JPH11505103A

JPH11505103A - ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ▲上★▼１６０１と複合体を形成するペプチドをコードする単離核酸分子とその利用

Info

Publication number: JPH11505103A
Application number: JP8525000A
Authority: JP
Inventors: ベール，パスカーレ; ワイルドマン，クロード; ブーン−ファラー，ティエリー; ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; クーリ，ピエール; ルノー，ジャン−クリストフ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1999-05-18
Also published as: CA2213001C; WO1996025511A1; ZA961242B; AU697527B2; NZ302565A; CN1175977A; CA2213001A1; US5877017A; EP0811076A4; EP0811076A1; AU4864696A

Abstract

(57)【要約】腫瘍拒絶抗原先駆体のファミリーと、これらをコードする核酸分子とが開示される。これらの腫瘍拒絶抗原先駆体は、ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体と称され、これらをコードする核酸分子は、ＢＡＧＥコード分子と称される。前記コード配列と前記腫瘍拒絶抗原先駆体分子の様々な診断上及び治療上の使用方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１と複合体を形成するペプチドをコードする単離核酸分子とその利用関連出願のクロスリファレンス本出願は１９９４年２月１５日に出願した第０８／１９６，６３０号の一部継続出願であり、この出願第０８／１９６，６３０号は１９９３年６月１７日に出願した第０８／０７９，１１０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、病理状態の診断と治療とに関して有用な、核酸分子、たん白質、及びペプチドとに関する。本発明は、更に、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示されるペプチドにプロセッシングされる前記たん白質とペプチド、及びその提示されるペプチド自身に関する。これらのペプチドは、診断及び治療に於いて有用である。背景及び従来技術ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これに対して反応するプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセッシングされるより大きな分子に由来する。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他のＡｄｖａｎｃｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする点で、限定されたものである。たとえ、特定のパートナーとなる複合体が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなければＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、免疫システムの、外来の物質に対する応答、自己免疫疾患、そして細胞異常に対する応答に関係している。タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）：マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）；及びラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関連付けられてきた。例えば、ここに参考文献として添付される１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、細胞表面上に発現されるペプチドにプロセッシングされ、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を可能にする遺伝子の一つのファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原先駆体」、即ち、”ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われており、これらに由来するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」、又は、”ＴＲＡ” と呼ばれている。この遺伝子ファミリーの詳細については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５（１９９２）：ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。更に、米国特許第５，３４２，７７４号を参照。この開示内容をここに参考文献として添付する米国特許出願第９３８，３３４号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれば、特定のペプチドが一つのＨＬＡ分子と結合し、他の分子には結合しないと予期される、と教示している。これは重要である。というのは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。その結果、ある特定のペプチドが特異的ＨＬＡ分子のパートナーとして同定されることが様々な診断上及び治療上の効果を有するとしても、これらはこの特定のＨＬＡ表現型を保有する個体にしか適切でないことになる。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られている訳ではないので、この分野において更に研究が必要であり、標的治療の為には対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現産物が、第２のＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１分子によって提示される。この開示には、あるＴＲＡＰが複数のＴＲＡを産生することが可能であることが示されている。ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号にはチロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この文献には、いくつかの正常細胞（例えば、メラノサイト）によって生成される分子が、腫瘍細胞内でプロセッシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を作ることが開示されている。ここに参考文献として添付する１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼに由来するのではない第２のＴＲＡが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されることが教示されている。このＴＲＡは、ＴＲＡＰに由来するものではあるが、非ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされる。この開示は、特定のＨＬＡ分子が、異なった起源に由来するＴＲＡを提示する可能性があるということを示している。参考文献として添付する１９９３年６月１７日出願の米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、そこにおいてＢＡＧＥファミリーと称されているところの遺伝子の新規なファミリーが開示された。これらの遺伝子も、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードすることが観察された。同出願に於いて、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１として知られているＭＨＣ分子がＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体に由来する腫瘍拒絶抗原を提示することが開示されている。しかし、その腫瘍拒絶抗原は開示されなかった。前記腫瘍拒絶抗原は、ここに参考文献として添付する１９９４年２月１５日出願の米国特許出願第０８／１９６，６３０号に開示されている。同出願は、又、前記腫瘍拒絶抗原の派生効果、更にこの抗原を利用した治療及び診断方法も開示している。本出願は、特許出願第０８／１９６，６３０号に記載されているＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする単離核酸分子に関する。本出願は、更に、前記単離ＢＡＧＥ核酸分子を利用した治療及び診断方法にも関する。本発明を、以下の開示に於いて更に詳述する。図面の簡単な説明上述した簡単な記載、及び本発明の更に別の課題及び特徴は、本発明の好適な、但し例示的な実施例の以下の詳細な説明を、添付の図面を参照して斟酌することにってより完全に理解されるであろう。ここで、図１は、図１Ａ及び図１Ｂから成る。図１Ａは、ＭＺ２−ＭＥＬのサブラインであるＭＺ２−ＭＥＬ．３．０、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１、ＭＺ２−ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４に対するＣＴＬクローン８２／８２の溶解活性を示している。図１Ｂは、ＭＺ２−ＭＥＬサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３と、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１陽性患者由来のメラノーマ細胞ラインＭＩ４０２４／１−ＭＥＬ及びＬＢ１７ −ＭＥＬとに対するＣＴＬクローン８２／８２の溶解活性を示している。図２は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみ、ｃＤＮＡ−ＡＤ５との組み合わせ、又はＡＤ５のみ、をそれぞれトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞に接触した時に於ける、ＣＴＬ８２／８２によるＴＮＦ放出を示している。ＣＴＬ８２／８２は、コントロールとして、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３とＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５とも接触させた。図３は、図３Ａと３Ｂとから成る。図３Ａは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５とを坦持する発現ベクターをコトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲマウス細胞と、更に、トランスフェクションしなかったＰ１．ＨＴＲ、および、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみをトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲ、のＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。図３Ｂは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とＢＡＧＥ由来ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ；（配列認識番号３）とをトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲのＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。図４は、ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示している。箱内のセグメントは、前記先駆体由来の腫瘍拒絶抗原である。図５は、メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０と患者ＭＺ２からの血液リンパ球と、マウス細胞ラインＰ１．ＨＴＲとから抽出されたＤＮＡのサザン・ブロットを示している。図６は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞中に於けるＢＡＧＥの発現のノザン・ブロット分析を示す。図７は、メラノーマライン、腫瘍及び正常サンプル由来のｃＤＮＡ、更に、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３由来のゲノムＤＮＡの、ＰＣＲ増幅を示している。図８は、ＢＡＧＥにコードされるペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）又は、ノナペプチドＡＲＡＶＦＬＡＬＦ（配列認識番号４）又はＭＡＡＲＡＶＦＬＡ（配列認識番号５）とインキュベートしたリンパ芽球細胞ラインＭＺ２ −ＥＢＶのＣＴＬ８２／８２による溶解を示している。発明の詳細な説明例１メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬを、標準方法を使用して患者ＭＺ２から得た。この細胞ラインは、ここに参考文献として添付する１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４に記載されている。前記細胞ラインの確立後、そのサンプルを照射し、これを非増殖性にした。多数のサブクローンをＭＺ２−ＭＥＬから得た。具体的には、クローナルラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０を制限希釈によってＭＺ２−ＭＥＬから得た。次に、このＭＺ２−ＭＥＬ．３．０培養物を更に培養した。培養での１５０世代以上後、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１として示す新たなサブラインが得られた。ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１は、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０に対して強い溶解活性を有する自己由来ＣＴＬクローンの大きなフラクションに対して抵抗を有することがわかった。ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１は、ＨＬＡ−Ａ２９、Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする遺伝子を失ったと判断された（ここに参考文献として添付するファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２１３４−２１４０（１９９４）参照）。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３を、変異誘発物質処理後に生存したＭＺ２− ＭＥＬ．３．０細胞から制限希釈によって誘導した（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：６３４− ６４０（１９８９））。抗原ＭＺ２−Ｅを発現しないクローンサブラインＭＺ２ −ＭＥＬ．２．２を、自己由来抗−ＭＺ２−ＥＣＴＬクローンによってサブクローンＭＺ２−ＭＥＬ．３．１から選択した（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，前述）。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５を、抗−ＭＺ２−ＦＣＴＬクローンによってサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２から選択した。ＭＺ２−ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４を、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１遺伝子をサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５へのトランスフェクションによって得た（ファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。メラノーマ細胞ラインを、ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，前述及びトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５−１５２（１９９２）によって以前に記載されている要領で成長させた。細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬに対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞クローン（“ＣＴＬ”）を、照射済みＭＺ２−ＭＥＬ細胞を利用して得た。具体的には、末梢血液単核細胞（“ＰＢＭＣ”）のサンプルを、患者ＭＺ２から採取して、これを、前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。その混合物の前記メラノーマ細胞の溶解を観察したところ、前記メラノーマ細胞によって提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的なＣＴＬが前記サンプル中に存在することが示された。