JP2002509859A

JP2002509859A - Ｈｌａ−ａ２９分子に結合する単離ポリペプチド、それらをコードする分子である核酸、およびそれらの使用

Info

Publication number: JP2002509859A
Application number: JP2000528586A
Authority: JP
Inventors: ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; ファン・デン・エインデ，ベノイト; デバッカー，オリヴィエール; ブーン‐ファラー，ティエリー
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2002-04-02
Also published as: CN1291992A; KR20010024877A; AU2318999A; WO1999037665A1; EP1047707A1; ZA99445B; CA2317492A1

Abstract

(57)【要約】ＨＬＡ−Ａ２９分子に結合するペプチドが開示される。これらの分子は、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５によって規定されるモチーフを満足する。本発明のペプチドをコードするミニ遺伝子およびそれらの使用も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、１９９３年７月２２日出願の出願番号第０８／０９６，０３９号の
一部継続出願である、１９９４年５月２７日出願の係属特許出願番号第０８／２
５０，１６２号の一部継続出願である、１９９５年１月１０日出願の係属出願番
号第０８／３７０，６４８号の一部継続出願である、１９９５年９月２１日出願
の出願番号第０８／５３１，６６２号の一部継続出願である。これらの出願すべ
てを、参考文献として本出願にその内容を合体させる。

【０００２】発明の分野本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする、核酸分子に関する。より具体的
には、本発明は、その腫瘍拒絶抗原前駆体が、とりわけ、ＨＬＡ−Ｃｗ６分子に
よって提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされる遺伝子
に関する。問題となる遺伝子は他の既知の腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列とは関
連していないようである。本発明はまた、ＨＬＡ−Ｃｗ６分子によって提示され
るペプチドおよびそれらの利用方法にも関する。ＨＬＡ−Ａ２９分子によって提
示されるペプチドおよびそれらの利用方法も、本発明の一部である。

【０００３】背景および従来技術哺乳類の免疫系が外来のまたは異質の物質を認識して、それらと反応するプロ
セスは複雑なものである。このシステムの重要な局面は、Ｔリンパ球、即ち“Ｔ
細胞”応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“ＨＬＡ”）、ま
たは、主要組織適合遺伝子複合体（“ＭＨＣ”）と称される細胞表面分子と、ペ
プチドとからなる複合体を認識し、その複合体と相互作用することを必要とする
。前記ペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセシングさ
れるより大きな分子に由来する。この点に関しては、メール（Male）他, Advanc ed Immunology (J.P. Lipincott Company, 1987),特にその６−１０章を参照。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体の相互作用は制限されたものである。即ち、Ｈ
ＬＡ分子とペプチドとの特定の組み合わせに対して特異的なＴ細胞が必要とされ
る。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在
していてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在していても、それに
特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、異物に
対する免疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対する応答に関与してい
る。タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドへとプロセシングされるメカニズムに関し
て多くの研究がなされてきている。この事については、バリナガ（Barinaga）,
Science 257: 880 (1992); フリーモント（Fremont）他, Science 257: 919 (19
92); マツムラ（Matsumura）他, Science 257: 927 (1992); ラトロン（Latron ）他, Science 257: 964 (1992)を参照。エンゲルハルト（Engelhard）, Ann. R
ev. Immunol. 12: 181-207(1994)も参照。

【０００４】Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関係している。たとえば、１
９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公表で、参考文献として本出
願にその内容を合体させるＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、一つ
の遺伝子ファミリーが開示されており、それらはプロセシングされてペプチドと
なり、次に細胞表面に発現され、特異的なＣＴＬ細胞溶解性Ｔリンパ球、即ち、
以後“ＣＴＬ”と称されるものによって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができ
る。これら遺伝子は、“腫瘍拒絶抗原前駆体”即ち “ＴＲＡＰ”分子をコードするものであると言われ、これら分子に由来するペプチドは、“腫瘍拒絶抗原”
即ち“ＴＲＡ”と称される。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴァ
ーサリ（Traversari）他, Immunogenetics 35: 145 (1992); ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）他, Science 254: 1643 (1991)を参照。又、現在米国特許第５，３４２，７７４号となっている、１９９１年１２月１２日出願の
米国特許出願第８０７，０４３号も参照。

【０００５】その開示内容を本出願に参考文献として合体させる、現在米国特許第５，４０
５，９４０号となっている、米国特許出願第９３８，３３４号において、プロセ
シングされてＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドになる腫瘍拒絶
抗原前駆体をコードするＭＡＧＥ−１遺伝子が説明されている。前記参考文献は
、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれば、ある特定の
ペプチドは一つのＨＬＡ分子に対して結合するが、他のＨＬＡ分子に対しては結
合しないであろうと推測される、ということを教示している。これは重要なこと
である。なぜなら、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するからである。その
ため、ある特定のペプチドが、ある特定のＨＬＡ分子に対するパートナーである
と同定されたことが、診断上および治療上の効果を有しているとしても、その効
果はその特定のＨＬＡ表現型を有する個体に対してしか適切ではないのである。
細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られるものではないため、また、標的
化療法(targeted therapy) には、問題の異常細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、この分野において更なる研究を行う必要がある。

【０００６】参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年１月２２日出願の
米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現産物がプロセシングさ
れて第２のＴＲＡになるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡはＨＬ
Ａ−Ｃクローン１０分子によって提示される。この開示は所与のＴＲＡＰから複
数のＴＲＡが生じることができるということを示している。

【０００７】参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９２年１２月２２日出願
の米国特許出願第９９４，９２８号は、いくらかの正常細胞（例えば、メラノサ
イト）によって産生される分子である、チロシナーゼが、腫瘍細胞中でプロセシ
ングされてＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるペプチドを生じるということを
教示している。

【０００８】参考文献として本出願にその内容全体を合体させる、１９９３年３月１８日出
願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼ由来ではない、
第２のＴＲＡがＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるということが教示されてい
る。このＴＲＡはＴＲＡＰ由来であるが、非−ＭＡＧＥ遺伝子によってコードさ
れている。この開示はある特定のＨＬＡ分子が異なるソースに由来するＴＲＡを
提示することができるということを示している。

【０００９】参考文献として本出願にその内容を合体させる、１９９３年６月１７日出願の
米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、関連のない腫瘍拒絶抗原前駆体で
ある、いわゆる、“ＢＡＧＥ”前駆体が記載されている。ＢＡＧＥ前駆体はＭＡ
ＧＥファミリーとは関連していない。

【００１０】先に引用した論文、特許、および特許出願に示されている研究は、大部分は、
ＭＡＧＥファミリーの遺伝子、および（それとは）関連のないＢＡＧＥ遺伝子に
ついて扱っている。しかし、さらに別の腫瘍拒絶抗原前駆体が細胞によって発現
されるということは、判っていなかった。これらの腫瘍拒絶抗原前駆体は“ＧＡ
ＧＥ” 腫瘍拒絶抗原前駆体と称される。これらはＭＡＧＥファミリーの遺伝子ともＢＡＧＥ遺伝子ともホモロジーを示さない。したがって、本発明は、そのよ
うなＴＲＡＰをコードする遺伝子、腫瘍拒絶抗原前駆体自体およびそれら両方の
適用に関する。

【００１１】したがって、本発明のもう一つの特徴は概して９から１６アミノ酸長であって
、以下の配列：ＸａａＴｒｐＰｒｏＸａａＸａａＸａａＸａａＴｙｒ（配列番号２３）を含むペプチドである。ここで、Ｘａａはいずれのアミノ酸であってもよく、そ
してＸａａ_(1,2)は、１または２のアミノ酸がＴｒｐ残基のＮ−末端側にあってもよいということを意味する。これらのペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２９分子に結合
する。および／またはＨＬＡ−Ａ２９分子に結合するペプチドへとプロセシング
される。

【００１２】本発明を、以下の開示においてさらに詳細に説明する。

【００１３】好適実施例の詳細な説明例１メラノーマ細胞系、ＭＺ２−ＭＥＬを、標準方法を用いて患者ＭＺ２から採取
したメラノーマ細胞から確立した。この細胞系は、例えば、１９９２年５月２２
日出願、１９９２年１１月２６日公表で参考文献として本出願にその内容全体を
合体させる、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４号において記載されてい
る。細胞系が確立したら、それを非−増殖性にするために、そのサンプルを照射
した。これらの照射された細胞を、次にそれらに対して特異的な細胞溶解性Ｔ細
胞クローン（“ＣＴＬ”）を単離するために使用した。

【００１４】患者ＭＺ２から採取した末梢血単核細胞（“ＰＢＭＣ”）のサンプルを、照射
されたメラノーマ細胞に接触させた。混合物をメラノーマ細胞の溶解について観
察した。メラノーマ細胞の溶解は、メラノーマ細胞によって提示される、ペプチ
ドとＨＬＡ分子とからなる複合体に対して特異的なＣＴＬがサンプル中に存在し
ていることを示すものであった。

