが判明したので
ある。これら複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞（“CTL"）に
よって認識され、その後、CTLが提示細胞を溶解するこ
とが判った。この驚くべき意外な現象の効果が記載され
た。現在、同様にHLA−A2分子によって提示される腫瘍
拒絶抗原として作用する別のペプチドが発見されてい
る。これらは、1994年２月28日出願で参考文献として本
出願にその内容を合体させる第08/203,054号に記載され
ている。
1994年４月26日出願で参考文献として本出願にその内
容を合体させる米国特許出願第08/233,305号は、チロシ
ナーゼは、また、プロセシングされてHLA−B44分子によ
って提示される抗原にもなるということを開示した。こ
の知見は重要であった。というのは、すべての個体がHL
A−A2+というわけではないからである。しかしながら、
チロシナーゼがHLA−B44提示ペプチドへとプロセシング
されるという知見によって、すべてのHLA−B44+腫瘍の
診断および治療に対する普遍的なアプローチが提供され
るわけでなない。なぜならば、チロシナーゼ発現は普遍
的ではないからである。更に、チロシナーゼが腫瘍細胞
のみならず正常細胞によっても発現されるという事実
は、同治療領域においてかなりの注意が必要であること
を示唆するものである。
集団解析によると、コーカソイド集団の約22−24％が
HLA−B44分子を発現することが示されている。例えば、
イマニシ（Imanishi）他,inツジ（Tsuji）他,ed.,“HLA
1991,Vol.I.XIth International Histocompatibility
Workshop And Conference",Oxford University Press,1
991;Lee in Lee ed.,The HLA System:A New Approach.S
pringer,pp.141−178（1990）を参照。以前の研究によ
って、すべての移転性メラノーマ腫瘍の約76％が、MAGE
−３を発現するということが示されている（ブラッスー
ル（Brasseur）他,Int.J.Cancer 63:375−380（199
5））。したがって、コーカソイド集団における転移性
メラノーマのおよそ17％が、その表面にHLA−B44とMAGE
−３由来ペプチドとからなる複合体を提示しているはず
であり、明らかに診断および治療に対する示唆を与えて
いる。フライシュハウアー（Fleishhauer）他,Tissue A
ntigens 37:133−137（1991）；ペータースドルフ（Pet
ersdorf）他,Tissue Antigens 44:211−216（1994）；
ヤオ（Yao）他,Immunogenetics 40:310;ヤオ（Yao）他,
Human Immunol 42:54−60（1995）；ヤオ（Yao）他,Imm
unogenetics 41:387（1995）によって示されているよう
に、５つの異なるHLA−B44対立遺伝子が同定されてい
る。HLA−B44を発現するコーカソイド集団においては、
61％がHLA−Ｂ★4402対立遺伝子を、そして36％が対立
遺伝子HLA−Ｂ★4403を提示している。ヤオ（Yao）他,H
uman Immunol.42:54−60（1995）を参照。これら２つの
対立遺伝子の間にはアミノ酸156において生じる、ただ
１つの相違がある。HLA−Ｂ★4402では、この位置はAsp
によって占められているが、HLA−Ｂ★4403においては
それはLeuによって占められている。HLA−Ｂ★4402およ
びHLA−Ｂ★4403対立遺伝子に関して異なっているドナ
ーとレシピエントの間には、骨髄同種異系移植片拒絶反
応および移植片対宿主疾患が観察されてきた。アミノ酸
156はα２ヘリックスの中間に位置しており、ペプチド
結合部位に達しているので、これらの異なるHLA−B44対
立遺伝子が異なるペプチドを提示するか否かを判定する
のは興味深いことであった。
カンナ（Khanna）他,J.Exp.Med.176:169−179（1992
年６月）は、HLA−B44結合ペプチドを開示し、これにつ
いては後に詳述される。このカンナ（Khanna）のペプチ
ドは、本出願で請求されているペプチドとは関係してい
ない。
キタ（Kita）他,Hepatology 18（５）;1039−1044（1
993）は、HLA−B44に結合し、溶解を引き起こすといわ
れる20アミノ酸ペプチドを教示している。
ソープ（Thorpe）他,Immunogenetics 40:303−305（1
994）は、HLA−B44に結合することが判った二つのペプ
チドのアラインメントについて議論し、普遍的な結合モ
チーフを示唆している。このソープ（Thorpe）の開示
は、位置２における負に荷電したアミノ酸と、位置９に
おける疎水性であるか、または正に荷電したアミノ酸と
について言及している。
フライシュハウアー（Fleischhauer）他,Tissue Anti
gens 44:311−317（1994）は、HLA−B44結合ペプチドの
概観を含んでいる。
今回、MAGE−３も又、HLA−B44分子によって提示され
る一つの腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされる腫瘍拒絶
抗原前駆体を発現することが判った。このペプチドは、
同様にMAGE−３由来で、HLA−A1に結合することが知ら
れているペプチドとは、Ｎ末端の一つの追加アミノ酸に
よって区別されることが注目される。これが、とりわ
け、下記の本発明の開示の課題である。
図面の簡単な説明 図１は、三種類の細胞ライン（LB33−MELc1,LB33EBV
−ＢおよびK562）のいずれかを使用した、細胞溶解性Ｔ
細胞クローン159/5による、クロム放出試験の結果を示
している。データは、エフェクター／標的比に対する溶
解の％として示されている。
図２は、細胞変異体（variant）、“A-",“B-"および
“A-,B-"を同定した溶解研究の結果を示している。ここ
でも、クロム放出試験が使用された。テストした両方の
CTLラインによる陽性の溶解によって示されているよう
に、細胞ラインLB33−MELc1はA+B+である。CTL159/3は
抗−Ａであり、これに対して、CTL159/5は抗−Ｂであ
る。
図３は、前記変異体A-B-を、HLA−A28,HLA−B44,HLA
−Cw7のいずれかに対するコード配列でトランスフェク
トした場合に得られた結果を、コントロールラインとの
比較において示している。これらの結果は、CTL159/5を
使用した敏感なTNF放出試験（pg/ml）について示されて
いる。
図４は、CTL159/5によるTNF放出を示し、ここでは、C
OS細胞を、HLA−B44で、または、HLA−B44と本発明によ
る核酸分子とでトランスフェクトした。
図5Aは、CTL159/5と接触させた場合の、EBV−Ｂ細胞
における51Cr放出を示している。
図5Bは、類似のものであるが、ただし、LB33−MEL B
-細胞を使用した。図5Aと図5Bとのそれぞれにおいて、
本発明の抗原ペプチドは、CTLとの接触の前に、前記細
胞に接触させた。
図６は、メラノーマクローンラインLB33.MEL.A−１由
来の抗原欠損（antigen loss）変異体に対する、種々の
自己CTLクローンの溶解活性を示している。
図７は、LB33−MEL.A−１の抗原欠損変異体による、H
LA−A24,A28,B13分子の発現を示す結果を表している。
腫瘍細胞は、予め、特定のHLA分子に対するマウス抗体
とインキュベートされ、その後、フルオレセイン標識化
ヤギ抗−マウス抗体で標識された。
図８は、種々のHLA対立遺伝子でトランスフェクトさ
れた、抗原欠損変異体によって刺激されたCTLクローン
による腫瘍壊死因子（TNF）の産生を示す。トランスフ
ェクトされていないLB33−MEL.A−１細胞を、抗原欠損
変異体とともに、コントロールとして使用した。使用さ
れたCTLクローンは、それぞれ抗−Ａ、抗−Ｂ、抗−C
A、抗−Cbおよび抗−Ｄ CTLに対応する159/3、159/5お
よび204/26、179c/50、そして202/1であった。
図９は、図６および図８に記載されたCTLクローンの
細胞溶解活性に関するさらなるデータを示す。細胞ライ
ンLB33−MEL.Aは、1988年の手術後に得られた。細胞ラ
インLB33−MEL.Bは、患者において1993年に発生した転
移から得た。
図10Aおよび図10Bは、自己メラノーマ細胞に対する抗
−Ｅ CTLクローンLB33−CTL−269/1の溶解活性を示
し、これに対して、図10Cは、LB33−MEL.B−１細胞によ
る刺激後の、同じCTLクローンによるTNFの産生を示して
いる。刺激細胞（10,000/マイクロウェル）を、3000のC
TLとともに16時間インキュベートした。前記CTLによっ
て放出されたTNFの濃度は、TNF感受性WEHI−164c13細胞
を使用して測定した。ハイブリドーマ細胞を接種された
マウスから得られた腹水液の1/100希釈液を添加するこ
とによって、抗HLA−A24モノクローナル抗体C7709A2を
使用して、CTL刺激を阻害した。
図11Aおよび11Bは、配列番号17,18,19,3をコンペティ
ティブ結合アッセイにおいてテストした、アッセイの結
果を示している。
図12は、配列番号17を、HLA−B44を自然に提示する細
胞に関して、51Cr放出試験において使用した時に得られ
た結果を示している。
図13は、標的細胞が、ガン細胞ライン等のように天然
でHLA−B44陽性であった時の51Cr溶解試験の結果を要約
している。
図14は、コンペティティブ結合アッセイにおいて、配
列番号17および３がテストされた研究の結果を示してい
る。
図15Aは、51Cr放出試験における、溶解アッセイの結
果を示している。ここで、ドナーLB816から得たリンパ
球が、HLA−Ｂ★4402提示細胞に対してテストされてい
る。図15Bは、ドナーLB822から得たリンパ球CTL LB822
と、HLA−Ｂ★4403提示細胞を使用した際における、同
様の情報を示している。
図16は、配列番号17とHLA−B44分子とからなる複合体
に対して特異的なCTLの特異性を確認するデータを示し
ている。
図17は、MAGE−３とHLA−B44に対して特異的なCTLの
特異性を確認するデータを示している。
図18は、自然にHLA−B44分子を提示し、そしてMAGE−
３も発現する細胞について、本出願で論じられたCTLで
テストした際に得られた結果を要約している。
好適実施例の詳細説明 例１ 下記の実験において、既に長年に渡って研究者にとっ
て入手可能であるメラノーマ細胞ラインLB33−MELを使
用した。これに由来するクローンも使用した。このクロ
ーンを、以後、LB33−MELc1と称する。
単核血液細胞を含む複数のサンプルを、患者LB33から
採取した。前記メラノーマ細胞ラインを、これらの単核
血液細胞含有サンプルに接触させた。これらの混合物に
ついて前記メラノーマ細胞ラインの溶解を観察した。こ
の溶解は、前記メラノーマ細胞によって提示される、ペ
プチドとHLA分子とからなる複合体に対して特異的な細
胞溶解性Ｔ細胞（“CTL"）がそのサンプル中に存在して
いることを示すものである。
使用した溶解アッセイは、参考文献として本出願にそ
の開示内容を合体させるヘリン（Herin）他,Int.J.Canc
