JP2001506972A

JP2001506972A - 二機能性のタンパク質をコードする核酸分子、そのコードされるタンパク質、およびそれらの利用方法

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Publication number: JP2001506972A
Application number: JP51504798A
Authority: JP
Inventors: ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; マンドルザット，スザンナ; ブーン―ファラー，ティエリー
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-07-09
Publication date: 2001-05-29
Also published as: AU718524B2; EP0935605A4; AU3602697A; ZA977039B; US5932694A; US5955313A; WO1998013374A1; US5952228A; EP0935605A1; CA2266329A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍拒絶抗原をコードする単離核酸分子の同定に関する。この核酸分子およびそれがコードするタンパク質の様々な利用方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】二機能性のタンパク質をコードする核酸分子、そのコードされるタンパク質、およびそれらの利用方法関連出願本出願は、１９９６年６月２４日出願で、現在では放棄されている出願番号第０８／６６９，５９０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、核酸分子に関する。より具体的には、本発明は、その腫瘍拒絶抗原前駆体が、とりわけ、ＨＬＡ−Ｂ３５分子によって提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされる遺伝子に関する。問題となる遺伝子は他の既知の腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列とは関連していないようであるが、細胞アポトーシスに関連するタンパク質のグループである、システインプロテアーゼファミリーのメンバーと関連しているようである。本発明はまた、ＨＬＡ−Ｂ３５分子によって提示されるペプチドおよびそれらの利用方法にも関する。背景および従来技術哺乳類の免疫系が外来のまたは異質の物質を認識して、それらと反応するプロセスは複雑なものである。このシステムの重要な局面は、Ｔリンパ球、即ち“Ｔ細胞”応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原(“ＨＬＡ”)、または、主要組織適合遺伝子複合体（“ＭＨＣ”）と称される細胞表面分子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、その複合体と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセシングされるより大きな分子に由来する。この点に関しては、メール（Male）他，Advanced Immunology (J.P.Lipincott Company,1987),特にその６−１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体の相互作用は制限されたものである。即ち、ＨＬＡ分子とペプチドとの特定の組み合わせに対して特異的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在していても、それに特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対する免疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対する応答に関与している。タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研究がなされてきている。この事については、バリナガ（Barinaga），Science 257:880(1992);フリーモント（Fremont）他,Science257:919(1992);マツムラ（Matsumura）他,Science25 7:927(1992);ラトロン（Latron）他,Science257:964(1992)を参照。エンゲルハルト（Engelhard）,Ann.Rev.Immunol.12:181-207(1994)も参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムはガンにも関係している。たとえば、１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公表で、参考文献として本出願にその内容を合体させるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、一つの遺伝子ファミリーが開示されており、それらはプロセシングされてペプチドとなり、次に細胞表面に発現され、特異的なＣＴＬ細胞溶解性Ｔリンパ球、即ち、以後“ＣＴＬ”と称されるものによって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができる。これら遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体”即ち“ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われ、これら分子に由来するペプチドは、“腫瘍拒絶抗原” 即ち“ＴＲＡ”と称される。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics35:145(1992);ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他,Science254:1643(1991)を参照。又、現在来国特許第５，３４２，７７４号となっている、１９９１年１２月１２日出願の米国特許出願第８０７，０４３号も参照。