ES2216169T3

ES2216169T3 - Molecula de acido nucleico aislado que codifica un antigeno asociado al cancer, al antigeno en si mismo y utilizaciones del mismo.

Info

Publication number: ES2216169T3
Application number: ES97941626T
Authority: ES
Inventors: Yao-Tseng Chen; Matthew Scanlan; Ali Gure; Lloyd J. Old; Elke Jager; Alexander Knuth; Jan W. Uni. Hos. Leiden DRIJFHOUT
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1996-10-03
Filing date: 1997-09-15
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2017-09-15
Also published as: JP2001507212A; ATE260930T1; PT948518E; CN1232467A; EP0948518A1; US6274145B1; EP0948518B1; AU4349597A; EP0948518A4; NZ335485A; HK1020968A1; KR20000048851A; DK0948518T3; CN1283652C; CA2266319C; DE69727966D1; DE69727966T2; JP3799483B2; AU732068B2; CA2266319A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL AISLAMIENTO DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA UN ANTIGENO ASOCIADO AL CANCER (COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA). ASIMISMO, UNA PARTE DE LA INVENCION ES EL ANTIGENO EN SI MISMO, Y LAS UTILIZACIONES DE LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO Y DEL ANTIGENO, Y PEPTIDOS DERIVADOS DEL MISMO.

Description

Molécula de ácido nucleico aislado que codifica un antígeno asociado al cáncer, el antígeno en sí mismo y utilizaciones del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un antígeno asociado con el cáncer, y a la molécula de ácido nucleico que lo codifica, así como a las utilizaciones de estos.

Antecedentes y estado de la técnica anterior

Está bastante bien establecido que muchos estados patológicos, tales como infecciones, cáncer, alteraciones autoinmunes, etc, se caracterizan por la expresión inapropiada de determinadas moléculas. De esta manera, estas moléculas sirven como "marcadores" de un estado patológico o anormal concreto. Aparte de este uso como "dianas" de diagnóstico, es decir materiales a ser identificados para diagnosticar estas alteraciones anormales, las moléculas sirven como reactivos que se pueden utilizar para generar agentes de diagnósticos y/o terapéuticos. Un ejemplo no limitativo de esto es la utilización los marcadores del cáncer para producir anticuerpos específicos para un determinado marcador. Todavía otro ejemplo no limitativo es la utilización de un péptido que se compleja con una molécula MHC para generar células T citolíticas contra células anormales.

La preparación de dichos materiales, por supuesto, presupone una fuente de reactivos utilizados para generarlos. La purificación a partir de células es un procedimiento de realización laborioso, lejos de ser seguro. Otro procedimiento preferido es el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador concreto, seguido de la utilización de la molécula codificante aislada para expresar la molécula deseada.

Hasta la fecha, se han utilizado dos estrategias para la detección de dichos antígenos, en, p.e. tumores humanos. Estos serán referidos como la aproximación genética y la aproximación bioquímica. La aproximación genética se ejemplifica por, p.e., dePlaen et al. Proc. Natl. Sci. USA 85:2275 (1988), incorporada aquí por referencia. En esta aproximación, varios cientos de pools de plásmidos de una librería de cDNA obtenida a partir de un tumor se transfieren a células receptoras, como las células COS, o a variantes negativas de antígeno de líneas celulares tumorales que se ensayan por la expresión del antígeno específico. La aproximación bioquímica, ejemplificada, p.e., por Kawakami, et al., Nature 369:69 (1994) incorporada aquí por referencia, se basa en la elución acídica de péptidos que se han unido a moléculas de MHC de clase I de células tumorales, seguido de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (HPLC). Los péptidos antigénicos se identifican después de que se unan a moléculas de MHC de clase I vacías de líneas celulares mutantes, defectuosas en el procesamiento de antígeno e inducen reacciones específicas con linfocitos T citotóxicos. Estas reacciones incluyen la inducción de la proliferación CTL, la liberación de TNF, y la lisis de células diana, medibles en un ensayo MTT o un ensayo de liberación de Cr^{51}.

Estas dos aproximaciones a la definición molecular de los antígenos tienen las siguientes desventajas: primero, son enormemente pesadas, consumen tiempo y son caras; y segundo, dependen del establecimiento de líneas de células T citotóxicas (CTLs) con una especificidad predefinida.

Los problemas inherentes en dos aproximaciones conocidas para la identificación y definición molecular de antígenos se demuestra mejor por el hecho de que ambos procedimientos han tenido éxito, hasta ahora, en la definición, únicamente, de unos pocos antígenos nuevos en tumores humanos. Véase, p.e., van der Bruggen et al., Science 254: 1643-1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178: 489-495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180: 35-42 (1994); Kawakami, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515-3519 (1994). Se ha identificado una nueva familia de precursores de antígeno de rechazo tumoral, en WO-A-96 21673.

Además, las metodologías descritas se basan en la disponibilidad de líneas celulares permanentes, establecidas del tipo de cáncer en consideración. Es muy difícil establecer líneas celulares a partir de determinados tipos de cáncer, como se muestra, p.e., en Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10: 607-637 (1990). También es conocido que algunos cánceres de tipo celular epitelial son pobremente susceptibles a CTLs in vitro, incluyendo análisis rutinarios. Estos problemas han estimulado la técnica para desarrollar metodologías adicionales para la identificación de antígenos asociados al cáncer.

Una metodología clave se describe en Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11913 (1995). Resumiendo, el procedimiento implica la expresión de librerías de cDNA en un hospedador procariota. (Las librerías se obtienen de una muestra de un tumor). Las librerías expresadas se inmunocriban, a continuación, con suero diluido y absorbido, con el fin de detectar aquellos antígenos que provocan respuestas humorales de titulación elevada. La metodología es conocida como el método SEREX ("Identificación Serológica de antígenos mediante clonación de Expresión Recombinante"). La metodología se ha utilizado para confirmar la expresión de antígenos asociados a tumor identificados previamente, así como para detectar otros nuevos. Véase la patente anteriormente referida y Sahin et al., supra, así como Crew et al., EMBO J 144: 2333-2340 (1995).

La metodología SEREX se ha aplicado a muestras de cáncer esofágicos y se ha identificado ahora un antígeno y su molécula de ácido nucleico codificante aislada y clonada. Se ha encontrado que el antígeno tiene una distribución del cáncer más extendido, pero no se ha encontrado en células no cancerosas. Esto, entre otros, es el objeto de la invención, la cual se describe con más detalle en la descripción que sigue.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el patrón de expresión de RNA para el antígeno NY-ESO-1 en diversos tipos de tejidos.

