CN1248739C - 识别患有细胞异常的个体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在异常细胞的表面呈递的HLA-C克隆10和MAGE-1衍生的肽的复合物的鉴别。还涉及诊断和治疗方法。

Description

识别患有细胞异常的个体的方法

相关申请

本申请是在审申请系列号No.08/195,186(1994年2月14日申请，该申请是美国申请系列号No.08/008,446，1993年1月22日申请的部分继续申请)，它也是No.08/196,630(申请日为1994年2月15日)的部分继续申请。

发明领域

本发明涉及基于某些异常细胞在其表面呈递HLA-Cw^**1601(以前称为之IILA-C克隆10)(Bodmer et al.，TissueAntigens 44：1(1994))以及称为MAGE-1的分子衍生的肽形成的复合物这一认识的各种治疗方法。另外，本发明涉及对患有细胞异常状态的个体进行鉴别的能力，其中，异常细胞呈递所说的复合物。

背景技术

哺乳动物免疫系统识别外源材料并与之反应的过程是一个复杂的过程。该系统的一个重要的方面是T细胞应答。这种应答要求T细胞识别细胞表面分子的复合物并与之发生作用，所说表面分子为人白细胞抗原(“HLA”)，或者主要组织相容性复合物(“MHCs”)和肽。所说的肽来源于由也呈递HLA/MIIC分子的细胞进行加工的较大的分子。参见Male et al.，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987)，尤其是第6-10章。T细胞和HLA/肽复合物的相互作用受到严格限制，要求一种对IILA分子和一种肽特定的结合具有特异性的T细胞。如果不存在这种特定的T细胞，即使存在其配体复合物也不发生T细胞应答。同样，如果没有该特定的复合物，但存在该T细胞也不能发生应答。其原理涉及在自身免疫病理学中的免疫系统对外源材料发生应答，以及对细胞异常的应答。最近更多的研究工作集中于将蛋白质加工为HLA结合肽的机理。关于这一点可参见，Barinaga Science 257：880(1992)；Fremont et al.，Science 257：919(1992)；Matsumura et al.，Science 257：927(1992)；Latron et al.，Science 257：964(1992)。

在癌中也已经注意到了T细胞识别细胞异常的机理。例如，在PCT申请PCT/US92/04354(1992年5月22日申请，1992年11月26日公开，公开号为WO92/20356，该文献作为本文的参考文献)公开了一个基因族，该基因族加工为肽，而这些肽又在细胞表面表达，并导致特定的CTL裂解肿瘤细胞。这些基因被称为“MAGE”族，并且据说它们编码“肿瘤排斥抗原前体”或者“TRAP”分子，由其衍生的肽称作为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。参见Traversari et al.，Immunogenetics 35：145(1992)；Van der Bruggen et al.，Science 254：1643(1991)中公开的有关该基因族的其它资料。

美国专利申请系列号No.938,334(引入本文作参考)中公开了与HLA-A1分子相结合的九肽类。该文献指出假如已知特定的肽对特定的HLA分子的特异性，应该可以预测与一种HLA分子，而不是别的分子相结合的一种特定的肽。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表现型。因此，尽管将一种特定的肽鉴别为是一种特定的HLA分子的配体的方法具有诊断和治疗用途，这些仅仅与具有该特定的HLA表现型的个体有关。在该领域内还需要作进一步的研究，因为，细胞异常不仅限制到特定的HLA表现型，并且定向治疗需要有争论的异常细胞的表现型的一些知识。

在Boon-Falleur等人的专利申请中(1992年12月22日申请)名称为“用于鉴别患有细胞异常的个体的方法，其中的一些异常细胞呈递HLA-A2/酷氨酸酶衍生的肽的复合物和治疗所说个体的方法”，其中所说的复合物被认为与某些细胞异常有关，但是该申请没有指出任何其它的HLA分子与细胞异常有关。

