JPH10503928A

JPH10503928A - Ｈｌａ−ａ２によって提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子

Info

Publication number: JPH10503928A
Application number: JP8504333A
Authority: JP
Inventors: ブリチャード，ヴィンセント; ファン・ペル，アリーネ; クーリ，ピエール; ブーン−ファラー，ティエリー; デ・プレーン，エティエンヌ; トラヴァーサリ，キャティア; ヴォルフェル，トーマス
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 1998-04-14
Also published as: EP0772626A4; WO1996001557A1; US6201111B1; AU696738B2; AU2951795A; US5856091A; FI970071A; EP0772626A1; NO970030D0; CA2194451A1; CN1152251A; NZ289616A; NO970030L; FI970071A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に関する。具体的には、前記腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、”ＴＲＡＰ”は、少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされ、これは、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される。この発見の応用も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＬＡ−Ａ２によって提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子発明の分野本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に関する。より詳しくは、本発明は、その腫瘍拒絶抗原前駆体が、上述したように、細胞表面上にＨＬＡ −Ａ２によって提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる遺伝子に関する。発明の背景ほ乳類の免疫システムが外来物質または異物を認識しこれらに対して反応するプロセスは複雑なものである。このシステムの重要な側面は、Ｔ細胞反応である。この反応の為には、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（”ＨＬＡ”）または主要組織適合性複合体（”ＭＨＣ”）と称される細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これらに対して反応する必要がある。これらペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によって処理される比較的大きな分子から由来するものである。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他のＡｄｖａｎｃｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｐ．ＬｉｐｉｎｃｏｔｔＣｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との間の相互作用は、特定のＨＬＡ分子とペプチドとの複合体に対して特定のＴ細胞が必要であるという意味において、制限されている。即ち、もし特定のＴ細胞が存在しないならば、たとえそのパートナー複合体が存在してもＴ細胞反応は起こらない。同様に、もし特定の複合体が存在していても、特定のＴ細胞が無ければ反応は起こらない。このメカニズムが、自己免疫疾患における異物に対する免疫システムの反応、および細胞異常に対する免疫システムの反応に関係している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへと処理されるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）；マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）；ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは、癌にも関係している。例えば、ここに参考文献として提示する、１９９２年５月２２日に出願され１９９２年１１月２６日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４において、１つの遺伝子グループが開示されている。これらの遺伝子は、ペプチドへと処理され、これらのペプチドが細胞表面に発現することによって、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞のリーシス（細胞溶解）が可能となる。これらの遺伝子は、”腫瘍拒絶抗原先駆体”、略称”ＴＲＡＰ” 分子をコードするものであると言われており、これらに由来するペプチドは”腫瘍拒絶抗原”即ち”ＴＲＡ”と称される。この遺伝子グループに関する更に詳しい情報については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５（１９９２）；ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。参考文献として提示した米国特許第５，３４２，７７４号も参照のこと。ここに参考文献として提示した米国特許出願第９３８，３３４号には、前記ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノナペプチドが教示されている。この文献によれば、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判っていれば、ひとつの特定のペプチドは１つのＨＬＡにしか結合しないと予測できるとされている。これは重要である、というのは、ＨＬＡの表現型は個々人によって異なっているからである。その結果、特定のペプチドが特定のＨＬＡ分子に対するパートナーであることの同定は診断的および治療的効果を有しており、これらは、その特定のＨＬＡ表現型を有する個体にのみ関係する。従って、細胞異常は１つの特定のＨＬＡ表現型に限られておらず、また標的療法のためには問題の異常細胞の表現型に関するなんらかの知識が必要であるため、この領域において更なる研究が必要である。参考文献として提示される１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号において、ＭＡＧＥ−１発現産生物が第２のＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２ＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃ^*１６０１ −分子によって提示される。この開示は、所与のＴＲＡＰが、複数のＴＲＡを産生できることを示している。