JP3496071B2 - 腫瘍拒絶抗原前駆体ｄａｇｅをコードする単離核酸分子とその利用方法 - Google Patents

腫瘍拒絶抗原前駆体ｄａｇｅをコードする単離核酸分子とその利用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本出願は、その開示内容が参考文献として含まれる19
94年９月30日出願の出願番号第08/316,231号の一部継続
である。
発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子
に関する。詳しくは、本発明は、その腫瘍拒絶抗原前駆
体が、とりわけ、HLA−A24によって提示される少なくと
も１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる遺伝子に
関する。前記腫瘍拒絶抗原前駆体、つまり“TRAP"は、H
LA−A1とその対立遺伝子、HLA−A2,HLA−ACw＊1601,HLA
−B44等のその他のMHC分子によって提示される別のペプ
チドにもプロセッシングされる。問題の遺伝子は、他の
公知の腫瘍拒絶抗原前駆体とは無関係であると考えら
れ、様々な腫瘍上において発現され、精巣、卵巣および
子宮内膜細胞を例外として、正常細胞によっては発現さ
れない。
背景および従来技術 ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識
し、これに対して反応するプロセスは複雑である。この
システムの重要な一面は、Ｔリンパ球、つまり“Ｔ細
胞”応答である。この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原
（“HLA"）、又は主要組織適合抗原（“MHCs"）と呼ば
れる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これ
と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、前
記HLA/MHC分子も提示する細胞によってプロセッシング
されるより大きな分子から誘導される。この点に関して
は、メール（Male）他の“Advanced Immunology"（J.
P.Lipincot Company,1987）、特にその第６〜10章を参
照。前記Ｔ細胞とHLA/ペプチド複合体との相互作用は、
HLA分子とペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を
必要とする点で、限定されたものである。たとえ、特定
の複合体が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなけれ
ばＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在して
も、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらな
い。このメカニズムは、免疫システムの、自己免疫病状
における外来の物質に対する応答や、細胞異常に対する
応答に関係している。最近、タンパク質がHLA結合ペプ
チドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの
研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Bari
naga）,Science 257:880（1992）；フリーモント（Fre
mont）他、Science 257:919（1992）：マツムラ（Mats
umura）他、Science 257:927（1992）、ラトロン（Lat
ron）他、Science 257:964（1992）参照。
Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関
連づけられてきた。例えば、ここに参考文献として含ま
れる1992年５月22日出願、1992年11月26日公開のPCT出
願PCT/US92/04354には、細胞表面上に発現されるペプチ
ドにプロセッシングされ、特定のCTL細胞障害性Ｔ細
胞、つまり“CTLs"による腫瘍細胞の溶解を可能にする
遺伝子の１つのファミリが開示されている。これらの遺
伝子は、“腫瘍拒絶抗原先駆体”、即ち、“TRAP"分子
をコードするものであると言われており、これらから誘
導されるペプチドは、“腫瘍拒絶抗原”、又は、“TRA
s"と呼ばれている。この遺伝子ファミリの詳細について
は、トラヴァーサリ（Traversari）他、Immunogenetics
35:145（1992）：ファン・デア・ブルッゲン（van d
er Bruggen）他、Science 254:1643（1991）参照。
又、この開示内容のすべてをここに参考文献として含ま
せる、1991年12月12日出願で現在は米国特許第5,342,77
4号である米国特許出願第807,043号参照。前記腫瘍拒絶
抗原前駆体の“MAGE"ファミリが、この特許に記載され
ている。
その開示内容を参考文献として含ませる、米国特許出
願第938,334号、現在では、米国特許第5,405,940号にお
いて、前記MAGE−１遺伝子は、HLA−A1分子によって提
示されるノナペプチドにプロセッシングされる腫瘍拒絶
抗原前駆体をコードすることが説明されている。HLA−A
1に結合する前記ノナペプチドは、あるモチーフが満た
される点において結合の“ルール”に従う。この点に関
して、PCT/US93/07421;フォーク（Falk）他、Nature 3
51:290〜296（1991）；エンゲルハード（Engelhard）,A
nn Rev.Immunol.12:181〜207（1994）；ルッパート（R
uppert）他、Cell 74:929〜937（1993）；レツシュケ
（Roetzschke）他、Nature 348:252〜254（1990）；ビ
ョークマン（Bjorkman）他、Nature 329:512〜518（19
87）；トラヴァーサリ（Traversari）他、J.Exp.Med.17
6:1453〜1457（1992）を参照。この参考文献は、特定の
HLA分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれ
ば、特定のペプチドが１つのHLA分子と結合し、他の分
子には結合しないと予期される、と教示している。これ
は重要である、というのは、保存するHLA表現型は個体
それぞれで異なるからである。その結果、ある特定のペ
プチドが特異的HLA分子のパートナとして同定されるこ
とが様々な診断上または治療上の派生効果を有するとし