使用した溶解アッセイは、ここに参考文献として添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）に基づくクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについてはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞をイン・ヴィトロで生育させ、次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと５０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中で４ｘ１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄とともに３７℃で６０分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、その後、１０³個の細胞を含む１００μｌのアリコットを、９６ウェルマイクロプレート中に分配した。ＰＢＬのサンプルを、１００μｌの同じ培地に添加し、同様にアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離し、３７℃で８％のＣＯ₂雰囲気中にて４時間インキュベートした。プレートを再び遠心分離し、１００μｌの上清のアリコットを採取し、カウントした。⁵¹Ｃｒ放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。％⁵¹Ｃｒ放出＝（（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ））×１００ここで、ＥＲは観察された実験⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³標識化細胞を２００ μｌの培地中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そしてＭＲは、１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を標的細胞に添加することによって得られた最大放出量である。高いＣＴＬ活性を示した前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張及びクローン化を行い、同じ方法を使用して再スクリーニングした。このようにしてＣＴＬクローンＭＺ２−ＣＴＬ８２／８２を単離した。前記クローンを、以後「８２／８２」と称する。ＭＺ２−ＭＥＬサブラインと他のメラノーマラインとを、ＣＴＬクローン８２／８２に接触させ、クロム放出を測定することによって溶解活性を判定した。クロム放出は４時間後に測定した。図１Ａは、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０とＭＺ２− ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４との溶解を示している。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．１は、ＣＴＬ８２／８２によって溶解されなかった。図１Ｂは、ＣＴＬ８２／８２によるクローンラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３の溶解があることを示している。更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１対立遺伝子を有するメラノーマ細胞ラインＭＩ４０２４／１−ＭＥＬ及びＬＢ１７／ＭＥＬがＣＴＬ８２／８２によって溶解された。例２ＣＴＬ８２／８２によって認識される抗原をコードする遺伝子を同定した。ここに記載するように、前記遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーとＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをコトランスフェクションすることによって同定された。ＣＴＬ８２／８２のＭＺ２−ＭＥＬ．４３に対する特異性に依り、この細胞ラインのｃＤＮＡを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーを形成した。前記ｃＤＮＡライブラリーをＭＺ２−ＭＥＬ．４３から構築するために、ｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、ｍＲＮＡ抽出キットを使用してＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞から抽出した。前記ｍＲＮＡを、ランダム・プライマーを使用してｃＤＮＡに変換し、標準的技術を使用してアダプターに結合させ、これをＳＶ４０の複製開始点を含む発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１にエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜した。前記ライブラリーは、６６，０００個のインサートを有し、これを４００のバクテリアの８７のプールと２００のバクテリアの２９７のプールとに分けた。前記プラスミドの約７０％が一つのインサートを有していたことから、これらのプールはそれぞれ、約２８０又は１４０種類のｃＤＮＡを含むことになる。これらバクテリアの各プールを、飽和まで増殖させ、プラスミドＤＮＡを周知のアルカリ溶解方法によって抽出した。プラスミドｐｃＤ−ＳＲαに、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをトランスフェクションした。次に、ｃＤＮＡプールと、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡを含有する前記ｐｃＤ−ＳＲαプラスミドを同一のＣＯＳ−７細胞のマイクロカルチャーにコトランスフェクションした。トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法によって行った（シード（Ｓｅｅｄ）他Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３３６５−３３６９（１９８７）：ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，１６２：１５６−１５９（１９９３））：クーリ(Ｃｏｕｌｉｅ)他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４））。簡単に説明すると、１．５ｘ１０⁴ ＣＯＳ−７細胞に、１００ｎｇのＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤ−ＳＲαと、１００ｎｇの前記ｃＤＮＡライブラリーのプール、即ち、１００ｎｇのｃＤＮＡクローン、をトランスフェクションした。前記ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡを、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３から抽出されたＲＮＡで調合したｃＤＮＡライブラリーから単離した（ファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。コトランスフェクション体を、２４又は４８時間後に、ＣＴＬによって腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生を刺激する能力をテストした（トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２３５：１４５−１５２（１９９２））。１５００のＣＴＬを、１０％のヒト血清と、２０Ｕ／ｍｌｒ −ｈｕ−ＩＬ−２とを含有する１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中にて、標的細胞を含有するマイクロ・ウェルに添加した。２４時間後、上清を収集し、そのＴＮＦ含有率を、ＭＴＴ比色定量アッセイ（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）他，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３９０−３９６（１９８９）及びトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，前述）に於いて、ＷＥＨＩ−１６４クローン１３（Ｅｓｐｅｖｉｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９５：９９− １０５（１９８６））細胞に対するその細胞障害性効果をテストすることによって判定した。トランスフェクションされたｃＤＮＡの３８４のプール（２００のバクテリアの２９７のプールと４００バクテリアの８７のプール）の内、二つが４０ｐｇ／ｍｌ以上のＴＮＦを含む陽性上清を産生したのに対して、その他のプールでトランスフェクションしたマイクロカルチャーの全部のＴＮＦ濃度は、５ｐｇ／ｍｌ以下であった。４００の別々のバクテリアを含むこれらのｃＤＮＡプールの内の一つから、８００のバクテリアがサブクローン化された。それらのそれぞれからプラスミドＤＮＡを抽出し、前述したＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１コンストラクトと共にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。１２のクローンが、ＣＴＬ８２／８２による認識を得た。ｃＤＮＡ−ＡＤ５として示すそれらの内の一つから得られた結果を図２に示す。図２は、ｃＤＮＡ−ＡＤ５とＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをコトランスフェクションした、又はこれらｃＤＮＡのいずれか一方をトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞によるＣＴＬ８２／８２の刺激を示している。前記ｃＤＮＡを、前述した要領で発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαに挿入した。ＣＴＬ８２／８２のサンプルを、前記トランスフェクションの１日後に添加し、その上清のＴＮＦ含有率を、ＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞に対するその障害性を１日後にテストすることによって推定した。ポジティブとネガティブとのコントロールを、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３及びＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５細胞を用いて行った。トランジェントなトランスフェクションに於いてｃＤＮＡ−ＡＤ５で得られた結果を確認するために、ステーブルなトランスフェクション体も準備した。マウスの腫瘍細胞ラインＰ８１５由来のトランスフェクション性の高いバリアントであるＰ１．ＨＴＲ（ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，Ｓｏｍ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．，１１：４６７−４７５（１９８５））（ニコラス（Ｎｉｃｏｌａｓ）他，ＣＳＨＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆ．，１０：４６９−４８５（１９８３））とＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみ、又は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５との両方とともに、燐酸カルシウム沈降法を使用して、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５の両方をトランスフェクションした。前記関連ｃＤＮＡを、前述した要領で、発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαに挿入した。クローナルサブラインを、抗ジェネチシントランスフェクション集団から単離した。トランスフェクションされた細胞は、ＣＴＬ８２／８２と接触された時、ＣＴＬ８２／８２によって溶解され、これは前記抗原がこれらのマウス細胞内でもプロセッシング可能であることを示した。図３Ａは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１及びｃＤＮＡ−ＡＤ５を坦持する発現ベクターをコトランスフェクションされたＰ１．ＨＴＲマウス細胞のＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。トランスフェクションされていないＰ１．ＨＴＲとＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみによってトランスフェクションされたＰ１．ＨＴＲもテストした。例３ｃＤＮＡ−ＡＤ５のＤＮＡ配列分析を、合成オリゴヌクレオチドでの特異的プライミングによって行った。配列認識番号１は、ここで「ＢＡＧＥ」と称する同定された遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド情報を示している。前記シークエンシング反応は、ジデオキシ−チェーンターミネーション法（Ｔ７シークエンシングキット、ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｐｓａｌａＳｗｅｄｅｎ，ΔＴＡｑ（商標名）サイクルーシークエンシングキット，ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）によって行った。配列相同性のコンピュータ検索を、プログラムＦＡＳＴＡ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ及びｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．によって行った。その配列は、コード領域の外部に位置するＡｌｕ反復（ヌクレオチド３８５から４８４）を除いて、現在データバンクに記録されている他のいずれの配列に対しても大きな類似性を有していない。例４ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示される前記抗原をコードするＢＡＧＥの領域を決定した。この領域を同定するために、多数の切形ＢＡＧＥｃＤＮＡクローンを作った。ＢＡＧＥをエキソヌクレアーゼＩＩＩで様々なインキュベーション時間で消化させることによって、３‘末端から始まる段階的なデリーションを生成した。その切形バリアントを、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに再結合し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＦ’ＩＱにエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μ ｇ／ｍｌ）で選抜した。このようにして４３８のクローンが得られた。前記プラスミドＤＮＡを、これらの４３８のクローンから得て、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、その抗原をコードする能力をテストした。これらのトランスフェクション体を、前述した要領でＴＮＦ放出アッセイでテストした。陽性クローンは、ＣＴＬ８２／８２によってＴＮＦ放出を刺激したものであった。細胞を陽性と陰性のトランスフェクション体に分けた後、５つの陽性と５つの陰性とからのプラスミドＤＮＡの配列を決定した。陽性クローンであるクローン１９Ｃ２は、ヌクレオチド２０１からヌクレオチド２６７までの、前述したＢＡＧＥ遺伝子に対するオープンリーディングフレームの一部を有していた。これに対して、陰性のトランスフェクション体であるクローン１７Ｇ１２は、ヌクレオチド２０１−２０６を有していた。これは、抗原ペプチドが、前記オープンリーディングフレームの最初の６７個のヌクレオチドによってコードされたことを示すものであった。ＢＡＧＥの配列を示す図４は、又、最大のオープンリーディングフレームによってコードされる４３のアミノ酸の推定たん白質をも示している。このたん白質は、提示ペプチドの配列を有しているものと同定された。ここで配列認識番号２と称するこの４３のアミノ酸たん白質は、次の通りである。ＭＺ２−ＣＴＬ８２／８２によってＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１と共同して認識されるペプチドに対応する配列は、箱内に示されている。この配列をここで配列認識番号３：ＡｌａＡｌａＡｒｇＡｌａＶａｌＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕと称する。例４に記載したように、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーＶＤＢ８５（配列認識番号６）（センス）及びＶＤＢ８６（配列認識番号７）（アンチセンス）の配列は、矢印の下線を引かれている。これに基づいて、いくつかの合成ペプチドが作られた。ペプチドは、アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）他，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．，１：５３８−５４６（１９８１）によって記載される、トランジェントなＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを使用して固体相上で合成され、質量分析法によってキャラクタライズされた。すべてのペプチドは、分析ＨＰＬＣによって示されているように純度＞９０％であった。