CN1308671A - 髓磷脂碱性蛋白肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及以脱髓鞘为特征的中枢神经系统自身免疫疾病的治疗。特别地,本发明涉及来源于人类髓磷脂碱性蛋白(MBP)的新型肽。当这些肽与适当的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合时,可用于多发性硬化症及其它脱髓鞘性自身免疫疾病的治疗。

Description

髓磷脂碱性蛋白肽及其应用

                      发明领域

本发明一般涉及以脱髓鞘为特征的中枢神经系统自身免疫疾病的治疗。特别地，本发明涉及来源于人类髓磷脂碱性蛋白的新型肽。这些肽可单独或与适当主要组织相容性复合物(MHC)分子结合作为药物，用于多发性硬化症及其它脱髓鞘性自身免疫疾病的治疗。

                      发明背景

多发性硬化症(MS)是一种以脱髓鞘为特征的人类中枢神经系统(CNS)慢性炎性自身免疫疾病，它是由巨噬细胞、浆细胞和T细胞局部渗透到CNS中而引起的(Allen(1991)多发性硬化症病理学，p341，见McAlpine多发性硬化症，Matthewse，et al.，eds，Churchill Livingstone，Edinburgh)。MS是一种作用于髓磷脂及产生髓磷脂的少突胶质细胞的自身免疫性疾病。在MS及其它脱髓鞘病中，对髓磷脂的成分，髓磷脂碱性蛋白(MBP)，具有特异性的T细胞克隆可导致CNS中的神经鞘脱髓鞘。除MBP限制性T淋巴细胞克隆之外，脱髓鞘性炎性病变还包含多种能够介导组织损伤的非限制性免疫细胞(Zamvil(1990)Ann.Rev.Immunol.8：579-621；Wucherpfenning(1991)Immunol.Today 12：277-282；Martin(1992)J.Immunol.148：1359-1366；Martin(1992)Ann.Rev.Immunol.10：153-187)。

主要组织相容性复合物(MHC)II型(DR)分子是出现在抗原加工/呈递细胞(APCs)表面的异二聚体。在脱髓鞘病中，APC II型分子可把来源于髓磷脂和少突胶质细胞的MBP自身肽“呈递”给辅助性(CD4+)T淋巴细胞。该II型分子将肽精确呈递给T细胞是通过在“肽结合位点”或在分子结构上位于离细胞膜最远端的沟内与这种肽相结合而实现的。这种肽结合位点，或抗原结合位点，还被称为“抗原结合袋”或“MHC沟”(Brown(1993)Nature 364：33-39)。

肽与肽结合位点的结合取决于这种肽及II型分子的一级氨基酸序列。只有肽与II型多肽间发生高亲和性结合才可形成一种复合物，该复合物将在细胞外被呈递给T细胞。这种分子间吸引的亲和力，或强度，的决定因素与所有肽：多肽结合反应的决定因素相同，例如构象、氢键、电荷、离子相互作用等。由一级序列引起的限制可进一步受到尺寸限制的影响；肽结合位点被认为可容纳长度约为8-20个氨基酸的肽(“抗原识别位”是指肽上可被MHC分子识别的部分)。因而抗原性多肽的不同部分通常由不同的II型分子呈递。因此，当一种肽被APC内化并经蛋白水解成片段时，特定的II型分子只与单一的或少量的肽发生高亲和力结合，即“特异结合”。由于个体中只表达有限数量的II型分子，因而来源于多肽抗原的所有肽组分中只有有限的部分可被呈递。

例如在MS的情况下，MBP的单一区域涉及与特定的一套II型分子结合，以协助产生抗髓磷脂的自身反应性T细胞克隆。一般认为，在某些MS患者中具有特定免疫优势的MBP肽及其结合的II型分子位于MBP肽的第83-102位残基(MBP83-102)，它能够结合被称为DRB1*1501或DRB5*0101的II型DR等位基因(在不同个体中可能还有其它II型等位基因和MBP肽介导MS或其它脱髓鞘病)。

辅助性CD4+T淋巴细胞对肽：II型复合物的识别是由T细胞克隆特异性受体(TCR)与该复合物的结合来介导的。TCR对该复合物的亲和力由它对II型分子及占据抗原结合袋的肽(肽可被TCR识别的部分称为“表位”)的吸引力所决定。TCR与APC复合物的高亲和性结合可激活T细胞，使其克隆增殖并分泌免疫调节细胞因子(可以是刺激性或免疫抑制性)。因此，II型多肽可引起抗原性肽(表位)特异性免疫应答的扩增。如果这种肽为自身肽，则应答即表现为自身免疫性反应。

对肽：II型复合物与TCR结合的能力进行干扰可抑制自身免疫性反应，或抑制其发展。例如，将抗MHC II型多肽的抗体给药可干扰复合物：TCR结合，并干扰由其导致的致病免疫反应。抗自身反应性TCR或T细胞克隆的抗体也具有相同效果。

替代的免疫抑制策略则是对T细胞需要由APC提供一种辅助刺激信号来加以利用。TCR与II型：肽的结合不足以激活CD4+T细胞。它还需要一种额外的“辅助刺激”信号(不是一种MHC分子)。所需的辅助刺激信号通常由APC细胞的一种表面蛋白提供。值得注意的是，如果没有APC的辅助刺激，II型：肽与TCR的结合不但不能够诱导T细胞活化，而且会导致再次诱发时出现抗原特异性无反应现象，这在体外被称为无反应性，在体内则称为耐受性(Boussiotis(1994)Curr.Opin.Immunol.6：797-807；Park(1997)Eur.J.Immunol.27：1082-1090)。这种抑制和再诱发无反应性被认为是由T细胞的克隆无反应性或免疫抑制细胞因子诱导的无反应性导致的。(Schwartz(1989)Cell 57：1073-1081；Quill(1987)J.Immunol.138：3704-3712)。