La Figura 2 muestra un análisis de transferencia Northern del mRNA de NY-ESO-1, el cual se encontró en testículos y en la línea celular SK-MEL-19 pero no en otras muestras de tejidos y células.

La Figura 3 muestra los sitios potenciales para la modificación de la secuencia de aminoácidos deducida de NY-ESO-1.

La Figura 4 es una transferencia de hidrofilicidad de NY-ESO-1, que muestra los dominios hidrofílicos en la región amino terminal y una extensión hidrofóbica larga cercana al extremo carboxilo.

La Figura 5 muestra los resultados de los estudios de lisis de CTL utilizando diversas células que son HLA-A2 positivas, NY-ESO-1 positivas, positivas para ambas o ninguna positiva.

La Figura 6 representa los datos que establecen que la HLA-A2 es la molécula presentadora para la presentación de los péptidos derivados de la SEC ID NO:1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Ejemplo 1

Se extrajo el RNA total a partir de un espécimen congelado de partida de células escamosas de cáncer de esófago, de bien a moderadamente diferenciadas, utilizando procedimientos bien conocidos. Véase, p.e., Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162: 156-159 (1987), para dicho método. Se utilizó este DNA para preparar una librería de cDNA que se transfectó, a continuación, en vectores fágicos \lambdaZAP, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La librería \lambdaZAP se transfectó, a continuación, en E. coli, consiguiendo 1,6x10^{6} aislados primarios.

A continuación, se utilizó la metodología SEREX de Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11813 (1995), incorporada aquí por referencia. Brevemente, del suero autológo se extrajeron los anticuerpos contra moléculas que son endógenas para E. coli mediante combinación del suero con lisados de E. coli transfectadas con el fago \lambdaZAP el cual no contenía los clones de cDNA procedentes de células de cáncer esofágico.

El suero agotado se diluyó, a continuación, y se mezcló con membranas de nitrocelulosa que contenían placas de fago. Las placas se incubaron durante toda la noche, a temperatura ambiente. Se lavaron, a continuación, y después se incubaron los filtros con fosfatasa alcalina conjugada a anticuerpos secundarios FC\gamma antihumanos de cabra y se visualizaron las placas reactivas de fagos mediante incubación con 5-bromo-4-cloroindoilo fosfato y nitroblue de tetrazolio. Se encontraron un total de 13 clones positivos.

Ejemplo 2

Después de la identificación, los clones reactivos se subclonaron para obtener monoclonales mediante clonación de dilución y ensayo con suero humano. A continuación, estos clones se purificaron, se rompieron in vitro y se convirtieron en formas plasmídicas pBK-CMV, utilizando las instrucciones del fabricante. El DNA insertado se examinó, a continuación, utilizando el mapeo de restricción con EcoRI-XbaI para determinar los diferentes insertos. Se identificaron ocho insertos diferentes, en el rango de tamaño de aproximadamente 500 a aproximadamente 1,3 kilopares de bases. Los clones se secuenciaron utilizando un secuenciador automatizado ABI PRISM.

La Tabla 1 resume los resultados. Se representó un gen mediante solapamiento de cuatro clones, un segundo mediante solapamiento de tres clones y los seis restantes mediante un solo clon.

Una búsqueda por homología reveló que los clones referidos como NY-ESO-2, 3, 6, 7 ya eran conocidos. Véase Elisei et al., J. Endocrin. Invest. 16: 533-540 (1993); Spritz et al., Nucl. Acids Res. 15: 10373-10391 (1987); Rabbits et al., Nature Genetics 4: 175-180 (1993); Crozat, et al., Nature 363: 640-644 (1993); GenBank H18368 y D25606. Se ha demostrado previamente que dos de los clones (NY-ESO-3 y NY-ESO-6) se expresan en diversos tejidos humanos normales. No se ha encontrado ninguna evidencia de restricción de linaje. NY-ESO-6 (cDNA) parece ser la región 3' no traducida del gen FUS/TLS. En experimentos no aportados aquí, la secuenciación y el análisis por transferencia Southern del NY-ESO-6 no mostró evidencias de translocación o mutaciones puntuales en el cáncer. Cuatro de los clones, es decir, NY-ESO-1, 4, 5 y 8 no mostraron una homología fuerte con las secuencias en las bases de datos examinadas y de esta manera se estudiaron más.

TABLA 1

1

Ejemplo 3

Se llevaron a cabo estudios para evaluar la expresión del mRNA de los clones NY-ESO-1, 4, 5 y 8. Para hacer esto, se diseñaron cebadores de oligonucleótidos específicos para cada secuencia, de tal manera que los segmentos de cDNA de 300-400 pares de bases se pudieran amplificar y, de tal manera, que la temperatura de fusión del cebador se encontrara en el rango de 65-70ºC. A continuación, se llevó a cabo la PCR de transcripción inversa utilizando materiales comercialmente asequibles y protocolos estándar. Se ensayaron una diversidad de tipos celulares normales y tumorales. Los clones NY-ESO-4 y NY-ESO-8 estaban omnipresentes y no se estudiaron más. La NY-ESO-5 mostró un nivel elevado de expresión en el tumor original y en tejido esofágico normal, sugiriendo que este era un marcador de diferenciación.

Se encontró que NY-ESO-1 se expresaba en mRNA tumoral y en testículos, pero no en tejido normal de colon, riñón, hígado o cerebro. Este patrón de expresión es coherente con otros precursores de antígeno tumorales de rechazo.

Ejemplo 4

El ensayo de RT-PCR indicado en supra se llevó a cabo con NY-ESO-1 para un conjunto de tejidos normales y tumorales mucho más completo. Las Tablas 2, 3 y 4 muestran estos resultados. Brevemente, se encontró que

\hbox{NY-ESO-1}

se expresaba altamente en testículos normales y en células de ovarios. Se encontraron pequeñas cantidades de la producción de RT-PCR en el miometrio uterino normal y no en el endometrio, pero el positivo que se mostraba no era coherente. También fueron negativos los diferentes tipos celulares escamosos de epitelio, incluyendo las de esófago y piel normales.

Cuando se ensayaron los tumores de linajes de células no relacionadas, 2 de las 11 líneas celulares de melanomas mostraron una expresión fuerte, como hacían 16 de los 67 especímenes de melanoma, 6 de los 33 especímenes de cáncer de pecho y 4 de los 4 cánceres de vejiga. Existía expresión esporádica en otros tipos tumorales.