ても、これらはこの特定のHLA表現型を保有する個体に
しか関連性を有していないことになる。細胞異常は１つ
の特定のHLA表現型に限られている訳ではないので、こ
の分野において更に研究が必要であり、標的治療のため
には対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知
識が必要である。
ここに参考文献として含ませる1993年１月22日出願の
米国特許出願第008,446号には、MAGE−１発現生成物
が、第２のTRAにプロセッシングされるという事実が開
示されている。この第２のTRAは、HLA−Cw＊1601分子に
よって提示される。この開示には、あるTRAPが複数のTR
Aを産生することを可能とし、それぞれがMHC分子と結合
するモチーフ・ルールを満たすことを示している。
ここに参考文献として含ませる1992年12月22日出願の
米国特許出願第994,928号には、チロシナーゼが腫瘍拒
絶抗原先駆体として記載されている。この文献には、い
くつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって産
生される分子が、腫瘍細胞内でプロセッシングされてHL
A−A2分子によって提示されるペプチドを作ることが開
示されている。
ここに参考文献として含ませる1993年３月18日出願の
米国特許出願第08/032,978号には、チロシナーゼから誘
導されたのではない第２のTRAが、HLA−A2分子によって
提示されることが教示されている。このTRAは、TRAPか
ら誘導されるものではあるが、非MAGE遺伝子によってコ
ードされる。この開示は、特定のHLA分子が、異なった
起源から誘導されたTRAを提示する可能性があるという
ことを示している。
1993年６月17日出願で、ここに参考文献として含ませ
る米国特許第08/079,110号には、無関連の腫瘍拒絶抗原
前駆体、いわゆる“BAGE"前駆体、が記載されている。
このBAGE前駆体は、MAGEファミリには関連していない。
その両方を参考文献として含ませる米国特許第08/09
6,039号と第08/250,162号には、無関連TRAP前駆体GAGE
も開示されている。
上述した諸文献、特許および特許出願によって提供さ
れている研究は、おもに、MAGEファミリの遺伝子と、無
関連BAGE及びGAGE遺伝子とを扱ったものである。しかし
ながら、今回、更に別の腫瘍拒絶抗原前駆体が細胞によ
って発現されることが判った。これらの腫瘍拒絶抗原前
駆体を、“DAGE"腫瘍拒絶抗原前駆体と称する。これら
は、MAGE遺伝子ファミリ、BAGE遺伝子、あるいはGAGE遺
伝子、に対する相同性を示さない。従って、本発明は、
このようなTRAPsをコードする遺伝子と、これら腫瘍拒
絶抗原前駆体自身と、更に、これら両方の利用方法とに
関するものである。
前記DAGE腫瘍拒絶抗原前駆体を更に特徴づけているも
のは、腫瘍細胞によるその発現が、前に記載された他の
腫瘍拒絶抗原前駆体よりも遥かに広範囲に分布している
ことにある。これについては以下に証明する。しかし、
このファミリの正常遺伝子による発現も、精巣、卵巣お
よび子宮内膜に限られている。従って、以前よりも遥か
に一般的な形質転換細胞の存在のためのアッセイを使用
することができる。このことを具体例によって示す。
本発明を、以下の開示において更に詳述する。
図面の簡単な説明 図１は、51Cr放出、細胞溶解の研究をまとめて示す。
特に、 図1Aは、細胞系LB33−MEL.B−１の溶解を示してい
る。
図1Bは、EBVによって形質転換されたLB33 Ｂ細胞の
溶解を示している。これらは、自己由来細胞である。
図1Cは、NK標的K562に関する研究を示している。各ケ
ースにおいて、エフェクタ細胞はCTLクローンLB33−CTL
−269/17であった。
図２は、抗−HLA−A24モノクローナル抗体の存在下に
おける細胞障害性Ｔ細胞による溶解の抑制に関する研究
を示している。これらの研究は、前記HLA−A24特異性モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの30倍培地
希釈物の存在下または不在下において行われた。
図3Aおよび3Bは、配列Hi2でLB804−ALL細胞の形質転
換後の溶解実験の結果を示す。
図４は、CTL269/17を使用したTNF放出アッセイにおい
て得られた結果を示している。刺激化細胞は、LB33−ME
L.B−１、HLA−A24をコードするcDNA配列を移入したCOS
−７細胞、またはHLA−A24をコードするcDNA配列と、本
発明による腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするcDNAとの両
方を移入したCOS−７細胞のいずれかであった。
図５は、DAGE由来の様々なペプチドを使用して誘発さ
れた溶解を比較している。
図６は、様々な組織サンプル中におけるDAGEの発現を
示す。
好適実施形態の詳細な説明 例１ メラノーマ細胞系LB−33−MEL.Bを、標準技術を使用
して患者LB33の転移腫瘍から得た。つぎに、腫瘍細胞を
限界希釈法によってクローン化し、後に使用するクロー
ンLB33−MEL.B−１を得た。
単核血液細胞（リンパ球を含む）を含有するサンプル
を、患者LB33から採取した。クローンLB33−MEL.B−１
のサンプルを、前記単核血液細胞サンプルに接触させ
た。これらの混合物について、前記LB−33−MEL.B−１
の溶解を観察したところ、この溶解は、ペプチドと前記
細胞によって提示されるHLA分子との複合体に対する特
異性を有する細胞障害性Ｔ細胞（“CTLs"）が、サンプ
ル中に存在していることを示した。
使用した溶解アッセイは、その開示内容を参考文献と
して含ませるヘリン（Herin）他、Int.J.Cancer 39:39
0〜396（1987）によるクローム放出アッセイであった。
しかし、このアッセイについてここで説明しておく。前
記標的メラノーマ細胞をインヴィトロで増殖させた。ラ
ベル化する前に、これら細胞を50U/mlのINF−γの存在
下においてインキュベートし、HLAクラスＩ分子の発現
を増加させた。つぎに、これらの細胞を、再び、10mMの
HEPESと30％のFCS（即ち、胎児ウシ血清）とを添加した
DMEM中にて107細胞/mlで再懸濁させ、200μCi/mlのNa（
51Cr）O4と37℃で45分間インキュベートした。ラベル化
した細胞を10mMのHepesを添加したDMEMで３回洗浄し
た。つぎに、これらを10mMのHepesと10％FCSとを添加し
たDMEM中で再懸濁させ、その後、103の細胞を有する100
ulのアリコットを96ウェルのマイクロプレートに分け