【００１５】使用した溶解アッセイは、参考文献として本出願にその開示内容を合体させる
、ヘリン（Herin）他, Int. J. Cancer 39: 390-396 (1987) に従ったクロム放出試験（クロム放出アッセイ）であった。しかし、このアッセイについて本明細
書において記載する。標的メラノーマ細胞をインビトロで培養し、そして１０ｍ
ＭＨＥＰＥＳと３０％ＦＣＳを追加したＤＭＥＭ中に、１０⁷細胞／ｍｌにて再懸濁し、そして、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄とともに３７℃ で４５分間インキュベートした。標識された細胞を、１０ｍＭＨｅｐｅｓを追
加したＤＭＥＭで３回洗浄した。これらを次に、１０ｍＭＨｅｐｅｓと１０％
ＦＣＳを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁し、その後、１０³細胞を含む１００ｕｌのアリコットを、９６ウェルのマイクロプレートに分配した。１００ｕｌの同
じ培地中においてＰＢＬのサンプルを加え、アッセイを二連で(in duplicate)行
った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離し、８％ＣＯ₂雰囲気中にて３７ ℃で４時間インキュベートした。

【００１６】プレートを再び遠心分離し、上清の１００ｕｌのアリコットを収集し、そして
カウントした。⁵¹Ｃｒ放出の百分率を下記式に従って算出した。％ ⁵¹Ｃｒ放出＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）ｘ１００ここでＥＲは観察された実験的な⁵¹Ｃｒ放出であり、ＳＲは２００ｕｌの培地の
みの中で１０³の標識された細胞をインキュベートすることによって測定された自発的な放出であり、そしてＭＲは標的細胞に１００ｕｌの０．３％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を加えることによって得られた最大放出である。

【００１７】高いＣＴＬ活性を示した単核血液サンプルを拡張(expand)し、そして限界希釈
法によってクローン化し、そして同じ方法を用いて再びスクリーニングした。こ
のようにしてＣＴＬクローンＭＺ２−ＣＴＬ７６／６が単離された。このクロー
ンを以後“７６／６”と称する。

【００１８】同じ方法を用いて、標的Ｋ５６２細胞およびメラノーマ細胞系についてテスト
した。図１は、このＣＴＬクローンがメラノーマ細胞系、即ちＭＺ２−ＭＥＬを
認識して溶解するが、Ｋ５６２は溶解しないということを示している。このクロ
ーンを次に、その他のメラノーマ細胞系および自己ＥＢＶ−トランスフォームＢ
細胞に対して、前記したものと同じ方法でテストした。図１は、エプスタイン- バーウイルス（“ＥＢＶ”）によってトランスフォームされた自己Ｂ細胞は溶解
されなかったこと、および、ＭＺ２−ＭＥＬ３．０はＣＴＬクローン７６／６に
よって溶解されたのに対し、抗原Ｆを発現しない変異体である、細胞系ＭＺ２−
ＭＥＬ．４Ｆは溶解されなかったことを示している。したがって、このクローン
はこの抗原に対して特異的であると思われる。

【００１９】前に示した結果からは、どのＨＬＡ分子がＴＲＡを提示しているのかというこ
とについて結論がでない。溶解された細胞系、即ちＭＺ２−ＭＥＬは、ＨＬＡ−
Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｃｗ６およ
びＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現することが知られている。本明細書では報告し
ないがこの例のプロトコールにしたがった実験において、ＨＬＡ分子Ａ２９、Ｂ
４４およびＣクローン１０の発現を失った、ＭＺ２−ＭＥＬの亜系統（サブライ
ン）についてテストした。この亜系統は溶解されたので、このことは、提示分子
がＡ１、Ｂ３７またはＣｗ６のいずれかであるはずであるということを示してい
る。

【００２０】例２７６／６が標的細胞と接触した際に腫瘍壊死因子（“ＴＮＦ”）も産生するか
を判定するために、さらなる研究を行った。用いた方法は、参考文献として本出
願にその開示内容を合体させる、トラヴァーサリ（Traversari）他, Immunogene
tics 35: 145-152 (1992) によって記載されたものであった。簡単に説明すると
、ＣＴＬ系統（ライン）のサンプルを、培地中で問題の標的細胞のサンプルと混
合した(combined)。２４時間後、培養からの上清を取り出し、そしてＴＮＦ−感
受性ＷＥＨＩ細胞に対してテストした。前述の、そして引用文献に記載のＭＺ２
−ＭＥＬ細胞系のサブクローンである、細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は非常に強
い応答を与え、そして以下の諸実験において使用した。

【００２１】例３例２からの結果は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３が問題の標的抗原を提示するという
ことを示していた。したがって、それをｃＤＮＡライブラリーを調製するための
トータルｍＲＮＡのソースとして用いた。

【００２２】細胞系からトータルＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは周知の技術にしたがって、
オリゴ−ｄＴ結合キットを用いて単離した。ｍＲＮＡを確保すると、それをＮｏ
ｔＩ部位を含むオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写によって、ｃＤＮＡへと転
写し、その後第二鎖（セカンドストランド）合成を行った。ｃＤＮＡを次にＢｓ
ｔＸＩアダプターに結合し、ＮｏｔＩで消化し、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−５０
０ＨＲカラムによってサイズ分画し、そしてｐｃＤＮＡＩ／ＡｍｐのＢｓｔＸ
ＩおよびＮｏｔＩ部位に、無方向性に(undirectionally)クローニングした。組換えプラスミドを次にＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌にエレクトロポレー
ションした。全部で、１００の組換え細菌の１５００のプールをマイクロウェル
に播いた。ほとんど全ての細菌がインサートを含んでいたので、それぞれが約１
００のｃＤＮＡを含んでいた。

【００２３】各プールを飽和するまで増幅し、そしてプラスミドＤＮＡをアルカリ法(alkal
ine lysis)および酢酸カリウム沈殿によって抽出した。フェノール抽出は行わな
かった。

【００２４】例４例３に記載したライブラリーの調製の後、ｃＤＮＡを真核細胞にトランスフェ
クトした。本明細書に記載するトランスフェクションは二連で(in duplicate)行
った。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％ウシ胎児血清を追加したダルベッ
コ修飾イーグル培地(Dulbecco's modified Eagles Medium)（“ＤＭＥＭ”）中において、１５，０００細胞／ウェルの割合で組織培養平底マイクロウェルに播
いた。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、培地を除去し、そして１０％Ｎ
ｕ血清、４００μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン、および１００μＭクロ
ロキン、それに加えて１００ｎｇのプラスミドを含む、５０μｌ／ウェルのＤＭ
ＥＭ培地に置換した。前に示したように、溶解研究ではどのＨＬＡ分子が抗原を
提示するのか確証されなかった。その結果、抗原を提示する可能性のあるＨＬＡ
分子（Ａ１、Ｂ３７、Ｃｗ６）のそれぞれについてのｃＤＮＡを用いて、別々に
細胞を共トランスフェクト(cotransfect)した。具体的には、２８ｎｇのｐＣＤ −ＳＲαにクローニングされたＨＬＡ−Ａ１をコードする遺伝子、５０ｎｇのｐ
ｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ中のＨＬＡ−Ｂ３７に対するｃＤＮＡ、または７５ｎｇのｐ
ｃＤＮＡＩ−Ａｍｐ中のＨＬＡ−Ｃｗ６に対するｃＤＮＡ、のいずれか１つにつ
いて、ライブラリーでのトランスフェクションに用いたものと同じプロトコール
を使用した。

【００２５】トランスフェクションは二連の(in duplicate)ウェルで行ったが、５００プー
ルのＨＬＡ−Ｃｗ６トランスフェクタントだけは、単一のウェルでしかテストで
きなかった。３７℃で４時間のインキュベーションの後、培地を除去し、１０％
ＤＭＳＯを含む５０μｌのＰＢＳで置換した。この培地を２分間後に除去し、
そして１０％ＦＣＳを追加した２００μｌのＤＭＥＭで置換した。

【００２６】この培地の変更の後、ＣＯＳ細胞を３７℃で２４−４８時間インキュベートし
た。そして培地を捨て、１００μｌの１０％プール(pooled)ヒト血清を含み、
２０−３０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２を追加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ培地中にて、１０００−３０００細胞のＣＴＬクローン７６／６を加えた。上清を２４時間
後に取り出し、そして参考文献として本出願にその開示内容を合体させる、トラ
ヴァーサリ（Traversari）他, Immunogenetics 35: 145-152 (1992)によって記載されているように、ＷＥＨＩ細胞に対するアッセイにおいてＴＮＦ含量を測定
した。