TABLA 2

2

TABLA 3

3

TABLA 4

4

Se llevó a cabo un conjunto más de experimentos para discernir si la presencia de anticuerpo anti-NY-ESO-1 en los sueros de pacientes con cáncer se podía determinar mediante un ELISA. Brevemente, la proteína NY-ESO-1, producida mediante los procedimientos indicados más abajo, se cubrió sobre superficies sólidas, utilizando procedimientos estándar. Las muestras de suero se extrajeron de pacientes normales y de pacientes con varios cánceres. Los anticuerpos anti-NY-ESO-1 deberían unirse a estos. A continuación, estos se pusieron en contacto con IgG antihumana de cabra, marcada con peroxidasa alcalina y, a continuación, se visualizó con el sustrato. Los resultados se presentan en la siguiente tabla:

	Eso 1+ / ensayado total	%
Cáncer de pacientes: melanoma	11/127	8,7
Cáncer de ovarios	4/31	12,9
Cáncer de pulmón	1/24	4,0
Donantes de sangre	0/70	0

Ejemplo 5

A continuación, se llevó a cabo el análisis de transferencia Northern para investigar el tamaño del transcrito NY-ESO-1 y para confirmar los patrones de expresión en el tejido. Se utilizó la metodología de Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1995). Especificando, se disolvieron 20 ug de RNA total por carril con formamida y formaldehído que contenía un tampón, se calentó a 65ºC y, a continuación, se separó en gel de agarosa al 1,2%, con un 3% de formaldehído, seguido de la transferencia a papel de nitrocelulosa. A continuación, se llevó a cabo la hibridación utilizando una sonda marcada con P^{32}, seguida de un lavado altamente riguroso. El lavado final fue con 0,1xSSC, 0,1% SDS, 60ºC durante 15 minutos.

El RNA procedente de los testículos y de una línea celular de melanoma (SK-MEL-19) que había sido positivo para NY-ESO-1 en los ensayos anteriores, mostró un transcrito de RNA de aproximadamente 0,8-0,9 kb. Un espécimen de carcinoma esofágico mostró una mancha en el rango de 0,4-0,9 kb, que reflejaba una degradación parcial. El RNA procedente de tejidos adicionales o de líneas celulares ensayadas no mostraron transcrito.

Para conseguir el cDNA codificante del transcrito completo, la librería de cDNA esofágica se volvió a cribar, utilizando hibridación de placa, y el clon de cDNA original como la sonda de hibridación. Cuando se cribaron 3x10^{5} clones, se encontraron seis clones positivos. Los tres clones más largos se secuenciaron. El análisis de marcos de lectura abierto mostró que los tres contenían la región codificante entera y regiones en 5' no traducidas de tamaño variable. El clon más largo, de 755 pares de bases de longitud (excluyendo el poliA), contiene una región codificante de 543 pares de bases, junto con 53 bases no traducidas en el extremo 5' y 151 pares de bases no traducidas en el extremo 3'. Véase SEC ID NO:1 (también Figura 3).

El ORF largo indicaba que la secuencia deducida de la proteína NY-ESO-1 es de 180 aminoácidos. El único clon inmunopositivo contenía una secuencia que codificaba 173 de estos. La masa molecular deducida es de 17995 daltons.

El análisis muestra que existe una abundancia en residuos de glicina en la región N-terminal (30 de los primeros 80, 4 en los 100 restantes). El análisis de hidrofilicidad indicó que existían secuencias antigénicas hidrofílicas en la mitad N-terminal de la molécula, con secuencias hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas, que finalizaban con una cola hidrofóbica C-terminal larga (aminoácidos 152-172), seguida de una cola corta hidrofílica. Este patrón sugiere un dominio transmembrana. Existen diversos puntos potenciales de N-miristorilación, 3 puntos de fosforilación y ninguna evidencia de puntos de N-glicosilación.

Ejemplo 6

Se estableció en 1995 una línea celular de melanoma "NW-MEL-38", procedente de un paciente que sufría un melanoma maligno. Las muestras de suero, linfocitos de sangre periférica y muestras de tumor, se extrajeron del sujeto y se congelaron hasta llevar a cabo el trabajo descrito en el presente documento. Para anticipar la evaluación de la respuesta de células T antitumorales en este paciente, el paciente se tipó como HLA-A1 y HLA-A2.

Para determinar si el melanoma procedente de este paciente expresaba o no NY-ESO-1, se aisló el RNA total procedente tanto de muestras tumorales como de la línea celular NW-MEL-38 utilizando técnicas estándar. A continuación, se sometieron dos microgramos de RNA total de cada una de las muestras a la síntesis de cDNA.

El cDNA se utilizó, a continuación, en RT-PCR, utilizando los siguientes cebadores:

5'-CAACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G'-3' (SEQ ID NO: 2)

y

CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG-3' (SEQ ID NO: 3)

Estos cebadores deberían amplificar un segmento de la SEC ID NO:1 que empalma los nucleótidos 271 a 599.

La amplificación se llevó a cabo durante 35 ciclos, utilizando una temperatura de hibridación de 60ºC. Los productos de la PCR se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio, en un gel de agarosa al 1,5%.

Los resultados indicaron que tanto el tumor como la línea celular expresaban la SEC ID NO:1. Las muestras de la línea celular y de tumor se utilizaron en los experimentos subsiguientes.

Ejemplo 7

La molécula de cDNA aislada, discutida en supra, se utilizó, a continuación, para preparar la proteína recombinante. Específicamente, se amplificó por PCR el cDNA, utilizando técnicas estándar, y se clonó, a continuación, en un vector plasmídico disponible comercialmente, es decir, pQE9, que contiene etiquetas de His. En el trabajo no elaborado aquí, se utilizó, también, un segundo vector pQE9K. Este difiere de PQE9 en que la resistencia a kanamicina está impartida por pQE9K, más que la resistencia a ampicilina.

El vector plasmídico se transformó en la cepa de E.coli XL1-Blue y los transformantes positivos se identificaron mediante mapeo por restricción y secuenciación del DNA. La producción de proteína recombinante se indujo utilizando isopropil \beta-D-tiogalactósido y la proteína se purificó en una columna de cromatografía iónica de Ni^{2+}, siguiendo procedimientos bien conocidos. Cuando se analizó la proteína mediante SDS-PAGE al 15% y tinción con plata, se identificó como una proteína de un peso molecular de aproximadamente 22 kilodaltons. Esto es coherente con el tamaño predecido de la proteína a partir de su secuencia.

