JPH08506015A

JPH08506015A - Ｈｌａ‐ｃ‐クローン１０／ｍａｇｅ‐１を発現する癌細胞を有する個体の識別及び治療方法

Info

Publication number: JPH08506015A
Application number: JP6517167A
Authority: JP
Inventors: デルブルージャンピエールファン; ファルールティエリーボーン
Original assignee: ラドウィックインスティテュートフォアキャンサーリサーチ
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 1996-07-02
Also published as: AU680236B2; CN1096584A; US5629166A; FI953534A0; ZA94407B; EP0680330A4; EP0680330A1; NO952797L; CA2154468A1; NO952797D0; AU6091394A; WO1994016713A1; FI953534A

Abstract

(57)【要約】癌の診断及び治療の分野において、本発明は、HLA-C-クローン10 MHC抗原及びMAGE-1から誘導されたぺプチドの複合体を発現する異常細胞の同定及び、異常細胞を認識及び溶解する細胞傷害性Ｔ細胞に関する。HLA-C-クローン10/MAGE-1複合体を認識するクローン化した細胞傷害性Ｔ細胞を、複合体を発現する癌細胞を有する個体を確認するのに使用してもよい。また、HLA-C-クローン10及びMAGE-1をコードする遺伝子を単離する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 HLA-C-クローン10/MAGE-1を発現する癌細胞を有する個体の識別及び治療方法発明の属する技術分野本発明は、一定の異常細胞が、HLA-C-クローン10と、MAGE-1と呼ばれる分子から誘導されるペプチドとの複合体をそれらの細胞表面に提示するという認識から得られる、様々な治療方法論に関する。さらに、本発明は、異常細胞がこの複合体を提示するという細胞の異常性により特徴づけられる状態により診断される、それら個体の識別能力に関する。背景及び従来技術哺乳類の免疫系が異物あるいは外来物質を認識し且つそれと反応する方法は、複合体形成方法にある。その系の重要な面は、Ｔ細胞応答にある。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（「HLA」）又は主要組織適合性複合体（「MHC」）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し且つそれと相互作用することを必要とする。そのペプチドは、またHLA/MHC分子を提示する細胞により処理される（process）大きな分子から誘導される。このことに関しては、メール（M ale）ら著、Advanced Immunology（J.P．Lipincott Company，1987）、具体的にはチャプター6〜10を参照されたい。Ｔ細胞とHLA/ペプチド複合体の相互作用は制限されており、HLA分子とペプチドの特定の組み合わせに関して特異的なＴ細胞を必要とする。もし特異的Ｔ細胞が存在しないのならば、たとえパートナーである複合体が存在していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、もし特異的複合体がないのならば、Ｔ細胞が存在していても応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対する免疫系の応答、自己免疫病理学及び細胞異常性に対する応答に包含される。近年、タンパク質をHLA結合ペプチドに処理するメカニズムに、多くの研究が集中してきた。これに関して、バリナガ（Barinaga）著、Science257 ：880（1992）；フレモント（Fremont）ら著、Science257：919（1992）；マツムラ（Matsumura）ら著、Science257：927（1992）；ラトロン（Latron）ら著、 Science257：964（1992）を参照されたい。また、Ｔ細胞が細胞異常性を認識するメカニズムは、癌に関連付けられてきた。例えば、1992年5月22日に出願され、1992年11月26日にWO92/20356として公開されたPCT出願PCT/US92/04354（それは参考文献としてここに含まれるものとする）において、一系統群の遺伝子が開示され、それらはペプチドに処理され、引き続き細胞表面に発現し且つ特異的CTLにより腫瘍細胞の溶解を導くことができる。