た。PBL含有サンプルを、100ulの同じ培地に添加し、ア
ッセイを反復実施した。プレートを４分間、100gで遠心
分離して、5.5％のCO2雰囲気中にて37℃で４時間インキ
ュベートした。
プレートを再度、遠心分離にかけ、100ulの上清アリ
コットを収集し、計数した。51Cr放出の百分率は、以下
のようにして算出した。
ここで、ERは観察された実験51Cr放出量、SRは103の
ラベル化細胞を200ulの培地のみの中でインキュベート
することによって測定された自発的放出量、そして、MR
は100ulの0.3％Triton Ｘ−100 を標的細胞に添加す
ることによって得られた最大放出量である。
高いCTL活性度を示した単核細胞サンプルを、限界希
釈法によって拡張、クローン化し、同じ方法を使用して
再びスクリーニングした。
同じ方法が、標的K562細胞をテストするのに用いられ
た。EBV−Ｂ細胞を使用したときの唯一の相違点は、DME
M培地を、５％のFCSを添加したHank培地によって置き換
えたことであった。
これらの実験によって、患者LB33からCTLクローンLB3
3−CTL−269/17が単離された。図1A〜1Cが示すように、
このCTLクローンはLB33−MEL.B−１腫瘍細胞を溶解した
が、患者LB33のEBV形質転換Ｂ細胞やK562細胞は溶解し
なかった。前記標的細胞を、HLA−A24に対して特異的な
モノクローナル抗体とインキュベートしたとき、溶解が
抑制され、これは、関連するすべてのTRAペプチドがHLA
−A24によって提示されることを示唆している。図２に
これらの結果を示す。
LB33−CTL−269/1と称する第２のCTLクローンは、LB3
3−MEL.B−１は溶解したが、EBV−Ｂ形質転換Ｂ細胞やK
562細胞は溶解しなかったので、これは、同じ標的抗原
が認識されたことを示唆している。クローンLB33−CTL
−269/1による溶解は、前記抗−HLA−A24モノクローナ
ル抗体によっても抑制された。
例２ 前記提示MHC分子がHLA−A24であることを同定した
後、被提示ペプチドのソースである、以下“腫瘍拒絶抗
原前駆体”、即ち“TRAP"分子と称するタンパク質分子
のコード配列を同定するための研究を行った。
これを行うため、細胞系LB33−MEL.B−１から全RNAを
単離した。mRNAは、周知の技術に従って、オリゴ−dT結
合キットを使用して単離した。mRNAが得られたところ
で、これを、再び標準方法を使用してcDNAに転写した。
つぎに、このcDNAを、EcoRIアダプタに結合させ、その
製造業者の指示に従って、プラスミドpcDNA−I/AmpのEc
oRIサイトにクローン化した。次に、これらの組換えプ
ラスミドを、DH5α E.coliに電気穿孔挿入した（電気
穿孔条件:1パルス当り25μファラド、2500V）。
前記被移入バクテリアを、アンピシリン（50μg/ml）
で選択し、つぎに、これらをそれぞれが100クローンの4
00個のプールに分割した。分析によれば、すべてのプラ
スミドが挿入体に含まれ、かつ、クローン化が指向性を
有していなかったことから、それぞれのプールは飽和状
態にまで増幅し、プラスミドDNAを、マニアティス（Man
iatis）他、in Molecular Cloning:A Laboratory M
anual（Cold Spring Harbor,N.Y.,1982）に従って、
アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱とフェノール抽出とに
よって単離した。セシウム勾配遠心分離は使用しなかっ
た。
例３ つぎに、増幅したプラスミドを真核細胞に移入した。
COS−７細胞のサンプルを、10％のFSCを添加したDelbec
co変性Eagles培地（“DMEM"）中で、15,000細胞／ウェ
ルの割合にて、組織培養平底マイクロウェルに接種し
た。これらの細胞を、一晩37℃でインキュベートし、培
地を除去し、つぎに、これを10％のNu血清と、400μg/m
lのDEAE−デキストランと、100uMのクロロキンと、100n
gのプラスミドpcDNA−I/Amp−A2Aと、前述したcDNAライ
ブラリーのプールの100ngのDNAとを含有する30μl/ウェ
ルのDMEM培地と交換した。プラスミドpcDNA−I/Amp−A2
4は、対立遺伝子HLA−Ａ＊2402であると同定されたLB33
−MEL.BからのHLA−A24を含有している。37℃での４時
間のインキュベーション後、前記培地を除去し、これ
を、10％のDMSOを含有した50μｌのPBSによって置換し
た。この培地を、２分後に除去し、これを、10％のFCS
を添加した200μｌのDMEMと交換した。
この培地の交換後、COS細胞を、37℃で48時間インキ
ュベートした。つぎに、培地を廃棄し、10％のプールさ
れたヒト血清を含有した100μｌのIscove培地に、前述
したCTLクローン269/1の2000個の細胞を添加した。24時
間後に上清を除去し、TNF含有量を、その開示内容を参
考文献として含ませるトラヴァーサリ（Traversari）
他、Immunogenetics 35:145〜152（1992）に記載され
ているようにして、WEHI細胞に対するアッセイによって
測定した。
テストした400のプールの内、１つが陽性であった。
例４ 前記陽性プールのバクテリアをサブクローン化した。
プラスミドDNAを600個の独立した集落から抽出し、pcDN
A−I/Amp−A24とともに、上述したのと同じ方法によっ
て、COS細胞の新しいサンプルに共同移入し、これらの
細胞について、再び、CTL269/1の刺激をテストした。１
つの陽性クローンが見つかり、これか“5E10"と同定さ
れた。
前記陽性クローンからのプラスミドを取出し、当該分
野において公知の技術に従って配列した。
同定された配列は、1554塩基対長（配列認識番号１を
参照）である。この配列は、518個のアミノ酸をコード
する転写解読枠を含んでいる。
位置1310〜1413の104個のヌクレオチドは、Genbank:L
25344,HOMRBCESTC“Human（クローン17）”に記録され
ている、赤白血病発現配列タグ（EST）mRNAフラグメン
トである113塩基対配列の内の最初の104の塩基対と同じ
であることが判った。が、配列認識番号１の配列に対応
する配列は見だせなかった。
例５ 5E10の単離後、上述したように、これを、LB33−MEL
の全RNAと標準技術とを使用して、標準ノザンブロット
法におけるプローブとして使用した。
その結果は、約2.5キロ塩基長のバンドを示し、これ
は、もちろん、前記プローブ自身よりも幾分長い。これ
は、クローン5E10が完全なものではないことを示唆して
いる。