ここに参考文献として提示される１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号において、チロシナーゼが、腫瘍拒絶抗原前駆体として記載されている。この参考文献は、いくつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって産生される分子が、腫瘍細胞中でプロセッシングされて、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される腫瘍拒絶抗原を産生することを開示している。前出の米国特許第３２，９７８号は、過去において記載されたものと異なる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子について報告している。ここに記載する本発明のＴＲＡＰは、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされるが、配列分析によれば、本発明のＴＲＡＰは、チロシナーゼではなく、又、チロシナーゼと無関係である。従って、前記親出願の発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、”ＴＲＡＰ”分子をコードする核酸分子に関するものである。この”ＴＲＡＰ”分子はチロシナーゼではない。更に、前記親出願の発明のＴＲＡＰは、少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原、即ち、”ＴＲＡ”にプロセッシングされ、これはＨＬＡ−Ａ２によって提示される。前記ＴＲＡはチロシナーゼと無関係であり、本発明のＴＲＡＰｓから誘導される他のＴＲＡｓは、他のＨＬＡ分子によって提示可能である。上述した親出願の後に発表された文献において、カワカミ（Ｋａｗａｋａｍｉ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３５１３〜３５１９（１９９４）も、前記親出願の対象物が、メラノーマ抗原をコードする遺伝子であると同定した。更なる研究は、ここで”メラン（Ｍｅｌａｎ）−Ａ”と称するこのＴＲＡＰをコードする遺伝子が約１８キロベース長さを有し、５つのエキソンを有することを示している。これは、メラノーマとメラニン細胞においてのみ発現され、従って、これらのマーカとして役立つようである。本発明とその様々な態様を、以下の開示において詳述する。図面の簡単な説明図１Ａは、ＬＢ３９−ＭＥＬ，Ｋ５６２及びＬＢ３９芽球に対して、ＣＴＬクローンＩ／９５を使用した細胞溶解実験の結果を示す。図１Ｂは、ＳＫ２３−ＭＥＬ及びＳＫ２９−ＭＥＬに対してＣＴＬクローンＩ／９５を使用した溶解を示す。図２は、種々の細胞系をＣＴＬＩ／９５と共に使用したＴＮＦ放出アッセイの結果を示す。図３Ａは、ＣＴＬクローンＩ／９５と共にテストしたとき、移入体（トランスフェクタント）を含む、種々の細胞系によって誘導されたＴＮＦ放出を示す。図３Ｂは、ＣＴＬクローンＩＶＳＢを使用したＴＮＦ放出データを示す。図３Ｃは、ＣＴＬクローン１０／１９６を使用したＴＮＦ放出を示す。図４は、ここに記載した核酸分子から誘導されたオリゴヌクレオチドプローブを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、メラン−Ａ遺伝子、”ＡａＧｌｃｌ２４”、の発現をテストした、組織、細胞系および腫瘍のパネルを示す。図５は、遺伝子Ｍｅｌａｎ−Ａの構造を略示しており、ここでエクソンは黒箱（ｂｌａｃｋｂｏｘｅｓ）で示され、制限部位が示されている。点で示された部分は、前記遺伝子の配列未決定部分を表す。好適実施形態の詳細な説明例１メラノーマ細胞系，”ＬＢ−３９−ＭＥＬ”を、標準方法を使用して、患者ＬＢ３９から採取したメラノーマ細胞から、樹立した。前記細胞系の樹立後、そのサンプルを照射し、それを、非増殖性にした。つぎに、これらの照射済み細胞を使用して、それに対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（”ＣＴＬｓ”）を単離した。末梢血液単核細胞（”ＰＢＭＣｓ”）のサンプルを、患者ＬＢ３９から採取し、これを、前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。この混合物についてメラノーマ細胞の溶解を観察したところ、ペプチドとメラノーマ細胞によって提示されるＨＬＡ分子との複合体が該サンプル中に存在していた。使用した溶解アッセイは、その開示内容をここに参考文献として提示するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）によるクロム放出アセイであった。しかし、このアセイについては、ここにおいても説明する。標的黒色腫細胞をインヴィトロで成長させ、つぎに、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で１０⁷細胞／ｍｌの密度で再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄と共に３７℃で４５分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。つぎに、これらを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１０％のＦＣＳとを添加したＤＭＥＭ中で再懸濁させ、その後、それぞれ１０³の細胞を含む１００ｕｌのアリコットを９６ウェルのマイクロプレートに分けた。１００ｕｌの同じ培地にＰＢＬのサンプルを添加し、同様にアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離にかけ、６０％のＣＯ₂を含有する雰囲気中にて３７℃で培養した。プレートを再び遠心分離にかけ、１００ｕｌの上清のアリコットを収集し、計数した。⁵¹Ｃｒ放出の割合は以下の式によって表される。ここで、ＥＲは、観察された実験 ⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³の標識化細胞を２００ｕｌの培地だけの中で培養することによって測定された自然放出量、そしてＭＲは、標的細胞に１００ｕｌの０．３％トリトン（Triton）Ｘ−１００を添加することによって得られた最大放出量である。高いＣＴＬ活性を示したこれらの単核血液サンプルを、拡張（ｅｘｐａｎｄｅｄ）して制限希釈によってクローン化し、前述と同じ方法によって再度スクリーニングした。このようにしてＣＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬＩ／９５が単離された。同じ方法を使用して、標的Ｋ５６２細胞と、更に、自己由来、ＰＨＡ誘導Ｔ細胞芽球とをテストした。図１Ａに示すこれらの結果は、このＣＴＬクローンが、前記メラノーマ細胞系はこれを認識し溶解するが、Ｋ５６２やＴ細胞芽球は認識溶解しないことを示している。つぎに、前記ＣＴＬ，ＬＢ３９ −ＣＴＬＩ／９５を、前述したのと同じ方法によって、メラノーマ細胞系ＳＫ２３−ＭＥＬとＳＫ２９ＭＥＬとに対してテストした。これらの系の両方からの細胞も溶解された。これらの系は、共に、ＬＢ３９と同様に、ＨＬＡ−Ａ２として分類された患者から単離されたものであった。