CN1379041A - 细胞毒性t淋巴细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供,具有序列号1或2的序列、或该序列中具有突变的序列,且可诱导具有下述T细胞受体的CTL的HLA－A24限制性抗原肽及其核酸;具有该T细胞受体的CTL;应用该HLA－A24限制性抗原肽的CTL诱导方法;含有HLA－A24限制性抗原肽的CTL诱导剂及抗癌药;含有CTL抗癌药及CTL敏感细胞检测试剂;呈递该复合物的抗原呈递细胞;含有抗原呈递细胞的CTL诱导剂及抗癌药;检测细胞毒性T淋巴细胞敏感细胞的方法及检测试剂;HLA－A24分子的检测方法;CTL的靶细胞及其制备方法。

Description

细胞毒性T淋巴细胞
技术领域
本发明涉及前列腺特异性膜抗原(prostate specificmembrane antigen，以下略作PSMA)异常表达导致的疾病，例如癌、具体地说，为前列腺癌等的治疗及诊断中有用的技术。更详细地说，本发明涉及在癌、具体为前列腺癌等PMSA异常表达的癌的治疗及诊断中有用的，具有可识别抗原肽与人主要组织相容性抗原(HLA)分子的复合物的T细胞受体的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，以下略作CTL)，该抗原肽，诱导该CTL时等有用的CTL诱导物，该CTL的诱导方法，对上述癌症有用的抗癌药，该CTL敏感细胞的检测方法及其检测试剂，HLA-A24分子的检测方法以及可被该CTL杀伤的靶细胞及其制备方法。
背景技术
前列腺癌，尤其在美国是患病率最高的癌症种类，但在日本等亚洲国家也在迅速增多。激素疗法及放射线疗法对前列腺癌的治疗效果最好。但是，长时间的激素疗法会产生激素非应答性癌，因此非常需要一种对这种病态更有效的治疗方法，并渴望进行免疫治疗。
在CTL中，抗原肽和主要组织相容性抗原基因复合物(majorhistocompatibility gene complex，以下略作MHC)编码的主要组织相容性抗原MHC I类(若对象为人时，称为人白细胞抗原I类(human leukocyte antigen class I)，以下略作HLA I类)分子的结合形成的复合物可被特异性T细胞受体(T cellreceptor，以下略作TCR)识别，由此杀伤在细胞表面上呈递该复合物的细胞。这种CTL只识别杀伤具有与该CTL本身相同MHC I类分子的靶细胞，因此，又称为MHC I类限制性CTL。
因此，为了使该细胞杀伤性反应成立，必须具备以下两个条件：1)存在携有特异性TCR的CTL；2)为了成为可被HLA I类分子呈递、且可被CTL识别的抗原肽，需存在既可与MHC I类抗原分子结合、且可形成TCR可识别的复合物的抗原肽。
这种抗原肽，例如哺乳动物细胞的细胞内合成的抗原等经过内质网的加工过程，被降解为小的表位肽，然后它进一步与MHCI类分子结合，呈递在细胞表面上。即，在由很多亚基组成的蛋白酶复合物中，蛋白质被降解为8～15个氨基酸组成的肽，其中几个从细胞质由TAP转运体转运至内质网。这些肽在内质网上若能与I类/β2微球蛋白(microglobulin)异二聚体结合，则将作为3分子复合物保持稳定，并通过高尔基装置转运至细胞表面。表达肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原蛋白质的癌细胞可在肿瘤细胞表面呈递可被T淋巴细胞识别的MHC I类分子限制性抗原肽。
作为可被T淋巴细胞识别的最初肿瘤特异性抗原，P.vanderBruggen等克隆鉴定了被称为黑素瘤(melanoma)抗原E(以下，略作MAGE)的基因(P.van der Bruggen等，Science，第254卷，第1643-1647页(1991))。P.van der Bruggen等使用来自于黑素瘤患者的CTL克隆、该CTL可识别的相同患者来源的一系列黑素瘤细胞株、免疫筛选该细胞株中若干个具有CTL抗性的细胞所获取的细胞株，并根据表达克隆法分离出MAGE。
也就是说，由可被CTL识别的黑素瘤细胞株制得5kb DNA片断，然后将该片断转染至原来不能被CTL识别的细胞株中，从而所得到的转染株能够被上述CTL克隆识别。该DNA片断编码推定分子量约26,000的蛋白质。编码这种蛋白质的基因被称作MAGE-1。另外，通过mRNA分析表明，来自于非转移性早期黑素瘤的40％的细胞株可表达上述MAGE-1。来源于MAGE-1蛋白质的抗原是一种HLA-A1限制性抗原，MAGE-1特异性CTL克隆可识别与HLA I类分子当中的一种HLA-A1分子结合了的9个氨基酸残基构成的肽(C.Traversari等，Journal of Experimental ofMedicine，第176卷，第1453-1457页(1992))。
已知有很多抗原可作为肿瘤抗原，但作为可被CD8阳性CTL识别的抗原已知的有，上述MAGE-1等数十种以上的MAGE家族、gp100、酪氨酸酶(tyrosinase)、CEA、HER2/neu等。可被CTL识别的肽是来自于肿瘤抗原蛋白质的肽，并作为与HLA I类分子的复合物所呈递。
众所周知，HLA I类分子主要有HLA-A、HLA-B、HLA-C，与这些分子结合并呈递的抗原肽由8-10个氨基酸组成，而且因它们各自的HLA分子种类不同而具有一定的结构上的特征差异。例如，作为与世界上频度最高的HLA-A2.1分子相结合的肽，被研究得最多的是，N末端第2位为Leu，且C末端位置为Leu或Val的肽，并由9-10个氨基酸组成的肽。另外，作为日本人等亚洲人种中常见的作为与HLA-A24分子结合的肽，研究得最多的是，N末端第2位为Tyr、Phe、Met或Trp中任一氨基酸，且C末端位置为Leu、Ile、Trp或Phe中任一氨基酸，并由9-10个氨基酸所组成的肽(A.Kondo等，Joural of Immunology，第155卷，第4307-4312页(1995))。
迄今为止，已鉴定出作为抗原肽的肿瘤抗原为，针对HLA-A1的MAGE-1、MAGE-3，针对HLA-A2.1的MAGE-3、MART1、酪氨酸酶、gp100、HER2/neu、CEA等，针对HLA-Cw1的MAGE-3，针对HLA-B44的MAGE-3等，针对HLA-A24的MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、HER2/neu、酪氨酸酶、β-连环蛋白(catenin)等。
在前列腺癌中，称为前列腺特异性膜抗原(prostatespecific membrane antigen，以下略作PSMA)的肿瘤标记物被发现，并希望提供以它们作为靶子的抗原肽。关于来自PSMA的抗原肽，已被鉴定的有，由序列号3(PSM-P1：LLHETDSAV)的氨基酸序列组成及由序列号4(PSM-P2：ALFDIESKV)的氨基酸序列组成，且分别为9个氨基酸残基的2种肽，即HLA-A2.1限制性抗原肽(前列腺(Prostate)，第28卷，第65-69页(1996))。
另外，已知PSMA既可在前列腺癌的肿瘤细胞表达，也可在肿瘤部位的新生血管中表达[Chang S.S.等，癌研究(CancerResearch)，第59卷，第3192～3198页(1999)]。
这些肿瘤抗原肽中大多数的制备过程为，首先将识别肿瘤细胞的I类限制性CTL细胞株化，然后鉴定该CTL所识别的肿瘤抗原，再通过基因工程学的方法寻找CTL所能识别的肿瘤抗原蛋白质中的最小单位，进而以结合HLA I类分子的基序信息为基础，从上述最小单位中鉴定出具有抗原性的肽(Y.Kawakami等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA第91卷，第3515-3519页(1994))。另外，首先以上述HLA I类分子结合肽共同的基序结构为基础来寻找肿瘤抗原蛋白质中的HLA I类分子结合肽，然后，利用抗原呈递细胞筛选可诱导CTL的抗原肽，再由是否能诱导对肿瘤细胞具有杀伤性的CTL来最后确定抗原肽(E.Celis等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA第91卷，第2105-2109页(1994)；B.Gaugler，Journal of Experimental of Medicine，第179卷，第921-930页(1994))。
然而，在肽分子中有HLA-A24结合基序只不过是诱导CTL所需的1个条件，而由该基序实际上很难推测肽分子是否能显示出对细胞的选择性杀伤活性。
另一方面，HLA I类分子被分为几种亚型，不同人种间携有的亚型种类存在很大的差异。世界上最常见的是携有HLA-A2，占白种人的45％，在该HLA-A2限制性抗原肽的鉴定方面进展也最好。
在日本人中，上述HLA-A2占40％，分析它的亚型时，与白种人一样HLA-A*0201为20％，其它大多为HLA-A*0206。这些亚型所结合的肽并不相同，主要研究的HLA-A2是HLA-A*0201，另一方面，在日本人中HLA-A24占60％以上，这种HLA-A24与亚洲其它人种相比，比率很高。
就现状来看，关于上述HLA-A24引起的限制性抗原肽，例如MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、HER2/neu、酪氨酸酶、β-连环蛋白(β-catenin)等，但与HLA-A2.1相比它们的分析研究还很落后，极需发现针对各种各样肿瘤抗原的新型抗原肽。还有，对亚洲人种、尤其是对日本人的具有肿瘤细胞特异性作用的CTL的研究也很落后，很难提供适用于肿瘤治疗的CTL。
发明内容