その結果、LB33−MEL細胞のRNAから調製された前述し
たものと同じcDNAを、再びcDNA 5E10をプローブとして
使用してスクリーニングした。2148個の塩基対の１つの
cDNAが同定され、これを配列決定した。これを、Hi2と
称する。5E10の配列は、塩基254において、Hi2はシトシ
ンを有するのに対して、5E10はチミンを有していること
を除いて、Hi2の配列中に完全に含まれている。
例６ Hi2の単離後、Hi2が腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列で
あるか否かを確認するために、１組の実験を行った。具
体的には、HLA−A24陽性白血病細胞系LB804−ALLを使用
した。というのは、以前の実験によって、CTL269/17
は、前述したように、この系を溶解しないことが示され
ていたからである。
前記白血病細胞系に、発現ベクターpEF−BOS−puro.P
L3を移入した、このベクターは、遺伝子授与（gene co
nferring）ピューロマイシン抵抗性を有し、これにcDNA
Hi2をクローン化した。抗ピューロマイシン集団を選
択し、単離した。これらは、CTL269/17に対して敏感で
あることが判明し、従って、抗原LB33−Ｅの発現が、CO
S−７の移入から生じる高いコピー数に依存していない
ことを示唆している。
図3A及び3Bはこれらの結果を示し、ここで、3Aは移入
前の白血病細胞系を示し、CTL269/17はその応答体（res
ponder）である。
Hi2の配列は、配列認識番号２として提供される。こ
れをデータバンク中のその他の配列と比較すると、ヌク
レオチド1486〜1589は、骨髄白血病細胞系K562（Gen B
ank:L25344）において発現される113塩基対の配列の104
の塩基対と同じであることが判った。ヌクレオチド1983
〜2128は、前骨髄球細胞系HL−60（DDBJ:D20455）にお
いて発現される147の塩基対の内の146と同じであり、一
方、ヌクレオチド1736〜2067は、ヒトの精巣の細胞にお
いて見られる332塩基対のcDNA（Gen Bank:T19428）の
内の325の塩基対に対して97％相同である。
Hi2の配列の分析によって、信号配列を持たない、509
個のアミノ酸の推定タンパク質をコードする転写解読枠
が示された。データバンク中の他のタンパク質と有意の
相同性は見られなかった。
例７ つぎに、Hi2を使用して、前記関連タンパク質をコー
ドするゲノムDNAを単離した。ヒトゲノムDNAライブラリ
の70,000個のコスミドの12のグループのDNAを収集し、5
E10を使用して、標準技術によってこれらをハイブリッ
ド形成した。前記クローンは、１つのコスミドグループ
とハイブリッド形成した。サブクローン化後、cDNAクロ
ーン5E10とハイブリッド形成した１つのコスミドが同定
された。その配列を、前記cDNA配列から演繹されたプラ
イマを使用することによって得た。この配列は、６つの
エキソンを提示し、エキソン３〜６にわたって転写解読
枠を有している。
例８ 前記配列認識番号１の情報は、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）による遺伝子発現の分析を可能にするに十分な
ものであった。
下記のプライマを使用した。
5'−GCCTGCTGAAGGATGAGGCC−3'（配列認識番号３） 5'−GGTGCTGCAGGAGACTCTGC−3'（配列認識番号４） これらは、それぞれ、配列認識番号１の、ヌクレオチ
ド157〜176と、1328〜1347とに対応している。
前記PCRは、28のサイクル行った（１サイクル:94℃で
１分間、65℃で２分間、72℃で３分間）。このPCRを行
うに当たって、前述したように調製した、2.5ulのcDNA
テンプレートを、2.5ulの10xDynazyme緩衝液と、0.25ul
の各dNTP（10mM）と、0.5ulの各ブライマ（20mM）と、
0.5UのDynazyme（0.25ulストック,2U/ml）と、18.5ulの
水と組み合わせた。下記の表１は、これらの結果を示し
ている。多数の種々の腫瘍サンプルと腫瘍細胞系とにわ
たる発現に注目されたい。これは、これが細胞培養の人
為結果ではないということを示唆している。更に、精巣
を例外として、正常細胞には全く発現がない。
例９ TNF（腫瘍壊死因子）放出量に基づき、第２のアッセ
イを行った。このアッセイにおいて、COS−７細胞（10,
000細胞／マイクロウェル）に、上述したように、前記
プラスミドpcDNA I/Amp担持HLA−A24cDNAを移入する
か、もしくは、このプラスミドと、更に、上述した配列
認識番号１を含むプラスミドpcDNA I/Ampとを共同移入
した。移入の24時間後、CTL269/17の3000個の細胞を前
記移入体に添加した。コントロールにおいて、同数のLB
33−MEL.B−１細胞を使用した。前記細胞培地中におけ
るTNF放出の濃度を、TNF感応性細胞系WEHI−164c13を使
用して、24時間後に測定した。
その結果を図４に示す。これらは、CTLsによるTNF放
出が、HLA−A24を発現するベクターと配列認識番号１と
を共同移入されたCOS細胞のみに誘発されたことを示し
ている。COS細胞は、それ自身ではHLA−A24を提示せ
ず、また、本発明の前記配列を発現するものでもない。
しかし、共同移入されたとき、これらは、自己由来性細
胞系LB33−MEI.B−１のレベルに近いレベルにまでTNF放
出を誘発する。
図３に示す結果は、配列認識番号１の物質が、事実、
プロセッシングされたときに、CTLsを刺激する腫瘍拒絶
抗原前駆体をコードするものであることを示すだけでな
く、更に、後述するように、非形質転換細胞を使用する
ことによって腫瘍細胞に対して特異的なCTLsの存在をア
ッセイすることができ、これによって、その結果得られ
る移入体がHLA−A24とDAGEとの両方を発現するというこ
とも示している。
例10 TRAPsがより小さな腫瘍拒絶抗原にプロセッシングさ
れるということが十分に確立されたので、前述した配列
から作り出される腫瘍拒絶抗原または抗原を同定するた
めの実験を行った。
5E10のためのcDNAを、エンドヌクレアーゼNsi Iによ
って部分的に消化し、これによって裁頭化されたcDNAク
ローンを、HLA−A24 cDNAクローンとともに、COS−７
細胞に共同移入した。つぎに、これらの移入体のLB33−
Ｅの発現を、CTL269/17を添加し、TNF産生を測定するこ
とによってテストした。
その結果を図５にまとめる。Hi2のcDNAのヌクレオチ
ド1047〜1260に対応するヌクレオチドが、前記関連抗原