その開示内容を本出願に参考文献として合体させる、現在米国特許第５，４０５，９４０号となっている、米国特許出願第９３８，３３４号において、プロセシングされてＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドになる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするＭＡＧＥ−１遺伝子が説明されている。前記参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分子に対して結合するが、他のＨＬＡ分子に対しては結合しないであろうと推測される、ということを教示している。これは重要なことである。なぜなら、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。そのため、ある特定のペプチドが、ある特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであると同定されたことが、診断上および治療上の効果を有しているとしても、その効果はその特定のＨＬＡ表現型を有する個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られるものではないため、また、標的化療法(targeted therapy)には、問題の異常細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、この分野において更なる研究を行う必要がある。参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現産物がプロセシングされて第２のＴＲＡになるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬＡ−Ｃクローン１０分子によって提示される。この開示は所与のＴＲＡＰから複数のＴＲＡが生じることができるということを示している。参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号は、いくらかの正常細胞（例えば、メラノサイト）によって産生される分子である、チロシナーゼが、腫瘍細胞中でプロセシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドを生じるということを教示している。参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼ由来ではない、第２のＴＲＡがＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるということが教示されている。このＴＲＡはＴＲＡＰ由来であるが、非−ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされている。この開示はある特定のＨＬＡ分子が異なるソースに由来するＴＲＡを提示することができるということを示している。参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年６月１７日出願の米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、関連のない腫瘍拒絶抗原前駆体である、いわゆる、“ＢＡＧＥ”前駆体が記載されている。ＢＡＧＥ前駆体はＭＡＧＥファミリーとは関連していない。先に引用した論文、特許、および特許出願に示されている研究は、大部分は、ＭＡＧＥファミリーの遺伝子、および（それとは）関連のないＢＡＧＥ遺伝子について扱っている。この研究はいずれもＨＬＡ−Ｂ３５分子によって提示される腫瘍拒絶抗原については記載していない。ヒトＭＨＣ分子には多様性があるので、そのような分子の同定には長く続く興味がもたれる。この腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされるタンパク質をコードする核酸分子は以前に同定されている腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列とは関連していないようである；むしろ、それはＩＣＥシステインプロテアーゼコード配列と関連しているようである。このタンパク質は細胞のアポトーシスと関連している。核酸分子（配列番号１）および腫瘍拒絶抗原（配列番号２）は、本発明の特徴構成であり、以下の開示において示される。図面の簡単な説明図１は、標的にされる細胞集団に対する種々のＣＴＬクローンの溶解活性の研究において得られた結果を示す。図２は、同じＣＴＬクローンを用いた、ＴＮＦ放出試験を示す。図３は、どのＨＬＡ分子がＣＴＬによって標的にされる抗原を提示するのかを判定するために行った、ＴＮＦ放出試験を示す。図４は、関連するＨＬＡ分子をより詳細に表すために計画された研究を示す。図５は、ＨＬＡ−Ｂ３５およびｃＤＮＡ配列番号１とでトランスフェクトされた細胞をＣＴＬが同定したことを示す。図６は、配列番号２を用いて行った⁵¹Ｃｒ試験を示す。好適実施例の詳細な説明例１ＢＢ４９−ＳＣＣＨＮと称される、頭頸部扁平上皮ガンは、患者の腫瘍集団（腫瘤：tumor mass）に由来し、これを切除し、そして培養に使用した。これら細胞を次に周知のリン酸カルシウム沈殿法を用いて発現ベクターｐＥＦＢＯＳｐｕｒｏでトランスフェクトした。このベクターは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ミズシマ（Mizushima）他,Nucl.Acids Res.18(17):5322(1990) によって記載されているように、プラスミドｐＥＦＢＯＳにピューロマイシン耐性遺伝子を挿入することによって調製した。このプラスミドはＣＤ８０としても知られている、ヒトの同時刺激分子Ｂ７．１をコードする核酸配列を含む。トランスフェクタントを０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選抜し、そして限界希釈法によってクローン化した。“ＢＢ４９−Ｂ７．１クローン７”と称されるクローンは、既知の抗−ＣＤ８０モノクローナル抗体を用いた細胞けい光分析によって判定して、高いＢ７．１発現に基づいて選抜された。