本发明的目的在于，提供对亚洲人种、尤其是日本人中前列腺特异性膜抗原(prostates pecific membrane antigen，以下略作PSMA)异常表达导致的疾病，例如癌、具体为前列腺癌等的治疗及诊断有用的技术，例如提供CTL等。详细地说，例如，本发明的目的在于提供至少可满足下列需求之一的CTL，这些需求包括治疗及诊断PSMA异常表达导致的疾病，例如，癌、具体为前列腺癌等，可选择性杀伤HLA-A24及PSMA均为阳性的细胞、尤其是肿瘤细胞，可用作癌症治疗的细胞医药(抗癌药等)，检查离体试样中是否存在HLA-A24及PSMA均为阳性的细胞、尤其是肿瘤细胞。第二，本发明的目的在于提供至少可满足下列需求之一的HLA-A24限制性抗原肽及其编码核酸，这些需求包括可选择性诱导上述CTL，可用作上述CTL的诱导剂，基于上述CTL的诱导、使癌症等疾病的治疗成为可能。第三，本发明的目的在于提供至少可满足下列需求之一的抗原呈递细胞，这些需求包括用于上述CTL的制备，基于上述CTL的诱导、使癌症等疾病的治疗成为可能。第四，本发明的目的在于提供可高效且选择性地得到本发明CTL的CTL诱导方法及CTL诱导剂。第五，本发明的目的在于提供至少可满足下列需求之一的CTL敏感细胞检测方法及检测试剂，这些需求包括可高效且选择性地检测CTL敏感细胞，HLA的分类，癌、具体为前列腺癌等疾病的诊断。第六，本发明的目的在于提供可在人主要组织相容性抗原未表达细胞和/或抗原蛋白质未表达细胞中表达人主要组织相容性抗原和/或抗原蛋白质的、可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞及可高效获取它的该靶细胞的制备方法。
本发明涉及，[1]一种人体主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性抗原肽，具有下述(a)或(b)的氨基酸序列，(a)序列号1或2所示的氨基酸序列，或(b)在序列号1或2中，具有选自下述①～③至少一种突变的氨基酸序列，①至少缺失1个氨基酸残基，②至少有1个氨基酸残基置换为其它氨基酸或氨基酸类似物，以及③至少附加1个其他氨基酸残基或氨基酸类似物；且具有可诱导具有下述T细胞受体的CTL的性质，该T细胞受体可特异性识别将上述序列号1或2所示的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。[2]一种细胞毒性T淋巴细胞，具有下述T细胞受体，该T细胞受体可特异性识别将上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子结合形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。[3]一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其特征在于，通过使用上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽来诱导细胞毒性T淋巴细胞。[4]上述[3]所述的诱导方法，包括以下3个步骤，(1)将上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽与选自巨噬细胞、B细胞以及树状细胞中的1种具有抗原呈递能力的细胞接触来获取抗原呈递细胞，然后用所获抗原呈递细胞对具有抗原呈递能力的细胞进行抗原刺激，由此，来获得效应细胞的步骤，(2)将上述步骤(1)所获效应细胞与可被上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞接触，以检测是否具有细胞毒活性的步骤，以及(3)在上述步骤(2)中，筛选呈现细胞毒活性的效应细胞作为细胞毒性T淋巴细胞的步骤。[5]上述[4]所述的诱导方法，其特征在于，在IL-7的存在的条件下，对于1个淋巴细胞，接触0.01-1个比例的抗原呈递细胞。[6]上述[4]所述的诱导方法，在IL-7和匙孔血蓝蛋白存在的条件下，上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽，按含有外周血单核细胞的每1ml溶液中添加1ng-100μg的量添加到外周血单核细胞中。[7]一种CTL诱导剂，含有上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽作为有效成分，并用于获取上述[2]所述细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。[8]一种抗癌药，含有上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽作为有效成分。[9]一种抗癌药，含有上述[2]所述细胞毒性T淋巴细胞作为有效成分。[10]一种抗原呈递细胞，可将上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合物呈递在细胞表面。[11]一种CTL诱导剂，含有上述[10]所述的抗原呈递细胞作为有效成分，并用于获取上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。[12]一种抗癌药，含有上述[10]所述的抗原呈递细胞作为有效成分。[13]一种细胞毒性T淋巴细胞敏感细胞的检测方法，其特征在于下述检测指标，使上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触，从而引起选自CTL导致的细胞裂解、细胞因子释放以及CTL增殖的变化时，所述待测细胞为对上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞具有敏感性的细胞(敏感细胞)。[14]一种细胞毒性T淋巴细胞敏感细胞的检测剂，含有上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞作为有效成分。[15]一种待测细胞中人主要组织相容性抗原(HLA)-A24分子的检测方法，其特征在于，在上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽存在的条件下，使上述[2]所述的细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触。[16]一种核酸，编码上述[1]所述的HLA-A24限制性抗原肽构成的。[17]一种可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞的制备方法，包括将人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白的编码核酸导入细胞的工序。[18]上述[17]所述的制备方法，通过腺病毒载体将核酸导入细胞。[19]上述[17]或[18]所述的制备方法，人主要组织相容性抗原的编码核酸为HLA-A24的编码核酸。[20]上述[17]～[19]任一项所述的制备方法，抗原蛋白质的编码核酸为上述[16]所述的核酸。[21]一种靶细胞，由上述[17]～[20]任一项所述的制备方法获取，并可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤。
发明的实施方式
本发明基于本发明人的以下研究，以具有作为肿瘤抗原的PSMA蛋白质中的HLA-A24结合基序的肽为中心，从众多候选肽中寻找抗原肽的结果发现，在众多候选肽中，当用序列号1或2所示氨基酸序列组成的肽对淋巴细胞进行抗原刺激时，从表达HLA-A24的正常人外周血单核细胞中，能诱导选择性杀伤该肿瘤抗原表达细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，从而完成了本发明。
另外，在本说明书中，作为表示将HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合物呈递到细胞表面的细胞的术语，使用“靶细胞”以及“抗原呈递细胞”。
特别是，所述“靶细胞”是指可被特异性识别该细胞的细胞毒性T淋巴细胞(以下略作CTL)杀伤的细胞。另一方面，所述“抗原呈递细胞”是指，具有同时呈递抗原和MHC分子并激活T淋巴细胞的功能的细胞，无特殊情况时，指MHC分子为HLA-A24分子的细胞。
上述“潜在的抗原呈递细胞”是指，通过该细胞中存在的MHC分子和抗原肽形成复合物，可成为抗原呈递细胞的细胞，无特殊情况时，指该MHC分子为HLA-A24分子的细胞。
本说明书中，癌是指恶性肿瘤，其中包括癌瘤、肉瘤两者。本说明书中，癌除了肿瘤细胞，还包括肿瘤相关部位、例如肿瘤部位内的新生血管等。
本发明的HLA-A24限制性抗原肽的特征之一在于，具有下述(a)或(b)的氨基酸序列：(a)序列号：1或2所示的氨基酸序列，或(b)在序列号：1或2中，具有选自下述①～③中的至少一种突变的氨基酸序列，①至少缺失1个氨基酸残基，②至少有1个氨基酸残基置换为其它氨基酸或氨基酸类似物，以及③至少附加1个其他氨基酸残基或氨基酸类似物；且具有可诱导具有下述T细胞受体的CTL的性质，该T细胞受体可特异性识别将上述序列号1或2所示的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。另外，本说明书中，上述序列号1或2所示的氨基酸序列组成的肽有时也称作PSMA抗原肽。
根据本发明HLA-A24限制性抗原肽，可诱导对PSMA异常表达引起的疾病、例如癌症的治疗及诊断中有用的HLA-A24限制性CTL，即，可发挥诱导具有下述T细胞受体CTL的优异效果，该T细胞受体可特异性识别将上述抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。也就是说，本发明的HLA-A24限制性抗原肽对亚洲人种、尤其是日本人中常见的HLA-A24为限制性，因此在肿瘤等疾病的治疗中可发挥优良的效果，例如，可特异性抑制亚洲人种、尤其是日本人等的肿瘤细胞和/或肿瘤相关部位、具体为PSMA异常表达导致的肿瘤细胞和/或肿瘤相关部位，尤其是可特异性抑制前列腺癌细胞和/或前列腺癌相关部位。
另外，本发明还包含具有下述T细胞受体的CTL，该T细胞受体可特异性识别将本发明的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递到细胞表面上的细胞。
在本说明书中，所谓“抗原肽”是指，具有与MHC I类分子结合并与该MHC I类分子形成复合物的能力，同时所形成的复合物具有可被特异性CTL的TCR所识别的抗原性的肽。
还有，在本说明书中，所谓“ HLA限制性抗原肽”是指，MHCI类分子是作为HLA分子的抗原肽。
本发明HLA-A24限制性抗原肽，可以是单纯氨基酸组成的纯合肽，也可以是含非氨基酸成分的杂合肽。所述氨基酸可以是天然型氨基酸，也可以是经过化学修饰的氨基酸。上述肽可以是单体，也可以是多聚体。
作为本发明的HLA-A24限制性抗原肽，例如，在序列号1或2所示的氨基酸序列中至少1个氨基酸残基，具体为1个或数个氨基酸产生选自缺失、置换及附加的至少1个突变，进而与该序列号1或2所示的氨基酸序列不同，但它能与HLA-A24分子形成复合物，同时所形成的复合物可被具有下述T细胞受体的CTL所识别，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上细胞。