er 39:390−396（1987）によるクロム放出試験であっ
た。しかし、このアッセイについてここで説明してお
く。標的メラノーマ細胞を、イン・ヴィトロで成長さ
せ、次に、10mM HEPESと30％FCS（即ち、ウシ胎児血清
由来）とを追加したDMEM中に107細胞/mlで再懸濁し、20
0μCi/mlのNa（51Cr）O4とともに37℃で45分間インキュ
ベートした。標識された細胞を、10mM Hepesを追加し
たDMEMで３回洗浄した。次に、これらを、10mM Hepes
と10％FCSとを追加したDMEM中に再懸濁し、その後、そ
れぞれ103個の細胞を含む100μｌのアリコットを、96穴
マイクロプレートに分配した。PBLのサンプルを、同じ
培値100μｌ中で添加し、アッセイを二連で行った。プ
レートを、100gで４分間遠心分離し、5.5％CO2雰囲気
中、37℃で４時間インキュベートした。
プレートを再び遠心分離にかけ、上清の100μｌのア
リコットを、収集し、カウントした。51Cr放出の百分率
を以下のように計算した。
ここで、ERは観察された、実験による51Cr放出量、SR
は、200μｌの培地のみの中で103個の標識された細胞を
インキュペートすることによって測定された自発的放出
量、そしてMRは、100μｌの0.3％Triton Ｘ−100を標
的細胞に添加することによって得られる最大放出量であ
る。
高いCTL活性を示した単核血液サンプルを、拡張し、
限界希釈法によってクローン化し、同じ手法を使用して
再度スクリーニングした。
標的K562細胞をテストするのにも同じ手法を使用し
た。EBV−Ｂ細胞を使用した時の唯一の相違点は、DMEM
培地を、５％FCSを追加したハンクス培地（Hank's medi
um）に置換したことであった。
これらの実験によって、CTLクローンLB3−CTL−159/5
が単離された。図１は、このクローンが腫瘍細胞を溶解
したが、EBV−Ｂ細胞やK562細胞は溶解しなかったこと
を示している。
同じプロトコールに従い、第２のCTLクローン、即
ち、LB33−CTL−159/3を単離した。これらのラインを、
それぞれ、“159/5",“159/3"と称する。この第２のCTL
は159/5とは異なる特異性を有する。このことは、以下
の２つの抗原欠損変異体の単離によって確認された。即
ち（ｉ）159/5によって溶解され、159/3によっては溶解
されないものと、（ii）159/5によっては溶解されず、1
59/3によって溶解されるもの、である。これらの変異体
を、それぞれ、“A-"と“B-"と称する。
前記A-変異体を、次に、159/5で免疫選抜（immunosel
ect）し、第３の変異体を得たが、これは、159/5と159/
3のいずれによっても溶解されなかった。この変異体をA
-B-と称する。図２は、これらの変異体の単利を導いた
溶解アッセイの結果を要約している。
例２ 変異体A-B-のHLA発現パターンを判定することが注目
された。親ラインLB33−MELの起源である患者を、HLA−
A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7であるとタイプした。PCR発現
分析を行った時、LB33−MELc1とB-変異体との両方が６
つ全部の対立遺伝子を発現するのに対して、A-B-変異体
は、HLA−A28,B44およびCw7を発現しないということが
判った。その結果、これらのHLA分子の一つが、CTLによ
る溶解をもたらす抗原を提示するものであると結論され
た。下記の例においてこれを更に探求する。
例３ A-B-変異体のサンプルを、HLA−A28,HLA−B44またはH
LA−Cw7のいずれか一つをクローニングしたプラスミドp
cDNA−I/AmpIでトランスフェクトした。選抜後、細胞
を、参考文献として本出願にその内容を合体させるトラ
ヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics 35:145−
152（1992）に従ってTNF放出試験でテストした。その結
果を図３に要約するが、これは、HLA−B44が明らかに抗
原の提示に関連していることを示している。
例４ 提示HLA分子が同定されたので、以後、提示ペプチド
のソースである“腫瘍拒絶抗原前駆体”即ち、“TRAP"
分子と称される分子を同定するための研究を行った。
これを行うために、トータルmRNAを、細胞ラインLB33
−MELc1から単離した。前記メッセンジャーRNAは、周知
の技術に従って、オリゴ−dT結合キットを使用して単離
した。メッセンジャーRNAを確保した後、これを、再び
標準手法を使用してcDNAへと転写した。次に、製造業者
の指示に従って、前記cDNAを、EcoR Iアダプターに結合
させ、プラスミドpcDNA−I/AmpのEcoR I部位にクローニ
ングした。次に、これらの組換えプラスミドを、DH5α
大腸菌（E.coli）にエレクトロポーレーションした（エ
レクトロポーレーション条件:25μファラドで１パル
ス、2500V）。
前記トランスフェクトされた細菌を、アンピリシン
（50μg/ml）で選抜し、次に、それぞれが100の細菌か
らなる複数のプールに分けた。分析によると、約50％の
プラスミドがインサートを含んでいることが示されたの
で、各プールは約50種類のcDNAを代表するものであっ
た。各プールを、飽和するまで増幅し、プラスミドDNA
を、マニアティス（Maniatis）他,in Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual（Cold spring Harbor,N.Y.,198
2）に従って、アルカリ法、酢酸カリウム沈殿およびフ
ェノール抽出によって単離した。セシウム勾配遠心法は
使用しなかった。
増幅したプラスミドを、次に、真核細胞にトランスフ
ェクトした。COS−７細胞のサンプルを、10％ウシ胎児
血清を追加したダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbeco'
s modified Eagles medium）（“DMEM"）中に、組織培
養平底マイクロウェルに、15,000細胞／ウェルの割合で
播種した。これらの細胞を、37℃で一晩インキュベート
し、培地を除去し、次にこれを、30μl/ウェルの、10％
Nu血清、400μg/ml DEAE−デキストラン、100μＭクロ
ロキン、およびLB33由来のHLA−B44に対するcDNAを有す
るプラスミド100ngを含むDMEM培地と交換した。37℃で
４時間のインキュベーション後、前記培地を除去し、こ
れを、10％DMSOを含有するPBS50μｌと交換した。この
培地を２分後に除去し、これを、10％のFCSを追加したD
MEM200μｌと交換した。
この培地の交換後、COS細胞を、37℃で48時間インキ
ュベートした。次に、培地を捨て、10％のヒトプール血
清と25U/mlのIL−２とを含む100μｌのIscove培地中に
て、2000個の159/5細胞を添加した。上清を24時間後に
除去し、TNF含量を、その開示内容を本出願に参考文献
として合体させるトラヴァーサリ（Traversari）他,Imm
unogenetics 35:145−152（1992）に記載されている要
領で、WEHI細胞に対するアッセイにおいて測定した。一
つのプールがバックグラウンド以上のTNF放出を刺激
し、これらの細菌をクローン化し、次の実験に使用し
た。
例５ 例４でクローン化された細菌からプラスミドDNAを抽
出し、前述したものと同じ要領で、COS細胞の新しいサ
ンプルにトランスフェクトし、これらの細胞を、再び、
159/5の刺激に関してテストした。図4Aに要約されてい
るデータによって示されているように、クローン350/2
において一つの陽性クローンが見つかった。
この時点までに得られた結果を確認するために、ATCC
から容易に入手可能なヒト絨毛ガン細胞ラインJARを使
用した。この細胞ラインは、HLA分子を発現せず、ま
た、CTL159/5によって認識されない。JARをHLA−B44cDN
Aでトランスフェクトした時、それはCTL159/5によって
まだ認識されなかった。しかし、HLA−B44と350/2cDNA
とによる同時トランスフェクションによって、図4Bに示
されるように、溶解が起こった。
前記陽性クローンからのプラスミドを取り出し、これ
を、当該技術分野において公知の技術に従って配列決定
した。その情報は、前記プラスミドインサートが1896塩
基対長であることを示しており、データバンクのいずれ
の配列ともホモロジーを示さなかった。このヌクレオチ
ド配列を、配列番号１として本出願に示す。
例６ 腫瘍拒絶抗原であるペプチドを確認するために、平均
で約300塩基対の、配列番号１の断片をPCRで増幅し、pc
DNA−1Ampにクローニングし、次に前記諸例のプロトコ
ールに従って、HLA−B44をコードするプラスミドととも
に、COS細胞に同時トランスフェクトした。これらの実
験によって、配列番号１の683−955のヌクレオチド残基
に対応する領域が、抗原ペプチドをコードするものであ
ることが同定された。この領域を、カンナ（Khanna）
他,J.Exp.Med.176:169−176（7/92）によって記載され
ているペプチド、及び、1994年４月26日出願の第08/23
3,305号に記載されているペプチドと比較したところ、
配列番号１の核酸残基782−808にコードされる、 がこれらの残基に対応している。従って、この配列に対
応するペプチドを合成して、HLA−B44+細胞ラインを感
作するのに使用した。その結果を、図5A,5Bに示すが、
これらは、EBVトランスフォームＢ細胞を使用した場合
（図5A）と、前述したB-変異体を使用した場合（図5B）
の51Cr放出試験の結果を示している。これらの細胞を、
CTL159/5を添加する前に、様々な濃度の前記ペプチドと
ともに、37℃で30分間インキュベートした（エフェクタ
ー／標的比:10:1）。100−200ng/mlのペプチドで最大半
減の溶解が得られた。
例７ 前述した例１−６は、細胞ラインLB33−Melc1を使用
した研究を記載するものである。患者LB33からの皮膚転
移由来の細胞ラインも得た。その一つのラインはLB33−
MEL.A−１であり、これを下記の例に使用する。
先ず、前記細胞ラインを、例１−６の細胞ラインと同
様にして使用した（ヘリン（Herin）他，前述）。血液
単核細胞（106/ウェル）を、10％のヒトプール血清、ア
スパラギン−グルタミン−アルギニン（それぞれ36mg/m
l,216mg/ml,116mg/ml）、２−メルカプトエタノール
（0.05mM）および5U/mlのヒトIL−４を追加した2mlのIs
cove培地中で、照射された腫瘍細胞（3/105細胞／ウェ
ル）によって刺激した。培養の三日目にIL−２（10U/m
l）を添加した。前記腫瘍細胞の自己CTLに対する感受性
を、前述の例１と同様にして測定した。この実験によっ
て、７つの独立した培養から82の安定した細胞溶解性Ｔ
リンパ球が得られた。これらCTLの全部がCD8+であっ
た。これらは、LB33−MEL.A−１細胞は溶解したが、K56
2または自己のEBVトランスフォーム細胞は溶解しなかっ
たという意味において、腫瘍細胞に対して特異的であっ
た。
例８ LB33−MEL.A−１細胞が自己CTLによって溶解されたと
いう事実によって次の実験が示唆され、これは、抗原欠