このクローン、およびＢＢ４９−ＳＣＣＨＮ細胞を、参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、ガズダー（Gazdar）他,Canc.Res.46:6011(1986)によって記載されているように、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、Ｌ−アルギニン(１１６ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−アスパラギン(３６ｍｇ／ｍｌ)、Ｌ−グルタミン（２１６ｍｇ／ｍｌ）およびＡＣＬ −４を加えたＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地中で培養した。末梢血単核細胞（以後、“ＰＢＭＣ”と称する）もＢＢ４９−ＳＣＣＨＮを提供した患者から単離した。患者ＢＢ４９の細胞を血清学によってテストしたところ、ＨＬＡ−Ａ２、Ｂ３５、Ｂ６２、Ｃｗ１およびＣｗ４陽性であることが判明した。例２細胞が確立されたので、自己混合リンパ球腫瘍細胞培養（ＭＬＴＣ）アッセイを行った。具体的には、０日目に、２ｍｌの前述の、但しＡＣＬ−４を含まずＦＣＳではなく１０％プールヒト血清を追加した培地中で、２ｘ１０⁶のＰＢＭＣを１０⁵の照射されたＢＢ４９．Ｂ７腫瘍細胞（１００Ｇｙ）で刺激した。３日目に、２５Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加した。反応集団を７日目および１５日目に、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む培地中で、１０⁵の照射されたＢＢ４９．Ｂ７腫瘍細胞によって再刺激した。２１日目に、周知の技術を用いてＣＤ８＋細胞をソートした。簡単に説明すると、抗−ヒトＣＤ８特異的モノクローナル抗体を磁気マイクロビーズに結合させ、そしてビーズをサンプルに添加した。ＣＤ８⁺細胞は付着し、そしてＣＤ８⁺／ＣＤ８^-細胞を分離カラムに通すことによって分離した。全部で３ｘ１０⁵のＣＤ８⁺リンパ球を次に、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で５ｘ１０⁴の照射されたＢＢ４９．Ｂ７腫瘍細胞および１０⁶の照射された（３０Ｇｙ）ＣＤ８^-細胞で再刺激した。この後、２８日目に、ＭＬＴＣ集団に対して限界希釈法技術を用いてＣＤ８⁺ＣＴＬクローンを単離した。これらＣＴＬクローンの細胞溶解活性を、ＢＢ４９−ＳＣＣＨＮ細胞を標的として用いて⁵¹Ｃｒ放出試験においてテストした。標的は１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで７２時間前処理したか、または処理しなかった。ＢＢ４９を溶解した３つのＣＴＬクローンが同定され、これらはＮＫ−感受性標的細胞、即ちＫ５６２細胞のコントロールサンプルを溶解しなかった。これらクローンは、ＣＴＬクローン３２８ａ／６９、３２８ａ／１２１および３２８ｃ／１と称される。図１は、様々なエフェクター：標的比における、標的細胞の溶解のパーセンテージを示す実験の結果を示している。前記ＣＴＬクローンについて、次にこれらがＢＢ４９腫瘍細胞で刺激された際にＴＮＦを放出するかを調べるためにテストした。このアッセイは、１０％ヒト血清および２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む１００ｕｌのＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地とともに、マイクロウェル中で１０⁴標的細胞と１５００のＣＴＬを混合することによって行った。上清を４または２４時間後に収集し、そしてＴＮＦ含量を、ＴＮＦ感受性細胞であるＷＥＨＩ−１６４クローン１３を用いることによって測定した。図２は、３つのすべてのＣＴＬクローンが有意な量のＴＮＦを放出したことを示す。例３どのＨＬＡ分子が前記ＣＴＬクローンに対して抗原ペプチドを提示したのかを決定することに興味が持たれた。ＣＴＬクローン３２８ａ／１２１をこれらの実験において使用した。これは１５００のＣＴＬを、１−２ｘ１０⁴のＢＢ４９細胞、および当業者に周知の種々のモノクローナル抗体と混合する工程を含むものであった。Ｗ６／３２は抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＣｍＡｂであり、Ｂ．１．２３．２は抗ＨＬＡ−Ｂ，ＣｍＡｂであり、２Ｂ５は抗−ＨＬＡ−ＤＲｍＡｂであり(ネガティブコントロール)、そして４Ｅは抗−ＨＬＡ−ＢｍＡｂである。図３は、これらの結果を示すものであり、ＴＮＦ産生はＷ６／３２、Ｂ．１２３．２および４Ｅの存在下においては激しく減少したが、２Ｂ６の存在下では減少しなかったということを示しており、これはＨＬＡ−Ｂ３５またはＢ６２／ペプチド複合体の認識を示すものである。どちらのＨＬＡ分子が関与していたかを決定するために、異なるＨＬＡ−Ｂ３５およびＨＬＡ−Ｂ６２陽性腫瘍細胞ラインについてテストした。図４は、これらの結果を示す。ＬＢ１０４７−ＲＣＣおよびＬＥ９２．11-RＣＣはともにＨＬＡ−Ｂ３５陽性であり、この結果はＨＬＡ−Ｂ３５が提示分子であることを示唆するものである。例４ＨＬＡ−Ｂ３５に対するｃＤＮＡは以前にＬＢ１０４７−ＲＣＣの細胞から得られていた。ＢＢ４９−ＳＣＣＨＮからｃＤＮＡライブラリーも調製した。次にｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを用いて組換えプラスミドを調製するのに使用し、その後これらプラスミドを大腸菌ＤＨ５αにエレクトロポレーションし、そして５０μｇ／ｍｌのアンピシリンで選抜した。このライブラリーをそれそれ１００の細菌からなる８００のプールに分けて、それぞれのプールの細菌を飽和するまで増幅した。プラスミドＤＮＡを次に抽出した。次に抽出したｃＤＮＡを、以前に言及したＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡを用いた共トランスフェクション(co-transfection)実験において使用した。共トランスフェクションは周知のＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法を用いて行った。簡単に説明すると、１．