作为上述突变，具体为，①至少缺失1个氨基酸残基，②至少有1个氨基酸残基置换为其它氨基酸或者氨基酸类似物，以及③至少附加1个其他氨基酸残基或氨基酸类似物等。这种突变可以是单独一种，也可以是它们的组合。
只要发挥可诱导具有下述T细胞受体的CTL性质，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞，则本发明的HLA-A24限制性抗原肽的氨基酸序列长度可以是9-10个氨基酸残基，但不作特别限定。例如，上述序列号1或2所示的氨基酸序列中，具有②突变的氨基酸序列组成的肽时，氨基酸序列的长度可以是9-10个残基，但不作特别限定。上述序列号1或2所示的氨基酸序列中，具有③突变的氨基酸序列组成的肽时，氨基酸序列的长度可以是9-10个残基，但不作特别限定。
作为上述氨基酸类似物有，多种氨基酸的N-酰化物、O-酰化物、酯化物、酰胺化物、烷基化物等。
另外，与HLA-A24分子形成的复合物，只要可被具有下述T细胞受体的CTL所识别，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞，则该抗原肽的N末端和游离的氨基上还可以结合甲酰基、乙酰基、叔-丁氧基、羰(t-Boc)基等，而抗原肽的C末端和游离的羧基上还可以结合甲基、乙基、叔-丁基、苄基等。
另外，本发明的HLA-A24限制性抗原肽进行各种修饰，以易于导入到生物体内。
本发明的HLA-A24限制性抗原肽，可以通过使用具有下述T细胞受体的CTL进行筛选，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。上述筛选，例如，可以根据以下1～3的方法等进行。
方法1
混合作为本发明HLA-A24限制性抗原肽的候选物质和HLA-A24表达细胞，洗涤除去没有结合到HLA-A24分子上的候选物质后，使所得候选物质结合HLA-A24表达细胞与CTL反应。当候选物质的细胞特异毒性、细胞因子释放以及增殖反应等被确认时，即可判断上述候选物质为本发明的HLA-A24限制性抗原肽。
方法2
使候选物质与潜在的抗原呈递细胞接触，经过一定的时间，例如经过抗原摄入到细胞内，并将抗原肽和HLA分子的复合物呈递在细胞表面上所要需的时间，使之反应后，使所得反应物与CTL反应。当候选物质特异性细胞因子释放或增殖反应被确认时，即可判断上述候选物质为本发明的HLA-A24限制性抗原肽。
方法3
在可将肽呈递给对于后述的潜在抗原呈递细胞上的HLA-A24分子的可以表达的载体中，插入候选物质的氨基酸序列的编码核酸，用所得重组载体进行转染，再使已转染的潜在抗原呈递细胞与CTL反应。当候选物质特异性细胞因子释放或增殖反应被确认时，即可判断上述候选物质为本发明的HLA-A24限制性抗原肽。
本发明的HLA-A24限制性抗原肽中，只要与HLA-A24形成的复合物可被具有下述T细胞受体的CTL所识别，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞，例如在序列号1或2所示的氨基酸序列中，为了加强与HLA-A24分子的结合，在N末端第2位的氨基酸可被与HLA-A24分子结合的肽中特征性的氨基酸Tyr、Phe、Met或Trp所置换，和/或C末端的氨基酸可被与HLA-A24分子结合的肽中特征性的氨基酸：Leu、Ile、Trp或Phe所置换。例如，可举出序列号2的氨基酸序列的C末端氨基酸(Phe)具有被置换为Leu的序列号5的氨基酸序列的肽。
作为在序列号1或2所示氨基酸序列中作为具有1个或数个氨基酸被置换的氨基酸序列组成的肽，例如是被与各自置换对象的氨基酸具有相似侧链的氨基酸或氨基酸类似物置换了的肽，且具有与HLA-A24分子结合的能力，又能被具有下述T细胞受体的CTL识别，该T细胞受体能特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽和HLA-A24分子结合形成的复合物的与HLA-A24分子的复合物呈递在细胞表面上的细胞。
作为侧链相似的氨基酸，例如，甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和蛋氨酸(Met)；天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)，天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)；赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)。
具体地说，作为序列号1或2所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被置换了的氨基酸序列组成的肽，例如在序列号2中，具有N末端的氨基酸(Asn)被置换为Gln的序列号6所示的氨基酸序列组成的肽；具有N末端的第5位氨基酸(Thr)被置换为Ser的序列号7所示的氨基酸序列组成的肽。
序列号1或2所示的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸被置换了的氨基酸序列的肽，只要可被具有下述T细胞受体的CTL所识别，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示抗原肽与HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞，则也可与侧链并不类似的氨基酸发生置换。例如，序列号2所示的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸是被置换为其它氨基酸或氨基酸类似物、例如被Ala所置换的氨基酸序列组成的肽，且具有与HLA-A24分子结合的能力，并且与HLA-A24分子形成的复合物是可被具有下述T细胞受体的CTL所识别的肽，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。
作为序列号1或2所示的氨基酸序列中，具有1个或数个氨基酸被置换的氨基酸序列组成的肽，例如是具有序列号8或9任一氨基酸序列的肽。上述肽中可被Ala置换的N末端及N末端的第5位氨基酸，有可能被置换为与原来氨基酸不同的其它氨基酸、或者是氨基酸类似物。
另外，本发明HLA-A24限制性抗原肽可以是序列号1或2的N末端或C末端附加氨基酸的肽，但需要被具有下述T细胞受体的CTL所识别，该T细胞受体可特异性识别将序列号1或2所示抗原肽与HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。这些肽在抗原呈递细胞内为了成为序列号1或2的肽，附加适当的氨基酸，由此，更有效地呈递给HLA-A24分子。例如，优选应用来自PSMA的肽片段，且含有序列号1或2所示的氨基酸序列，且比该氨基酸序列氨基酸残基数目多的肽，具体来说，由15-25个氨基酸残基组成的肽。
本发明HLA-A24限制性抗原肽可以通过液相或固相氨基酸偶联方法等有机化学方法制备。另外，上述HLA-A24限制性抗原肽也可以通过使用HLA-A24限制性抗原肽的氨基酸序列的编码核酸的DNA重组技术来制备。通过DNA重组技术得到的肽，必要时，可以采用适当的有机化学或生物化学方法等进行修饰。
本发明还包括编码上述HLA-A24限制性抗原肽的核酸。即，在可被具有下述T细胞受体的CTL识别的范围内，本发明核酸编码的多肽可以是具有各种变异的变体，该T细胞受体特性在于，可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽与HLA-A24分子的复合物呈递于细胞表面的细胞。另外，这类核酸可以是通过兼并而与上述核酸具有差异的核酸。
作为编码HLA-A24限制性抗原肽的核酸，例如PSMA基因，该基因序列已被公开(R.S.Israeli等，Cancer Research，第53卷，第227-230页(1993))。从上述序列可以选择并使用编码所述肽的区域。
本发明细胞毒性T淋巴细胞的特征之一为，具有可特异性识别将本发明的HLA-A24限制性抗原肽与HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞的T细胞受体。按照本发明的CTL只能特异性杀伤呈递本发明的HLA-A24限制性抗原肽与HLA-A24分子的复合物的细胞。也就是说，按照本发明的CTL可特异性杀伤肿瘤细胞、尤其是前列腺癌细胞。
再者，本发明的CTL对亚洲人种、尤其是日本人中常见的HLA-A24为限制性，因此作为肿瘤治疗，采用该CTL可有效地特异性杀伤亚洲人种、尤其是日本人的肿瘤细胞、尤其是前列腺癌细胞。
本发明的CTL可以引起靶细胞的特异性细胞裂解反应或细胞因子释放反应。另外，本说明书中的CTL可识别呈递在HLA-A24分子上的抗原肽的抗原性并具有杀伤活性，而不被其它抗原性识别等所限定。
本发明的CTL由于具有可特异性识别将序列号1或2所示的抗原肽、即PSMA抗原肽与HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞的T细胞受体，所以，对于HLA-A24及PSMA均为阳性的肿瘤细胞可特异性产生细胞因子。因此，可作为对于肿瘤的细胞药物，还可以用于检测该CTL的敏感细胞等。HLA-A24及PSMA均为阳性的细胞也可以是导入HLA-A24或PSMA基因的细胞。
本发明的CTL可由下述方法获得，该方法的特征在于，通过使用HLA-A24限制性抗原肽来诱导细胞毒性T淋巴细胞。这种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法也包含在本发明之中。
作为本发明的细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，具体来说，例如含有以下步骤的方法。(1)使本发明HLA-A24限制性抗原肽与选自巨噬细胞、B细胞及树状细胞中的1种具有抗原呈递能力的细胞接触，并得到抗原呈递细胞，用所得抗原呈递细胞对具有抗原呈递能力的细胞进行抗原刺激，进而获得效应细胞的步骤，(2)使上述步骤(1)中所得到的效应细胞与可被本发明的细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞接触，以检测是否具有细胞杀伤活性，以及(3)上述步骤(2)中，筛选呈现细胞杀伤活性的效应细胞作为细胞毒性T淋巴细胞。