これらの遺伝子は、「MAGE」系統群といわれ、「腫瘍拒絶抗原前駆体」又は「TRAP」分子をコードするといわれ、かつそれらから誘導されるペプチドは「腫瘍拒絶抗原」又は「TRA」といわれる。この遺伝子系統群のさらなる情報について、トラベルサリ（Traversari）ら著、Immunogenetics 35：145（1992）；ファンデルブルジェン（van der Bruggen）ら著、Science254：1643（1991）を参照されたい。 U.S.特許出願番号938,334（その開示は参考文献として含まれるものとする）において、HLA-A1分子に結合するノナペプチド（nonapeptide）が教示されている。その参考文献は、特定のHLA分子に関する特定のペプチドの公知の特異性を示しているので、特定のペプチドは一つのHLA分子に結合するが他のものには結合しないことが予期できる。このことは重要である。なぜなら、異なる個体は異なるHLA表現型を保持しているからである。その結果として、特定のHLA分子のパートナーとしての特定のペプチドの同定は、診断及び治療に支脈を有するが、これらは、その特定のHLA表現型を有する個体に関連するのみである。細胞異常性は一つの特定のHLA表現型に制限されず且つターゲッティング療法は組織において異常細胞の表現型の多少の知識を必要とするので、その領域においてさらなる研究が必要である。ブーン−フォーラー（Boon-Falleur）らにより、「Method For Identifying I ndividuals Suffering From a Cellular Abnormality，Some of Whose Abnormal Cells Present Complexes of HLA-A2/Tyrosinase Derived Peptides and Metho ds for Treating said Individuals」という名称で、1992年12月22日に出願された特許出願において、その名称の複合体は、一定の細胞異常性に関係づけられて同定された。しかし、その出願は、どのような他のHLA分子も細胞異常性に包含されてもよいとは示唆していない。また、上記のような、HLA-A分子によるMAGE-1の先の提案も、そのタンパク質が他のHLA分子により提示され得ることについては示唆していない。従って、HLA -A1により提供される真のMAGE分子は、HLA-C-クローン10により提供されるということが示されたことは驚くべきことである。先の研究は、その現象を理解するのに重要であるが、それにより当業者が以下の開示を準備できるものではない。図面の簡単な説明図１は、MAGE-1及びMLA-C-クローン10の配列をコードすることを伴うCOS-7のトランスフェクションを含む実験を示す。好ましい態様の詳細な説明実施例１以下の実験において、様々なメラノーマ細胞系を使用した。これらは、MZ2及びLB73と同定されるメラノーマ患者から得た。細胞系MZ2-MEL.43、MZ2-MEL-3.0 及びMZ2-MEL 3.1は、MZ2-MELの下位の系（subline）をクローン化したものであり、それらは、ファンデンアインド（Van den Eynde）ら著、Int．J.Canc.44:63 4（1989）及びPCT特許出願WO92/20356（1992年11月26日）に記載され、両方の開示は参考文献として且つ完全にここに含まれるものとする。細胞系LB73-MELは、ここに記載された他の細胞系と同じ方法において患者LB73から得た。単核血球を含むサンプルを、患者MZ2から採った。メラノーマ細胞系MZ2-MEL.4 3のサンプルを放射線照射し、その後、単核血球含有サンプルに接触させた。その混合物をメラノーマ細胞系の溶解について観察したが、この溶解は、メラノーマ細胞により提示されるペプチドとHLA分子との複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（「CTL」）がサンプル中に存在することを示すものである。使用した溶解分析は、ヘリン（Herin）ら著、Int.J.Cancer39:390-396（1987 ）に従うクロム放出分析であり、その開示は参考文献として含まれるものとする。しかしながら、その分析をここに記載する。標的メラノーマ細胞をin vitroで成長させ、その後10mMHEPES及び30％FCSで補足したDMEMにおいて10⁷細胞/mlにおいて再懸濁し、さらに、Na（⁵¹Cr）O₄ 200μCi/mlとともに、37℃で45分間インキュベートした。