Los transfectantes eucarióticos fueron producidos a continuación. Para hacer esto, la secuencia codificante de
NY-ESO-1 se aisló a partir del vector pQE9 descrito en supra, y, a continuación, se clonó en los puntos BamHI-HindIII del vector de expresión eucariota pcDNA 3.1. A continuación, las células COS-7 se transfectaron con este vector, poniendo en contacto las muestras de células con 150 ng del plásmido discutido en supra, y 150 ng del pcDNA plasmídico 1 Amp, que contenía o cDNA de HLA-A2.1 o el cDNA del HLA-A1. Se utilizó el procedimiento, bien conocido, de la DEAE-dextrano cloroquina. Las células se incubaron, a continuación, a 37ºC durante 48 horas, después de lo cual se ensayaron en un ensayo de estimulación de CTLs. Específicamente, el ensayo seguía Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-148 (1992), incorporado aquí por referencia. Brevemente, 2500 CTLs (NW38-IVS-1, véase ejemplo 9, infra) en 100 uL de RPMI suplementado con suero humano al 100% y se añadieron 25 U/ml de IL-2 recombinante a los micropocillos que contenían células COS-7 transfectadas (20.000 células/pocillo). Después de 24 horas, se recogieron 50 ul de sobrenadante de cada pocillo, y se determinaron los niveles de TNF-\alpha en un ensayo estándar, es decir, uno en donde se ensayaba la citotoxicidad de 13 células contra el clon WEHI 164, utilizando MTT. Las células positivas se utilizaron en el análisis de transferencia Western, descrito en los ejemplos que siguen.

Las CTLs utilizadas fueron CTL NW38-IVS-1 preparadas de acuerdo con Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3511-3515 (1984), incorporada aquí por referencia. Específicamente, los cultivos de células T mezclados se produjeron, mediante combinación de 10^{5} células tumorales autólogas NW38 MEL-1 y 10^{6} linfocitos de sangre periférica, procedentes del sujeto. Se añadió la citoquina IL-2 y el cultivo mezclado se incubó durante una semana a 37ºC. Las células tumorales se extrajeron y se añadió una nueva alícuota de 5x10^{4} células tumorales junto con la
IL-2. Este proceso se repitió semanalmente, hasta que se observó una fuerte respuesta cuando se ensayó con células NW-MEL-38 marcadas con Cr^{51}. Los contestadores (en inglés "responders") de células T se recogieron y se congelaron hasta su utilización en experimentos adicionales.

Ejemplo 8

Se llevó a cabo, a continuación, un análisis de transferencia Western, utilizando las muestras de suero descritas más arriba, así como los lisados celulares procedentes de la línea celular NW-MEL-38, descrita más arriba, y los transfectantes COS-7, descritos en supra, y la proteína recombinante purificada, también descrita en supra. Las muestras de suero se tomaron en diversos momentos de la terapia del paciente.

En estos ensayos, se diluyeron 1 ug de la proteína recombinante NY-ESO-1 ó 5 ul de lisados celulares de cualquier tipo en SDS y se hirvió durante cinco minutos y, a continuación, se realizó la electroforesis en un gel de SDS al 15%. Después de toda la noche de transferencia a nitrocelulosa (0,45 um) y de bloquearlo con BSA al 3%, las manchas se incubaron con suero, diluido al 1:1000, 1:10.000 y 1:100.000 o con un anticuerpo monoclonal contra

\hbox{NY-ESO-1}

diluido a 1:50 como control positivo. El anticuerpo monoclonal se preparó como sigue. Se inmunizaron ratones BALB/C mediante cinco inyecciones subcutáneas de la proteína recombinante NY-ESO-1 en intervalos de 2-3 semanas. La formulación de inmunización incluía 50 ug de proteína recombinante en un adyuvante. La primera inyección utilizaba Adyuvante de Freund Completo y se utilizó el Adyuvante de Freud Incompleto de ahí en adelante. De los ratones inmunizados se extrajeron células de bazo y se fusionaron con la línea celular SP2/0 de mieloma de ratón para generar hibridomas.

Una vez se generaron los hibridomas, estos se clonaron y sus sobrenadantes se cribaron contra la proteína recombinante, utilizando un ELISA en fase sólida estándar en placas de microtitulación. El ensayo fue de acuerdo con Dippold et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118 (1980), incorporado aquí por referencia. Se hicieron correr también una serie de controles negativos, utilizando la NY-ESO-1 recombinante. Los anticuerpos del suero que se unían a la proteína recombinante producida por E. coli, según se ha descrito más arriba, se visualizaron utilizando IgG antihumano de cabra marcado con fosfatasa alcalina en una dilución 1:10.000 y, a continuación, se visualizaron con NBT-fosfato. Las células COS-7 no transfectadas se utilizaron también como control. También se utilizó el suero procedente de un individuo sano como control.

La fuerte reactividad contra la proteína recombinante se encontró en las diluciones por debajo de 1:100.000 y existía también reactividad contra el lisado de NW-MEL-38. No se encontró reactividad contra las células COS-7 no transfectadas ni se mostró reactividad en el suero de un individuo sano.

Ejemplo 9

En el ensayo de los tranfectantes de COS-7, supra, y en los ensayos discutidos en este ejemplo, se utilizó una línea de células T citolíticas "NW38-IVS-1". Esta "CTL" se generó mediante una estimulación in vitro de los linfocitos de sangre periférica mencionados más arriba, utilizando la línea de células tumorales NW-MEL-38. Esto se hizo utilizando técnicas estándar.

La CTL se utilizó en un ensayo de citotoxicidad con NW-MEL-38 (el cual era HLA-A1, A2 positivo y NY-ESO-1 positivo), junto con dos líneas celulares alogénicas que eran NY-ESO-1 y HLA-A2 positivas (SK-MEL-37 y MZ-MEL-19), una línea celular que es de clase MHC I negativa (SK-MEL-19), una línea celular que es HLA-A2 positiva, pero NY-ESO-1 negativa (NW-MEL-145) junto con las líneas celulares control K562 y los blastos autólogos estimulados con fitohemaglutinina. Se utilizaron diferentes relaciones efector/diana y el parámetro de medida de la lisis fueron las células diana marcadas con Cr^{51}. La Figura 5 muestra esto.

Los resultados indicaban que la CTL NW38-IVS-1 lisaba tanto la línea celular autóloga NW MEL-38 como las líneas celulares alogénicas que eran HLA-A2 y ESO-1 positivas. De esta manera, la CTL era reactiva a materiales alogénicos. Véase Figura 6.

Ejemplo 10

Puesto que el paciente NW38 era HLA-A1 y HLA-A2 positivo, se llevaron a cabo experimentos para determinar qué molécula era la molécula presentadora.