損変異体を確立することによって確認される抗原を同定
するためのものであった。
これを行うために、前述の要領で、自己CTLクローンL
B33−CTL159/3によって、前記細胞ラインのサンプル
を、４回選抜した。各ラウンドの選抜は、上述したのと
同様に、２−3x107個の粘着腫瘍細胞を類似数のCTLとと
もに２−６時間インキュベートするものであった。各ラ
ウンドにおいて、CTLを、インキュベーション後に洗い
流し、残存する粘着腫瘍細胞を、次のラウンドの選抜の
前に増幅した。
この手順によって、CTL159/3に対する抵抗性を有する
クローンが得られたが、別の自己CTLでテストした場
合、前述したCTL159/5は、204/26と202/1とを含む他のC
TLクローンと同様に、この欠損変異体を溶解することが
判った。図６、“MEL.A−1.1"と表示されたコラムを参
照されたい。同様に、これら４つのCTLクローンのうち
の一つによっては溶解されないが、他合のものによって
は溶解される更なる細胞ラインが確立された。図６を参
照。このように、４種類の異なる抗原欠損変異体が同定
されたので、少なくとも４つの異なる抗原が、LB33−ME
L.A−１の表面上に提示されることが判った。従って、
図６に示すように、LB33−MEL.A−１は、抗原発現に関
して“A+B+C+D+"（CTL159/3,159/5,204/26および202/1
の全部によって溶解される）であり、MEL.A−1.1はA-B+
C+D+（159/3によっては溶解されず、他によっては溶解
される）であり、MEL.A−1.2はA+B-C+D+（159/5によっ
ては溶解されず、他によっては溶解される）であり、ME
L.A−1.3はA+B+C-D+（204/26によっては溶解されず、他
によっては溶解される）であり、そしてMEL.A−1.4はA-
B+C+D-（202/1または159/3によっては溶解されない）と
考えられる。更に、細胞ラインMEL.A−1.1.1が単離さ
れ、これはA-B-C+D-（204/26のみによって溶解される）
であった。
例７で同定された82のCTLを、これらのラインに対し
てテストしたところ、29個の抗−A,29個の抗−B,10個の
抗−Ｃおよび14個の抗−Ｄクローンが同定され、このこ
とは提示される抗原は他にはないことを示唆している。
抗−Ｄ CTLクローン202/1での選抜によって、抗−Ｂ
CTLでの選抜と同様に（即ち、A-B-C+D-ラインが得ら
れた）、抗−Ａ CTLクローン（159/3）に対しても抵抗
性を示すラインが同定された。この結果は、A-D-とA-B-
D-抗原欠損変異体が、実際に、抗原A,BおよびＤが同じH
LA提示分子を共有するHLA欠損変異体であるか、もしく
は、種々のクラスＩ分子が抗原欠損変異体と共に欠損し
ていた、ということを示唆している。次の諸実験によっ
てこの問題を更に追求した。
例９ LB33細胞ラインの発生源である患者は、以前に、HLA
−A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7として血清学的にタイプさ
れている。次に、前記細胞ラインによるHLAクラスＩ遺
伝子の発現を測定するための研究を行った。
種々のLB33−MEL腫瘍細胞クローンによる前記６つの
クラスＩ対立遺伝子の各々の発現を評価するために、PC
RによるDNA増幅のための半定量的条件を確立した。DNA
増幅の特異性を保証するために、プライマーの3'末端に
おいて必要とされる、完全なヌクレオチド一致に基づ
く、ブラウニング（Browning）他，によって提案された
Amplification Refractory Mutation System（ARMS）PC
R法を使用した。参考文献として本出願にその内容を合
体されるブラウニング（Browning）他,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 90:2842（1993）を参照。LB33をタイプする際
に得られた配列に基づいて、前記６つの対立遺伝子のそ
れぞれを他の５つから区別することを可能にする対立遺
伝子−特異的プライマー（5'プライマーの後に3'プライ
マーを示す）を合成した。
A24に対しては、5'−GCCGGAGTATTGGGACGA、および、 5'−GGCCGCCTCCCACTTGC（配列番号５および６）、 A28に対しては、5'−GGAGTATTGGGACCGGAAG、および、 5'−GGCCGCCTCCCACTTGT（配列番号７および８）、 B13に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAT、および、 5'−CCTTGCCGTCGTAGGCTA（配列番号９および10）、 B44に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAA、および、 5'−CCTTGCCGTCGTAGGCGT（配列番号11および12）、 Cw6に対しては、5'−CCGAGTGAACCTGCGGAAA、および、 5'−GGTCGCAGCCATACATCCA（配列番号13および14）、 Cw7に対しては、5'−TACAAGCGCCAGGCACAGG、および、 5'−CTCCAGGTAGGCTCTGTC（配列番号15および16）。
発現の半定量的測定を行うために、逆転写されたRNAの2
7サイクルのPCR増幅を、それぞれのセットのプライマー
を用いて行い、DNA増幅が、観察されたリニアな範囲に
あることが判った。増幅されたDNAの量を、臭化エチジ
ウムで染色したアガロースゲルで視覚的に評価した。こ
れらの量を、LB33−MEL.A−細胞からのRNAの段階希釈物
のRT−PCR増幅産物を含む標準曲線で得られたものと比
較した。サンプルの発現は、β−アクチン遺伝子の発現
レベルを考慮することによって、RNA整合性に関して、
標準化された。その結果を、LB33−MEL.A−１細胞によ
る発現のレベルと比較して表わした。この研究の結果
を、下記の表１に示す。“＋＋＋”は、LB33−MEL.A−
１細胞の発現の半分以上に対応する発現を示し、“＋
＋”は、発現がLB33−MEL.A−１の発現の1/8から1/2で
あったことを示し、“＋”は発現がLB33−MEL.A−１の
発現の1/8以下であったことを示し、“−”は発現がみ
られなかったことを示している。
表から理解されるように、MEL.A−１細胞とB-変異体と
の両方が６つのHLA対立遺伝子すべてを類似のレベルで
発現した。A-変異体は、Cw7の発現において約４分の１
の減少を示した。残りの抗原欠損変異体は、３つの対立
遺伝子の組の発現における減少を示した。C-細胞につい
ては、HLA−A24,B13およびCw6の発現レベルの減少が見
られたのに対し、A-D-およびA-B-D-変異体は、A28,B44
およびCw7発現の減少を示した。これは、A24−B13−Cw6
とA28−B44−Cw7が患者LB33の二つのHLAクラスＩハプロ
タイプを構成するものであり、これらのハプロタイプの
発現の減少が、恐らく、前記免疫選抜された腫瘍細胞に
よる抗原発現の欠損の原因であった、ということを示唆
している。
例10 HLA遺伝子発現とCTLによる溶解との間の相関関係を確
認するために次の実験を構成した。これを行うために、
前述の要領で測定した所与のHLA遺伝子の発現を、標準
式抗体アッセイを使用して得られた結果と比較した。A2
4,A28とB13についてのみ、それらに対して特異的なマウ
ス抗体（A24用にはC7709A1;A28用には2.28MIそしてB13
用にはＴ48）を使用して、テストした。抗体の結合
を、抗体とインキュベーションし、洗浄し、その後、フ
ルオレセインに結合させたヤギ抗−マウスIg抗体に接触
させることによって判定した。次に、これらの細胞を標
準技術であるフローサイトメトリーによって分析した。
表２にその結果を要約するが、これらは、図７にも示
されている。下記の表２において示されたHLA発現レベ
ルは、図７に図示された平均蛍光強度に対応している。
値は、LB33−MEL.A−１細胞において見られるレベルと
比較して表わされている。
これらの結果から、HLA発現のレベルが、LB33−MEL.A
−１細胞のそれの1/8以下の範囲であると評価された場
合、つまり、HLA表面分子のレベルが検出不能である
か、かろうじて検出可能のいずれかであるという場合、
これは従って、CTLに対する抗原提示がその所与のHLA分
子によるものである可能性が低いことを示唆しているよ
うである。
この点から、又、C-,A-D-およびA-B-D-選抜細胞が、H
LA分子を欠くという理由で抗原の発現を欠損したとする
と、抗原Ａに対するクラスＩ提示分子は、A28またはCw7
であり、抗原Ｂに対するものはB44であり、抗原Ｃに対
するものはA24またはB13またはCw6であり、抗原Ｄに対
するものはA28またはCw7であるように思われる。
例11 上述した諸実験の後、LB33−MEL.A細胞によって発現
される抗原に対する提示分子を決定的に判定するめに更
に研究を行った。これを行うために、特定のHLAクラス
Ｉ分子の発現を欠損した腫瘍細胞を、古典的なリン酸カ
ルシウム沈殿法を使用して、前記特定クラスIcDNAをク
ローニングした発現ベクターpcDNA3でトランスフェクト
した。このベクターは、neoRマーカーを含む。トランス
フェクタントを、1.5mg/mlのG418で選抜し、これを、前
記諸例に記載したTNF試験を用いて、CTLクローンを刺激
するのに使用した。
図８にこれらの結果を示す。抗原Ｂの発現は、HLA−B
44を有するプラスミドでのトランスフェクションによっ
てA-B-D-細胞において回復したが、HLA−A28またはHLA
−Cw7を有するプラスミドでのトランスフェクションに
よっては回復しなかった（図8A）。抗原Ｃの発現は、HL
A B13でのトランスフェクションによってC-細胞におい
て回復した（図8C）。４つの他の抗−Ｃ CTLクローン
も、C-細胞を認識したが、図示されたCTL179C/50を含む
他の５つの抗−Ｃ CTLクローンは、それを認識せず、
むしろ、これらのCTLはHLA−Cw6でトランスフェクトさ
れたC-細胞を認識した（図8B）。従って、２つのグルー
プの抗−Ｃ CTLクローンが存在すると結論することが
できる。一方は、HLA−B13によって提示される抗原を認
識し、他方は、HLA−Cw6によって提示される抗原を認識
する。抗原Ｄに関して、A-D-細胞は、HLA−A28でのトラ
ンスフェクションによって、A-D+に回復した（図8B）。
抗−Ａ CTLによる溶解は抗−クラスＩモノクローナル
抗体W6/32によって完全に阻害されるため、抗原ＡがHLA
−クラスＩ分子によって提示されるものであることが明
らかであるにも拘わらず、cDNAのいずれ（即ち、テスト
されたHLA A28,B44,Cw7）も抗原Ａの発現を回復しなか
った（図8E、8F）。この抗原は、非−A,B,CクラスＩ分
子によって提示されるものであり、それらの２つの対立
遺伝子が患者LB33に存在しており、それらの内の１つ
が、A-D-,A-B-D-細胞において、A28−B44−Cw7ハプロタ
イプと共に欠損している可能性がある。
抗原Ｃに対する結果から、命名法に変化が生じた。以
後、抗原Caと抗原Cbと称する二つの抗原が存在すること
とする。
例12 更なる実験において、ラインLB33−MEL.Bの細胞が、
自己細胞ラインによって認識されるか否かの問題が追及
された。（図９） 照射されたLB33−MEL.B.1細胞を、自己リンパ球を刺