【００２７】ＨＬＡ−Ａ１でトランスフェクトされた１５００プール、およびＨＬＡ−Ｂ３
７でトランスフェクトされた１５００プールは、それぞれ、１５−２０ｐｇ／ｍ
ｌ、または２−６ｐｇ／ｍｌの濃度までＴＮＦ放出を刺激した。ＨＬＡ−Ｃｗ６
トランスフェクタントのほとんどは３−２０ｐｇ／ｍｌ産生したが、１つのプー
ルでは６０ｐｇ／ｍｌ以上産生した。このプールをさらなる研究のために選択し
た。

【００２８】例５選択されたプールの細菌をクローン化し、そして６００のクローンについてテ
ストした。それらからプラスミドＤＮＡを抽出し、前に記載したものと同じ方法
にて新しいサンプルのＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。そして細胞を再びＣ
ＴＬクローン７６／６の刺激についてテストした。９４の陽性クローンが見つか
った。これらのうちの１つをｃＤＮＡクローン２Ｄ６と称し、更にテストした。
比較テストにおいてＣＯＳ細胞を、ｃＤＮＡクローン２Ｄ６とＨＬＡ−Ｃｗ６
ｃＤＮＡ、ＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡのみ、またはｃＤＮＡ２Ｄ６のみでトラ
ンスフェクトした。コントロール細胞系ＭＺ２−ＭＥＬＦおよびＭＺ２−ＭＥ
ＬＦ⁺も用いた。ＣＴＬ上清へのＴＮＦ放出を、前述のように、ＷＥＨＩ細胞に対してそれをテストすることによって測定した。生存する（残存する）ＷＥＨ
Ｉ細胞の数を、ＭＴＴとの細胞のインキュベーション後に吸光度によって測定し
た。図２は、ＨＬＡ−Ｃｗ６とｃＤＮＡ−２Ｄ６とでトランスフェクトされたＣ
ＯＳ細胞、および細胞系ＭＺ２−ＭＥＬＦ⁺が、ＣＴＬクローン７６／６からのＴＮＦ放出を刺激したことを示し、このことによってＨＬＡ−Ｃｗ６が対象Ｔ
ＲＡを提示するということが示される。

【００２９】例６ｃＤＮＡ２Ｄ６を当業者に周知の技術にしたがって配列決定した。シークエ
ンスサーチによって、プラスミドインサートは既知の遺伝子またはタンパク質と
ホモロジーを示さないということが明らかになった。配列番号１に、以後“ＧＡ
ＧＥ”と称する、同定された遺伝子についてのｃＤＮＡヌクレオチド情報を示す
。推定上のオープンリーディングフレームはこの分子の塩基５１−４６７に位置
する。この配列の最初の２塩基はｃＤＮＡ配列を保有するベクターからのもので
あり、したがってこれらはｃＤＮＡ自体の部分ではない。

【００３０】例７例６によるｃＤＮＡの配列決定の後、正常組織の細胞がこの遺伝子を発現して
いるかを判定するための実験を行った。これを判定するために、以下に示すよう
に、組織および腫瘍細胞系に対してノーザンブロッティングを行った。ブロッテ
ィング実験には配列番号１の完全な配列についてのｃＤＮＡを使用した。次にＰ
ＣＴを用いてこの結果を確認した。

【００３１】

【表１】

【００３２】例８ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）および前述のＧＡＧＥ遺伝子情報を適用
することによって正常組織と腫瘍の詳細な分析を行った。

【００３３】まず、個々のサンプルから当業者に周知の技術を用いてトータルＲＮＡを得た
。これを用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡを作るために用いたプロトコール
は、４ｕｌの逆転写酵素緩衝液５ｘ、１ｕｌの各ｄＮＴＰ、（１０ｍＭ）、２ｕ
ｌのジチオスレイトール（１００ｍＭ）、２ｕｌのｄＴ−１５プライマー（２０
ｕｍ）、０．５ｕｌのＲＮａｓｉｎ（４０ユニット／ｕｌ）、および１ｕｌのＭ
ｏＭＬＶ逆転写酵素（２００ユニット／ｕｌ）を混合することを含むものであっ
た。次に、６．５ｕｌのテンプレートＲＮＡ（１ｕｇ／３．２５ｕｌ水、即ち２
ｕｇのトータルテンプレートＲＮＡ）を加えた。混合物の全容積は２０ｕｌであ
った。これを混合し、４２℃で６０分間インキュベートし、その後それを氷上で
冷却した。つぎに全部で８０ｕｌの水を加え、全部で１００ｕｌとした。この混
合物をＰＣＲにおいて用いるまで、−２０℃で保管した。

【００３４】ＰＣＲを行うために、プライマー、５’―ＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＧＣＣＴ―３’ （センス）および５’―ＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡ―３’ （アンチセンス）それぞれ、配列番号２および３、を用いた。試薬は、３０．５ｕｌの水、５ｕｌ
のＰＣＲ緩衝液１０ｘ、１ｕｌの各ｄＮＴＰ（１０ｕＭ）、２．５ｕｌの各プラ
イマー（２０ｕＭ）、および０．５ｕｌの重合酵素Ｄｙｎａｚｙｍｅ（２ユニッ
ト／ｕｌ）を含むものであった。全容積は４５ｕｌであった。全部で５ｕｌのｃ
ＤＮＡを加えた（これは１００ｎｇのトータルＲＮＡに相当する）。混合物を混
合し、一滴のミネラルオイルを層にして置いた。混合物をサーモサイクラー (th
ermocycler) ブロックに移し、９４℃に予熱し、そして増幅を３０サイクル行っ
た。各サイクルは下記のものからなる：最初の変性：９４℃、４分変性：９４℃、１分アニーリング：５５℃、２分伸張：７２℃、３分最終的な伸張：７２℃、１５分サイクリングの後、１０ｕｌのアリコットを１．５％アガロースゲルで泳動し、
臭化エチジウムで染色した。

【００３５】前に示したプライマーを用いて増幅されたｃＤＮＡから、２３８塩基対のフラ
グメントが得られた。もしあったとしても、混入するゲノムＤＮＡは増幅されな
い。

【００３６】結果を以下の表２において示す。これらは、ＧＡＧＥを発現する正常組織は精
巣のみであるのに対し、メラノーマ、肺、乳房、喉頭、咽頭、肉腫、睾丸セミノ
ーマ、膀胱および大腸を含む多くの腫瘍はこの遺伝子を発現するということを確
認するものである。したがって、これら腫瘍のいずれもＧＡＧＥ遺伝子の発現に
ついてアッセイすることができる。

【００３７】

【表２】

【００３８】例９前の諸例において言及した核酸分子が同定されたことから、ＨＬＡ−Ｃｗ６分
子によって提示され、ＧＡＧＥ遺伝子に由来する腫瘍拒絶抗原を決定するための
さらなる研究が導かれた。

【００３９】発現ベクターｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ中におけるＧＡＧＥの完全なｃＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＮｏｔＩおよびＳｐＨＩで消化し、そして次に製造業者(Era
se-a-base System, Promega)の指示に従って、エキソヌクレアーゼIIIで消化した。この処理により、３’末端から始まる、一連の進行性の欠失 (progressive
deletion)が生じた。

【００４０】欠失(deletion)産物をｐｃＤＮＡＩ／ＡＭＰに結合し、そして周知の技術を用
いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５α’ＩＱにエレクトロポレーションした
。形質転換体をアンピシリン（５０マイクログラム／ｍｌ）で選抜した。

【００４１】プラスミドＤＮＡをそれぞれの組換えクローンから抽出し、そしてＨＬＡ−Ｃ
ｗ６をコードするベクターとともにＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。使
用したプロトコールは前述のプロトコールに従うものである。

【００４２】トランスフェクタントを次にＴＮＦ放出試験においてテストした。これは陽性
クローンと陰性クローンの分離を可能にするものであった。すべての陰性クロー
ンは、完全なＧＡＧＥ配列における欠失を示した。最も小さい陽性クローンは、
配列番号１の最初の１７０ヌクレオチドを含むものであった。前述のこの配列の
分析では、オープンリーディングフレームはヌクレオチド５１から開始するとい
うことが述べられている。したがって、このフラグメントは、ＧＡＧＥＴＲＡ
Ｐの最初の４０アミノ酸をコードする配列を含むものである。

【００４３】例１０ＴＲＡペプチドをコードする領域をより正確に限定するためにさらなる実験を
行った。これを行うためにポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）増幅を用いた。

【００４４】２つのプライマーを合成した。第１のプライマーは、ＢａｍＨＩ部位の上流に
位置するプラスミドベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ中の配列に対して相補的な２
２−マー(mer)であった。第２のプライマーは、３’末端に配列番号１のヌクレオチド１０２−１１９を含み、５’末端にＸｂａＩ制限部位を含む１１ヌクレオ
チドの延長を含む、２９−マーであった。