これは、前記ＣＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬＩ／９５が、ＨＬＡ−Ａ２によって提示される抗原を認識する、ということを示唆している。例２ＬＢ３９−ＣＴＬＩ／９５が、標的細胞と接触されたときに、腫瘍壊死因子（”ＴＮＦ”）も産生するか否かを調べるため、更に研究を行った。使用した方法は、参考文献として提示される、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２（１９９２）に記載されているものであった。簡単に説明すると、前記ＣＴＬのサンプルを、培地中にて、対象の標的細胞のサンプルと組み合わせた。２４時間後、前記培地からの上清を除去し、つぎに、ＴＮＦ反応性ＷＥＨＩ細胞上でテストした。前述したＬＢ３９−ＭＥＬ及びＳＫ２３−ＭＥＬの他に、別の細胞系、即ち、ＳＫ２９ −ＭＥＬ．１、ＨＬＡ−Ａ２欠失変異体、即ち、ＳＫ−ＭＥＬ．１．２２及び、ＨＬＡ−Ａ１陽性である、非ＨＬＡ−Ａ２系、即ち、ＭＺ２−ＭＥＬもテストした。前記上清に対する曝露によって死滅したＷＥＨＩ細胞の百分率として表されているその結果が、図２に示されている。これらの結果は、前記ＨＬＡ−Ａ２欠失変異体ＳＫ２９−ＭＥＬ．１．２２は、もはや、ＣＴＬクローンを溶解する能力を失っており、これによって、ＬＢ３９−ＣＴＬ−Ｉ／９５によって認識される抗原がＨＬＡ−Ａ２によって提示されるものであることが確認された。例３前記例２からの結果は、ＳＫＭＥＬ２９．１が、対象の標的抗原を提示することを示した。従って、これを、全ｍＲＮＡ源として使用して、ｃＤＮＡライブラリを作成した。前記細胞系から全ＲＮＡを単離した。前記ｍＲＮＡは、周知技術に従って、オリゴ−ｄＴ結合キットを使用して単離した。ｍＲＮＡの入手後、これを、再び標準方法を使用して、ｃＤＮＡに転写した。つぎに、このｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩアダプタに結合させ、製造業者の指示に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／ＡｍｐのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。つぎに、これらの組換えプラスミドを、ＪＭ１０１Ｅ．ｃｏｌｉ電子穿孔移入した（電子穿孔条件：２５μファラドで１パルス、２５００Ｖ）。前記被移入バクテリアを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選択し、それぞれが１００のクローンからなる８００個のプールに分けた。分析によれば約５０％のプラスミドが挿入体を含有していたので、各プールは、約５０の種々のｃＤＮＡを表していた。各プールを飽和状態にまで増幅し、プラスミドを、マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８２）に従って、アルカリ溶出、フェノール抽出なしの酢酸カリウム沈澱によって単離した。例４例３に記載したライブラリの作成後、前記ｃＤＮＡを真核細胞に移入した。ここに記載するこれら移入を、反復実施した。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％胎児ウシ血清を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ変成Ｅａｇｌｅｓ培地（”ＤＭＥＭ”）中で、組織培養平底マイクロウェル中に１５，０００細胞／ウェルの割合で接種した。前記細胞を、３７℃で一晩インキュベートし、培地を除去し、つぎに、これを、１０％Ｎｕ血清を含有する３０μｌ／ウェルのＤＭＥＭ培地と、４００μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デクストラン、１００ μＭクロロキン、１００ｎｇのプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２と、前述したｃＤＮＡライブラリのプールの１００ｎｇのＤＮＡと、によって置換した。プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ−Ａ２は、ＳＫ２９−ＭＥＬからの前記ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含有している。３７℃での４時間のインキュベーション後、培地を除去して、これを、１０％ＤＭＳＯを含有する５０μｌのＰＢＳによって置換した。この培地を２分後に除去し、これを、１０％のＦＣＳを添加した２００μｌのＤＥＭＥによって置換した。この培地の置換後、ＣＯＳ細胞を、３７℃で４８時間インキュベートした。つぎに、培地を廃棄し、１０００個の細胞のＣＴＬＩ／９５を、１０％のプールされたヒト血清を含有し、２５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した、１００μｌのＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地中に、添加した。上清を２４時間後に除去し、ＴＮＦ含有量を、参考文献として前に提示されたトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、に記載されているように、ＷＥＨＩ細胞上のアッセイによって測定した。テストされた８００のプールの内、９９％が、前記上清中において、３〜６ｐｇ／ｍｌからの濃度まで、ＴＮＦ放出を刺激した。２つのプールは８ｐｇ／ｍｌ以上産生し、その複製ウェルも８ｐｇ／ｍｌ以上産生した。例５前記上清中において、高いＴＮＦ産生を示した２つのプールを、更なる研究のために選択した。具体的には、前記バクテリアをクローン化し、各プールから８００のバクテリアをテストした。そこからプラスミドＤＮＡを抽出し、これを、前述したものと同じ方法により、ＣＯＳ細胞の新しいサンプルに移入し、これらの細胞について、再び、ＬＢ３９−ＣＴＬクローンＩ／９５の刺激をテストした。１つの陽性のクローンが見つかり、これをＡａＧｌｃｌ２４と称する。前記陽性クローンと前記ＨＬＡ−Ａ２遺伝子とからのｃＤＮＡを移入したＣＯＳ細胞と、ＨＬＡ−Ａ２のみを移入したＣＯＳ細胞と、細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬとの比較テストを行うことによって、前記被移入細胞がＣＴＬｓによって認識されるという確証を得た。ＣＴＬ上清中のＴＮＦ放出を、前述したようにして、それをＷＥＨＩ細胞上でテストすることによって測定した。生存ＷＥＨＩ細胞の光学的濃度をＭＴＴを使用して測定した。図３Ａは、ＣＴＬクローンＩ／９５で得られた結果を示している。更なるテストにより、前記被移入細胞中においてＨＬＡ−Ａ２によって提示された前記ペプチドは、前に観察されたもの、即ち、チロシナーゼ由来ペプチドとは異なることが示された。ＣＴＬクローンＩＶＳＢは、チロシナーゼ由来ペプチドとＨＬＡ−Ａ２との複合体に対して特異的である。このＣＴＬクローンを、ＡａＧｌｃｌ２４とＨＬＡ−Ａ２とを移入した細胞に接触させたとき、ＴＮＦ放出は、図３Ｂに示すように、最小であった。例６前記陽性クローンからのｃＤＮＡを除去し、周知技術に従って配列決定した。配列検索によって、前記プラスミド挿入体は、公知のいずれの遺伝子またはタンパク質とも相同性を示さないことが判った。