体外(in vitro)诱导该CTL时，例如使用来自于可表达HLA-A24的机体的离体试样，通过用本发明的HLA-A24限制性抗原肽刺激该离体试样来进行诱导。作为上述“离体试样”，例如血液、通过手术等摘除的淋巴节、脾脏、还有其它各种脏器组织等。在本发明中，优选使用这些试料中存在的淋巴细胞或浸润淋巴细胞。
例如，使用血液时，可对由HLA-A24阳性的人血液制备的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells，以下也略作PBMC)反复进行抗原刺激来诱导CTL。
上述抗原刺激通过以下过程来实施，例如在由制备淋巴母细胞的同一血液制备的具有抗原呈递能力的细胞中，使用将本发明的HLA-A24限制性抗原肽作为与HLA-A24分子的复合物呈递给细胞表面的细胞(抗原呈递细胞)、使用该HLA-A24限制性抗原肽等。
被诱导的CTL可通过进一步地给予抗CD3抗体等的刺激，或在本发明的HLA-A24限制性抗原肽或抗原呈递细胞的存在下给予各种刺激来使之增殖。例如在IL-7存在下，相对于由PBMC制得的1个淋巴细胞，以0.01-1个的比例混合抗原呈递细胞，即可进行CTL的诱导。作为其它诱导方式，例如在IL-7、匙孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)存在下，在PBMC细胞培养液中，以每种抗原肽为1ng/ml-100μg/ml、优选为10ng/ml-1μg/ml的量添加本发明HLA-A24限制性抗原肽，进而诱导CTL。
被诱导的CTL通过克隆化，可以具有稳定的细胞毒性的淋巴细胞形式来维持。例如，被诱导的CTL可以通过抗原、各种细胞因子、抗CD3抗体等刺激使之增殖。
被诱导的特异性CTL的检测，可通过测定对用诱导CTL的抗原肽和放射性物质等标记的靶细胞的杀伤性，可由放射能量的吸收进行测定的CTL增值的抗原特异性增加，或由CTL或靶细胞抗原特异性释放的CM-CSF、INF-γ等细胞因子量来进行检测。例如，通过测定CTL对上述51Cr标记的靶细胞的杀伤性的方法来进行评价。
具体地说，在96孔细胞培养板等的各孔中混和含有51Cr标记的靶细胞和用于消除混入的NK细胞引起的非特异杀伤活性的细胞(如，K562细胞等)的细胞混合物、和CTL，经过适当时间的温育之后，使用γ计数器测定51Cr的释放量来进行检测。然后，可按照下述式1算出特异性细胞毒活性。
Figure A0210856500191
(式中，最小释放值为只含有靶细胞和用于消除非特异杀伤活性的细胞的孔中51Cr量，表示靶细胞的51Cr自然释放量，最大释放值表示用表面活性剂等破坏靶细胞时的51Cr释放量)
另外，通过使用荧光素等标记的抗原肽和复合物也可以直接确定特异性细胞毒活性。此时，例如使CTL和与CTL特异性抗体偶联的第1荧光标记物相接触之后，再和与第2荧光标记物偶联的抗原肽-MHC复合物接触，然后通过荧光激活细胞分类法(fluorescence-activated cell sorting，FACS)分析双重标记细胞的存在来进行。
另一方面，体内(in vivo)诱导CTL时，例如可以通过将本发明的HLA-A24限制性抗原肽与HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面的抗原呈递细胞投药于机体内来实施。对人进行给药时，每个成人的给药量通常优选104-109个。其它方法还有，将本发明的HLA-A24限制性抗原肽与适当的佐剂混合后对生物体进行给药，进而可诱导对该肽具有特异性的CTL。
作为上述佐剂，例如①弗氏(Freund)完全佐剂、②弗氏不完全佐剂、③氢氧化铝、明矾等无机物凝胶、④溶血卵磷脂、溴化二甲基十八烷基铵等表面活性剂、⑤硫酸葡聚糖、聚IC等的聚阴离子、⑥胞壁酰基肽、它普素(タフトシン)等的肽、⑦Ribi公司制单磷酰基脂质(monophosphory llipid，MPL)A等。在机体中诱导CTL时，除了抗原肽和佐剂的混合物外，也可以混合给药MHC II类限制性辅助T细胞抗原肽。
为了在机体内保持稳定，本发明的HLA-A24限制性抗原肽也可以通过适当的接头与高级脂肪酸和辅助T细胞抗原肽共价结合后进行给药。对人进行给药时，每个成人的给药量，以HLA-A24限制性抗原肽的浓度计，每种抗原肽给药0.1μg/kg-10mng/kg，优选1μg/kg-1mg/kg，更优选1μg/kg-100μg/kg。
通过本发明的HLA-A24限制性抗原肽的刺激诱导CTL时，也可以使用该HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子形成的复合物。此时，HLA-A24分子不一定是天然HLA-A24分子，也可以是本质上保持有与HLA-A24限制性抗原肽的结合性的片段。这些片段，例如可以通过天然型HLA-A24分子的蛋白质降解或重组DNA技术获得。这种复合物可以与β2-微球蛋白，尤其是与可识别复合物的抗体共存来保持稳定。
由于本发明的CTL是由本发明的HLA-A24限制性抗原肽诱导的，所以可用作含有这种肽作为有效成分的、用于获得细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的CTL诱导剂。这种CTL诱导剂也包含在本
发明的范围内。
本发明的CTL诱导剂，例如可以是单独的上述HLA-A24限制性抗原肽，或者与其它分子(辅助T细胞抗原肽和/或佐剂)的混合物形式，以悬浮于生理盐水或者磷酸缓冲生理盐水中形态来供给。上述HLA-A24限制性抗原肽，也可以是与高级脂肪酸和辅助T细胞抗原肽的共价结合物或者与HLA-A24分子的复合物形式来应用。
本发明CTL诱导剂中的本发明的HLA-A24限制性抗原肽的含量，只要是诱导CTL所需的量即可，例如抗原肽含量按每种抗原肽计，为0.01-100重量％，优选0.1-95重量％。所述含量，例如从HLA-A24抗原阳性的人体分离外周血淋巴细胞，在离体条件下，分别添加HLA-A24限制性抗原肽含量不同的试剂，边刺激边培养时，这时可由诱导特异性识别HLA-A24阳性细胞的CTL的试剂中作为该HLA-A24限制性抗原肽的含量来确定。此时，对于CTL诱导的有无，例如可以用常规的ELISA法等测定与靶细胞反应后CTL生成的各种细胞因子(如，IFN-γ)的量来确定。另外，也可以通过测定CTL对以51Cr标记的靶细胞的杀伤性的方法来确定。
本发明的CTL诱导剂，可用作体外增殖本发明的CTL时培养基的添加物，以及用于以T淋巴细胞增殖活性、延迟性皮肤过敏反应为指标的致敏状态的诊断等。例如，用作培养基的添加物时，使用量以培养基中的肽浓度计，每种抗原肽为1ng/ml-100μg/ml，优选10ng/ml-1μg/ml。另外，还可以用作下述抗癌药。
根据本发明HLA-A24限制性抗原肽，可以诱导本发明的CTL，并且该CTL对亚洲人种、尤其是日本人中常见的HLA-A24为限制性，因此，作为肿瘤治疗，可提供对亚洲人种、尤其是对日本人特别有效的可特异性杀伤肿瘤细胞、尤其是前列腺癌细胞的抗癌药，例如提供上述CTL或基于诱导CTL的抗癌药。因此，本发明可提供(1)含有本发明的HLA-A24限制性抗原肽作为有效成分的抗癌药，以及(2)含有本发明的CTL作为有效成分的抗癌药。这种抗癌药也包含在本发明的范围内。
本发明的抗癌药，由于含有(1)本发明的HLA-A24限制性抗原肽、或(2)本发明的CTL作为有效成分，所以该抗癌药在可特异性杀伤前列腺特异性膜抗原(prostate specificmembrane antigen，以下略作PSMA)异常表达导致的癌症、尤其是前列腺癌中的肿瘤细胞方面发挥优异的特性。
本发明的抗癌药的药物的剂型可以是1)单纯的本发明的HLA-A24限制性抗原肽或单纯的本发明的CTL，2)本发明的HLA-A24限制性抗原肽或本发明的CTL与可药用载体和/或稀释剂的混合物，或者3)必要时在上述1)或2)中添加助剂。作为上述载体，例如人血清白蛋白。作为稀释剂，例如磷酸缓冲液、蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、适于保存本发明的CTL的培养基等。作为培养基，通常为RPMI、AIM-V等培养基。作为助剂，例如可药用的上述佐剂等。将本发明的抗癌药投入到人体时，可以使用注射器给药或者用喷雾等方法从粘膜经皮吸收等形式给药。当使用注射剂时，可以含有注射剂用溶剂(例如水、酒精、甘油等)。
本发明抗癌药中有效成分量只要满足下述条件即可，也就是所，由本发明的HLA-A24限制性抗原肽诱导的CTL量或者本发明的CTL量为杀伤前列腺特异性膜抗原(prostate specificmembrane antigen，以下略作PSMA)异常表达导致的癌、尤其是前列腺癌中的肿瘤细胞所需的量即可。
上述“杀伤肿瘤细胞所需的量”，例如可以通过测定CTL对上述的51Cr标记靶细胞的杀伤性的方法来进行评价。
本发明抗癌药的药理作用，如前所述，可以根据对肿瘤细胞杀伤程度来进行评价，还可以将本发明的抗癌药给药于患有癌症的小鼠等，并以肿瘤大小的变化作为指标来进行评价。
本发明抗癌药的剂型可以是注射剂，但为了提高与体内的亲和性，也可以是脂质体制剂，结合在直径为数个μm的可药用珠子上的粒状制剂，结合脂质等的制剂等剂型。
上述注射剂可以单独，或者与葡萄糖、氨基酸等常规助剂混合后注射到经脉内，必要时也可以单独注射到肌肉内、皮内、皮下或者腹腔内。
给药方法有皮内注射、皮下注射、静脉注射、口服给药、鼻腔内给药等。
另外，本发明的抗癌药也可用作免疫治疗上可合用的其他抗癌药。
上述(1)的抗癌药中所含的本发明的HLA-A24限制性抗原肽，以每种抗原肽计，为0.01-100重量％，优选0.1-95重量％。每个成人的给药量，作为肽浓度以每种抗原肽计，为0.1μg/kg-10mg/kg，优选1μg/kg-1mg/kg，更优选1μg/kg-100μg/kg。本发明的抗癌药与人体的相容性优良。
上述(2)的抗癌药中本发明的CTL的含量，以每种CTL计，为104-108个/ml，优选5×105-5×107个/ml。
当给人服用上述(2)的抗癌药时，也可以使用注射剂并用注射器给药，每个成人的给药量依据患者的年龄、体重、疾病程度等适宜选定，例如CTL数以每种CTL计，为106-1010个。上述范围只是一个基准，并不受此限定。在本发明的抗癌药中，作为有效成分的C TL来自于所要给药的人体，所以本发明的抗癌药对人体的相容性优良。