Se llevó a cabo el mismo experimento que el descrito arriba con células COS-7, excepto en que en estos experimentos, se debía de tener la seguridad de separar los grupos de cotransformantes que habían sido transformados con cualquiera cDNA de HLA-A1 o de HLA-A2 pero no ambos. Estos resultados muestran que las CTL NM38-IVS-1 lisaban los transfectantes COS-7 que contenían tanto NY-ESO-1 como HLA-A2 exclusivamente. Véase la Figura 6. El trabajo también confirmó la especificidad de la CTL, puesto que las células NY-ESO-1 negativa, HLA-A2 positivas descritas en el Ejemplo 9 fueron positivas para otras moléculas conocidas por ser procesadas a péptidos presentados por moléculas HLA-A2.

Ejemplo 11

Una vez se identificó la molécula presentadora MHC como la HLA-A2, se llevó a cabo el cribado de la secuencia de aminoácidos de la NY-ESO-1, para identificar todos los péptidos que satisfacen este motivo, utilizando el modelo descrito por D'Amaro et al., Human Immunol. 43: 13-18 (1995) y Drijfhout, et al., Human Immunol. 43: 1-12 (1995) incorporados aquí por referencia. Se sintetizaron los péptidos correspondientes a todas las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de éstos utilizando técnicas estándar y, a continuación, se utilizaron en pruebas de citotoxicidad, siguiendo Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 3511-3515 (1984) incorporado aquí por referencia. Específicamente, se utilizó la línea celular CEMX721.174.T2 ("T2" de aquí en adelante) ya que este no procesa antígenos a los péptidos complejados a MHC, haciéndole, de esta manera, ideal para los experimentos del tipo descrito aquí. Las muestras de células T se marcaron con 100 uCi de Na(Cr^{51})O_{4}, utilizando métodos estándar, y se lavaron, a continuación, tres veces, seguido de la incubación con 10 ug/ml de péptido y 2,5 ug/ml de \beta-2-microglobulina. La incubación fue de una hora, a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron las células de conestadores (100 Ul de una suspensión de CTL NW38-IVS-1) en una relación efector/diana de 90:1 y se incubaron durante cuatro horas en una atmósfera saturada de agua, con un 5% de CO_{2}, a 37ºC. A continuación, las placas se centrifugaron a 200xg durante cinco minutos, se extrajeron 100 ul de sobrenadante y se midió la radioactividad. El porcentaje de Cr^{51} liberado se determinó de acuerdo con estrategias conocidas. Se encontró que los péptidos SLLMWITQCFL (SEC ID NO:4), SLLMWITQC (SEC ID NO:5) y QLSLLMWIT (SEC ID NO: 6) eran los tres estimuladores mejores de CTLs. Se encontraron resultados comparables cuando se utilizaron como dianas NW-MEL-38 y las líneas celulares SK-MEL-37 y MZ-MEL-19, como se ha mostrado en supra.

Los ejemplos anteriores describen el aislamiento de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado con el cáncer de esófago. "Asociado" se utiliza aquí porque mientras es evidente que la molécula importante se expresaba por el cáncer esofágico, otros cánceres como el melanoma, el cáncer de mama, próstata y pulmón también expresan el antígeno.

La invención se refiere a aquellas moléculas de ácido nucleico que codifican antígenos según se ha descrito, y que hibridan con una secuencia de referencia SEC ID NO: 1 bajo condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas" según se utiliza en el presente documento se refiere a condiciones tales como las especificadas en la patente US Nº 5.342.774, es decir, 18 horas de hibridación a 65ºC, seguido de cuatro lavados de una hora con 2xSSC, 0,1% SDS, y un lavado final con 0,2xSSC, más preferiblemente 0,1xSSC, 0,1% SDS durante 30 minutos, así como condiciones alternadas que permitan el mismo nivel de rigurosidad y condiciones más rigurosas.

También son otra parte de la invención vectores de expresión que incorporan las moléculas de ácido nucleico de la invención, en unión operativa ("unido operativamente") a un promotor. La construcción de dichos vectores forma parte del conocimiento del experto en la materia, como es la transformación o transfección de células, para producir líneas de células eucariotas o cepas de células procariotas que codifiquen la molécula de interés. Ejemplos de células hospedadoras que se pueden utilizar de esta manera son las células COS, células CHO, células de levadura, células de insectos (p.e. Spodolptera frugiperda), células NIH 3T3 y más. También se pueden utilizar células procariotas tales como E. coli y otras bacterias.

También es parte de la invención el antígeno descrito aquí, tanto en la forma de péptido original como en la forma post-traduccional modificada. La molécula es suficientemente larga como para ser antigénica sin cualquier modificación post-traduccional y, de esta manera, es útil como inmunogen, cuando se combina con un adyuvante (o sin este), tanto en la forma de precursor como en la forma modificada de manera post-traduccional. Los anticuerpos producidos utilizando este antígeno, tanto poli como monoclonal, también forman parte de la invención así como la hibridación que hace el anticuerpo monoclonal. Esto se puede utilizar terapéuticamente como la proteína entera, o en fragmentos, según se discute en infra. También forman parte de la invención los anticuerpos contra el antígeno, siendo estos policlonales, monoclonales, fragmentos reactivos, como el Fab, F(ab)'_{2} y otros fragmentos, así como quimeras, anticuerpos humanizados, anticuerpos producidos de manera recombinante, y más.

Como resulta evidente de la descripción, uno puede utilizar proteínas y las moléculas de ácido nucleico de la invención para el diagnóstico. La metodología SEREX discutida aquí está basada en una respuesta inmune para un antígeno asociado a una patología. De esta manera, uno puede ensayar para la patología relevante mediante, por ejemplo, ensayo de la reactividad con un antígeno per se de un fluido corporal en una muestra de un fluido corporal de un sujeto, como suero. La reactividad sería considerada indicativa de la posible presencia de la patología, por lo que también, uno podría ensayar la expresión del antígeno mediante cualquier de los ensayos estándar de hibridación de ácido nucleico que son bien conocidos en la materia y no necesitan ser elaborados a partir de aquí. Uno podría probar los anticuerpos contra la molécula objeto, utilizando también inmunoensayos estándar.

El análisis de la SEC ID NO:1 mostrará que existen regiones no codificantes en 3' y 5' presentadas allí. La invención se refiere a aquellas moléculas de ácido nucleico aisladas que contienen por lo menos el segmento codificante, es decir, los nucleótidos 54-593 y que pueden contener cualquier o todos los nucleótidos 1-53 y/o 594-747 de la SEC ID NO:1.