激するのに、前述したのと同様に（ヘリン（Herin）
他）使用した。これらのリンパ球は、1990年または1994
年に患者LB33から採取されていたものである。
1994年採取のリンパ球のみがLB33−MEL.B−１細胞を
溶解したが、これらは、LB33−MEL.A−１細胞は溶解し
なかった。従って、LB33−MEL.B−１ラインは、LB33−M
EL.Aには見られない抗原を提示するものである。
ここに記載した実験と前述した実験とにおいても、過
去における実験と同様に、さらなるCD8+CTLクローンの
パネルが確立された。CTL269/1の反応性のパネルを図10
Aおよび図10Bに示す。“MEL.B−1"とは反応するが（図1
0A）、“MEL.A−1"とは反応しない（図10B）ことに注
目。これによって定義されるこの新規な抗原をLB33−Ｅ
と称する。
抗体阻害実験において、HLA−A24に対するmAbが溶解
を阻害した。これは、図10Cに示されている。従って、
前記“E"抗原は、HLA−A24によって提示される。
例13 参考文献として本出願にその内容を合体させるフライ
シュハウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 44:
311−317（1994）は、HLA−B44結合に対するコンセンサ
スモチーフを教示している。このモチーフは、９または
10のアミノ酸のポリペプチドとして記載され、ここで、
Gluが第２位置において優勢であり、TyrまたはPheが最
後の位置（位置９または10）に存在し、Met等の疎水性
残基が、第３位置に存在している。
MAGE−３ TRAPアミノ酸配列は、このモチーフに対応
する、位置167−176の一続きのアミノ酸を含んでいる。
そのアミノ酸配列は、 Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr（配列番号17）である。
HLA−B44モチーフは、HLA−Ｂ★4402とHLA−Ｂ★4403
と称される少なくとも二つの主要なサブタイプを含むこ
とが知られている。このMHC分子は、すべてのコーカソ
イドの23％に現れる。この数字をメラノーマの標準分析
と組み合わせると、コーカソイドのメラノーマ患者の15
％が、そのメラノーマ細胞の表面上にHLA−B44を提示す
るはずである、と結論される。従って、配列番号17のペ
プチドまたはそれに関連する分子を、実際に、HLA−B44
細胞を同定して、MHC分子との結合後にその溶解を誘発
させるために利用可能であるか否かを判定することが非
常に注目される。前記諸例において記載したように、配
列番号20のペプチドは、HLA−B44陽性細胞に結合するこ
とが示された。位置８においてLeUではなくAlaを有する
ことを除いて配列番号２と類似するペプチドをデザイン
した。この新規なペプチド、即ち、 を、配列番号17とのコンペティションアッセイにおいて
テストした。このペプチドは、ここでは報告しない実験
において得られた結果に鑑みて使用された。簡単に説明
すると、それぞれの誘導体が配列番号２中においてAla
によって占有されていない位置にAlaを有する、複数の
配列番号２の誘導体を作成した。CTLクローン159/5は、
配列番号２よりも、配列番号18を含む複合体を認識する
のにわずかに良好であり、この理由からそれ（配列番号
18）はコンペティティブアッセイのための優れた試薬と
なる。コンペティションを、ストークス（Storkus）他,
J.Immunol 138:1657−1659（1987）に記載されているよ
うに、C1R細胞を使用して行った。これらのC1R細胞は、
MHCクラスＩ陰性の、リンパ芽球腫細胞である。これら
のC1R細胞を、上述したのと同じ手法を使用して、HLA−
Ｂ★4402に対するcDNA、または、HLA−Ｂ★4403に対す
るゲノムDNAのいずれかでトランスフェクトした。HLA−
Ｂ★4402に対するcDNAは、フライシュハウアー（Fleisc
hhauer）他,Tissue Antigens 44:311−317（1994）によ
って示され、HLA−Ｂ★4403に対するゲノムDNAは、フラ
イシュハウアー（Fleischhauer）他，（1990）New Eng.
J.Med.323:1818−1822（1990）によって提供されてい
る。これら両方の文献を、参考文献として本出願にその
内容を合体させる。
これら細胞を、抗−HLAクラスＩモノクローナル抗体W
6/32（ハイブリドーマ細胞の培地の30％（v/v））の存
在下において、37℃で１時間、51Crによって標識した。
これによって、前記細胞がＴ細胞に対して抗原ペプチド
を提示する能力が増大する。
標識された細胞を洗浄し、種々の濃度のコンペティタ
ーペプチドと共に、無血清培地中にて、20℃で30分間イ
ンキュベートした。これらのペプチドは、以下のもの、 これは、上述したように、HLA−B44分子に結合する、 これはEBV遺伝子EBNA−3Aによってコードされ、HLA−B8
に結合する（バロウズ（Burrows）,J.Exp Med 171:345
−349（1990））。そして、配列番号17、とを含むもの
であった。
配列番号18のペプチドを次に、前記無血清培地に、終
濃度45ng/ml（C1R−B4402+細胞）または、160ng/ml（C1
R−B4403+細胞）にて添加した。細胞を、20℃で30分間
インキュベートし、２％ウシ胎児血清を追加したIscove
培地中で２回洗浄した。CTLクローンLB33−CTL159/5
を、Iscove培地と10％ヒト血清中で、E:T比20で添加し
た。51Crの放出を、３時間後に測定し、これを、C1R−
Ｂ★4402細胞とC1R−Ｂ★4403細胞とに関して、図11Aお
よび11Bに示す。図11に示されたデータは、コンペティ
ションの明らかな証拠を示している。
例14 次に、例13の実験に続いて、追加の実験を行った。
細胞溶解性Ｔ細胞クローン（CTL）を、それぞれ、LB8
16およびLB822と称する２名の対象（subject）から得
た。これらの対象はガンの証拠を示さなかった。
血液単核細胞（BMC）を、密度勾配遠心分離法を使用
して、前記対象から分離した。前記BMC中のＴリンパ球
を、予めアミノエチルイソチウロニウムブロミド（amin
oethylisothiouronium bromide）で処理しておいたヒツ
ジ赤血球を使用してロゼット法（rosetting）によって
精製し、次に、磁性マイクロビーズに結合させた抗−CD
8モノクローナル抗体で標識した。CD+8細胞を、磁化領
域を通過させることによって分類し、その後、10％ヒト
血清、116mg/ml Ｌ−アルギニン、36mg/lm Ｌ−アス
パラギン、そして216mg/mlのＬ−グルタミン、0.05mM
２−メルカプトエタノールおよび10％DMSOを追加したIs
cove培地中で−80℃で保存した。
すべての非−ロゼット形成（non−rosetting）BMC
は、組織培養プレート上にて37℃で２時間粘着するよう
に放置された。非−粘着細胞を捨て、粘着細胞を、IL−
４（50U/ml）とGM−CSF（100ng/ml）の存在下で７日間
培養した。その結果得られた集団を抗原提示細胞（“AP
C";この場合、樹状細胞またはマクロファージ）につい
て増強（enrich）させた。次に、これらの細胞の5x105
ないし106個を、2.5μg/mlのヒトβ２ミクログロブリ
ン、および50μg/mlの配列番号17のペプチドとを追加し
た400μｌのIscove培地中で、37℃で４時間、2mlのウェ
ル内でインキュベートした。ペプチドをパルスした（pe
ptide pulsed）粘着細胞を、次に、5000ラドで照射し、
洗浄した。次に、2x106個の自己CD8+T細胞を、1000U/ml
のIL−６と5ng/mlのIL−12とを追加した培地中で添加し
た。
７日後、リンパ球を、上述した要領でペプチドをパル
スした、粘着自己BMCで再刺激した。5x106個のBMCを、
上述したように、β２ミクログロブリンと配列番号17と
を含む400μｌのIscove培地中で37℃で２時間粘着する
ように放置した。すべての、ペプチドをパルスした粘着
細胞を、照射し、洗浄した。次に、反応細胞を、10U/ml
のIL−２と、5ngmlのIL−７を追加した培地中にて添加
した。
第14日目に、前記リンパ球を、配列番号17でパルスし
た自己BMCで再刺激した。BMCを、B2−ミクログロブリン
および配列番号17を含有するIscove培地中で2x107細胞/
mlでインキュベートした。２時間のインキュベーション
（20℃）後、ペプチドをパルスしたBMCを、照射し、洗
浄し、上述したように、IL−２とIL−７とを加えた培地
中で2x106細胞/mlで再懸濁した。これらの刺激細胞（2x
106）のサンプルを、反応細胞を含む各ウェルに加え
た。
反応リンパ球を、第21日目にクローン化した。10ない
し0.3細胞／ウェルで、50U/mlのIL2と5U/mlのIL−４と
を追加しておいた培地中で、マイクロウェルに播種し
た。次に、これらを、同種EBVトランスフォームＢ細胞
（LG2−EBV−Ｂ）であって、ウェル当たり20,000細胞の
割合で、10,000ラドで照射したものと、（ｉ）ペプチド
をパルスしたHLA−B4402+細胞、または（ii）ペプチド
をパルスしたHLA−B4403+細胞、のいずれか一つとを添
加することによって刺激した。（ｉ）と（ii）の場合、
照射は、ウェル当たり8000個の細胞の割合で15,000ラド
で行われた。
ミクロ培養物を、第21日目と同様の要領で、毎週、再
刺激した。一つの相違点は、第21日目においては20,000
個であったのに対して、第28日目と35日目とにおいて
は、各ウェル当たりそれぞれ40,000と60,000個のEBV−
Ｂ細胞を添加したことであった。
第41日目と第52日目との間に、増殖しているミクロ培
養物のアリコットを、配列番号17によってパルスした、
および、パルスしなかったHLA−B4402+またはHLA−B440
3+標的細胞に対する溶解活性をテストするためにＶ字型
マイクロウェルに移した。
抗−ペプチド溶解活性を示したすべてのミクロ培養物
を、5x104の照射された、ペプチドをパルスしたB4402+
またはB4403+細胞と、5x105の照射されたLG2−EBV−Ｂ
細胞とで、50U/mlのIL−２と5U/mlのIL−４とを加えた8
00μｌの培地中にて、再刺激した。
７日間後、CTLクローンを、毎週、前述したように、1
06の照射されたLG2−EBV−Ｂ細胞と共に、2x105の照射
された、ペプチドをパルスしたB4402+またはB4403+細胞
によって再刺激した。このようにして、CTL LB 816−
CTL−340A/1とLB822−CTL−346A/1とが得られた。これ
らのCTLは、それぞれ、配列番号17と、HLA−Ｂ★4402+
またはHLA−B4403+のいずれかとの複合体に対して特異
的である。
例15 更に別のセットの実験において、MAGE−３を発現しな
いHLA−B4402+またはHLA−B4403+EBVトランスフォーム
Ｂ細胞を、37℃で１時間、モノクローナル抗体W6/32の
存在下で、51Crによって標識した。ブロツキー（Brodsk
y）他,J.Immunol 128:129−135（1982）。これらの細胞
を洗浄し、種々の濃度の配列番号17を使用して、無血清
培地中にて、20℃で30分間インキュベートした。例14に
おいて記載した各CTLを、同時に記載されたように、51C