尽管长20个氨基酸的MBP83-102具有免疫优势，但在某些个体中经自然加工的MBP肽、合成的或重组的髓磷脂变体或能够以更高亲和力与II型分子和/或T细胞受体结合的MBP83-102肽也可具有治疗效果。这些肽通过，例如，将其作为诱导耐受性的可溶性II型：肽复合物进行给药，可成为更好的致病性自身免疫反应的抑制剂。本发明则提供能够与II型分子和TCRs结合的新型MBP肽，以此来满足这些需要及其它方面的需要。

目前对自身免疫疾病的治疗主要是治疗症状，而不是对疾病的病因进行干预。通常使用的广谱免疫抑制剂具有多种不良副作用。目前可用治疗方案的匮乏表明，急需鉴定出能够预防或抑制MHC限制性免疫应答但又可避免诸如对个体的全部免疫应答产生非特异性抑制等不良副作用的新型制剂。能够在辅助性CD4+T细胞水平对自身免疫应答进行选择性抑制的复合物可作为安全而又更有效的治疗手段。本发明则提供新型MBP肽及肽：II型分子复合物，以此来满足这些需要及其它方面的需要。

                       发明概述

本发明提供一种分离的髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。在一项实施方案中，这种分离的髓磷脂碱性蛋白肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。这种分离的髓磷脂碱性蛋白肽可与一异种序列相连。在一项实施方案中，该髓磷脂碱性蛋白肽与一异种序列相连形成一种融合蛋白。

本发明还提供一种能够特异性结合一种抗体的分离的髓磷脂碱性蛋白肽，该抗体可定向抗一种特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro氨基酸序列的肽。

在另一项实施方案中，本发明提供一种编码髓磷脂碱性蛋白肽的分离的核酸，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。编码的该髓磷脂碱性蛋白肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。在一项实施方案中，该分离的核酸含有序列编号：1的序列。

本发明还提供一种组合物，该组合物含有一种能够与T细胞受体结合的MHC II型复合物，该复合物基本包括：一种含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHC II型多肽，该成分由与作用于髓磷脂碱性蛋白的自身免疫疾病相关的等位基因编码，其中该II型成分在不存在去污剂或脂类的生理条件下为可溶性；和一种具有Phe-X-Lys-R₁-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列的髓磷脂碱性蛋白，其中X为任意一种氨基酸，R₁为Asn或Gln；其中该髓磷脂碱性蛋白肽结合在MHC II型成分的抗原结合袋上。该髓磷脂碱性蛋白肽可具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。该组合物可包含一种融合蛋白和/或一种效应组合物。在可选实施方案中，该自身免疫疾病为多发性硬化症，或该II型多肽含有HLA DR2的抗原结合袋。

本发明提供一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的一种肽，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

本发明还提供一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的含有能够与T细胞受体结合的MHC II型复合物的一种组合物，该复合物基本包括：一种含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHC II型多肽，该成分由与作用于髓磷脂碱性蛋白的自身免疫疾病相关的等位基因编码，其中该II型成分在不存在去污剂或脂类的生理条件下为可溶性；和一种具有Phe-X-Lys-R₁-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列的髓磷脂碱性蛋白，其中X为任意一种氨基酸，R₁为Asn或Gln；其中该髓磷脂碱性蛋白肽结合在MHC II型成分的抗原结合袋上。

本发明提供一种抗体，该抗体在免疫反应条件下能够与一种髓磷脂碱性蛋白肽发生特异性免疫反应，该肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列。在另一项实施方案中，本发明提供一种抗体，该抗体在免疫反应条件下能够与一种含有由编码髓磷脂碱性蛋白肽的核酸编码的肽的髓磷脂碱性蛋白肽发生特异性免疫反应，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

本发明提供一种方法，用于抑制主体中由T细胞介导的抗髓磷脂碱性蛋白免疫应答，该方法包括将能够有效治疗T细胞介导免疫应答剂量的一种分离的髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽向主体给药，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

本发明提供一种方法，用于抑制主体中由T细胞介导的抗髓磷脂碱性蛋白免疫应答，该方法包括将一种含有能够与T细胞受体结合的MHC II型复合物的组合物向主体给药，该复合物基本包括：一种含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHC II型多肽，该成分由与作用于髓磷脂碱性蛋白的自身免疫疾病相关的等位基因编码，其中该II型成分在不存在去污剂或脂类的生理条件下为可溶性；和一种具有Phe-X-Lys-R₁-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列的髓磷脂碱性蛋白，其中X为任意一种氨基酸，R₁为Asn或Gln；其中该髓磷脂碱性蛋白肽结合在MHC II型成分的抗原结合袋上。

本发明提供一种方法，用于抑制主体中由T细胞介导的抗髓磷脂碱性蛋白免疫应答，其中由T细胞介导的该免疫应答可导致一种神经系统病变。在一项实施方案中，该神经系统病变为多发性硬化症。

本发明提供一种方法，用于鉴定抗原上的一种T细胞表位，当该表位结合在MHC II型分子的抗原结合袋上时能够与T细胞受体结合，这种结合可通过T细胞表达的该T细胞受体而触发一种细胞外酸化反应，该方法的步骤包括：a)提供一种组合物，该组合物含有结合在MHC II型分子的抗原结合袋上的T细胞表位；b)将表达该T细胞受体的T细胞与该表位接触；以及c)测量细胞外酸化作用，其中细胞外酸化作用的改变可表明T细胞表位与该T细胞受体的结合。在一项实施方案中，细胞外酸化作用的改变是利用微生理测量仪来进行测量。

参考详细说明书的其余部分、附图以及权利要求可对本发明的本质和优点作进一步的了解。

文中引用的所有出版物、专利及专利申请在此均特意引入作为参考。

                      附图简述

图1A显示在实施例1的研究中使用的MBP肽。图1B显示在实施例1的研究中使用的多种具有丙胺酸取代残基的MBP肽。

图2A、2B和2C显示实施例1的研究结果，分别表明由6种N端截尾的MBP肽引起的γ-IFN、TNF-β水平的增加以及细胞外酸化率的增加。图2D、2E和2F分别显示实施例1中5种N端截尾的MBP肽对γ-IFN、TNF-β及酸化率的影响的比较结果。

