CN1264423A - 细胞毒性t淋巴细胞 - Google Patents

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Abstract

识别能将抗原肽与HLA－A24分子的复合体呈递到细胞表面的细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),该抗原肽选自序列号1－6中任一序号的氨基酸序列所代表的人主要组织相容性抗原(HLA)－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一种;含有该CTL的制癌剂;该CTL的诱导方法;该CTL的诱导剂;含有至少一种选自该HLA－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的制癌剂;能将选自前面HLA－A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一种抗原肽与HLA－A24分子的复合体呈递到细胞表面的抗原呈递细胞;含有该抗原呈递细胞的CTL的诱导剂;含有该抗原呈递细胞的制癌剂;该CTL的敏感性细胞的检测方法;含有该CTL的该CTL的敏感性细胞的检测剂及其HLA分子的检测方法。

Description

细胞毒性T淋巴细胞
技术领域
本发明涉及用于癌症治疗和诊断的细胞毒性T淋巴细胞(有时称作细胞障碍性T淋巴细胞)(cytotoxic T lymphorytes：以下略作CTL)以及诱导该CTL时有用的CTL诱导剂。
技术背景
CTL通过特异性T细胞受体(T cell receptor：以下略作TCR)识别抗原肽与主要组织相容性抗原基因复合体(majorhistocompatibility gene complex，以下略作MHC)编码的主要组织相容性抗原MHCI(人的叫做人白细胞抗原(human leukocyteantigen)I类抗原，以下略作HLA-I)分子结合所形成的复合体，从而可以损伤将该复合体呈递到细胞表示的细胞。由于该CTL只能识别杀伤具有自身MHC I类分子的靶细胞，所以称之为MHC I类分子限制性CTL。因此，如果这种细胞杀伤反应成立的则需要1)存在具有特异TCR的CTL，以及2)呈递给MHC-I类人分子被CTL所识别的抗原肽。为此，存在不仅能与MHC-I类抗原分子相结合，而且能形成被TCR所识别的复合体的抗原肽是必要的。
也就是说，本说明书中的“抗原肽”是指这样的抗原肽，它具有与MHC-I分子相结合并与之形成复合体的能力，同时该复合体具有被特异的CTL的TCR所识别的抗原性。另外，本说明书的“HLA限制性抗原肽”是指MHC-I类分子为HLA分子的抗原肽。本说明书中的“肽”不特殊限定于只由氨基酸组成的同质肽，也包括包含有非氨基酸成分的异质肽。氨基酸也不特别限定于天然型氨基酸，也可以是经过化学修饰的氨基酸。此外，本说明书中的肽不限定于单体，也可为多聚体。
该抗原肽的形成是，例如在哺乳类细胞的细胞内合成的抗原在内质网中经过处理，分解成小的抗原决定肽，然后该肽段与MHC-I类分子会合，呈递到细胞表示。也就是说，在由多个亚单位构成的蛋白酶体复合体中，蛋白质被分解成由8～15个氨基酸组成的肽，其中的一些肽被TAP转运蛋白从细胞质转运至内质网。若这些肽能与内质网中的I/β2微球蛋白(microglobulin)的异二聚体结合，便以3分子复合体的形式形成稳定和复合体，通过高尔基体转运至细胞表示，表达肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原蛋白质的肿瘤细胞，应能将T淋巴细胞识别的MHC-I类分子限制性的抗原肽呈递到肿瘤细胞表示。
由T淋巴细胞识别的最初的肿瘤特异性抗原是由T.Boor等对叫做黑色素瘤抗原E(以下略作MAGE)的基因进行克隆，鉴定出的(P.Vander Bruggen)等，科学(Science)，第254卷，1643～1647页(1991)〕。他们采用来源于黑色素瘤患者的CTL克隆以及CTL所识别的来源于同一患者的一系列黑色素瘤细胞株，应用其中几个对CTL具有抗性的免疫选择株，通过表达克隆的方法分离了MAGE。也就是说，将用CTL识别的黑色素瘤细胞株制备的5kb的DNA片段导入原来不被CTL识别的细胞株，这些细胞株就可成为被上述CTL克隆识别的细胞株。该DNA片段编码预测分子量为26,000的蛋白质。编码该蛋白质的基因叫做MAGE-1，通过mRNA分析显示，不仅在转移性，而且来源于初期阶段黑色素瘤的40％的细胞株表达MAGE-1。由该蛋白质而来的抗原是HLA-A1限制性的，MAGE-1特异的CTL克隆识别与HLA-I类分子中的一种HLA-A1分子结合，由序列号7中的9个氨基酸序列构成的肽序列(EADPTGHSY)(C.Traversari)等，实验医学杂志(Journal of Experimental of Medicine)，第176卷，1453～1457页(1992)〕。
已知的肿瘤抗原有许多种，但现在已知被CD-8阳性CTL所识别的肿瘤抗原有：以上述的MAGE-1为代表的已知有10种以上的MAGE家族：gp100；酪氨酸激酶(tyrosinase)或癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen；以下略作CEA)，HER2/neu等。CTL所识别的是来源于肿瘤抗原蛋白质的肽，与HLA-I类分子以复合体的形式呈递。
HLA-I类分子主要有HLA-A、-B、-C，已知与它们结合而呈递的抗原肽由9～10个氨基酸构成，而且随各种HLA分子的不同而存在不同的一定结构上的特征。例如最熟知的与世界上出现几率最多的HLA-A2.1分子结合的肽是由9～10个从N末端数第二个氨基酸为Leu，且C末端为Leu或Val的氨基酸构成的肽。另外，已熟知以日本人为代表的亚洲人种多数为HLA-A24分子，与该分子结合的肽是由9～10个氨基酸构成的肽，从N末端开始其第2位的氨基酸为Tyr、Phe、Met、Trp中的任一个，且其C末端为Leu、Ile、Trp、Phe中的任一个〔(A.Kondo)等，免疫学杂志，(Journal ofImmunology)，第155卷，第4307～4312页(1995)〕。
到目前为止作为肿瘤抗原已鉴定出的抗原肽有：与HLA-A1相对应的MAGE-1、MAGE-3；与HLA-A2.1相对应的有MAGE-3、MART1、酪氨酸激酶、gp100、HER2/neu、CEA等；与HLA-Cw1相对应的MAGE-3；与HLA-B44相对应的MAGE-3等；与HLA-A24相对应的酪氨酸激酶、β-连环蛋白(catenin)等。已鉴定出与CEA来源的抗原肽相关的，由序列号34所示的9个氨基酸序列所组成的肽为HLA-A2.1限制性的抗原肽〔国家癌症研究所杂志(Journal of National Cancer Institute)，第87卷，第982～990页(1993)〕。同样鉴定出与HER2/neu来源的抗原肽相关的、由序列号35或36所示的9个氨基酸序列组成的肽为HLA-A2.1限制性的抗原肽〔实验医学杂志，第181卷，第2109～2117页(1995)，癌症研究(Cancer Research)，第54卷，第1071～1076页(1994)〕。其中大多数是首先建立识别肿瘤细胞的I类分子限制性的CTL细胞株，鉴定该CTL所识别的肿瘤抗原，然后应用遗传工程学方法找出肿瘤抗原蛋白质中的最小单位，再根据与HLA-I类分子结合的基元序列相关的信息找出最小单位中的肽〔(Y.Kawatami)等，美美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of theSciences of the United States of America)，第91卷，第3515～3519页(1994)〕。或者，首先以与上述HLA-I类分子结合的肽中共同的基元结构为基础，找出肿瘤抗原蛋白质中与HLA-I类分子结合的肽，然后应用抗原呈递细胞选择出具有诱导CTL能力的肽后，最后通过能否诱导对肿瘤细胞具有杀伤性的CTL来确定抗原肽〔(E.Celis)等，美国国家科学院院刊，第91卷，第2105～2109页(1994)；(B.Gaugler)等，实验医学杂志，第179卷，第921～930页(1994)〕。
另一方面，HLA-I类分子可分为几个亚型，其保有的亚型种类在人种间有很大的差异，世界上最多的为HLA-A2，约占白色人种的45％。因此，对HLA-A2限制性抗原肽的鉴定工作进行得最多，在日本人中HLA-A2约占40％，但是对其亚型的研究发现，与白色人种相同的HLA-A*0201占20％，其余的多数为A*0206。与这些亚型结合的肽不同，主要研究的HLA-A2为HLA-A*0201。另一方面，日本人中HLA-A24占60％以上，与其它人种相比，HLA-A24在亚洲人种的比率较高。然而到目前为止，尽管已知该HLA-A24限制性的抗原肽作为肿瘤抗原表达的有上述的酪氨酸激酶，β-连环蛋白，但是对其进行的分析研究非常落后。因此对亚洲人种，尤其是对日本人肿瘤细胞具有特异作用的CTL的分析也很落后，不能提供用于肿瘤治疗的CTL。本发明的目的是提供该CTL。
发明的公开
本发明的第1方案是涉及识别将抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到细胞表示的细胞的CTL，而抗原肽选自序列号1～6任一序号中记载的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性的抗原肽以及其功能性衍生物。本发明的第2方案涉及以第1方案的CTL为有效成分的制癌剂。本发明的第3方案涉及第1方案中CTL的诱导方法。本发明的第4方案涉及CTL的诱导剂，它是以选自序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一个抗原肽作有效成分。本发明的第5方案涉及以抗原肽作有效成分的制癌剂，而该抗原肽选自序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。本发明的第6方案涉及将抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到细胞表示的抗原呈递细胞，而抗原肽选自序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。本说明书中作为将HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合体呈递到细胞表示的细胞，使用术语“靶细胞”和“抗原呈递细胞”。本说明书中的“靶细胞”是被特异性识别该细胞的CTL所杀伤的细胞。另一方面，本说明书中的“抗原呈递细胞”是指与MHC分子一起呈递抗原，具有激活T淋巴细胞功能的细胞，特别是只要没有预先说明，MHC分子为HLA-A24分子的细胞。另外，本说明书中的“具有抗原呈递能力的细胞”指的是具有通过将存在于该细胞上的MHC分子与抗原肽形成复合体可成为抗原呈递细胞的能力的细胞，特别只要无预先说明，MHC分子为HLA-A24分子的细胞。本发明的第7方案是涉及以第6方案的抗原呈递细胞为有效成分的CTL的诱导剂。本发明的第8方案涉及以第6方案的抗原呈递细胞为有效成分的制癌剂。本发明的第9方案涉及该CTL敏感性细胞的检测方法，该方法以第1方案的CTL与待检细胞接触时所产生的变化为指标。本说明书中的“待检细胞”是由末梢血淋巴细胞、组织等体外摘取的样品而来的人细胞或株细胞。另外，本说明书中的“敏感性细胞”是指以被CTL所识别引起细胞溶解或细胞因子游离的肿瘤细胞为代表的异常细胞。本发明的第10方案涉及该CTL敏感性细胞的检测剂，其特征在于它包含以1中的CTL作有效成分。再者，本发明的第11方案涉及HLA分子的检测方法，其特征在于在选自HLA限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一个抗原肽存在的条件下，让可能识别该抗原肽与HLA分子亲合体的CTL与被检细胞接触。