r放出試験でテストした。クロム放出は４時間後に測定
した。図12に示すその結果は、前記ペプチドが、事実、
溶解を引き起こしたことを示している。
例16 下記の諸実験において、HLA−B44陽性である別の腫瘍
細胞ラインを調べた。
テストされるすべての細胞ラインを、51Crによって、
37℃で１時間、標識した。次に、これらを、２％ウシ胎
児血清を追加したIscove培地中にて、様々な数の例14に
記載した二つのCTLクローンに添加した。放出された51C
rの量を４時間後に測定した。コントロールも、図13に
示したように使用した。尚、細胞ラインLB33−MELは、
アッセイに先だって、48時間、IFN−γ（50U/ml）とイ
ンキュベートした。
これらの実験の結果を図13に示す。CTLクローンLB816
−CTL−340A/1とLB822−CTL−346A/1とは、MAGE−３を
発現する腫瘍細胞を溶解したが、前記MAGE遺伝子を発現
しないLB33−EBV Ｂ細胞は溶解しなかった。CTLクロー
ンLB822−346A/1は、MAGE−３を発現するHLA−Ｂ★4403
+腫瘍細胞ラインMZ2−MELを溶解したが、抗原欠損変異
体MZ2−MEL＜.D-62.1は溶解しなかった。
例17 配列番号17のペプチドが、HLA−B44との複合体とし
て、CTLを刺激したか否かを判定する最後のテストとし
て、腫瘍壊死因子放出が刺激されたか否かを判定する実
験を行った。
先ず、COS−７細胞を、発現ベクターpcDNA−1/AMP中
の、ゴーグラー（Gaugler）他,J.Exp.Med 179:921−930
（1994）による、MAGE−３をコードするcDNAと、ベクタ
ーpcDNA3にクローニングされたHLA−Ｂ★4402cDNA、ま
たは、pcDNA1/AMPにクローニングされたHLA−Ｂ★4403c
DNAのいずれか一方とで、トランスフェクトした。アル
ッフォ（Aruffo）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3365−3
369（1987）のDEAEデキストランクロロキン法を使用し
た。
トランスフェクタントを、37℃で24時間インキュベー
トし、次に、3000CTL/ウェルを添加した。構成物を、37
℃で18時間インキュベートした。次に、上清を収集し、
TNF含量を、エスペヴィック（Espevik）他,J.Immunol.M
eth 95:99−105（1986）に従って、TNF感受性WEHI−16
クローン13細胞に対する細胞溶解効果をテストすること
によって測定した。
次の表３にその結果を示し、ここで、TNF放出はpg/ml
単位で表わされている。LB33−MELとLB494−MELとを、
アッセイの前に、24時間、100U/mlのIFNγとインキュベ
ートした。腫瘍細胞ラインLB33−MEL,LB494−MEL,MZ2−
MELもテストした。これらの細胞ラインはすべて、MAGE
−3cDNAを発現し、HLA−Ｂ★4402+（LB33−MEL,LB494−
MEL）か、HLA−Ｂ★4403+（MZ2−MEL）のいずれかであ
る。従って、これらの細胞についてはトランスフェクシ
ョンは不要であった。結果はTNFが放出されたことを示
す。従って、配列番号17は、HLA−B44 MHC分子によっ
て提示されており、これらの複合体がCTL活性を引き起
こすものである、と結論される。
例18 前述の結果は、例えば、ブリチャード（Brichard）
他,Eur.J.Immunol.［引用］（1995）；ブセイン（Busey
ne）他,J.Virol 67:694−702（1993）；クーリ（couli
e）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2105−2109（199
4）；ディ・ブリノ（DiBrino）他,Biochemistry 34:101
30−10138（1995）；フライシュハウアー（Fleischhaue
r）他,Tissue Antigens 44:311−317（1994）：カンナ
（Khanna）他,J.Exp.Med.176:169−176（1992）；キタ
（Kita）他,Hepatology 18:1039−1044（1993）によっ
て示されているデータとともに、HLA−B44分子に結合す
るペプチドは、しばしば位置２にGluを、そして最後の
位置にTyrまたはPheのいずれかを含んでいることを示し
ている。MAGE−３配列の分析によると、４つのペプチド
配列がこれらの制約を満足していることが明らかとされ
ている。即ち、 これらのペプチドを、標準的な固相技術を用いて合成
し、これらがHLA−B44 MHC分子に結合するか否かを判
定するための実験に使用した。
この実験に使用した細胞はエプスタイン・バールウイ
ルス（EBV）でトランスフォームされたC1R細胞であっ
た。これらの細胞は、それらがMAGE−３遺伝子を発現す
るという点において、他のEBVトランスフォームＢ細胞
と異なっている。これらはまた、MHC陰性であり、した
がって、MHC分子をコードする遺伝子でのトランスフェ
クションの対象として役立つことができる。サンプルを
HLA−Ｂ★4402をコードするcDNA分子か、またはHLA−Ｂ
★4403をコードするゲノムDNAのいずれかで、参考文献
としてその両方の開示内容を本出願に合体させる、フラ
イシュハウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 4
4:311−317（1994）またはフライシュハウアー（Fleisc
hhauer）他,N.Eng.J.Med 323:1828−1822（1990）に従
ってトランスフェクトした。トランスフェクタントを、
10％ウシ胎児血清（FCS）を追加したRPMI−1640培地中
で生育した。
コンペティティブアッセイにおいて、ペプチド を用いた。というのは、それがHLA−B44に結合すること
が報告されていたからである。例えば、参考文献として
本出願にその内容を合体させる、クーリ（Coulie）他,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7976−7980（1995）を参
照。細胞溶解性Ｔ細胞クローンLB33−CTL−159/5が、こ
のペプチドとHLA−B44とからなる複合体をその表面上に
提示する細胞を認識して溶解するということも報告され
ている。このクローンを一定量の配列番号18と、様々な
量の配列番号20,17,21,22のそれぞれと、および下記の
コントロールペプチド： および とともにこのアッセイにおいて使用した。
アッセイを行うために、前記トランスフェクトされた
C1R（C1R−Ｂ★4402、C1R−Ｂ★4403）トランスフォー
ム細胞を、抗−ヒト クラス−Ｉ MHCモノクローナル
抗体W6/32の存在下で（ハイブリドーマ細胞の培地の30
％ w/v）、37℃で１時間、51Cr標識し、そして３回洗
浄した。標識された細胞（80μｌ中1000細胞）を、Ｖ底
マイクロウェルにおいて、無血清Ｘ−VIVO 10培地中で
20℃で30分間インキュベートした。テストペプチドを、
以下に説明するように様々な濃度で添加し、その後、ペ
プチド を、40μｌのＸ−VIVO 10培地中で、C1R−Ｂ★4402に
ついては50ng/mlで、そしてC1R−Ｂ★4403については16
0ng/mlで添加した。このペプチドはHLA−Ｂ★4402およ
びHLA−Ｂ★4403両方のアロタイプに結合することが知
られている。（例えば、クーリ（Coulie）他,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 92:7976−7980（1995）を参照）。配列
番号18で刺激した細胞を、20℃で30分間インキュベート
し、そして２％ウシ胎児血清を含有するIscove培地で洗
浄した。次にクーリ（Coulie）他によって、配列番号18
とHLA−B44とからなる複合体をその表面に提示する細胞
を認識および溶解するとして記載されている、CTLクロ
ーンLB33−159/5を、10％ヒト血清を追加したIscove培
地150μｌ中に、20,000細胞添加した。
コンペティティブペプチドを様々な濃度で、CTL159/5
による溶解が50％阻害されるまで添加した。溶解は前述
の式を用いて測定した。コンペティターペプチドが使用
されなかった場合、C1R−Ｂ★4402トランスフォーマン
トの溶解は58％であり、C1R−Ｂ★4403では72％であっ
た。
以下の表において配列番号３と19がコントロールとし
て使用された。前者、即ち： はチロシナーゼ由来であり、HLA−Ｂ★4402とHLA−Ｂ★
4403との両方に結合することが知られており（ブリチャ
ード（Brichard）他,Eur.J.Immunol.（1995））、一
方、後者、即ち： はHLA−A8に結合する（バロウズ（Burrows）他,J.Exp.M
ed.171:345−349（1990））。以下に示す結果は、配列
番号18で感作されたC1R−B44細胞の溶解を阻害するのに
必要なペプチドの濃度を、uM単位で示したものである。
ペプチド C1R−Ｂ★4402 C1R−Ｂ★4403 配列番号20 60 15 配列番号17 2 1 配列番号21 80 7 配列番号22 20 5 配列番号３ 1 ＜１ 配列番号19 ＞100 ＞100 以上から理解されるように、配列番号17、20、21およ
び22のすべてがC1R−B44細胞の溶解を阻害し、これは、
これらがHLA−B44分子に結合することを示している。配
列番号17のペプチドがHLA−Ｂ★4402とHLA−Ｂ★4403と
の両方にとっての最も良好な結合物質（binder）であっ
た。これは図14に示されている。そこにおいて、配列番
号17,19および３が、溶解対コンペティターペプチド濃
度の関数としてプロットされている。
ここでは報告しない実験において、配列番号17にホモ
ロガスな、MAGE−1,2,4,6および12のアミノ酸配列に由
来するペプチドについてもテストされ、HLA−B44分子に
結合することが判明した。
例19 様々なペプチドが、実際にHLA−B44アロタイプに結合
することが明らかになったので、これらペプチドが、ペ
プチドとMHC分子とからなる複合体に対して特異的な細
胞溶解性Ｔ細胞クローンを誘発するのに利用可能である
かを判定することに興味が持たれた。
これを判定するために、粘着末梢血単核細胞を、ガン
を患っておらず、HLA−Ｂ★4402陽性であるLB816と称さ
れるドナーから分離した。
粘着細胞を、まず、末梢血単核細胞（以下、“PBMC"
と称する）のサンプルを、密度勾配遠心分離法を用いて
確保することによって分離した。Ｔ−リンパ球のこのサ
ンプルから、２−アミノエチル−イソチオウロニウムブ
ロミド水素酸塩処理した（２−aminoethyl−isothiouro
nium bromide hydrobromide−treated）ヒツジ赤血球を
使用して、参考文献として本出願にその内容を合体させ
る、ミカモ（Mikamo）,J.Immunol.Meth.107:189−196
（1988）によるロゼット法によって、また、磁性マイク
ロビーズに結合させた抗−CD8モノクローナル抗体で標
識し、次にCD+8細胞を、磁化領域を通過させてソートす
ることによって精製した。そのようにして分離した細胞
を凍結保存した。すべての非−ロゼット形成（non−ros