をコードすることが判った。この領域における、（ｉ）
９又は10アミノ酸長で、（ii）位置２にTyr又はPheを有
し、かつ（iii）Ｃ末端に置いて、Phe,Leu,Ile又はTrp
のいずれかを有する、４つの配列が可能であった。これ
は、クボ（Kubo）他、Immunol 152:3913（1994）；メ
イエール（Meier）他、Immunogenetics 40:306〜308
（1994）によって記載されているHLA−A24結合のための
モチーフである。これらを合成し、上述したHLA−A24
cDNAクローンを予め移入しておいた、MHCクラスＩ陰性
Ｂ−細胞リンパ芽球系CIRの細胞とインキュベートし
た。１つのペプチド、即ち、 Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu（配
列認識番号５）が、前記被移入CRI−A24細胞を、500nM
で半値効果（half maximal effect）として、前記抗L
B33−Ｅ CTLsによる溶解に対して感作させた。
比較実験を行い、ここでは、１つの追加Ｎ−又はＣ−
末端アミノ酸を含有し、そのＣ−末端Leuが欠失された
ペプチドを使用した。配列認識番号６は、配列認識番号
５よりは低い程度にではあるが、前記細胞を溶解に対し
て感作させた。配列認識番号７と８とは、図６に示すよ
うに、前記細胞の感作に関してはるかに感度が低かっ
た。ペプチドは、そのＮ末端をAlaで延長した配列識別
番号５（Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Ph
e Leu;配列認識番号６）を、そのＣ末端Leuを欠失させ
る（Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe;配列認
識番号７）ことによって使用した。Ｃ末端にArgを加え
ることによって、Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe
Phe Leu Arg;配列認識番号８が得られた。これらの
実験において、51Crラベル化CIR−A24細胞を、示された
ペプチド濃度の存在下で30分間インキュベートした。CT
Lsは、10:1のE/T比で添加し、クロム放出は４時間後に
測定した。
例11 次に、周知の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（“RT−PC
R"）を使用して、対象の遺伝子の発現を調べるためのテ
ストを行った。下記の表２に、その結果が示されてい
る。
陽性腫瘍の比率が高いのは、メラノーマ（91％）、肺
扁平ガン腫（78％）、と腺癌（46％）と、更に、腎臓癌
（43％）、肉腫（40％）、そして急性白血病（33％）と
であった。
また、正常組織中にもいくらかの発現があった。精巣
と、卵巣と子宮内膜とが、細胞系LB33−MEL中に発見さ
れたものの内の10％を占め、他方、より低いレベルが、
皮膚、脳、心臓、腎臓および副腎組織中に見られた、表
２と図６を参照。
上記諸例は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分
子の単離を示すものである。しかし、この“TRAP"コー
ド分子は、前述した諸参考文献に記載されている過去に
おいて開示されたMAGE,BAGEあるいはGAGEコード配列の
いずれとも相同性を有していない。従って、本発明の１
つの態様は、配列認識番号１又は配列認識番号２、更
に、HLA−A24等のMHC分子によって提示される配列認識
番号5,6及び８をコードするものなどのTRAsを発現する
配列認識番号１又は配列認識番号２の部分で、DAGEから
誘導されたものである。この配列は、それを、前に挙げ
た参考文献に記載されているこれら遺伝子の配列と比較
することによって理解されるように、MAGE、BAGEあるい
はGAGE配列ではない。更に、非−MAGE,非−BAGE及び非
−MAGE腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするが、ストリンジ
ェント条件下において配列認識番号１及び２のヌクレオ
チド配列とハイブリッド形成するヌクレオチド配列も本
発明の一部を構成する。ここで使用する“ストリンジェ
ント条件”という用語は、当該技術において周知のパラ
メータをいう。より具体的には、ここで使用するところ
のストリンジェント条件とは、1MのNaClと、１％のSDS
と、そして10％の硫酸デキストランとの中でのハイブリ
ッド形成のことである。この後、2xSSC中で５分間と、2
xSSC,0.1％SDS中で30分間の洗浄を１回とのフィルタの
室温での洗浄を行う。同じ程度またはより高いストリン
ジェント条件を作り出すことができる使用可能なその他
の条件、試薬も存在する。当業者は、このような条件に
ついて周知であろう。従って、これらはここでは記載し
ない。
この遺伝子の発現の広い分布（８つのタイプの腫瘍の
内で７つがそれを発現することが判った）は、前記単離
核酸分子を、形質転換した細胞の存在を判定するための
プローブとして使用可能であることを示している。メラ
ノーマの同定は、非常に基本的レベルにおいて、100％
であったので、前記単離核酸分子は、メラノーマが存在
しているか否かの判定に使用することができる。尚、当
業者においては、腫瘍サンプルがメラノーマサンプルで
あるかどうかを確認する多数の方法が利用可能であるの
で、これらについてはここで繰り返す必要はない。更
に、腫瘍の同定の成功率は、細胞の形質転換を判定する
ための核酸に基づく診断方法による。
尚、前記諸例から、本発明が発現ベクター中の配列の
利用を含むものであり、これらを、原核細胞（例えば、
E.coli）や真核細胞（例えば、CHO又はCOS細胞）のいず
れであっても、宿主細胞および細胞系の形質転換または
移入に利用可能であることが理解されるであろう。これ
らの発現ベクターは、関連する配列、即ち、前述したも
のが、プロモータに作動連結されていることを必要とす
る。ヒト白血球抗原HLA−A24が、これらの遺伝子から誘
導される腫瘍拒絶抗原を提示することが判っているの
で、前記発現ベクターは、更に、HLA−A24をコードする
核酸配列を含むことができる。前記ベクターが両方のコ
ード配列を含む場合、これは、正常にはいずれも発現し
ない細胞の形質転換または移入に利用することが可能で
ある。前記腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例えば、
宿主細胞が既にHLA−A24を発現する場合などにおいて、
単独で使用可能である。もちろん、使用可能な具体的な
宿主細胞に関しては制限はない。前記２つのコード配列