本发明者们以含有肿瘤抗原MAGE-3蛋白质中的HLA-A24结合基元序列的肽为中心，从大量的候补肽中探索抗原肽，结果表明，应用由序列号1或2中的氨基酸序列组成的肽可从表达HLA-A24的健康人末梢血单核细胞诱导出对该肿瘤抗原的表达细胞具有选择性杀伤作用的CTL。同样，以含有各种肿瘤抗原蛋白质中的HLA-A24结合基元序列的肽为中心，从候补肽中探索HLA-A24限制性抗原肽，结果表明，应用存在于MAGE-1蛋白质氨基酸序列中的由序列号3中的氨基酸序列构成的肽，应用存在于CEA蛋白质氨基酸序列中的序列号4或5中代表的氨基酸序列构成的肽，或应用存在于HER2/neu蛋白质氨基酸序列中的序列号6中的氨基酸序列构成的肽，可从表达HLA-A24的健康人末梢血单核细胞诱导出对该肿瘤抗原的表达细胞具有选择性杀伤作用的CTL，完成了本发明。
附图简述
图1表示用抗原肽MA3-2刺激诱导的效应细胞对靶细胞的特异性细胞杀伤作用。
图2表示用抗原肽MA3-4刺激诱导的效应细胞对靶细胞的特异性细胞杀伤活性。
图3表示用抗原肽MA3-2刺激诱导的效应细胞对各种癌细胞的特异性细胞杀伤活性。
图4表示用抗原肽MA3-4刺激诱导的效应细胞对各种癌细胞的特异性细胞杀伤活性。
图5表示用抗原肽MA1-1刺激诱导的效应细胞对各种靶细胞的特异性细胞杀伤活性。
本发明的最佳实施方案
本发明的第1方案是识别能将抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到细胞表面的细胞的CTL，该抗原肽选自序列号1～6任一序号中记载的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物，而该CTL能引起对靶细胞特异的细胞反应或细胞因子释放反应。本说明书的CTL指识别呈递到HLA-A24分子上的抗原肽的抗原性，具有杀伤活性的CTL，而不是由其它抗原性识别所限定的CTL。
本说明书中的HLA-A24限制性抗原肽的功能性衍生物指具有与HLA-A24分子形成复合体的能力，同时所形成的复合体能被CTL所识别，而该CTL能识别序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所表示的抗原肽与HLA-A24分子的复合体。例如，序列号1～6任一序号的氨基酸序列所表示的肽的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸缺失，被其它的氨基酸或衍生物置换氨基酸，和/或添加1个或数个氨基酸或衍生物氨基酸，或这些情况组合发生而形成的不同氨基酸序列，具有与HLA-A24分子形成复合体的能力，同时所形成的复合体能被CTL所识别的肽，也包含通过二硫键结合形成的肽的二聚体。功能性衍生物的氨基酸序列长度优选9～10个，但并不特别限定于此。另外，本发明中所指的氨基酸衍生物，指各种氨基酸的N-酰化物，O-酰化物，酯化物，酸性酰胺化合物，烷化物等。
另外，只要与HLA-A24分子的复合体能被CTL所识别，抗原肽的N末端和游离的氨基可结合甲酰基、乙酰基、叔丁氧羰基(t-Boc)等。只要与HLA-A24分子的复合体能被CTL所识别，抗原肽的C末端和游离的羧基可结合甲基、乙基、叔丁基、苯甲基等。同样，只要与HLA-A24分子的复合体能被CTL所识别，抗原肽中所包含的半胱氨酸的硫醇基可结合乙酰氨甲基、甲氧苄基等。
应用识别序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所代表的抗原肽与HLA-A24分子所形成的复合体的CTL可鉴别出功能性衍生物，例如可用下述方法。
第1种方法是，将作为功能性衍生物的候补物质与表达HLA-A24的细胞混合，洗净未与HLA-A24分子结合的候补物质后，与CTL进行反应。若能观察到对候补物质的特异性反应，细胞杀伤性反应，细胞因子释放反应或增殖反应，就可判断为功能性衍生物。
第2种方法是，向候补物质中添加具有抗原呈递能力的细胞，在适当的时间内，如抗原被细胞摄取，经过加工，抗原肽与HLA分子的复合体呈递到细胞表示所必需的时间，进行反应后，与CTL进行反应。若能观察到候补物质特异的细胞因子游离或增殖反应，则判断该物质为功能性衍生物。
第3种方法是，将编码候补物质氨基酸序列的核酸结合到载体上，该载体能够将肽呈递给后述的具有抗原呈递能力的细胞上的HLA-A24分子，将该重组载体转化的抗原呈递细胞与CTL进行反应。若能观察到候补物质特异的细胞因子游离或增殖反应，则判断该物质为功能性衍生物。
上述的功能性衍生物是，例如为了增强与HLA-A24分子的结合，序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所代表的肽的氨基酸序列，从N末端开始的第2个氨基酸可置换或以与HLA-A24分子结合肽为特征的Tyr、Phe、Met、Trp中选择的氨基酸，和/或C末端的氨基酸置换或从与HLA-A24分子结合肽为特征的Leu、Ile、Trp、Phe中选择的氨基酸，这样的肽中具有与HLA-A24分子相结合的能力，与HLA-A24分子所形成的复合体能被识别序列号1～6中的任一种肽与HLA-A24分子所形成的复合体的CTL所识别，这样的肽可作为上述的功能性衍生物。
另外也可是这样的肽，序列号1～6任一项氨基酸序列中的1个或数个氨基酸发生置换后的氨基酸序列所代表的肽中，发生了置换的各种氨基酸或侧链类似的氨基酸，或者氨基酸衍生物所形成的肽中，具有与HLA-A24分子结合的能力，且与HLA-A24分子形成的复合体能被本发明的CTL所识别的肽。与侧链类似的氨基酸可列举，如：甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸等。
例如，作为序列号4中所示的抗原肽的功能性衍生物，可列举将N末端第6位的氨基酸(Val)置换成Ile的序列号24中氨基酸序列所代表的肽，将N末端第8位的氨基酸(Gly)置换成Ala的序列号46中氨基酸序列所代表的肽。另一方面，作为序列号5中所示抗原肽的功能性衍生物，可列举N末端第6位的氨基酸(Val)分别置换成Ile、Met的序列号53、55中记载的氨基酸序列所代表的肽，或者是N末端第4位的氨基酸(Cys)置换成Cys的硫醇基与4，5-二羟基-2-环戊烷-1-酮(4，5-dihydroxy-2-cyclopenten-1-one，以下略作DHCP)发生反应所得的生成物的序列号33中记载的肽。另外，N末端第4位的氨基酸也可是Cys的硫醇基与N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol)、4-乙烯基吡啶(4-Vinylpyridine)进行反应而得的产物。
另外，作为上述功能性衍生物，也可以是与侧链不相类似的氨基酸的置换，例如，可以是序列号1～6任一序号记载的氨基酸序列所代表的肽的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸置换或其它的氨基酸或氨基酸衍生物，如置换成Ala的氨基酸序列所代表的肽中具有与HLA-A24分子结合的能力，与HLA-A24分子形成的复合体能被识别序列号1～6任一序号中记载的肽与HLA-A24分子复合体的CTL所识别的肽。
例如，作为序列号4中所示抗原肽的功能性衍生物，可列举序列号39、40、42～45、48任一序号中记载的氨基酸序列所代表的肽，作为序列号5中所示抗原肽的功能性衍生物，可列举序列号26、27、30、32记载的氨基酸序列所代表的肽。
另外，上面的肽中可置换成Ala的这一位置的氨基酸具有置换成与原本氨基酸不同的其它氨基酸，或氨基酸衍生物的可能性。例如，序列号5记载的氨基酸序列所代表的抗原肽的第4位氨基酸，可置换成Ala之外的其它除Asp、Gln等酸性氨基酸以外的氨基酸或氨基酸衍生物。例如，序列号51或52中记载的氨基酸序列所代表的用Ser或Gly置换的肽。
另外，作为通过二硫键所形成的肽的二聚体，可以序列号5记载的氨基酸序列所代表的肽为例，它是借助于半胱氨酸的硫醇基而进行二硫键的结合的。
除上述之外还有，如由序列号1记载的氨基酸序列所构成的肽的功能性衍生物也包含来自以MAGE-3为代表的MAGE家族蛋白质的肽，它们能被用序列号1记载的氨基酸序列构成的肽所诱导的CTL所识别。同样由序列号2记载的氨基酸序列所构成的肽的功能性衍生物与包含来自以MAGE-3为代表的MAGE家族蛋白质的肽，而该肽能被用序列号2记载的氨基酸序列构成的肽所诱导的CTL所识别。由序列号3记载的氨基酸序列所构成的肽的功能性衍生物也包含能被用序列号3记载的氨基酸序列构成的肽所诱导的CTL识别的，来自以MAGE-1为代表的MAGE家族蛋白质的肽。
由序列号4记载的氨基酸序列所构成的肽的功能性衍生物可列举能被序列号4记载的氨基酸序列构成的肽所诱导的CTL识别的，来自CEA和非特异性交差反应性抗原(non-specific crossneacting antigen，NCA)的肽。序列号5中记载的氨基酸序列所代表的肽的功能性衍生物可列举能被用序列号5中记载的氨基酸序列所代表的肽诱导的CTL所识别的、来自CEA及NCA的肽。
以下，本说明书中将序列号1或2中表示的肽及其功能性衍生物统称为MAGE-3抗原肽，将序列号3中表示的肽及其功能性衍生物统称为MAGE-1抗原肽。同样，将序列号4或5中表示的肽及其功能性衍生物统称为CEA抗原肽，将序列号6中表示的肽及其功能性衍生物统称为HER2/neu抗原肽。若无特殊说明，以下本说明书中所使用的“抗原肽”。表示从MAGE-3抗原肽、MAGE-1抗原肽，CEA抗原肽和/或HER2/neu抗原肽中任意选择的肽。
抗原肽及其衍生物可通过液相或固相氨基酸的偶联应用有机化学的方法进行制备。另外，也可应用用编码抗原肽的氨基酸序列的核酸重组DNA的技术进行制备。根据DNA重组技术得到的肽，在必要情况下，可应用适当的有机化学或生物化学方法进行修饰。
因为用MAGE-3抗原肽所诱导的CTL以及用MAGE-1抗原肽、CEA抗原肽和HER2/neu抗原肽所诱导的CTL分别对HLA-A24和MAGE-3共阳性的肿瘤细胞、HLA-A24和MAGE-1共阳性的肿瘤细胞、HLA-A24和CEA共阳性的肿瘤细胞以及HLA-A24和HER2/neu共阳性的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，所以本发明的CTL可作为抗肿瘤的细胞药物使用，或者用于该CTL敏感性细胞的检测等。
本发明的第2方案是涉及以第1方案的CTL作有效成分的制癌剂。该制癌剂是以将该CTL悬浮到医药允许的稀释剂中的形式而提供的。这里所讲的稀释剂可以是，如保存该CTL所适宜的培养基、生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水。一般培养基可列举RPMI、AIM-V等。另外，为了达到稳定的目的，该制癌剂中可添加医药上所允许的载体。这里所讲的载体为人血清白蛋白等。该制癌剂中包含的第1方案的CTL量是每1种CTL 104～108个/ml，优选5×105～5×107个/ml。
将上述制癌剂施用给人的时候可用注射器，每1个成人的施用量通常是CTL的数目为每1种CTL达106～1010个。不过上述的范围只是一个标准，并不限于此。另外，因为作为有效成分的CTL来自所施与的人，所以该制癌剂无毒性。
尽管本发明的制癌剂施用给其肿瘤细胞表达有效成分CTL可识别的抗原肽的癌症患者，例如，MAGE当初是从黑色素瘤患者的恶性肿瘤细胞鉴定出的抗原，但其后证实黑色素瘤以外的癌症患者约10～50％表达该抗原。表达MAGE-1、MAGE-2或MAGE-3的肿瘤细胞除黑色素瘤外，还有来自如肺癌、乳腺癌、头颈部癌、胃癌、食道癌、膀胱癌的肿瘤细胞〔(B.Gaugler)等，实验医学杂志，第179卷，第921～930页(1994)〕。因此，例如以用MAGE-3抗原肽诱导的本发明第1方案中的CTL作有效成分的制癌剂对治疗肿瘤细胞为HLA-A24和MAGE-3共阳性的上述癌症患者也有效。
另外，在应用上述制癌剂的时候尽管也可并用其它制癌剂，但最好不要并用具有免疫抑制作用的制癌剂。