５ｘ１０⁴のＣＯＳ−７細胞を、上述のライブラリーからの、１００ｎｇの組換えプラスミドｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐおよび、ＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡを含む、５０ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ３によってトランスフェクトした。トランスフェクタントを次に、それらがここに記載した方法を用いてＣＴＬクローン３２８ａ／６９および３２８ａ／１２１によるＴＮＦ産生を刺激することができるかどうかを判定するためにテストした。１つのｃＤＮＡプールが両方のＣＴＬクローンについて陽性であることが判明、それを配列決定した。次にサブクローニングを行い、そして個々のプラスミドＤＮＡを上述のトランスフェクションおよびスクリーニングプロセスに使用した。配列番号１に示す、１つのｃＤＮＡクローンをこれらの手順を用いて単離した。例５単離したｃＤＮＡを次に、ＰＣＲによってクローニングされた自己ＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡを用いた共トランスフェクション実験においてテストした。ＨＬＡ−Ｂ３５をクローニングするために、プライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣ−３’ （配列番号２）および５’−ＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＣ−３’ （配列番号３）をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲはＰＦＵポリメラーゼ酵素を用いて３５サイクル行った(９４℃で１分、６２℃で５秒、７５℃で５分が１サイクル)。ＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ３にクローニングし、配列番号１を含むプラスミドとともに、ＣＯＳ細胞を共トランスフェクトするのに使用した。図５に示すように、トランスフェクタントはＣＴＬによって認識された。例６前述のｃＤＮＡクローン（配列番号１）は、２６４９塩基対長である。最も近いホモロジーは、the GenBankライブラリーにおいて“ｙｙｌｌｇｌｌ．ｓｌ．ヒトｃＤＮＡクローン２７０９８０”として同定されているクローンについて見られた。このクローンは、ヘンカート（Henkart）,Immunity 4:195-201(3/96)によって教示されている細胞死タンパク質３(“ＣＥＤ３”)をコードする配列と類似している。配列番号１が関連遺伝子のファミリーに属しているかどうかを判定するために次の実験を行った。これをテストするために患者ＢＢ４９の血中のリンパ球および腫瘍細胞から抽出したＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行った。ＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次にアルカリブロッティングを用いて、ＤＮＡキャピラリートランスファーをメンブランに対して行った。トランスファー後、メンブランを２ｘＳＳＣ中でリンスし、８０℃で１時間ベーキングし、そして６ｘＳＳＣ、１０ｘデンハルト溶液中で６０℃で３０分間前処理した。次にハイブリダイゼーションを、３．５ｘＳＳＣ、１ｘデンハルト溶液、２５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．０、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡおよびＰＣＲによって作った³²Ｐで標識した配列番号１のヌクレオチド１１５８−１４８２中で、６５℃で１８時間行った。メンブランを６５℃で２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでそれぞれ３０分間、２回洗浄し、次に、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３０分間、２回洗浄し、そして０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５分間、１回洗浄した。オートラジオグラフィーは３日間行った。ＥｃｏＲＩでの消化では１つのおよそ５ｋｂのバンドのみが観察され、ＨｉｎｄＩＩＩでの消化後には１つのおよそ４ｋｂのバンドのみが観察された。これは、単離された配列が関連遺伝子のファミリーに属するものではないということを示唆している。しかし、ヌクレオチドレベルでのホモロジーの欠如は、ＩＣＥシステインプロテアーゼとして知られるファミリーの分子の特徴である。事実、配列番号１の推定アミノ酸配列は、そのようなタンパク質の１つ、即ちＣＰＰ３２と２１％のホモロジーを示し、モチーフ“ＱＡＣＸＧ”を含んでいる。ここで“Ｘ”は通常Ｒである。ＸがＱであるという支持が、ＸがＱである、配列番号１の推定アミノ酸配列から得られる。この位置は参考文献として本出願にその内容を合体させる、フェルナンデス-アルナーミ（Fernandes-Alnermi）他,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7464-7469(1996)によって支持される。この論文は２つの新規に同定されたシステインプロテアーゼファミリーのメンバー、即ちｍｃｈ４およびｍｃｈ５について記載しており、これらは両方関連する位置において“Ｑ”を有する。参考文献として本出願にその内容を合体させる、ヘンカート（Henkart）,Immunity 4:1 95-201(3/96)も参照。ＩＣＥシステインプロテアーゼは細胞のアポトーシスに関連しており、これは前記核酸分子によってコードされるタンパク質がアポトーシスに関連している可能性があることを示唆している。例７抗原ペプチドをコードする、配列番号１の領域を決定した。これを行うために、この配列のデリーション(deletions)をクローンの３’末端から市販のエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて行った。切形の(truncated)ｃＤＮＡを含むプラスミドを次に自己ＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡとともにＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトし、そして共トランスフェクタントを次にＴＮＦ産生アッセイにおいてＣＴＬ認識についてテストした。