凍結乾燥したペプチドを、ＤＭＳＯ中で２０ｍｇ／ｍｌに溶解し、１０ｍＭの酢酸中で２ｍｇ／ｍｌの割合で希釈し、８０℃で保存した。ペプチドを、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクションし、これらペプチドとともにインキュベートしたＣＯＳ−７細胞でのＣＴＬ刺激アッセイでテストした。これらは、又、前述した要領で、クロム放出アッセイによってもテストした（ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０））。このペプチド感作アッセイに於いて、標的細胞を、１時間３７℃で⁵¹Ｃｒ標識化し、広範囲に洗浄した。次に１０００の標的細胞を、ＣＴＬ８２／８２細胞を添加する前に、様々な濃度のペプチドの存在下に於いて、９６ −ウェルマイクロプレート中にて３０分間３７℃でインキュベートした。クロム放出を、４時間後３７℃で測定した。図８は、ＢＡＧＥコードペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベートしたリンパ芽球細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．ＥＢＶのＣＴＬ８２／８２による溶解を示している。前記ＣＴＬとの標的細胞のインキュベーション中のペプチドの最終濃度が示されている。矢印は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３の溶解の百分率を示している。患者ＭＺ２からのリンパ芽球細胞ラインのＣＴＬ８２／８２による溶解に対する感作が、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）（アミノ酸２−１０、図４）で観察された。最大値の半分の溶解は、３０ｎＭのペプチド濃度で得られた（図８）。Ｎ−末端Ａｌａを含まないノナペプチド、即ち、ＡＲＡＶＦＬＡＬＦ（配列認識番号４）、あるいはＣ−末端Ｌｅｕを含まないノナペプチド、即ちＭＡＡＲＡＶＦＬＡ（配列認識番号５）は、標的細胞を感作して溶解させることができなかった。Ｐ１．ＨＴＲ細胞にＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１をトランスフェクトし、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションした。そのトランスフェクションされた細胞は、ＣＴＬ８／８２によって溶解された。図３Ｂは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクションされ、１μＭのＢＡＧＥコードノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションされたＰ１．ＨＴＲのＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。クロム標識化細胞の溶解を、４時間後にテストした。患者ＭＺ２のさまざまな血液サンプルからセットアップされた二つのＭＬＴＣ（リンパ球・腫瘍細胞混合培養）から、前記ＢＡＧＥ／ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１抗原を認識する６つのＣＴＬクローンが誘導された。これらは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１とＢＡＧＥｃＤＮＡ−ＡＤ５とをコトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の存在下に於いてＴＮＦを産生した。これらは、又、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１をトランスフェクションされ、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションされた細胞にも応答した。少なくとも３種類のＣＴＬ前駆体がこのＢＡＧＥ抗原を認識できるようである。ＣＬＴクローン８２／１はＶα２，Ｖα３，及びＶβ１３を発現したのに対して、ＣＴＬクローン２５／２４４は、Ｖα８，Ｖβ８を発現し、ＣＴＬクローン８２／８２はＶα３，Ｖα４およびＶβ１３を発現した。Ｖα及びＶβ発現は、次の要領で判定した。さまざまなＣＴＬクローンからの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ^★Ｂ（Ｃｌｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して準備した。単鎖ｃＤＮＡ合成を、オリゴ（ｄＴ）とＲＮＡｓｅＨ活性の無いモロニーマウス白血病ウィルス−由来逆転写酵素とで行った。ＰＣＲを、ジュネーヴェ（Ｇｅｎｅｖｅｅ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１２６１−１２６９（１９９２）によって記載されているＴＣＲ可変領域（Ｖα１−Ｗ２９，Ｖβ１−Ｗ２４）と定常領域（Ｃα，Ｃβ）配列とに対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴＣＲ−α、及び−βｃＤＮＡ増幅によって行った。ＴＣＲＶα及びＶβ ＰＣＲ増幅の特異性は、サザン・ブロッティングと、増幅に使用したものに対して内部にある³²Ｐ標識化Ｃα又はＣβオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって評価した。例５組織中に於けるＢＡＧＥの発現を、逆転写とｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）によってテストした。メラノーマライン、腫瘍及び正常組織サンプルからのｃＤＮＡと、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。全ＲＮＡを、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１３０−１３５（ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）に記載されているグアニジン− イソチオシアネート法によって抽出した。逆転写を、２μｇの全ＲＮＡに対して、４μｌの５ｘ逆転写酵素バッファーと、２μｌの２０ｍＭのオリゴ（ｄＴ）１５プライマー溶液と、２０ＵのＲＮａｓｉｎと、２μｌの０．１Ｍジチオトレイトールと、２００ＵのＭｏＭＬＶ逆転写酵素と１μｌの各１０ｍＭのｄＮＴＰ溶液とを含有する２０μｌの反応容量で行った。前記反応物を、４２℃で６０分間インキュベーションした。前記ｃＤＮＡ産物の１／２０を、次に、５μｌの１０ｘ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼバッファーと、１μｌの各１０ｍＭのｄＮＴＰ溶液と、１μｌの各２５μＭのプライマー溶液と、１ＵのＤｙｎａＺｙｍｅ（商標名）と、水とを５０μｌの最終容量にまで添加した。前記ＰＣＲプライマーは、５‘−ＴＧＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ−３’（配列認識番号６）（ＶＤＢ８５，センス、ヌクレオチド１００−１１７）と５‘−ＣＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＧ−３’（配列認識番号７）（ＶＤＢ８６、アンチセンス、ヌクレオチド３６７−３８５）であった。ＰＣＲを、３０サイクル（９４℃で１分間、６２℃で２分間及び７３℃で２分間）行った。１０μｌの前記ＰＣＲ産物を、１．５％アガロース・ゲル上でサイズ分画した。ＲＮＡ調合物の品質を、ヒト β−アクチンｃＤＮＡを、プライマ−５‘−ＧＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧ−３’（配列認識番号８）（エキソン４、センス）及び５‘−ＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ−３’（配列認識番号９）（エキソン６、アンチセンス）と共に、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって、９４℃で１分間、６８℃で２分間、７２℃で２分間の２１サイクルでのＰＣＲ増幅を行うことによってテストした。前記ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドによって染色した１．５％のアガロース・ゲル上で視覚化した。精巣を除いて正常な成人組織には遺伝子ＢＡＧＥの発現は見られなかった（図７と下記の表１参照）。前記遺伝子は、胎盤と臍帯及び、２０週齢以上の胎児からのいくつかの組織サンプルとにおいてもサイレントであった。テストした１２のＥＢＶ−形質転換リンパ芽球細胞ラインや、フィトヘマグルチニンで刺激した血液リンパ球中に於いてもＢＡＧＥの発現は見られなかった。ＢＡＧＥは、精巣を除いて、メラノサイトを含む正常成人組織中でサイレントであるようである。その発現が逆転写とＰＣＲとによってテストされたので、正常組織に於いて検出可能な産物が不在であるということは、腫瘍ＭＺ２−ＭＥＬに於いて観察されるものの０．１％以下の発現レベルを示すものである。例６腫瘍サンプルと細胞ラインとに於けるＢＡＧＥの発現も測定した。組織起源の異なる６００の腫瘍サンプルのＢＡＧＥ発現を分析した。下の表２に示されているように、ＢＡＧＥ遺伝子は、主に、メラノーマ（２２％）、膀胱癌（１５％）、乳癌（１０％）、及び頭部及び首部扁平上皮細胞癌（８％）に於いて発現する。より低い率の陽性サンプルが、肉腫（６％）と非−小細胞肺癌（６％）に見られた。腎臓、結腸直腸および前立腺癌、白血病、又はリンパ腫にはＢＡＧＥの発現は見られなかった。非常に少数の例外を除き、ＢＡＧＥを発現した腫瘍サンプルは、前に概略説明したＭＡＧＥ遺伝子の一つも発現した。ＢＡＧＥは、メラノーマの一次病変（８％）よりも転移病変（２６％）に於ける方がより頻繁に発現された。膀胱の過渡性細胞癌に於いて、３０％の侵入性腫瘍がＢＡＧＥを発現したのに対して、皮相性腫瘍に於いては発現は観察されなかった。ＢＡＧＥは、腫瘍サンプルよりも腫瘍細胞ラインにおいて、より高い比率で発現された。すなわち、３２／６０メラノーマ（５３％）と３／１５直腸結腸癌細胞ライン（２０％）が陽性であった。これは、又、ＭＡＧＥ遺伝子においても観察され、これは、恐らく、腫瘍細胞ラインが転移性腫瘍からより容易に誘導されることに依る。例７ＢＡＧＥ抗原の提示分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１は、有用な抗体が入手不能である為、血清アッセイに於いては同定することができない。しかしながら、その発現は、逆転写とｎｅｓｔｅｄＰＣＲとによってテストすることが可能である。約７％（７／９９）の白色人種の個体が、このＨＬＡ対立遺伝子を発現することがわかっている（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。細胞表面上に於けるＨＬＡ−Ｃ分子の濃度は、恐らく、β２− ミクログロブリンに対する結合の能率が低いことに依り、ＨＬＡ− ＡおよびＢの濃度の約１／１０以下であると報告されている（ニーフジェス（Ｎｅｅｆｊｅｓ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：８０１−８１０（１９８８））。しかしながら、ＢＡＧＥがＨＬＡ−Ｃ分子上で認識されるペプチドをコードすることが判り、これは、ＨＬＡ−Ｃ分子もＣＴＬに対する抗原の提示に於いて重要な役割を果たしていることを示唆している。例８患者ＭＺ２の血液リンパ球と、前記メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０とから抽出されたＤＮＡでサザン・ブロットを行った。サザン・ブロット分析を行うために、メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０、患者ＭＺ２のＰＢＬおよびマウス細胞ラインＰ１．ＨＴＲからのＤＮＡをＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ＤＮＡキャピラリートランスファーを、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（商標名）メンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でのアルカリ・ブロッティングによって行った。トランスファー後、前記メンブレンを、２ｘＳＳＣ中で洗浄し、８０℃で１時間ベーキングし、６ｘＳＳＣ，１０ｘデンハルト溶液中にて６０℃で３０分間前処理した。次に、このメンブレンを、３．５ｘＳＳＣ，１ｘデンハルト溶液、２５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ７．０，０．５％ＳＤＳ，２ｍＭＥＤＴＡ，１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、およびＰＣＲによって作成された２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの１２１ｂｐ³²Ｐ− 標識化プローブ（配列認識番号１のヌクレオチド２１１−３３１）中にて６５℃ で１８時間ハイブリダイゼーションした。前記メンブレンを、次に、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で６５℃で２ｘ１５分間洗浄し、次に、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間洗浄し、１０日間オートラジオグラフィーにかけた。このブロットが、上述した１２１ｂｐプローブによってハイブリダイゼーションされた時、ＥｃｏＲＩで切断されたＤＮＡを含むレーンに４つのバンドが観察され、ＨｉｎｄＩＩＩ切断の後には６つのバンドが観察された（図５）。前記プローブの小ささと、コード配列中のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の不在とを考えると、これらの結果は、ＢＡＧＥが複数の関連する遺伝子からなるファミリーに属するものであることを示している。例９サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３のｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを用いて行ったノザン・ブロットを、配列認識番号１のヌクレオチド１００−３８５を含む２８６ｂｐのＢＡＧＥプローブでハイブリダイゼーションした。ノザン・ブロット分析を行うために、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３からのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、ｍＲＮＡ抽出キットを使用して調整した。マウスの腎臓組織からの全ＲＮＡを、前述のデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他に記載されているグアニジン−イソチオシアネート法によって抽出した。ｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴカラム上で全ＲＮＡから精製した。ノザン・ブロット分析のために、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３から５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡと、マウス腎臓細胞からの５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡとを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロース・ゲル上で分画し、１０ｘＳＳＣ中にてメンブレン上にトランスファーした。前記メンブレンを、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ及び１ＭＮａＣｌ中にて６０℃で１５分間、プレハイブリダイゼーションし、同じ溶液中にて、２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの前記２８６ｂｐ³²Ｐ−標識化プローブとともに、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションした。前記メンブレンを、０．２ｘＳＳＣ中にて室温で１０分間、次に、０．１％ＳＤＳを添加した０．２ｘＳＳＣ中で６０℃で２ｘ２０分間、洗浄し、１５時間オートラジオグラフィーにかけた。マウスβ−アクチンプローブを用いて同じメンブレン上にてコントロールハイブリダイゼーションを行った。図６は、この実験の結果を示している。各レーンは、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞からの５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを含んでいた。β−アクチンプローブを用いて同じメンブレン上にてコントロールハイブリダイゼーションを行った。約１および２．４ｋｂの２本のバンドが観察された。これまでのところ、ヒトのメラノーマに於いて、自己由来ＣＴＬによって認識される２つの主要なクラスの抗原が見つかっている。第１のクラスの抗原は、腫瘍中に於いて非常に特異的に発現される遺伝子によってコードされる。遺伝子ＭＡＧＥ−１によってコードされる抗原が第１の例であり（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１））、その後に、遺伝子ＭＡＧＥ−１とＭＡＧＥ−３とによってコードされる他の抗原が続く（ゴーグラー（Ｇａｕｇｌｅｒ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：９２１−９３０（１９９４）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。