配列認識番号１は、完全腫瘍拒絶抗原前駆体コード分子、即ち、ゲノムクローンである、配列認識番号２のｍＲＮＡ転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を表すｃＤＮＡである。前記ｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド位置７５から４３１にわたって、大きな転写解読枠を示している。配列認識番号２に対する完全なヌクレオチド配列は、まだ、推定されていない。但し、その大部分は既に推定されている。位置９４２２〜９４５６における３５”Ｎ”’ｓによって示される未コード領域は、約４．７キロベースから約５．３キロベース長である。ヌクレオチド配列は、核酸分子にとって本来的であるため、詳細は省略する。例７ＣＴＬクローンＬＢ３９−ＣＴＬＩ／９５を単離したのと同様にして、ＰＢＭＣｓと、患者ＳＫ２９（ＡＶ）から発生分化したメラノーマ細胞系とを使用して、ＣＴＬクローンＳＫ２９−ＣＴＬ１０／１９６を単離した。この新しい細胞系を、例５で記載したのと同様の方法で、テストした。図３Ｃに示されているこれらのアッセイの結果は、ＡａＧｌｃｌ２４によってコードされる腫瘍拒絶抗原（以後、”ＬＢ３９−Ａａ”という）も、このＣＴＬクローンによって認識されることを示している。これらの実験は、他の患者も、この抗原に対して特異的なＣＴＬｓを産生可能であるし、事実、それらを産生する、ということを示している。前記配列からオリゴヌクレオチドプローブを導出し、これらを標準式ポリメラーゼ連鎖反応に使用して、前記遺伝子の、正常組織、腫瘍、および腫瘍細胞系中における発現を調べた。これらの結果は図４に示されており、これは、テストした正常組織の内、メラニン細胞のみが前記遺伝子を発現したことを示している。テストしたすべての腫瘍サンプル及び／又は、メラノーマ細胞系における発現に注目されたい。例８上記ｃＤＡＮは、６７５ベース対長である。これを、メラノーマ細胞系ＳＫ２９−ＭＥＬとともに、プローブとして使用した。ここに参考文献として提示されるファン・デン・エインデ（ＶａｎｄｅｎＥｙｎｄｅ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７３（１９９１）に従って、ノザンブロッチングを行い、約０．７５キロベースのバンドを同定した。この後、前記６７５ベース対長の配列（配列認識番号１）を使用して、、ここに記載したｃＤＮＡのスクリーニングのための方法と同じ方法を使用して、ＳＫ２９−ＭＥＬから誘導されたｃＤＡＮをプローブをした。７６０ベース対のクローンが同定され、配列認識番号３がこれを示している。この配列は、その５’末端において８３の追加のベース対を有している点において、配列認識番号１と異なっている。例９上述したｃＤＮＡに対応する遺伝子を、つぎに、単離した。これを行うために、全ヒトＤＮＡ（７００，０００独立コスミド）のゲノムライブラリを、ここに参考文献として提示されるデ・プレーン（ＤｅＰｌａｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２２７４（１９８８）に従って、メラノーマ細胞系ＬＢ３３−ＭＥＬからのＤＮＡを使用して、コスミドｃ２ＲＢ中で構築した。ＤＮＡを７０，０００のコスミドの２２のグループから単離し、これらに対して、³²Ｐラベル化配列認識番号１をプローブとして使用して、標準式のサザンブロッチングを行った。前記プローブは９つのグループとハイブリッド化した。最も強力なハイブリダイゼーションバンドを生成したグループをサブクローン化し、つぎに、これを、再び前記ラベル化ｃＤＮＡを使用して、集団ハイブリダイゼーションした。ついで、最も強力なシグナルを発したコスミドを、前記ｃＤＮＡ配列から推定したプライマを使用して配列決定した。即ち、上記配列化作業によって、１５１２ベース対の第１のイントロンと、５キロベースの第２のイントロンと、前記第３のイントロンの部分配列と、１４６２ベース対の第４のイントロンとが明らかにされた。更に別の実験において、それらの制限部分が前記遺伝子中に存在していることを判定した上で、前記コスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩとによって消化した。前記配列化イントロンのそれぞれに基づき、オリゴヌクレオチドを準備し³²Ｐでラベル化し、これらを、上述した消化物を使用して、標準式サザンブロッチングに利用した。この作業によって、７ｋｂのＥｃｏＲｉ断片が、イントロン３の末端からの³²Ｐラベル化オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションした。前記イントロンの推定サイズは、９．５ｋｂであり、これから、メラン−Ａの全長が約１８．５キロベースであることが導かれた。この推定は、いくつかのデータから導かれたものである。即ち、（ｉ）前記サザンブロッチング作業において、オリゴヌクレオチドが、７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片のいずれかの側に結合した、という事実、（ｉｉ）前記遺伝子のイントロン３の２．５キロベースが、最も下流側に位置する前記ＥｃｏＲＩの上流側において既に配列決定されていた、という事実。例１０メラン−Ａの発現パターンを、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とを使用して分析した。この作業を行うため、全ＲＮＡを、デイビス（Ｄａｖｉｓ）他（ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８６，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ３１０）に従って、腫瘍サンプルから単離するか、もしくは、メラニン細胞から入手した。逆転写を、オリゴ（ｄＴ）プライマを使用して、各サンプルの２ｕｇの全ＲＮＡに対して行った。１００ｎｇの全ＲＮＡ（１０⁴細胞相当）に対応するｃＤＮＡのサンプルを、次のプライマ、即ち、５’−ＡＣＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’（センス）（配列認識番号１０）、５’−ＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧ−３（アンチセンス）（配列認識番号１１）、を使用して、ＰＣＲによって、６３℃で３５サイクル増幅した。これらのプライマは、前記メラン−Ａ遺伝子（配列認識番号２）のエキソン３及び５に見られるものであり、これらを使用して、ＤＮＡ汚染物質の増幅を防止した。ＰＣＲ反応のアリコットを、１％アガロースゲル上に流し、臭化エチジウムで染色した。劣化ＲＮＡが存在していないことを確認するため、ｃＤＮＡ産生物を、ヒトβ反応の存在に関してテストした。その結果を、次の表１に示す。２１のメラノーマ細胞系の内、１２が陽性であった。正常組織に関しては、メラニン細胞のみが陽性であった。皮膚生検が陽性であった場合、これは、メラニン細胞の割合が通常よりも高いことによるものであると推定される。以上の諸実験は、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡとしての、腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、”ＴＲＡＰ”分子、をコードする単離核酸分子を記載するものである。