最も長い陰性クローン（ヌクレオチド１−１４４６）を最も短い陽性クローン（ヌクレオチド１−１６００）と比較して、少なくとも抗原ペプチドのＣ−末端はヌクレオチド１４４７−１６００の範囲内にコードされるということが明らかとなった。例８ｃＤＮＡのヌクレオチド１４４７−１６００がその中に腫瘍拒絶抗原を含むペプチドをコードするとして同定されたことから、さらなる研究が導かれた。まず、このヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を推定した。次に、その推定アミノ酸配列について、ラメンシー（Ramensee）他,Immunogenetics 41:178-229(1 995)によって提供されている、ＨＬＡ−Ｂ３５に対するペプチドの結合のための、コンセンサス配列が存在しているかどうかを判定するために研究を行った。そのような結合のための前記コンセンサス配列は、位置２においてＰＲｏを、そしてＣ−末端において疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）を要求する。以下のペプチドが前記推定アミノ酸配列内に含まれることが判明した： PhePro Ser Asp Ser Trp Cys Tyr Phe（配列番号４）および Phe Pro Ser Asp Ser Trp Cys Tyr（配列番号５）。両方のペプチドを周知の固相方法を用いて合成した。それらを次に周知の⁵¹Ｃｒ放出試験に用いて、それらがＣＴＬによる標的細胞の溶解を引き起こすことができるかどうか判定した。具体的には、標的細胞を⁵¹Ｃｒで３７℃にて１時間標識し、十分に洗浄した。１０００細胞からなるグループを様々な濃度のペプチドとともに３７℃で３０分間インキュベートした。次に１０，０００のＣＴＬを添加し、そして⁵¹Ｃｒ放出を４時間後に測定した。図６に示すように、前記ノナマーは溶解を引き起こした。前記オクタマーは⁵¹ Ｃｒ放出を引き起こさなかったので前記オクタマーについてのデータは示さない。例９前述の例６において論じた、配列番号１とｙｙｌｌｇｌｌ．ｓ１との比較は、配列番号１が位置１５０７−１５０９において突然変異した(mutated)終止コドンを有する可能性があるということを示唆していた。更に、ボルディン(Boldin) 他,Cell85:803-815(6-14-96)およびムズィオ（Muzio）他，Cell 85:817-827(6-1 4-96)によって発表された論文において、ボルディン（Boldin）他によっては“ ＭＡＣＨ”、そしてムズィオ（Muzio）他によってはＦＬＩＣＥと名付けられたタンパク質が開示されている。これらの論文において開示されたアミノ酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７０−１５０７によってコードされるアミノ酸配列に対応している。しかし、配列番号１のヌクレオチド配列内にコードされるオープンリーディングフレームはこれよりもっと長く、このことは終止コドン突然変異(mutation)を示唆している。この問題を研究するために、標準的方法に従ってＢＢ４９−ＳＣＣＨＮから採取した外科的サンプルから、ＲＮＡを単離した。次にＲＮＡを配列番号１のヌクレオチド６８３−７０３（センス）および１５１０−１５３０（アンチセンス）からなるプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに使用した。ＲＴ−ＰＣＲは９５℃で５分、その後３０サイクル(１サイクル：９５℃で１分、５５℃で２分、そして７２℃で２分)、続いて更に７２℃で１５分で行った。ＰＣＲ産物を次に精製して配列決定した。具体的には、配列番号１のヌクレオチド１４２３−１４４３からなるシークエンシングプライマーを、１０ピコモルのプライマー（４μＭのストックソリューションから）と、５ピコモルのγ³³Ｐ−ＡＴＰ、０．５μｌの１０ｘキナーゼバッファー(７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭＤＴＴ)、ｐＨ７．６、および１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによって標識した。水を加えて容量を５μｌとした。この混合物を３７℃で４５分インキュベートし、その後１５μｌの水を流加した。この反応の後、２００ｎｇのＰＣＲ産物をシークエンシング反応において用いた。具体的には、１１．５μｌのＰＣＲ産物を、２．０μｌの標準的反応バッファー、および２．０μｌの標識化プライマー（前述）と混合した。ＤＮＡポリメラーゼのサンプル（２．０μｌ）も添加した。この混合物の４μｌの部分をそれぞれ４本のチューブに添加した。チューブには４ｕｌの、４種の終結混合物のうち１種も添加した。各終結混合物は、それぞれ１５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、および７−デアザｄＧＴＰを含むものであった。各混合物は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰのうち１種を、１．５μＭ含むものであった。前記チューブを次にサーモサイクラー(thermocycler)に配置し、そして増幅にかけた。具体的には、増幅は９５℃で５分間のサイクリングによって開始させ、その後４９サイクル反復させた。１サイクルは９５℃で３０秒、５３℃で１分、そして９４℃で２分であった。反応は４μｌの停止反応物（９５％ホルムアミド、２ＯｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、および０．０５％キシレンシアノールFF）を添加することによって停止させた。全部で３ｕｌの各増幅ＰＣＲ産物を次に９５℃で２分間変性させ、そして変性ゲルにローディングした。結果は２つの対立遺伝子が存在することを示していた。１つの対立遺伝子は位置１５０８において突然変異を含んでおり、ｙｙｌｌｇｌｌ．ｓ１配列と比較すると“Ｇ”が“Ｃ”に（突然）変異しており、そしてこれはボルディン（Boldin ）およびムズィオ（Muzio）の論文において示される配列によって確認される。これによって終止コドンが消失することになり(即ちトリプレットＴＧＡがＴＣＡとなる)、その結果、位置１７７１−１７７３の新しい終止コドンまでにわたるオープンリーディングフレームの大きさが非常に大きくなった。