本发明的第3方案涉及第1方案中的CTL的诱导方法。可应用选自序列号1～6任一序号记载的氨基酸序列所表示的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物中的至少一个抗原肽来诱导该CTL。
在体外(in vitro)诱导该CTL的时候，比如可应用表达HLA-A24的生命体的体外摘取样品进行诱导。本说明书中所指的体外摘出样品，除血液之外，还包含通过手术摘取的淋巴结、脾脏、其它各种脏器，这些样品中所存在的淋巴细胞和浸润性淋巴细胞非常适用。
例如在应用血液的时候，可通过给由HLA-A24阳性的人血液制备的末梢血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，以下略作PBMC)而得到的淋巴细胞反复地抗原刺激而诱导CTL。抗原刺激是通过应用抗原呈递细胞而进行的，例如用制备淋巴细胞的同一血液制备的具有抗原呈递能力的细胞以HLA-A24分子复合体的形式将抗原肽呈递到细胞表示的抗原呈递细胞。再在抗CD3抗体的刺激下，或抗原肽存在下的各种刺激后，诱导出的CTL可增殖。例如，在IL-7存在的条件下，对从PBMC制备的1个淋巴细胞以0.01～1的比率混合抗原呈递细胞，可诱导CTL。其它的方式是，在IL-7和钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemoryanin，KLH)存在的条件下，向PBMC中加入抗原肽，在细胞培养液中，每1种抗原肽的量为1ng/ml～100μg/ml，优选10ng/ml～1μg/ml，以此来诱导CTL。
通过克隆化，可将所诱导的CTL作为具有稳定的细胞杀伤性的淋巴细胞进行维持。例如，向诱导的CTL中加入抗原、各种细胞因子、抗CD3抗体的刺激，CTL可进行增殖。
诱导的特异性CTL，对诱导CTL的抗原肽和放射性物质等标记的靶细胞的杀伤性，可通过放射能的摄取测定CTL增殖的抗原特异性增加或者从CTL和靶细胞游离出的抗原特异性GM-CSF、IFN-γ等细胞因子的量进行检测。另外也可通过使用荧光素等标记的抗原肽或复合体进行直接确认。这种情况下，例如将CTL接触与CTL特异性抗原相偶联的第一荧光标记物之后，再接触与第2荧光标记相偶联的抗原肽-MHC复合体，然后通过用FACS(fluorescence-activated cellsorting)分析双重标记细胞的存在来确认CTL。
另一方面，在体内(in viro)诱导CTL的时候，例如可通过活体内施用抗原呈递细胞而进行，而该抗原呈递细胞能将抗原肽和HLA-A24分子以复合体的形式呈递到细胞表面。施用给人的时候，每个成人的施用量通常为104～109个，也可应用其它的方法，如通过将抗原肽与适当的佐剂相混合施用给生物体，来诱导该抗原肽特异的CTL。佐剂可以是为①氟氏(Freund)完全佐剂，②氟氏不完全佐剂，③氢氧化铝、明矾等无机物凝胶，④溶血卵磷脂、二甲基硬脂铵溴化物等表面活性剂，⑤硫酸右旋糖苷、多聚肌胞苷酸等多聚阴离子，⑥胞壁酸酰肽、促吞噬肽等肽，⑦Ribi公司的单磷酰脂(monophosphonyl lipid；MPL)A等，但是佐剂并不仅限于此。除施用抗原剂和佐剂的混合物在生命体内诱导CTL外，还可与MHCII类制约性辅助T细胞抗原肽混合施用。另外，为了能在生命体内稳定存在，可借助于适当的连接体将该抗原肽与高级脂肪酸和辅助性T细胞抗原肽共同结合而进行施用。施用给人的时候，每1个成人的施用量是，抗原肽的浓度是每1种抗原肽的量为0.1μg/kg～10mg/kg，优选1μg/kg～1mg/kg，更优选的是1μg/kg～100μg/kg。
为了用诱导CTL的抗原肽进行刺激，也可应用抗原肽和HLA-A24分子的复合体。这种情况下，HLA-A24分子不必要是天然的HLA-A24分子，基本上保存有与抗原肽结合特性的片断即可。例如这些片段可以是通过天然HLA-A24分子的蛋白质分解或重组DNA技术进行制备的。该复合体与β2-微球蛋白共存，进一步讲，与识别复合体的抗体共存可使之稳定。
本发明的第4方案涉及CTL的诱导剂，它以选自序列号1～6中任一序号记载的氨基酸序列所代表HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一个抗原肽作有效成分。CTL诱导剂的供给方式是抗原肽单独或与其它分子(辅助性T细胞抗原肽和/或佐剂)的混合物悬浮到生理盐水或磷酸缓冲生理盐水中。该抗原肽也可作为与高级脂肪酸或辅助性T细胞抗原肽的共同结合体或与HLA-A24分子的复合体。该诱导剂中含有的抗原肽是每1种抗原肽占0.01～100重量百分比，优选含0.1～95重量百分比。
该CTL诱导剂可用做体外增殖本发明的CTL时培养基的添加物，以T淋巴细胞增殖活性，迟发型皮肤反应为指标的免疫应答状态的诊断等。例如作为培养基中的添加物使用时，其使用量是以培养基中的肽浓度达每1种抗原肽相当于1ng/ml～100μg/ml，优选10ng/ml～1μg/ml。
本发明的第5方案涉及制癌剂，它是以选自序列号1～6中任一序号记载的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的抗原肽作有效成分的。该制癌剂的提供形式是1)单独应用抗原肽，2)抗原肽与医药上允许的载体和/或稀释剂的混合物；或者3)必要时再向上述1)和2)中加入辅助剂。这里所讲的载体可以是，如人血清白蛋白，而稀释剂为，如磷酸缓冲液、蒸馏水、生理盐水等。另外补助剂可列举药学上所允许的上述佐剂。该制癌剂施用给人的时候，可用注射器施用给人，也可用喷雾等方法通过粘膜经皮吸收。该制癌剂中含有的抗原肽量为每1种抗原肽0.01～100重量％，优选0.1～95重量％。每个成人的施用量为，作为肽浓度，每种抗原肽的浓度0.1μg/kg～10mg/kg，优选1μg/kg～1mg/kg，更优选1μg/kg～100μg/kg。另外，施用给人的时候，没有观察到该肽的毒性。
使用该制癌剂的时候，也可与其它制癌剂并用，但不希望与具有免疫抑制作用的制癌剂并用。
本发明的第6方案涉及将抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到其细胞表面的抗原呈递细胞，而抗原肽选自序列号1～6任一序号记载的氨基酸序列所代表的HLA-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物。以下，本说明书中的“抗原呈递细胞”在没有特定说明的情况下，指的是呈递了选自MAGE-3抗原肽、MAGE-1抗原肽、CEA抗原肽和/或HER2/neu抗原肽中至少一个抗原肽的抗原呈递细胞。该抗原呈递细胞可用于本发明的CTL的诱导。
该抗原呈递细胞可通过应用具有抗原呈递能力的细胞进行制备。具有抗原呈递能力的细胞可列举，如能将抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到其细胞表面的以巨噬细胞、B细胞、树突状细胞(DC：dendritic cells)为代表的白细胞。因为DC每个细胞的抗原呈递量多，且对于抗原呈递所必要的细胞表面分子〔CD80、CD86等共刺激信号(co-stimnlatory signal)分子等〕的表达量也高，所以做为具有抗原呈递能力的细胞特别适宜。上述具有抗原呈递能力的细胞可从本说明书中体外摘取的样品中制备。例如，DC可用下面的任一种方法进行制备1)以几个细胞表面标记为基础从PBMC中分离提纯；2)用GM-CSF和IL-4从单核细胞来诱导3)用GM-CSF、TNF-α、SCF等细胞因子从CD34阳性细胞来诱导。
能将抗原肽呈递到具有抗原呈递能力的细胞表面的方法可列举，如将上述具有抗原呈递能力的细胞与抗原肽中的至少一种混合后，必要时洗净过剩量，将抗原肽负载到HLA-A24分子上。另外，对向上述制备具有抗原呈递能力细胞的方法1)中所制备的细胞那样已将与本发明无关的抗原肽呈递到HLA-A24分子上的细胞，可在负载抗原肽以前进行酸处理，除去HLA-A24分子上存在的不能诱导出本发明的CTL的肽。这种具有抗原呈递能力的细胞除可负载单一的抗原肽外，每个细胞也可负载多种的抗原肽。另外，作为其它的方法，可列举如对于B细胞和CD34阳性细胞，可通过应用能呈递上述抗原肽的表达载体来转化该细胞。这样的载体可列举通过重组DNA技术，将编码至少一种呈递到细胞表面的抗原肽的基因整合到pcDNA3、pMQMnes、pCEP4等商品化的质粒中的表达用质粒载体。再者，为了在细胞内有效地接受蛋白酶的分解，可在该表达载体中呈递到细胞表面的抗原肽的两端添加编码适当氨基酸序列的基因。再者，也可适当应用逆转录病毒载体和腺病毒载体。
优选抗原细胞没有增殖性。为了使细胞没有增殖性，可用X线等放射线进行照射或者用丝裂霉素(mitomycin)等试剂进行处理。
本发明的第7方案涉及CTL的诱导剂，该诱导剂以第6方案中的抗原呈递细胞作有效成分。该诱导剂是以将该抗原呈递细胞悬浮到保存细胞所适当的培养基、生理盐水、或磷酸缓冲生理盐水中的形式进行供给的。培养基一般是RPMI、AIM-γ、X-VIVO 10等培养基。另外为了使之稳定，可向该培养基或缓冲液中加入血清白蛋白。该诱导剂中含有的抗原呈递细胞为每种抗原呈递细胞103～5×106个/ml，优选104～106个/ml。
除用做体外增殖本发明的CTL的培养基的添加物之外，该CTL的诱导剂还可用于以T淋巴细胞增殖活性为指标的免疫应答状态的诊断。例如作为培养基中的添加物使用时，通常对于诱导CTL的淋巴细胞1以0.01～1的比率应用。
本发明的第8方案是含有以第6方案中的抗原呈递细胞作有效成分的制癌剂。该制癌剂是以将该抗原呈递细胞悬浮到医药上允许的稀释剂中的形式来提供的。这里所讲的稀释剂为适于保存细胞的培养基、磷酸缓冲液、生理盐水等。培养基一般为RPMI、AIM-γ、X-VIVO 10等培养基。另外，该制癌剂中可加入医药上允许的载体以使之稳定。这里所讲的载体为人血清白蛋白。该制癌剂中含有的抗原呈递细胞为，每1种抗原呈递细胞105～108个/ml，优选5×105～5×107个/ml。该制癌剂施用给人的时候可用注射器给予，或每个成人的施用量为，以抗原呈递细胞的数目计，每1种抗原呈递细胞通常为104～109个。上述范围只是大致标准，并不局限于此。另外，由于有效成分抗原呈递细胞来自所施用的人，所以该制癌剂无毒性。
使用该制癌剂的时候可与其它制癌剂并用，但不希望与具有免疫抑制作用的制癌剂并用。
本发明的第9方案涉及该CTL敏感性细胞的检测方法，它是以让第1方案中的CTL与待测细胞接触时所产生的变化为指标的。CTL与待检细胞中的敏感细胞相接触时所产生的变化可以是，如CTL对靶细胞的溶解、细胞因子游离或CTL增殖。靶细胞溶解的检测可这样进行，如用放射性同位素和荧光素标记待测细胞后，与CTL混合之时，通过测定被测细胞释放出的放射性同位素量和荧光素量进行。细胞因子释放的检测可通过测定从CTL或被测细胞释放出的GM-CSF、TNF、IFN-γ等的量来进行。另外CTL的增殖可通过细胞对3H-胸腺嘧啶核苷的摄取量的测定以及通过显微镜观察CTL的细胞数目来进行。通过这些变化可检测出被检细胞中所存在的HLA-A24和MAGE-3共阳性或HLA-A24和MAGE-3相关抗原共阳性的肿瘤细胞，HLA-A24和MAGE-1共阳性或HLA-A24和MAGE-1相关抗原共阳性的肿瘤细胞，HLA-A24和CEA共阳性或HLA-A24和CEA相关抗原共阳性的肿瘤细胞和/或HLA-A24和HER2/neu共阳性或HLA-A24和HER2/neu相关抗原共阳性的肿瘤细胞。
本发明的第10方案涉及第1方案中CTL敏感性细胞的检测剂，它含有以第1方案中的CTL作有效成分。该检测剂是以将该CTL悬浮到保存该CTL适用的培养基、生理盐水、或磷酸缓冲生理盐水的形式提供的。培养基一般为RPMI、AIM-γ或X-VIVO 10等。另外，可向该培养基或缓冲液中加入血清白蛋白等以使CTL稳定。该检测剂中含有第1方案中的CTL，每种CTL为104～108个/ml。
该检测剂除用以检测被检细胞中本发明的CTL的敏感性细胞外，还可鉴定被检细胞所表达的HLA是否为HLA-A24，对HLA进行分型。
本发明的第11方案涉及HLA分子的检测方法，其特征在于在至少一种选自HLA限制性抗原肽的抗原肽存在的条件下，让识别该抗原肽与HLA分子复合体的CTL与被检细胞相接触。