これらがコードする前記タンパク質分子は、それによって、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される、少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原、即ち、”ＴＲＡ” 、が産生されるように、細胞内でプロセッシングされる。ＨＬＡ−Ａ２分子がチロシナーゼから誘導されたペプチドを提示することは過去において観察されていたが、本発明の核酸分子はチロシナーゼをコードするものではなく、前記ＴＲＡｓは、チロシナーゼ由来ではない。従って、本発明は、チロシナーゼ以外であって、但し、配列認識番号１，２及び３に限定されない、腫瘍拒絶抗原前駆体、即ち、”ＴＲＡＰ”、をコードする単離核酸分子に関する。前記コードされるＴＲＡＰは、少なくとも１つの腫瘍拒絶抗原、即ち、ＴＲＡにプロセッシングされ、これが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって細胞表面上で提示される。本発明の核酸分子は、例えば、ゲノムＤＮＡ（”ｇＤＮＡ”）、相補的ＤＮＡ（”ｃＤＮＡ”）、あるいはＲＮＡとして構成することができる。本発明は、更に、上述した分子に対して相補的な単離核酸分子にも関する。本発明の特に好適な構成は、配列認識番号１，２及び３に記載される配列を含有する分子である。更に、本発明には、本発明の前記核酸分子を含有し、かつ、プロモータの作動連結されたベクターも含まれる。これらのベクターには、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする分子を含ませることも可能である。これらの２つの分子、即ち、ＨＬＡ−Ａ２と前記ＴＲＡＰとが、細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き起こすのに必要であることから、本発明は、更に、ＴＲＡＰコードする核酸分子とＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子とが、別々の部分として、例えば、キットとして、提供される発現システムをも含む。本発明は、更に、ここに記載したベクターによって移入される細胞系をも含み、これらの細胞系は、Ｅ．ｃｏｌｉ等の原核細胞であってもよいし、あるいは、チャイニーズハムスタの卵巣（”ＣＨＯ” ）細胞やＣＯＳ細胞などの真核細胞であってもよい。前に示したように、ＴＲＡとＨＬＡ−Ａ２との複合体によって、細胞傷害性Ｔ細胞応答が引き起こされることから、この腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との単離複合体も、本発明に含まれ、更に、過去に記載された核酸配列によってコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体も本発明に含まれる。ここに記載した本発明は、多数の利用方法を有し、その内のいくつかについては既に記載した。先ず、ＨＬＡ−Ａ２分子によって特異的に提示される腫瘍拒絶抗原、また、それに対応する腫瘍拒絶抗原前駆体、の同定によって、当業者は、前記ＴＲＡＰの発現によって特徴づけられる、メラノーマ等の障害を診断することができる。これらの方法には、前記ＴＲＡＰ遺伝子、および／又は、ＨＬＡ−Ａ２によって提示されるＴＲＡ等の、それから誘導されるＴＲＡｓ、の発現の判定が含まれる。これは、前述した配列、またはその断片を、プローブ、プライマ等として使用することによって達成される。その他のＴＲＡｓを、本発明のＴＲＡＰｓから誘導することも可能であり、これらは別のＨＬＡ分子によって提示される。前者の場合、このような判定は、ポリメラーゼ連鎖反応や、あるいは、ラベル化ハイブリダイゼーションプローブでのアッセイ等のどのような標準式核酸判定アッセイによっても行うことができる。後者の場合、抗体など、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体に対する結合パートナによるアッセイが特に好適である。前記ＴＲＡＰの単離によって、更に、前記ＴＲＡＰ分子自身、とくに、前記配列認識番号１のアミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子、を単離することも可能となる。これらの単離分子は、前記ＴＲＡとして提示されたとき、あるいは、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体として、アジュバント等の物質と結合させて、前記ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴づけられる障害の治療に有効なワクチンを製造することができる。更に、非増殖性癌細胞や非増殖性移入体などの、前記ＴＲＡ／ＨＬＡ複合体をその表面に提示する細胞からワクチンを作ることも可能である。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合において、これらは、ＣＴＬ応答を証明するのに必要な前記成分の片方または両方のためのコード配列を移入した細胞であってもよいし、あるいは、移入なしで両分子を発現する細胞であってもよい。更に、前記ＴＲＡＰ分子、その関連ＴＲＡｓ、及び、ＴＲＡとＨＬＡとの複合体を使用して、当該技術において周知の標準技術を利用して抗体を製造することができる。ここで”障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）”という用語を使用する場合、これは、前記腫瘍拒絶抗原前駆体が発現されるすべての病状を指す。このような障害の一例は、癌、特に、メラノーマである。この開示において提供された治療および診断アプローチは、ＨＬＡ−Ａ２細胞などのＴＲＡ提示細胞の溶解をもたらす対象体の免疫システムによる応答を前提としている。このようなアプローチの１つは、対象の表現型の異常細胞を有する対象体に対する、前記複合体に対して特異的なＣＴＬｓの投与である。当業者にとって、このようなＣＴＬｓをインヴィトロで開発することが可能である。具体的には、血液細胞などの細胞のサンプルを、前記複合体を提示し、特異的なＣＴＬの増殖を誘発することが可能な細胞に接触させる。標的細胞は、例えば、前述したようなタイプのＣＯＳ細胞などの移入体とすることができる。これらの移入体は、前記所望の複合体をその表面上に提示し、対象のＣＴＬと組み合わせられたときに、その増幅を刺激する。ここに使用したようなＣＯＳ細胞は容易に入手可能であって、他の適当な宿主細胞も同様である。養子移入（グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）；レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）；リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３〜１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他、Ｃｅｌｌ５９：６０３〜６１４（１１−１７−８９））と称する治療法について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞をＣＴＬｓと組み合わせて、これに対して特異的なＣＴＬｓを増殖させる。