图3A、3B和3C分别显示实施例1中由C端截尾的MBP肽诱导的γ-IFN、TNF-β及酸化率的比较研究结果。图3D、3E和3F分别显示实施例1中由C端截尾的MBP肽诱导的γ-IFN、TNF-β及酸化率的比较研究结果。

图4A、4B和4C分别显示实施例1中由II型DRB5*0101呈递给SS8T细胞时可导致γ-IFN、TNF-β及酸化率增加所必需的MBP肽残基的研究结果。图4D、4E和4F分别显示实施例1中由II型DRB5*0101呈递给SS8T细胞时可导致γ-IFN、TNF-β及酸化率增加所必需的MBP肽残基的研究结果。

图5A的突出部分(加框区域)显示TCR识别的核心序列，即MBP(91-100)(序列编号：38)。图5B(以箭头)显示参与TCR接触的关键MBP氨基酸残基，即F-91、K-93、N-94、I-95和V-96。

                      发明详述

本发明涉及一些方法和组合物，用来抑制免疫系统中引起不良自身免疫的那些方面。本发明首次描述了一套来源于人类髓磷脂碱性蛋白(MBP)的新型肽，这些肽可用于自身免疫性脱髓鞘病的治疗，特别是用于多发性硬化症(MS)的治疗。本发明提供含有新型MBP肽的治疗组合物，用于，例如，诱导口服耐受性或一般耐受性。本发明还提供一种针对T细胞介导的自身免疫反应的可溶性MBP肽：II型分子复合物。该复合物通过与能够结合MBP：II型复合物的自身反应性T细胞受体(TCR)结合而作用于可与MBP反应的T细胞克隆。MBP：II型复合物与T细胞的结合在治疗自身免疫性脱髓鞘病或抑制其发展方面具有治疗效果。尽管本发明不局限于任何特定的作用机制，但本发明的组合物可通过，例如，诱导T细胞克隆的无反应性和耐受性或诱导细胞因子介导的免疫抑制性免疫应答而发挥其药学活性。

本发明提供一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的一种肽，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。将这种肽单独给药可用来诱导口服耐受性，口服耐受性可作为由蛋白的口服给药导致的全身性抗原特异性免疫次反应的一种征兆。口服耐受性的产生机制取决于抗原(肽)的给药量。低剂量利于诱导调节性免疫抑制性辅助性CD4+T细胞。较高剂量则利于产生克隆缺失和无反应性(耐受性)。由口服低剂量抗原诱导出的调节性T细胞若再次受激会分泌出免疫抑制性细胞因子，这些细胞因子能够以非抗原特异性方式对炎性应答进行抑制。将自身抗原经口服给药可用来抑制多种试验性自身免疫疾病，其中包括研究得最广泛的MS动物模型、鼠脱髓鞘病试验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。鼠MBP肽已被用来产生抗原特异性口服耐受性，并被用来预防急性EAE的发展(Bitar(1988)Cell.Immun.112：364-370；Higgins(1988)J.ofImmun.140：440-445；Khoury(1992)J.Exp.Med.176：1355-1364；Whitacre(1996)Clin.Immunol.Immunopathol.80：S31-S39)。在一项研究中，将牛髓磷脂口服给药于MS患者可诱导出能够分泌免疫抑制细胞因子TGF-β-1的T细胞(Fukaura(1996)J.Clin.Invest.98：70-77)。因此，本发明的新型人MBP肽除能够有效用来诱导口服耐受性外，还可用来产生抗原特异性免疫抑制反应。

本发明还涉及一些纯化的复合物，这些复合物至少含有二体II型分子或单链(单体)亚基II型分子的一种抗原有效结合部分，以及一种本发明的MBP肽。“抗原有效结合部分”是指与MBP肽结合的亲和力足以产生一种可被自身反应性TCR识别并特异结合的复合物所必需的最少量的二体或单体II型分子。含有MBP肽和适当II型分子的本发明所述复合物可通过共价或非共价方式进行结合或缔合。本发明的复合物中也可含有第三种成分，如“效应剂”成分。该效应剂成分可以是一种细胞毒素剂，即毒素、放射性同位素、凋亡诱导剂等，以选择性消除或中和自身免疫性靶细胞群体。

此外，本发明涉及将本发明的肽和复合物作为活性成分的药用组合物。这些药用组合物可用来减量调节或消除免疫系统中的自身反应成分，并可用来治疗由T细胞介导的自身反应性脱髓鞘性免疫应答。本发明提供一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的一种MBP肽：II型复合物。该复合物可选择性结合MBP自身反应性T细胞。尽管本发明不局限于任何可使这些组合物具有药学活性的特定方法，但这些肽和复合物可诱导克隆无反应性/耐受性，或可诱导细胞因子介导的免疫抑制性免疫应答。这些复合物可进一步与细胞毒素剂结合，以消除特定的自身反应性靶T细胞。编码MBP肽及MHC II型DR等位基因的核酸以及这些核酸的表达

本发明提供新型髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，由这些MBP肽及至少含有足以形成抗原结合袋的II型分子细胞外区域的MHC II型多肽形成的复合物，以及编码这些MBP肽和II型多肽的核酸。本发明除提供合成的MBP和II型核酸外，还提供以重组方式形成的核酸、MBP肽和II型多肽。由于编码这些肽和蛋白的核酸可在体外或体内表达，因此本发明提供表达这些序列的多种方法，包括表达盒表达、载体表达、细胞系表达、转基因植物表达及转基因动物表达等。

实施本发明时可协同使用该领域所了解的任何方法或协议，它们在科学文献和专利文献中均有详细描述。因此，在讨论与本发明所述新制剂和新方法相关的示范性方法和实例之前，仅对少数的一般技术进行了描述。