上述(2)的抗癌药，可投药给前列腺癌等癌症患者，该患者具有表达可被作为有效成分的CTL所识别的抗原肽的肿瘤细胞。因此，含有用PSMA抗原肽诱导的本发明的CTL作为有效成分的抗癌药，对于HLA-A24和PSMA均为阳性的肿瘤细胞导致的前列腺癌等癌症的免疫治疗是有用的。
进而，本发明可提供一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞可将HLA-A24限制性的抗原肽、即PSMA抗原肽和HLA-A24分子的复合物呈递在细胞表面。根据本发明的抗原呈递细胞，可用于诱导本发明的CTL。
本发明的抗原呈递细胞可通过使用具有抗原呈递能力的细胞来制备。
作为具有抗原呈递能力的细胞，例如有可将本发明的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合物呈递在其细胞表面上的巨噬细胞、B细胞、以及树状细胞(dendritic cells，DC)等白血球细胞等。上述DC细胞因由单个细胞所呈递的抗原量多，且抗原呈递所需要的细胞表面分子(CD80、CD83、CD86等共刺激性信号(co-stimulatory signal)分子等)的表达量也高，所以DC特别优选作为具有抗原呈递能力的细胞。
上述具有抗原呈递能力的细胞可以从上述离体试样中制备。例如，上述DC可以从以下三种方法制备。1)由PSMA用若干个细胞表面标记物等分离纯化的方法，2)由单核细胞用GM-CSF和IL-4进行诱导的方法，3)由CD34阳性细胞用GM-CSF、TNF-α、SCF等细胞因子进行诱导的方法。
作为使本发明的HLA-A24限制性抗原肽呈递于具有抗原呈递能力的细胞表面上的方法，例如将具有抗原呈递能力的细胞和本发明的HLA-A24限制性抗原肽混合后，根据需要洗涤除去过剩量，让上述抗原肽负载于HLA-A24分子上的方法等。另外，和用上述具有抗原呈递能力的细胞的制备方法中1)的方法制备的细胞一样，已在HLA-A24分子上呈递了与本发明无关的抗原肽的细胞，可在负载HLA-A24限制性抗原肽之前用酸进行处理，进而除去存在于HLA-A24分子上的不能诱导本发明的CTL的肽。
本发明的抗原呈递细胞，除了负载单一的HLA-A24限制性抗原肽的细胞之外，也可以是每个细胞负载几种HLA-A24限制性抗原肽的细胞。
作为其他方法，例如对于B细胞和CD34阳性细胞，通过可呈递HLA-A24限制性抗原肽的表达载体转染上述具有的抗原呈递能力的细胞的方法。
作为这种载体，例如在pcDNA3、pMQMneo、pCEP4等市售的质粒中，通过DNA重组技术导入了编码PSMA的基因的表达用质粒载体。另外该表达载体还可以附加编码适当的氨基酸序列的基因，以使要呈递到细胞表面上的抗原肽的两端在细胞内更有效地被蛋白酶所降解。可以利用导入了HLA-A24基因的表达载体转染高度表达PSMA分子的作为前列腺癌细胞的LNCaP细胞上所得的细胞或其细胞提取物。也可利用同时转柒HLA-A24表达载体及PSMA表达载体的细胞或其细胞提取物。进而，更优选使用反转录病毒载体和腺病毒载体。
优选的抗原呈递细胞为非增殖性细胞。为了不使细胞增殖，可用X射线等放射线照射或者丝裂霉素(mitomycin)等药物进行处理。
由上述方法得到的细胞是否为抗原呈递细胞，可通过检测CTL的细胞因子生成量来进行评价。
另外，通过将人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白质的编码核酸导入到细胞中，可制备可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的、将该人主要组织相容性抗原与来源于对该抗原为限制性的抗原蛋白质的肽的复合物呈递在细胞表面上的靶细胞。本发明还包含所述靶细胞的制备方法及由该制备方法获得的可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞。根据本发明的靶细胞，可对以往因未能确定靶细胞而未能评价的细胞毒性T淋巴细胞进行评价。另外，根据本发明的靶细胞的制备方法，可表达任一人主要组织相容性抗原或抗原蛋白质，故有可能构建表达与已知靶细胞不同的、人主要组织相容性抗原与抗原蛋白质组合的靶细胞。
作为编码上述人主要组织相容性抗原的核酸，例如有编码HLA-A24的核酸。该核酸序列已公开，其基因库(GenBank)的编号为L47206。该核酸可以上述序列信息为基础，从适当的材料中通过已知方法、例如PCR法等来获得。
通过将人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白质的编码核酸通过导入到适当的细胞中，即可获得表达这两种核酸的细胞，且可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的细胞。
通过与导入对象细胞相适应的载体，可以把核酸导入细胞内，为了获得高的转染效率，优选通过腺病毒载体进行转染。
使用腺病毒载体时，由通常使用同源重组等方法将人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白质的编码核酸导入到载体内，进而可制备含有导入该核酸的腺病毒载体的腺病毒颗粒(例如D.M.Glover等，DNA Cloning 4，Mammalian SystemsSecond Edition A Practical Approach(日语版，宝酒造株式会社发行))，例如可以通过COS-TPC法(S.Miyake等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第93卷，第1320页(1966))制备。
通过腺病毒载体转染核酸，可以采用已知方法，例如可将COS-TPC法制备的含有上述腺病毒载体的腺病毒颗粒感染作为导入对象的细胞。
上述载体可以具有必要的一些元件，以使人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白质的编码核酸易于在细胞内进行表达。例如，在表达对象的核酸的上游附加调控转录的启动子序列等调控序列、翻译起始密码子等，在其下游附加翻译终止密码子，由此构建可在细胞内进行复制、并发挥作用的重组载体。
具体地说，用腺病毒载体导入动物细胞时，作为启动子有SV40基因启动子、腺病毒主要晚期基因启动子、胸苷激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、CAG启动子、SRα启动子、EF1α启动子、CMG启动子、PGK启动子等。从表达强度角度考虑，本发明优选使用CAG启动子。
通过腺病毒载体表达人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白质的编码核酸时，作为导入对象的细胞，例如有只表达人主要组织相容性抗原和抗原蛋白质其中之一的、或者这两者均不表达的细胞。
所得转染子根据细胞的需要，可以在合适的培养基中培养。
所得转染子是否呈递上述人主要组织相容性抗原和/或抗原蛋白质，可通过CTL生成的细胞因子量来进行评价。
本发明的抗原呈递细胞由于在细胞表面上呈递HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合物，并可诱导本发明的CTL，所以可将这种抗原呈递细胞作为CTL诱导剂使用。本发明也包含这种CTL诱导剂。该诱导剂含有本发明的抗原呈递细胞作为有效成分。
本发明的CTL诱导剂以将该抗原呈递细胞悬浮于适于保存细胞的培养基、生理盐水、或磷酸缓冲液生理盐水中的剂型提供。作为培养基，例如有RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培养基。以保持稳定为目的，上述培养基或缓冲液中也可添加血清白蛋白等。
本发明的CTL诱导剂中的抗原呈递细胞的含量只要是诱导CTL所需的量即可，以每种抗原呈递细胞计，为103-5×106个/ml，优选104-106个/ml。所述含量，例如从HLA-A24抗原阳性的人体分离外周血淋巴细胞，在离体条件下，分别添加抗原呈递细胞含量不同的试剂，边刺激边培养，这时可由诱导特异性识别HLA-A24阳性细胞的CTL的试剂中该抗原呈递细胞的含量来确定。
本发明的CTL诱导剂，可用作体外增殖本发明的CTL时培养基的添加物之外，还可用于以T淋巴细胞增殖活性为指标的致敏状态度的诊断等。例如用作培养基的添加物时，相对于1个用于诱导CTL的淋巴细胞，通常可以0.01-1个的比例使用。
本发明的抗原呈递细胞可诱导亚洲人种、尤其是日本人中常见的HLA-A24限制性的CTL，所以这种抗原呈递细胞本身就可用作癌、尤其是前列腺癌的抗癌药。本发明的抗癌药中，还包括含有(3)本发明抗原呈递细胞作为有效成分的抗癌药。
上述(3)的抗癌药，可以将本发明的抗原呈递细胞悬浮于可药用稀释剂中的剂型提供。上述稀释剂，例如适于保存细胞的培养基、磷酸缓冲液、生理盐水等。作为培养基，例如RPMI、AIM-V、X-VIVO10等培养基。为了保持药物的稳定性，上述(3)的抗癌药中还可以含有可药用载体。作为上述载体，例如人血清白蛋白等。
上述(3)中的抗原呈递细胞的含量(有效成分含量)，用该抗原呈递细胞诱导的CTL的量为，杀伤前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，以下略作PSMA)异常表达导致的癌、尤其是前列腺癌中的肿瘤细胞所需的量即可。该有效成分量可与上述(1)或(2)的抗癌药一样进行确定。具体地说，上述有效成分量，在抗癌药中以每种抗原呈递细胞计，为105-108个/ml，优选5×105-5×107个/ml。
将上述(3)的抗癌药投药给人时，可以使用注射器给药，每个成人的给药量可依据患者的年龄、体重、患病程度等适宜选定，例如，作为抗原呈递细胞的数量，以每种抗原呈递细胞计，优选104-109个。上述范围仅仅是一个基准，并不受此限定。另外，作为有效成分的抗原呈递细胞因为来自于欲给药的人，因此对人体的相容性优良。
另外，该抗癌药也可用作免疫治疗上可合用的其他抗癌药。
根据本发明的CTL，还可以检测对上述CTL敏感的细胞。本发明也包含CTL敏感细胞的检测方法。
本发明细胞毒性T淋巴细胞的敏感细胞的检测方法的特征在于以下述指标来进行检测，即，使本发明的细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触，由此产生变化时，该待测细胞为对本发明的细胞毒性T淋巴细胞具有敏感性的细胞(敏感细胞)。