つぎに、これらの増殖されたＣＴＬｓを、前記特定の複合体を提示するある種の異常細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する対象体に投与する。すると、ＣＴＬｓが前記異常細胞を溶解し、これによって所望の治療目的を達成する。上記療法は、対象体の異常細胞の内の少なくともいくつかが、前記ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示することを前提としている。当該技術において特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法と、更に、前述した配列を含むＤＮＡを発現する細胞を同定する方法とは周知であるため、これは非常に容易に判定可能である。単離後、これらの細胞を対象体の異常細胞に使用して溶解をインヴィトロに測定することができる。もしも溶解が観察されれば、特異的ＣＴＬｓをこのような療法に使用して、前記異常細胞に関連する症状を軽減することができる。より単純な方法においては、標準式アッセイを使用して異常細胞のＨＬＡ表現型を調べ、例えばＰＣＲを使用した増幅によって発現を判定する。この診断アプローチは、診断方法自身が有効であるため、必ずしも前述した治療方法に限られず、又、それに関連づけられる必要もない。養子移入は、本発明によって利用可能な唯一の治療態様ではない。多数のアプローチを使用することによってもインヴィヴォでＣＴＬｓを誘発することが可能である。１つのアプローチ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に詳述した。このアプローチにおいて使用される細胞は、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な遺伝子の片方または両方を移入した細胞など、の前記複合体を通常に発現する細胞とすることができる。チェン（Ｃｈｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１１０〜１１４（１９９１年１月）は、このアプローチ例の一つであり、これは、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現する被移入細胞の治療用途での使用を示している。様々細胞タイプを使用できる。同様に、対象の前記遺伝子の片方または両方を運ぶベクタを使用することができる。ウィルス又はバクテリアベクターが特に好適である。これらのシステムにおいて、対象の遺伝子は、ワクシニアウィルス又はバクテリアＢＣＧによって運ばれ、これらの物質が実際に宿主細胞に”感染”する。その結果得られる細胞は、対象の複合体を提示し、これらが、自己由来ＣＴＬｓによって認識され、その後、増殖する。前記腫瘍拒絶抗原または前駆体自身を、アジュバントと組み合わせて、対象のＨＬＡ分子を提示する細胞のＨＬＡ−Ａ２への組み込みを容易するすることによっても類似の効果を達成できる。前記ＴＲＡＰは、プロセッシングされて、前記ＨＬＡ分子のペプチドパートナを産生するのに対して、ＴＲＡは、更にプロセッシングする必要なく提示される。本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろう。従って、ここに繰り返す必要はない。ここに使用した用語および表現は、記載の用語であって限定の用語ではなく、これらの用語および表現を使用するに当たって、図示および記載した特徴構成またはその一部の均等物を除外する意図はなく、本発明の範囲内において種々の改変が可能であると認識される。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年１１月６日【補正内容】１．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、あるいは腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に対して相補的な単離核酸分子であって、前記単離核酸分子はゲノムＤＮＡである。２．請求項１の単離核酸分子であって、前記核酸分子は、前記腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする。３．配列認識番号２のヌクレオチド配列を有する請求項１の単離核酸分子。４．配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する単離核酸分子。５．プロモータに作動連結された請求項１又は８の核酸分子を有する組換え発現ベクター。６．プロモータに作動連結された、配列認識番号２又は配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する請求項５の組換え発現ベクター。７．請求項１の単離核酸分子を移入された、又は、この核酸分子によって形質転換された原核または真核細胞系。８．請求項７の原核または真核細胞系であって、前記核酸分子は、配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。９．ベクターを移入された、又はベクターによって形質転換された請求項７の原核または真核細胞系。１０．請求項９の原核または真核細胞系であって、前記ベクターは、配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。１１．請求項９の原核または真核細胞系であって、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換されたものである。１２．請求項８の原核または真核細胞系であって、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換されたものである。１３．請求項５の組換えベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を有している。１４．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原によってプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対して特異的で、かつ、この複合体を提示する細胞を溶解する細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。１５．配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と、前記腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導された腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。１６．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。１７．配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、ＨＬＡ分子と腫瘍拒絶抗原前駆体との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。