標識した細胞を、10mM Hepesで補足したDMEMで３回洗った。その後、これらを10mM Hepes及び10％FCSで補足したDMEMに再懸濁し、その後10³ 個の細胞を含む100μlアリコートを96ウェルのミクロプレートに分配した。PBL のサンプルを同じ培地100μlに加え、さらに、分析をデュプリケート（duplicat e）において行った。プレートを100gで４分間遠心分離し、5.5％のCO₂雰囲気において37℃で４時間インキュベートした。プレートを再び遠心分離し、上澄みの100μlアリコートを収集し、計数した。⁵¹ Cr放出の百分率を以下のように計算した：（式中、ＥＲは観察された実験⁵¹Cr放出値であり、ＳＲは培地200μlのみにおいて10³個の標識細胞をインキュベートすることにより測定した自然放出値であり、ＭＲは0.3％トリトンX-100 100μlを標的細胞に加えることにより得られる最大放出値である。）。高いCTL活性を示したそれらの単核血球サンプルを膨張させ、限界希釈によりクローン化し、さらに同じ方法論を使用して再びスクリーニングした。これらの実験は、CTLクローン“81/12”を含む、患者MZ2からの幾つかのCTLクローンの単離を導いた。細胞系MZ2-MEL 3.0及びMZ2-MEL 3.1の両方を使用して、その実験を記載のように繰り返した。その結果は、クローン81/12はMZ2-MEL.43及びMZ2-MEL 3.0の両方を認識したがMZ2-MEL 3.1は認識しなかったことを示していた。 8112により認識された抗原を、以下、「抗原Bb」という。実施例２上に要約したように、先の研究からすると、患者MZ2についてHLAクラス１のプロフィールを決定することは興味深いものであった。これを標準的な方法論により測定したが、ここに説明する。患者のHLAクラス１分子の遺伝子をコードするc DNAクローンを得るために、細胞系MZ2-MEL.43から抽出した（exptract）全mRNA を用いて出発し、周知の技術（ここで繰り返して述べない）を使用して、cDNAライブラリーを調整した。そのライブラリーをプラスミドpcD-SRαに入れ、その後全てのHLAクラス１遺伝子に共通の配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブ、即ち： 5'-ACTCCATGAGGTATTTC-3' （SEQ ID NO：1）を使用してスクリーニングした。そのように同定された１つのクローンはクローンIC4A7であり、それは、もし一致しないとしても、周知のヒト白血球抗原分子であるHLA-C-クローン10と配列決定において機能的に等価であることが見出された。HLA-Cクローン10をコードするDNAの配列は、例えば、シアネッティ（Cianetti）ら著、Immunogenetics 29 ：80-91（1989）により教示され、さらにその配列は、GENBANK受託番号HUMMHCAC Aにより入手可能である。最新の配列は、ツェマー（Zemmour）ら著、ImTnunogen etics37：239-250（1993）により報告され、その開示は上記のシンナッティらと同様に、参考文献として全体的に含まれるものとする。また、ツェマーの配列は、EMBL配列バンクにおいて入手可能である。実施例３上記において同定したHLA分子が、腫瘍拒絶抗原を誘導したmageを示すかどうか、また、抗原及びHLA分子の得られた複合体が、患者MZ2のCTLクローンにより認識されるかどうかを測定することは興味深いことであった。これを測定するために、受容細胞をHLA-Cクローン10をコードするcDNA、及びMAGE-1、MAGE-2又はM AGE-3cDNAの一つでトランスフェクトした。MAGE-1 cDNAをプラスミドpcDNA I/Am pに挿入し、一方、MAGE-2及びMAGE-3のcDNAをプラスミドpcD-SRαに挿入した。受容COS-7細胞のサンプルを、組織培養平底ミクロウェルに15,000細胞／ウェルにおいて、10％仔ウシ胎児血清で補足したダルベッコ修飾イーグル培地（「DM EM」）中にまいた。その細胞を一晩37℃でインキュベートし、培地を除去し、その後、10％Nu 血清、400μg/ml DEAE-デキストラン、100μMクロロキン及び目的プラスミド100ng（即ち、IC4A7クローン100ng及びMAGE-cDNAプラスミド100ng）を含有するDMEM培地30μl/ウェルにより置き換えた。37℃で４時間インキュベーションした後、培地を除去し、10％DMSOを含有するPBS50μlにより置き換えた。