上述“待测细胞”是指来源于外周血淋巴细胞、组织等离体试样的人细胞或株化细胞。本说明书中的“敏感细胞”是指可被CTL识别、并可引起细胞裂解或细胞因子释放的癌细胞等异常细胞。
由CTL和待测细胞中的敏感性细胞接触而产生的变化，例如CTL导致的细胞裂解、细胞因子释放、CTL增殖等。
细胞裂解的检测，可用放射性同位素和荧光素标记待测细胞后，再与CTL接触时，对待测细胞中释放的放射性同位素的量和荧光素的量进行测定来完成。
细胞因子释放的检测方法，可通过对来自CTL或待测细胞中的GM-CSF、TNF、IFN-γ等的释放量进行测定来完成。
CTL增殖的检测，可通过对细胞摄取的3H-胸苷量进行测定、用显微镜观察等测定细胞个数等来完成。
通过这种变化，可以检测存在于待测细胞中的HLA-A24及PSMA均为阳性的肿瘤细胞。
上述检测方法中，优选使用含有本发明的CTL作为有效成分的CTL敏感细胞的检测试剂。该检测试剂也包含在本发明中。
本发明的检测试剂，可以悬浮于适于保存上述CTL的培养基、生理盐水、或者磷酸缓冲生理盐水的剂型提供。
作为培养基，例如RPMI、AIM-V或X-VIVO10等培养基。以稳定CTL为目的，上述培养基或缓冲液中也可添加血清白蛋白等。
上述检测试剂中CTL的含量(有效成分含量)，只要是引起上述CTL和待测细胞中敏感细胞接触所产生的变化(例如，CTL导致的细胞裂解、细胞因子释放、CTL增殖等)所需的量即可。具体地说，CTL的含量，以每种CTL计，优选104-108个/ml。
本发明的检测试剂除了用来检测待测细胞中本发明CTL的敏感细胞外，通常还可用于鉴定待测细胞表达的HLA是否为HLA-A24的HLA的分类。
本发明的检测试剂还可适当地含有用于检测上述变化的试剂，例如分子标记物等。
本发明还提供检测待测细胞中人主要组织相容性抗原(HLA)-A24分子的方法。人主要组织相容性抗原(HLA)-A24分子的检测方法的特征之一在于，在HLA-A24限制性抗原肽存在的条件下，使本发明细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触。
例如，待测细胞表面上的HLA-A24分子可以本发明的CTL和待测细胞接触所产生的变化作为指标来检测。作为CTL和待测细胞接触所产生的变化，例如CTL导致的细胞裂解、细胞因子释放、或CTL的增殖。这种变化可由上述方法进行检测。
根据上述测定结果，不仅可检测HLA-A24分子表达的有无，还可测定待测细胞上的HLA-A24分子的表达量。
另外，当对待测细胞中是否表达PSMA未弄清时，可根据以下方法检测HLA-A24分子。本方法中，在反应液中让待测细胞和最终浓度为0.01-50μg/ml的、可识别本发明的HLA-A24限制性抗原肽、尤其是该抗原肽与HLA-A24分子的复合物的本发明CTL共存，使该CTL和待测细胞接触即可。
本发明可检测肿瘤细胞的HLA-A24分子，而采用以往必须具有补体活化步骤、且需用抗HLA抗体检测HLA分子的方法很难做到这一点。
实施例
以下，结合实施例对本发明进行更为具体的说明，但本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1 PSMA抗原肽特异性CTL的制备
本实施例中，CTL是由利用抗原呈递用树状细胞(DC)的诱导法制备。
(1)CTL诱导用肽的筛选及合成
对于750个氨基酸组成的PSMA蛋白质的氨基酸序列，以具有HLA-A24结合性基序结构的肽(其N末端第2位氨基酸残基选自于Tyr、Phe、Trp及Met，C末端氨基酸残基选自于Leu、Ile、Phe及Trp)为中心，筛选表1所示的9个肽作为PSMA抗原肽的候选肽，。
        [表1]
序列号  PSMA中的位置  名称
 10  298-306  PSMA24-1
 11  624-632  PSMA24-2
 1  227-235  PSMA24-3
 12  606-614  PSMA24-4
 2  178-186  PSMA24-5
 13  74-83  PSMA24-6
 14  565-574  PSMA24-7
 15  699-708  PSMA24-8
 16  624-633  PSMA24-9
表1中，“序列号”一项的编号为序列表中表示各个肽的氨基酸序列的序列号。“PSMA中的位置”一项的编号为由PSMA蛋白质N末端开始数起的氨基酸残基数。“名称”一栏项的符号表示由本发明人命名的肽的名称。用多肽合成仪(PSSM-8，岛津制作所制)，通过固相Fmoc法制备这些肽。
(2)效应细胞的制备
对于上述(1)中制备的PSMA24-1～PSMA24-9共9种肽，由携有HLA-A24的正常人的PBMC诱导识别各个肽的效应细胞，并测定细胞杀伤活性。以下，叙述制备过程。
①PBMC的制备
从携有HLA-A24的正常人通过成分采血进行采血。将采血液加在Ficoll-Paque分离液(Pharmacia公司制)的上层，500×g、于室温离心20分钟。回收中间层的PBMC，洗涤后，悬浮于由90％牛胎血清(FCS，Intergen公司制)和10％二甲基亚砜(Sigma公司制)组成的保存液中，并以该状态保存于液氮中(保存PBMC)。
②靶细胞的制备
将表达HLA-A24的EBV转化B细胞TISI(WSN09042)，在测定前一天由(1)配制的、分别含10μg/ml PSMA24-1～PSMA24-9中任一种肽的5种培养基(以下，把在该培养基里培养的TISI记为TISI(+))或不含肽的培养基(以下，把在该培养基里培养的TISI记为TISI(-))中进行过夜培养。测定当天，将各个5×106个的TISI(+)和TISI(-)分别在200μCi的Na2 51CrO4溶液中37℃下混合1小时，然后用含有10％FCS的RPMI1640培养液洗涤，并作为51Cr标记的靶细胞使用。
③效应细胞的制备
将上述(1)中制备的保存PBMC融解，洗涤后，把15ml的细胞悬浮液加入到T-75烧瓶(コ一ニンゲ公司制)中，于37℃放置1.5个小时后，向烧瓶粘附细胞添加25ml含有1000U/ml的GM-CSF(シェ一リンゲ公司制)和1000U/ml的IL-4(ジェンザィム公司制)的5H-RPMI，于37℃在CO2培养箱中培养，并诱导DC。7天后，回收细胞，悬浮于含有40μg/ml的肽、1μg/ml的β2微球蛋白、1％的牛血清白蛋白的PBS中，并使其终浓度为3×106个/ml，室温下反应4个小时。然后用X射线照射(5500Rad)，用5H-RPMI稀释，使其终浓度达到1×106个/ml，作为抗原呈递细胞。
将由上述①得到的保存PBMC融解后，于4℃、悬浮于含有1％人AB血清的磷酸缓冲生理盐水(PBS)(以下，略作1H-PBS)，并使其细胞浓度为2×107个/ml，得到PBMC悬浮液。然后，对于2×107个/ml的PBMC，加入140μl经1H-PBS洗涤的结合了抗CD8抗体的珠子(Dynabeads M450，ダィナル公司制)，于4℃、反应1小时。
然后，将上述配制PBMC悬浮液时所用的细胞数1×108个悬浮于0.9ml的1H-PBS中，所得的悬浮液中添加0.1ml细胞解吸用珠子(DETACHaBEAD，ダィナル公司制)。接着，所得溶液于室温混合1小时，回收解吸的细胞，用1H-PBS洗涤。
将所得洗涤细胞悬浮于5H-RPMI中，并使其终浓度为2×106个/ml。所得悬浮液分别与PSMA24-1～PSMA24-9中任一种肽及共同培养的DC悬浮液等量混合，并按终浓度为10ng/ml添加IL-7。将所得溶液分别以每孔0.5ml注入到48孔培养板中，并在37℃的CO2培养箱中进行培养。第二天，在培养物中加入含有100ng/ml的IL-10的5H-RPMI 50μl。
一周后除去各孔的培养上清，将细胞悬浮于0.5ml的5H-RPMI，得到悬浮液。然后，将由经X射线照射(5500Rad)的PBMC所得粘附细胞与含有20μg/ml的PSMA24-1～PSMA24-9中任一种肽和1μg/ml的β2微量球蛋白的1HSA-PBS(含1％人血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水)于室温放置2小时，洗涤各孔，在所得含有再刺激用抗原呈递细胞的各孔中加入上述悬浮液。
第二天，在各孔中添加IL-10，并使其终浓度为10ng/ml。接着，每隔两天在各孔中添加含有rIL-2的5H-PRMI，并使其最终浓度达到20IU/ml，并在CO2培养箱中培养一周。再进行3次同样的再刺激后，测定各孔中效应细胞对靶细胞的细胞杀伤活性。
对显示细胞杀伤活性的PSMA24-3和PSMA24-5效应细胞，分别用抗CD3抗体进行增殖。将增殖的细胞悬浮于5H-RPMI中，用下述(3)的方法测定对靶细胞的细胞杀伤活性。
(3)CTL的细胞杀伤活性的测定
用5H-RPMI稀释上述(2)所得效应细胞，并使其终浓度为3×103～1×106个/ml。所得稀释物100μl/孔分别加入到96孔培养板的各孔中。然后，在各孔中添加含有1×104个51Cr标记的靶细胞和3×105个K562细胞的100μl细胞悬浮液，得到细胞混合物。上述K562细胞用于消除混入的NK细胞引起的非特异性杀伤活性。
将上述细胞混合物于400×g离心1分钟后，在37℃的CO2培养箱中放置5小时。然后，取100μl各孔的培养上清，用γ计数器测定释放的51Cr量。
特异性细胞杀伤活性可按以下式1计算。
上述式1中，最小释放值为仅装有靶细胞和K562细胞的孔的51Cr量，表示靶细胞中51Cr的自然释放量。最大释放值为，靶细胞中加入表面活性剂Trion X-100后，细胞遭到破坏时的51Cr释放量。
图1及图2示出了由PSMA24-3或PSMA24-5诱导的效应细胞对TISI(-)和TISI(+)的、在各种E/T时的特异性细胞杀伤活性曲线。
图1表示使用由PSMA24-3诱导的效应细胞时的结果。图2表示使用由PSMA24-5诱导的效应细胞时的结果。另外，白色方框(□)表示用TISI(-)作为靶细胞、黑色实心圈(·)表示用TISI(+)作为靶细胞时的结果。另外，图1和2中，纵坐标为特异性细胞杀伤活性(％)、横坐标为E/T比。
结果表明，由PSMA24-3和PSMA24-5诱导的效应细胞对加入了各种肽的TISI(+)显示出抗原肽特异性的细胞毒性。
由上述结果可知，由PSMA24-3(序列号1)和PSMA24-5(序列号2)诱导的效应细胞为具有抗原肽特异性的细胞毒性的CTL。
实施例2 PSMA抗原肽功能性衍生物的制备
(1)PSMA24-5变体的合成