一般技术

本发明的MBP肽编码基因、MBP：II型复合物编码基因及核酸，无论是RNA、cDNA、基因组DNA或是其混合物，可分离自多种来源；可进行遗传操作；可重组表达；或可体外合成。编码本发明所述MBP及MBP：II型复合物的核酸能够以转化细胞裂解物形式或部分纯化或基本纯化的形式在转基因植物和转基因动物、转化细胞和转化细胞系中表达。对编码本发明所述MBP及MBP：II型复合物的基因进行核酸操作的技术，如定点诱变、文库创建、亚克隆至表达载体、探针标记、DNA测序、DNA杂交等，在科学文献及专利文献中均有描述，例如，可参考Sambrook，ed.，《分子克隆：实验指南(第二版)》，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboatory，(1989)(“Sambrook”)；《新编分子生物学实验指南》，Ausubel，ed.John Wiley & Sons，Inc.，New York(1997)(“Ausubel”)；和《生物化学与分子生物学实验技术：与核酸探针的杂交》，第一部分，原理及核酸制备，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)(“Tijssen”)。测序方法通常采用双脱氧测序法(测序酶，U.S.Biochemical)，而其它可用的试剂盒及方法已为该领域的技术人员所熟知。

根据文中所示方法可利用该领域技术人员所熟知的多种一般方法中的任何一种对核酸和蛋白进行检测、分离和定量。其中包括，例如，生化分析方法如NMR、分光光度法、放射照相术、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析法(TLC)及超扩散层析法等、多种免疫学方法如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIAs)、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、免疫荧光测定、DNA印记分析、RNA印记分析、点印记分析等，以及凝胶电泳、RT-PCR、定量PCR、其它核酸扩增或目标扩增或信号扩增方法、放射性标记法、闪烁计数法和亲和层析法。

在核酸中引入突变可通过多种传统方法来实现，这些方法在科学文献及专利文献中均有详细的描述。例如，重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)是实现高效定位诱变的一种快速方法(Urban(1997)Nucleic Acids Res.25：2227-2228)。

MHC II型DR等位基因

本发明提供编码新型髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽的核酸和编码至少含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHC II型多肽的核酸。本发明提供一个实例来说明人类DR II型等位基因，特别是称为DRB1*1501和DRB5*0101的等位基因，这些基因可编码能够与本发明所述MBP肽结合的多肽(例如，参考Weber(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11049-11053)。但本发明的复合物并不局限于这些等位基因或其相应的II型多肽。本发明的MBP：II型复合物包括任何一种含有MHC II型抗原结合袋的多肽或其功能等价物，它们均能够与本发明的MBP肽结合，并且其亲和力足以在本发明的方法中使用。已知的这些DR等位基因和II型多肽的鉴定方法，如利用Medline、GenBank等电子数据库，在科学文献及专利文献中均有详细描述。具有能够与特定肽，如本发明的MBP肽，结合的抗原结合袋的多肽的MHCII型DR等位编码基因的鉴定方法在科学文献及专利文献中亦有详细描述(例如，可参考Rammensee(1995)Immunogenetics 41：178-228；Sinigaglia(1994)Curr.Opin.Immunol.6：52-56)。

在本发明的一项实施方案中，该II型：肽复合物可溶于水。通过去除跨膜区(通常为疏水性)氨基酸残基可赋予II型多肽水溶性。其最有效的实现方法是利用重组方法对DR等位基因进行重新设计并表达出截尾形式的II型分子。跨膜区的去除可通过将残基完全去除或利用重组方法将II型编码序列重新设计成以亲水性残基取代疏水性残基的方式来实现。这也便于在重组表达后将水溶性II型多肽回收。例如，失去跨膜能力的II型分子会被直接分泌到重组表达宿主的培养基中。细胞质残基或细胞外残基的进一步去除可有效地消除潜在的免疫原性表位。在一项实施方案中，核酸被设计成可重组表达一种能够与肽结合位点/TCR结合的最小形式的多肽，即多肽的量刚刚满足能够与本发明所述MBP肽结合，并且其亲和力足以被适当自身反应性TCR识别且足以在本发明的方法中使用。能够与肽结合的多肽无论是最小形式的肽结合位点分子，还是分离的或重组的全长II型分子、改变的II型分子或截尾的II型分子，均可采取二体或单体形式。其它II型多态性DR等位基因可利用多种方法来加以鉴别和表征，这些方法包括i)利用计算机在DNA数据库中搜索含有上述II型DR分子的保守序列的DNAs，ii)用来源于已知DR基因序列的探针与mRNA、cDNA或DNA序列或文库杂交，并且iii)利用与不同DR基因中高度保守的区域互补的引物经PCR或其它信号扩增或目标扩增技术。

也可将核酸扩增方法应用于II型多态性等位基因的鉴定、分离和产生。适当的扩增方法包括，但并不局限于：聚合酶链反应，PCR(《PCR方法及应用指南》，ed.Innis，Academic Press，N.Y.(1990)和《PCR策略》(1995)，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.(Innis))；连接酶链反应(LCR)(Wu(1989)Genomics 4：560；Landegren(1988)Science 241：1077；Barringer(1990)Gene89：117)；转录扩增(Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173)；以及自持序列复制(Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：1874)；Q-β复制酶扩增(Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491，Q-β复制酶自动扩增测定；Burg(1996)Mol.Cell.Probes 10：257-271)和其它由RNA聚合酶介导的技术(如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；另外也可参考Berger(1987)Methods Enzymol.152：307-316、Sambrook、Tijssen、Ausubel以及Mullis(1987)美国专利号4,683,195和4,683,202。