如上文中公开，由HLA-A分子可呈递MAGE-1，但也没有暗示该蛋白质可以由其它IILA分子呈递。因此，令人惊奇的是已经证明由HLA-A1呈递的MAGE分子正是由HLA-Cw^**1601呈递。尽管以前研究的价值在于了解了该现象，但绝不能使本领域内技术人员明白下面公开的内容。

附图简述

图1描述了有关用编码MAGE-1和HLA-Cw^**1601的序列转染COS-7的试验。

图2A提供了利用由埃巴二氏病毒感染的MZ2细胞进行的⁵¹Cr释放试验的结果，所说的病毒已事先用SEQ ID NO：4肽培养了30分钟，效应细胞来源于CTL 81/12。

图2B是图2A的平行试验，其差异仅在于效应细胞是CTL 82/35。

优选实施方案的详细描述

实施例1

在下面的试验中，使用了各种黑素瘤细胞系，这些细胞系来源于称作为NG2和LB73的黑素瘤患者。细胞系MZ2-MEL.43，MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL3.1是细胞系MZ2-MEL的亚克隆系，并且描述于Van den Eynde et al.，Int J.Canc.44：634(1989)，以及PCT专利申请WO92/20356(1992年11月26日)，两篇文献全部引入本文作参考。细胞系LB73-MEL以类似于本文中描述的其它细胞系的方法从患者LB73产生。

从患者MZ2取出含有单核血细胞的样品。对黑素瘤细胞系MZ2-MEL.43的样品进行辐射，然后与含有单核血细胞样品接触。观察所说的混合物溶解黑素瘤细胞系的情况，这种溶解作用的发生表明在该样品中存在对黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子的复合物具有特异性的胞溶性T细胞(“CTLs”)。

所使用的溶解检测是铬释放检测法，参见Herin et al.，Int.J.Cancer 39：390-396(1987)，该文献引入本文作参考。但是，在本文中也描述了该检测方法。在体外培养黑素瘤细胞靶，然后以10⁷细胞数/ml悬浮于补充了10mM HEPES和30％FCS的DMEM中，并且在37℃用200μCi/ml的Na(⁵¹Cr)O₄培养45分钟。用补充了10mM赫佩斯缓冲液的DMEM将被标记的细胞洗3次，然后重悬于补充了10mM赫佩斯缓冲液和10％FCS的DMEM中，之后将含有10³细胞的100μl的样品分散到96孔微滴板上。将PBLs样品加到100μl的相同培养基中，检测试验设置两个重复组。以100g将平板离心4分钟，在37℃，5.5％的二氧化碳气氛下保温4小时。

将平板再次离心，收集100μl上清液样品并计数，按下列公式释放的⁵¹Cr的百分数：

其中ER是实验中观察到的⁵¹Cr释放量，SR是通过将10³标记细胞在200μl培养基中单独培养检测到的自发的释放量，MR是通过将100ul0.3％Triton X-100加到靶细胞中获得的最大释放量。

将显示出CTL高活性的单核血样通过有限稀释扩增并进行克隆，利用同样的方法进行再次筛选。

这些试验导致从包括CTL克隆“81/12”的MZ2患者分离了几个CTL克隆。

利用细胞系MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL3.1按前面所述重复试验。结果表明，克隆81/12识别MZ2-MEL.43和MZ2-MEL3.0，但并不识别MZ2-MEL3.1。由81/12识别的抗原下文被称作为“抗原Bb”。

实施例2

根据如上文中所概括的前面的研究，确定MZ2患者HLA-1型分布图是有意义的。所说测量方法按标准方法进行，在本文中不再列出。为了得到编码患者的HLA-1型分子的基因的cDNA克隆，利用已知的技术(本文不再重复)从细胞系MZ2-MEL.43提取总mRNA开始制备了一个cDNA文库。将该文库插入到质粒pcD-SRα中，然后利用含有所有的HLA-1型基因共有的序列的寡聚核苷酸探针进行筛选，所说探针序列如下：