etting）RBMCは、NUNC組織培養ウェル上にて37℃で２時
間粘着するように放置し、非−粘着細胞を捨てた。
次に粘着細胞を、IL−４（50U/ml）とGM−CSF（100ng
/ml）の存在下で、10％FCSを追加したRPMI培地中で７日
間培養した。GM−CSFとIL−４は培養中の樹状細胞の集
団を増加させるために用いられる。ロマーニ（Romani）
他,J.Exp.Med.180:83−93（1994）；サルスト（Sallust
o）他,J.Exp.Med.179:1109−1118（1994）を参照。細胞
集団を分析すると、ドナーLB816から採取したものは、
大部分がCD11c+およびCD14+であり、一方、ドナーLB822
からの細胞は、ほとんどがCD11c+およびCD14-でること
が判明した。
次に、全部で5x105ないし5x106個のこれらの抗原提示
細胞を、ヒトβ２ミクログロブリン（2.5μg/ml）、お
よび50μg/mlの配列番号17とを追加した400μｌのIscov
e培地中で、37℃で４時間、2mlのウェル内でインキュベ
ートした。この後、細胞を50Gyで照射し、そして洗浄し
た。これらの細胞を次に前述の自己CD8+細胞に対する刺
激細胞として使用した。
自己CD8+の培養物（culture）の６つのウェルが確立
された。各培養物について、2x106個のCD8+細胞を培地
（10％ヒト血清、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、
Ｌ−グルタミン、0.05mMの２−メルカプトエタノール、
1000U/mlのIL−６、および5ng/mlのIL−12とを追加した
Iscove培地）に混合した。第７日目と第14日目にこれら
の反応細胞を刺激細胞で刺激した。これを行うために、
第７日目に、前記PBMC（5x106個）を、前述したよう
に、β２ミクログロブリンと配列番号17のペプチドとを
含む400μｌのIscove培地中で37℃で２時間粘着するよ
うに放置した。また、前述したように粘着細胞を、照射
し、洗浄した。反応リンパ球（即ち、CD8+細胞）を、10
U/mlのIL−２と、5ng/mlのIL−７を追加した培地中にて
添加した。第14日目に、前記リンパ球を、ペプチドでパ
ルスしたPBMCで再刺激した。この再刺激において、1ml
当たり2x107細胞のPBMCを、β２ミクログロブリおよび
配列番号17のペプチドを含有するIscove培地中で前述し
たように20℃で２時間インキュベートした。再び、これ
らのPBMCを照射し、洗浄し、IL−２とIL−２とを追加し
た培地中で2x106細胞/mlで再懸濁し、また前述したよう
に、反応細胞に添加した。
第20日目に、配列番号17で感作しておいた、LB816細
胞（HLA−Ｂ★4402陽性細胞）に対する溶解活性を評価
した。溶解活性は前述の51Cr放出試験を使用して測定し
た。結果を図15Aに示す。NK−様エフェクターによる溶
解を阻害するために、エフェクター細胞を、標識してい
ないK562標識細胞（50,000細胞／ウェル）とともに45分
間インキュベートした。51Cr標識した標的細胞（1000細
胞／ウェル）を、１μＭの配列番号17とともに（●記
号）またはそれなしで（○記号）、インキュベートし
た。51Cr放出は４時間後に測定した。６つの自己CD8+培
養物のうち１つだけが選択的に標的細胞を溶解した。
同様に、HLA−Ｂ★4403陽性細胞（LB822）についてテ
ストした。図15Bに示す結果は、テストされた５つの培
養物のうち１つが選択的に前記細胞を溶解したことを示
している。
これらの結果に基づいて、抗−配列番号17/HLA−B44
細胞の前駆体（precursor）の頻度は、107のCD8+リンパ
球あたり１つのオーダーであるということが結論され
た。
陽性培養物のリンパ球を限界希釈法によってクローン
化した。具体的には、第21日目にこれらの細胞を50U/ml
のIL−２と5U/mlのIL−４とを追加した培地中で培養し
た。LB816細胞を、１μg/mlの配列番号17とともに20℃
で１時間インキュベートしておいた照射されたC1R−Ｂ
★4402細胞（150Gy、8000細胞／ウェル）で刺激し、そ
して洗浄した。LB822クローンは、照射された、HLA−Ｂ
★4403陽性のメラノーマ細胞であるMZ2−MEL細胞（100G
y、ウェル当たり8000細胞）で刺激した。照射された同
種LG2−EBV細胞（100Gy、20,000細胞／ウェル）を支持
細胞として添加した。ミクロ培養物を毎週刺激した。CT
LクローンLB816−CTL−340/1とLB822−CTL−346/8がこ
のようにして単離された。
例20 前述のCTLクローンを、2mlのウェル中で、１μg/mlの
配列番号17のペプチドとともに20℃で１時間インキュベ
ートした後、洗浄しておいた2x105の照射されたC1R−Ｂ
★4402またはC1R−Ｂ★4403細胞、および106の照射され
たLG2−EBV細胞で、すべて前述のようにIL−２とIL−４
を追加した培地中にて毎週刺激した。
このようにして単離したCTLクローンが配列番号17とH
LA−B44の両方のアロタイプとからなる複合体を認識す
るということを確認するために、10,000細胞の各CTLク
ローン（ウェル当たり）を、1000細胞の（ウェル当た
り）、無血清培地中で様々な濃度の配列番号17とともに
20℃で30分間インキュベートした後、洗浄しておいた、
51Cr標識されたリンパ芽球Ｂ細胞（HLA−Ｂ★4402陽性
である、LB33−EBV）と混合した。51Cr放出を４時間後
に本出願中に記載した方法を使用して測定した。
図16に示す結果は、CTL340/1については最大半減の溶
解はおよそ40nMで得られたのに対し、CTL346/8について
は最大半減の溶解は約100nMで得られたということを示
している。図16Aに示す実験に用いたCTLは、LB816−CTL
−340/1であり、図16Bに示す実験に用いたCTLは、LB822
−CTL−346/8である。
ここで要約だけする実験において、配列番号17のホモ
ロガスであるが位置９において異なっている（ロイシン
がバリンに置換されている）ペプチドについてテストし
た。このペプチド（配列番号29）はMAGE−６由来であ
る。特異的なCTLクローンはそれを認識しないと考えら
れていたのであるが、それは両方のHLA−B44サブタイプ
に有効に結合した。従って、HLA−B44分子に結合するた
めには、第９位置は必須ではなかった。
例21 MAGE−３遺伝子を発現する細胞上に、配列番号17が自
然に提示されるかどうかを判定するために、更なるセッ
トの実験を行った。
これを判定するために、COS−７細胞（ウェル当たり1
5,000）を、50ngのMAGE−３に対するcDNAを含有するpcD
NAI/Ampと、50ngのHLA−Ｂ★4403に対するcDNAを含有す
るpcDNAI/Ampまたは50ngのHLA−Ｂ★4402に対するcDNA
を含有するpcDNA3/Ampとのいずれかとで、同時トランス
フェクトした。この同時トランスフェクションは、シー
ド（Seed）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3365−3369
（1987）の周知のプロトコールに従って行った。同じ
く、NA8−MELメラノーマ細胞も同時トランスフェクトし
た。これらの細胞はHLA−B44もMAGE−３分子も発現しな
い。NA−8MEL（ウェル当たり30,000細胞）を同時トラン
スフェクトするために、LIPOFECTAMINEを用いて、前記
したプラスミドの100ngのサンプルを使用した。
同時トランスフェクションに続いて、細胞を37℃で36
時間インキュベートし、そして次にそれらが腫瘍壊死因
子（TNF）の産生を刺激する能力について、前述のCTLク
ローン340/1および346/8の存在下でテストした。TNF産
生は、レーマン（Lehmann）他,Eur.J.Immunol.25:340−
347（1995）に従って測定した。この文献は参考文献と
して本出願にその内容を合体させるが、ここで簡単に説
明する。これらの実験において、3000のCTLを10％ヒト
血清、および25U/mlのIL−２を追加した、100μｌのIsc
ove培地中に添加した。20時間後、上清を収集し、TNF含
有量を、エスペヴィック（Espevik）他,J.Immunol.Met
h.95:99−105（1986）に従って、WEHI164c13細胞に対す
るその細胞傷害性をテストすることにより測定した。図
17に要約するこれらの実験において、コントロールは単
一のトランスフェクション（MAGE−３またはHLA−Ｂ★4
402またはHLA−Ｂ★4403）を用いて調製した。図17は前
記２つのコンストラクトによって同時トランスフェクト
された細胞はTNF放出を刺激するのに対し、１つのプラ
スミドでトランスフェクトされた細胞は刺激しなかった
ということを示している。この結果は両方の細胞タイ
プ、および両方のCTLについて観察された。MAGE−3/HLA
−B44複合体の認識は、NA8−MELの研究が示すように、C
OS−７細胞による高コピー数の供給を必要としなかっ
た。
例22 次に前述のCTL、即ち340/1および346/8についてそれ
らがHLA−B44提示腫瘍細胞を溶解する能力についてテス
トした。使用した細胞は、LB3−MEL−Ａ−１、LB373−M
EL、LB494−MEL、LB831−BLC、LG2−MELおよびMZ2−ME
L.43を含む、MAGE−３を発現することが知られているラ
インを含むものであった。これらは、膀胱ガン由来の細
胞ラインであるLB831−BLCを除いて、メラノーマ細胞で
ある。細胞ラインMZ2−MEL.61.2はMAGE−３の発現を欠
損したメラノーマ細胞ラインである。以下に議論する図
18において、この細胞は閉円記号（“●”）ではなく、
開円記号（“○”）で示されている。MZ2−MEL.43、MZ2
−MEL61.2、およびLG2−MELを除いて、すべての細胞を
51Cr放出試験において用いる前に、50U/mlのIFN−γの
存在下で48時間以上インキュベートした。各ケースにお
いて、HLA−Ｂ★4402またはHLA−Ｂ★4403、およびMAGE
−３の発現を、ここでは繰り返し説明しない、RT−PCR
法を用いてテストした。
図18に示す結果は、前記CTLが、これらの自然にMAGE
−3/HLA−B44を発現する細胞を認識し、そして溶解した
ということを示している。
上記諸実験は、腫瘍拒絶抗原前駆体、“TRAP"分子、
をコードする単離核酸分子を記載するものである。これ
らがコードするタンパク質分子は、HLA−B44分子によっ
て提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原、即ち“TR
A"、の産生が導かれるように、細胞内でプロセシングさ
れる。HLA−B44分子はチロシナーゼ由来のペプチドを提
示することが以前に観察されていたが、本発明の核酸分
子は、チロシナーゼをコードせず、これらTRAはチロシ
ナーゼ由来ではない。
本発明の腫瘍拒絶抗原は、第２位置にGlu残基を、そ
して第９または第10位置にPheまたはTyr残基を有する単
離ノナペプチドおよびデカペプチドである。特に好適で
あるのは、以下の式を満足するペプチド： または であり、ここで、Xaaはいずれのアミノ酸であってもよ
い。これらの一般式は、配列番号17、および前述したよ
うに、同様にHLA−B44分子に結合する、種々のMAGEタン