この培地を２分後に除去し、10％FCSを補足したDMEM200μlにより置き換えた。培地のこの変更の後、COS細胞を48時間、37℃でインキュベートした。その後、培地を捨て、10％貯蔵ヒト血清を含有するイスコブ（Iscove）培地に100μlに 2000個の細胞のCTLクローン81/12を加えた。24時間後に上澄みを除去し、トラヴェルサリ（Traversari）ら著、Immunogenetics 35：145〜152（1992）（この開示は参考文献としてここに含まれるものとする）に記載されるように、TNF含有量をWEHI細胞上での分析において測定した。図１に示した結果は、MAGE-1から得られた腫瘍拒絶抗原は、HLA-C-クローン10 により提示され、CTLクローン81/12により認識されるが、MAGE-2及びMAGE-3の発現は好適な抗原の提示を導かなかったことを示している。前述の実験は、HLA-C-クローン10は、腫瘍拒絶抗原としてMAGE-1誘導ぺプチドを提示し、それは提示細胞の溶解を導くことを示している。この発見の結果は以下のようである。例えば、CTLクローン81/12は、問題の複合体に特異的なCTLの代表である。そのようなCTLの被験者への投与は、患者がHLA-C-クローン10表現型を異常細胞上に提示する時に治療用に有用であることが期待される。必要なCT Lをin vitroにおいて開発することは当業者の技術範囲内である。具体的には、血液細胞のような細胞のサンプルを、複合体を提示し、かつ増殖に特異的なCTL を生じることができる細胞に接触する。標的細胞は、トランスフェクタント、例えば上記のタイプのCOS細胞であってもよい。これらのトランスフェクタントはそれらの表面に望ましい複合体を提示し、興味あるCTLと組み合わされた時にその増殖を剌激する。HLA-Cの配列は、GENBANK及びEMBLにより当技術分野に公知であり、MAGE-1に関する配列は、その単離に関する詳細なプロトコールと共に、PC T出願及びファンデンブルジェン（Van den Bruggen）らにより提供され、それらは両方とも全体的に参考文献として上に含まれるものとする。ここに使用されたようなCOS細胞は、他の好適な宿主細胞と同様に、広く入手可能である。養子移入といわれる治療方法論（グリーンベルグ（Greenberg）著、J．Immuno l．136（5）：1917（1986）；レデル（Reddel）ら著、Science 257：238（7-10- 92）；リンチ（Lynch）ら著、Eur．J．Immunol．21：1403-1410（1991）；キャスト（Kast）ら著、Cell 59：603-614（11-17-89））を詳述するために、所望の複合体を示す細胞を、それらに特異的なCTLの増殖を導くCTLと組み合わせる。その後、増殖したCTLを、特定の複合体を提示する一定の異常細胞により特徴付けられる細胞異常性を示す被験者に投与する。その後、CTLは異常細胞を溶解し、それにより所望の治療目標を達成する。上記の治療は、被験者の異常細胞の少なくとも幾つかは、HLA-C-クローン10/M AGE-1誘導ペプチド複合体を示すことが考えられている。これは非常に容易に測定することができる。例えば、CTLは、上記のトランスフェクタントを使用して同定され、一度単離すると、被験者の異常細胞のサンプルを使用してin vitroで溶解を測定することができる。もし溶解が観測されれば、そのような治療において特定のCTLの使用は、異常細胞と関連した状態を軽減できる。より少なく関連した方法論は、標準的な分析を使用してHLA表現型について異常細胞を試験し、例えばPCRを使用する増幅を介するMAGE-1の発現を測定する。養子移入は、本発明に利用できる治療の唯一の形態ではない。また、CTLを、多くのアプローチを用いて、in vivoで剌激することができる。一つのアプローチ、即ち、複合体を発現する非増殖細胞の使用は、上に詳論している。このアプローチに使用する細胞は、複合体、例えば複合体の提示に必要な遺伝子の一つ又は両方でトランスフェクトした放射線照射したメラノーマ細胞を正常に発現するものであってもよい。チェン（Chen）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88：110 -114（1991年１月）は、このアプローチを例示しており、治療体制においてHPVE 7ペプチドを発現するトランスフェクトした細胞の使用を示している。多様な細胞型を使用してもよい。同様に、重要な遺伝子の１つ又は両方を運ぶベクターを使用してもよい。ウイルス又は細菌ベクターは特に好ましい。