5’-ACTCCATGAGGTATTTC-3’

(SEQ ID NO：1)

如此鉴别到的一个克隆是IC4A7克隆，经过测序发现该克隆的功能等同于(如果不相同于)HLA-Cw^**1601(一种已知的人白细胞抗原分子)。在例如Cianetti et al.，Immunogenetics 29：80-91(1989)中公开了编码HLA-Cw^**1601的DNA的序列，其中命名为HLA-C克隆10，该序列可以从GENBANK登记号HUMMHCACA获得。由Zemmour et al.，Immunogenetics 37：239-250(1993)报道了一个重新修改的序列，该文献引入本文作为参考，如Cianetti et al.，见上文。Zemmour序列也可从EMBL序列库获得。

实施例3

确定上文中鉴别的HLA分子是否能呈递mage衍生的肿瘤排斥抗原，以及确定得到的抗原和HLA分子复合物是否是由MZ2患者的CTL克隆识别是有意义的。为此，用编码HLA-Cw^**1601的cDNA以及用MAGE-1，MAGE-2或MAGE-3 cDNA之一转染受体细胞。将MAGE-1 cDNA插入到质粒pcDNA I/Amp中，而将MAGE-2和MAGE-3 cDNA插入到质粒pcD-SRα。

以15,000细胞数/孔的浓度将受体COS-7细胞样品接种于组织培养平底微孔中，所说平板孔中含有添加了10％胎牛血清的Dulbeccos改良的伊格尔培养基(“DMEM”)。将细胞在37℃培养过夜，除去培养基，然后用30μl/孔的DMEM培养基替代，所说DMEM培养基含有10％Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖，100μM氯喹，以及100ng的本发明质粒(即，100ng的IC4A7克隆，和100ng的MAGE-cDNA质粒)。在37℃培养4小时之后，除去培养基，用含有10％DMSO的50μl PBS替代。2分钟后除去该培养基并用补充了10％FCS的200μl DMEM替代。

在将培养基进行所说的变换之后，在37℃将COS细胞培养48小时。然后滗去培养基，加入存在于100μl的含有10％库存人血清的Iscove培养基中的2000个CTL克隆81/12细胞。24小时之后除去上清，根据Traversari et al.，Immunogenetics 35：145-152(1992)(引入本文作参考)的描述在WEHI细胞上检测TNF的含量。

图1中给出的结果证明由HLA-Cw^**1601呈递来源于MAGE-1的肿瘤排斥抗原，并且由CTL克隆81/12识别，而MAGE-2和MAGE-3的表达并不导致合适的抗原呈递。

实施例4

在上面讨论的试验完成之后，进行其它的研究，以确定由HLA-Cw^**1601呈递的肽。

按照供应商的说明用限制性内切酶NotI和SphI消化位于表达载体pcDNA I/Amp中的MAGE-1 cDNA，然后用核酸外切酶III消化。经过该处理后产生了从3’末端开始的一系列连续缺失的MAGE-1cDNA。

将该缺失产物连接到pcDNA I/Amp，然后利用已知技术电穿孔到大肠杆菌DH5αF’IQ菌株中。用氨苄青霉素(50μg/ml)筛选转化子，并且获得600个克隆。

从每个克隆中除去质粒DNA，然后与编码HLA-Cw^**1601的载体一起转染到COS-7细胞中，所使用的方案在上文中详细描述。

然后按实施例3描述的TNF释放试验检测转染子，这种方法可以将阳性和阴性克隆分离开。比较结果显示一个阳性克隆含有MAGE-1基因的1-730位核苷酸，而一个阴性克隆含有1-706位核苷酸。将阳性和阴性克隆的序列进行比较，鉴别出一个16个氨基酸的区域，推断其含有抗原肽。该序列是：

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys

Leu Leu Thr Gln Asp Leu

(SEQ ID NO：2)