Un análisis adicional, según se ha discutido en supra, revela que la molécula se procesa a péptidos que provocan la lisis mediante células T citolíticas. El Ejemplo 7 mostraba como este tipo de análisis del motivo se puede llevar a cabo para moléculas HLA-A2. Se ha realizado un gran trabajo en motivos de diversas moléculas MHC o HLA, que es aplicable aquí. De esta manera, la invención se refiere a composiciones útiles en un método terapéutico, en donde se administra al paciente uno o más péptidos que se unen a una molécula de HLA en la superficie de células tumorales de un paciente, en una cantidad suficiente para que los péptidos se unan a las moléculas MHC/HLA y provocar la lisis mediante células T. La ejemplificación dada más arriba para las moléculas HLA-A2 no es de ninguna manera el único tipo de esta administración que se puede utilizar. Cualquier combinación de péptidos se puede utilizar. Estos péptidos, que se pueden utilizar solos o en combinación, así como la proteína entera o porciones inmunoreactivas de la misma, se pueden administrar a un sujeto que necesite de estas, utilizando cualquiera de los tipos estándar de administración, tales como la administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, rectal y transdérmica. Los portadores farmacéuticos estándar, adyuvantes, como las saponinas, GM-CSF e interleuquinas y demás también se pueden utilizar. Además, estos péptidos y proteínas se pueden formular en vacunas con el material listado, como células dendríticas u otras células que presentan complejos MHC/péptido relevantes.

De manera similar, la invención se refiere a composiciones útiles en terapias en donde la molécula de ácido nucleico que codifica la NY-ESO-1, se incorpora en un vector, como un vector basado en un adenovirus, para volverlo transfectable en células eucariotas, como las células humanas. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más de los péptidos se pueden incorporar en estos vectores, que son, entonces, el constituyente principal de las terapias a base de ácido nucleico.

Cualquiera de estos ensayos se puede utilizar también en estudios de progresión/regresión. Uno puede seguir el transcurso de una anormalidad que implique la expresión de NY-ESO-1, simplemente mediante el seguimiento de los niveles de proteína, su expresión y demás utilizando cualquiera o todos los métodos indicados en supra.

Debería ser evidente que estas metodologías se pueden utilizar también para rastrear la eficacia de un régimen terapéutico. Esencialmente, uno puede tomar un valor de línea base para la proteína NY-ESO-1, utilizando cualquiera de los ensayos discutidos más arriba, administrar un agente terapéutico determinado y, a continuación, seguir los niveles de la proteína de aquí en adelante, observando los cambios en los niveles de ESO-1 como indicio de la eficacia del régimen.

Como se indicaba en supra, la invención implica, entre otros, el reconocimiento de una respuesta inmune "integrada" para la molécula NY-ESO. Una ramificación de esto es la capacidad para seguir el transcurso de la terapia del cáncer. En este procedimiento, un sujeto que necesite la terapia recibe una vacuna de un tipo descrito aquí. Dicha vacuna resulta, p.e. en una respuesta de células T contra células que presentan los complejos de péptido/HLA en sus células. La respuesta también incluye una respuesta de anticuerpos, posiblemente un resultado de la liberación de anticuerpo que provocan las proteínas mediante la lisis de células a través de células T. De esta manera, uno puede seguir el efecto de una vacuna, mediante seguimiento de la respuesta del anticuerpo. Como se indicaba más arriba, un aumento en la titulación de anticuerpos se puede tomar como un indicio del progreso con un vacuna, y viceversa. De esta manera, un aspecto más de la invención es un procedimiento de seguimiento de la eficacia de una vacuna, siguiendo a la administración de la misma, mediante la determinación de los niveles de anticuerpos en el sujeto que son específicos para la vacuna en sí misma o moléculas grandes de las que la vacuna es una parte.

La identificación de proteínas NY-ESO-1 por estar implicadas en los estados patológicos como el cáncer también sugiere una serie de aproximaciones terapéuticas en suma a las discutidas más arriba. Los experimentos indicados arriba establecen que los anticuerpos se producen en respuesta a la expresión de la proteína. De esta manera, la invención proporciona composiciones que se relacionan con el tratamiento de estados que se caracterizan por niveles aberrantes o anormales de proteínas NY-ESO-1, mediante administración de anticuerpos, como anticuerpos humanizados, fragmentos de anticuerpos y demás. Estos se pueden etiquetar o marcar con reactivos citostáticos o citotóxicos.

Las composiciones de la invención se pueden utilizar en procedimientos en donde las células T también se pueden administrar. Cabe indicar que las células T se pueden estimular in vitro utilizando las células de respuesta inmune tales como células dendríticas, linfocitos, o cualquier otra célula de respuesta inmune y, a continuación, se vuelven a prefusionar en el sujeto a ser tratado.

Véase que la generación de células T y/o de anticuerpos se puede llevar a cabo mediante administración de células, preferiblemente tratadas para volverlas no proliferativas, las cuales presentan epítopos de células B o T relevantes para la respuesta, como los epítopos discutidos más arriba.

Las aproximaciones terapéuticas pueden incluir también las terapias antisentido, en donde una molécula antisentido, preferiblemente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, se administra al sujeto ya sea "arreglado" o en un portador, como un liposoma, para facilitar la incorporación en una célula, seguido de la inhibición de la expresión de la proteína. Dichas secuencias antisentido también se pueden incorporar en vacunas apropiadas, tales como en vectores virales (p.e. Vaccinia), construcciones bacterianas, como variantes de la vacuna conocida BCG y demás.

También una parte de la invención son péptidos, que pueden ser nonámeros, docámeros o undecámeros definidos por tener una secuencia central:

LLMWIT (SEQ ID NO: 7)

que tiene por lo menos un residuo terminal adicional respecto al primer residuo L, preferiblemente serina y puede tener como mucho tres, en donde la Serina se une a L para formar -SL-, y de 0-4 aminoácidos adicionales en el
C-terminal, según se ha mostrado en supra, unido a moléculas HLA-A2, provocando de esta manera una respuesta CTL. Estos péptidos se pueden utilizar terapéuticamente, mediante administración a un paciente que es HLA-A2 positivo, y expresa NY-ESO-1 relacionada con una patología, así como de manera diagnóstica, es decir, para determinar si las células HLA-A2 positivas están presentes o si están presentes CTLs relevantes, y demás.