【００４５】増幅の後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｂａＩによって消化し、そしてプラス
ミドｐｃＤＮＡ−３のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位にクローニングした。組換えコ
ロニーを、例４の記載にしたがって、ＨＬＡ−Ｃｗ６をコードするｃＤＮＡとと
もにＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクト(cotransfect)し、そしてまた前述のように、ＣＴＬ７６／６を用いてＴＮＦ放出試験を行った。

【００４６】ＴＮＦ放出が観察され、これは“ミニ遺伝子”がプロセシングされてＴＲＡと
なるということを示すものであった。このミニ遺伝子、即ち配列番号１のヌクレ
オチド１−１１９は、そのコード領域がヌクレオチド５１−１１９にわたってお
り、配列番号１のｃＤＮＡの最初の２３アミノ酸をコードするものであった。こ
の情報は、次のセットの実験のための基礎として役立った。

【００４７】例１１配列番号１の最初の２３アミノ酸に基づいて、２つのペプチドを合成した。そ
れらは：ＭｅｔＳｅｒＴｒｐＡｒｇＧｌｙＡｒｇＳｅｒＴｈｒＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇ（配列番号１２）およびＴｈｒＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＶａｌＧｌｕＰｒｏＰｒｏＧｌｕＭｅｔＩｌｅ（配列番号１３）であった。それぞれのペプチドを以前にＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡでトランスフ
ェクトされているＣＯＳ−７細胞にパルスし (pulsed)、そしてＣＴＬ７６／６と混合してＴＮＦ放出が誘発されるかどうか判定した。ペプチド（２０ｕｇ／ｍ
ｌ）を２４時間前にＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ
−７細胞に加えた。３７℃で９０分間のインキュベーションの後、培地を捨て、
そして３０００のＣＴＬを、２５ユニット／ｍｌのＩＬ−２を含む、１００マイ
クロリットルの培地中で加えた。１８時間後、上清のＴＮＦ含量を、ＷＥＨＩ−
１６４−１３細胞に対する毒性を測定することによってテストした。第２のペプ
チド（配列番号１３）は、３０ｐｇ／ｍｌ以上のＴＮＦを誘発することが判明し
たのに対し、第１のペプチド（配列番号１２）は、１０ｐｇ／ｍｌ以下のＴＮＦ
を誘発することが判明した。第２のペプチドをさらなる実験のために使用した。

【００４８】例１２配列番号１３に基づく種々のペプチドを合成し、テストした。これらのうちい
くつかを以下に示す。これらのテストを行うためにＨＬＡ−Ｃｗ６陽性の、⁵¹Ｃ
ｒ標識したＬＢ３３−ＥＢＶ細胞を以下のペプチドのいずれかとともにインキュ
ベートした：ＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号４）ＴｈｒＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号５）ＴｈｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＶａｌ（配列番号６）ＴｈｒＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＶａｌ（配列番号７）ＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＶａｌＧｌｕ（配列番号８）ＭｅｔＳｅｒＴｒｐＡｒｇＧｌｙＡｒｇＳｅｒＴｈｒＴｙｒＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇ（配列番号１２）図３に示すようにペプチド濃度を変化させ、そしてＣＴＬ：ＬＢ３３−ＥＢＶの
比（“エフェクター：標的比”）を１０：１とした。３７℃で４時間のインキュ
ベーションの後、⁵¹Ｃｒ放出を測定した。ポジティブ（“Ｆ⁺”、ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１）およびネガティブ（“Ｆ”；ＭＺ２−ＭＥＬ．２．２．５）コント
ロール細胞についての溶解のレベルを、図３において示す。

【００４９】非常に驚いたことに、配列番号４の八量体（オクタマー）が最良のペプチドで
あることが判明し、これは腫瘍拒絶抗原であると思われる。八量体がヒトのＭＨ
Ｃ分子による提示に関与していると報告されたのはこれが初めてである。Ｈ−２
Ｋ^bおよびＨ−２Ｋ^K分子について１９９において前出のエンゲルハルト（Engelh
ard）によって報告されているように、マウスの系についてはいくらかの前例がある。配列番号５および配列番号６の九量体（ノナマー）も、配列番号４の八量
体より程度の低いものではあったが、ＣＴＬ溶解を誘発した。

【００５０】ここでは報告しない結果において、第２のＣＴＬをテストした（ＣＴＬ８２／
３１）。このＣＴＬはＭＺ２−Ｆを提示する細胞を溶解することが知られている
ものであった。それはまた、配列番号４のペプチドでパルスした(pulsing)後に、ＨＬＡ−Ｃｗ６陽性細胞を溶解した。

【００５１】例１３前述のＧＡＧＥＤＮＡが唯一のものであるかどうかを調べるために、ＭＺ２
−ＭＥＬ．４３からのＲＮＡで作ったｃＤＮＡライブラリー（ＧＡＧＥのクロー
ニングに使用したものと同じライブラリー）を、ＧＡＧＥｃＤＮＡに由来する
プローブとハイブリダイズさせた。プローブは、配列番号１の位置２０および３
２８の間の３０８塩基対のＰＣＲフラグメントであった。２０の陽性のｃＤＮＡ
が得られた。それらのうち６つを完全に配列決定した。これらはすべてＧＡＧＥ
配列と高度に関連するものであったが、これらはＧＡＧＥ配列とはわずかに異な
るものであった。６つのクローンのうち、２つは互いに同一であったが、他のす
べては互いに異なっていた。したがって、ＧＡＧＥと異なるが高度に関連してい
る、５つの新しい配列が同定された。これらをＧＡＧＥ−２、３、４、５および
６（図４）と称し、それぞれ配列番号１４−１８に示す。１４の他のクローンに
ついては５’末端を部分的に配列決定したことろ、それらの配列は６つのＧＡＧ
ＥｃＤＮＡのいずれかと一致するものであった。

【００５２】これらのｃＤＮＡとＧＡＧＥ−１との間の主な相違は、配列番号１のＧＡＧＥ
配列の位置３７９から５２１に位置する１４３塩基の広がりがないことである。
残りの配列は１９の異なる位置においてミスマッチを示すのみであるが、ＧＡＧ
Ｅ−３は例外であり、その５’末端が最初の１１２塩基についてその他のＧＡＧ
Ｅと全く異なっている。ＧＡＧＥ−３ｃＤＮＡのこの領域は、長い反復および
ヘアピン構造を含んでいる。

【００５３】腫瘍拒絶抗原前駆体に対応する推定ＧＡＧＥ−１タンパク質は、他の５つのタ
ンパク質よりも約２０アミノ酸長く、他の５つのタンパク質の最後の７つの残基
も、ＧＡＧＥ−１の相同的な残基と異なっている（図５）。残りのタンパク質配
列は１０のミスマッチを示すのみである。それらのうち１つは配列番号４の抗原
ペプチドに対応する領域にある。ペプチドの配列はＧＡＧＥ−３、４、５および
６において変更されており、位置２がＲではなくＷとなっている。

【００５４】例１４位置２における変更がペプチドの抗原性に影響するかどうかを評価するために
、６つのＧＡＧＥｃＤＮＡのｃＤＮＡを、ＨＬＡ−Ｃｗ６のｃＤＮＡとともに
、個々にＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクタントを前述のよう
にＣＴＬ７６／６による認識についてテストした。ＧＡＧＥ−１およびＧＡＧＥ
−２をトランスフェクトされた細胞のみが認識され、この実験に関しては、ＧＡ
ＧＥ−３、４、５および６によってコードされる変更されたペプチドは抗原性で
はなかったということが示された。前述の１４のその他のクローンの５’末端の
配列分析によって、それらのうち７つが抗原ペプチドをコードする配列を含み、
したがって、おそらくＧＡＧＥ−１またはＧＡＧＥ−２のいずれかに相当すると
いうことが示された。

【００５５】例１５腫瘍サンプルにおけるＧＡＧＥの発現をテストするために、前に使用したＰＣ
Ｒプライマーは、ＧＡＧＥ−１または２と、抗原ＭＺ２Ｆをコードしないその他
の４つのＧＡＧＥｃＤＮＡとを識別しないものである。ＧＡＧＥ−１および２
を特異的に増幅し、ＧＡＧＥ−３、４、５および６を増幅しない新しいセットの
プライマーを作成した。それらのプライマーは以下のものである：ＶＤＥ４４５’―ＧＡＣＣＡＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＧ―３’ （配列番号９）ＶＤＥ２４５’―ＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡ―３’ （配列番号１０）これらのプライマーを、ポリメラーゼ酵素を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応において、
前述のようにして使用した。温度条件は以下のものである：９４℃で４０分３０サイクルを、９４℃で１分５６℃で２分７２℃で３分７２℃で１５分この分析の結果を表３において示す。