例如，可以以第1方案中的CTL与被检细胞相接触时所产生的变化为指标来检测被检细胞表面上的HLA-A24分子。作为CTL与被检细胞接触时所产生的变化可列举，如CTL对靶细胞的溶解、细胞因子的释放或CTL的增殖。靶细胞溶解的检测可这样测定，如用放射性同位素和荧光素标记被检细胞后与CTL混合，通过测定此时被检细胞释放出的放射性同位素的量和荧光素量来进行。细胞因子释放的检测可通过检测从CTL或被检细胞释放出的GM-CSF、TNF、IFN-γ等的量来进行。另外，CTL的增殖可通过细胞对3H-TdR摄取量的测定以及通过显微镜观察CTL的细胞数目来进行。
通过上述测定值不仅可检测出HLA-A24分子有无表达，而且能测定被检细胞上HLA-A24分子的表达量。然而在被检细胞是否表达MAGE-3、MAGE-1、CEA或HER2/neu不明确的情况下，可通过以下方法将HLA-A24分子检测出来。该方法中，反应液中共同存在被检细胞和终浓度为0.01～50μg/ml的选自序列号1～6任一序号记载的氨基酸序列所构成的抗原肽及其功能性衍生物的至少一个抗原肽，以及识别该抗原肽与HLA-A24分子的复合体的第1方案中的CTL，让CTL与被检细胞接触即可。
应用本发明可检测出肿瘤细胞的HLA-A24分子，而这是以往应用抗HLA抗体必须借助补体活化过程来检测HLA分子的检测方法所检测不出的。
另外，本发明中使用的抗原肽并不特别限定于选自序列1-6中任一氨基酸序列所表示的肽及其功能性衍生物的HLA-A24限制性抗原肽，它可应用各种HLA限制性抗原肽来检测各种HLA分子，例如应用HLA-A2限制性抗原肽也可检测出HLA-A2分子。作为HLA-A2限制性抗原肽可以是，如来自序列号37中MAGE-3的肽，来自序列号38中流感基质肽的肽。
另外，HLA的各种类型中还存在亚型。例如，HLA-A可分成以A*0201，A*0206，A*0207为代表的10种以上的亚型。由于HLA限制性抗原肽在各亚型间也不同，所以在作为制癌剂利用CTL的时候，连HLA分子的亚型也要决定，这一点是很重要的。应用抗HLA抗体来检测HLA分子的方法(分型)对亚型的分型是不可能的，而本方法可以。例如，应用具有序列号37中氨基酸序列的肽可诱导出A*0201限制性的CTL，将该CTL与该肽联合应用，可测定出被检细胞HLA-A2分子的亚型。另外本方法具有一个优点是应用从被检细胞提取出的DNA，通过DNA分型法可检测出细胞表面上实际表达的HLA分子。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明并不仅限于这些实施例。实施例1  MAGE-3抗原肽特异性CTL的制备(1)
本实施例中的CTL通过应用金黄色葡萄球菌(Staphylococwsauneus Cowan-1；SAC-1)的诱导方法来制备。(1)诱导CTL时应用的肽的选择及合成
对于由314个氨基酸构成的MAGE-3蛋白质的氨基酸序列，以具有HLA-A24结合性基元构造的序列(N末端第2位为Try、Phe、Trp、Met中的任一种氨基酸，C末端为Leu、Ile、Phe、Trp中的任一种氨基酸的肽)为中心。同时考虑其它位置的氨基酸种类进行检索。结果表明：作为MAGE-3抗原肽的候补肽，存在如表1所示的7种肽。
             表1
序列号   MAGE-3中的位置     名称
 8         76-84            MA3-62         113-121          MA3-49         142-150          MA3-110        142-151          MA3-511        150-158          MA3-71         195-203          MA3-212        195-204          MA3-3
表1中序列号这一项中的序号表示显示名肽的氨基酸序列的表的序列号。另外，MAGE-3中的位置这一项中的序号表示从MAGE-3蛋白质的N末端开始的氨基酸数。名称项中的符号表示本发明者们所命名的肽的名称。
可用肽合成仪(PSSM-8，岛津生产)通过固相Fmoc法来制备表1中所示的MA3-1～MA3-7七种肽。(2)PBMC的制备
按照成分采血从保有HLA-A24的健康人中采血，收集白细胞部分后再按以下的分离方法来分离PBMC。也就是说，用RPMI 1640培养基将所采血样约稀释2倍后，重悬到Ficoll-Paque分离液(Pharmacia公司)上，500×g室温离心20分钟。用吸管回收中间层的PBMC，洗净后悬浮到由90％胎牛血清(FCS，ィンタゲン公司)和10％二甲基亚砜(Sigma公司)构成的保存液中，保存在液氮中。(3)效应细胞(effector cell)的制备
用下列方法制备用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一种肽单独刺激所产生的5种效应细胞。
将(2)中制备的保存的PBMC复苏后，以细胞浓度在4×106个/ml的浓度悬浮到5H-RPMI中。5H-RPMI为向RPMI 1640培养基中添加了终浓度为5％(v/v)的人AB型血清(ァ-バィンサィェンス公司制)，终浓度为0.1mm的非必须氨基酸(Gibco BRL公司产)、终浓度为1mM的丙酮酸钠(Gibco BRL公司产)、终浓度为4mM的L-谷氨酸胺(Gibco BRL公司产)、终浓度为10μg/ml的硫酸庆大霉素(ァ-バィンサィェンス公司产)的培养基。将25ml细胞悬浮液加入到结合了抗CD4抗体的T-150培养瓶)AIS Micro(Ellector，ァプラィドィシュ-ンサィェンス公司制)中，室温反应1小时后，回收非粘附细胞，以2×106个/ml的浓度悬浮到5H-RPMI中。将该悬浮液分别与用MA3-1，MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一种肽按照后面实施例8(1)中的方法制备的经SAC-1处理的5种初次刺激用抗原呈递细胞分别等量混合，加入终浓度为15ng/ml的IL-7(ジェンザィム公司产)，24孔培养板中各孔注入2ml，在37℃的CO2培养箱中进行培养。第2天加入终浓度为10ng/ml的IL-10(R&D公司产)。6天后半量弃去培养上清，加入等量的含20ng/ml IL-7的5H-RPMI。
由培养3天后将细胞离心，回收，以细胞达2×106个/ml的浓度悬浮到5H-RPMI中。将该悬浮液以1ml/孔加入到含有用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7中任一种肽按照后面实施例8(2)的方法制备的抗原呈递细胞的培养板中，用同肽进行再刺激。次日，加入终浓度为10ng/ml的IL-10，再每隔2日，半量弃除培养上清，加入等量含20IU/ml γIL-2(盐野义制药公司产)的5H-RPMI，在CO2培养箱中培养1周。同样的刺激再进行3次后回收细胞，作为效应细胞。(4)CTL靶细胞的制备
用表达HLA-A24的EBV转化的B细胞TISI(WSNO 9042)作为测定细胞杀伤活性的靶细胞。首先在测定前一天，在单独含有10μg/ml的(1)中制备的MA3-1、MA3-2、MA3-6、MA3-4、MA3-7中任一种肽的5种培养基(以下将在该培养基中培养的TISI用TISI(+)表示)或不含有肽的培养基〔以下将在该培养基中培养的TISI用TISI(-)表示〕中将TISI细胞培养一晚。测定当天，将5种TISI(+)和TISI(-)细胞各5×106个分别加入到200μCi的Na2 51CrO4溶液中，37℃下混合1小时，其后用含有10％FCS的RPMI1640培养液洗净，这样制备出51Cr标记的标记性靶细胞。(5)CTL的细胞杀伤活性的测定
用5H-RPMI将(3)中的效应细胞稀释为5×105～1×106个/ml后，以每孔100μl加入到96孔培养板的各孔中，然后加入含有(4)中制备的1×104个51Cr标记的靶细胞和3×105个K562细胞的100μl细胞悬浮液。K562细胞用于去除混入的NK细胞的非特异性杀伤活性。
将上述细胞悬浮液在400×g离心1分钟后，于37℃的CO2培养箱中放置5小时。其后将各孔的培养上清吸取100μl，用γ计数器测定游离的51Cr的量。
按下面的公式(数1)计算特异性细胞杀伤活性。特异性细胞杀伤活性(％)＝〔(各孔的测定值-最小释放值)
          /(最大释放值-量小释放值)〕×100(数1)
上式(数1)中，最小释放值是指加入靶细胞和K562细胞的孔的51Cr量，是靶细胞的51Cr的自然释放量。最大释放值表示向靶细胞中加入表面活性剂Triton X-100，破坏细胞时51Cr的释放量。结果如表2所示。
                 表2
肽的名称 E/T    特异性细胞杀伤活性TISI(-)        TISI(+)
  MA3-1MA3-2MA3-4MA3-6MA3-7     101055.810   1.6            0.86.6            65.63.1            3.40.8            0.017.0           13.7
表2中E/T表示效应细胞与靶细胞的比率。结果显示：用MA3-2诱导的效应细胞对添加了MA3-2肽的TISI(+)细胞具有抗原特异性细胞杀伤活性。实施例2  MAGE-3抗原肽特异性CTL的制备(2)
本实施例中的CTL是通过应用KLH的诱导方法来制备的。抗原肽使用实施例1的(1)中制备的MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6和MA3-7五种肽。(1)PBMC的制备
从保有HLA-A24的健康人中采血，按照以下的分离方法分离PBMC。即，将所采血液悬浮到等量的RPMI 1640培养液中，重悬到Ficoll-paque分离液上，500×g室温离心25分钟。用吸管回收中间层的PBMC，加入到15ml的离心管中，用RPMI 1640培养基洗涤3次。然后以终浓度为4×106个/ml将细胞悬浮到5H-RPMI中。(2)效应细胞的制备
按照以下方法制备用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7任一种肽个别刺激所产生的5种效应细胞。
将(1)中制备的PBMC与加入了20μg/ml肽的5H-RPMI等量混合后，在37℃的CO2培养箱中放置2～3小时。向其中加入终浓度分别为5μg/ml、25ng/ml的KLH(カルビォケム公司产)溶液和IL-7溶液，以2ml/孔将该细胞悬浮液加到24孔培养板的2孔中，37℃的CO2培养箱中培养。3天后，加入60μl含有1000IU/ml γIL-2的5H-RPMI(γIL-2的终浓度为30IU/ml)。
培养1周后，离心回收细胞，以5×103个/ml的浓度将细胞悬浮到5H-RPMI中。将该悬浮液以1ml/孔加入到含有任何一种按照后面实施例8(4)中的方法，用MA3-1、MA3-2、MA3-4、MA3-6、MA3-7任一种肽制备的抗原呈递细胞的5种培养板中，进行再刺激。次日加入60μl γIL-2溶液(1000IU/ml)，CO2培养箱中培养1周，同样的再刺激再进行4次后，回收细胞作为效应细胞。
将用上述方法所得到的5种效应细胞以4×106个/ml的浓度悬浮到5H-RPMI中。(3)CTL靶细胞的制备
除应用与实施例1(4)同样制备的TISI(-)，5种TISI(+)细胞作标记的靶细胞外，还应用MAGE-3及HLA-A24共阳性的WiDr(大肠癌细胞株)、TEll(食道癌细胞株)、MRKnu1(乳腺癌细胞株)。还使用了MAGE-3阳性、HLA-A24阴性的癌细胞株KATO-III(胃癌细胞株)。WiDr、TEll、MRKnu1和KATO-III各5×106个细胞在200μCi的Na2 51CrO4溶液中，37℃下混合1小时，其后用含有10％FCS的RPMI 1640培养液洗涤，由此进行51Cr标记。(4)CTL的细胞杀伤活性的测定