マウスの肥満細胞腫Ｐ８１５上に於いて観察される腫瘍拒絶抗原も、精巣を例外としてすべての正常成人組織中においてサイレントな遺伝子の活性化から生じた（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：１３７３−１３８４（１９９１））。第２のクラスの抗原は、メラノサイトとメラノーマとに於いてのみ発現される遺伝子によってコードされる分化抗原である。チロシナーゼによってコードされる抗原がこのクラスの第１の例であり（ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他，Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９９３）；ロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：７５９−７６４（１９９４）、これらは更にＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３５−４２（１９９４）；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５−３５１９（１９９４））と、ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５−１００９（１９９４）；コックス（Ｃｏｘ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１６−７１９（１９９４））とによってコードされる抗原も含む。上記諸例は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする核酸分子の単離を示すものである。しかしながら、この“ＴＲＡＰ”のコードする分子は、前述した諸文献に記載されている過去に開示されたＭＡＧＥをコードする配列のいずれとも相同性を有していない。従って、本発明の一態様は、配列認識番号１に示すヌクレオチド配列を有する単離核酸分子である。この配列は、これを前記諸文献に於いて記載されているＭＡＧＥ遺伝子のすべての配列と比較することから明らかなように、ＭＡＧＥをコードする配列ではない。非ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体もコードするものであるが、ストリンジェントな条件下に於いて前述したヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする核酸分子配列も本発明の一部を構成するものである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、当該技術に於いて周知のパラメータをいう。より具体的には、ここでのストリンジェントな条件とは、３．５ｘＳＳＣ、１ｘデンハルト溶液、２５ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、および２ｍＭＥＤＴＡ中に於ける、６５℃で１８時間のハイブリダイゼーションをいう。その後、フィルタは、６５℃で、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で２ｘ１５分間と、更に、０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で１ｘ１５分間の４回の洗浄を行う。同程度のストリンジェントな条件をもたらすために使用可能なその他の条件、試薬等もあるが、これらの条件は当業者には周知であるのでここでは記載しない。上記諸例から、又、本発明が前記配列の発現ベクターに於ける使用と、更に、原核細胞株（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）あるいは真核細胞（たとえば、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞）を含む宿主細胞および細胞ラインをトランスフォーメーション又はトランスフェクションするためのこれら配列の使用も含むことが理解されるであろう。前記発現ベクターは、前記配列が、プロモーターと操作可能にリンクされていることを必要とする。前記発現ベクターは、又、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸配列も含むことが可能である。ベクターが両方のコード配列を含む場合には、それを利用して、正常にはいずれも発現しない細胞をトランスフェクションすることも可能である。上記腫瘍拒絶抗原先駆体コード配列は、たとえば、宿主細胞が既にＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する場合等において、単独で使用することも可能である。もちろん、使用可能な具体的な宿主細胞についての限定はない。所望の場合、前記２つのコード配列を有するベクターをＨＬＡ− Ｃｗ^★１６０１提示細胞に使用することが可能であり、同様に、腫瘍拒絶抗原先駆体の遺伝子をＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現しない宿主細胞に使用することが可能である。本発明は、更に、技術者がそれによって所望の単数又は複数の発現ベクターを作ることが可能な発現キットをも含む。このような発現キットは、前述したコード配列のそれぞれの少なくとも分離(separate)部分を含むものである。前述した必要な配列が含まれる限り、所望の場合、他のコンポーネントを追加することも可能である。本発明の核酸分子とＴＲＡＰとを前述したＭＡＧＥファミリーから区別するために、本発明を、遺伝子とＴＲＡＰのＢＡＧＥファミリーと称する。従って、ここで“ＢＡＧＥ”は、前述した配列によってコードされる前記腫瘍拒絶抗原先駆体を指す。“ＢＡＧＥコード分子”とこれに類似の用語とは、前記核酸分子自身を記載するのに使用される。更に、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を提示する細胞の同定に使用可能なペプチド、たとえば、配列認識番号３のペプチド、も本発明の一部を構成する。これを達成する一つの方法は、検出可能なシグナルを備えたこれらのペプチドを投与し、その後、たとえば、前記ペプチドが結合した細胞を同定することである。これを達成する別の方法は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１提示細胞が結合する固相結合ペプチドを使用して、これらをアッセイされているサンプルから分離することである。更に、本発明によって、当業者は、ＴＲＡＰの発現によって特徴付けられる疾患を診断することができる。これらの方法は、前記ＴＲＡＰ遺伝子の発現の測定および／又は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示されるＴＲＡ等のそこから由来するＴＲＡの発現の測定を含む。前者の場合、このような測定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定アッセイ、又は標識化ハイブリダイゼーションプローブによるアッセイ等によって行うことができる。後者の場合には、抗体等の、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体に対する結合パートナーによるアッセイが特に好ましい。測定の別の方法としては、上述したタイプのＴＮＦ放出アッセイがある。ＴＲＡＰ遺伝子の単離によって、ＴＲＡＰ分子自身、特に、配列認識番号１によってコードされる前記アミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子を単離することも可能になる。これらの単離された分子は、ＴＲＡとして、又は、ＴＲＡとＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１等のＨＬＡとの複合体として提示された場合、アジュバント等の物質と結合させて、ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴付けられる疾患の治療に有用なワクチンを製造することができる。更に、ワクチンは、非増殖性癌細胞、非増殖性トランスフェクション体等の、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞から作ることができる。ＢＡＧＥとＭＡＧＥ抗原との両方に対する免疫化を行うことができる。細胞がワクチンとして使用されるすべてのケースに於いて、これらは、ＣＴＬ応答を証明するのに必要な成分の１つ又は両方をコードする配列でトランスフェクションされた細胞、又は、トランスフェクション無しで両方の分子を発現する細胞であるといえる。更に、前記ＴＲＡＰ分子、その関連ＴＲＡ、およびＴＲＡとＨＬＡとの複合体は、当該技術に於いて周知の標準的技術を使用して、抗体の製造に利用することができる。ここで「疾患」という時、これは、腫瘍拒絶抗原先駆体が発現されるすべての病状を指す。このような疾患の一例は特に癌メラノーマである。当開示に基づく治療方法は、患者の免疫システムによる応答、すなわちＨＬＡ −Ｃｗ^★１６０１等のＴＲＡ提示細胞が溶解されることを前提としている。このような方法の一つは、前記複合体に対して特異的なＣＴＬを、問題の表現型の異常細胞を有する患者に投与することである。このようなＣＴＬをイン・ヴィトロに開発することは十分に当業者の技術範囲に含まれる。具体的には、血液細胞等のサンプル細胞を、前記複合体を提示し、特異的なＣＴＬの増殖を促進することが可能な細胞に接触させる。標的細胞は、上述したタイプのＣＯＳ細胞等のトランスフェクション体であってよい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、対象のＣＴＬと結合された時に、その増殖を刺激する。このように使用したようなＣＯＳ細胞は、広く一般に入手可能であり、その他の適当な宿主細胞も同様である。養子移入と称される治療方法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）：レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）：リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０（１９９１）：Ｋａｓｔ他、Ｃｅｌｌ５９：６０３−６１４（１１−１７−８９）について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬと結合させ、これに対して特異的なＣＴＬを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬを、前記特定の複合体を提示している異常細胞のいくつかによって特徴付けられる細胞異常を有する患者に投与する。すると、ＣＴＬが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。上述の治療方法は、患者の異常細胞の内の少なくともいくつかが適切なＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示することを前提としている。これは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法と、前記特定の配列、ここではＢＡＧＥ配列、を有するＤＮＡを発現する細胞を同定する方法が当業技術において周知であるため、非常に容易に判断することができる。一旦、関連複合体を提示する細胞が、上述したスクリーニング法によって同定されると、これらを、患者からの、ＣＴＬを含むサンプルと結合させることができる。もしも複合体提示細胞が前記混合ＣＴＬサンプルによって溶解されるならば、ＢＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原が提示されていると推定することが出来、その患者は、上述の治療アプローチを使用するのに適切な候補となる。養子移入のみが本発明によって利用可能な治療形態ではない。種々のアプローチを使用して、イン・ヴィヴォにＣＴＬを刺激することも可能である。一つのアプローチ、すなわち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。このアプローチに於いて使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発現する細胞、たとえば、照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前記遺伝子の一つ又は両方によってトランスフェクションされた細胞、等を使用することができる。このアプローチの一具体例は、Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１０−１１４（１９９１）に例示されており、ここにはＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の、治療法に於ける使用が示されている。さまざまな細胞タイプを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の１つ又は両方を坦持するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムに於いて、問題の遺伝子は、たとえば、ワクシニア・ウィルスやバクテリアＢＣＧ等によって坦持され、これらの物質が実質的（ｄｅｆａｃｔｏ）に宿主細胞に「感染」（“ｉｎｆｅｃｔ”）する。その結果得られる細胞は、問題の複合体を提示し、自己由来ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬは増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又は前記先駆体自身を、問題のＨＬＡ分子を提示するＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１提示細胞への組み込みを促進するアジュバントと組み合わせることによっても類似の効果を達成することができる。前記ＴＲＡＰは、プロセッシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生成し、他方、前記ＴＲＡは、更なるプロセッシングを必要とせずに提示される。ここにおいて、本発明は、特定の実施例について言及し、記載されているが、これらの実施例は単に本発明の様々な態様の例証に過ぎないことが理解されるべきである。従って、本発明の精神と範囲から外れることなく、この例示的な実施例において多くの改良が可能であり、又、他の組み合わせが開発可能であることが理解されるべきである。

【手続補正書】【提出日】１９９８年４月１６日【補正内容】全文訂正明細書ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１と複合体を形成するペプチドをコードする単離核酸分子とその利用関連出願のクロスリファレンス本出願は１９９４年２月１５日に出願した第０８／１９６，６３０号の一部継続出願であり、この出願第０８／１９６，６３０号は１９９３年６月１７日に出願した第０８／０７９，１１０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、病理状態の診断と治療とに関して有用な、核酸分子、たん白質、及びペプチドとに関する。本発明は、更に、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示されるペプチドにプロセッシングされる前記たん白質とペプチド、及びその提示されるペプチド自身に関する。これらのペプチドは、診断及び治療に於いて有用である。背景及び従来技術ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これに対して反応するプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセッシングされるより大きな分子に由来する。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他のＡｄｖａｎｃｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする点で、限定されたものである。たとえ、特定のパートナーとなる複合体が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなければＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、免疫システムの、外来の物質に対する応答、自己免疫疾患、そして細胞異常に対する応答に関係している。タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）：マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）；及びラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関連付けられてきた。例えば、ここに参考文献として添付される１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、細胞表面上に発現されるペプチドにプロセッシングされ、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を可能にする遺伝子の一つのファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原先駆体」、即ち、”ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われており、これらに由来するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」、又は、”ＴＲＡ” と呼ばれている。