【００５６】

【表３】 ^*ＧＡＧＥの発現を、すべてのＧＡＧＥ遺伝子を検出するプライマー、ＶＤＥ− １８およびＶＤＥ−２４を用いた、トータルＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによっ
てテストした。これらのプライマーをＭＺ２−ＭＥＬからのＤＮＡに対してアッ
セイした場合、ＰＣＲ産物は観察されなかった。^** ＧＡＧＥ−１および２の発現を、４つのその他のＧＡＧＥ遺伝子からＧＡＧＥ
−１および２を識別するプライマー、ＶＤＥ−４４およびＶＤＥ−２４を用いた
、トータルＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲによってテストした。これらのプライマ
ーをＭＺ２−ＭＥＬからのＤＮＡに対してアッセイした場合、ＰＣＲ産物は観察
されなかった。

【００５７】さらなる研究において、すべてのＧＡＧＥ遺伝子を増幅する新しいプライマー
をデザインした。これは、正常組織においてそれらのいずれも発現しないという
ことを確かめるために行った。これらのプライマーは、以下の通りＶＤＥ４３５’―ＧＣＧＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡ―３’ （配列番号１１）ＶＤＥ２４５’―ＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡ―３’ （配列番号１０）これらはＶＤＥ４４およびＶＤＥ２４プライマーを用いたＰＣＲと全く同じよう
にして使用した。結果を表４において示す。これらは、正常組織は精巣を例外と
して陰性であることを確認するものである。

【００５８】

【表４】 ^*ＧＡＧＥの発現を、すべてのＧＡＧＥ遺伝子を検出するプライマー、ＶＤＥ４３およびＶＤＥ２４を用いた、トータルＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ増幅によっ
てテストした（図７）。ＰＣＲ産物の非存在を−によって示し、存在を＋によっ
て示す。これらのプライマーを、ＭＺ２−ＭＥＬからのＤＮＡに対してアッセイ
した場合、ＰＣＲ産物は観察されなかった。^* 胎児組織は２０週以上の胎児に由来する。

【００５９】例１６ここでは報告しない研究において、細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ２２／２
３（参考文献として本出願にその内容を合体させる、ファン・デン・エインデ（
Van den Eynde）他, Int. J. Cancer 44: 634-640 (1989) ）は、メラノーマ細胞ＭＺ２−ＭＥＬ．３．１を認識しないということが確かめられている。このメ
ラノーマ細胞系は、ファン・デア・ブルッゲン（Van der Bruggen）他, Eur. J.
Immunol. 24: 2134-2140 (1994) によって、ＭＨＣ分子、ＨＬＡ−Ａ２９、ＨＬＡ−Ｂ２４およびＨＬＡ−Ｃｗ^*１６０１の発現を失っているということが報告されている。これらＭＨＣ分子のうちの１つによってトランスフェクションす
ることによって、この（細胞）系をＣＴＬ２２／２３に対して感受性にすること
ができるかどうかを判定するための研究を行った。ＨＬＡ−Ａ２９が最初にテス
トされた分子であった。これを行うために、ポリＡ⁺ＲＮＡをＨＬＡ−Ａ２９⁺細
胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３から、市販の抽出キットを用いて、製造業者の指示に
従って抽出した。ｍＲＮＡを次に標準方法を用いてｃＤＮＡへと変換し、サイズ
分画し、そして、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／ＡｍｐのＢｓｔＸＩおよびＮｏｔ
Ｉ部位に一方向性に挿入した。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５
α５’ＩＱにエレクトロポレーションし、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選
抜した。細菌をニトロセルロースフィルターにプレーティングし、そして複製し
た。フィルターを調製し、６ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／１ｘデンハルト溶液
中で、４０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ここで以下の³²Ｐ標識したプローブ
を用いた：５’―ＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣ―３’ （配列番号１９）このプローブは、ほとんどのＨＬＡ配列の開始コドンを囲む配列である。

【００６０】フィルターを室温で５分間それぞれ６ｘＳＳＣ中で２回洗浄し、そして６ｘＳ
ＳＣ中で４３℃で２回洗浄した。陽性配列を次に、³²Ｐで標識した以下のプロー
ブでスクリーニングした：５’―ＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴ―３’ （配列番号２０）この配列は、参考として本出願にその内容を合体させる、the Kabat Database o
f sequences and proteins of immunological interest を参照して判定すると、ＨＬＡ−Ａ２９に対して特異的なものである。このデータベースはＮＣＢＩ（
ＵＳＡ）において、またはＷｅｂＳｏｌｔｅ（インターネット）WWW. NCBI. N
LM. NIH. GOV.上で利用できる。フィルターを室温でそれぞれ５分間、６ｘＳＳＣで２回洗浄し、その後、６ＸＳＳＣで（洗浄あたり５分間）４２℃で２回洗浄
した。

【００６１】例１７陽性のＨＬＡ−Ａ２９クローンが単離されたので、これらを前述のＤＥＡＥ−
デキストランクロロキン法を用いてＣＯＳ−７にトランスフェクトした。簡単に
説明すると、１．５ｘ１０⁴のＣＯＳ−７細胞を、５０ｎｇのＨＬＡ−Ａ２９を含むプラスミドｐｃＤＮＡ−Ｉ／Ａｍｐ、および、１００ｎｇの前述のＧＡＧＥ
配列のうちの１つまたは従来技術のＭＡＧＥまたはＢＡＧＥ配列のうちの１つに
対するｃＤＮＡを含むそれぞれプラスミドｐｃＤＮＡα−Ｉ／Ａｍｐまたはｐｃ
ＤＳＲ−α中のｃＤＮＡによって、処理した。次にトランスフェクタントを３７
℃で２４時間インキュベートした。

【００６２】トランスフェクタントを次に、それらがＣＴＬによるＴＮＦ産生を刺激する能
力について、前述の例４の終わりにおいて説明したアッセイを用いてテストした
。

【００６３】この研究の結果を示す図７は、トランスフェクタントとしてＧＡＧＥ−３、４
、５または６のいずれかとＨＬＡ−Ａ２９とを用いると高レベルのＴＮＦ産生が
達成されるということを示している。対照的に、ＧＡＧＥ−１およびＧＡＧＥ−
２はＣＴＬクローン２２／２３を刺激しない。したがって、ＧＡＧＥ−３、４、
５および６がプロセシングされて抗原、即ちＨＬＡ−Ａ２９分子によって提示さ
れてＣＴＬ２２／２３によって認識される抗原となる、という結論が導かれる。

【００６４】例１８ＧＡＧＥ−３、４、５および６がプロセシングされてＨＬＡ−Ａ２９＋細胞に
よって提示されるペプチドになったのに対し、ＧＡＧＥ−１およびＧＡＧＥ−２
はならなかったという事実から、ＧＡＧＥ３、４、５および６に共通であって、
ＧＡＧＥ−１およびＧＡＧＥ−２には存在しない配列について、推定アミノ酸配
列を調べることが示唆された。以下の配列が同定された：ＡｒｇＳｅｒＴｈｒＴｙｒＴｙｒＴｒｐＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒＶａｌＧｌｎ（配列番号２１）ペプチドを合成し、凍結乾燥し、そして、１容積のＤＭＳＯ、９容積の水中の１
０ｍＭ酢酸に溶解した。この方法は、以下に記載する、その他の合成されたペ
プチドについても使用した。

【００６５】ペプチド（配列番号２１）を、前述の方法にしたがって、⁵¹Ｃｒ放出実験にお
いてテストした。

【００６６】このペプチドは溶解を引き起こすことが判明した。連続的な欠失（デリーショ
ン）を調製し、そしてそれらが溶解を引き起こす能力について、再び⁵¹Ｃｒ溶解
試験を用いてテストした。この研究を図８に示す。溶解を引き起こす最も短いペ
プチドは、ＴｙｒＴｙｒＴｒｐＰｒｏＡｒｇＰｒｏＡｒｇＡｒｇＴｙｒ（配列番号２２）であることが判明した。これは、ＧＡＧＥ−３から６のすべてに共通のものであ
る。具体的には、ＧＡＧＥ−３のアミノ酸１０−１８、およびＧＡＧＥ−４、５
および６のアミノ酸９−１７がこのペプチドに相当する。

【００６７】図８において示され、例えば配列番号２１および２２によって表されるペプチ
ドファミリーのメンバーは、参考文献として本出願にその内容を合体させる、ト
ゥバート（Toubert）他, "HLA-A29 Peptide Binding Motif", Abstract No. 418
3, Ninth International Congress of Immunology, July 23-29, 1995, San Fra
ncisco, CAによって示されるデータと一致しない。トゥバート（Toubert）他, によると、少なくとも、ＨＬＡ−Ａ２９に結合するすべてのペプチドの第３番目
の位置において、Ｐｈｅ残基が必要とされる。本明細書において示したように、
事実はそうではない。