根据实施例1的(1)中合成的PSMA24-5，设计了表2所示的7种衍生物。表2
  序列号     名称
    8   PSMA24-5-1A
    17   PSMA24-5-4A
    9   PSMA24-5-5A
    18   PSMA24-5-6A
    19   PSMA24-5-7A
    20   PSMA24-5-8A
    5   PSMA24-5-9L
用多肽合成仪制备表2所示的PSMA24-5-1A～PSMA24-5-9L共7种肽。
(2)PSMA24-5功能性衍生物的鉴定
对于可识别PSMA24-5和HLA-A24分子的复合物的上述实施例1中所得CTL是否能识别表2所示的肽和HLA-A24分子的复合物进行了确认。
首先，对于可识别按实施例1的(2)同样方法制备的PSMA24-5的CTL，对51Cr标记TISI(-)细胞、以及用选自PSMA24-5-1A～PSMA24-5-9L的肽并按实施例1的(2)同样方法制备的7种51Cr标记TISI(+)细胞是否能显示细胞毒性进行了确认。
结果表明，可识别PSMA24-5的CTL，对用添加选自PSMA24-5-1A、PSMA24-5-5A和PSMA24-5-9L的1种肽的培养基培养所得的51Cr标记TISI(+)显示出细胞毒性。另外，该CTL对51Cr标记TISI(-)细胞没有显示出细胞毒性。由此表明，PSMA24-5-1A(序列号8)、PSMA24-5-5A(序列号9)和PSMA24-5-9L(序列号5)为PSMA24-5的功能性衍生物。
实施例3  利用腺病毒评价CTL
(1)由腺病毒制备基因导入靶细胞
作为内源性呈递抗原的靶细胞，构建可表达HLA-A24和PSMA的肿瘤细胞。即，对表达PSMA、不表达HLA-A24的前列腺癌细胞株LNCaP细胞，用转HLA-A24基因腺病毒载体将基因导入细胞。对表达HLA-A24、不表达PSMA的癌细胞MKN45、888mel、SW480、T.T，用转PSMA基因腺病毒载体将PSMA基因导入细胞。
转基因腺病毒载体根据COS-TPC方法制备。
首先，将5×105个/ml的细胞悬浮液4ml接种在6孔细胞培养板中，过夜培养。培养后，用转HLA-A24基因腺病毒、转PSMA基因腺病毒或未转基因的腺病毒感染上述细胞(MOI＝20-30)，再培养2天。回收腺病毒感染的细胞，用含有10％FCS的RPMI1640培养液洗涤，制备得到靶细胞。
(2)利用转基因靶细胞的CTL的功能评价
对于用腺病毒转染的转基因细胞作为评价CTL的抗原特异性反应的靶细胞是否能发挥作用，用CTL的细胞因子生成能力进行了确认。
按实施例1的(2)同样方法诱导的效应细胞用5H-RPMI稀释至1×105个/ml，所得稀释物以100μl/孔分别加在96孔U型底培养板的各孔中。接着，各孔中加入上述(1)中制备的含有1×104个靶细胞的100μl细胞悬浮液。
将培养板在37℃的CO2培养箱中放置过夜。然后，取各孔的培养上清100μl，用人IFN-γ测定用ELISA试剂盒(ジェンザィムテクノ公司制)测定IFN-γ。IFN-γ生成量根据同时测定的IFN-γ标准品的标准曲线求出。
对导入HLA-A24基因的前列腺癌细胞株LNCaP，PSMA24-3或PSMA24-5诱导的CTL生成了IFN-γ，而对没有导入HLA-A24基因的LNCaP，没有生成IFN-γ。
另外，对导入PSMA基因的HLA-A24表达细胞株888mel、SW480，PSMA24-3诱导的CTL生成了IFN-γ。对导入PSMA基因的HLA-A24表达细胞株MKN45、T.T，PSMA24-5诱导的CTL生成了IFN-γ。对HLA-A24非表达细胞株MKN28及526mel，所有CTL均没有生成IFN-γ。
以上结果表明，PSMA24-3特异性CTL及PSMA24-5特异性CTL，对导入HLA-A24基因或导PSMA基因的表达HLA-A24、表达PSMA的靶细胞，均可生成IFN-γ；由此，利用腺病毒的转基因细胞可用于CTL的功能评价；进而，这些转基因细胞因可在HLA-A24分子上呈递本发明的抗原肽，所以可用作抗原呈递细胞。序列表说明序列号1为合成的HLA-A24限制性抗原肽的序列(PSMA24-3)。序列号2为合成的HLA-A24限制性抗原肽的序列(PSMA24-5)。序列号3为HLA-A2.1限制性抗原肽的序列(PSM-P1)。序列号4为HLA-A2.1限制性抗原肽的序列(PSM-P2)。序列号5为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-9L)。序列号6为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-1Q)。序列号7为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-5S)。序列号8为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-1A)。序列号9为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-5A)。序列号10为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-1)。序列号11为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-2)。序列号12为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-4)。序列号13为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-6)。序列号14为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-7)。序列号15为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-8)。序列号16为具有HLA-A24结合基序的合成肽的序列(PSMA24-9)。序列号17为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-4A)。序列号18为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-6A)。序列号19为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-7A)。序列号20为序列号2的肽的衍生物肽的序列(PSMA24-5-8A)。
发明的效果
本发明提供对亚洲人种、尤其是日本人中，癌，具体地，前列腺癌等异常表达PSMA的癌的治疗及诊断有用的技术。具体来说，本发明的CTL可以发挥下述优良效果，即，可对癌、具体为前列腺癌等PSMA异常表达的癌进行治疗及诊断，可选择性杀伤HLA-A24及PSMA均为阳性的肿瘤细胞，且可用作治疗癌症的细胞医药(抗癌药)，且可进行离体试样中的HLA-A24及PSMA均为阳性的肿瘤细胞有无的检测。本发明的HLA-A24限制性抗原肽可选择性诱导上述CTL。由此，本发明的HLA-A24限制性抗原肽可用作CTL的诱导剂及抗癌药。本发明的抗原呈递细胞可用于该CTL的制备方法中及可用作抗癌药。根据本发明的CTL诱导方法，可达到高效且选择性地获取本发明CTL的效果。根据本发明的CTL诱导物，可高效且选择性地诱导本发明的CTL，并可表现出对亚洲人种、尤其是日本人的癌、具体为前列腺癌等异常表达PMSA的癌的治疗有用的优良性质。根据本发明的CTL敏感细胞检测方法及检测试剂，可以达到高效且选择性地检测CTL敏感细胞的优良的效果。进而，根据本发明的CTL敏感细胞检测方法及检测试剂，可达到对HLA进行分类，并应用于癌、具体为前列腺癌等的诊断等的优良效果。根据本发明的核酸，可达到高效供给本发明HLA-A24限制性抗原肽的优良效果。根据本发明的可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞的制备方法，可达到构建表达与已知靶细胞不同的、人主要组织相容性抗原与抗原蛋白质组合的靶细胞的优良效果。进而，根据本发明的可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞，可达到对以往因未能确定靶细胞而未能评价的细胞毒性T淋巴细胞进行评价的优良效果。
附图的简单说明
图1表示使用由PSMA24-3诱导的效应细胞时的结果。白色方框(□)表示用TISI(-)作为靶细胞、黑色实心圈(·)表示用TISI(+)作为靶细胞时的结果。纵坐标为特异性细胞杀伤活性(％)、横坐标为E/T比。
图2表示使用由PSMA24-5诱导的效应细胞时的结果。白色方框(□)表示用TISI(-)作为靶细胞、黑色实心圈(·)表示用TISI(+)作为靶细胞时的结果。纵坐标为特异性细胞杀伤活性(％)、横坐标为E/T比。