基于该序列，完成第一套试验，其中包括制备合成肽，并检测这些肽赋予用HLA-Cw^**1601转染的COS-7细胞刺激溶解的能力。鉴别出一个阳性12聚体，即：

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu

(SEQ ID NO：3)

将该12聚体截短后鉴别出一个可作为最好的溶解刺激剂的九肽

Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu

(SEQ ID NO：4)

在肽浓度为10nM时观察到半数最大裂解值。

在本文未提供但在系列号08/196,630(1994年2月15日申请，引入本文作参考)列出的试验中，还发现肽

Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu

(SEQ ID NO：5)

是由HLA-Cw^**1601呈递的并且被各种胞溶性T细胞克隆，例如CTL82/82所溶解。

实施例5

鉴别出由HLA-Cw^**1601呈递的两个单独肽暗示实施确定患者中表达的HLA-Cw^**1601的检测试验是合乎需要的。由于抗HLA-Cw^**1601的抗体不能得到因而血清试验并不是可行的手段，但是聚合酶链反应(“PCR”)是一种可选择的方法。下文中公开了以一组同类的引物系统为基础研制一种用于检测HLA-Cw^**1601表达的可行的及有效的PCR检测法。

使用通常由Browning et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：2842(1993)描述的模型。该参考文献中讨论了寡核甘酸引物的使用，引物的3’末端对HLA分子的编码序列具专一性。利用该方法合成引物：

5′-CAAGCGCCAGGCACAGA-3′

(SEQ ID NO：6)

和

5′-GCCTCATGGTCAGAGACGA-3′

(SEQ ID NO：7)

为了检测该方法，使用来自患者的各种细胞样品。利用已知的由Davis等人，Basic Methods in Moleular Biology(Elsevier，New York，1986)，pp.130.描述的异硫氰酸胍方法提取总RNA。为了合成cDNA，用水和4μl的5×逆转录酶缓冲液稀释2μg的RNA。加入1μl各为10mM的dNTP，2μl的20μM寡聚(dT)溶液，20U RNasin，2μl的0.1M二硫苏糖醇，以及200U的Mo MLV逆转录酶，总反应体积为20μl，在42℃将该混合物保温60分钟。为了扩增该cDNA，向1％的cDNA反应液中加入5μl的10×热稳定DNA聚合酶缓冲液，1μl各为10mM的dNTP，0.5μl各为80μM的引物溶液(SEQ ID NO：6和7)，1U的Dyna Zyme，加水至终体积为50μl。PCR反应进行30个循环(95℃1分钟，62℃1分钟，72℃2分钟)。将产物稀释至1/500。然后利用添加了5μl的10×热稳定DNA聚合酶缓冲液，1μl各为10mM的dNTP，0.5μl各为80μM的引物溶液：

5′-GAGTGAGCCTGCGGAAC-3′

(SEQ ID NO：8)

和

5′-CCTCCAGGTAGGCTCTCT-3′

(SEQ ID NO：9)，

和1U的Dyna Zyme的1μl稀释的PCR产物进行第二次PCR反应。SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9代表定位于第一套引物即SEQ ID NO：6和7内部的核苷酸序列。加入水到50μl，并使PCR进行20个循环(95℃1分钟；65℃1分钟；72℃2分钟)。然后在含1.5％琼脂糖凝胶的TAE缓冲液中根据大小将PCR产物分离开。

在两套单独的试验中利用该方法。在第一套试验中，检测上文中描述的方法制备的并且由抗与HLA分子复合的SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：5的胞溶性T细胞克隆溶解的转染子。发现所有的阳性转染子在其表面上呈递HLA-Cw^**1601分子，未产生PCR产物的任何样品被认为阴性。