【００６８】前述の諸例は、腫瘍拒絶抗原前駆体および腫瘍拒絶抗原をコードする核酸分子
の単離を示すものである。しかし、これらの分子は以前に開示された、前述の参
考文献において記載されているＭＡＧＥおよびＢＡＧＥコード配列のいずれとも
相同的ではない。したがって、本発明の１つの側面は、配列番号１−６のいずれ
かに示されるヌクレオチド配列、および、配列番号１のヌクレオチド１−１７０
および５１−１７０などのそれらのフラグメント、または腫瘍拒絶抗原へとプロ
セシングされるその他のフラグメントを含む単離核酸分子である。配列番号１−
６の配列は、ＭＡＧＥコード配列でもＢＡＧＥコード配列でもない。このことは
、これらを、引用された文献において記載されているＭＡＧＥまたはＢＡＧＥ遺
伝子の配列と比較することによって理解されるであろう。非−ＭＡＧＥかつ非−
ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原前駆体をコードするが、配列番号１の記載されたヌクレ
オチド配列を含む核酸分子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
核酸分子も本発明の一部である。本明細書で使用する、“ストリンジェントな条
件”という用語は当業者に周知のパラメーターのことを指すものである。より具
体的には、本明細書で使用する、ストリンジェントな条件とは、１ＭＮａＣｌ
、１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸中での６５℃で１８時間のハ
イブリダイゼーションのことを指す。この後、フィルターを２ｘＳＳＣ中で室温
で５分間、２回洗浄し、さらに２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で３０
分間１回洗浄する。同じまたはより高い程度のストリンジェンシーをもたらす、
使用可能なその他の条件、試薬などがある。そのような条件については当業者で
あれば精通しているであろうから、ここでは記載しない。

【００６９】本発明は、発現ベクター中における配列の使用、および原核生物であろうと（
例えば、大腸菌）あるいは真核生物であろうと（例えば、ＣＨＯまたはＣＯＳ細
胞）、宿主細胞および細胞系をトランスフォームまたはトランスフェクトするた
めの配列の使用も含むということも、諸例から理解されるであろう。発現ベクタ
ーは、適切な配列、即ち前述のような配列が、プロモーターに操作可能に連結し
ていることを必要とする。ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ｃｗ６およびＨＬＡ−Ａ２９
の両方がこれら遺伝子に由来する腫瘍拒絶抗原を提示することが判明したことか
ら、発現ベクターは、ＨＬＡ−Ｃｗ６またはＨＬＡ−Ａ２９のいずれかをコード
する核酸分子も含むものであってもよい。ベクターが両方のコード配列を含むよ
うな状況においては、通常はそのいずれも発現しない細胞をトランスフェクトす
るためにそれを利用することができる。腫瘍拒絶抗原前駆体コード配列は、例え
ば、宿主細胞がすでにＨＬＡ−Ｃｗ６およびＨＬＡ−Ａ２９の一方または両方を
発現しているような場合、単独で使用してもよい。もちろん、利用可能な特定の
宿主細胞に関する制限はない。所望の場合、２つのコード配列を含むベクターを
、ＨＬＡ−Ａ２９またはＨＬＡ−Ｃｗ６提示細胞において使用してもよいし、Ｈ
ＬＡ−Ａ２９またはＨＬＡ−Ｃｗ６を発現しない宿主細胞において、腫瘍拒絶抗
原前駆体に対する遺伝子を使用することもできる。

【００７０】本発明は、当業者が所望の発現ベクターまたはベクターを作成するのを可能に
するような、いわゆる発現キットも含む。そのような発現キットは、少なくとも
前に記載したコード配列のそれぞれの別々の部分を含む。必要とされる前に述べ
た配列が含まれる限り、所望であればその他の成分を加えてもよい。

【００７１】本発明の核酸分子およびＴＲＡＰを、以前に記載されたＭＡＧＥおよびＢＡＧ
Ｅ物質から区別するために、本発明のものをＧＡＧＥファミリーの遺伝子および
ＴＲＡＰと称することにする。したがって、本明細書において“ＧＡＧＥ”とい
う語が用いられる場合、それは、前に記載された配列によってコードされる腫瘍
拒絶抗原前駆体のことを指す。“ＧＡＧＥコード分子”および類似の用語は、核
酸分子自体を記載するために用いられる。

【００７２】本明細書に記載した本発明には、多くの利用法があり、それらのうちいくつか
をここに記載する。まず、本発明は、ＴＲＡＰの発現または腫瘍拒絶抗原の提示
によって特徴づけられる、メラノーマなどの疾患を、当業者が診断することを可
能にする。これらの方法は、ＴＲＡＰ遺伝子の発現、および／またはＨＬＡ−Ｃ
ｗ６またはＨＬＡ−Ａ２９によって提示されるＴＲＡなどのそれらに由来するＴ
ＲＡを判定することを含む。前者の状況においては、そのような判定は、ポリメ
ラーゼ連鎖反応、または標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いてア
ッセイすることを含むあらゆる標準核酸判定アッセイによって行うことができる
。後者の状況においては、抗体などの、ＴＲＡとＨＬＡとからなる複合体に対す
る結合パートナーを用いてアッセイすることが、特に好ましい。それに代わる判
定方法として、前述したタイプのような、ＴＮＦ放出試験（放出アッセイ）があ
る。このアッセイを行うためには精巣細胞が存在していないことを確かめるのが
好ましい。というのは、それらは通常ＧＡＧＥを発現しているからである。しか
し、これは重要なことではない。なぜなら精巣とその他の細胞タイプとは、ルー
チン的に区別されるからである。また、非−精巣サンプルにおいて精巣細胞が存
在するということは、実際的に不可能である。

【００７３】ＴＲＡＰ遺伝子の単離によって、ＴＲＡＰ分子自体、特に配列番号２−６のい
ずれかによってコードされるアミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子を単離することも
可能となる。これらの単離分子は、ＴＲＡとして、あるいは、ＴＲＡとＨＬＡ−
Ｃｗ６またはＨＬＡ−Ａ２９などのＨＬＡとの複合体として提示された場合、ア
ジュバントなどの物質と組み合わせて、ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴づけら
れる疾患を治療することにおいて有用なワクチンを生産することができる。

【００７４】アジュバントの具体例として以下のものが含まれる。フロイント完全アジュバ
ントおよびフロイント不完全アジュバント、不活化(killed) 百日咳菌生物体、 “ＢＣＧ”、即ちBacille Calmente-Guerin、Ａｌ（ＯＨ）_３、ムラミルジペプチドおよびその誘導体、これらはスクアレンなどの代謝性(metabolizable)油中に乳化してもよい、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、キーホールリンペット
ヘモシニアン（ＫＬＨ）、ＱＡ−７、ＱＡ−１９およびＱＡ−２１（ＱＳ−２１
とも称される）などのサポニン抽出物、これらは参考文献として本出願にその内
容を合体させる、ケンシル（Kensil）他の米国特許第５，０５７，５４０号にお
いて記載されている、ＭＴＰ−ＭＦ５９、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオ
キシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート (
N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl sulfate)（ＤＯＴＡＰ）、カチオン性の両親媒性物質ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥなどの中性のリ
ン脂質、およびこれらの組み合わせが挙げられる。このリストアップは決して包
括的なものではなく、当業者であれば、このリストアップに付け加えることが可
能であろう。すべてのさらなるアジュバントがここに含まれる。

【００７５】さらに、ワクチンは、非−増殖性の癌細胞、非―増殖性のトランスフェクタン
トなどの、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞から調製することが
できる。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合において、それらは、Ｃ
ＴＬ応答を与えるために必要な成分の一方または両方に対するコード配列でトラ
ンスフェクトされた細胞とすることができ、あるいは、トランスフェクション無
しで両方の分子を発現する細胞とすることができる。さらに、ＴＲＡＰ分子、そ
れに関連するＴＲＡ、およびＴＲＡとＨＬＡとからなる複合体は、当業者に周知
の標準技術を用いて、抗体を産生するのに利用することができる。

【００７６】本明細書において“疾患”という語が使用される場合、それは、腫瘍拒絶抗原
前駆体が発現しているあらゆる病的状態のことを指す。そのような疾患の例は癌
、特にメラノーマである。メラノーマは色素産生細胞の癌としてよく知られてい
る。

【００７７】前に示したように、配列番号４に示されるもののような腫瘍拒絶抗原も、本発
明の一部である。８から１６のアミノ酸を含む分子などのポリペプチドも本発明
の一部である。ここにおけるポリペプチドは配列番号４に示すアミノ酸配列を含
むものである。前記諸例に示されるように、配列番号４の八量体よりも長いよう
なペプチドは、ＨＬＡ−Ｃｗ６提示癌細胞によって配列番号４の腫瘍拒絶抗原へ
とプロセシングされ、そしてそれによって提示される。この提示によって、複合
体を提示する細胞に接触した体液サンプル中に存在している細胞溶解性Ｔリンパ
球による溶解が導かれる。同様に、配列番号２１などの、配列番号２２よりも長
いペプチドは、適切なＴＲＡへとプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２９陽性細胞な
どの、癌細胞によって提示される。