核酸测序

对分离的MBP编码核酸和II型编码核酸的序列进行鉴定可以，例如，确定并表征可编码能够与MBP肽结合的多肽的DR等位基因的种类；验证以合成方法产生或克隆的核酸的序列；验证突变，等等。MBP编码序列和II型编码序列可作为载体的插入片段、由载体释放或分离出的插入片段或其它多种形式中的任何一种(即作为扩增产物)来加以测序。可利用限制酶使MBP编码片段和II型编码片段从载体中释放，也可通过PCR将其扩增，或利用聚合酶进行转录。测定插入片段的序列以确定全长编码序列时，可使用与N端或C端互补的引物，也可使用与最初的噬菌体或其它载体的插入点互补的引物。在科学文献及专利文献中描述了多种众所周知的核酸测序技术，例如，可参考Rosenthal(1987)见上文；Arlinghaus(1997)Anal.Chem.69：3747-3753；Dubiley(1997)Nucleic Acids Res.25：2259-2265；也可利用生物传感器芯片对核酸进行鉴定和测序。

重组MBP肽及II型多肽的表达

本发明提供用于对本发明所述复合物中使用的新型MBP肽及II分子进行重组表达的方法和试剂。有多种传统技术可用来将本发明所述核酸引入基因组或引入细胞的胞质或核中并加以表达，这些方法在科学文献及专利文献中均有详细描述。例如，可参考Roberts(1987)Nature 328：731；Berger(1987)见上文；Schneider(1995)ProteinExpr.Purif.6435：10；Sambrook、Tijssen或Ausubel。生物试剂和实验设备的产品信息也会提供有关已知生物学方法的信息。本发明使用的启动子和载体可由天然资源中分离，也可由ATCC或GenBank文库等来源获取，或利用文中所述的合成或重组方法进行制备。以下将对选定的一些与该技术相关的说明性一般示例或特定示例进行阐述。

载体及转录调控因子

本发明除提供用于制备文中所述新型核酸的方法和制剂外，还进一步提供利用组成型和诱导型的转录及翻译顺式(如启动子和增强子)和反式作用调控元件经新型表达盒、载体、转基因植物及转基因动物来表达这些核酸的方法和制剂。天然的、重组的或合成的MBP肽或多肽的编码核酸的表达方法是通过操作将编码区与一种启动子(可以是组织特异型、组成型或诱导型)相连接，并将构建体接入一种表达盒(如一种表达载体)，然后将所得构建体引入一种体外反应体系或适当的宿主细胞或组织中。本发明的核酸也可利用合成方法来产生。转录及翻译调控元件包括转录与翻译的起始序列、启动子和增强子、转录与翻译的终止子、多腺苷酸化序列，以及可用来将DNA转录成RNA的其它序列。在构建本发明的重组表达盒、载体和转基因体时，可使用一种启动子片段使植物或动物的所有组织中均能够直接表达所需核酸。在生理条件下可持续刺激表达的启动子称为“组成型”启动子，这些启动子可在细胞发育或分化的大多数环境条件和状态下发挥作用。这些表达系统可选择性含有至少一种独立的终止子序列、允许在植物、真核或原核生物体内进行表达盒复制的序列或其联合序列(如穿梭载体)，以及用于植物系统、原核系统或真核系统等特定表达系统的选择标记。为了确保在不同条件下均能够正确表达多肽，也可在编码区的3’端加入多腺苷酸化区域。

本发明的核酸可以在表达盒、载体或病毒内表达，它们可利用，例如，游离表达系统在细胞内进行瞬时表达。可表达蛋白的表达载体已为该领域所熟知。表达盒或表达载体内可掺入选择标记，以使转化细胞和维持游离性及游离复制的编码序列具有可选择的表型，从而无需将其整合到宿主的基因组内。举例来说，该标记可编码抗生素抗性，特别是抗氯霉素、卡那霉素、G418、博莱霉素或潮霉素的抗性，也可编码除草剂抗性，如抗chlorosulfuron？？或Basta的抗性，借此可筛选出已被特定DNA序列转化的细胞，可参考如Blondelet-Rouault(1997)Gene 190：315-317；Aubrecht(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.281：992-997。由于赋予对新霉素或潮霉素等底物的抗性的可选择标记基因只能应用于组织培养，因而也可使用化学抗性基因作为体外和体内的可选择标记。

转化体及转基因植物和转基因动物的产生

本发明提供多种用于表达本发明所述MBP肽、II型多肽和肽：II型复合物的体内表达系统，其中包括转化细胞、转基因植物和转基因动物。可使用的体内表达系统包括细菌、酵母、昆虫(杆状病毒)、植物以及哺乳动物细胞系统。所用系统的选择取决于多种因素，如所需的活性和数量。

有几种众所周知的方法可用来将核酸引入动物、植物、细菌和其它细胞，这一过程通常被称为“转化”，这些方法中的任何一种都可在本发明的方法中使用(例如，可参考Sambrook、Ausubel或Tijssen)。用于对广泛的动物及植物细胞进行转化的体内表达系统和技术已众所周知，并且在科技文献中均有描述。例如，对植物细胞进行转化可参考Weising，Ann.Rev.Genet.22：412-477(1988)，对动物及细菌细胞进行转化可参考Sambrook或Tijssen。

II.MBP肽和MHC II型DR多肽

本发明提供新型髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽、所含多肽量至少能够与本发明所述MBP肽结合并且其亲和力足以被适当自身反应性TCR识别的II型多肽，以及II型：MBP肽复合物。本发明提供(由天然资源)分离的、合成的，以及重组产生的MBP肽和II型多肽。这些肽和蛋白可通过体外或体内的重组表达产生。本发明的肽、多肽及复合物可利用该领域所了解的任何方法来加以制备和分离，而本发明也提供了一些用于产生这些蛋白的示范方法。此外，II型：肽复合物的制备方法在，例如，1993年3月16日公开的美国专利号(USPN)5,194,425；1992年7月14日公开的5,130,297；1994年2月8日公开的5,284,935；1993年11月9日公开的5,260,422；和1995年11月21日公开的5,468,481中均有讲解。