La molécula HLA-A2 es una molécula MHC de clase I, y las células T que responden a complejos de péptidos y moléculas de clase I son generalmente células CD8+. Otro subconjunto de células T, las células CD4+, responden a los complejos y péptidos de MHC de clase II y se han detectado respuestas de células T CD4+ restringidas a MHC de clase II contra la NY-ESO-1 recombinantes, presentados por células dendríticas autólogas cultivadas, en pacientes con melanoma. Específicamente, en resultados no descritos aquí, las células CD4+ se separaron de las otras células a partir de PBLs o muestras de suero, utilizando técnicas bien conocidas. A continuación, se mezclaron con células dendríticas, las cuales se habían pulsado con la proteína NY-ESO-1. Se observó la proliferación de células T CD4+, llevando otra faceta a la respuesta inmune discutida más aquí. De esta manera, un aspecto más de la presente invención son estas células T CD4+, péptidos que se unen a las moléculas de MHC de clase II y su utilización en terapia.

Otras características y aplicaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la materia y no necesitan ser expuestos aquí.

(1) INFORMACION GENERAL:

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(i): SOLICITANTES: Yao-Tseng Chen; Scanlan, Matthew; Gure, Ali; Old, Lloyd; Knuth, Alexander; Jager, Elke; Drijfhout, Jan, W.

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(ii): TITULO DE LA INVENCION: Molécula de Ácido nucleico aislada que codifica un antígeno asociado con el cáncer de esófago, el antígeno en sí mismo y utilizaciones de los mismos.

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(iii): NUMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv): DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): A QUIEN SE HA DE DIRIGIR: Felfe & Linch

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(B): CALLE: 805 Third Avenue

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(C): CIUDAD: Ciudad de Nueva York

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(D): ESTADO: Nueva York

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(E): USA

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(F): CODIGO POSTAL: 10022

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(v): FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE SOPORTE: Disquete de 3,5 pulgadas, memoria de 144 Kb

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(B): ORDENADOR: IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS

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(D): PROGRAMA: Wordperfect

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACION:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NUMERO DE SOLICITUD: US 08/752.182

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(B): FECHA DE PRESENTACION: 03 de Octubre de 1996

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(C): CLASIFICACIÓN: 935

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(viii): INFORMACION SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:

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(A): NOMBRE: Hanson, Norman D.

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(B): NUMERO DE REGISTRO: 30.946

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(C): NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: LUD 5466.1-PCT

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(ix): INFORMACION PARA TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELEFONO: (212) 688-9200

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(B): TELEFAX: (212) 838-3884

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 1:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 752 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: doble

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(D): TOPOLOGIA: lineal

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(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 1:

5

6

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 2:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 31 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TOPOLOGIA: lineal

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(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G

\hfill

31

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 32 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGIA: lineal

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(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG

\hfill

32

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 4:

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(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGIA: lineal

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(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu}

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys}

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(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Met Trp Ile Thr}

Claims

1. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica un antígeno asociado con el cáncer, teniendo dicha molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos, la secuencia complementaria de la cual híbrida, en condiciones rigurosas, con la molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos indicada en los nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.

2. Molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que consiste en los nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.

3. Molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, que consiste en cualquiera del nucleótido 1 hasta el nucleótido 747 de la SEC ID NO:1, con la condición de que dicha molécula de ácido nucleico aislada contiene por lo menos los nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.

4. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o reivindicación 3, unido operativamente a un promotor.

5. Vector de expresión que comprende un virus mutado o atenuado y la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.

6. Vector de expresión de la reivindicación 5, en donde dicho virus es un adenovirus o virus de la vacuna.

7. Vector de expresión de la reivindicación 4, que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica para un MHC o HLA.

8. Vector de expresión de la reivindicación 4, que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica para una citoquina.

9. Línea celular eucariota aislada o cepa celular procariota transformada o transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 4.

10. Línea celular eucariota aislada o cepa celular procariota transformada o transfectada con la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.

11. Línea celular eucariota aislada de la reivindicación 10, en donde dicha línea celular ha sido convertida en no proliferativa.

12. Línea celular eucariota aislada de la reivindicación 10, en donde dicha línea celular es una línea celular de fibroblasto.

13. Línea celular eucariota aislada de la reivindicación 10, en donde dicha línea celular está transfectada también con una molécula de ácido nucleico que codifica para una citoquina.

14. Línea celular eucariota aislada de la reivindicación 13, en donde dicha línea celular está transfectada además con una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de HLA.

15. Línea celular eucariota aislada de la reivindicación 13 o del vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicha citoquina es una interleuquina.

16. Línea celular eucariota aislada o vector de expresión de la reivindicación 15, en donde dicha interleuquina es IL-2, IL-4 o IL-12.

17. Antígeno aislado asociado al cáncer que comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.

18. Sistema de expresión útil en la transfección de una célula que comprende (i) un primer vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno aislado asociado al cáncer de la reivindicación 17 y (ii) un segundo vector seleccionado del grupo que consiste en (a) un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de MHC o HLA que presenta un antígeno derivado de dicho antígeno asociado con el cáncer y (b) un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica para una interleuquina.

19. Composición inmunogénica que comprende el antígeno aislado de la reivindicación 17 o un vector de expresión que codifica dicho antígeno, y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

20. Composición inmunogénica que comprende por lo menos un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de 8 a 12 aminoácidos concatenados uno con otro en un antígeno aislado asociado con el cáncer de la reivindicación 17 que comprende toda la secuencia de aminoácidos y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

21. Composición inmunogénica de la reivindicación 19 o reivindicación 20, en donde dicho adyuvante es una citoquina, una saponina, o GM-CSF.

22. Composición inmunogénica de la reivindicación 20, en donde dicha composición comprende una pluralidad de péptidos que complejan con una molécula específica de MHC.

23. Composición inmunogénica que comprende por lo menos un vector de expresión que codifica para una pluralidad de péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NO:1 y un adyuvante o portador.

24. Péptido aislado derivado de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NO:1, en donde dicho péptido aislado se une a una molécula HLA, es un nonámero, un docámero o un undecámero, y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:7, de uno a tres aminoácidos adicionales en el N-terminal y hasta cuatro aminoácidos adicionales en el C-terminal.

25. Péptido aislado de la reivindicación 24, seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6.

26. Composición inmunogénica de la reivindicación 22 o el péptido aislado de la reivindicación 24, en donde dicha molécula MHC o HLA es la HLA-A2.

27. Vacuna útil en el tratamiento de un sujeto aquejado de un estado canceroso que comprende la línea celular aislada de la reivindicación 14 y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

28. Vacuna de la reivindicación 27, en donde dicha línea celular se vuelve no proliferativa.

29. Composición de materia útil para el tratamiento de un estado canceroso que comprende (i) un péptido derivado de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NO:1, (ii) una molécula MHC o HLA y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable.

30. Composición de materia útil para el tratamiento de un estado canceroso que comprende una línea celular no proliferativa que tiene expresado en su superficie un péptido derivado de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID NO:1.