用(2)中制备的效应细胞和(3)中制备的靶细胞测定细胞的杀伤活性。用TISI(-)和TISI(+)细胞作靶细胞的时候，用与实施例1(5)相同的方法进行测定。但效应细胞和靶细胞的反应时间为4.5小时。用其它4种标记的癌细胞株作靶细胞的时候，向96孔培养板的各孔中以100μl/孔(4×105个/孔)分别加入上述(2)中的效应细胞悬浮液，然后加入含5×103个51Cr标记的靶细胞和1.5×105个K562细胞的100μl的细胞悬浮液。400×g离心1分钟后，在37℃的CO2培养箱中放置4.5个小时。其后吸取100μl各孔的培养液上清，用γ计数器来测定释放的51Cr量。特异性细胞杀伤活性的计算与实施例1(5)相同。结果如表3所示。
                              表3
肽的名称 E/T             特异性细胞杀伤活性TISI(-)   TISI(+)   WiDr  TEll   MRKnu1
 MA3-1MA3-2MA3-4MA3-6MA3-7     8080808080   27.6      51.7      ND    ND     ND7.4       60.5      51.5  39.0   20.95.4       39.4      48.7  29.1   27.68.7       14.8      ND    ND     ND21.8      39.4      ND    ND     ND
表3中E/T为效应细胞与靶细胞的比率，ND表示未进行测定。
由表，由MA3-2或MA3-4诱导的效应细胞在各种E/T情况下对TISI(-)和TISI(+)细胞的特异性杀伤活性曲线如图1和图2所示，在各种E/T条件下对WiDr、TEll、MRKnu1细胞的特异性杀伤活性曲线如图3和图4所示。
图1是应用MA3-2所诱导的效应细胞的结果，图2是应用MA3-4所诱导的效应细胞的结果。另外四角符号(□)表示用TISI(+)细胞作靶细胞的结果，菱形(◇)表示用TISI(-)作靶细胞的结果。白圆(○)表示用MRKnu1作靶细胞的结果。
图3是应用MA3-2所诱导的效应细胞的结果，图4是应用MA3-4所诱导的效应细胞的结果，菱形(◇)表示用TE-I1作靶细胞的结果。空心圆(○)表示用MRKnu1作靶细胞的结果。
图3及图4中所示的细胞杀伤活性可被反应系中共存的I类抗体(W6/32)所抑制。另外，由MA3～2或MA3-4所诱导的效应细胞对MAGE-3阳性及HLA-A24阴性的癌细胞株KATO-III无细胞杀伤活性。
由以上结果可知，由MA3-2、MA3-4肽所诱导的效应细胞具有抗原特异性的细胞杀伤作用，并且是对HLA-A24及MAGE-3共阳性癌细胞有细胞杀伤作用的CTL。实施例3  MAGE-1抗原肽特异性CTL的制备
本实施例中的CTL是应用KLH诱导法来进行制备的。(1)诱导CTL所用肽的筛选和合成
与实施例1(1)同样，对于由309个氨基酸构成的MAGE-1蛋白质的氨基酸序列〔分子免疫学(Molecular Immunology)，第31卷，第1423～1430页(1994)〕，以具有HLA-A24结合性基元结构的序列为中心，同时考虑其它位置的氨基酸种类进行检测，结果如表4所示，筛选了5种肽作为候补抗原肽。
              表4
  序列号    MAGE-1中的位置    名称
  3         135-143           MA1-114        135-144           MA1-313        188-196           MA1-215        188-197           MA1-416        275-284           MA1-5
表4中的序列号这一项中的序号代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列号。另外，MAGE-1中的位置这一项中的序号表示MAGE-1蛋白质从N末端的氨基酸数。名称这一项中的符号表示由本发明者们命名的肽的名称。
可用肽合成仪合成表4中所示的MA1-1～MA1-5的5种肽。(2)依照应用KLH的诱导方法来制备MAGE-1抗原肽特异性CTL
用与实施例2(2)同样的方法，应用按后面实施例8(4)中的方法，用实施例3(1)中制备的MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中的任一种肽和MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中的任一种肽制备的抗原呈递细胞来制备效应细胞，测定其对各种靶细胞的细胞杀伤活性。除应用TISI(-)和用添加了MA1-1、MA1-2、MA1-3、MA1-4、MA1-5中任一种肽的培养基培养的5种TISI(+)作靶细胞外，还应用了MAGE-1和HLA-A24共阳性的NUGC-3(胃癌细胞株)、TE-11、MAGE-1阳性和HLA-A24阴性的KATO-III、MAGE-1和HLA-A24共阳性的Raji(淋巴瘤)作靶细胞。由MA1-1所诱导的效应细胞在各种E/T条件下对各种靶细胞的特异性细胞杀伤活性曲线如图5所示。
图5中实心圆(●)表示用NUGC-3作靶细胞的结果，黑四角(■)表示用TEll，倒三角()表示用KATOIII，菱形(◇)表示用Raji，三角形(△)表示用TISI(-)作靶细胞的结果。
再者，对用添加了MA1-1的培养基所得到的TISI(-)、图5所示的NUGC-3细胞株以及TE-11细胞株的细胞杀伤活性，可被反应系中共存的I类抗体所抑制。
因此该结果表明，用MA1-1诱导的效应细胞是针对HLA-A24和MAGE-1共阳性的癌细胞株的CTL。实施例4  CEA抗原肽特异性CTL的制备(1)
与实施例1同样，本实施例中通过应用SAC-1的CTL的诱导方法来制备CTL。(1)诱导CTL所用肽的选择和合成
对于由464个氨基酸构成的CEA蛋白质的氨基酸，以其有HLA-A24结合性基元结构的序列为中心，同时考虑其它位置的氨基酸的种类来进行检索。结果如表5所示，证明存在5种肽。
              表5
  序列号  CEA蛋白质中的位置   名称
  17      101-109             CE-118      234-242             CE-54       268-277             CE-219      318-326             CE-45       652-660             CE-3
表5中序列号项中的序号代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列号。另外，CEA蛋白质中的位置这一项中的序号表示由CEA蛋白质中N末端开始的氨基酸数。名称项中的代号表示由本发明人命名的肽的名称。
表5中所示的5种肽可用肽合成仪进行合成。(2)效应细胞的制备
应用与实施例1(2)同样的方法制备的保存PBMC、按照后面实施例8(1)的方法用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一种肽制备的须SAC-1处理的初次刺激用抗原呈递细胞以及含有任何一种用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一种肽按照后面实施例8(2)的方法制备的抗原呈递细胞的5种培养板，用与实施例1(3)同样的方法制备用CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一种肽个别刺激的4种效应细胞。(3)CTL靶细胞的制备
可应用与实施例1(4)同样的方法，用添加了CE-1、CE-3、CE-4、CE-5中任一种肽的培养基培养所得的5种TISI(+)和胃癌细胞株KMN-45(HLA-A24及CEA阳性)，作为用于测定细胞杀伤活性的靶细胞。与实施例1(4)的方法相同，在测定细胞杀伤活性的当天标记上述各细胞。(4)CTL的细胞杀伤活性的测定
应用(2)中的效应细胞和(3)中的靶细胞，按与实施例1(5)相同的方法计算出特异性细胞杀伤活性。
结果如表6所示。
                     表6
  肽名   E/T   TISI(-)   TISI(+)   MKN-45
  CE-1CE-3CE-4CE-5   10101010   24.8      86.7      0.01.9       92.5      9.27.5       5.9       0.24.8       4.6       0.0
表6中E/T表示效应细胞对靶细胞的比例。
结果显示，用CE-3诱导所得的效应细胞对添加了CE-3肽的培养基所培养的TISI(+)具有抗原肽特异性细胞杀伤活性，同时对MKN-45也有细胞杀伤活性。实施例5  CEA抗原肽特异性CTL的制备(2)
本实施例中的CTL是通过应用抗原呈递用的树突状细胞(DC)来进行诱导而制备的。
从健康人的PBMC诱导识别对于实施例4(1)中制备的CE-2和CE-3两种肽的效应细胞，测定其细胞杀伤活性。(1)效应细胞的制备
按下述方法制备用CE-2或CE-3任一种肽个别刺激的2种效应细胞。
将实施例1(2)中制备的PBMC融解后，以2×107个/ml的细胞浓度悬浮到4℃的含1％人AB型血清的PBS(以下略作1H PBS)中。每2×107个/ml的PBMC中，加入14μl的结合了用1H PBS洗涤后的抗CD8抗体的珠子(Dynabeads M450，ダィナル公司产)，4℃下反应1小时后，除去非粘附细胞。除去非粘附细胞后，相对于最初用的细胞数1×108个，悬浮到0.9ml的1H-PBS中，加入0.1ml的细胞解离用珠子(DETACHaBEAD，ダィナル公司产)。室温混合1小时后回收解离的细胞，用1H-PBS洗涤。将洗净的细胞悬浮到5H-RPMI中，达到2×106个/ml，分别与按实施例8(3)的方法用CE-2或CE-3任一种肽制备的DC悬浮液等量混合。向该悬浮液中加入终浓度为10ng/ml的IL-7，每孔0.5ml，分别加入到48孔培养板中，在37℃的CO2培养箱中培养。次日加入50μl含100ng/ml IL-10的5H-RPMI。
1周后除去各孔的培养上清，将细胞悬浮到0.5ml的5H-RPMI中。将该悬浮液加入到含有任何一种用CE-2或CE-3中任一种肽按实施例8(2)的方法制备的抗原呈递细胞的培养板中，进行再刺激。次日加入终浓度为10mg/ml的IL-10，再每隔2日，去除半量培养上清，加入等量含20IU/ml γIL-2的5H-RPMI，在37℃的CO2培养箱中培养1周。再进行同样的再刺激3次后，测定各孔中的效应细胞对TISI(+)、TISI(-)的细胞杀伤活性，再单独用抗CD3抗体或用作刺激抗原的肽使显示细胞杀伤活性的效应细胞增殖。将增殖的细胞悬浮到5H-RPMI中用下面(3)的方法测定细胞杀伤活性。(2)CTL靶细胞的制备
与实施例4(3)同样，制备TISI(-)和用添加了CE-2或CE-3的培养基培养的2种TISI(+)作为靶细胞。另外用100IU/ml的IPN-γ37℃处理MKN-45 48小时。在测定细胞杀伤活性的当天，按与实施例4(3)同样的方法用51Cr标记上述4种靶细胞。(3)CTL的细胞杀伤活性的测定
应用(1)中制备的效应细胞和(2)中制备的标记靶细胞，用与实施例1(5)同样的方法测定细胞杀伤活性。结果如表7所示。
                   表7
  肽名   E/T   TISI(-)  TISI(+)  MKN-45
  CE-2CE-3   1010   0.9      89.1     25.81.9      92.0     67.9
表7中E/T表示效应细胞对靶细胞的比例。
结果表明，CE-2或CE-3任一种肽所诱导的效应细胞对TISI(+)和MKN-45显示抗原肽特异性的细胞杀伤活性，它是CEA特异性CTL。实施例6  HER2/neu抗原肽特异性CTL的制备(1)
本实施例中CTL的制备与实施例1同样，应用SAC-1进行CTL的诱导。(1)诱导CTL所用肽的选择及合成