を有するベクターは、所望の場合には、HAL−A24提示細
胞中にて使用可能であるので、腫瘍拒絶抗原前駆体のた
めの遺伝子を、HLA−A24を発現しない宿主細胞中におい
て使用することができる。
本発明は、更に、当業者が所望の単数または複数の発
現ベクターを調製することを可能にする、いわゆる発現
キットをも含む。このような発現キットには、少なくと
も、前述したコード配列のそれぞれを別々のポーション
として有する。必須である前述した配列が含まれる限
り、所望の場合には、その他のコンポーネントを含ませ
ることも可能である。
本発明の前記核酸分子およびTRAPsを、前述したMAGE,
BAGE及びGAGE物質から区別するために、本発明を、DAGE
ファミリの遺伝子およびTRAPsと称することにする。そ
れ故、ここで“DAGE"を用いる場合はいつも、前述した
配列によってコードされた腫瘍拒絶抗原前駆体と称す
る。“DAGEコード分子”およびこれに類似の用語が、前
記核酸分子自身を指すのに使用される。
ここに記載した本発明は多数の利用方法があるが、そ
の内のいくつかについて、ここに記載する。先ず、本発
明によって、当業者は、TRAPの発現によって特徴づけら
れる障害を診断することが可能である。これらの方法に
は、TRAP遺伝子の発現および／又はHLA−A24によって提
示されるTRA等のそこから誘導されるTRAsの発現の判定
が含まれる。前者の場合、このような判定は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応を含むどのような標準式核酸判定アッセ
イ、あるいは、ラベル化ハイブリッド形式プローブを使
用したアッセイによっても実施することが可能である。
後者の場合、例えば、抗原などのTRAとHLAとの複合体に
対する結合パートナを使用したアッセイが特に好適であ
る。別の判定方法として、前述したタイプのTNF又は51C
r放出アッセイがある。
前記TRAP遺伝子の単離によって、更に、このTRAP分子
自身、特に、配列認識番号２によってコードされる前記
アミノ酸配列を含むTRAP分子を単離することが可能にな
る。これらの単離分子は、TRAとして、あるいはTRAとHL
Aとの複合体として提示されたときに、アジュバント等
の物質と組み合わせてTRAP分子の発現によって特徴づけ
られる障害の治療に有効なワクチンを製造することがで
きる。更に、非−増殖性癌細胞、非−増殖性移入体など
の、その表面にTRA/HLA複合体を提示する細胞からもワ
クチンを作ることができる。細胞がワクチンとして使用
されるすべての場合において、これらは、CTL応答を提
供するのに必要な前記要素の一方または両方のコード配
列を移入された細胞、あるいは、両方の分子を移入なし
で発現する細胞とすることができる。更に、前記TRAP分
子、その関連TRAs、更に、TRAとHLAとの複合体は、当該
技術において周知の標準技術を使用して、抗体を製造す
るのに使用することができる。
ここで“障害”という用語を使用するとき、これは、
腫瘍拒絶抗原前駆体が発現されるすべての病状を指す。
このような障害の具体例としては、癌、特にメラノーマ
がある。メラノーマは、色素産生細胞の癌として周知で
ある。
前記開示内容に基づく治療方法は、HLA−A24細胞など
のTRA提示細胞の溶解を導く対象体の免疫システムによ
る応答を前提としている。このような方法の１つとし
て、前記複合体に対して特異的なCTLsの、問題の表現型
の異常細胞を有する対象体に対する投与がある。このよ
うなCTLsをインヴィトロで開発することは、当業者の技
術的範囲に含まれる。具体的には、血液細胞などの細胞
サンプルが、前記複合体を提示し、特異的CTLの増殖を
誘発可能な細胞に接触される。標的細胞は、上述したタ
イプのCOS細胞などの移入体であってよい。これらの移
入体は、その表面上に前記所望の複合体を提示し、対象
のCTLと組み合わされたとき、その増殖を刺激する。こ
こに使用したもののようなCOS細胞は、広く入手可能で
あり、他の適当な宿主細胞もしかりである。
養子移入（adoptive transfer）と称される前記治療
方法（グリーンバーグ（Greenberg）J.Immunol.136
（５）:1917（1986）：リッデル（Riddel）他、Science
257:238（７−10−92）：リンチ（Lynch）他、Eur.J.
Immunol.21:1403〜1410（1991）；カスト（Kast）他、C
ell 59:603〜614（11−17−89）について詳述すると、
所望の複合体を提示する細胞を、CTLsと結合させ、この
細胞に対して特異的なCTLsを増殖させる。つぎに、この
増殖したCTLsを、前記特定の複合体を提示している前記
異常細胞のいずれかによって特徴づけられる細胞異常を
有する対象体に投与するものであり、前記複合体は直接
的HLA分子を含む。すると、CTLsが異常細胞を溶解し、
所望の治療目的を達成する。
上述の治療方法は、対象体の異常細胞の内の少なくと
もいくつかが前記HLA/TRA複合体を提示することを前提
としている。これは、その技術が特定のHLA分子を提示
する細胞を同定する方法と、前記特定の配列、ここでは
DAGE配列、を有するDNAを発現する細胞を同定する方法
とに非常に類似しているため、非常に容易に判断するこ
とができる。一旦、関連複合体を提示する細胞を上述の
スクリーン法によって同定した後は、そのような細胞
を、対象体からの、CTLsを含むサンプルと結合させるこ
とが出来る。もしも細胞提示複合体が前記混合CTLサン
プルによつて溶解されるならば、GAGE派生の腫瘍拒絶抗
原が提示されていると推定することができ、その対象体
は、上述の治療アプローチを使用するのに適切な候補と
なる。
養子移入のみが本発明によって利用可能な治療方法で
はない。種々のアプローチを使用して、インヴィヴォで
CTLsを誘発することも可能である。１つのアプローチ、
即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用につい
ては既に記載した。このアプローチにおいて使用される
細胞としては、前記複合体を正常時において発現する細
胞、例えば、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の
提示に必要な前記遺伝子の１つ又は両方によって移入さ
れた細胞などを使用することができる。このアプローチ
の一具体例はチェン（Chen）他、Proc.Natl.Acad.Si.US
A 88:110〜114（1991年１月）に記載されており、ここ
には、HPVE7ペプチドを発現する移入された細胞の、治
療法における使用が示されている。様々な細胞タイプを