31. Composición de materia de la reivindicación 30 o la vacuna de la reivindicación 28, en donde dicha línea celular es una línea celular humana.

32. Anticuerpo aislado o un fragmento de un anticuerpo capaz de unirse a un antígeno, siendo específico dicho anticuerpo o fragmento para el antígeno aislado asociado al cáncer de la reivindicación 17.

33. Anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicación 32, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

34. Fragmento de anticuerpo aislado de la reivindicación 32 ó reivindicación 33 el cual es un fragmento Fab o un fragmento F(ab')_{2}.

35. Anticuerpo aislado o fragmento de la reivindicación 32 que está producido de manera recombinante.

36. Anticuerpo aislado de la reivindicación 35, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

37. Anticuerpo aislado de la reivindicación 35, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

38. Procedimiento de cribado para el cáncer en una muestra tomada de un sujeto, que comprende poner en contacto dicha muestra con una molécula de ácido nucleico aislada que hibrida específicamente con todo o parte de la SEC ID NO: 1 y determinar la hibridación de la SEC ID NO:1 como indicación de células cancerígenas en dicha muestra.

39. Procedimiento de cribado para el cáncer en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con el anticuerpo aislado o el fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37, y determinar la unión de dicho anticuerpo o fragmento con una diana como indicador del cáncer.

40. Procedimiento de diagnóstico de un estado canceroso en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula reactiva inmune que contiene una muestra tomada de dicho paciente con una línea celular transfectada con la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, y determinar la interacción de dicha línea celular transfectada con dicha célula inmunoreactiva, siendo indicativa dicha interacción de dicho estado canceroso.

41. Procedimiento de la reivindicación 40, en donde dicha célula inmune reactiva que contiene una muestra comprende sangre o suero.

42. Procedimiento para determinar la regresión, progresión o inicio de un estado canceroso que comprende seguir una muestra tomada de un paciente con dicho estado canceroso por (i) una proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, (ii) un péptido derivado de dicha proteína o (iii) células T citolíticas específicas de dicho péptido y una molécula MHC con la cual se compleja de manera no covalente, en donde la cantidad de dicho parámetro es indicativa de la progresión o regresión o inicio de dicho estado canceroso.

43. Procedimiento de la reivindicación 42, en donde dicha muestra aislada es un fluido corporal, exudado o una muestra de tejido.

44. Procedimiento de la reivindicación 42, que comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une de manera específica con dicha proteína o péptido.

45. Procedimiento de la reivindicación 44, en donde dicho anticuerpo o fragmento está marcado con una etiqueta radioactiva o un enzima.

46. Procedimiento de la reivindicación 44, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

47. Procedimiento de la reivindicación 44 o reivindicación 45, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento F(ab)'_{2}.

48. Procedimiento de la reivindicación 44, en donde el anticuerpo o fragmento está producido de manera recombinante.

49. Procedimiento de la reivindicación 48, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

50. Procedimiento de la reivindicación 48, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

51. Procedimiento de la reivindicación 42, que comprende amplificar el RNA que codifica dicha proteína.

52. Procedimiento de la reivindicación 42, en donde dicha amplificación comprende llevar a cabo la reacción de la polimerasa en cadena.

53. Procedimiento de la reivindicación 42, que comprende poner en contacto dicha muestra con una molécula de ácido nucleico que híbrida de manera específica con una molécula de ácido nucleico que codifica para o expresa dicha proteína.

54. Procedimiento de la reivindicación 42, que comprende ensayar dicha muestra para dicha proteína.

55. Procedimiento de diagnóstico de un estado canceroso que comprende evaluar una muestra tomada de un sujeto por una célula inmunoreactiva específica para un péptido derivado de una proteína codificada por un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, complejada con una molécula MHC, siendo indicativa la presencia de dicha célula inmunoreactiva de dicho estado canceroso.

56. Procedimiento de preparación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto afectado por un estado canceroso, que comprende poner en contacto una muestra que contiene células inmunoreactivas extraída del sujeto con una línea celular de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en condiciones que favorezcan la proliferación de dichas células inmunoreactivas.

57. Célula transfectada con (i) una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula MHC o HLA que presenta un péptido procedente de una proteína codificada por dicho ácido nucleico, para utilizar en el tratamiento de un sujeto con un estado cancerosos, en donde dicho péptido está presentado por células asociadas con dicho estado canceroso.

58. Utilización de la célula de la reivindicación 57 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de dicho estado canceroso, dicha utilización comprendiendo el tratamiento de dichas células para volverlas no proliferativas.

59. Utilización de un reactivo que consiste esencialmente en células no proliferativas que tienen expresadas en su superficie el complejo no covalente de la molécula MHC y el péptido procedente de una proteína codificada por el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece un estado canceroso.

60. Utilización de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, uniéndose de manera específica dicho anticuerpo o fragmento a una proteína codificada por el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un péptido derivado de dicha proteína, expresada en una célula cancerosa, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece un estado canceroso, estando acoplado dicho anticuerpo o fragmento a un agente anticanceroso, en una cantidad suficiente para tratar dicho estado canceroso.

61. Utilización de la reivindicación 60, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

62. Utilización de la reivindicación 60, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento F(ab')_{2}.

63. Utilización de la reivindicación 60, en donde dicho anticuerpo o fragmento está producido de manera recombinante.

64. Utilización de la reivindicación 63, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

65. Utilización de la reivindicación 63, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

66. Utilización de la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, la vacuna de la reivindicación 27 o la composición de materia de la reivindicación 30 en la fabricación de un medicamento destinado a la prevención del inicio de un estado canceroso.

67. Utilización del antígeno aislado asociado al cáncer de la reivindicación 17, que comprende toda la secuencia de aminoácidos para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de un estado canceroso.

68. Procedimiento para determinar la eficacia de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28, o de una vacuna que comprende la composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 o la composición de materia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, después de la administración de dicha vacuna a un sujeto, que comprende determinar los anticuerpos en una muestra tomada de dicho sujeto que se une a dicha vacuna o a una molécula que comprende dicha vacuna, en donde un cambio en el nivel de dichos anticuerpos después de la administración de dicha vacuna respecto a dicho nivel antes de la administración es indicativo de la eficacia o carencia de la misma.

69. Procedimiento de la reivindicación 56, la célula de la reivindicación 57, o la utilización de acuerdo con las reivindicaciones 59-67 en donde un sujeto con dicho estado canceroso tiene por lo menos uno de los anticuerpos contra la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o células T citolíticas específicas para complejos de moléculas de HLA y un péptido derivado de dicha proteína en un fluido corporal de dicho sujeto.