この遺伝子ファミリーの詳細については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５（１９９２）：ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。更に、米国特許第５，３４２，７７４号を参照。この開示内容をここに参考文献として添付する米国特許出願第９３８，３３４号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれば、特定のペプチドが一つのＨＬＡ分子と結合し、他の分子には結合しないと予期される、と教示している。これは重要である。というのは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。その結果、ある特定のペプチドが特異的ＨＬＡ分子のパートナーとして同定されることが様々な診断上及び治療上の効果を有するとしても、これらはこの特定のＨＬＡ表現型を保有する個体にしか適切でないことになる。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られている訳ではないので、この分野において更に研究が必要であり、標的治療の為には対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現産物が、第２のＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１分子によって提示される。この開示には、あるＴＲＡＰが複数のＴＲＡを産生することが可能であることが示されている。ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号にはチロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この文献には、いくつかの正常細胞（例えば、メラノサイト）によって生成される分子が、腫瘍細胞内でプロセッシングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原を作ることが開示されている。ここに参考文献として添付する１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼに由来するのではない第２のＴＲＡが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されることが教示されている。このＴＲＡは、ＴＲＡＰに由来するものではあるが、非ＭＡＧＥ遺伝子によってコードされる。この開示は、特定のＨＬＡ分子が、異なった起源に由来するＴＲＡを提示する可能性があるということを示している。参考文献として添付する１９９３年６月１７日出願の米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、そこにおいてＢＡＧＥファミリーと称されているところの遺伝子の新規なファミリーが開示された。これらの遺伝子も、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードすることが観察された。同出願に於いて、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１として知られているＭＨＣ分子がＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体に由来する腫瘍拒絶抗原を提示することが開示されている。しかし、その腫瘍拒絶抗原は開示されなかった。前記腫瘍拒絶抗原は、ここに参考文献として添付する１９９４年２月１５日出願の米国特許出願第０８／１９６，６３０号に開示されている。同出願は、又、前記腫瘍拒絶抗原の派生効果、更にこの抗原を利用した治療及び診断方法も開示している。本出願は、特許出願第０８／１９６，６３０号に記載されているＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする単離核酸分子に関する。本出願は、更に、前記単離ＢＡＧＥ核酸分子を利用した治療及び診断方法にも関する。本発明を、以下の開示に於いて更に詳述する。図面の簡単な説明上述した簡単な記載、及び本発明の更に別の課題及び特徴は、本発明の好適な、但し例示的な実施例の以下の詳細な説明を、添付の図面を参照して斟酌することにってより完全に理解されるであろう。ここで、図１は、図１Ａ，１Ｂ，１Ｃ，１Ｄ，１Ｅ，１Ｆから成る。図１Ａは、ＭＺ２ −ＭＥＬのサブラインであるＭＺ２−ＭＥＬ．３．０、図１Ｂは、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１、図１Ｃは、ＭＺ２−ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４に対するＣＴＬクローン８２／８２の溶解活性を示している。図１Ｄは、ＭＺ２−ＭＥＬサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３、図ＩＥは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１陽性患者由来のメラノーマ細胞ラインＭＩ４０２４／１−ＭＥＬ及び、図１Ｆは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１陽性患者由来のメラノーマ細胞ラインＬＢ１７−ＭＥＬに対するＣＴＬクローン８２／８２の溶解活性を示している。図２は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみ、ｃＤＮＡ−ＡＤ５との組み合わせ、又はＡＤ５のみ、をそれぞれトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞に接触した時に於ける、ＣＴＬ８２／８２によるＴＮＦ放出を示している。ＣＴＬ８２／８２は、コントロールとして、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３とＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５とも接触させた。図３は、図３Ａ，３Ｂ，３Ｃ，３Ｄから成る。図３Ａは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５を坦持する発現ベクターをコトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲマウス細胞、図３Ｂは、トランスフェクションしなかったＰ１．ＨＴＲ、図３Ｃは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみをトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲ、のＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。図３Ｄは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクションしたＰ１．ＨＴＲとＢＡＧＥ由来ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ；（配列認識番号３）とのＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。図４は、ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示している。箱内のセグメントは、前記先駆体由来の腫瘍拒絶抗原である。図５は、メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０と患者ＭＺ２からの血液リンパ球と、マウス細胞ラインＰ１．ＨＴＲとから抽出されたＤＮＡのサザン・ブロットを示している。図６は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞中に於けるＢＡＧＥの発現のノザン・ブロット分析を示す。図７は、メラノーマライン、腫瘍及び正常サンプル由来のｃＤＮＡ、更に、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３由来のゲノムＤＮＡの、ＰＣＲ増幅を示している。図８は、ＢＡＧＥにコードされるペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）又は、ノナペプチドＡＲＡＶＦＬＡＬＦ（配列認識番号４）又はＭＡＡＲＡＶＦＬＡ（配列認識番号５）とインキュベートしたリンパ芽球細胞ラインＭＺ２ −ＥＢＶのＣＴＬ８２／８２による溶解を示している。発明の詳細な説明例１メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬを、標準方法を使用して患者ＭＺ２から得た。この細胞ラインは、ここに参考文献として添付する１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４に記載されている。前記細胞ラインの確立後、そのサンプルを照射し、これを非増殖性にした。多数のサブクローンをＭＺ２−ＭＥＬから得た。具体的には、クローナルラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０を制限希釈によってＭＺ２− ＭＥＬから得た。次に、このＭＺ２−ＭＥＬ．３．０培養物を更に培養した。培養での１５０世代以上後、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１として示す新たなサブラインが得られた。ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１は、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０に対して強い溶解活性を有する自己由来ＣＴＬクローンの大きなフラクションに対して抵抗を有することがわかった。ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１は、ＨＬＡ−Ａ２９、Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする遺伝子を失ったと判断された（ここに参考文献として添付するファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４：２１３４−２１４０（１９９４）参照）。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３を、変異誘発物質処理後に生存したＭＺ２− ＭＥＬ．３．０細胞から制限希釈によって誘導した（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：６３４− ６４０（１９８９））。抗原ＭＺ２−Ｅを発現しないクローンサブラインＭＺ２ −ＭＥＬ．２．２を、自己由来抗−ＭＺ２−ＥＣＴＬクローンによってサブクローンＭＺ２−ＭＥＬ．３．１から選択した（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，前述）。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５を、抗−ＭＺ２−ＦＣＴＬクローンによってサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２から選択した。ＭＺ２−ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４を、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１遺伝子をサブラインＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５へのトランスフェクションによって得た（ファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。メラノーマ細胞ラインを、ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，前述及びトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３５：１４５−１５２（１９９２）によって以前に記載されている要領で成長させた。細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬに対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞クローン（“ＣＴＬ”）を、照射済みＭＺ２−ＭＥＬ細胞を利用して得た。具体的には、末梢血液単核細胞（“ＰＢＭＣ”）のサンプルを、患者ＭＺ２から採取して、これを、前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。その混合物の前記メラノーマ細胞の溶解を観察したところ、前記メラノーマ細胞によって提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的なＣＴＬが前記サンプル中に存在することが示された。使用した溶解アッセイは、ここに参考文献として添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）に基づくクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについてはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞をイン・ヴィトロで生育させ、次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと５０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中で４ｘ１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄とともに３７℃で６０分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、その後、１０³個の細胞を含む１００μｌのアリコットを、９６ウェルマイクロプレート中に分配した。ＰＢＬのサンプルを、１００μｌの同じ培地に添加し、同様にアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離し、３７℃で８％のＣＯ₂雰囲気中にて４時間インキュベートした。プレートを再び遠心分離し、１００μｌの上清のアリコットを採取し、カウントした。⁵¹Ｃｒ放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。％⁵¹Ｃｒ放出＝（（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ））×１００ここで、ＥＲは観察された実験⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³標識化細胞を２００ μｌの培地中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そしてＭＲは、１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を標的細胞に添加することによって得られた最大放出量である。高いＣＴＬ活性を示した前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張及びクローン化を行い、同じ方法を使用して再スクリーニングした。このようにしてＣＴＬクローンＭＺ２−ＣＴＬ８２／８２を単離した。前記クローンを、以後「８２／８２」と称する。ＭＺ２−ＭＥＬサブラインと他のメラノーマラインとを、ＣＴＬクローン８２／８２に接触させ、クロム放出を測定することによって溶解活性を判定した。クロム放出は４時間後に測定した。図１Ａ〜Ｃは、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．０（図１Ａ）と、ＭＺ２−ＭＥＬ．Ｂ．ＴＣ．４（図１Ｃ）との溶解を示している。サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．１（図１Ｂ）は、ＣＴＬ８２／８２によって溶解されなかった。図１Ｄ〜Ｆは、ＣＴＬ８２／８２によるクローンラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３（図１Ｄ）の溶解があることを示している。更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１対立遺伝子を有するメラノーマ細胞ラインＭＩ４０２４／１−ＭＥＬ（図１Ｅ）及びＬＢ１７／ＭＥＬ（図１Ｆ）がＣＴＬ８２／８２によって溶解された。例２ＣＴＬ８２／８２によって認識される抗原をコードする遺伝子を同定した。ここに記載するように、前記遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリーとＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをコトランスフェクションすることによって同定された。ＣＴＬ８２／８２のＭＺ２−ＭＥＬ．４３に対する特異性に依り、この細胞ラインのｃＤＮＡを使用して前記ｃＤＮＡライブラリーを形成した。前記ｃＤＮＡライブラリーをＭＺ２−ＭＥＬ．４３から構築するために、ｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、ｍＲＮＡ抽出キットを使用してＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞から抽出した。前記ｍＲＮＡを、ランダム・プライマーを使用してｃＤＮＡに変換し、標準的技術を使用してアダプターに結合させ、これをＳＶ４０の複製開始点を含む発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１にエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選抜した。