同じ実験をＢＢ４９−ＰＢＬおよびＢＢ４９−ＥＢＶからの２つの他のサンプルについて行ったところ前記突然変異は観察されなかった。ＢＢ４９−ＳＣＣＨＮからのゲノムＤＮＡを分析したところ、正常な“Ｇ”および突然変異した“Ｃ ”の両方の対立遺伝子が示された。これらの結果は、細胞のアポトーシスが長い方のオープンリーディングフレームから発現するタンパク質の存在または非存在に影響される可能性があることを示唆するものである。これは例えば、正常および突然変異したタンパク質のレベルのバランスにおける変化、および／または正常および突然変異したタンパク質の間の何らかのタイプの競合の結果である可能性がある。ここで、突然変異したタンパク質は正常なアポトーシスの割合を減少させ、それによって、腫瘍細胞の特徴である細胞の生存および増殖を増加させる。前述の諸実験は、配列番号４のノナペプチドが、ＨＬＡ−Ｂ３５に結合しＨＬＡ−Ｂ３５をその表面上に提示する細胞によって提示される腫瘍拒絶抗原であるということの同定について記載するものである。したがって、このペプチドは、とりわけＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞に対する“マーカー”として役立ち、標的細胞に対するその結合および結合の欠如を研究することで、それらのＨＬＡタイプを判定することができる。前記ペプチドは例えば、周知のアッセイ技術を用いて、標識された形態または標識されていない形態において利用可能である。以上で示したように、配列番号４とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体は、それら複合体に対するＣＴＬの増殖を引き起こす。これら複合体に対する単離ＣＴＬは、これらＣＴＬの治療および診断に関する利用方法とともに本発明の更なる特徴である。例えば、サンプルにおけるＨＬＡ−Ｂ３５細胞の存在を、前記サンプルとそのようなＣＴＬとを接触させ、そして前記細胞の存在の指標(indicia)として、例えばＴＮＦ放出、標的細胞溶解などのいずれかを観察することによって、判定することができる。同様に、配列番号４とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体によって特徴づけられる障害を患う対象を、そのようなＣＴＬを投与することによって治療することができる。更に、サンプルおよび／または対象から、配列番号４のペプチドを投与することによってＨＬＡ−Ｂ３５細胞を除去することができる。というのは、配列番号４はＨＬＡ−Ｂ３５に結合して複合体を形成し、そしてそれが結合した細胞のＣＴＬによる溶解を引き起こすことが示されているからである。本発明は配列番号１の単離核酸分子およびヌクレオチド１４４７−１６００からなるそのフラグメントも包含する。これら分子はそれぞれ、上述したように、腫瘍拒絶抗原即ち配列番号４の腫瘍拒絶抗原をコードする。配列番号４をコードする核酸分子、およびストリンジェントな条件下で配列番号１またはその１４４７−１６００ヌクレオチドのフラグメントにハイブリダイズする単離核酸分子も本発明に包含される。これらの条件は様々なものとすることができるが、少なくとも６５℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのストリンジェンシーが必要である。プロモーターに操作可能にリンクした(operably Iinked to a promoter)、上述の配列のいずれかを含む発現ベクター、および細胞、即ちリストされた核酸分子および／または発現ベクターによってトランスフォームまたはトランスフェクトされた原核細胞または真核細胞も、本発明の一部をなす。前記終止コドンにおける突然変異は、本発明の部分をなすいくつかの効果を有する。オープンリーディングフレームにおける変化の結果、正常に生じるタンパク質よりも大きいタンパク質がコードされることになるということは当業者にとって明らかである。付加された配列はそれを免疫原性にするのに十分な大きさであり、それにより当業者は前記突然変異したアポトーシスのタンパク質（即ちヌクレオチド１５０７−１７７３によってコードされるアミノ酸）に対して特異的な抗体を作製することができる。これによって当業者が、細胞または細胞含有サンプルのアポトーシスの状態を判定するための、イムノアッセイなどのアッセイを行うことが可能となる。そのようなアッセイは例えば、その割合の減少であれ増加であれ、アポトーシスの状態における変化が望まれる治療に関して有用である。更に、突然変異した対立遺伝子の存在または非存在を検出するための、標準的なハイブリダイゼーションアッセイにおいて、配列番号１のヌクレオチド１４２３−１４４３などのプライマーが利用可能である。更に、突然変異が１塩基であるという事実によって、例えば相同的組換えまたはその他のヌクレオチドを基礎とする治療などの治療方法が利用可能であると考えることができる。本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろうからここで示す必要はない。ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載の用語として使用されたものであり、従って、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載された特徴構成またはその一部のいかなる均等物も除外する意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能であると理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月２４日（１９９８．８．２４）【補正内容】次にサブクローニングを行い、そして個々のプラスミドＤＮＡを上述のトランスフェクションおよびスクリーニングプロセスに使用した。配列番号１に示す、１つのｃＤＮＡクローンをこれらの手順を用いて単離した。例５単離したｃＤＮＡを次に、ＰＣＲによってクローニングされた自己ＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡを用いた共トランスフェクション実験においてテストした。