在利用阴性样本进行的其它试验中，第二次使用上文中所用的PCR方案，但是引物是以在所有的HLA-C序列中共有的序列为基础的，参见Zemmouret al.，J.Exp.Med.176：937(1992)，引入本文作参考。阴性样品证明是表达不同的即非HLA-Cw^**1601 HLA-C亚型的细胞。

实施例6

在第二套试验中对PBL或肿瘤细胞借助HLA-Cw^**1601呈递肽的能力进行检测。为此，在Hank’s溶液中洗涤取自患者的细胞，并且以5×10⁵细胞/ml的浓度进行重新悬浮。然后通过在室温下用1％多聚甲醛处理10分钟进行固定，固定之后，在Hank’s溶液中洗涤2次，并重悬于加有10％人血清的Iscove’s培养基中。

然后以3×10⁴PBLs或1×10⁴肿瘤细胞的浓度将细胞分散于96V-形底的孔中，并用不同浓度的肽脉冲。在37℃保温2小时之后，洗涤2次，然后加入CTLs(1500，100μl Iscove培养基，10％人血清，20U/ml重组人IL-2)，检测从WEHI-164细胞释放的TNF。参见例如Traversari et al.，Immunogenetics 35：145(1992)，引入本文作为该检测方法的特定参考。该检测方法中的效应细胞来自于CTL82/35。

结果概括于下表中。仅在来源于由PCR方法(见上文)检测是HLA-Cw^**1601阳性的患者的靶细胞存在的情况下产生TNF，所说细胞已用肽进行脉冲处理。

概括于表1中的试验使用已用戊二醛固定的细胞并且该细胞用肽脉冲处理，然后检测用胞溶性T细胞系CTL82/35对其进行识别的情况。如表所示，仅在存在肽脉冲的靶细胞时产生TNF，所说细胞已在上文中讨论的PCR方法中检测为HLA-Cw^**1601阳性。

                       表1

患者                    HLA-Cw^**1601

                        PCR                  对CTL82/35的肽呈递

MZ2                     +                    +

LB17                    +                    +

LB678                   +                    +

LB708                   +                    +

MI4024/1                +                    +

LB73                    -                    -

LY-2                    -                    -

SK19                    -                    -

SK37                    -                    -

实施例7

如上文所述，约8％的样品(99个中有7个)是该HLA型阳性，并且阳性样本中有5个检测了其CTL溶解性，如表1所述所有的样品都可引起溶解。相反，取自HLA-Cw^**1601非阳性的4个患者的样品没有引起CTLs的溶解。

实施例8

在另一个试验中，在⁵¹Cr释放检测中使用被埃巴二氏病毒感染的MZ2类原始淋巴样细胞，该被感染的细胞称作为“MZ2-EBV”，用⁵¹Cr标记细胞，然后在浓度为1-5000nM的MAGE-1肽存在下培养30分钟。以效应细胞/靶细胞3∶1的比例加入CTLs(CTL81/12或CTL82/35)，4小时之后检测释放铬量。

结果显示于图2A和2B中，图中显示了由CTL81/12(图2A)和CTL82/35(图2B)引起的溶解情况。箭头表示在没有肽保温的情况下MZ2-MEL43(B⁺)和MZ2类原始淋巴样细胞(B^-)的溶解水平。

上文中列出的试验暗示对于结合到HLA-Cw^**1601上需要具有特定结合基的肽。下列通式的肽

Xaa Ala (Xaa)₆ Leu

(SEQ ID NO：10)是本发明的特征之一。在SEQ ID NO：10中，Xaa是指优选于下列基团的任何氨基酸：

在第一位是Ala或Ser

在第三位是Tyr或Arg

在第四位是Gly或Ala

在第五位是Glu或Val

在第六位是Pro或Phe

在第七位是Arg或Leu

在第八位是Lys或Ala

从该通式分离出的肽可用于例如诊断癌症，将在后面进行解释。如本文引用的参考资料，已知患者产生抗其自身肿瘤的胞溶性T细胞。对于HLA-Cw^**1601阳性患者，这些胞溶性T细胞识别任何呈递HLA-Cw^**1601和通式SEQ ID NO：10，最优选的是SEQ ID NO：4或SEQID NO：5肽的复合物的细胞并与之反应。可以通过CTLs对TNF的释放情况，CTLs增殖，和/或靶细胞含有的某些试剂的释放例如，放射性铬(⁵¹Cr)，来监测识别情况。因此，本发明的一个方面是，将含有PBLS的个体的血样本与呈递HLA-Cw^**1601的细胞进行接触，例如通过用SEQ ID NO：10所示的肽脉冲处理而接触这些细胞。这些肽与HLA-Cw^**1601分子复合，并且与含有PBL的样品中的CTLs反应。因此，本发明的一个方面是用于确定肿瘤特异性CTLs的诊断检测法，已经确定只有肿瘤细胞呈递来自TRAs的MAGE。一个例外是睾丸细胞，但是简单地排除患者血中的CTLs与睾丸细胞发生反应的可能性是很简单的。也可以用MAGE基因例如MAGE-1转染HLA-Cw^**1601阳性细胞使之产生所需的复合物。

在本发明的另一个方面，可以单独使用本发明公开的肽或者将它与载体蛋白质复合在一起使用，然后用作为免疫原。所说免疫原可以单独使用或者优选的是与药物学上可接受的载体一起使用。在诊断测中也可以使用抗体，以确定细胞上是否呈递特定的肽。同样，这种呈递是癌症的标志。

正如所说的，本发明的分离的核酸分子也可用作为确定HLA-Cw^**1601表达的探针。在例如用于移植的组织分型和其它区域中确定HLA类型的重要性是毫无疑问的，因此具有适用于本文的物质是有用的。在PCR研究中使用的引物可以单独或者结合用于扩增试验中例如聚合酶链反应。如果进行标记例如放射性或非放射性标记，则还可以在其它诊断检测中将这些引物用作为确定是否表达HLA-Cw^**1601的探针。因此，可使用两个或多个SEQ IDNO：6，7，8和9的组合，以“one-pot”或药盒形式用作为诊断试剂。如果提供了单独的SEQ ID NO：6和7和SEQ ID NO：8和9的成分则优施方案中该药盒还可以包括聚合酶，例如Taq聚合酶。

前面的试验证明HLA-Cw^**1601呈递作为肿瘤排斥抗原的MAGE-1衍生的肽，导致呈递该肽的细胞溶解。下文中将讨论该发现的几种情况。例如CTL克隆81/12是典型的对所说复合物具有特异性的CTLs。预期当患者在异常细胞上呈递HLA-Cw^**1601表现型时将所说的CTLs施用给患者具有治疗效果。体外研制必要的CTLs是本领域内技术人员熟知的。具体地说，将细胞样品例如血细胞与呈递该复合物并且能够引起特定的CTL增殖的细胞接触。该靶细胞是一个转染子，例如上面描述的COS细胞类型，这些转染子在其表面呈递所需要的复合物，并且当与所需的CTL结合时可以刺激其增殖。已有人指出，借助于GENBANK和EMBL，本领域内技术人员可以知道HLA-Cw^**1601的序列，并且由PCT申请和Van den Bruggen et al.，(两篇文献全部引入本文作参考，见上文)提供了MAGE-1的序列和用于其分离的一个详细的方案。例如其中使用的COS细胞是普通存在的，如其它合适的宿主一样。

详细地说，该治疗方法，称作过继转移(Greenberg，J.Immunol.136(5)：1917(1986)；Riddel et al.，Science 257：238(7-10-92)；Lynch etal.，Eur.J.Immunol.21：1403-1410(1991)；Kast et al.，Cell 59：603-614(11-17-89))，是将呈递所需复合物的细胞与CTLs结合之后，导致特异于其的CTLs增殖。然后将增殖的CTLs施用给具有细胞异常的患者，所说患者的特征为其异常细胞呈递特定的复合物。然后CTLs溶解异常细胞，从而达到预期的治疗目的。