これらのシステムにおいて、重要な遺伝子は、例えばワクシニアウイルス又はバクテリアBCGにより運ばれ、そのものは、事実上宿主細胞に「感染する」。その結果として生じる細胞は、重要な複合体を提示し、自己CTLにより認識され、その後増殖する。同様の効果は、MAGE-1それ自体をアジュバントと合わせ、細胞を提示するHLA-C-クローン10への組み込みを促進することにより達成できる。その後、酵素を処理し、HLA分子のパートナーであるペプチドを生成する。上記の議論は、「異常細胞」及び「細胞異常性」に関連している。これらの語句はそれらの最も広い解釈で使用され、問題の細胞が、それらの特定の型の正常の細胞とは異なることを指摘する少なくとも一つの特性を示すどのような状況をもいう。異常な特性の例としては、形態学的及び生化学的変更が挙げられ、例えば、細胞性異常としては、腫瘍、例えばメラノーマ、自己免疫疾患等が挙げられる。本発明の他の態様は、当業者に明らかであり、ここに繰り返す必要はないであろう。使用した語句及び表現は、記載上の語句として使用するものであってそれらに限定されるものではなく、また、そのような語句及び表現の使用において、示し且つ記載した特徴又はその一部と等価なものを除外することを意図しようとするするものではなく、様々な変更は本発明の範囲内で可能であると認識されるものである。（2）配列番号１の情報（i）配列の特徴：（A）配列の長さ：１７塩基対（B）配列の型：核酸（C）鎖の数：一本鎖（D）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号：１

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 6807−4Ｂ 1/04 6807−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 49/00 Ｚ 7431−4Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．HLA-C-クローン10とMAGE-1誘導ぺプチドとの複合体に特異的な治療剤で治療されるべき者の識別方法であって、（1）上記複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、患者から採った異常細胞のサンプルと接触させること、及び（2）上記異常細胞のサンプルの少なくとも一部の溶解を、治療候補の指標として確認することを含むことを特徴とする上記方法。２．表面にHLA-C-クローン10/MAGE-1誘導ペプチドの複合体を提示する細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を生じる薬剤を、表面に上記複合体を提示する異常細胞に応答を生じるのに十分な量において、上記患者に投与することを特徴とする細胞異常性の患者の治療方法。３．細胞異常性が癌である、請求項２記載の方法。４．癌がメラノーマである、請求項３記載の方法。５．薬剤がMAGE-1をコードするベクターである、請求項２記載の方法。６．薬剤が、HLA-C-クローン10をコードするベクターをさらに含む、請求項５記載の方法。７．ベクターが、また、HLA-C-クローン10をコードする、請求項５記載の方法。８．薬剤が、細胞の表面に上記複合体を提示する非増殖細胞のサンプルである、請求項２記載の方法。９．異常細胞の表面上のHLA-C-クローン10/MAGE-1誘導ペプチドの複合体の提示により特徴付けられる細胞異常性を有する患者に、上記複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を異常細胞を溶解するのに十分な量で投与することを特徴とする細胞異常性の治療方法。 10．細胞異常性が癌である、請求項９記載の方法。 11．癌がメラノーマである、請求項１０記載の方法。 12．異常細胞が癌細胞である、請求項１１記載の方法。 13．癌細胞がメラノーマ細胞である、請求項１２記載の方法。 14．細胞傷害性Ｔ細胞が自己由来である、請求項９記載の方法。 15．HLA-C-クローン10/MAGE-1誘導ペプチドの複合体に特異的な単離した細胞傷害性Ｔ細胞。 16．表面にHLA-C-クローン10/MAGE-1誘導ペプチドの複合体を提示する異常細胞の同定方法であって、上記複合体に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を異常細胞のサンプルと接触させること及び上記複合体を提示する細胞の確認として上記異常細胞の溶解を確認することを特徴とする上記方法。