本发明的MBP肽和II型：肽复合物可利用该领域熟知的化学方法来全部或部分合成(例如，可参考Caruthers(1980)Nucleic AcidsRes.Symp.Ser.215-223；Horn(1980)Nucleic Acids Res.Symp.Ser.225-232；Banga，A.K.，治疗性肽和蛋白、配制、方法及递送系统(1995)Technomic Publishing Co.，Lancaster，PA(“Banga”))。举例来说，肽的合成可通过多种固相技术来实现(例如，可参考Roberge(1995)Science 269：202；Merrifield(1997)Methods Enzymol.289：3-13)，自动合成则可利用，例如，ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)并根据厂商提供的说明来实现。

新合成的肽可通过制备型高效液相色谱方法(HPLC)来分离和基本纯化，例如可参考Creighton，蛋白、结构与分子原理，WH Freemanand Co，New York NY，1983。合成的肽组合物可通过氨基酸分析或测序(如Edman降解法；Creighton，见上文)来加以确认。也可利用激光解吸质谱法(MALDI-MS)在，例如，自动组装、裂解与脱保护化学、RP-HPLC分析与纯化，和终产物的结构确认等各种所需水平上对肽合成的过程进行评定(Moore(1997)Methods Enzymol.289：520-542)。电子溅射电离质谱法则是一种可用来验证肽的正确合成以及鉴定大多数合成副产物的快速简便方法(Burdick(1997)Methods Enzymol.289：499-519)。

此外，也可以在直接合成的过程中改变本发明所述肽和多肽的氨基酸序列，或其任何部分，并且/或可利用化学方法将本发明的肽和多肽与其它蛋白序列或其任何部分相连接，由此产生不同的多肽。本发明的改良肽和改良蛋白除了能够利用对核酸编码序列的操作，如定点诱变方法，来产生之外，也可以对多肽进行化学修饰以引入非天然氨基酸侧链(例如，可参考Paetzel(1997)J.Biol.Chem.272：9994-10003的一般方法)。作为另一实例，也可参考Gallivan(1997)Chem.Biol.4：739-749将含有生物素的氨基酸生物胞素引入特定位点；或参考Liu(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：10092-10097在体内将非天然氨基酸引入蛋白的特定位点；此外还可参考Koh(1997)Biochemistry 36：11314-11322。

也可利用该领域熟知的多种技术从天然资源，如表达适当DR等位基因的细胞系或具有适当基因型的患者，中分离适用于本发明的II型多肽。例如，可通过木瓜蛋白酶处理、3M KCl处理或去污剂处理来溶解细胞。也可使用去污剂来提取淋巴细胞的II型蛋白，然后再进行亲和纯化。此后可利用透析或选择性结合小珠，如Bio Beads，将去污剂去除。这些分子可分离自能够表达所需II型分子的任何细胞，如来源于具有适当基因型的个体，如患有脱髓鞘性自身免疫疾病的个体，的B淋巴细胞或T淋巴细胞。也可利用该领域的已知技术从通过转化而能够无限增殖的B细胞或T细胞，如利用复制缺陷型Epstein-Barr病毒转化的B细胞，中分离适当的MHC分子。

可利用该领域技术人员所了解的标准技术从分离的II型分子中分离单一亚基。例如，II型分子的α亚基和β亚基可利用SDS/PAGE和电洗脱来分离(例如，可参考Rothenhausler(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：352-354；Gorga(1987)J.Biol.Chem.262：16087-16094；Dornmair(1989)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54：409-416)。技术人员都将认可，还有多种分离分子的其它标准技术可以使用，如离子交换层析、尺寸排阻层析、凝胶渗透层析、HPLC、RP-HPLC，或亲和层析。例如可参考Banga。

在一项实施方案中，本发明的复合物还连接了一种额外的“效应剂”成分，以抑制或消除自身免疫反应。分子的“效应剂”部分可以是，例如，一种毒素、一种化学治疗剂、抗细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面分子的一种抗体、一种脂酶，或放射性同位素的一种毒性射线，如钇-90、磷-32、铅-212、碘-131或钯-109等放射性同位素发出的γ射线。该领域熟知的多种蛋白毒素包括，例如，蓖蔴毒蛋白、白喉毒素、gelonin、假单胞菌毒素和相思豆毒素。化学治疗剂则包括，例如，阿霉素、柔红霉素、氨甲蝶呤、细胞毒素和抗反义RNA。此外还可以使用抗生素。毒素或其它效应剂成分有时被包载在脂质体或右旋糖苷载体等递送系统中；此时，可将活性成分或该载体结合在II型：肽复合物上。

在制备本发明的药用组合物时，通常需要对这些肽或复合物进行修饰，以改变其药物动力学和体内分解(下文将进一步讨论)。例如，适于提高复合物的血清半衰期的处理方法包括，将参与从血流中清除该复合物的糖类去除。优选的是通过这种处理基本上将所有糖类部分去除。基本上将所有糖类部分去除是指至少约75％被去除，优选的约为90％被去除，最优选的则约为99％的糖类部分被去除。同样能够发挥作用的是与可溶性大分子结合，如蛋白、多糖，或合成聚合物如聚乙二醇。其它方法还包括，将复合物保护在含有蛋白、脂类(如下文讨论的脂质体)、糖类或合成聚合物等物质的载体中。

复合物形成

该领域所了解的任何标准方法均可用来形成本发明的II型多肽：MBP肽复合物。举例来说，可通过，例如，简单地将两种成分混合来实现本发明的肽与抗原结合位点的非共价结合。也可利用标准方法用，例如，光亲和标记使它们与抗原结合袋共价结合(例如，可参考Hall(1985)Biochemistry 24：5702-5711；Leuscher(1990)J.Biol.Chem.265：11177-11184；Wraith(1989)Cell 59：247-255)。其它连接方式包括，例如，借糖蛋白上的糖类/外源凝集素基团，如II型α链和/或β链的糖类部分，而进行附着(Husain(1995)Biochem.Mol.Biol.Int.36：669-677)。利用碳化二亚胺进行脱水反应的方法也可采用。还可以使用N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-二硫吡啶基)-丙酸酯(SPDP)、取代的亚氨基硫代烷、戊二醛等异双功能衔接物(例如，可参考Traut(1995)Biochem.CellBiol.73：949-958；Haselgrubler(1995)Bioconjug.Chem.6：242-248；Carroll(1994)Bioconjug.Chem.5：248-256)。作为选择，也可以将II型：肽复合物设计成一种连续的重组多肽。也可参考1996年12月19日发表的PCT出版号WO96/40944；1996年12月19日发表的WO96/40194和1997年11月6日发表的WO97/04360。