前記ライブラリーは、６６，０００個のインサートを有し、これを４００のバクテリアの８７のプールと２００のバクテリアの２９７のプールとに分けた。前記プラスミドの約７０％が一つのインサートを有していたことから、これらのプールはそれぞれ、約２８０又は１４０種類のｃＤＮＡを含むことになる。これらバクテリアの各プールを、飽和まで増殖させ、プラスミドＤＮＡを周知のアルカリ溶解方法によって抽出した。プラスミドｐｃＤ−ＳＲαに、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをトランスフェクションした。次に、ｃＤＮＡプールと、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡを含有する前記ｐｃＤ−ＳＲαプラスミドを同一のＣＯＳ−７細胞のマイクロカルチャーにコトランスフェクションした。トランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法によって行った（シード（Ｓｅｅｄ）他Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３３６５−３３６９（１９８７）：ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他，Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，，１６２：１５６−１５９（１９９３））：クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５−４２（１９９４））。簡単に説明すると、１．５ｘ１０⁴ ＣＯＳ−７細胞に、１００ｎｇのＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤ−ＳＲαと、１００ｎｇの前記ｃＤＮＡライブラリーのプール、即ち、１００ｎｇのｃＤＮＡクローン、をトランスフェクションした。前記ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡを、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３から抽出されたＲＮＡで調合したｃＤＮＡライブラリーから単離した（ファン・デア・ブルッゲン（ＶａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。コトランスフェクション体を、２４又は４８時間後に、ＣＴＬによって腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生を刺激する能力をテストした（トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２３５：１４５−１５２（１９９２））。１５００のＣＴＬを、１０％のヒト血清と、２０Ｕ／ｍｌｒ−ｈｕ−ＩＬ−２とを含有する１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中にて、標的細胞を含有するマイクロ・ウェルに添加した。２４時間後、上清を収集し、そのＴＮＦ含有率を、ＭＴＴ比色定量アッセイ（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）他，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３９：３９０−３９６（１９８９）及びトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，前述）に於いて、ＷＥＨＩ−１６４クローン１３（Ｅｓｐｅｖｉｋｅｔａｌ. ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，９５：９９−１０５（１９８６））細胞に対するその細胞障害性効果をテストすることによって判定した。トランスフェクションされたｃＤＮＡの３８４のプール（２００のバクテリアの２９７のプールと４００バクテリアの８７のプール）の内、二つが４０ｐｇ／ｍｌ以上のＴＮＦを含む陽性上清を産生したのに対して、その他のプールでトランスフェクションしたマイクロカルチャーの全部のＴＮＦ濃度は、５ｐｇ／ｍｌ以下であった。４００の別々のバクテリアを含むこれらのｃＤＮＡプールの内の一つから、８００のバクテリアがサブクローン化された。それらのそれぞれからプラスミドＤＮＡを抽出し、前述したＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１コンストラクトと共にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。１２のクローンが、ＣＴＬ８２／８２による認識を得た。ｃＤＮＡ−ＡＤ５として示すそれらの内の一つから得られた結果を図２に示す。図２は、ｃＤＮＡ−ＡＤ５とＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１ｃＤＮＡをコトランスフェクションした、又はこれらｃＤＮＡのいずれか一方をトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞によるＣＴＬ８２／８２の刺激を示している。前記ｃＤＮＡを、前述した要領で発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαに挿入した。ＣＴＬ８２／８２のサンプルを、前記トランスフェクションの１日後に添加し、その上清のＴＮＦ含有率を、ＷＥＨＩ−１６４クローン１３の細胞に対するその障害性を１日後にテストすることによって推定した。ポジティブとネガティブとのコントロールを、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３及びＭＺ２ −ＭＥＬ．２．２．５細胞を用いて行った。トランジェントなトランスフェクションに於いてｃＤＮＡ−ＡＤ５で得られた結果を確認するために、ステーブルなトランスフェクション体も準備した。マウスの腫瘍細胞ラインＰ８１５由来のトランスフェクション性の高いバリアントであるＰ１．ＨＴＲ（ファン・ペル（ＶａｎＰｅｌ）他，Ｓｏｍ．ＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．，１１：４６７−４７５（１９８５））（ニコラス（Ｎｉｃｏｌａｓ）他，ＣＳＨＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅｓＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆ．，１０：４６９−４８５（１９８３））とＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみ、又は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５との両方とともに、燐酸カルシウム沈降法を使用して、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１とｃＤＮＡ−ＡＤ５の両方をトランスフェクションした。前記関連ｃＤＮＡを、前述した要領で、発現ベクターｐｃＤ−ＳＲαに挿入した。クローナルサブラインを、抗ジェネチシントランスフェクション集団から単離した。トランスフェクションされた細胞は、ＣＴＬ８２／８２と接触された時、ＣＴＬ８２／８２によって溶解され、これは前記抗原がこれらのマウス細胞内でもプロセッシング可能であることを示した。図３Ａは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１及びｃＤＮＡ−ＡＤ５を坦持する発現ベクターをコトランスフェクションされたＰ１．ＨＴＲマウス細胞のＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。トランスフェクションされていないＰ１．ＨＴＲ（図３Ｂ）とＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１のみによってトランスフェクションされたＰ１．ＨＴＲ（図３Ｃ）もテストした。例３ｃＤＮＡ−ＡＤ５のＤＮＡ配列分析を、合成オリゴヌクレオチドでの特異的プライミングによって行った。配列認識番号１は、ここで「ＢＡＧＥ」と称する同定された遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド情報を示している。前記シークエンシング反応は、ジデオキシ−チェーンターミネーション法（Ｔ７シークエンシングキット、ＰｈａｒｍａｃｉａＵｐｐｓａｌａＳｗｅｄｅｎ， ΔＴＡｑ（商標名）サイクルーシークエンシングキット，ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）によって行った。配列相同性のコンピュータ検索を、プログラムＦＡＳＴＡ＠ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ及びｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．によって行った。その配列は、コード領域の外部に位置するＡｌｕ反復（ヌクレオチド３８５から４８４）を除いて、現在データバンクに記録されている他のいずれの配列に対しても大きな類似性を有していない。例４ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示される前記抗原をコードするＢＡＧＥの領域を決定した。この領域を同定するために、多数の切形ＢＡＧＥｃＤＮＡクローンを作った。ＢＡＧＥをエキソヌクレアーゼＩＩＩで様々なインキュベーション時間で消化させることによって、３‘末端から始まる段階的なデリーションを生成した。その切形バリアントを、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに再結合し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αＦ’ＩＱにエレクトロポーレーションし、アンピシリン（５０μ ｇ／ｍｌ）で選抜した。このようにして４３８のクローンが得られた。前記プラスミドＤＮＡを、これらの４３８のクローンから得て、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１ｃＤＮＡと共にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、その抗原をコードする能力をテストした。これらのトランスフェクション体を、前述した要領でＴＮＦ放出アッセイでテストした。陽性クローンは、ＣＴＬ８２／８２によってＴＮＦ放出を刺激したものであった。細胞を陽性と陰性のトランスフェクション体に分けた後、５つの陽性と５つの陰性とからのプラスミドＤＮＡの配列を決定した。陽性クローンであるクローン１９Ｃ２は、ヌクレオチド２０１からヌクレオチド２６７までの、前述したＢＡＧＥ遺伝子に対するオープンリーディングフレームの一部を有していた。これに対して、陰性のトランスフェクション体であるクローン１７Ｇ１２は、ヌクレオチド２０１−２０６を有していた。これは、抗原ペプチドが、前記オープンリーディングフレームの最初の６７個のヌクレオチドによってコードされたことを示すものであった。ＢＡＧＥの配列を示す図４は、又、最大のオープンリーディングフレームによってコードされる４３のアミノ酸の推定たん白質をも示している。このたん白質は、提示ペプチドの配列を有しているものと同定された。ここで配列認識番号２と称するこの４３のアミノ酸たん白質は、次の通りである。ＭＺ２−ＣＴＬ８２／８２によってＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１と共同して認識されるペプチドに対応する配列は、箱内に示されている。この配列をここで配列認識番号３：ＡｌａＡｌａＡｒｇＡｌａＶａｌＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕと称する。例４に記載したように、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーＶＤＢ８５（配列認識番号６）（センス）及びＶＤＢ８６（配列認識番号７）（アンチセンス）の配列は、矢印の下線を引かれている。これに基づいて、いくつかの合成ペプチドが作られた。ペプチドは、アサートン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ）他，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ．，１：５３８−５４６（１９８１）によって記載される、トランジェントなＮＨ２−末端保護のためにＦ−ｍｏｃを使用して固体相上で合成され、質量分析法によってキャラクタライズされた。すべてのペプチドは、分析ＨＰＬＣによって示されているように純度＞９０％であった。凍結乾燥したペプチドを、ＤＭＳＯ中で２０ｍｇ／ｍｌに溶解し、１０ｍＭの酢酸中で２ｍｇ／ｍｌの割合で希釈し、８０℃で保存した。ペプチドを、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクションし、これらペプチドとともにインキュベートしたＣＯＳ−７細胞でのＣＴＬ刺激アッセイでテストした。これらは、又、前述した要領で、クロム放出アッセイによってもテストした（ブーン（Ｂｏｏｎ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：１１８４−１１９３（１９８０））。このペプチド感作アッセイに於いて、標的細胞を、１時間３７℃で⁵¹Ｃｒ標識化し、広範囲に洗浄した。次に１０００の標的細胞を、ＣＴＬ８２／８２細胞を添加する前に、様々な濃度のペプチドの存在下に於いて、９６−ウェルマイクロプレート中にて３０分間３７ ℃でインキュベートした。クロム放出を、４時間後３７℃で測定した。図８は、ＢＡＧＥコードペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベートしたリンパ芽球細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．ＥＢＶのＣＴＬ８２／８２による溶解を示している。前記ＣＴＬとの標的細胞のインキュベーション中のペプチドの最終濃度が示されている。矢印は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３の溶解の百分率を示している。患者ＭＺ２からのリンパ芽球細胞ラインのＣＴＬ８２／８２による溶解に対する感作が、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）（アミノ酸２−１０、図４）で観察された。最大値の半分の溶解は、３０ｎＭのペプチド濃度で得られた（図８）。Ｎ−末端Ａｌａを含まないノナペプチド、即ち、ＡＲＡＶＦＬＡＬＦ（配列認識番号４）、あるいはＣ−末端Ｌｅｕを含まないノナペプチド、即ちＭＡＡＲＡＶＦＬＡ（配列認識番号５）は、標的細胞を感作して溶解させることができなかった。Ｐ１．ＨＴＲ細胞にＨＬＡ− Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクトし、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションした。そのトランスフェクションされた細胞は、ＣＴＬ８２／８２によって溶解された。図３Ｄは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をトランスフェクションされ、１μＭのＢＡＧＥコードノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションされたＰ１．ＨＴＲのＣＴＬクローン８２／８２による溶解を示している。クロム標識化細胞の溶解を、４時間後にテストした。患者ＭＺ２のさまざまな血液サンプルからセットアップされた二つのＭＬＴＣ（リンパ球・腫瘍細胞混合培養）から、前記ＢＡＧＥ／ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１抗原を認識する６つのＣＴＬクローンが誘゛導された。これらは、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１とＢＡＧＥｃＤＮＡ−ＡＤ５とをコトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞の存在下に於いてＴＮＦを産生した。これらは、又、ＨＬＡ−Ｃｗ^★ １６０１をトランスフェクションされ、ノナペプチドＡＡＲＡＶＦＬＡＬ（配列認識番号３）とインキュベーションされた細胞にも応答した。少なくとも３種類のＣＴＬ前駆体がこのＢＡＧＥ抗原を認識できるようである。ＣＬＴクローン８２／１はＶα２，Ｖα３，及びＶβ１３を発現したのに対して、ＣＴＬクローン２５／２４４は、Ｖα８，Ｖβ８を発現し、ＣＴＬクローン８２／８２はＶα ３，Ｖα４およびＶβ１３を発現した。Ｖα及びＶβ発現は、次の要領で判定した。さまざまなＣＴＬクローンからの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ^★Ｂ（Ｃｌｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して準備した。単鎖ｃＤＮＡ合成を、オリゴ（ｄＴ）とＲＮＡｓｅＨ活性の無いモロニーマウス白血病ウィルス−由来逆転写酵素とで行った。ＰＣＲを、ジュネーヴェ（Ｇｅｎｅｖｅｅ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１２６１−１２６９（１９９２）によって記載されているＴＣＲ可変領域（Ｖα１−Ｗ２９，Ｖβ１− Ｗ２４）と定常領域（Ｃα，Ｃβ）配列とに対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴＣＲ−α、及び−βｃＤＮＡ増幅によって行った。