【００７８】したがって、本発明のさらなる特徴は、概して９から１６アミノ酸長のペプチ
ドであって、以下の配列を含むものである：ＸａａＸａａＴｒｐＰｒｏＸａａＸａａＸａａＸａａＴｙｒ（配列番号２３）またはＸａａＸａａＴｒｐＸａａＡｒｇＸａａＸａａＸａａＴｙｒ（配列番号２４）またはＸａａＸａａＴｒｐＸａａＸａａＸａａＸａａＡｒｇＴｙｒ（配列番号２５）ここで各ケースにおけるＸａａはいずれのアミノ酸であってもよい。

【００７９】配列番号２３、２４および２５の式にしたがうペプチドの中で特に好適なもの
は、以下の１またはそれ以上の基準も満足するものである：Ｎ−末端アミノ酸位
置がＴｙｒ、第２位置がＴｙｒ、第４位置がＰｒｏ、第５位置がＡｒｇ、第６位
置がＰｒｏ、第７位置がＡｒｇ、そして第８位置がＡｒｇというものである。も
ちろん、配列番号２３においては第４位置はすでに固定されており、配列番号２
４においては第５位置はすでに固定されており、配列番号２５においては第８位
置はすでに固定されている。これらの基準のすべてが満足され、このペプチドが
９アミノ酸からなる場合、それは配列番号２２である。それとは異なる特定の代
わりのものは、いずれのものであってもすべて、配列番号２３、２４または２５
のモチーフおよび９−１６アミノ酸のサイズを条件として、本発明の請求項にお
けるペプチドに含まれる。この好適な代わりのものの条件として、特に好適なも
のは、９−１４アミノ酸長であって、配列番号２３、２４または２５を含むペプ
チドである。

【００８０】配列番号２３、２４または２５の特に好適な態様のすべてを含む、配列番号２
１、２２、２３、２４または２５のいずれかをコードする単離核酸分子である、
いわゆる“ミニ遺伝子”も本発明の一部である。例えば、配列番号２１または２
２をコードすることができる核酸分子は限られた数しかなく、これらはすべてコ
ドンの縮重についての既知のルールから簡単に推定することができる。インビボ
およびインビトロの両方の標準的な方法において、本発明のペプチドをコードす
ることにおけるこれらミニ遺伝子の利用も、本発明に含まれる。これらのペプチ
ドはＨＬＡ−Ａ２９分子に結合する。および／または、ＨＬＡ−Ａ２９分子に結
合するペプチドへとプロセシングされる。これらのペプチドがプロセシングされ
て腫瘍拒絶抗原になるという事実は、前記諸例によって示されている。

【００８１】この性質は、特にメラノーマといった、癌などの病的状態の診断を確認するこ
とにおいて、その他のパラメーターに関して利用してもよい。例えば、研究者は
、血液または尿中に入れた(shed) 抗原について研究し、生理的な変化を観察し、そして本明細書において記載したＣＴＬ増殖方法を用いてメラノーマの診断を
確認することができる。

【００８２】好ましくは可溶性の形態における、ＨＬＡ−Ａ２９分子と前にリストしたペプ
チドのいずれかとからなる複合体も、本発明の一部である。そのような可溶性の
複合体は、たとえば、体液サンプルなどのサンプルにおけるＣＴＬの存在を判定
するために、利用することができる。それは、サンプルに可溶性の複合体を加え
、そしてＣＴＬとの反応を判定することによって行われる。ＭＨＣ分子とペプチ
ドとからなる可溶性の複合体を用いたＣＴＬについてのパンニングは、例えば、
参考文献として本出願にその内容を合体させる、ブッソ（Bousso）他, Immunol.
Lett. 59(2): 85-91 (1997) によって教示されている。複合体は、ＣＴＬの濃縮を促進するために固定化されるのが好ましい。そのような複合体を利用してイ
ンビボでＣＴＬを刺激することができるということを示している、参考文献とし
て本出願にその内容を合体させる、サキタ（Sakita）他, J. Immunol. Meth. 19
2: 105-115 (1996) が注目される。これは本発明のさらなる特徴である。特に好
ましい態様において、前に言及した可溶性の複合体は多量体のものであり、最も
好ましくは四量体のものである。参考文献として本出願にその内容を合体させる
、アルトマン（Altman）他, Science 274: 94-96 (1996) には、どのようにして
そのような構造が作られるかが記載されている。

【００８３】本発明によるペプチドは、それ自体で、ＨＬＡ−タイピングアッセイを行うた
めに利用することができる。皮膚移植、器官移植などが必要な場合、移植片拒絶
反応の可能性を最小化するためにＨＬＡタイピングを行わなければならないこと
はよく知られている。本発明のペプチドを利用して、ある個人がＨＬＡ−Ｃｗ６
またはＨＬＡ−Ａ２９陽性であるか否かを判定することができ、それによって適
切なドナーを選ぶことができる。このタイプのアッセイは簡単に行うことができ
る。本発明のペプチドを目的のサンプルに接触させ、そしてそのサンプルにおけ
る細胞への結合によって、そのサンプルが採取された個人がＨＬＡ−Ｃｗ６また
はＨＬＡ−Ａ２９陽性であるか否かが示される。そのようなアッセイを至適化す
るために、ペプチド自体を標識すること、それらを標識されたリンカーと抱合 (
conjugate)もしくは結合させること、それらを固相に固定化することなどを行っ
てもよい。その他の標準的な方法は当業者にとって明らかであり、本明細書にお
いて示す必要はないであろう。

【００８４】本開示に基づく治療的なアプローチは、ＨＬＡ−Ａ２９またはＨＬＡ−Ｃｗ６
細胞などの、ＴＲＡ提示細胞の溶解を導く、患者の免疫系による応答を前提とす
る。そのようなアプローチの１つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者に、
複合体に対して特異的なＣＴＬを投与することである。そのようなＣＴＬをイン
ビトロで開発することは、当業者にとって可能であろう。具体的には、血液細胞
などの細胞のサンプルを、複合体を提示しており、特異的なＣＴＬの増殖を誘発
する能力のある細胞に接触させる。標的細胞は前述したタイプのＣＯＳ細胞など
の、トランスフェクタントとすることができる。これらトランスフェクタントは
、その表面に所望の複合体を提示し、そして、問題のＣＴＬと結合する(combine
)と、その増殖を刺激する。本明細書において用いられたもののようなＣＯＳ細胞は、その他の適当な宿主細胞と同様に、広く入手可能である。

【００８５】養子移入と称される治療方法について詳述すると（グリーンバーグ（Greenber
g）, J. Immunol. 136 (5): 1917 (1986); リッデル（Riddel）他, Science 257
: 238 (7-10-92); リンチ（Lynch）他, Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410(1991)
; カスト（Kast）他, Cell 59: 603-614 (11-17-89)）、所望の複合体を提示する細胞をＣＴＬと結合させ(combined)、それに対して特異的なＣＴＬの増殖を導
く。増殖したＣＴＬを次に特定の複合体を提示する特定の異常細胞によって特徴
づけられる細胞異常を有する患者に投与する。ここで前記複合体は適切なＨＬＡ
分子を含むものである。そしてＣＴＬが異常細胞を溶解し、それによって所望の
治療目的が達成される。

【００８６】前述の治療法は、患者の異常細胞の少なくともいくらかが関連するＨＬＡ／Ｔ
ＲＡ複合体を提示することを仮定している。このことは非常に簡単に判定できる
。というのは、当業者は、特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定するための方
法について、および、この場合はＧＡＧＥ配列である、適切な配列のＲＮＡを発
現する細胞を同定する方法について、精通しているからである。前述のスクリー
ニング方法によって、関連する複合体を提示する細胞が同定されると、それらを
患者からのサンプルと混合することができる。ここにおいて、サンプルはＣＴＬ
を含むものである。もし複合体を提示する細胞が混合されたＣＴＬサンプルによ
って溶解されたら、ＧＡＧＥ由来の腫瘍拒絶抗原が提示されており、その患者は
前に示した治療アプローチに適した候補であると考えることができる。

【００８７】養子移入は、本発明によって利用可能な治療法の唯一の形態であるわけではな
い。ＣＴＬは多くのアプローチを用いてインビボでも誘発することができる。１
つのアプローチ、即ち複合体を発現する非−増殖性の細胞の利用については前に
詳細に述べた。このアプローチにおいて用いられる細胞は、照射されたメラノー
マ細胞または複合体の提示に必要な遺伝子の一方または両方でトランスフェクト
された細胞のような、通常、複合体を発現するものとすればよい。チェン（Chen
）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110-114 (January, 1991) は、治療法(
therapeutic regime)における、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクトされた細胞の利用について示しており、このアプローチを例証している。種
々の細胞タイプが利用可能である。同様に、問題の遺伝子の一方または両方を保
有するベクターも利用可能である。ウイルス性または細菌性のベクターが特に好
適である。これらのシステムにおいて問題の遺伝子は、例えばワクシニアウイル
スまたは細菌ＢＣＧによって保有され、そしてこれら物質は、事実上、宿主細胞
に“感染” する。その結果得られた細胞は問題の複合体を提示し、自己ＣＴＬによって認識され、そして、それらＣＴＬは増殖する。腫瘍拒絶抗原または前駆
体自体とアジュバントとを組み合わせて、ＨＬＡ−Ｃｗ６提示細胞への取り込み
を促進することによっても同様の効果が達成される。そしてＨＬＡ−Ｃｗ６提示
細胞は問題のＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する。ＴＲＡＰはプロセシングされ
てＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生じるが、ＴＲＡはさらなるプロセシング
を受ける必要なく提示される。