ＨＬＡ−Ｂ３５をクローニングするために、プライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣ−３’ （配列番号３）および５’−ＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＣ−３’ （配列番号４）をそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーとして使用した。ＰＣＲはＰＦＵポリメラーゼ酵素を用いて３５サイクル行った(９４℃で１分、６２℃で５秒、７５℃で５分が１サイクル)。ＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ３にクローニングし、配列番号１を含むプラスミドとともに、ＣＯＳ細胞を共トランスフェクトするのに使用した。図５に示すように、トランスフェクタントはＣＴＬによって認識された。例６前述のｃＤＮＡクローン（配列番号１）は、２６４９塩基対長である。最も近いホモロジーは、the GenBankライブラリーにおいて“ｙｙｌｌｇｌｌ．ｓ１．ヒトｃＤＮＡクローン２７０９８０”として同定されているクローンについて見られた。このクローンは、ヘンカート（Henkart），Immunity 4:195-201(3/96) によって教示されている細胞死タンパク質３(“CED3”)をコードする配列と類似している。配列番号１が関連遺伝子のファミリーに属しているかどうかを判定するために次の実験を行った。これをテストするために患者ＢＢ４９の血中のリンパ球および腫瘍細胞から抽出したＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行った。例７抗原ペプチドをコードする、配列番号１の領域を決定した。これを行うために、この配列のデリーション(deletions)をクローンの３’末端から市販のエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて行った。切形の(truncated)ｃＤＮＡを含むプラスミドを次に自己ＨＬＡ−Ｂ３５ｃＤＮＡとともにＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクトし、そして共トランスフェクタントを次にＴＮＦ産生アッセイにおいてＣＴＬ認識についてテストした。最も長い陰性クローン（ヌクレオチド１−１４４６）を最も短い陽性クローン（ヌクレオチド１−１６００）と比較して、少なくとも抗原ペプチドのＣ−末端はヌクレオチド１４４７−１６００の範囲内にコードされるということが明らかとなった。例８ｃＤＮＡのヌクレオチド１４４７−１６００がその中に腫瘍拒絶抗原を含むペプチドをコードするとして同定されたことから、さらなる研究が導かれた。まず、このヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を推定した。次に、その推定アミノ酸配列について、ラメンシー（Ramensee）他,Immunogenetics41:178-229(19 95)によって提供されている、ＨＬＡ−Ｂ３５に対するペプチドの結合のための、コンセンサス配列が存在しているかどうかを判定するために研究を行った。そのような結合のための前記コンセンサス配列は、位置２においてＰＲｏを、そしてＣ−末端において疎水性残基（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）を要求する。以下のペプチドが前記推定アミノ酸配列内に含まれることが判明した： Phe Pro Ser Asp Ser Trp Cys Tyr Phe（配列番号２）および Phe Pro Ser Asp Ser Trp Cys Tyr（配列番号６）。両方のペプチドを周知の固相方法を用いて合成した。それらを次に周知の⁵¹Ｃｒ放出試験に用いて、それらがＣＴＬによる標的細胞の溶解を引き起こすことができるかどうか判定した。具体的には、標的細胞をこれらの結果は、細胞のアポトーシスが長い方のオープンリーディングフレームから発現するタンパク質の存在または非存在に影響される可能性があることを示唆するものである。これは例えば、正常および突然変異したタンパク質のレベルのバランスにおける変化、および／または正常および突然変異したタンパク質の間の何らかのタイプの競合の結果である可能性がある。ここで、突然変異したタンパク質は正常なアポトーシスの割合を減少させ、それによって、腫瘍細胞の特徴である細胞の生存および増殖を増加させる。前述の諸実験は、配列番号２のノナペプチドが、ＨＬＡ−Ｂ３５に結合しＨＬＡ−Ｂ３５をその表面上に提示する細胞によって提示される腫瘍拒絶抗原であるということの同定について記載するものである。したがって、このペプチドは、とりわけＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞に対する“マーカー”として役立ち、標的細胞に対するその結合および結合の欠如を研究することで、それらのＨＬＡタイプを判定することができる。前記ペプチドは例えば、周知のアッセイ技術を用いて、標識された形態または標識されていない形態において利用可能である。以上で示したように、配列番号２とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体は、それら複合体に対するＣＴＬの増殖を引き起こす。これら複合体に対する単離ＣＴＬは、これらＣＴＬの治療および診断に関する利用方法とともに本発明の更なる特徴である。例えば、サンプルにおけるＨＬＡ−Ｂ３５細胞の存在を、前記サンプルとそのようなＣＴＬとを接触させ、そして前記細胞の存在の指標(indicia)として、例えばＴＮＦ放出、標的細胞溶解などのいずれかを観察することによって、判定することができる。同様に、配列番号２とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体によって特徴づけられる障害を患う対象を、そのようなＣＴＬを投与することによって治療することができる。更に、サンプルおよび／または対象から、配列番号４のペプチドを投与することによってＨＬＡ−Ｂ３５細胞を除去することができる。というのは、配列番号２はＨＬＡ−Ｂ３５に結合して複合体を形成し、そしてそれが結合した細胞のＣＴＬによる溶解を引き起こすことが示されているからである。本発明は配列番号１の単離核酸分子および請求の範囲１．配列番号２のアミノ酸配列からなる単離ペプチド。２．