ＴＣＲＶα及びＶβ ＰＣＲ増幅の特異性は、サザン・ブロッティングと、増幅に使用したものに対して内部にある³²Ｐ標識化Ｃα又はＣβオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって評価した。例５組織中に於けるＢＡＧＥの発現を、逆転写とｎｅｓｔｅｄＰＣＲ（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）によってテストした。メラノーマライン、腫瘍及び正常組織サンプルからのｃＤＮＡと、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。全ＲＮＡを、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１３０−１３５（ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）に記載されているグアニジン−イソチオシアネート法によって抽出した。逆転写を、２μｇの全ＲＮＡに対して、４μｌの５ｘ逆転写酵素バッファーと、２μｌの２０ｍＭのオリゴ（ｄＴ）１５プライマー溶液と、２０ＵのＲＮａｓｉｎと、２μｌの０．１Ｍジチオトレイトールと、２００ＵのＭｏＭＬＶ逆転写酵素と１μｌの各１０ｍＭのｄＮＴＰ溶液とを含有する２０μｌの反応容量で行った。前記反応物を、４２℃で６０分間インキュベーションした。前記ｃＤＮＡ産物の１／２０を、次に、５μｌの１０ｘ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼバッファーと、１μｌの各１０ｍＭのｄＮＴＰ溶液と、１μｌの各２５μＭのプライマー溶液と、１ＵのＤｙｎａＺｙｍｅ（商標名）と、水とを５０μｌの最終容量にまで添加した。前記ＰＣＲプライマーは、５‘−ＴＧＧＣＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＧ−３’（配列認識番号６）（ＶＤＢ８５，センス、ヌクレオチド１００−１１７）と５‘−ＣＣＴＣＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＧ−３’（配列認識番号７）（ＶＤＢ８６、アンチセンス、ヌクレオチド３６７−３８５）であった。ＰＣＲを、３０サイクル（９４℃で１分間、６２℃で２分間及び７３℃で２分間）行った。１０μｌの前記ＰＣＲ産物を、１．５％アガロース・ゲル上でサイズ分画した。ＲＮＡ調合物の品質を、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡを、プライマ−５‘−ＧＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧ−３’（配列認識番号８）（エキソン４、センス）及び５‘−ＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ−３’（配列認識番号９）（エキソン６、アンチセンス）と共に、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって、９４℃で１分間、６８℃で２分間、７２℃で２分間の２１サイクルでのＰＣＲ増幅を行うことによってテストした。前記ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドによって染色した１．５％のアガロース・ゲル上で視覚化した。精巣を除いて正常な成人組織には遺伝子ＢＡＧＥの発現は見られなかった（図７と下記の表１参照）。前記遺伝子は、胎盤と臍帯及び、２０週齢以上の胎児からのいくつかの組織サンプルとにおいてもサイレントであった。テストした１２のＥＢＶ−形質転換リンパ芽球細胞ラインや、フィトヘマグルチニンで刺激した血液リンパ球中に於いてもＢＡＧＥの発現は見られなかった。ＢＡＧＥは、精巣を除いて、メラノサイトを含む正常成人組織中でサイレントであるようである。その発現が逆転写とＰＣＲとによってテストされたので、正常組織に於いて検出可能な産物が不在であるということは、腫瘍ＭＺ２−ＭＥＬに於いて観察されるものの０．１％以下の発現レベルを示すものである。例６腫瘍サンプルと細胞ラインとに於けるＢＡＧＥの発現も測定した。組織起源の異なる６００の腫瘍サンプルのＢＡＧＥ発現を分析した。下の表２に示されているように、ＢＡＧＥ遺伝子は、主に、メラノーマ（２２％）、膀胱癌（１５％）、乳癌（１０％）、及び頭部及び首部扁平上皮細胞癌（８％）に於いて発現する。より低い率の陽性サンプルが、肉腫（６％）と非−小細胞肺癌（６％）に見られた。腎臓、結腸直腸および前立腺癌、白血病、又はリンパ腫にはＢＡＧＥの発現は見られなかった。非常に少数の例外を除き、ＢＡＧＥを発現した腫瘍サンプルは、前に概略説明したＭＡＧＥ遺伝子の一つも発現した。ＢＡＧＥは、メラノーマの一次病変（８％）よりも転移病変（２６％）に於ける方がより頻繁に発現された。膀胱の過渡性細胞癌に於いて、３０％の浸潤性腫瘍がＢＡＧＥを発現したのに対して、皮相性腫瘍に於いては発現は観察されなかった。ＢＡＧＥは、腫瘍サンプルよりも腫瘍細胞ラインにおいて、より高い比率で発現された。すなわち、３２／６０メラノーマ（５３％）と３／１５直腸結腸癌細胞ライン（２０％）が陽性であった。これは、又、ＭＡＧＥ遺伝子においても観察され、これは、恐らく、腫瘍細胞ラインが転移性腫瘍からより容易に誘導されることに依る。例７ＢＡＧＥ抗原の提示分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１は、有用な抗体が入手不能である為、血清アッセイに於いては同定することができない。しかしながら、その発現は、逆転写とｎｅｓｔｅｄＰＣＲとによってテストすることが可能である。約７％（７／９９）の白色人種の個体が、このＨＬＡ対立遺伝子を発現することがわかっている（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。細胞表面上に於けるＨＬＡ−Ｃ分子の濃度は、恐らく、β２− ミクログロブリンに対する結合の能率が低いことに依り、ＨＬＡ−ＡおよびＢの濃度の約１／１０以下であると報告されている（ニーフジェス（Ｎｅｅｆｊｅｓ）他，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８：８０１−８１０（１９８８））。しかしながら、ＢＡＧＥがＨＬＡ−Ｃ分子上で認識されるペプチドをコードすることが判り、これは、ＨＬＡ−Ｃ分子もＣＴＬに対する抗原の提示に於いて重要な役割を果たしていることを示唆している。例８患者ＭＺ２の血液リンパ球と、前記メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０とから抽出されたＤＮＡでサザン・ブロットを行った。サザン・ブロット分析を行うために、メラノーマ細胞ラインＭＺ２−ＭＥＬ．３．０、患者ＭＺ２のＰＢＬおよびマウス細胞ラインＰ１．ＨＴＲからのＤＮＡをＥｃｏＲＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ＤＮＡキャピラリートランスファーを、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ（商標名）メンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でのアルカリ・ブロッティングによって行った。トランスファー後、前記メンブレンを、２ｘＳＳＣ中で洗浄し、８０℃で１時間ベーキングし、６ｘＳＳＣ，１０ｘデンハルト溶液中にて６０℃で３０分間前処理した。次に、このメンブレンを、３．５ｘＳＳＣ，１ｘデンハルト溶液、２５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ ｐＨ７．０，０．５％ＳＤＳ，２ｍＭＥＤＴＡ，１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、およびＰＣＲによって作成された２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの１２１ｂｐ³²Ｐ− 標識化プローブ（配列認識番号１のヌクレオチド２１１−３３１）中にて６５℃ で１８時間ハイブリダイゼーションした。前記メンブレンを、次に、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で６５℃で２ｘ１５分間洗浄し、次に、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１５分間洗浄し、１０日間オートラジオグラフィーにかけた。このブロットが、上述した１２１ｂｐプローブによってハイブリダイゼーションされた時、ＥｃｏＲＩで切断されたＤＮＡを含むレーンに４つのバンドが観察され、ＨｉｎｄＩＩＩ切断の後には６つのバンドが観察された（図５）。前記プローブの小ささと、コード配列中のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の不在とを考えると、これらの結果は、ＢＡＧＥが複数の関連する遺伝子からなるファミリーに属するものであることを示している。例９サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３のｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを用いて行ったノザン・ブロットを、配列認識番号１のヌクレオチド１００−３８５を含む２８６ｂｐのＢＡＧＥプローブでハイブリダイゼーションした。ノザン・ブロット分析を行うために、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３からのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、ｍＲＮＡ抽出キットを使用して調整した。マウスの腎臓組織からの全ＲＮＡを、前述のデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他に記載されているグアニジン−イソチオシアネート法によって抽出した。ｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴカラム上で全ＲＮＡから精製した。ノザン・ブロット分析のために、サブラインＭＺ２−ＭＥＬ．４３から５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡと、マウス腎臓細胞からの５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡとを、０．６６Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロース・ゲル上で分画し、１０ｘＳＳＣ中にてメンブレン上にトランスファーした。前記メンブレンを、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ及び１ＭＮａＣｌ中にて６０℃で１５分間、プレハイブリダイゼーションし、同じ溶液中にて、２ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌの前記２８６ｂｐ³²Ｐ−標識化プローブとともに、６０℃で一晩ハイブリダイゼーションした。前記メンブレンを、０．２ｘＳＳＣ中にて室温で１０分間、次に、０．１％ＳＤＳを添加した０．２ｘＳＳＣ中で６０℃で２ｘ２０分間、洗浄し、１５時間オートラジオグラフィーにかけた。マウスβ−アクチンプローブを用いて同じメンブレン上にてコントロールハイブリダイゼーションを行った。図６は、この実験の結果を示している。各レーンは、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３細胞からの５μｇのｐｏｌｙ−Ａ⁺ＲＮＡを含んでいた。 β−アクチンプローブを用いて同じメンブレン上にてコントロールハイブリダイゼーションを行った。約１および２．４ｋｂの２本のバンドが観察された。これまでのところ、ヒトのメラノーマに於いて、自己由来ＣＴＬによって認識される２つの主要なクラスの抗原が見つかっている。第１のクラスの抗原は、腫瘍中に於いて非常に特異的に発現される遺伝子によってコードされる。遺伝子ＭＡＧＥ−１によってコードされる抗原が第１の例であり（ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１））、その後に、遺伝子ＭＡＧＥ−１とＭＡＧＥ−３とによってコードされる他の抗原が続く（ゴーグラー（Ｇａｕｇｌｅｒ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：９２１−９３０（１９９４）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，前述）。マウスの肥満細胞腫Ｐ８１５上に於いて観察される腫瘍拒絶抗原も、精巣を例外としてすべての正常成人組織中においてサイレントな遺伝子の活性化から生じた（ファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：１３７３−１３８４（１９９１））。第２のクラスの抗原は、メラノサイトとメラノーマとに於いてのみ発現される遺伝子によってコードされる分化抗原である。チロシナーゼによってコードされる抗原がこのクラスの第１の例であり（ブリチャード（Ｂｒｉｃｈａｒｄ）他，Ａｎｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９９３）；ロビンズ（Ｒｏｂｂｉｎｓ）他，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，５４：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：７５９−７６４（１９９４）、これらは更にＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（クーリ（Ｃｏｕｌｉｅ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３５−４２（１９９４）；カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５−３５１９（１９９４））と、ｇｐ１００／ｐｍｅ１１７（バッカー（Ｂａｋｋｅｒ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５−１００９（１９９４）；コックス（Ｃｏｘ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：７１６−７１９（１９９４））とによってコードされる抗原も含む。上記諸例は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする核酸分子の単離を示すものである。しかしながら、この“ＴＲＡＰ”のコードする分子は、前述した諸文献に記載されている過去に開示されたＭＡＧＥをコードする配列のいずれとも相同性を有していない。従って、本発明の一態様は、配列認識番号１に示すヌクレオチド配列を有する単離核酸分子である。この配列は、これを前記諸文献に於いて記載されているＭＡＧＥ遺伝子のすべての配列と比較することから明らかなように、ＭＡＧＥをコードする配列ではない。非ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体もコードするものであるが、ストリンジェントな条件下に於いて前述したヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズする核酸分子配列も本発明の一部を構成するものである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、当該技術に於いて周知のパラメータをいう。より具体的には、ここでのストリンジェントな条件とは、３．５ｘＳＳＣ、１ｘデンハルト溶液、２５ｍＭ燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、および２ｍＭＥＤＴＡ中に於ける、６５℃で１８時間のハイブリダイゼーションをいう。その後、フィルタは、６５℃で、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で２ｘ１５分間と、更に、０．２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で１ｘ１５分間の４回の洗浄を行う。同程度のストリンジェントな条件をもたらすために使用可能なその他の条件、試薬等もあるが、これらの条件は当業者には周知であるのでここでは記載しない。上記諸例から、又、本発明が前記配列の発現ベクターに於ける使用と、更に、原核細胞株（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ）あるいは真核細胞（たとえば、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞）を含む宿主細胞および細胞ラインをトランスフォーメーション又はトランスフェクションするためのこれら配列の使用も含むことが理解されるであろう。前記発現ベクターは、前記配列が、プロモーターと操作可能にリンクされていることを必要とする。前記発現ベクターは、又、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸配列も含むことが可能である。ベクターが両方のコード配列を含む場合には、それを利用して、正常にはいずれも発現しない細胞をトランスフェクションすることも可能である。上記腫瘍拒絶抗原先駆体コード配列は、たとえば、宿主細胞が既にＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する場合等において、単独で使用することも可能である。もちろん、使用可能な具体的な宿主細胞についての限定はない。所望の場合、前記２つのコード配列を有するベクターをＨＬＡ− Ｃｗ^★１６０１提示細胞に使用することが可能であり、同様に、腫瘍拒絶抗原先駆体の遺伝子をＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現しない宿主細胞に使用することが可能である。