对于由1255个氨基酸构成的HER2/neu蛋白质的氨基酸序列，以具有HLA-A24结合性基元结构的序列为中心，考虑其它位置的氨基酸种类进行检索。结果如表8所示，选择了5种肽，用肽合成仪来合成了它们。
            表8
 序列号  HER2/neu蛋白质中的位置  名称
 6       8-16                    HE-120      440-448                 HE-421      780-788                 HE-222      907-915                 HE-523      951-959                 HE-3
表8中序列号这一项中的序号代表表示各肽的氨基酸序列的序列表的序列号。另外，HER2/neu蛋白质中的位置项中的序号表示HER2/neu蛋白质中从N末端开始的氨基酸数。名称项中的代号表示本发明人命名的肽。(2)效应细胞的制备
按下述方法制备了用HE-1～HE-5中任一种肽个别刺激的5种效应细胞。
应用实施例1(2)中制备的保存PBMC，用HE-1～HE-5中任一种肽按后面实施例8(1)中记载的方法制备的经SAC-1处理的初次刺激用抗原呈递细胞，以及含有任何一种用HE-1～HE-5任一种肽按后面实施例8(2)的方法制备的抗原呈递细胞的5种培养板，用与实施例1(3)同样的方法制备由HE-1～HE-5任一种肽刺激的效应细胞。(3)CTL靶细胞的制备
应用与实施例1(4)同样的方法，应用含有HE-1～HE-5任一种肽的培养基所培养的5种TISI(+)及卵巢癌细胞株SKOV3(HLA-A3及HER2/neu阳性)及其HLA-A24转化株SKOV-A24(HLA-A24及HER2/neu阳性)作为测定细胞杀伤活性的靶细胞。估测定细胞杀伤活性的当天，按与实施例1(4)同样的方法再用51Cr标记上述细胞。(4)CTL的细胞杀伤活性的测定
应用(2)中的效应细胞和(3)中的靶细胞，用与实施例1(5)同样的方法计算特异性细胞杀伤活性。结果如表9所示。
                      表9
  肽名   E/T   TISI(-)  TISI(+)  MKN-45
  HE-1HE-2HE-3HE-4HE-5   1010101010   5.3      41.9     4.31.4      0.0      0.468.3     67.2     0.00.4      0.7      0.00.0      9.4      0.9
表9中E/T表示效应细胞与靶细胞的比例。
该结果显示HE-1诱导出的效应细胞对用添加了HE-1肽的培养基培养的TISI(+)具有抗原肽特异性的细胞杀伤作用。实施例7  HER2/neu特异性CTL的制备(2)
本实施例中的CTL是通过应用抗原呈递用的树突状细胞(DC)进行诱导的方法来制备的。
用健康人的PBMC诱导识别实施例6(1)中制备的HE-1肽的效应细胞，测定细胞的杀伤活性。(1)效应细胞的制备
应用实施例1(2)中制备的PBMC，用HE-1肽按后面实施例8(3)中的方法制备的DC，以及含有用HE-1肽按后面实施例8(2)中的方法制备的抗原呈递细胞的培养板，按与实施例5(1)同样的方法制备用HE-1肽刺激出的效应细胞。(2)CTL靶细胞的制备
与实施例6(3)同样制备TISI(-)、用添加了HE-1的培养基培养的TISI(+)作为靶细胞。用100U/ml的IFN-γ处理SKOV3和SKOV3-A24，37℃处理48小时。在测定细胞杀伤活性的当天，按与实施例1(4)相同的方法用51Cr标记上述4种靶细胞。(3)CTL的细胞杀伤活性的测定
应用(1)中制备的效应细胞和(2)中制备的靶细胞，按与实施例1(5)同样的方法测定细胞杀伤活性。结果如表10所示。
                       表10
    E/T  TISI(-)  TISI(+)  SKOV3-A24  SKOV3
    45155  8.4      86.2     14.4       6.23.0      74.6     10.4       5.63.6      49.1     6.8        3.5
表10中E/T表示效应细胞与靶细胞的比例。
结果显示用HE-1肽诱导的效应细胞对TISI(+)及SKOV3-A24具有抗原特异性细胞杀伤作用，这表明它是HER2/neu特异性CTL。实施例8  非增殖性抗原呈递细胞的制备(1)经SAC-1处理的抗原呈递细胞的制备
将实施例1(2)中制备的保存PBMC融解后，悬浮到5H-RPMI中，使细胞浓度为2×106个/ml。向细胞悬浮中加入终浓度为0.005％的SAC-I(Pansorbin cells，カルビォケム公司产)，终浓度为20μg/ml的免疫珠(兔抗人IgM，バィォラド公司产)，再加入终浓度为20ng/ml的IL-4(ジェンザィム公司产)，加入到6孔培养板中，5ml/孔，在37℃的CO2培养箱中培养4天。用含有终浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水洗涤培养了4天的细胞，以1×107个/ml的浓度将细胞悬浮到含有1％BSA和3μg/ml β2微球蛋白的柠檬酸缓冲液(pH3.0)中后，冰中处理2分钟。然后用5倍细胞悬液体积的含有1％BSA、3μg/ml β2微球蛋白和10μg/ml肽的磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤细胞后，悬浮到含有1％BSA、3μg/ml β2-微球蛋白和50ug/ml肽的磷酸缓冲液中，20℃下反应4小时。反应后进行X线照射(5500Rad)，以1×106个/ml的浓度将细胞悬浮到5H-RPMI中，作为初次刺激用的抗原呈递细胞。(2)由粘附细胞制备抗原呈递细胞
将实施例1(2)中制备的PBMC融解后，用X线照射(5500Rad)。然后将悬浮到5H-PBMC细胞浓度达4×106个/ml的细胞悬液加到24孔培养板中，1ml/孔，在CO2培养箱中培养1.5小时。其后吸去难粘附细胞，再用RPMI 1640洗涤各孔以除去非粘附细胞。然后各孔中加入0.5ml含有3μg/ml β2微球蛋白和20μg/ml肽的5H-RPMI，CO2培养箱中培养，2小时后吸去上清，用5H-RPMI洗涤1次，各孔中残余的细胞作为再刺激用的抗原呈递细胞。(3)富含DC的抗原呈递细胞的制备
将实施例2(1)中制备的保存PBMC融解后，悬浮到5H-RPMI中，使细胞浓度达2×106个/ml，将10ml该细胞悬浮液加入到T-25培养瓶(ヲンケ公司产)中。37℃下放置1.5小时后，去除非粘附细胞，向剩余的粘附细胞中加入10ml含有1000U/mlGM-CSF(ジェンザィム公司制)和2000U/ml IL-4(ジェンザィム公司制)的5H-RPMI，在37℃的CO2培养箱中培养，诱导DC细胞。7日后回收浮游细胞。将粘附细胞回收到细胞解离缓冲液(Gibco BRL公司产)中，用5H-RPMI洗涤后与浮游细胞结合。将回收细胞悬浮到含有40μg/ml肽，3μg/ml β2微球蛋白，加入了1％人血清白蛋白的生理盐水中，使细胞达3×106个/ml，在20℃的恒温箱中反应4小时。反应后用X线照射(5500Rad)，然后用加入了1％人血清白蛋白的生理盐水稀释，达到1×106个/ml，作为抗原呈递细胞。(4)由全PBMC制备抗原呈递细胞
用丝裂霉素处理〔PBMC1×107个/ml的悬浮液中加入丝裂霉素C，使其终浓度成200μg/ml(ICNバィォメディカルズ公司产)，放置30分钟〕用与实施例2(1)同样的方法制备的PBMC，用RPMI1640培养基洗涤3次后，与加入1的肽达20μg/ml的5H-RPMI等量混合，然后分加到24孔培养板中，1ml/孔，作为抗原呈递细胞使用。实施例9  CEA抗原肽功能性衍生物的制作(1)CE-2变异体及CE-3变异体的合成
以实施例5(1)中合成的CE-2为基础，如表11所示设计了12种变异体。
                  表11
          序列号      名称
          24          CE-201
          25          CE-202
          39          CE-203
          40          CE-204
          41          CE-205
          42          CE-206
          43          CE-207
          44          CE-208
          45          CE-209
          46          CE-210
          47          CE-211
          48          CE-212同样，如表12所示，以CE-3为基础设计了17种变异体。
                  表12
          序列号      名称
          26          CE-301
          27          CE-302
          28          CE-303
          29          CE-304
          30          CE-305
          31          CE-306
          32          CE-307
          49          CE-308
          50          CE-309
          51          CE-310
          52          CE-311
          53          CE-312
          54          CE-313
          55          CE-314
          56          CE-315
          33          CE-316
                      CE-317
用肽合成仪制备了表11和12中所示的CE-201～CE212和CE-301～CE-315的27种肽。
表12中CE-316的制作是，向实施例5(1)中制作的CE-3(2.85μmo1)中加入100μl的DHCP(宝酒造公司产)水溶液(10mg/ml)，37℃反应19小时后，用HPLC进行纯化。
另外，CE-317是2分子的CE-3借助于序列号5所表示的CE-3的氨基酸序列中，N末端第4位的半胱氨酸的硫醇基，通过二硫键而结合成的CE-3的二聚体。本肽的制作是将CE-3以0.3mM的浓度溶解在0.02M NH4HCO3水溶液中，37℃下反应24小时后用HPLC进行纯化。(2)CE-2或CE-3功能性衍生物的鉴定
确认了实施例4中获得的识别CE-2或CE-3与HLA-A24分子的复合体的CTL是否识别表11及表12中所示的肽或肽的类似体与HLA-A24分子的复合体。
首先确认了用与实施例4(2)同样的方法制备的识别CE-2的CTL是否对51Cr标记的TISI(-)细胞以及用CE-201～CE-212肽中的任一种按实施例4(3)中的方法制备的12种51Cr标记的TISI(+)细胞具有杀伤活性。结果显示识别CE-2的CTL对用添加了CE-201、CE-203、CE-204、CE-206、CE-207、CE-208、CE-209、CE-210、CE-212的培养基所培养得到的51Cr标记的TISI(+)细胞有显著的细胞杀伤活性。而该CTL对51Cr标记的TISI(-)细胞没有细胞杀伤活性，由此说明CE-201、CE-203、CE-204、CE-206、CE-207、CE-208、CE-209、CE-210、CE-212为CE-2的功能性衍生物。