【００８８】本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろうからここで繰り返す必
要はない。

【００８９】使用された用語および語句は限定ではなく、記載のための用語として用いられ
たものであり、そのような用語および語句の使用に当たって、図示および記載さ
れた特徴またはその部分のいかなる均等物も除外する意図はなく、本発明の枠内
において様々な改変が可能であることが認識されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＴＬクローン７６／６を用いた溶解研究を示す図

【図２】種々のトランスフェクタントおよびコントロールについて得られた腫瘍壊死因子
（“ＴＮＦ”）放出試験（アッセイ）を示す図

【図３】クローンＣＴＬ７６／６の細胞溶解性Ｔリンパ球によって誘発された溶解を比較
する図。配列番号４を含む、異なる長さのペプチドについてテストした。

【図４】本明細書において記載する６つのＧＡＧＥ遺伝子のｃＤＮＡのアラインメントを
示す図。図において、同一の領域は箱で囲まれている。翻訳開始部位および終止
コドンも示されている。実施例において記載されるポリメラーゼ連鎖反応におい
て用いられるプライマーは矢印によって示されている。

【図５】ＧＡＧＥファミリーのメンバーについての推定アミノ酸配列のアラインメントを
示す図。同一の領域は箱によって示され、配列番号４の抗原ペプチドが示されて
いる。

【図６】各ＧＡＧＥｃＤＮＡを、ＨＬＡ−Ｃｗ６ｃＤＮＡとともに、ＣＯＳ細胞にト
ランスフェクトした際に得られた結果を示す図。２４時間後、ＣＴＬ７６／６の
サンプルを加え、そして２４時間後、ＴＮＦ放出を測定した。

【図７】図示されたようにＨＬＡ−Ａ２９ｃＤＮＡ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、またはＧＡ
ＧＥ配列によってトランスフェクトされた、ＣＯＳ−７細胞によるＣＴＬ２２／
２３の刺激を比較する図。コントロール値は、刺激細胞(stimulator)として、Ｍ
Ｚ２−ＭＥＬ．４３およびＣＯＳ細胞によって提供される。

【図８】配列番号２２を含む種々のペプチドおよびそれらに由来する種々のペプチドを用
いた、⁵¹Ｃｒ放出研究によって得られた結果を示す図

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月３日（２０００．３．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 605 ＴＨＩＲＤＡＶＥＮＵＥ，ＮＥＷＹＯＲＫ，ＮＥＷＹＯＲＫ 10158，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者ファン・デン・エインデ，ベノイトベルギービー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者デバッカー，オリヴィエールベルギービー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ブーン‐ファラー，ティエリーベルギービー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA12 BA80 CA04 DA02 DA06 EA04 GA14 GA19 HA01 HA12 4B063 QA01 QQ02 QQ18 QQ19 QR48 QS07 QS15 QS28 QX07 4B064 AG01 4H045 AA10 AA30 BA10 CA41 EA51 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】９から１６アミノ酸からなり、配列番号２３、配列番号２４
または配列番号２５を含む、単離ペプチド。
【請求項２】配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５からなる、
請求項１の単離ペプチド。
【請求項３】体液サンプルにおける、ＨＬＡ−Ａ２９分子と配列番号２３
、配列番号２４または配列番号２５とからなる複合体に対して特異的な細胞溶解
性Ｔリンパ球の存在を判定する方法であって、その表面にＨＬＡ−Ａ２９を提示
する細胞のサンプルを、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５を含む
ポリペプチドと、前記ポリペプチドの配列番号２３、配列番号２４または配列番
号２５のポリペプチドへのプロセシングおよび配列番号２３、配列番号２４また
は配列番号２５の前記ＨＬＡ−Ａ２９分子への結合に好適な条件下で接触させる
工程、前記細胞溶解性Ｔリンパ球を含むと思われる体液サンプルを、配列番号２
３、配列番号２４または配列番号２５とＨＬＡ−Ａ２９とからなる複合体をその
表面に提示している前記細胞と接触させる工程、および、少なくとも（ｉ）細胞
溶解性Ｔリンパ球によって放出される腫瘍壊死因子、または（ｉｉ）前記複合体
を提示している前記細胞の溶解、のうち１つを、前記サンプルにおける前記細胞
溶解性Ｔリンパ球の存在の判定として測定する工程、を有する、体液サンプルに
おける、ＨＬＡ−Ａ２９分子と配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５
とからなる複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔリンパ球の存在を判定する方法
。
【請求項４】腫瘍壊死因子の放出を測定する工程を有する、請求項３の方
法。
【請求項５】放射能標識されたクロムの放出を定量することによって、溶
解を測定する工程を有する、請求項３の方法。
【請求項６】少なくとも、配列番号２３のＮ−末端がＴｙｒであるか、第
２アミノ酸がＴｙｒであるか、第５アミノ酸がＡｒｇであるか、第６アミノ酸が
Ｐｒｏであるか、第７アミノ酸がＡｒｇであるか、または、第８アミノ酸がＡｒ
ｇである、請求項１の単離ペプチド。
【請求項７】配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５のペプチド
をコードするヌクレオチド配列からなる単離核酸分子。
【請求項８】配列番号２１のペプチドをコードするヌクレオチド配列から
なる、請求項７の単離核酸分子。
【請求項９】配列番号２２のペプチドをコードするヌクレオチド配列から
なる、請求項８の単離核酸分子。
【請求項１０】少なくとも、配列番号２４のＮ−末端がＴｙｒであるか、
第２アミノ酸がＴｙｒであるか、第４アミノ酸がＰｒｏであるか、第６アミノ酸
がＰｒｏであるか、第７アミノ酸がＡｒｇであるか、または、第８アミノ酸がＡ
ｒｇである、請求項１の単離ペプチド。
【請求項１１】少なくとも、配列番号２５のＮ−末端がＴｙｒであるか、
第２アミノ酸がＴｙｒであるか、第４アミノ酸がＴｙｒであるか、第４アミノ酸
がＰｒｏであるか、第５アミノ酸がＡｒｇであるか、第６アミノ酸がＰｒｏであ
るか、または、第７アミノ酸がＡｒｇである、請求項１の単離ペプチド。
【請求項１２】配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５のアミノ
酸配列からなるポリペプチドを作る方法であって、前記ペプチドをコードする核
酸分子配列で細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトして、前記ペプチ
ドを産生させることからなる、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５
のアミノ酸配列からなるポリペプチドを作る方法。
【請求項１３】前記ペプチドが配列番号２１からなる、請求項１２の方法
。
【請求項１４】前記ペプチドが配列番号２２からなる、請求項１２の方法
。
【請求項１５】前記核酸分子が前記細胞にインビボでトランスフォームま
たはトランスフェクトされる、請求項１２の方法。
【請求項１６】前記核酸分子が前記細胞にインビトロでトランスフォーム
またはトランスフェクトされる、請求項１２の方法。
【請求項１７】ＨＬＡ−Ａ２９分子と請求項１のペプチドとからなる単離
複合体。
【請求項１８】溶液中の、請求項１７の単離複合体。
【請求項１９】サンプルにおける細胞溶解性Ｔ細胞の存在を判定する方法
であって、前記細胞溶解性Ｔ細胞が、請求項１８の単離複合体と、ＨＬＡ−Ａ２
９と配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５に示すアミノ酸配列からな
るペプチドとの複合体に対して特異的なレセプターを有しており、細胞溶解性Ｔ
細胞の前記単離複合体に対する結合を、前記サンプルにおける前記細胞溶解性Ｔ
細胞の判定として測定する工程を有する、サンプルにおける細胞溶解性Ｔ細胞の
存在を判定する方法。
【請求項２０】インビボで細胞溶解性Ｔ細胞を刺激する方法であって、請
求項１８の単離複合体を、前記複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を刺激
するのに十分な量、対象(subject)に投与する工程を有する、インビボで細胞溶解性Ｔ細胞を刺激する方法。
【請求項２１】前記複合体が多量体である、請求項１７の単離複合体。
【請求項２２】前記多量体の複合体が四量体である、請求項２１の単離複
合体。