配列番号２とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体に対して特異的な単離細胞溶解性Ｔ細胞ライン。３．サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法であって、前記サンプルを配列番号２の単離ペプチドと接触させる工程、および、前記サンプル中のＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の指標として前記ペプチドの結合を判定する工程を有する、サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法。４．サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法であって、前記サンプルを請求項２の単離細胞溶解性Ｔ細胞と接触させる工程、および、前記サンプル中のＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の判定として前記細胞溶解性Ｔ細胞の活性を測定する工程を有する、サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法。５．ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、前記対象における前記ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の溶解を引き起こすのに十分な量の請求項１の単離ペプチドを投与する工程を有する、ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法。６．ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法であって、対象に、前記対象における前記ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を溶解するのに十分な量の請求項２の単離細胞溶解性Ｔ細胞を投与する工程を有する、ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法。７．その相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/04 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者ブーン―ファラー，ティエリーベルギー国ビー―1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号４のアミノ酸配列からなる単離ペプチド。２．配列番号４とＨＬＡ−Ｂ３５との複合体に対して特異的な単離細胞溶解性Ｔ細胞ライン。３．サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法であって、前記サンプルを配列番号４の単離ペプチドと接触させる工程、および、前記サンプル中のＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の指標として前記ペプチドの結合を判定する工程を有する、サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法。４．サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法であって、前記サンプルを請求項２の単離細胞溶解性Ｔ細胞と接触させる工程、および、前記サンプル中のＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の判定として前記細胞溶解性Ｔ細胞の活性を測定する工程を有する、サンプルがＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を含むことを判定する方法。５．ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、前記対象における前記ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞の溶解を引き起こすのに十分な量の請求項１の単離ペプチドを投与する工程を有する、ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法。６．ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法であって、対象に、前記対象における前記ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞を溶解するのに十分な量の請求項２の単離細胞溶解性Ｔ細胞を投与する工程を有する、ＨＬＡ−Ｂ３５陽性細胞によって特徴づけられる病的状態を有する対象を治療する方法。７．その相補的配列がストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリダイズする、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子。８．配列番号１からなる、請求項７の単離核酸分子。９．ＨＬＡ−Ｂ３５分子によって提示される抗原へとプロセシングされるポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記単離核酸分子が配列番号１のヌクレオチド１４４７−１６００からなる、ＨＬＡ−Ｂ３５分子によって提示される抗原へとプロセシングされるポリペプチドをコードする単離核酸分子。１０．プロモーターに操作可能にリンクした、請求項７の単離核酸分子を含む発現ベクター。１１．プロモーターに操作可能にリンクした、請求項８の単離核酸分子を含む発現ベクター。１２．プロモーターに操作可能にリンクした、請求項９の単離核酸分子を含む発現ベクター。１３．請求項１０の発現ベクターを含む、トランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞。１４．請求項１１の発現ベクターを含む、トランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞。１５．請求項１２の発現ベクターを含む、トランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞。