CN1261374A - 结合hla分子的分离的九肽和十肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结合HLA分子并且引起溶细胞性T细胞增殖的九肽和十肽。十肽以缬氨酸结束,并且他们开始的3个氨基酸位置有限制,也公开了其它有用的九肽。

Description

结合HLA分子的分离的九肽和十肽及其应用
相关申请
本申请是1998年1月13日递交的系列号09/061,388的部分继续申请，09/061,388是引入本文作为参考的1997年6月23日递交的系列号08/880,963的部分继续申请。本发明人在第一个部分继续申请的申请日前的一年之内公开了本发明的一部分。参见Romeo等人，免疫学杂志，159：2366(1997)，引入本文作为参考。
本发明的领域
本发明涉及细胞免疫学有用的肽。更具体地说，本发明涉及结合细胞表面的HLA分子的肽。当它们与它们的配体HLA分子复合时，至少一些这些肽也诱导溶细胞T细胞的活化。同时本发明的一部分涉及这些肽在鉴定HLA-A2阳性细胞，刺激T细胞，确定特定的T细胞以及溶细胞T细胞本身的存在的领域中的应用。
背景和现有技术
已经在许多不同方向进行了宿主生物体识别或不识别癌细胞的研究。对该领域的了解意味着对免疫学和癌症学的一些理解。
对小鼠肿瘤的早期研究表明这些展示的分子当移植进入同源的动物中时导致对肿瘤细胞的排斥。在受体动物中T细胞“识别”这些分子，并激发溶细胞T细胞应答，导致移植细胞的溶解。利用化学致癌物如甲基胆蒽体外诱导的肿瘤首先获得证据。发现肿瘤表达的引发T细胞应答的抗原对于每个肿瘤是不同的。参见，Prehn，等人，自然癌症研究杂志18：769-778(1957)；Klein等人，癌症研究，20：1561-1572(1960)；Gross，癌症研究，3：326-333(1940)，Basombrio，癌症研究，30：2458-2462(1970)，这些文献教导了利用化学致癌剂诱导肿瘤和细胞表面抗原的差异。这一类抗原已经知道为“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTAs”。在观察到当化学致癌剂诱导时呈递这样的抗原之后，通过紫外辐射体外诱导肿瘤时获得同样的结果。参见Kripke，自然癌症研究杂志，53：333-1336(1974)。
尽管对于如上所述的肿瘤类型观察到T细胞介导的免疫应答，但是据信自发肿瘤一般是非免疫原性的。所以确信这些肿瘤不呈递引起对肿瘤携带个体中的肿瘤的应答的抗原。参见Hewitt，等人，英国癌症杂志，33：241-259(1976)。
如引入本文作为参考的，Boon等人，实验方法杂志，152：1184-1193(1980)所述，tum-呈递抗原细胞系家族是由小鼠肿瘤细胞或细胞系的诱变获得的免疫原性变异体。为了证明，通过突变在同源小鼠中不产生免疫应答并且将形成肿瘤的肿瘤细胞(即，“tum+”细胞)可以获得tum-抗原。当诱变这些tum+细胞时，它们受到同源小鼠的排斥，并且不能形成肿瘤(所以是“tum-”)。参见Boon等人，美国科学院院刊，74：272(1977)，该公开物引入本文作为参考。已经显示许多肿瘤类型展示了这一现象。参见例如，Frost等人，癌症研究，43：125(1983)。
tum-突变体不能形成进行性肿瘤似乎是因为它们启动了免疫排斥过程。有利于这一假说的证据包括肿瘤的tum-突变体，即那些不能正常形成肿瘤的突变体，在利用亚致死量辐射抑制免疫系统的小鼠中能形成肿瘤，见Van Pel等人，美国科学院年报，76：5282-5285(1979)；以及观察到腹膜内注射的肥大细胞瘤P815的tum-细胞在12-15天呈指数倍增，然后在淋巴细胞和巨噬细胞的流入过程中，在仅仅几天内就消失了(Uyttenhove等人，实验方法杂志，1175-1183(1980))。其它证据包括甚至当在攻击细胞之后给予免疫抑制量的辐射时，观察到小鼠获得能抵抗对同样的tum-变异体的随后的攻击的免疫记忆(Boon等人，美国科学院院刊，74：272-275(1977)；VanPel等人，出处同上；Uyttenhove等人，出处同上)。后来的研究发现当对自发肿瘤进行诱变时，产生能够产生应答的免疫原性变异体。确实，这些变异体能够引发抗原始肿瘤的免疫保护应答。参见Van Pel等人，实验方法杂志，157：1992-2001(1983)。所以，已经显示在同源排斥应答的靶的肿瘤中引发所谓的“肿瘤排斥抗原”的呈递是可能的。当外源基因已经转染进入自发肿瘤时，已经获得同样的结果。关于这一点参见Fearon等人，癌症研究，48：2975-1980(1988)。
已经识别了一类抗原，它们存在于肿瘤细胞的表面，并且被溶细胞T细胞识别，导致溶解。这一类抗原下文将称作“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRAs能或不能引发抗体应答。这些抗原被研究的内容，是借助于体外溶细胞T细胞的鉴定研究，即特定的溶细胞T细胞(下文的“CTL”)亚组鉴定抗原的研究。在呈递的肿瘤排斥抗原被识别时亚组增殖，并且呈递肿瘤排斥抗原的细胞被溶解。特征研究已经鉴定了特异地溶解表达肿瘤排斥抗原的细胞的CTL克隆。在Levy等人，癌症研究进展，24：1-59(1977)；Boon等人，实验方法杂志，152：1184-1193(1980)；Brunner等人，免疫学杂志，124：1627-1634(1980)；Maryanski等人，当前免疫学杂志，124：1627-1634(1980)；Maryanski等人，当前免疫学杂志，12：406-412(1982)；Palladino等人，癌症研究，47：5074-5079(1987)可以发现这一研究工作的例子。对于CTL识别的抗原的其它类型，包括次要组织相容性抗原，雄性特异H-Y抗原，和本文讨论的称为“tum-”抗原的抗原类别需要这一类型的分析。
上面所述的肿瘤例子已知是P815。参见引入本文作为参考的DePlaen等人，美国科学院年报，85：2274-2278(1988)；Szikora等人，EMBO J9：1041-1050(1990)，和Sibille等人，实验方法杂志，172：35-45(1990)，。P815肿瘤是利用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱导的，并作为体外肿瘤和细胞系培养的肥大细胞瘤。P815细胞系已经在诱变之后产生许多tum-变异体，包括称为P91A(DePlaen，出处同上)，35B(Szikora，出处同上)，和P198(Sibille，出处同上)的变异体。相反于肿瘤排斥抗原，这是关键的区别，tum-抗原只在肿瘤细胞诱变后呈递。没有诱变时肿瘤排斥抗原存在于给定的肿瘤的细胞上。所以参考该文献，细胞系抗原是“tum+”的如称为“P1”的细胞系，并且可以引发产生tum-的变异体。由于tum-的表型有别于亲本细胞系，与它们的tum+亲本细胞系相比，可以预期在tum-细胞系的DNA中存在差别。并且这一差别可以开发定位tum-细胞中感兴趣的基因。结果是，发现tum-变异体的基因如P91A，35B和P198由于基因的编码区中的点突变而区别于它们正常的等位基因。参见，Szikora和Sibille，出处同上，和Lurquin等人，细胞58：293-303(1989)。已经证明本发明的TRA不是这样。这些论文也证明H-2dI类分子呈递来自tum-抗原的肽以被CTL识别。Ld呈递P91A，Dd呈递P35，Kd呈递P198。
转让给本申请相同的受让人的1992年5月22日递交的PCT申请PCT/US92/04354，涉及人肿瘤排斥抗原前体编码基因的家族，称为MAGE家族。在van der Bruggen等人，科学254：1643(1991)也讨论了几个这些基因。现在已经清楚在肿瘤细胞中表达MAGE家族的各种基因，并且可以作为这样的肿瘤的诊断以及本文讨论的其它目的的标记。也参见Traversari等人，免疫遗传学，35：145(1992)；van derBruggen等人，科学，254：1643(1991)和DePlaen等人，免疫遗传学，40：360(1994)。蛋白质加工和呈递于细胞表面的机制现在已经相当好的记录了。在Barinaga，“得到一些′骨架′：MHC怎样结合肽”，科学257：880(1992)；同样参见Fremont等人，科学257：919(1992)；Matsumura等人，科学，257：927(1992)；Engelhard，免疫学年评，12：181-207(1994)；Madden等人，细胞，75：693-708(1993)；Ramensee等人，免疫学年评，11：213-244(1993)；Germain，细胞76：287-299(1994)可以发现该领域的开发的综述。这些论文通常指出结合MHC/HLA分子的肽需九个氨基酸长(“九肽”)，并且指出了九肽的第二个和第九个残基的重要性。对于H-2Kb，固定残基是八聚体的位置5和8，对于H-2Db，它们是九肽的位置5和9，而对于HLA-A1的固定残基是九聚体的位置3和9。通常，对于HLA分子，位置2和9是固定的。
对基因的MAGE家族的研究已经表明特定的九肽事实上呈递在一些肿瘤细胞的表面，并且九肽的呈递需要呈递分子是HLA-A1。MAGE-1肿瘤排斥抗原(“TRA”或“九肽”)的复合物导致溶细胞T细胞(″CTL″)溶解呈递它的细胞。
在1992年8月31日申请的美国专利号5,405,940和美国专利号5,571,711中提供的研究发现当将各种MAGE基因的同源区和编码相关的九肽的MAGE-1基因的区域比较时，存在大量的同源性。确实，这些观察导致这些专利所公开的发明的一个方面和权利要求，它是九肽的一个家族，所有都具有同样的N末端和C末端氨基酸。这些九肽被描述为可用于各种目的，包括它们用作免疫原，单独或与载体肽偶联。九肽大小足够构成抗原表位，并且其中产生的抗体被描述为可用于鉴定单独存在或作为更大的多肽的一部分的九肽。
相关文献的前面的概括显示了各种肽，通常八个，九个，或十个氨基酸长，与MHC分子复合，并呈递由溶细胞T细胞识别的靶。对黑素瘤已经进行了大量的研究，现在将溶细胞T细胞识别的黑素瘤抗原分成3大类。第一类包括许多上面讨论的抗原(例如MAGE)，在一些黑素瘤以及其它肿瘤类型和正常的睾丸和胎盘中表达，这些抗原是在正常组织中通常是沉默的正常基因的表达产物。
黑素瘤抗原的第二个家族包括起源于正常蛋白质的突变形式的抗原。这一家族的例子是MUM-1(Coulie等人，美国科学院院刊，92：7976-7980(1995))；CDK4(Wolfel，等人，科学269：1281-1284(1955))；Bcatenin(Robbins，等人，实验医学杂志，183：1185-1192(1996))；和HLA-A2(Brandel，等人，实验医学杂志，183：2501-2508(1996))。同样上面讨论的第三类包括黑素瘤和黑素细胞表达的分化抗原。例子是酪氨酸酶，gp100，gp75，和Melan A/Mart-1。关于Melan-A参见引入本文作为参考的美国专利号5,620,886，关于酪氨酸酶参见Wolfel，等人，当前免疫学杂志，24：759(1994)和Brichard，等人，当前免疫学杂志，26：224(1996)；关于gp100参见Kang等人，免疫学杂志，155：1343(1995)；Cox等人，科学264：716(1994)；Kawakami等人，免疫学杂志，154：3961(1995)；关于gp75参见Wang等人，实验医学杂志，183：1131(1996)。
在HLA-A*0201阳性的黑素瘤病人的外周血淋巴细胞，和肿瘤浸润淋巴细胞中鉴定了溶细胞T细胞(下文中称为“CTLs”)。参见Kawakami，等人，美国科学院院刊91：3515(1994)；Coulie等人，实验医学杂志，180：35(1994)。当测试来源于不同病人的十个HLA-A*0201限制的Melan-A特异的CTL时，发现它们中的九个识别肽Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：2)并与之反应，该肽由Melan-A的氨基酸27-35组成。(Kawakami，等人，实验医学杂志，180：347-352(1994))。Rivoltini等人，免疫学杂志，154：2257(1995)，显示了利用SEQ ID NO：2刺激来自HLA-A*0201阳性正常供体和黑素瘤病人的PBL可以诱导Melan-A特异的CTL。这一应答的强度已经导致建议SEQ ID NO：2作为疫苗开发的靶。但是，现在已经发现十肽，即Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：1)实际上是比SEQ ID NO：2更好的靶。这一发现已经导致前面阐述的工作，这些工作是本发明的一部分。
已经鉴定与HLA-A*0201结合的大多数肽是9个或10个氨基酸长，并且特征在于具有两个固定残基。第一个是位置2的Leu或Met，第二个是位置9的Leu或Val。参见Falk等人自然351：290(1991)。Ruppert等人在细胞74：929(1993)中示出在九肽或十肽内的其它位置的氨基酸也可能在肽-HLA-A*0201相互作用中起作用。他们显示例如位置1的带负电残基或脯氨酸与弱的HLA-A*0201结合相关。
这一工作的令人感兴趣之处在于SEQ ID NO：1和2代表的两个肽在位置2不具有主要的固定残基，并且强结合物SEQ ID NO：l在位置1具有带负电的残基。
强结合物不是必须是稳定结合物，意味着在肽和HLA分子之间的相互作用可能是并且是简要的。当需要诱导CTL，鉴定CTL，或进行其它类型的实验时，具有以高亲和力结合MHC类I分子并且形成稳定的复合物的能力的肽是如人所愿的。参见Van der Burg等人，免疫学杂志，156：3308(1996)。
本发明特别涉及是非常好的HLA结合物和CTL刺激物的新九聚体和十聚体的开发，这些分子及其应用是下面的公开物中阐述的本发明的特征。
附图的简要描述
图1显示了确定肿瘤浸润淋巴细胞群是否溶解在其表面呈递HLA-A*0201和各种肽的复合物的细胞的实验的结果。
图2a-2d显示了比较各种肽的稳定性研究。
图3显示了当用TILN测试时，各种肽的抗原活性。
图4平行于图3，但利用的是用各种肽刺激而从PBL产生的CTL。
图5a-5r显示了在用各种肽刺激PBMC后流式细胞计数研究的结果。
图6a-6e描述了在已经利用各种肽刺激的PBMC上溶解活性的测试的结果。
图7a-7e提供了用其它肽刺激后含有SEQ ID NO：1的四聚体阳性的荧光分拣淋巴细胞的Melan-A特异溶解活性的数据。
图8显示了Melan-A单特异性CTL细胞系的肽依赖溶解活性的定量评估。
优选的实施方案的详细描述
实施例1
在这些实验中，从HLA-A*0201阳性的病人的肿瘤入侵淋巴结产生肿瘤浸润淋巴细胞(下文“TILs”)。设计实验以便避免体外抗原特异选择，现在阐述方法。
溶解肿瘤浸润淋巴结(下文中“TILNs”)的活体组织成单细胞悬浮液，然后在24孔培养板上培养。在2毫升用Asn(0.24毫摩尔/升)，Arg(0.55毫摩尔/升)，和Gln(1.5毫摩尔/升)，和10％混合人A+血清(从A型血液供体获得的血清)，以及重组的人IL-2(100单位/毫升)和IL-7(10纳克/毫升)补充的Iscove′s Dulbecco培养基中加入总共3×106个细胞。仅使用这些细胞因子用于培养细胞悬浮液以避免体外抗原特异选择。培养悬浮液2-3星期，然后鉴定细胞的细胞表面表现型。仅使用大于75％CD8+T细胞，以及所需的溶细胞的活性的细胞群体。将TILN群体与自体细胞，以前鉴定为HLA-A*0201阳性的黑素瘤细胞系(Me290)，已知是HLA-A*0201阴性的黑素瘤细胞系(Me260)或不加工抗原的细胞系T2，以及SEQ ID NO：1的肽合并在一起确定上述第二种特性。以1微摩尔/升将肽，以及变化比例的效应器(TILN)细胞和靶细胞一起加入。图1所示的结果显示利用LAU132和LAU203，通过这一方法鉴定两个TILN群体，获得的结果。在图1中，“M10”是SEQ ID NO：1，并且其它简写如上所述。测试是在不存在或存在外源加入肽时的4小时51Cr释放测试。在图1中，空心的标记代表不存在肽，实心的标记代表肽的存在。在这一测试中，在37℃利用51Cr标记靶细胞1小时，然后洗涤两次。在存在或不存在50微升抗原肽(1微克/毫升)时，在50微升效应器细胞的样品中(变化量，如本文指出)加入标记的细胞(在50微升中的1000个细胞)。在它们加入之前，为了消除由于效应器群体中存在NK类效应器的任何非特异溶解，在存在未标记天然杀伤(NK)细胞的靶(50,000细胞每孔)条件下，在37℃最少温育效应器细胞20分钟。在37℃温育4小时后测量51Cr释放，并且如下计算特异性溶解百分数：
Figure A9880653400121
如图1所示，不管是否加入肽，两个TILN群体同样溶解HLA-A*0201阳性细胞系。在每种情况下均不溶解HLA-A*0201阴性系Me260，并且只有当加入肽时，不加工抗原的T2才被溶解。这些结果显示当与HLA-A*0201阳性细胞复合时，下文中利用的两个TILN群体识别SEQ ID NO：1限定的表位。
实施例2
对如上所述的实验进行了一些修饰以便确定是否TILN识别其它肽好于SEQ ID NO：1。在这些实验中，利用已知的方法合成下面的肽：
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：2)
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val Ile(SEQ ID No：3)
Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu(SEQ ID NO：4)
这些肽分别对应于Melan-A的氨基酸27-35，27-36，和32-40。
以效应器∶靶比例30∶1，将T2细胞(靶)与TILN(效应器)温育以便确定TILN识别。利用了变化浓度的肽SEQ ID NO：1，2，3或4。使用上面讨论的51Cr释放测试。下面的表阐述了这些实验的结果，其中肽浓度是给出50％最大活性时的浓度。相对活性通过与SEQ IDNO：2的比较，即[nM]50％[SEQ ID NO：2]/[nM]50％[测试肽]获得的。
                            表1
                   TILN LAU 203                TILN LAU 132肽序列           肽2[nM]50％    相对活性b     肽[nM]50％    相对活性AAGIGILTV27-35        40           1            15            1EAAGIGILTV26-35       1.5          27           1             15AAGIGILTVI27-36       600          0.06         300           0.05ILTVILGV32-40         ＞104       ＜4×10-3   ＞104       ＜1.5×10-3
可以看到SEQ ID NO：1具有明显高于测试的其它肽的活性。
实施例3
为了尝试确定与HLA-A*0201分子具有增强的结合性的肽，合成了一系列肽。合成的肽据认为是SEQ ID NO：2(即，Ala Ala Gly IleGly Ile Leu Thr Val)的衍生物，并且是
Ala Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：5)
Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：6)
Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：7)
和
Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：8)
对于SEQ ID NO：1，即Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val，衍生物是：
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：9)
Glu Met Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：10)
Glu Ala Leu Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：11)
Glu Ala Met Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：12)
Tyr Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：13)
Phe Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：14)
Ala Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：15)
Ala Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val(SEQ ID NO：16)
使用了三个其它对照肽，即
Glu Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu(SEQ ID NO：17)
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr(SEQ ID NO：18)和
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val(SEQ ID NO：19)
SEQ ID NOS：17和18对应于流感A基质蛋白质(“FLUMA”)的氨基酸58-66，和MAGE-3 TRAP的氨基酸168-176。
在这些实验中，利用了已知结合HLA-A*0201的肽，即MAGE-3 TRAP的氨基酸271-279(SEQ ID NO：19)，在抑制测试中，一起利用了识别SEQ ID NO：19和HLA-A*0201的溶细胞T细胞系198NS(Valmori等人，癌症研究，57：735(1997)。在这些测试中，将变化浓度的测试肽(1μM到100μM)与51Cr标记的T2细胞(1000个细胞/孔)在室温下一起温育15分钟。然后加入亚最适剂量的SEQ IDNO：19(lnM)以及足以产生5/1效应器/靶比例的量的CTL198NS。然后根据上面所述的方法，进行51Cr释放测试。计算抑制CTL识别复合物的测试肽的量，然后利用下述通式计算相对于SEQ ID NO：2的每个肽的结合亲和力：
Figure A9880653400151
如果R大于1，则测试肽结合HLA-A*0201的亲和力大于SEQ IDNO：2。值小于1表明亲和力较低。下面阐述了结果：
                      表II
  肽          序列          竞争剂a     竞争剂相对
                            [μM]50％    活性bMelan-A27-35    AAGIGILTV        60           1
            ALGIGILTV        1.5          40
            AMGIGILTV        2            30
            LAGIGILTV        65           1
            MAGIGILTV        55           1Melan-A26-35    EAAGIGILTV       15           4
            ELAGIGILTV       6.5          9
            EMAGIGILTV       20           3
            EALGIGILTV       100          0.6
            EAMGIGILTV       100          0.6
            YAAGIGILTV       4            15
            FAAGIGILTV       2            30流感A基质58-66  GILGFVFTL        1            60MAGE-3168-176   EVDPIGHLY        ＞100        ＜0.6SEQ ID NO：1，5，6，9，10，13和14都显示比SEQ ID NO：2更高的亲和力。
实施例4
在开发MHC结合肽中的一个考虑是产生的MHC分子和肽的复合物是稳定的，优选地比最初发现与MHC分子复合的肽更加稳定。
为了测试新合成的肽的稳定性，在室温下，在含有饱和量的肽(10微摩尔/升)，和3微克/毫升(微球蛋白的无血清培养基中过夜温育T2细胞，以便有利于需要的MHC分子的组装。然后，除去肽，加入10-4摩尔/升ementine(抑制蛋白质合成)。然后在37℃温育细胞不同时间。在各个温育时间点，利用标记的HLA-A2特异性mAb染色细胞的等分试样以便测量HLA-A2表达。
通过与包括SEQ ID NO：17的复合物的比较确定稳定性，这一复合物在6小时期间内是稳定的。图2A-D表示了结果。图2A显示了每个肽的平均荧光强度。“NC”指在缺乏外源肽时，由T2细胞呈递的HLA-A*0201，而“FLUMA”是SEQ ID NO：17，并且是“流感基质抗原”的缩写。在图2A中，肽是SEQ ID NO：2，1和9。在图2B中，肽是SEQ ID NOS：2，7，8，5，6和17(“FLUMA”)。在图2C中，肽是SEQ ID NOS：1，12，11，9，10和17。在图2D中，肽是SEQ ID NOS：1，13，14和17。分解图仅是为便于理解。图2B-2D显示了相对的复合物稳定性，其中相对于用SEQ ID NO：17时观察到的稳定性，测试肽的荧光强度被标准化。SEQ ID NO：1和2形成不稳定的复合物，在一小时内裂解。这也在SEQ ID NO：7和8中发现。
在另一方面，SEQ ID NO：9，10，13和14形成在6小时内稳定的复合物，其中SEQ ID NO：5，6，11和12形成中等程度稳定的复合物。
实施例5
利用TILN和CTL，在上面讨论的51Cr测试类型中测试当肽结合HLA-A*0201时每种肽的抗原活性。对每个肽进行剂量应答分析，并且计算相对于SEQ ID NO：2的抗原活性。在下面的表III和表IV及图3中分别表示了来自TILN(表III和图3)和CTL(表IV)的数据。
利用Leu或Met取代SEQ ID NO：2的N末端氨基酸增强了活性7.5到20倍，而在第二个位置上的取代几乎使活性消失，尽管增强了与HLA-A*0201的结合(表III和图3)。
SEQ ID NO：1比SEQ ID NO：2更好识别，并且在SEQ ID NO：1中第二位的Ala的取代分别增强了识别30和600倍。在位置3的这样的取代如所预期的降低了活性。在位置1的取代导致了识别的增强。
                      表III
             TILN LAU 203       TILN LAU 132肽序列         [nM]    相对活性    [nM]    相对活性AAGIGILTV       60        1         30         1ALGIGILTV       ＞1000    ＜0.6     ＞1000     ＜0.03AMGIGILTV       ＞1000    ＜0.6     ＞1000     ＜0.03LAGIGILTV       6         10        1.5        20MAGIGILTV       8         7.5       2.5        12EAAGIGILTV      12        5         3          10ELAGIGILTV      2         30        0.05       600EMAGIGILTV      2         30        0.05       600EALGIGILTV      ＞1000    ＜0.06    ＞1000     ＜0.03EAMGIGILTV      ＞1000    ＜0.06    ＞1000     ＜0.03YAAGIGILTV      5         20         1         30FAAGIGILTV      1         60         0.05      600
本文示出了利用CTL获得的结果。具体地，利用了5个独立的HLA-A*0201限制的Melan-A特异CTL克隆，已知其中每一个克隆均溶解黑素瘤靶细胞。
CTL以不同效率识别SEQ ID NO：2。当用Leu取代位置1的Ala，5个克隆中的4个增强了识别，而位置2的同样的取代导致了活性的丧失。5个克隆的3个识别SEQ ID NO：1比SEQ ID NO：2更加有效，但所有克隆都非常有效地识别SEQ ID NO：9，而识别SEQID NO：10导致不同程度减弱了的识别，SEQ ID NO：11的识别导致5个克隆中的4个降低了识别。当测试SEQ ID NO：12时，令人惊奇地识别提高了，因为TIL识别降低。关于SEQ ID NO：13和14，CTL的识别减弱。
由此可以结论，SEQ ID NO：7和9比测试的其它肽更好地被识别。而其它肽被不同程度地识别。
Figure A9880653400181
如图4和表III所述测定Melan-A衍生的肽相对活性
图3描述了其它实验，显示了TILN LAU203和TILN LAUl32对T2细胞呈递的各种Melan-A肽类似物的识别。在淋巴细胞与靶比例30：1时进行4小时的51Cr测试。
图3的第一组(顶部和底部)比较了SEQ ID NO：2，7，8，5和6。
第二组(项部和底部)比较了SEQ ID NO：1，9，10，11和12。
第三组(顶部和底部)比较了SEQ ID NO：1，13，14和4。
但是，本文获得的最重要的结果是：当利用SEQ ID NO：9时，SEQID NO：9诱导的CTL识别和溶解呈递内源肽的细胞。
实施例6
根据前面的数据，利用SEQ ID NO：9的肽进行CTL诱导研究。
根据Valmori等人，出处同上，离心纯化来自HLA-A*0201阳性黑素瘤病人的外周血淋巴细胞，并且富集CD3+细胞。然后选择这一富集亚群的CD8+细胞。得到的亚群常规地含有90％以上的CD8+细胞，并且将这些亚群用于进一步的实验。
以1-2×106细胞/孔涂布纯化的CD8+T细胞，以及2×106个刺激细胞，下面将讨论它的制备。在总共2毫升Iscove′培养基中合并效应器和刺激细胞，该培养基已经补充了10％人血清，L-精氨酸(0.55毫摩尔/升)，L-天冬酰胺(0.24毫摩尔/升)，和L-谷氨酰胺(1.5毫摩尔/升)，以及重组的人IL-7(10纳克/毫升)和重组的人IL-2(10单位/毫升)。
为了制备刺激细胞，在37℃，在无血清培养基中，温育2×106个自体PBL以及20微克/毫升每种肽和3微克/毫升(2微球蛋白2小时。然后洗涤，辐射(300rads)PBL，然后在加入到CD8+细胞群体中之前，调节到适当体积。在第7天，用在补充10纳克/毫升重组人IL-7和10U/ml重组人IL-2的完全培养基中的肽脉冲的自体PBL再刺激细胞。用肽脉冲的并辐射的PBL进行每周再刺激。在第二轮(MC-2)后第一次测试CTL活性。
下表和图4中示出了结果。在图4中，所用的CD8+细胞来源是LAU203。在第二次(MC-2)再刺激后7天分析CTL活性。用SEQID NOS：1和2获得了结果。用这些结果与SEQ ID NO：9比较。
注意对于样品LAU203亲本肽几乎没有活性，而SEQ ID NO：9引发强CTL应答，这一活性也与SEQ ID NO：1交叉反应。
下表中的结果描述了用同样的肽和用来自8个不同HLA-A2阳性黑素瘤病人，即LAU203，LAU132，LAU145，LAU86，LAU50，LAU148，LAU161，和LAU119的PBL的实验。
Figure A9880653400201
a)在第三次再刺激后7天测试溶解活性。b)每次测试进行淋巴细胞与靶细胞的比例的滴定。c)数字代表了每个靶获得的特异溶解百分数。Me290是从病人LAU203获得的Melan-A和HLA-A*0201阳性黑素瘤细胞系。Me260是从病人LAU149获得的HLA-A*0201阴性黑素瘤细胞系。每个数字代表重复培养物的几何平均数。黑体字表示明显特异的CTL。当在存在或缺乏Melan-A26-35(1微摩尔/升)或Me290和Me260时在T2细胞上获得的特异溶解的差异等于或高于10％时。当在至少一个培养物中检测到明显特异的溶解时，认为病人是应答者。
d)克隆6是来源于TILN289的Melan-A特异CTL克隆。
实施例7
正如上面指出的，SEQ ID NO：1的十肽比SEQ ID NO：2的九肽具有更高的识别效率。进行实验以便确定这是否是肽SEQ ID NO：1与HLA-A*0201分子的更好的结合的结果。这些实验包括功能肽竞争测试。引入本文作为参考的Gaugler等人，实验医学杂志，174：921(1994)描述了这一类型的测试，本文再加描述。在这一测试中，利用51Cr标记表达HLA-A*0201的靶细胞(T2细胞)，然后与不同浓度的肽温育15分钟。加入突变的Ras5-14肽的亚最适浓度。这一肽具有的氨基酸序列为：
Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val(SEQ ID NO：20)在15分钟后，加入CTL克隆7RAS的样品。从已经注射了SEQ IDNO：20肽的HLA-A*0201人/β-微球蛋白双转基因小鼠的淋巴结获得这一CTL克隆。以5淋巴细胞(10,000细胞/孔)：1靶细胞的比例加入CTL。在37℃温育细胞4小时，然后终止测试。除了SEQ ID NO：1的肽之外，还测试了SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQID NO：21)。SEQ ID NO：21是已知的肽，起源于MAGE-1，已知它结合HLA-A1分子并且刺激溶解。参见引入本文作为参考的美国专利号，5,405,940，SEQ ID NO：12。
当单独利用SEQ ID NO：20时，溶解百分数是80％。没有肽的对照溶解百分数是4％。
结果表明SEQ ID NO：1显示比SEQ ID NO：2高5倍的有效结合。SEQ ID NO：3和4均以对于SEQ ID NO：2可比的活性结合，而对照(SEQ ID NO：21)显示没有结合。与SEQ ID NO：2相比，SEQ IDNO：13和14显示明显提高的结合。当利用特异于HLA-A*0201和一种不同的肽的复合物的人CTL克隆时，获得了同样的结果。下表示出了相对竞争剂活性，其是以抑制对照溶解50％所需的SEQ IDNO2的浓度除以待测试的肽浓度来表示以保证同样的结果：
                表VI
          相对竞争剂活性肽            实验1    实验2    实验3SEQ ID NO：2    1         1       1SEQ ID NO：1    4         4       5SEQ ID NO：14   12        17      20SEQ ID NO：13   8         10      10SEQ ID NO：3    未做      未做    2SEQ ID NO：4    未做      未做    2
实施例8
在基于流式细胞计数测试的另一个测试中确定相对的HLA-A*0201肽结合活性。在这些实验中，在23℃，在存在2微克/毫升人β2微球蛋白时，用不同浓度的肽SEQ ID NO：1，2，13，14或4温育2×105个T2细胞16小时。在4℃洗涤细胞，然后利用FITC标记的单克隆抗体BB7.2染色。这一mAb特异于HLA-A2分子上的构象依赖的表位。然后，利用通式(样品的平均荧光一背景的平均荧光)/(背景的平均荧光)计算荧光指数。参见Nijman等人，当前免疫学杂志，23：1215(1993)。再次，SEQ ID NO：1显示比SEQ ID NO：2更高的结合效率(约10倍)。SEQ ID NO：4显示与SEQ ID NO：2同样的相对结合活性，而SEQ ID NO：13和14具有与SEQ ID NO：1相当的结合活性。
实施例9
在这些实验中，利用13个CTL克隆评估肽识别的效率，所有这些克隆均是特异于HLA-A*0201和SEQ ID NO：2的复合物的。
进行了如上所述的实施例3中描述的同样类型的51Cr释放测试。具体地，如Gaugler等人，出处同上，所述，在2毫克/毫升小牛血清白蛋白和1∶40稀释的W6/32腹水补充的Tris-Dulbecco缓冲液中，用51Cr(用钠盐)标记T2细胞，这稳定了MHC分子。在不同浓度的肽中加入不同量的标记细胞以产生不同的效应器：靶比例。测试的13个CTL的10个识别SEQ ID NO：1十肽比SEQ ID NO：2九肽更有效，获得半最大溶解需要的浓度比九肽低20到1000倍。另外三个CTL产生类似的滴定曲线。没有一个CTL识别SEQ ID NO：3和HLA-A2的复合物。在另外的实验中，在IL-2释放测试中测试一个CTL克隆，再次证实用SEQ ID NO：1提供了比SEQ ID NO：2高10倍的效率。
实施例10
如上所述，利用SEQ ID NO：1，13，和14“分解”CTL组。利用这些肽进行如上实施例7中描述的识别测试。4个CTL识别SEQ IDNO：1，13和14同样好。第5个CTL识别SEQ ID NO：1和13，但不识别SEQ ID NO：14。两个其它的CTL识别SEQ ID NO：1和14但不识别SEQ ID NO：13。一个CTL只识别SEQ ID NO：1。
实施例11
然后进行一套实验以研究本文所述的T细胞的受体(下文″TCRs″)，因为已知在TCR所有组成成分中有不同的成分组合，结果形成不同的TCR。
为此，根据Chomczynski等人，生物化学年评162：156(1987)提取了所测试的每个CTL的106细胞的总RNA。然后，根据商购产品说明书，用聚(dT)引物进行逆转录。之后，根据引入本文作为参考的Genevee等人，当前免疫学杂志，22：1261(1992)，利用Vα和Vβ探针组，和Cα/Cβ特异性寡核苷酸经PCR扩增样品等分试样。发现了六个不同的Vα区段，即Vα2，4，6，7，14和21。一个克隆实际上呈递两个框内Vα转录物。发现了7个不同的Vβ区段(两个克隆表达Vβ13，两个克隆表达Vβ14，两个克隆表达Vβ16。Vβ2，Vβ3，Vβ7.2和Vβ8.2每个均由一个克隆表达)。
实施例12
通过测试单Ala取代的衍生物，研究确定单氨基酸侧链在SEQ IDNO：1和HLA-A*0201分子之间的相互作用中的贡献。即制备的衍生物与SEQ ID NO：1相同，但位置1，4，5，6，7，8，9或10改变成Ala。
根据标准的合成方法制备肽。然后，根据它们抑制已知的HLA-A*0201结合肽即来源于酪氨酸酶的Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ ID NO：22)，与HLA-A*0201限制的CTL克隆LAU132/2的结合的能力在一功能竞争测试中测试它们。简要地说，在单克隆抗体W6/32存在下，用51Cr标记T2细胞。细胞和单克隆抗体如上所述。在室温下，将不同浓度的竞争肽(50微升体积)与50微升51Cr标记的T2细胞(这一量给出了1000细胞/孔)一起温育15分钟。然后，每孔(体积50微升)加入亚最适剂量的1纳摩尔/升SEQ ID NO：22肽以及5000CTL。在37℃温育4小时后测量51Cr释放。确定了抑制50％51Cr释放所需的每个竞争肽的浓度。将抑制50％需要的SEQ ID NO：1的浓度除以测试肽的50％抑制值，计算相对竞争剂活性简化了比较。
发现在位置1(SEQ ID NO：15)利用Ala取代Glu导致竞争剂活性增加5倍。Ala取代位置4或6的Glu导致20和10倍的活性的下降，位置7和10的取代也是如此(约25倍，每次)。在位置8或9变化即，Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Ala Thr Val(SEQ ID NO：23)和Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Ala Val(SEQ ID NO：24)未导致活性的明显变化。实施例13
然后研究如上所述讨论的SEQ ID NO：1的单Ala取代与HLA-A*0201形成的复合物的稳定性。简要地说，利用饱和浓度的类似物(10微摩尔/升)加载T2细胞，并且在室温下与肽和β2微球蛋白(3微克/毫升)在无血清的培养基中过夜温育。除去过量的肽，加入emetine(10-4摩尔/升)以阻断蛋白质合成。然后，温育细胞不同时间，用荧光素标记的抗HLA-A2单克隆抗体(BB7.2)染色等分试样以确定表面上的分子的量。因为已知SEQ ID NO：17的肽与HLA-A*0201形成稳定的复合物(van der Burg，免疫学杂志，156：3308(1996))，利用这一肽作为内部标准。通过计算类似物的平均荧光减去背景荧光，并且除以用SEQ ID NO：17获得的同样值确定复合物的稳定性。背景荧光是不加肽同样处理T2细胞获得的值。
发现在1-6小时内，复合物SEQ ID NO：1/HLA-A*0201是不稳定的，并且在1小时之内分解。在同样的6小时内SEQ ID NO：15形成稳定的复合物。所有测试的其它衍生物形成低稳定性的复合物。
实施例14
然后，测试如上所述的衍生物的相对抗原活性。在这些实验中，测试了如上所述制备的TILN LAU132和TILN LAU203两个TILN群和10个不同的溶细胞T细胞系。在10个CTL中，5个起源于浸润的淋巴细胞或肿瘤浸润的淋巴结，5个来自正常供体的外周血淋巴细胞。已知所有的CTL均特异于HLA-A*0201和SEQ ID NO：2的复合物；但是，给出了如上所述的结果，显示了SEQ ID NO：1的优势，这一十肽用于进行比较。
在51Cr释放测试中评估抗原识别。在37℃用51Cr标记靶T2细胞1小时，然后洗涤两次。然后在加入效应器细胞(50微升)之前，用不同浓度的肽(50微升体积)，在室温温育标记的靶细胞(在50微升中的1000细胞样品)15分钟。当TILN是效应器细胞时，这些细胞已经与未标记的K562细胞(50,000细胞/孔)至少预温育20分钟，以去除由于NK类效应器的非特异溶解。测量了在37℃温育4小时后的上清液中的51Cr。通过从测试的51Cr释放中减去自发释放的51Cr，除以总51Cr减去自发释放，得到的数据乘以100确定溶解百分数。在浓度范围10-5M到10-13M进行滴定。为了定量比较，确定50％最大活性需要的浓度，对SEQ ID NO：2的参考值进行标准化。
与其它测试的变异体相反，发现两个TILN群体识别SEQ ID NO：15比SEQ ID NO：1的亲本十肽好20-60倍。关于CTL，所测试的10个CTL中的8个识别该肽比它们识别SEQ ID NO：1或2好。
关于CTL特异性观察到了其它差异。10个测试的CTL中的5个识别SEQ ID NO：1好于SEQ ID NO：2。这5个CTL中的1个识别SEQ ID NO：1很有效，识别SEQ ID NO：2较差。剩余的5个克隆的3个识别SEQ ID NO：1和2同样有效，2个识别SEQ ID NO：2好于SEQ ID NO：1。
这显示了在肿瘤反应性CTL的良好特异性中具有强烈的趋异性。
实施例15
然后进行进一步的实验确定CTL克隆所展示的抗原特异性的趋异性是否是T细胞所有组成成分对抗原SEQ ID NO：1的一个共有特征，或是由于用于产生CTL的不同方法所致。为了测试这一点，特异的T细胞的来源是没有进行来自肽的体外刺激的抗原驱动的选择。利用了出处同上的TILN群LAU203。正如前面的实施例显示的，该群展示了相当高的抗Melan-A HLA-A*0201阳性黑素瘤细胞的CTL活性。通过限制稀释培养物，在辐射的异源的PBMC，Epstein Barr病毒转化的B淋巴细胞，植物凝集素，和重组IL-2存在下，从这一群中衍生CTL克隆。利用标准几率模型，从克隆率高于90％的培养物衍生克隆。然后，通过在微滴平板上，每3-4星期涂布5×103个细胞以及辐射饲养细胞(5×104异源PBMC，和2×104EBV转化的B细胞)，以及PHA和重组IL-2扩展它们。
进行了两个独立的实验，得到130个生长的克隆，当在如上所述类型的51Cr释放测试中测试这些克隆时，发现11个至少识别SEQ IDNO：1和2中的一个。
为了确定细微的特异性，用SEQ ID NO：1，2和15进行了如上所述类型的抗原识别测试。发现4个克隆识别SEQ ID NO：1好于SEQID NO：2(即相对抗原活性至少高10倍)，6个克隆识别2个肽同样好，一个识别SEQ ID NO：2好于SEQ ID NO：1。9个CTL识别SEQID NO：15好于SEQ ID NO：1和2，与肽SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的微摩尔识别浓度相反，其中一个克隆识别纳摩尔浓度的SEQID NO：15。
实施例16
确定本发明的肽的体外免疫原性。为此，通过在含有细胞的培养基中加入1微摩尔/升肽刺激来自LAU203的PBMC(1.0×107细胞每个测试)。测试的肽是SEQ ID NO：1，29，15和16。将SEQ ID NO：17的肽用作阴性对照。
在加入肽之后，用已经利用上面列出的一个肽在37℃脉冲1小时的自体PBMC每星期刺激培养物。即，用SEQ ID NO：1脉冲PBMC再刺激用SEQ ID NO：1处理的培养物。充分洗涤再刺激培养物，并且在它们使用之前辐射。
在刺激后7天，检测培养物以确定与HLA-A2和SEQ ID NO：9四聚体反应的CD8+的存在。在3星期中重复这一步骤总共3次。为了制备四聚体，首先需要制备编码修饰的HLA-A*0201分子的构建体。为此，从HLA-A*0201阳性细胞中提取总RNA，然后利用特异于该分子的引物，和逆转录链式反应(RT-PCR)克隆HLA-A*0201。按照引入本文作为参考的Altman等人，科学，274：94-96(1996年10月4日)进行。同时利用RT-PCR，改变氨基末端核苷酸序列以便最佳化所用的载体中的蛋白质表达。参见引入本文作为参考的Garboczi等人，美国科学院院刊，89：3429(1992)。之后，再次利用特异的引物扩增分子的细胞外编码部分。将得到的构建体再克隆进入在HLA-A*0201重链的3′末端的产生框架内BirA生物素化识别位点的载体。在独立的大肠杆菌培养物过量表达修饰的HLA-A*0201和β2微球蛋白。纯化得到的内含体，并且在脲中溶解HLA和β2微球蛋白重组蛋白，然后在4℃的再折叠溶液中再折叠形成复合物。(再折叠溶液含有100毫摩尔/升Tris，pH8.0，L-精氨酸，400毫摩尔/升，EDTA，2毫摩尔/升，还原型谷胱甘肽5毫摩尔/升，氧化型谷胱甘肽，0.5毫摩尔/升，PMSF 0.1毫摩尔/升，HLA重链和β2微球蛋白1微摩尔/升，和10微摩尔/升需要的肽)。利用标准技术将再折叠溶液浓缩到7.5毫升。然后，利用BirA反应缓冲液交换再折叠缓冲液(Tris100毫摩尔/升，pH7.5，NaCl 200毫摩尔/升，MgCl2 5毫摩尔/升，PMSF 100微摩尔/升，亮抑酶肽1微摩尔/升，和抑胃酶肽1微摩尔/升)，最后3种是在使用之前加入。
然后通过合并含有HLA-A2复合物的再折叠混合物与50微摩尔/升酶，在200毫摩尔/升的Tris中的100毫摩尔/升生物素，和100毫摩尔/升腺苷三磷酸，利用生物素全酶合成酶(BirA酶)生物素化复合物。在室温下过夜温育混合物。然后纯化生物素化的复合物，与藻红素标记的链霉抗生物素蛋白结合，以产生四聚体结构。分离这些物质，在小体积中重配，浓度为1毫克/毫升。
加入SEQ ID NO：9的肽以结合四聚体。确定相对于每个样品中的CD8+细胞总数的四聚体阳性的T细胞的总数。图5显示了这些结果。发现这些类似物都诱导特异于SEQ ID NO：9的CD8+细胞。
实施例17
在第三次刺激循环后7天，在51Cr释放测试中测试培养物以确定在存在或缺乏SEQ ID NO：1时它们是否溶解T2细胞。基本如实施例14所述进行这些测试。在图6中表示了结果。发现用类似物刺激比用SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2刺激导致了与上述的四聚体反应的CD8+细胞更强烈的扩增。另外，Melan-A特异溶解直接与也是四聚体特异的CD8+细胞的百分数相关，提示相当的溶解能力。
实施例18
进行另外的实验系列以便研究CD8+，四聚体阳性细胞的抗原特异性。为此，利用标准流式细胞分拣方法，从每个培养物中纯化CD8+四聚体阳性细胞。然后利用标准有丝分裂原刺激技术，体外扩展细胞。然后，根据前面实施例的方法，在存在或缺乏在上述体外刺激中所用的肽或SEQ ID NO：1时，对T2细胞测试它们的溶解活性。
图7的结果显示每个培养物展示高水平的针对用测试肽和用SEQID NO：1脉冲的靶细胞的特异溶解。
通过评估抗自体Melan-A+黑素瘤细胞系Me290的能力图7同样记录了不同培养物的杀肿瘤能力。参见实施例1，观察到了高的杀肿瘤活性，对SEQ ID NO：2，在效应器/靶比例3∶1时，对SEQ ID NO：1在效应器/靶比例7∶1时，对SEQ ID NO：15在效应器/靶比例4∶1时，对SEQ ID NO：9在效应器/靶比例5∶1时，对SEQ ID NO：16在效应器/靶比例15∶1时观察到了50％最大的杀肿瘤活性。
实施例19
利用标准CTL测试以及实施例3的测试细胞系，定量抗原识别的亲和力和不同细胞群体的相对抗原活性。利用各种范围的肽浓度开发滴定曲线，图8显示了其中一个。表VII概括了这些数据：
                      表VIII
在四聚体指导的荧光细胞流动分拣之后，Melan-A单特异性
                  CTL系的相对潜力利用下列SEQ ID NO：刺激培养物(A)              2         1         15       9         16肽[nM]50％
2            25        20        25       35        50
1            1         2.5       3        3         15
15           0.04      0.04      0.15     0.08      0.15
9            0.001     0.15      0.03     0.03      0.3
16           0.001     0.015     0.01     0.003     0.03(B)相对抗原活性：
2            1         1         1        1         1
1            25        8         8        12        3
15           625       500       166      437       333
9            25×103  133       833      1666      166
16           25×103  1333      2500     16×103  1666(这些值是50％最大活性所需的肽浓度)
不同的细胞系对亲本肽的亲和力是非常相似的，除了用SEQ IDNO：16体外刺激后获得的细胞系。发现这一细胞系识别HLA-A2/SEQ ID NO：1复合物的效率低约2倍，识别HLA-A2/SEQ IDNO：1比其它细胞系低约5-15倍。
关于表VIII的第二部分，必须注意，不管用于刺激扩增的肽是何种，所有细胞系识别含有SEQ ID NO：1的复合物都比识别含有SEQID NO：2的复合物更好。所有细胞系识别肽类似物均比亲本序列更有效，尽管不同细胞系的相对抗原性不同。细胞系对类似物的优选不总是与用于产生细胞系的类似物相关。
正如将要看到的，前面的实施例描述了本发明的各种特征。这些特征包括结合HLA分子如HLA-A2分子的肽，举例的分子是可以引发溶细胞T细胞增殖的HLA-A*0201。正如从本文的数据可以看到，这些肽是九肽或十肽。所有的肽，第一个氨基酸均指氨基末端，并且最后一个氨基酸指羧基末端。本发明的肽可以是十肽，在C端或羧基末端是Val。当第二个氨基酸是Ala时，它们可以在氨基末端具有Tyr或Phe。在另一个实施方案中，氨基末端是Glu，接着第二个，第三个位置是Ala，Leu或Met，末端是Val，其中如果位置2是Ala，位置3必须是Met或Leu，反过来也是一样。具有在SEQ ID NO：5和8-14所示的氨基酸序列的肽是举例性的。
同样是本发明的一部分的是分离的溶细胞T细胞系，它们特异于这些肽和它们的MHC结合配体即HLA分子如HLA-A2分子，优选地是HLA-A*0201的复合物。
这些肽结合HLA分子的能力使它们可用作通过确定肽是否结合样品中的细胞来确定HLA-A2阳性细胞如HLA-A*0201阳性细胞的存在的试剂。“配体/受体”反应类型是本领域已知的，各种方法可用于确定它。
本发明的另一方面是携带指导细胞合成修饰的十肽必须的信息的“小基因”，在所述细胞中转染了小基因。可以设计编码一个或多个抗原肽的小基因，并且利用质粒转染或通过克隆进疫苗或腺病毒转移到宿主细胞基因组。参见引入本文作为参考的，例如Zajac，等人，癌症杂志研究，71：496(1997)。
可以将肽与来自其它肿瘤排斥抗原的肽结合以便形成“polytopes”。举例的肽包括引入本文作为参考的美国专利申请系列号，08/672,351，08/718,964，现在美国专利号____，08/487,135现在美国专利号_____，08/530,569和08/880,963列出的那些。
可以利用的另外的肽是下面的参考文献中描述的那些，所有均引入本文作为参考：美国专利号5,405,940；5,487,974；5,519,117；5,530,096；5,554,506；5,554,724；5,558,995；5,585,461；5,589,334；5,648,226；和5,683,886；PCT国际公开号92/20356，94/14459；96/10577；96/21673；97/10837；97/26535；和97/31017以及在审的美国申请系列号08/713,354。