パク質に由来するホモロガスなペプチドも包含する。こ
れらのホモローグ（homologous）は、以下のものを含
む： および これらはそれぞれ、MAGE−1,2,4,5,6および12の対応す
る位置に見られるという点において、これらは配列番号
17とホモロガスなペプチド配列に対応する。これらがHL
A−B44分子に結合する能力によって、これらはとりわ
け、その表面上にHLA−B44分子を提示する細胞を同定す
ることにおいて有用なものとなる。
本発明の前記ペプチドは、本出願の被譲渡人に同時譲
渡されている第08/233,305号に開示されているペプチ
ド、即ち、 に類似している。
前述のカンナ（Khanna）他は、デカマー、即ち、 を教示しているが、このデカマーをいかにして有効なノ
ナマーに改変可能であるかについては記載していない。
従って、本発明は、HLA−B44分子に結合し、次に、CT
Lによる溶解を引き起こす腫瘍拒絶抗原に関する。
前に示したように、TRAとHLA分子との複合体は、細胞
溶解性Ｔ細胞応答を引き起こす。従って、前記腫瘍拒絶
抗原とHLA−B44分子との単離複合体も本発明の範囲に含
まれ、又、前述の核酸分子によってコードされる単離腫
瘍拒絶抗原前駆体も含まれる。結合特異性が与えられれ
ば、前記ペプチドを、単にHLA−B44陽性細胞を同定する
ためのみに利用することも可能である。
ここに記載した本発明は、多数の利用方法が有るが、
その内のいくつかをここに記載する。先ず、HLA−B44分
子によって特異的に提示される腫瘍拒絶抗原と、更に、
それに対応の腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子
との同定によって当業者は、前記TRAPの発現によって特
徴付けられる疾患を診断することができる。これらの方
法には、TRAP遺伝子、および／または、HLA分子によっ
て提示されるTRA等のこれらに由来するTRAの、発現の測
定が含まれる。他のTRAも、本発明のTRAPから由来させ
ることができ、種々のHLA分子によって提示させること
ができる。前者の場合、このような測定は、ポリメラー
ゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定アッセイ、或
いは、標識化ハイブリダイゼーションプローブによるア
ッセイ、によって行うことが可能である。後者の場合
は、抗体等の、TRAとHLAとの複合体に対する結合パート
ナーによるアッセイが特に好ましい。
TRAP遺伝子の単離によって、そのTRAP分子自身、特
に、配列番号１によってコードされるアミノ酸配列を含
むTRAP分子、を単離することも可能となる。TRAとし
て、またはTRAとHLA−B44との複合体として、提示され
る場合のこれらの単離分子のペプチドのフラグメント
を、アジュバント等の物質と組み合わせて、TRAP分子の
発現によって特徴付けられる疾患の治療に有用なワクチ
ンを作ることができる。更に、たとえば、非増殖性のガ
ン細胞、非増殖性のトランスフェクタント等の、その表
面上にTRA/HLA複合体を提示する細胞からワクチンを作
ることが可能である。細胞がワクチンとして使用される
すべての場合において、これらは、CTL応答を引き起こ
すのに必要な前記構成成分の一つ又両方に対するコード
配列をトランスフェクトされた細胞、あるいは、トラン
スフェクション無しで両方の分子を発現する細胞とする
ことができる。更に、TRAP分子、その関連TRA、更に、T
RAとHLAとの複合体は、当該技術において周知の標準的
技法を利用して、抗体を製造するのに使用することがで
きる。
ここで“疾患”という用語が用いられた場合、それ
は、腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するすべての病的（異
常）な状態を指す。このような疾患の一例は、ガン、特
にメラノーマ、である。
本開示に基づく治療上のアプローチは、関連HLA分子
を提示する細胞等の、TRA提示細胞の溶解を導く、患者
の免疫系による応答を前提としている。そのようなアプ
ローチの一つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者
に、前記複合体に対して特異的なCTLを投与することで
ある。そのようなCTLをイン・ヴィトロで開発すること
は当業者の技術の範囲内に含まれる。即ち、血液細胞の
ような、細胞のサンプルを、前記複合体を提示する細胞
に接触させると、特異的なCTLの増殖を誘発することが
できる。標的細胞は、前述のタイプのCOS細胞のよう
な、トランスフェクタントとすることができる。その表
面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントは、
問題のCTLと結合すると、その（CTLの）増殖を刺激す
る。ここで用いたようなCO細胞は、他の適当な宿主細胞
と同様に、広く入手可能である。
養子移入（養子免疫細胞移入）と呼ばれる治療上の方
法を詳述すると、（グリーンバーグ（Greenberg）,J.Im
munol.136（５）:1917（1986）；レッデル（Reddel）
他,Science 257:238（７−10−92）；リンチ（Lynch）
他,Eur.J.Immunol.21:1403−1410（1991）；カスト（Ka
st）等,Cell 59:603−614（11−17−89））所望の複合
体を提示する細胞を、CTLと結合させると、その結果、
それに対して特異的なCTLが増殖する。増殖したCTLは、
次に、特定の複合体を提示するいくらかの異常細胞によ
って特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与され
る。すると、前記CTLが異常細胞を溶解し、それによっ
て所望の治療目的が達成される。
前述の療法は、少なくともいくらかの患者の異常細胞
が、HLA/TRA複合体を提示することを仮定している。こ
のことは非常に簡単に判定できる。というのは、特定の
HLA分子を提示する細胞を同定する方法、及び、指示さ
れた配列を含むDNAを発現する細胞をどのように同定す
るかということについて、当業者は非常によく精通して
いるからである。単離されると、そのような細胞を、患
者の異常細胞のサンプルとともに、イン・ヴィトロで溶
解を判定するのに使用することができる。もしも溶解が
観察されれば、そのような療法において特異的CTLを使
用することによって、前記異常細胞に関連する病気を軽
減することができる。より簡単な方法は、標準的アッセ
イを使用して、HLA表現型タイピングのために異常細胞
を調べ、たとえばPCRを使用して増幅によって発現を判
定するものである。
養子移入（養子免疫細胞移入）のみが本発明に従って
利用できる唯一の治療形態であるわけではない。CTL
を、数々のアプローチを利用して、イン・ヴィヴォを誘
発することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前
記複合体を発現する非増殖性の細胞の利用方法について
は先に詳述した。このアプローチにおいて用いられる細
胞は、照射を受けたメラノーマ細胞、または、前記複合
体を提示するのに必要な一方または両方の遺伝子をトラ
ンスフェクトされた細胞のような、通常前記複合体を発
現する細胞であってよい。チェン（Chen）等,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 88:110−114（1991年１月）は、治療法
（therapeutic regime）における、HPVE7ペプチドを発
現するトランスフェクション細胞の利用を示しており、
このアプローチを例証している。様々な細胞タイプが利
用可能である。同様に、問題の遺伝子の一方または両方
を担持するベクターが利用可能である。ウィルス性のま
たは細菌性のベクターが特に好ましい。これらのシステ
ムにおいて、問題の遺伝子は、たとえばワクシニアウィ
ルスまたは細菌BCGによって伝えられ、この物質は、事
実上、宿主細胞に“感染”する。その結果得られた細胞
は問題の複合体を提示し、自己CTLによって認識され、
そしてそのCTLは増殖する。問題のHLA分子を提示する細
胞への取り込みを容易にするために、前記腫瘍拒絶抗原
またはその前駆体自身を、アジュバントと組み合わせる
ことによって、同様の効果を達成することができる。TR
APはHLA分子のペプチドパートナーを生じるためにプロ
セシングされるが、一方、TRAは、異なるプロセシング
をされる必要無く提示される。
本発明の他の態様は、当業者にとって明らかであり、
ここで繰り返す必要はない。
ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載
の用語として使用されたものであり、従って、これらの
用語および表現を使用するに当たって、図示および記載
された特徴構成またはその一部のいかなる均等物も除外
する意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能であ
ると理解される。
（１）一般情報： （ｉ）出願人：ハーマン，ジャン；クーリ，ピエー
ル；ブーン−ファラー，ティエリー；ファン・デア・ブ
ルッゲン，ピエール；ルシャー，イマニュエル （ii）発明の名称:HLA−B44分子によって提示される
腫瘍拒絶抗原とその利用方法 （iii）配列の数:30 （iv） 連絡先： （Ａ）宛先 ：フェルフェ・アンド・リンチ （Ｂ）通り名 ：サード・アベニュー805 （Ｃ）都市名 ：ニューヨーク・シティ （Ｄ）州名 ：ニューヨーク （Ｆ）郵便番号:10022 （ｖ） コンピュータ読み取り可能フォーム （Ａ） 媒体型式:3.5インチフロッピーディスク,3
60kbメモリ （Ｂ） コンピュータ:IBM （Ｃ） オペレーティング・システム:PC−DOS （Ｄ） ソフトウェア：ワードパーフェクト（Word