以4个健康人的PBMC作研究对象，用与实施例4(2)中同样的方法制备出4种识别CE-3而原材料不同的CTL，确认其是否对51Cr标记的TISI(-)细胞及用表12中所示的17种肽中的任一种按实施例4(3)的方法制备的17种51Cr标记的TISI(+)细胞具有细胞杀伤作用。结果显示识别CE-3的CTL对培养基中添加了CE-301、CE-302、CE-305、CE-307、CE-310、CE-311、CE-312、CE-314、CE-316、CE-317中任一种肽所培养出的10种51Cr标记的TISI(+)有明显的细胞杀伤活性，而该CTL对51Cr标记的TISI(-)细胞无细胞杀伤活性，这表明CE-301、CE-302、CE-305、CE-307、CE-310、CE-311、CE-312、CE-314、CE-316、CE-317为CE-3的功能性衍生物。实施例10  应用CTL检测HLA-A24分子
以人的PBMC作被检细胞来检测用本发明的CTL能否检测出HLA-A24分子。
应用以往方法中的抗HLA抗体判明所表达的HLA类型的8人，按与实施例1(2)同样的方法，从这8人中制备PBMC，作为被检细胞PBMC的8个待检体。将各待检体分为2组，一组分别悬浮到溶解的CE-3达10μg/ml的5H-RPMI中，作为添加CE-3的待检组。而另一组分别悬浮到5H-RPMI中，作为未添加CE-3的待检组。各组在37℃放置2小时后通过离心回收细胞，除去上清。通过该操作以去除CE-3添加组中过剩的CE-3。然后将上述16种细胞悬浮到5H-RPMI后，以各孔1×104个分加到96孔微孔培养板中。然后向各孔中加入实施例5中用CE-3得到的CTL3×104个，37℃ CO2培养箱中放置22小时后，用Dnoset，Genzyme公司制，测定各孔上清中的IPN-γ量。结果证实，只在加入了从CE-3添加组中表达HLA-A24分子的人制备的5个PBMC待检体的孔中有IPN-γ存在。由此表明应用本发明的CTL可检测出HLA-A24分子。
另一方面，在CE-3添加组中观测到IPN-γ存在的PBMC待检体中，孔中加入的PBMC待检体来自HLA-A24同源的人时其IPN-γ量为来自HLA-A24异源人的2倍左右。由此表明，应用本发明的CTL可推算出HLA-A24的表达量。实施例11  用CTL对HLA-A2分子的检测和对HLA-A2亚型的鉴定
应用来自序列号37中氨基酸序列所表示的MAGE-3的HLA-A2限制性肽FLWGPRALV，用与实施例1(3)中同样的方法，从保有HLA-A2(A*0201)的健康人的PBMC制备效应细胞。在测定细胞杀伤活性的前一天用含有上述肽10μg/ml的培养基(.221(A2.1)(+))或不含肽的培养基(.221(A2.1)(-))培养作为靶细胞的HLA-A2细胞-.221(A2.1)细胞。测定当天，51Cr标记的.221(A2.1)(+)或.221(A2.1)(-)细胞与效应细胞混合，5小时后测定培养基中游离的51Cr量。结果表明，制备的效应细胞是具有肽特异性杀伤活性的CTL。另外，.221(A2.1)(+)或.221(A2.1)(-)细胞与CTL混合1日后测定其上清中的IFN-γ时发现，效应细胞CTL可释放肽特异性IFN-γ。扩增该CTL后检测其对各种HLA-A2细胞有无肽特异性IFN-γ的释放作用。1)对成株细胞.221(A2.1)(HLA-A*0201)、CLA(HLA-A*0206)、FUN(HLA-A*0203)、p815(HLA-A*0202)的反应性
向上述各细胞中加入10μg/ml的肽FLWGPRALV，37℃培养4小时。洗去过剩的肽以后，以1×104个/0.1ml/孔加入到96孔微量板中，反应20个小时。用未加肽的细胞作对照，同样与CTL细胞进行反应。从反应液中吸取上清，适当稀释后测定IFN-γ的含量。结果表明该CTL只对.221(A2.1)(HLA-A*0201)引起肽特异性IFN-γ的释放。2)对人PBMC的反应性
向3个健康的自愿者的PBMC(A氏：HLA-A*0207/A11；B氏：A*0206/A24；C氏：A*0201/A*0206)中加入达10μg/ml的肽FLWGPRALV，37℃培养2小时。洗去过剩的肽以后，以1×104个/0.1ml/孔加入到96孔微量板中，向其中加入CTL细胞1×104个/0.1ml/孔，反应20小时。用未添加肽的细胞作对照，同样与CTL进行反应，从反应液吸取上清，适当稀释后测定IFN-γ的含量。结果表明，该CTL只对具有HLA-A*0201的C氏的PBMC能引起肽特异性IFN-γ游离。
由以上1)、2)的结果，表明通过应用HLA-A2限制性肽及用该肽从HLA-A*0201的PBMC诱导出的CTL不仅能对被检细胞进行DNA分型，甚至可鉴定HLA-A2的亚型。序列表独立章节：
序列号33中氨基酸序列的第4位氨基酸为2-羟基-4(R，S)-L-半胱氨酸-S-基-2-环戊烯-1-酮。
产业上利用的可能性
本发明的CTL对HLA-A24和MAGE-3共阳性、HLA-A24和MAGE-1共阳性、HLA-A24和CEA共阳性或HLA-A24和HER2/neu共阳性的肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，可用作用于癌症治疗的细胞药物，另外可用于检测体外摘取的样品中有无HLA-A24和MAGE-3共阳性的肿瘤细胞、HLA-A24和MAGE-1共阳性、HLA-A24和CEA共阳性、或者HLA-A24及HER2/neu共阳性的肿瘤细胞，再者当与抗原肽同时使用时可用于体外摘取的样品中细胞的HLA分型。另外，本发明的抗原呈递细胞可用于该CTL的制备或用作制癌剂。再者，以本发明的抗原肽作有效成分的医药用复合物可用作CTL的诱导剂，或用作制癌剂。
                     序列表<110>宝酒造株式会社<120>细胞毒T淋巴细胞<130>98-029-PCT<160>56<210>1<211>9<212>蛋白质<213>人<400>1Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile1               5<210>2<211>9<212>蛋白质<213>人<400>2Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu1               5<210>3<211>9<212>蛋白质<213>人<400>3Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile1               5<210>4<211>10<212>蛋白质<213>人<400>4Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>5<211>9<212>蛋白质<213>人<400>5Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>6<211>9<212>蛋白质<213>人<400>6Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu1           5<210>7<211>9<212>蛋白质<213>人<400>7Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1               5<210>8<211>9<212>蛋白质<213>人<400>8Asn Tyr Pro Leu Trp Ser Gln Ser Tyr1               5<210>9<211>9<212>蛋白质<213>人<400>9Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile1               5<210>10<211>10<212>蛋白质<213>人<400>10Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe1               5                  10<210>11<211>9<212>蛋白质<213>人<400>11Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu1               5<210>12<211>10<212>蛋白质<213>人<400>12Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile1               5                  10<210>13<211>9<212>蛋白质<213>人<400>13Ile Met Pro Lys Thr Gly Phe Leu Ile1               5<210>14<211>10<212>蛋白质<213>人<400>14Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe1           5                      10<210>15<211>10<212>蛋白质<213>人<400>15Ile Met Pro Lys Thr Gly Phe LeuIle Ile1               5                 10<210>16<211>10<212>蛋白质<213>人<400>16Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile1               5                  10<210>17<211>9<212>蛋白质<213>人<400>17Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile1               5<210>18<211>9<212>蛋白质<213>人<400>18Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile1               5<210>19<211>9<212>蛋白质<213><400>19Val Tyr Ala Glu Pro Pro Lys Pro Phe1               5<210>20<211>9<212>蛋白质<213>人<400>20Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile1               5<210>21<211>9<212>蛋白质<213>人<400>21Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp1               5<210>22<211>9<212>蛋白质<213>人<400>22Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu1               5<210>23<211>9<212>蛋白质<213>人<400>23Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu1               5<210>24<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>24Gln Tyr Ser Trp Phe Ile Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>25<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>25Gln Tyr Ser Trp Leu Ile Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>26<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>26Ala Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>27<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>27Thr