前面的治疗方法假设患者的异常细胞呈递HLA-Cw^**1601/MAGE-1衍生的肽的复合物，这很容易确定，例如利用上文中讨论的转染子可鉴别CTLs，并且一旦分离，可与患者的异常细胞样品一起用于体外确定溶解情况。如果观察到溶解发生，则在所说的治疗方法中使用特定的CTLs可减轻异常细胞相关症状。利用标准的检测方法和采用较少的步骤可以检测异常细胞的HLA表现型，并利用例如PCR，通过扩增确定MAGE-1的表达。

过继转移不是本发明适用的唯一的治疗形式，利用许多途径也可以体内激发CTLs。一种途径已在上文中进行了说明，即使用表达复合物的非增殖细胞。在该途径中使用的细胞是那些通常表达该复合物的细胞例如被辐射的黑素瘤细胞或者用呈递该复合物所必须的一个或两个基因进行转染的细胞。Chen etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：110-114(January，1991)例举了该方法，显示了在一治疗方法中表达HPVE7肽的转染细胞的应用。可以使用各种细胞类型，同样，可使用携带一个或两个所需要基因的载体，特别优选的是病毒或细菌载体。在这些系统中，由例如痘苗病毒或细菌BCG携带所需基因，并且该材料“感染”宿主细胞，得到的细胞呈递所需的复合物并且被自体CTLs识别，然后增殖。通过将MAGE-1本身与一种促进其掺入到呈递HLA-Cw^**1601细胞中的佐剂相结合可达到同样的效果。然后加工该酶使之产生HLA分子的肽配体。

前面的讨论中涉及“异常细胞”和“细胞异常”，这些术语具有最宽的含义，并且是指任何情形，即其中所说的细胞显示至少一种特性，该特性指明其不同于特定类型的正常细胞。异常特性的情况包括形态学和生化变化，例如细胞异常包括肿瘤，例如黑素瘤，自身免疫紊乱等等。

本发明的其它方面对本领域内的技术人员而言是显而易见的并且不需要在此重复。

本文中已经使用的术语和表示方式可用作为描述的术语，并不以任何方式进行限制，并且也不打算使用这些术语和表示方式来排除所显示和描述的特征的等价物或其部分，还应认识到进行各种修饰也在本发明的范围内。

                             序列表

(1)一般信息：

    (i)申请人：van der Bruggen，Pierre

               Szikora，Jean-Pierre

               Coulie，Pierre

               Wildman，Claude

               Boel，Pascale

               Boon-Falleur，Thierry

    (ii)发明名称：识别其异常细胞呈递HLA-Cw^**1601/MAGE-1衍生肽复合物的细胞异常患者的方法以及治疗所说患者的方法

    (iii)序列数：10

    (iv)联系地址：

        (A)联系人：Felfe & Lynch

        (B)街道：805 Third Avenue

        (C)城市：纽约市

        (D)州：纽约州

        (E)国家：美国

        (F)邮编：10022

    (v)计算机可读形式：

        (A)媒体类型：软盘5.25寸，360kb存储量

        (B)计算机：IBM PS/2

        (C)操作系统：PC-DOS

        (D)软件：Wordperfect

    (vi)本申请资料

        (A)申请号：08/292,492

        (B)申请日：1994年8月18日

        (C)分类：435

    (vii)在先申请资料：

        (A)申请号：08/195,186

        (B)申请日：1994年2月14日

    (vii)在先申请资料：

        (A)申请号：08/008,446

        (B)申请日：1993年1月22日

    (viii)代理人/代理信息：

        (A)姓名：Hanson，Norman D.