本発明は、更に、技術者がそれによって所望の単数又は複数の発現ベクターを作ることが可能な発現キットをも含む。このような発現キットは、前述したコード配列のそれぞれの少なくとも分離(separate)部分を含むものである。前述した必要な配列が含まれる限り、所望の場合、他のコンポーネントを追加することも可能である。本発明の核酸分子とＴＲＡＰとを前述したＭＡＧＥファミリーから区別するために、本発明を、遺伝子とＴＲＡＰのＢＡＧＥファミリーと称する。従って、ここで“ＢＡＧＥ”は、前述した配列によってコードされる前記腫瘍拒絶抗原先駆体を指す。“ＢＡＧＥコード分子”とこれに類似の用語とは、前記核酸分子自身を記載するのに使用される。更に、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を提示する細胞の同定に使用可能なペプチド、たとえば、配列認識番号３のペプチド、も本発明の一部を構成する。これを達成する一つの方法は、検出可能なシグナルを備えたこれらのペプチドを投与し、その後、たとえば、前記ペプチドが結合した細胞を同定することである。これを達成する別の方法は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１提示細胞が結合する固相結合ペプチドを使用して、これらをアッセイされているサンプルから分離することである。更に、本発明によって、当業者は、ＴＲＡＰの発現によって特徴付けられる疾患を診断することができる。これらの方法は、前記ＴＲＡＰ遺伝子の発現の測定および／又は、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１によって提示されるＴＲＡ等のそこから由来するＴＲＡの発現の測定を含む。前者の場合、このような測定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定アッセイ、又は標識化ハイブリダイゼーションプローブによるアッセイ等によって行うことができる。後者の場合には、抗体等の、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体に対する結合パートナーによるアッセイが特に好ましい。測定の別の方法としては、上述したタイプのＴＮＦ放出アッセイがある。ＴＲＡＰ遺伝子の単離によって、ＴＲＡＰ分子自身、特に、配列認識番号１によってコードされる前記アミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子を単離することも可能になる。これらの単離された分子は、ＴＲＡとして、又は、ＴＲＡとＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１等のＨＬＡとの複合体として提示された場合、アジュバント等の物質と結合させて、ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴付けられる疾患の治療に有用なワクチンを製造することができる。更に、ワクチンは、非増殖性癌細胞、非増殖性トランスフェクション体等の、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞から作ることができる。ＢＡＧＥとＭＡＧＥ抗原との両方に対する免疫化を行うことができる。細胞がワクチンとして使用されるすべてのケースに於いて、これらは、ＣＴＬ応答を証明するのに必要な成分の１つ又は両方をコードする配列でトランスフェクションされた細胞、又は、トランスフェクション無しで両方の分子を発現する細胞であるといえる。更に、前記ＴＲＡＰ分子、その関連ＴＲＡ、およびＴＲＡとＨＬＡとの複合体は、当該技術に於いて周知の標準的技術を使用して、抗体の製造に利用することができる。ここで「疾患」という時、これは、腫瘍拒絶抗原先駆体が発現されるすべての病状を指す。このような疾患の一例は特に癌メラノーマである。当開示に基づく治療方法は、患者の免疫システムによる応答、すなわちＨＬＡ −Ｃｗ^★１６０１等のＴＲＡ提示細胞が溶解されることを前提としている。このような方法の一つは、前記複合体に対して特異的なＣＴＬを、問題の表現型の異常細胞を有する患者に投与することである。このようなＣＴＬをイン・ヴィトロに開発することは十分に当業者の技術範囲に含まれる。具体的には、血液細胞等のサンプル細胞を、前記複合体を提示し、特異的なＣＴＬの増殖を促進することが可能な細胞に接触させる。標的細胞は、上述したタイプのＣＯＳ細胞等のトランスフェクション体であってよい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、対象のＣＴＬと結合された時に、その増殖を刺激する。このように使用したようなＣＯＳ細胞は、広く一般に入手可能であり、その他の適当な宿主細胞も同様である。養子移入と称される治療方法（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）：レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）：リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３−１４１０（１９９１）：Ｋａｓｔ他、Ｃｅｌｌ５９：６０３−６１４（１１−１７−８９）について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬと結合させ、これに対して特異的なＣＴＬを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬを、前記特定の複合体を提示している異常細胞のいくつかによって特徴付けられる細胞異常を有する患者に投与する。すると、ＣＴＬが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。上述の治療方法は、患者の異常細胞の内の少なくともいくつかが適切なＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示することを前提としている。これは、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法と、前記特定の配列、ここではＢＡＧＥ配列、を有するＤＮＡを発現する細胞を同定する方法が当業技術において周知であるため、非常に容易に判断することができる。一旦、関連複合体を提示する細胞が、上述したスクリーニング法によって同定されると、これらを、患者からの、ＣＴＬを含むサンプルと結合させることができる。もしも複合体提示細胞が前記混合ＣＴＬサンプルによって溶解されるならば、ＢＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原が提示されていると推定することが出来、その患者は、上述の治療アプローチを使用するのに適切な候補となる。養子移入のみが本発明によって利用可能な治療形態ではない。種々のアプローチを使用して、イン・ヴィヴォにＣＴＬを刺激することも可能である。一つのアプローチ、すなわち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。このアプローチに於いて使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発現する細胞、たとえば、照射メラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前記遺伝子の一つ又は両方によってトランスフェクションされた細胞、等を使用することができる。このアプローチの一具体例は、Ｃｈｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１０−１１４（１９９１）に例示されており、ここにはＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の、治療法に於ける使用が示されている。さまざまな細胞タイプを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の１つ又は両方を坦持するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムに於いて、問題の遺伝子は、たとえば、ワクシニア・ウィルスやバクテリアＢＣＧ等によって坦持され、これらの物質が実質的（ｄｅｆａｃｔｏ）に宿主細胞に「感染」（“ｉｎｆｅｃｔ”）する。その結果得られる細胞は、問題の複合体を提示し、自己由来ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬは増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又は前記先駆体自身を、問題のＨＬＡ分子を提示するＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１提示細胞への組み込みを促進するアジュバントと組み合わせることによっても類似の効果を達成することができる。前記ＴＲＡＰは、プロセッシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生成し、他方、前記ＴＲＡは、更なるプロセッシングを必要とせずに提示される。ここにおいて、本発明は、特定の実施例について言及し、記載されているが、これらの実施例は単に本発明の様々な態様の例証に過ぎないことが理解されるべきである。従って、本発明の精神と範囲から外れることなく、この例示的な実施例において多くの改良が可能であり、又、他の組み合わせが開発可能であることが理解されるべきである。特許請求の範囲１．配列認識番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。２．ストリンジェントな条件下に於いて、配列認識番号１に記載の核酸分子にハイブリダイズし、かつ、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする単離核酸分子であって、ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体をコードしない単離核酸分子。３．請求項１の核酸分子に対して相補的な単離分子であって、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである分子。４．請求項１の核酸分子によってトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。５．請求項２の核酸分子によってトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。６．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項１の単離核酸分子を有する発現ベクター。７．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２の単離核酸分子を有する発現ベクター。８．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する哺乳類細胞である請求項４の宿主細胞。９．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する哺乳類細胞である請求項５の宿主細胞。１０．更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子を有する請求項６の発現ベクター。１１．更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子を有する請求項７の発現ベクター。１２．次の各要素の分離部分を有する発現キット、（ｉ）請求項１の単離核酸分子、および（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子。１３．次の各要素の分離部分を有する発現キット、（ｉ）請求項２の単離核酸分子、および（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子。１４．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号１から導かれる配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を有する患者を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と前記ペプチドとの複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記患者に投与する工程を有する方法。１５．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を有する患者を治療する方法であって、ＨＬＡと前記ペプチドとの複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を、前記患者に投与する工程を有する方法。１６．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、患者からのサンプルを、配列認識番号３のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前記発現生成物との間の相互作用を、前記疾患であるとの判定として測定する工程とを有する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ワイルドマン，クロードベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン−ファラー，ティエリーベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ファン・デア・ブルッゲン，ピエールベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者クーリ，ピエールベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ルノー，ジャン−クリストフベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．配列認識番号１に記載のヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。２．ストリンジェントな条件下に於いて、配列認識番号１に記載の核酸分子にハイブリダイズし、かつ、腫瘍拒絶抗原先駆体をコードする単離核酸分子であって、ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体をコードしない単離核酸分子。３．請求項１の核酸分子に対して相補的な単離分子であって、ｍＲＮＡ又はＤＮＡである分子。４．請求項１の核酸分子によってトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。５．請求項２の核酸分子によってトランスフェクション又はトランスフォーメーションされた宿主細胞。６．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項１の単離核酸分子を有する発現ベクター。７．プロモーターに操作可能にリンクされた請求項２の単離核酸分子を有する発現ベクター。８．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する哺乳類細胞である請求項４の宿主細胞。９．宿主細胞が、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１を発現する哺乳類細胞である請求項５の宿主細胞。１０．更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子を有する請求項６の発現ベクター。１１．更に、ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子を有する請求項７の発現ベクター。１２．次の各要素の分離部分を有する発現キット、（ｉ）請求項１の単離核酸分子、および（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子。１３．次の各要素の分離部分を有する発現キット、（ｉ）請求項２の単離核酸分子、および（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃｗ^★１６０１をコードする核酸分子。１４．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号１から導かれる配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を有する患者を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と前記ペプチドとの複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記患者に投与する工程を有する方法。１５．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を有する患者を治療する方法であって、ＨＬＡと前記ペプチドとの複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を、前記患者に投与する工程を有する方法。１６．細胞表面上に於けるＨＬＡ分子と配列認識番号３のペプチドとの複合体の存在によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、患者からのサンプルを、配列認識番号３のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前記発現生成物との間の相互作用を、前記疾患であるとの判定として測定する工程とを有する方法。