polytopes是两个或多个潜在的免疫原性或免疫刺激肽的组合，它们可以各种方式结合，以确定是否这一类型的分子将刺激和/或引起免疫应答。
这些肽可以直接或通过侧接序列连接在一起。参见Thompson等人，美国科学院院刊，92(13)：5845-5849(1995)，教导了相关表位序列的直接连接。利用polytopes作为疫苗是已知的。参见例如，Gilbert等人，自然生物技术，15(12)：1280-1284(1997)；Thomson等人，出处同上；Thomson等人，免疫学杂志，157(2)：822-826(1996)；Tam等人，实验医学杂志，171(1)：299-306(1990)，所有这些引入本文作为参考。特定地Tam参考文献显示，当用于小鼠模型时，polytopes可用于产生抗体和保护免疫。另外，参考文献显示当消化时，polytopes产生可以并被MHC呈递的肽。Tam通过示出CTL识别polytpoe′串′加工的各个表位显示这一情况。这一途径例如可以用于确定多少表位可连接在polytope中并且仍引发识别，也可确定不同的表位的结合的效率。不同的结合可以是对表达特定肿瘤排斥抗原亚组的病人量身定做的。这些polytopes可以作为多肽结构或通过利用核酸递送系统导入。例如，本领域有许多不同方法可以导入编码单个表位或如上讨论的polytope的DNA。参见例如引入本文作为参考的Allsopp等人，欧洲免疫学杂志，26(8)；1951-1959(1996)。可以利用腺病毒，痘病毒，Ty病毒状颗粒，质粒，细菌等等。在小鼠模型中可以测试这些系统以确定哪个系统是最适于人的给定的平行情况。它们也可以在人临床试验中测试。
同样，本发明的一个特征是利用这些肽确定样品中溶细胞T细胞的存在。如上所示样品中的CTL将与肽/MHC复合物反应。所以，如果知道CTL在样品中，加入本发明的肽到HLA-A2阳性细胞如HLA-A*0201阳性细胞中可以“溶解”HLA-A2阳性细胞，然后确定例如放射活性铬释放，TNF生产，等等，或通过其它方法确定T细胞活性。同样，在样品中加入HLA-A2阳性细胞和要求保护的肽，可以确定样品中是否存在特异的肿瘤浸润淋巴细胞(″TILs″)，并且通过例如51Cr释放，TNF存在等确定HLA-A2阳性细胞的溶解。另外，通过ELISPOT分析可以检测CTL。参见例如Schmittel等人(1997)，免疫学方法杂志，210：167-174和Lalvani等人(1997)，实验医学杂志，126：859或通过荧光四聚体MHC I类/肽复合物的分析(Dunbar等人(1998)当前生物学8：413-416。所有文章引入本文作为参考。
当然，该肽可以用于引发CTL的生产。如上所示，当与适当的复合物相遇时，CTL前体发展成CTL。通过引起这样的“相遇”，可以产生CTL。这可用于在体内以及来自体内地生产这样的CTL。
本发明的其它特征对技术人员是明了的。并且不需要本文重复。
利用的术语和表达是用作描述的术语而非限制性的，不排除利用除了本文显示和描述的特征或其部分的任何等当物以外的术语和表达，应该认识到在本发明的范围内各种修饰时可能的。

Claims (18)

1.结合HLA-A2分子的分离的肽，所述的肽由10个氨基酸组成，其中羧基末端氨基酸是Val，氨基末端氨基酸是Ala，Tyr或Phe，并且第二个氨基酸是Ala。
2.结合HLA-A2分子的由10个氨基酸组成的分离的肽，所述的肽在它的羧基末端具有Val，在它的氨基末端为Glu，N末端的第二个和第三个氨基酸是Ala，Leu或Met，条件是当第二个氨基酸是Ala时，第三个氨基酸必须是Leu或Met，并且当第三个氨基酸是Ala时，第二个氨基酸必须是Leu或Met。
3.根据权利要求1所述的分离的肽，具有选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的分离的肽，具有选自SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
5.特异地识别权利要求1的分离的肽和HLA-A2分子的复合物的分离的溶细胞T细胞系。
6.特异地识别权利要求2的分离的肽和HLA-A2分子的复合物的分离的溶细胞T细胞系。
7.用于引发溶细胞T细胞增殖的方法，包括将含有溶细胞T细胞前体的样品与权利要求1的分离的肽和HLA-A2分子的复合物接触以引发任何特异于所述的复合物的溶细胞T细胞前体增殖成溶细胞T细胞。
8.用于引发溶细胞T细胞增殖的方法，包括将含有溶细胞T细胞前体的样品与权利要求2的分离的肽与HLA-A2分子的复合物接触以引发任何特异于所述的复合物的溶细胞T细胞前体增殖成溶细胞T细胞。
9.由选自SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7和SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的分离的九肽。
10.确定肿瘤样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在的方法，包括将所述的肿瘤样品与HLA-A2阳性细胞样品以及权利要求1的分离的肽混和，并且确定所述的HLA-A2阳性细胞的溶解作为TIL在所述的样品中存在的指征。
11.确定肿瘤样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在的方法，包括将所述的肿瘤样品与HLA-A2阳性细胞样品以及权利要求2的分离的肽混和，并且确定所述的HLA-A2阳性细胞的溶解作为TIL在所述的样品中存在的指征。
12.确定肿瘤样品中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的存在的方法，包括混合所述的肿瘤样品与HLA-A2阳性细胞样品和权利要求9的分离的肽混和，并且确定所述的HLA-A2阳性细胞的溶解作为TIL在所述的样品中存在的指征。
13.由SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：23，或SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的分离的十肽。
14.具有选自SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的氨基酸序列的分离的十肽。
15.引发与在细胞表面存在HLA-A2分子和与所述的HLA-A2分子形成非共价复合物的肽的复合物的细胞反应的溶细胞T淋巴细胞的增殖的方法，包括将含有所述的溶细胞T淋巴细胞的样品与HLA-A2分子和九聚体或十聚体的复合物接触，其中所述的九聚体或十聚体的羧基末端氨基酸是Val，所述的九聚体或十聚体的氨基末端氨基酸是Ala，Glu，Tyr或Phe，所述的九聚体或十聚体的第二个氨基酸是Ala或Leu，以刺激与HLA-A2和所述的九聚体或十聚体的复合物以及至少一个其它的HLA-A2和第二种不同的九聚体或十聚体的复合物反应的溶细胞T细胞的增殖。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的九聚体或十聚体具有Ala或Glu作为它的N末端氨基酸。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述的单体是具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的九聚体。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述的十聚体是具有SEQID NO：1，9，15或16的氨基酸序列的十聚体。
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