                        序列表<110>宝酒造株式会社(Takara Shuzo Co.Ltd.)<120>细胞毒性T淋巴细胞<130>02-013CN<150>JP2001-104693<151>2001-04-03<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：合成的HLA-A24限制性抗原肽的序列<400>1Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe1               5<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：合成的HLA-A24限制性抗原肽的序列<400>2Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe1               5<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：HLA-A2.1限制性抗原肽的序列<400>3Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val1               5<210>4<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：HLA-A2.1限制性抗原肽的序列<400>4Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val1               5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>5Asn Tyr Ala Arg Thr 6lu Asp Phe Leu1               5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>6Gln Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe1               5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>7Asn Tyr Ala Arg Ser Glu Asp Phe Phe1               5<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>8Ala Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe1               5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>9Asn Tyr Ala Arg Ala Glu Asp Phe Phe1               5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>10Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys Leu Leu  1               5<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>11Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu1               5<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>12Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Tyr Ser Ile1               5<210>13<211>10<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>13Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile Pro His Leu1               5                  10<210>14<211>10<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>14Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu1               5                  10<210>15<211>10<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>15Lys Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Pro Gly Ile1               5                  10<210>16<211>10<212>PRT<213>人工序列(Artifieial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成具有HLA-A24结合基序的肽的序列<400>16Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe1               5                  10<210>17<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>17Asn Tyr Ala Ala Thr Glu Asp Phe Phe
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              5<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于合成序列号2的肽的衍生物肽的序列<400>20Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Ala Phe
              51

Claims (21)

1.一种人体主要组织相容性抗原(HLA)-A24限制性抗原肽，其具有下述(a)或(b)的氨基酸序列，
(a)序列号1或2所示的氨基酸序列，或
(b)在序列号1或2中，具有选自下述①～③至少一种突变的氨基酸序列，
①至少缺失1个氨基酸残基，
②至少有1个氨基酸残基置换为其他氨基酸或氨基酸类似物，以及
③至少附加1个其他氨基酸残基或氨基酸类似物；
且具有可诱导具有下述T细胞受体的CTL的性质，该T细胞受体可特异性识别将上述序列号1或2所示的氨基酸序列组成的肽和HLA-A24分子形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。
2.一种细胞毒性T淋巴细胞，其具有下述T细胞受体，该T细胞受体可特异性识别将权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子结合形成的复合物呈递在细胞表面上的细胞。
3.一种细胞毒性T淋巴细胞的诱导方法，其特征在于，通过使用权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽来诱导细胞毒性T淋巴细胞。
4.权利要求3所述的诱导方法，包括以下3个步骤，
(1)将权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽与选自巨噬细胞、B细胞以及树状细胞中的1种具有抗原呈递能力的细胞接触来获取抗原呈递细胞，然后用所获抗原呈递细胞对具有抗原呈递能力的细胞进行抗原刺激，由此，来获得效应细胞的步骤，
(2)将上述步骤(1)所获效应细胞与可被权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞接触，以检测是否具有细胞毒活性的步骤，以及
(3)在上述步骤(2)中，筛选呈现细胞毒活性的效应细胞作为细胞毒性T淋巴细胞的步骤。
5.权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，在IL-7的存在的条件下，对于1个淋巴细胞，接触0.01-1个比例的抗原呈递细胞。
6.权利要求4所述的诱导方法，在IL-7和匙孔血蓝蛋白存在的条件下，将权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽，按含有外周血单核细胞的每1ml溶液中添加1ng-100μg的量添加到该外周血单核细胞中。
7.一种CTL诱导剂，其含有权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽作为有效成分，并用于获取权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
8.一种抗癌药，其含有权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽作为有效成分。
9.一种抗癌药，其含有权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞作为有效成分。
10.一种抗原呈递细胞，可将权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽和HLA-A24分子的复合物呈递在细胞表面。
11.一种CTL诱导剂，其含有权利要求10所述的抗原呈递细胞作为有效成分，并用于获取权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
12.一种抗癌药，其含有权利要求10所述的抗原呈递细胞作为有效成分。
13.一种细胞毒性T淋巴细胞敏感细胞的检测方法，其特征在于，其检测指标是，使权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触，从而引起选自CTL导致的细胞裂解、细胞因子释放以及CTL增殖的变化时，所述待测细胞为对权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞具有敏感性的细胞(敏感细胞)。
14.一种细胞毒性T淋巴细胞敏感细胞的检测剂，其含有权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞作为有效成分。
15.一种待测细胞中的人主要组织相容性抗原(HLA)-A24分子的检测方法，其特征在于，在权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽存在的条件下，使权利要求2所述的细胞毒性T淋巴细胞和待测细胞接触。
16.一种核酸，其是编码权利要求1所述的HLA-A24限制性抗原肽构成的。
17.一种可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤的靶细胞的制备方法，包括将人主要组织相容性抗原的编码核酸和/或抗原蛋白的编码核酸导入细胞的步骤。
18.权利要求17所述的制备方法，通过腺病毒载体将核酸导入细胞。
19.权利要求17或18所述的制备方法，其中，人主要组织相容性抗原的编码核酸为HLA-A24的编码核酸。
20.权利要求17～19中任一项所述的制备方法，抗原蛋白质的编码核酸为权利要求16所述的核酸。
21.一种靶细胞，由权利要求17～20中任一项所述的制备方法获取，并可被细胞毒性T淋巴细胞杀伤。
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