    (B)登记号：30,946

    (C)案号/文档号：LUD 5361.1

(ix)电信资料：

    (A)电话：(212)688-9200

    (B)传真：(212)838-3884

(2)SEQ ID NO：1的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：17个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1

ACTCCATGAG GTATTTC                                    17

(2)SEQ ID NO：2的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：16个氨基酸残基

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp

Leu

                5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：3的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：12个氨基酸残基

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3

Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu

                 5                   10

(2)SEQ ID NO：4的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：9个氨基酸残基

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4

Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu

                 5

(2)SEQ ID NO：5的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：9个氨基酸残基

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5

Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu

                 5

(2)SEQ ID NO：6的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：17个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6

CAAGCGCCAG GCACAGA                                        17

(2)SEQ ID NO：7的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：19个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7

GCCTCATGGT CAGAGACGA                                      19

(2)SEQ ID NO：8的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：17个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8

GAGTGAGCCT GCGGAAC                               17

(2)SEQ ID NO：9的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：18个碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：9

CCTCCAGGTA GGCTCTCT                              18

(2)SEQ ID NO：10的资料

    (i)序列特征

        (A)长度：9个氨基酸残基

        (B)类型：氨基酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑：线性

    (xi)序列描述：SEQ ID NO：10

 Xaa Ala (Xaa)₆ Leu

Claims (19)

1、用于鉴别细胞异常的诊断组合物，所述组合物包含胞溶性T细胞，所述胞溶性T细胞溶解表面呈递HLA-C克隆10和SEQ ID NO：4的肽的复合物的靶细胞。

2、用于治疗细胞异常的治疗组合物，所述组合物包含有效量的引发对在表面呈递HLA-C克隆10和SEQ ID NO：4的肽的复合物的细胞的胞溶性T细胞应答的试剂。

3、根据权利要求2所述的组合物，其中所述的细胞异常是癌症。

4、根据权利要求3所述的组合物，其中所述癌症是黑素瘤。

5、根据权利要求2所述的组合物，其中所述的试剂包含一种编码SEQ IDNO：4的肽的载体。

6、根据权利要求5所述的组合物，其中所述的试剂还含有编码HLA-C克隆10的载体。

7、根据权利要求5所述的组合物，其中所述的载体还编码HLA-C克隆10。

8、根据权利要求2所述的组合物，其中所述的试剂是一种非增殖细胞样品，该细胞在其表面呈递所述的复合物。

9、用于治疗细胞异常的组合物，所述组合物包含足以溶解所说异常细胞的所需量的胞溶性T细胞，所述的细胞异常的特征为在异常细胞的表面呈递HLA-C克隆10和SEQ ID NO：4肽的复合物，所述的胞溶性T细胞对所述的复合物具有特异性。

10、根据权利要求9的组合物，其中所述的细胞异常是癌症。

11、根据权利要求10所述的组合物，其中所述的癌症是黑素瘤。

12、根据权利要求9的组合物，其中所述的胞溶性T细胞是自体的。

13、分离的胞溶性T细胞，它特异于HLA-C克隆10和SEQ ID NO：4肽的复合物。

14、用于鉴别在其表面呈递HLA-C克隆10和SEQ ID NO：4肽的复合物的异常细胞的方法，该方法包括将所述的异常细胞样品与特异于所说复合物的胞溶性T细胞接触，并且确定所说异常细胞的溶解情况从而确定呈递所述的复合物的细胞。

15、选自于下列组的分离肽

SEQ ID NO：2

SEQ ID NO：3和

SEQ ID NO：4。

16、HLA-C克隆10和分离的SEQ ID NO：4肽的分离的复合物。

17、具有下列通式的分离的九肽：

Xaa Ala (Xaa)₆ Leu

(SEQ ID NO：10)

其中Xaa是任何氨基酸。

18、免疫原组合物，含有权利要求17所述的分离的九肽和药物学上可接受的佐剂。

19、根据权利要求18所述的免疫原组合物，其中所述的分离的九肽与载体蛋白复合。

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