Tyr Ala Ala Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>28<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>28Thr Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Leu1               5<210>29<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>29Thr Tyr Ala Cys Phe Ala Ser Asn Leu1               5<210>30<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>30Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ala Asn Leu1               5<210>31<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>31Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Ala Leu  1               5<210>32<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>32Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Ala1               5<210>33<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>MOD_RES<222>4<223>Xaa是2-羟基-4(R，S)-L-半胱氨酸-S-基-2-环戊烯-1-酮<400>33Thr Tyr Ala Xaa Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>34<211>9<212>蛋白质<213>人<400>34Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu1               5<210>35<211>9<212>蛋白质<213>人<400>35Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu1               5<210>36<211>9<212>蛋白质<213>人<400>36His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val  1               5<210>37<211>9<212>蛋白质<213>人<400>37Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val1               5<210>38<211>9<212>蛋白质<213>流感病毒<400>38Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1               5<210>39<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>39Ala Tyr Ser Trp Phe ValAsn Gly Thr Phe1               5                 10<210>40<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>40Gln Ala Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>41<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><22>变异体<400>41Gln Tyr Ala Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>42<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>42Cln Tyr Ser Ala Phe Val Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>43<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>43Gln Tyr Ser Trp Ala Val Asn Gly Thr Phe  1               5                 10<210>44<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>44Gln Tyr Ser Trp Phe Ala Asn Gly Thr Phe1               5                  10<210>45<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>45Gln Tyr Ser Trp Phe Val Ala Gly Thr Phe1               5                  10<210>46<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>46Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Ala Thr Phe1           5                      10<210>47<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>47Gln Tyr 3er Trp Phe Val Asn Gly Ala Phe1               5                  10<210>48<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>48Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Ala1               5                  10<210>49<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>49Thr Tyr Ala Asp Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>50<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>50Thr Tyr Ala Pro Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>51<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>51Thr Tyr Ala Ser Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>52<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>52Thr Tyr Ala Gly Phe Val Ser Asn Leu1               5<210>53<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>53Thr Tyr Ala Cys Phe Ile Ser Asn Leu1               5<210>54<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>54Thr Tyr Ala Cys Phe Asp Ser Asn Leu1               5<210>55<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>55Thr Tyr Ala Cys Phe Met Ser Asn Leu1               5<210>56<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变异体<400>56Thr Tyr Ala Cys Phe Lys Ser Asn Leu  1               5

Claims (11)

1.细胞毒性T淋巴细胞，它能够识别将选自序列号1～6任一序号的氨基酸序列所表示的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性抗原肽及其功能性衍生物的至少一种抗原肽与HLA-A24分子的复合体呈递到细胞表面的细胞。
2.一种制癌剂，它含有权利要求1的细胞毒性T淋巴细胞作有效成分。
3.权利要求1中细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其特征在于使用选自序列号1～6任一序号的氨基酸序列所表示的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一种抗原肽。
4.权利要求1中细胞毒性T淋巴细胞的诱导剂，它包含以选自序列号1～6任一序号的氨基酸序列所表示的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一种抗原肽作有效成分。
5.一种制癌剂，它包含有以选自序列号1～6任一序号中的氨基酸序列所表示的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物的至少一种抗原肽作有效成分。
6.一种抗原呈递细胞，它能将选自序列号1～6任一序号的氨基酸序列所代表的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性的抗原肽及其功能性衍生物中的至少一种抗原肽与HLA-A24分子形成的复合体呈递到细胞表面。
7.细胞毒性T淋巴细胞的诱导剂，它含有以权利要求6中的抗原呈递细胞作有效成分。
8.一种制癌剂，它含有以权利要求6的抗原呈递细胞作有效成分。
9.对权利要求1中细胞毒性T淋巴细胞的敏感之细胞的检测方法，其特征在于，它以让权利要求1的细胞毒性T淋巴细胞与被检细胞接触时所产生的变化为指标。
10.权利要求1中细胞毒性T淋巴细胞的敏感性细胞的检测剂，它含有以权利要求1的细胞毒性T淋巴细胞作有效成分。
11.人主要组织相容性抗原(HLA)分子的检测方法，其特征在于，在选自人主要组织相容性抗原(HLA)限制性抗原肽的至少一种抗原肽存在的条件下，让识别该抗原肽与HLA分子的复合体的细胞毒性T淋巴细胞与被检细胞相接触。
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US7700108B2 (en) * 2002-09-27 2010-04-20 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. Tumor antigen protein and use thereof
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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