１８．ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成する腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤に接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。１９．配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列に対して特異的な抗原、または、その発現産生物に接触させる工程と、前記薬剤と前記配列または前記発現産生物との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。２０．サンプル中における、腫瘍拒絶抗原前駆体メラン− Ａの発現を測定する方法であって、前記サンプルを、ヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブに接触させる工程を有し、前記少なくとも１つのプローブが、メラン−Ａをコードするヌクレオチド配列と混成し、更に、そのハイブリダイゼーションを、前記サンプル中におけるメラン−Ａの発現として判定する方法。２１．ポリメラーゼ連鎖反応を有する請求項２０の方法。２２．請求項２０の方法であって、前記少なくとも１つのプローブは、配列認識番号１０と配列認識番号１１とを有する。２３．請求項２１の方法であって、前記サンプルを、配列認識番号１０と配列認識番号１１とに接触させる。２４．配列認識番号１０と配列認識番号１１とからなるグループから選択された単離核酸分子。２５．請求項２の核酸分子によってコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月７日【補正内容】請求の範囲：１．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、あるいは腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に対して相補的な単離核酸分子であって、前記単離核酸分子はゲノムＤＮＡである。２．請求項１の単離核酸分子であって、前記核酸分子は、前記腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする。３．配列認識番号２のヌクレオチド配列を有する請求項１の単離核酸分子。４．配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する単離核酸分子。５．プロモータに作動連結された請求項１又は８の核酸分子を有する組換え発現ベクター。６．プロモータに作動連結された、配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する請求項５の組換え発現ベクター。７．請求項１の単離核酸分子を移入された、又は、この核酸分子によって形質転換された原核または真核細胞系。８．請求項７の原核または真核細胞系であって、前記核酸分子は、配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。９．請求項７の原核または真核細胞系であって、ベクターを移入された、又はベクターによって形質転換されたものである。１０．請求項９の原核または真核細胞系であって、前記ベクターは、配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。１１．請求項９の原核または真核細胞系であって、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換されたものである。１２．請求項８の原核または真核細胞系ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換されたものである。１３．請求項５の組換えベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を有している。１４．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原によってプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対して特異的で、かつ、この複合体を提示する細胞を溶解する細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。１５．配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と、前記腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導された腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。１６．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。１７．配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、ＨＬＡ分子と腫瘍拒絶抗原前駆体との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。１８．ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成する腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤に接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。１９．配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列に対して特異的な抗原、または、その発現産生物に接触させる工程と、前記薬剤と前記配列または前記発現産生物との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。２０．サンプル中における、腫瘍拒絶抗原前駆体メラン−Ａの発現を測定する方法であって、前記サンプルを、ヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブに接触させる工程を有し、前記少なくとも１つのプローブが、メラン−Ａをコードするヌクレオチド配列と混成し、更に、そのハイブリダイゼーションを、前記サンプル中におけるメラン−Ａの発現として判定する方法。２１．請求項２０の方法であって、ポリメラーゼ連鎖反応を有する。２２．請求項２０の方法であって、前記少なくとも１つのプローブは、配列認識番号１０と配列認識番号１１とを有する。２３．請求項２１の方法であって、前記サンプルを、配列認識番号１０と配列認識番号１１とに接触させる。２４．配列認識番号１０と配列認識番号１１とからなるグループから選択された単離核酸分子。２５．請求項２の核酸分子によってコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＰＣ１２Ｑ 1/68 33/53 ＫＧ０１Ｎ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＦＩ，ＪＰ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者ファン・ペル，アリーネベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者クーリ，ピエールベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン−ファラー，ティエリーベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者デ・プレーン，エティエンヌベルギー国ビー−1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者トラヴァーサリ，キャティアイタリア国イ−20132 ミラノヴィア・オルゲッティナ 60 (72)発明者ヴォルフェル，トーマスドイツ連邦共和国デー−6500 マインツランゲンベックシュトラーセ１