还可以利用这些方法将效应剂或其它(用于纯化等，见上文所述)融合蛋白组分连接在该复合物上。用于制备该复合物的序列取决于所用成分的情况。例如在一项示范性协议中是通过，例如，将肽与MHC亚基成分相混合而使其相互接触，由此使肽成分与MHC亚基成分非共价结合。然后再与效应剂共价结合。作为选择，也可以先将效应剂与MHC亚基连接，然后用该连接物连接MBP肽成分。如果效应剂本身是一种蛋白，则可利用重组技术由适当的编码DNA直接制备出完整的复合物。

复合物评定

本发明的肽和MBP：II型复合物可利用该领域熟知的多种体外模型来加以测定。如上所述，活化CD4+T细胞和TCR不足以结合II型：肽。它们还需要一种额外的“辅助刺激”信号。本发明的II型：肽复合物与TCR的相互作用缺乏一种辅助刺激信号。因此，需诱导出抗原特异性T细胞的无反应性状态(Boussiotis(1994)Curr.Opin.Immunol.6：797-807；Park(1997)Eur.J.Immunol.27：1082-1090)。这种“耐受性”或“无反应性”免疫抑制及二次诱发无反应性可利用T细胞克隆无反应性产生，或利用由免疫抑制细胞因子诱导的无反应性产生，或可两种共同使用(Schwartz(1989)Cell57：1073-1081；Quill(1987)J.Immunol.138：3704-3712)。

在一种示范性体外系统中，可将该复合物与自身反应性T细胞共保温，并用MBP再次诱发该细胞。来源于MS等脱髓鞘病患者的周围血T细胞或髓磷脂(MBP)反应性T细胞均可以使用。分析前可将T细胞分离。在将假定的耐受原给药之前，可利用抗原(MBP或髓磷脂)再次体外刺激自身反应性T细胞(使用同系APCs)。也可以使用“静息”T细胞(在体外不被刺激的细胞)。将这些T细胞用不同量的本发明所述复合物处理不同的时间。复合物与MBP反应性T细胞的结合可导致体外自身免疫反应的抑制或消除。

免疫抑制性或二次诱发无反应性(即耐受性、无反应性)的程度可通过监测细胞增殖、细胞代谢、细胞因子或淋巴因子的分泌，或任何形式的细胞活化来加以测量。T细胞活化可利用该领域熟知的多种方法来进行测量。举例来说，可测量，例如，³H-胸苷或3-(4，5-二甲基-噻唑-2-7’)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)的摄取以评定T细胞的增殖(例如，参考Liu(1997)J.Neurochem.69：581-593)。由于T细胞活化后可合成并分泌细胞因子，因此，作为选择，也可以通过测量细胞因子的转录、翻译或分泌来评定II型：肽复合物的免疫抑制效果。有多种细胞因子和淋巴因子，如白细胞介素、干扰素(INFs)(如γ-INF)、肿瘤坏死因子(TNFs)(如β-TNF)等，可以被定量。由于静息T细胞与可溶性MHC-II型肽复合物长期保温会导致T细胞凋亡，因而也可以对细胞死亡进行监测(Arimilli(1996)Immunol.And Cell Biol.74：96-104)。细胞死亡的监测可采用多种已知的方法，如染料排除渗透性实验等。凋亡则可通过，例如，细胞DNA碎裂、观测(如利用透射电镜)、检测以及对bcl-2等凋亡相关蛋白进行定量等方法来加以评定(例如，参考Arimilli(1996)见上文)。

对本发明所述II型：肽复合物的免疫抑制效应进行评定的优选方法是利用微生理测量仪来测量T细胞内酸性代谢物的产生速率。利用该仪器可快速而方便地检测复合物与TCRs的相互作用效果。T细胞经TCR：II型：肽复合物的结合反应刺激后，其活化过程中最早出现的可检测事件是淋巴细胞的代谢增加，这可通过其酸性副产物反映出来。微生理测量仪可测量哺乳动物细胞中主要代谢产物，乳酸和二氧化碳，的酸度。利用轻便型可寻址电势传感器能够方便地测定培养有少量细胞样品的培养基中的极小量酸度变化。酸化率可作为所测细胞代谢率的测量标准。例如，可参考Parce(1989)Science 246：243-247；Owicki(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4007-4011；Renschler(1995)Cancer Res.55：5642-5647；Beeson(1996)J.Exp.Med.184：777-782。

在自身反应性T细胞与同系APCs的混合物中加入MBP肽或髓磷脂多肽可导致酸释放的增加，这是由自身反应性TCR与结合在APC上的II型：MBP肽复合物的抗原特异性结合造成的。因此，本发明所述MBP肽或II型：MBP肽复合物的免疫抑制能力可通过先在自身反应性T细胞/APC培养物中加入复合物，然后进行抗原(MBP或髓磷脂)诱发来加以评定。细胞活化作用可用来表明免疫抑制性，其缺乏或相对降低可通过细胞外酸化作用的减少或缺乏来测量。

在一项实施方案中使用了一种带有效应剂成分的本发明所述复合物。其处理可分为两步：首先用II型：MBP肽复合物处理个体以减量调节其免疫应答；再用复合物及效应剂成分处理以实现进一步的减量调节。