使用することができる。同様に、問題の遺伝子の片方ま
たは両方を担持するベクターを使用することができる。
ウィルス性またはバクテリア性のベクターが特に好まし
い。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例え
ば、ワクシニアビールスやバクテリアBCG等によって担
持され、これらの物質が実質的に（defacto）宿主細胞
に感染（“インフェクション”）する。その結果得られ
る細胞は、問題の複合体を提示し、自己増殖CTLsによっ
て認識され増殖する。前記腫瘍拒絶抗原または前記先駆
体自身を、問題のHLA/ペプチド複合体を提示するHLA−A
24提示細胞への組み込みを促進するアジュバントと結合
させることによっても、類似の効果を達成することがで
きる。前記TRAPはプロセッシングされてHLA分子のペプ
チドパートナーを生成し、他方、TRAは、更なるプロセ
ッシングを必要とせずに提示される。
本発明の更に別の特徴構成は、前記DAGE TRAPから誘
導され、MHC分子による提示ルールに従う単離ペプチド
にある。例えば、ここに参考文献として含ませるPCT出
願PCT/US93/07421号には、様々なMHC分子に関連してい
るものとしていくつかのモチーフが記載されている。こ
こに参考として含ませるこれらのモチーフと、それらの
すべてが参考文献として含まれる、例えば、フォーク
（Falk）他、Nature 351:290〜296（1991）；エンゲル
ハード（Engelhard）,Ann.Rev.Immunol 12:181〜207（1
994）；ルッパート（Ruppert）他、Cell 74:929〜937
（1993）；レツシュケ（Roetzschke）他、Nature 348:
252〜254（1990）；ビョークマン（Bjorkman）他、Natu
re 329:512〜518（1987）及びトラヴァーサリ（Traver
sari）他、J.Exp.Med.176:1453〜1457（1992）によって
教示されているモチーフは、前記DAGE遺伝子から入手ま
たは誘導可能な適当なペプチドの同定のための基礎とし
て役立つ。これらのペプチドは、単体として使用しても
よいし、つぎに記載する本発明の別態様におけるように
混合物として使用してもよい。これらの具体例は以下の
通りである。HLA−A2に対して、結合モチーフは、Xaa
Leu Xaa Gly（Xaa）ｎ Leu（配列認識番号9,10）で
あり、ここでｎは４又は５である。配列識別番号１のア
ミノ酸120〜128がこのモチーフに対応している。HLA−A
2の第２のモチーフは、末端LeuをValで置換したもので
あり（配列認識番号19,20）、アミノ酸375〜384がこの
モチーフを満たす。HLA−３に対して、そのモチーフ
は、Xaa Leu （Xaa）６（Lys又はTyr）（配列認識番
号11及び配列認識番号12）である。配列認識番号１のア
ミノ酸48〜56,100〜108,138〜146,214〜222及び257〜26
5が、このモチーフを十分に満たす。HLA−A11に対し
て、そのモチーフ（Xaa）７ Lys Lys（配列認識番号1
3）が知られており、アミノ酸169〜178,214〜223及び22
3〜232がそれを満たすであろう。HLA−A24に対して、公
知のモチーフは、Xaa Tyr （Xaa）６ Leu（配列認識
番号18）であり、これは、アミノ酸274〜282,及び467〜
475、更に、配列認識番号５によっても満たされる。HLA
−B7に対して、そのモチーフは、Xaa Pro Arg （Xa
a）５ Leu（配列認識番号14）であり、これはアミノ酸
68〜76が満たす。HLA−B8に対して、（Xaa）２ Lys X
aa Lys （Xaa）３ Leu（配列認識番号15）がそのモ
チーフであり、これはアミノ酸176〜184と218〜226とに
よって満たされる。HLA−B44に対して、モチーフXaa G
lu （Xaa）３ Asp （Xaa）２ Phe（配列認識番号1
6）は、アミノ酸204〜212によって満たされる。HLA−Cw
＊1601は、アミノ酸60〜68及び395〜403によって満たさ
れる。
HLAモチーフに対応する多数の配列が存在するという
事実は、ここで“カクテル”治療および診断利用方法と
称されるものを示唆するものである。腫瘍細胞に対する
典型的なCTL応答において、１以上のペプチドとHLA分子
の複合体が増殖するものと予想される。例えば、HLA−A
24提示細胞に対して、HLA−A24とアミノ酸配列467〜475
に対して特異的なCTLsが増殖するかもしれない。従っ
て、CTLsの同定を試みる際に両方のペプチドを使用する
ことによって、アッセイを最適化することができる。同
様に、１以上のHLA−A24結合ペプチドを使用することに
よって前記治療方法を最適化できるかもしれない。
細胞が１種類以上のHLAを提示することから、個人のH
LA分子は“１価”ではないことはよく知られている。従
って、CTLsを判定する診断アッセイ又は、前述した治療
法において患者を処置するために、前述した多数のペプ
チドを組み合わせることによって、診断および／治療を
最大化することが可能である。
虚偽の陽性に関する懸念は杞憂であると考えられる。
というのは、前述したように、本発明の核酸分子は、腫
瘍細胞中においてのみ発現されることが判っており、従
って、HLAとペプチドに対するCTLsの存在は、現存の癌
状態または形質転換状態の過去のなんらかの時点におけ
る、その存在の事実上の証拠と考えなければならない。
このように、本発明のペプチドのカクテルを調製するこ
とができる。混合物の成分の決定は困難ではない。とい
うのは、必要なのは、考慮対象の個人によって提示され
る１つまたは複数のHLAタイプだけであるからである。H
LA分類は、当該技術において周知の非常に標準的な技術
であり、十分に当業者の能力および技量の範囲内であ
る。
腫瘍を患う個人の血液が、MHC分子と提示ペプチドと
の複合体に対する細胞障害性Ｔ細胞（“CTLs"）を有し
ていることが多いことは、既に十分に実証されている。
例えば、これらのすべての参考文献として含ませるロビ
ンス（Robbins）他、Canc.Res.54:3124〜3126（199
4）；トポリアン（Topolian）他、J.Immunol.142:3714
〜3725（1989）；クーリ（Coulie）他、Int.J.Cancer
50:289〜297（1992）を参照。又、これらのすべてを参
考文献として含ませる、カワカミ（Kawakami）他、J.Ex
p.Med.180:347〜352（1994）；ホム（Hom）他、J.Immun
other 10:153〜164（1991）；ダロー（Darrow）他、J.