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原へとプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、あるいは腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子に対して相補的である単離核酸分子。２．請求項１の単離核酸分子であって、前記核酸分子は前記腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする。３．請求項２の単離核酸分子であって、前記核酸分子はＤＮＡである。４．請求項３の単離核酸分子であって、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。５．請求項３の単離核酸分子であって、前記ＤＮＡはｇＤＮＡである。６．配列認識番号１のヌクレオチド配列を有する請求項４の単離核酸分子。７．配列認識番号２のヌクレオチド配列を有する請求項５の単離核酸分子。８．配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する請求項４の単離核酸分子。９．プロモータに作動連結された請求項１の核酸分子を有する組換え発現ベクター。１０．プロモータに作動連結された、配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する請求項９の組換え発現ベクター。１１．請求項１の単離核酸分子を移入された、又は、この核酸分子によって形質転換された原核または真核細胞系。１２．請求項１１の原核または真核細胞系であって、前記核酸分子は、配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。１３．ベクターを移入された、又はベクターによって形質転換された請求項１１の原核または真核細胞系。１４．請求項１３の原核または真核細胞系であって、前記ベクターは、配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する。１５．ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換された請求項１１の原核または真核細胞系。１６．ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を共同移入された、又は、この核酸分子と共同形質転換された請求項１２の原核または真核細胞系。１７．請求項９の組換えベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ａ２をコードする核酸分子を有している。１８．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原によってプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対して特異的で、かつ、この複合体を提示する細胞を溶解する細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。１９．配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と、前記腫瘍拒絶抗原前駆体から誘導された腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を、前記障害を軽減するのに十分な量、投与する工程を有する。２０．ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示される腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、前記腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ａ２分子との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。２１．配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を有する対象体を治療する方法であって、前記対象体に対して、ＨＬＡ分子と腫瘍拒絶抗原前駆体との複合体に対する免疫応答を誘発させる薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量、投与する工程を有する。２２．ＨＬＡ−Ａ２分子と複合体を形成する腫瘍拒絶抗原にプロセッシングされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤に接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。２３．配列認識番号１，配列認識番号２または配列認識番号３のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体の発現によって特徴づけられる障害を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列に対して特異的な抗原、または、その発現産生物に接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との間の相互反応を、前記障害の判定として判定する工程とを有する。２４．サンプル中における、腫瘍拒絶抗原前駆体メラン−Ａの発現を測定する方法であって、前記サンプルを、ヌクレオチドからなる少なくとも１つのプローブに接触させる工程を有し、前記少なくとも１つのプローブが、メラン−Ａをコードするヌクレオチド配列と混成し、更に、そのハイブリダイゼーションを、前記サンプル中におけるメラン−Ａの発現として判定する方法。２５．ポリメラーゼ連鎖反応を有する請求項２４の方法。２６．請求項２４の方法であって、前記少なくとも１つのプローブは、配列認識番号１０と配列認識番号１１とを有する。２７．前記サンプルを、配列認識番号１０と配列認識番号１１とに接触させる請求項２５の方法。２８．配列認識番号１０と配列認識番号１１とからなるグループから選択された単離核酸分子。２９．請求項２の核酸分子によってコードされる単離腫瘍拒絶抗原前駆体。