perfect） （vi） 現在の出願データ： （Ａ） 出願番号： （Ｂ） 出願日 ： （Ｃ） 分類 ： （vii） 先の出願データ： （Ａ） 出願番号:08/602,506 （Ｂ） 出願日 :1996年２月20日 （vii） 先の出願データ： （Ａ） 出願番号:08/531,864 （Ｂ） 出願日 :1995年９月21日 （vii） 先の出願データ： （Ａ） 出願番号:08/373,636 （Ｂ） 出願日 :1995年１月17日 （vii） 先の出願データ： （Ａ） 出願番号:08/253,503 （Ｂ） 出願日 :1994年６月３日 （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ） 氏名 ：ハンソン，ノーマン，ディ （Ｂ） 登録番号:30,946 （Ｃ） 参照／書類番号:LUD5436−PCT （ix）通信情報： （Ａ） 電話 ：（212）688−9200 （Ｂ） ファックス：（212）838−3884 （２）配列番号１の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:1896塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｃ） 鎖の数：一本鎖 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列の記述：配列番号1: （２）配列番号２の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ：アミノ酸残基 （Ｂ） タイプ:9アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （xi） 配列の記述：配列番号2: （２）配列番号３の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:9アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:HLA−B44結合ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号3: （２）配列番号４の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー：カンナ（Khanna）ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号4: （２）配列番号５の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号5: （２）配列番号６の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:17塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号6: （２）配列番号７の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:19塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号7: （２）配列番号８の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号8: （２）配列番号９の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号9: （10）配列番号10の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号10: （２）配列番号11の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号11: （２）配列番号12の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号12: （２）配列番号13の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:19塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号13: （２）配列番号14の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:19塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号14: （２）配列番号15の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:19塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号15: （２）配列番号16の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:18塩基対 （Ｂ） タイプ：核酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：核酸 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:PCRプライマー （xi） 配列の記述：配列番号16: （２）配列番号17の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−３ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号17: （２）配列番号18の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:9アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー： （xi） 配列の記述：配列番号18: （２）配列番号19の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:9アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー： （xi） 配列の記述：配列番号19: （２）配列番号20の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:8アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−３ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号20: （２）配列番号21の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−３ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号21: （２）配列番号22の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:9アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−３ペプチド （xi） 配列の記述：配列番号22: （２）配列番号23の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:HLA−B44モチーフ （xi） 配列の記述：配列番号23: （２）配列番号24の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:HLA−B44モチーフ （xi） 配列の記述：配列番号24: （２）配列番号25の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:MAGE−1/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号25: （２）配列番号26の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−2/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号26: （２）配列番号27の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−4/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号27: （２）配列番号28の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−5/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号28: （２）配列番号29の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−6/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号29: （２）配列番号30の情報： （ｉ） 配列特徴： （Ａ） 長さ:10アミノ酸 （Ｂ） タイプ：アミノ酸 （Ｄ） トポロジー：直鎖状 （ii） 分子タイプ：タンパク質 （ix） 特徴： （Ａ） 名前／キー:Mage−12/HLA−B44 （xi） 配列の記述：配列番号30:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クーリ，ピエール ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ブーン―ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ファン・デア・ブルッゲン，ピエール ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ルシャー，イマニュエル ベルギー国 ビー―1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (56)参考文献 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ, 1994，Ｖｏｌ．44，ｐ．311−317 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1994，Ｖｏｌ．91，Ｎｏ. ６，ｐ．2105−2109 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，1994，Ｖｏｌ. 202，Ｎｏ．１，ｐ．549−555 Ｇｅｎｅ，1995，Ｖｏｌ．160，Ｎｏ. ２，ｐ．287−290 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍ ｍｕｎｏｔｈｅｒ．，1994，Ｖｏｌ. 39，Ｎｏ．２，ｐ．105−116 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 7/06 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号26及び配列番号30から成るグルー
    プより選択されるアミノ酸配列を有する単離ペプチド。
  2. 【請求項２】配列番号27、配列番号28及び配列番号29か
    ら成るグループより選択されるアミノ酸配列を有する単
    離ペプチド。
  3. 【請求項３】配列番号26のアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の単離ペプチド。
  4. 【請求項４】配列番号30のアミノ酸配列を有する請求項
    １に記載の単離ペプチド。
  5. 【請求項５】配列番号27のアミノ酸配列を有する請求項
    ２に記載の単離ペプチド。
  6. 【請求項６】配列番号28のアミノ酸配列を有する請求項
    ２に記載の単離ペプチド。
  7. 【請求項７】配列番号29のアミノ酸配列を有する請求項
    ２に記載の単離ペプチド。
  8. 【請求項８】サンプル中におけるHLA−B44陽性細胞を同
    定する方法であって、前記サンプルを請求項１に記載の
    単離ペプチドと接触させる工程、そして、前記サンプル
    中のHLA−B44陽性細胞の判定として、前記ペプチドの結
    合を測定する工程を有する、サンプル中におけるHLA−B
    44陽性細胞を同定する方法。
  9. 【請求項９】サンプル中におけるHLA−B44陽性細胞を同
    定する方法であって、前記サンプルを請求項２に記載の
    単離ペプチドと接触させる工程、そして、前記サンプル
    中のHLA−B44陽性細胞の判定として、前記ペプチドの結
    合を測定する工程を有する、サンプル中におけるHLA−B
    44陽性細胞を同定する方法。
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