Immunol.142（９）:3329〜3335（1989）；ソルビン（So
lvin）他、J.Immunol.137（９）:3042〜3048（1986）を
参照。これらの文献は、すべて、癌の診断のためのCTL
増殖アッセイの有効性を実証している。一般的に記載す
ると、テスト対象体から末梢血液リンパ球（PBL）含有
サンプルを採取する。その患者が癌を有しているか、あ
るいは、その対象体の細胞が形質転換を受け始めている
と仮定すると、形質転換細胞に対して特異的なCTLsがそ
のサンプル中に含まれているであろう。これらのCTLs
を、関連MHC分子とそれによって提示されるペプチドと
の複合体を提示する標的細胞との接触によって刺激させ
て増殖させることができる。例えば、既に示したよう
に、DAGE誘導腫瘍拒絶抗原前駆体（“TRAs"）が、HLA−
A24細胞によって提示される。従って、前記PBLサンプル
を、HLA−A24提示細胞とTRAPから誘導され、HLA−A24に
よって提示されるペプチドとの標的と混合することによ
って、CTL増殖を観察することができ、従って、形質転
換細胞の存在を診断することができる。これらの細胞
は、問題のMHC分子を正常に提示する細胞であってもよ
いし、あるいは、HLAコード配列によって形質転換され
る細胞であってもよい。前記細胞は、腫瘍細胞であって
もよいし、正常細胞であってもよい。TNF放出アッセイ
や51Cr放出アッセイを含めてCTL増殖の判定の様々な方
法が知られている。その他の方法も利用可能である。こ
のように、本発明の一態様は、標的細胞サンプルを、DA
GE TRAから誘導され、かつ、標的細胞サンプルのMHC分
子によって提示される単数種または複数種のペプチド
と、評価対象体のPBLsとの混合に関する。そして、この
混合物のCTL増殖をテストしている。
前記単数または複数種のペプチドは、又、より明確な
CTL応答を刺激する単数または複数のアジュバントと組
み合わせることができる。このようなアジュバントの具
体例としては、参考文献として含ませるケンシル（Kens
il）他の米国特許第5,057,540号、又は、これも参考文
献として含ませるスコット（Scott）他のPCT出願PCT/US
92/03579号によって開示されているようなサポニン又は
その誘導体がある。もちろん、フロイント完全アジュバ
ントやフロイント不完全アジュバント等の標準的アジュ
バントも使用することができる。
本発明のその他の態様は、当業者にとって明らかであ
ろう、従って、ここで繰り返す必要はない。
ここに使用した用語および表現は、記載の表現であっ
て限定の表現ではなく、これらの用語および表現を使用
するに当たって、ここに図示および記載した特徴構成、
または、その一部のなんらかの均等物を除外する意図は
なく、本発明の範囲内において種々な改変が可能である
と認識される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｐ 35/00 5/00 Ｂ 37/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 イケダ，ヒデユキ ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ブーン−ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (56)参考文献 特表 平６−511144（ＪＰ，Ａ) 特表 平８−500106（ＪＰ，Ａ) Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏ ｌ．40（1994），ｐ．306−308 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．152, Ｎｏ．８（1994），ｐ．3913−3924 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列認識番号１に記載のヌクレオチド配列
    からなる単離核酸分子。
  2. 【請求項２】配列認識番号２に記載のヌクレオチド配列
    からなる単離核酸分子。
  3. 【請求項３】ストリンジェントな条件下において、配列
    認識番号１又は配列認識番号２に記載の核酸分子とハイ
    ブリダイズするとともに、腫瘍拒絶抗原前駆体をコード
    する単離核酸分子であって、MAGE腫瘍拒絶抗原前駆体、
    BAGE腫瘍拒絶抗原前駆体、又はGAGE腫瘍拒絶抗原前駆体
    のいずれをもコードしない前記単離核酸分子。
  4. 【請求項４】配列認識番号１のヌクレオチド１〜1554か
    らなる単離核酸分子。
  5. 【請求項５】請求項１の核酸分子に対して相補的な単離
    mRNA分子。
  6. 【請求項６】請求項１の核酸分子を移入された、又は、
    この核酸分子によって形質転換された宿主細胞。
  7. 【請求項７】請求項３の核酸分子を移入された、又は、
    この核酸分子によって形質転換された宿主細胞。
  8. 【請求項８】請求項４の核酸分子を移入された、又は、
    この核酸分子によって形質転換された宿主細胞。
  9. 【請求項９】プロモータに作動可能に連結され、請求項
    １又は請求項２の単離核酸分子を有する発現ベクター。
  10. 【請求項１０】プロモータに作動可能に連結され、請求
    項３の単離核酸分子を有する発現ベクター。
  11. 【請求項１１】プロモータに作動可能に連結され、請求
    項４の単離核酸分子を有する発現ベクター。
  12. 【請求項１２】請求項６の宿主細胞であって、この宿主
    細胞は、HLA−A24を発現するほ乳類細胞である前記宿主
    細胞。
  13. 【請求項１３】請求項７の宿主細胞であって、この宿主
    細胞は、HLA−A24を発現するほ乳類細胞である前記宿主
    細胞。
  14. 【請求項１４】請求項８の宿主細胞であって、この宿主
    細胞は、HLA−A24を発現するほ乳類細胞である前記宿主
    細胞。
  15. 【請求項１５】請求項９の発現ベクターであって、更
    に、HLA−A24をコードする核酸分子を有する前記発現ベ
    クター。
  16. 【請求項１６】請求項10の発現ベクターであって、更
    に、HLA−A24をコードする核酸分子を有する前記発現ベ
    クター。
  17. 【請求項１７】請求項11の発現ベクターであって、更
    に、HLA−A24をコードする核酸分子を有する前記発現ベ
    クター。
  18. 【請求項１８】以下の各要素の別々のポーションを有す
    る発現キット、 （ｉ）請求項１又は請求項２の単離核酸分子、そして （ii）HLA−A24をコードする核酸分子。
  19. 【請求項１９】以下の各要素の別々のポーションを有す
    る発現キット、 （ｉ）請求項３の単離核酸分子、そして （ii）HLA−A24をコードする核酸分子。
  20. 【請求項２０】以下の各要素の別々のポーションを有す
    る発現キット、 （ｉ）請求項４の単離核酸分子、そして （ii）HLA−A24をコードする核酸分子。
  21. 【請求項２１】請求項1,2,3又は４の核酸分子によって
    コードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
  22. 【請求項２２】配列認識番号５又は配列認識番号６の単
    離ペプチド。
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