III.多肽的检测与纯化

本发明还提供通过多种方法对本发明所述MBP肽和II型多肽复合物进行分离、检测或定量的方法和试剂。

抗体

在一项实施方案中，本发明提供能够在免疫反应条件下与本发明的MBP肽发生特异性免疫反应的抗体。这些抗体可用于本发明所述MBP肽或复合物的分离、检测或定量。多克隆抗体和单克隆抗体的产生方法已为该领域的技术人员所了解，并且在科学文献和专利文献中均有所描述，例如，可参考Coligan，新编免疫学实验手册，Wiley/Greene，NY(1991)；Stites(eds.)基础免疫学与临床免疫学(第7版)Lange Medical Publications，Los Altos，CA(“Stites”)；Goding，单克隆抗体：原理与实践(第2版)AcademicPress，New York，NY(1986)；Kohler(1975)Nature 256：495；Harlow(1988)抗体：实验手册，Cold Spring Harbor Publications，New York。这些技术包括从噬菌体重组抗体文库(“噬菌体显示文库”)中选择抗体。可参考Huse(1989)Science 246：1475；Ward(1989)Nature 341：544；Hoogenboom(1997)Trends Biotechnol.15：62-70；Katz(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26：27-45。重组抗体可按照Norderhaug(1997)J.Immunol.Methods204：77-87和Boder(1997)“用于筛选组合多肽的酵母表面显示文库”，Nat.Biotechnol.15：553-557中的描述用瞬时表达载体或稳定表达载体在哺乳动物细胞中表达产生。

MBP肽及复合物的纯化

本发明的方法和试剂可用来从植物细胞、幼虫组织均浆、细菌细胞、酵母、哺乳动物细胞、人类细胞、组织培养物、转基因植物和转基因动物等多种资源中纯化出基本纯净的本发明所述MBP肽和复合物，这将取决于所选择的天然资源、合成系统或重组表达系统。有关标准纯化方法的一般信息在上文所述的科学文献和专利文献中有详细的描述；此外也可参考，例如，Scopes，R.K.，蛋白纯化：原理与实践，第2版，Springer Verlag，(1987)、Banga、Ausubel和Sambrook。

融合蛋白

MBP肽和多肽复合物还可作为额外连接有一种或多种附加多肽区以提高杀细胞(如使用上文所述的效应剂)、蛋白检测、纯化或其它应用的效率的蛋白来进行表达。可提高检测和纯化效率的区域包括，例如，可在固定的金属上进行纯化的多聚组氨酸域、组氨酸-色氨酸组件等金属螯合肽、可在固定的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A区域，以及FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp，Seatle WA)中使用的区域。在用于纯化的区域和植物疾病抗性多肽之间加入一种可裂解衔接物序列，如Xa因子或肠肽酶(Invitrogen，San DiegoCA)，同样会有效地提高纯化的效率。例如有一种表达载体，其包含的多肽编码核酸序列与6个组氨酸残基相连，其间为硫氧还蛋白和肠肽酶的裂解位点(例如，可参考Williams(1995)Biochemistry34：1787-1797)。组氨酸残基可以提高检测与纯化的效率，而肠肽酶裂解位点可提供一种方法，用来将所需蛋白从融合蛋白的其余部分中纯化。有关编码融合蛋白的载体以及融合蛋白应用的技术在科学文献和专利文献中均有详细的描述，例如，可参考Kroll(1993)DNA Cell.Biol.，12：441-53。

IV.MBP肽与复合物：药用组合物的配制和给药

本发明的MBP肽和II型：肽复合物通常可与药学容许的载体(赋形剂)混合，以形成药用组合物。药学容许的载体可包含一种能够，例如，稳定本发明所述药用组合物或提高或降低其吸收率或清除率的生理容许的复合物。生理容许的复合物可包括，例如，葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷等糖类、抗坏血酸或谷胱甘肽等抗氧化剂、螯合剂、低分子量蛋白、可减少肽或多肽复合物的清除或水解的组合物、或赋形剂、或其它稳定剂和/或缓冲液。也可使用去污剂来稳定或提高或降低该药用组合物的吸收，典型的去污剂见下文所述，其中包括脂质体载体。用于肽和多肽的药学容许的载体和制剂已为技术人员所了解，并且在科学文献和专利文献中均有详细描述，例如，可参考最新版本的Remington’s Pharmaceutical Science，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania(“Remington’s”)和Banga。

其它生理容许的复合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或能够非常有效地防止微生物生长或发挥功能的防腐剂。有多种众所周知的防腐剂，如苯酚和抗坏血酸。该领域的技术人员都将认可，对含有生理容许的复合物的药学容许载体的选择取决于，例如，本发明所述蛋白或多肽的给药途径及其特定的生理化学性质。

用于肠内给药、胃肠外给药或穿粘膜给药的水性溶液

用于给药的组合物通常含有将本发明所述肽或多肽溶解于药学容许载体的一种溶液，若该组合物为水溶性，则优选的药学容许载体为水性载体。能够在肠内给药、胃肠外给药或穿粘膜给药的制剂中使用的水性溶液实例包括，例如，水、生理盐水、磷酸缓冲盐溶液、Hank’s溶液、Ringer’s溶液、葡糖/盐溶液、葡萄糖溶液等。这些制剂可根据适当生理条件的需要而包含有药学容许的辅助剂，如缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、去污剂等。添加剂还可包括额外的活性成分，如杀菌剂或稳定剂。举例来说，该溶液可包含醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂酸酯或三乙醇胺油酸酯。这些组合物可通过众所周知的传统灭菌技术进行灭菌，或可过滤除菌。所得水性溶液可按其应用进行包装，或可冻干，冻干制品需在给药前与无菌水性溶液混合。这些制剂中的MBP肽和/或II型：肽复合物的浓度可以有很大的不同，其选择则根据选定的给药方式及患者的需要而主要取决于流体体积、粘度、体重等因素。

用于肠内给药的固体制剂

固体制剂可用于肠内(口服)给药。这些制剂可被配制成，例如，丸剂、片剂、粉剂或胶囊。可用于固体组合物的传统无毒固体载体包括，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。用于口服给药的药学容许无毒组合物可通过加入任何常用的赋形剂，如上文所列的那些载体，而形成，并且活性成分(MBP肽或复合物)通常占10-95％。也可将非固体制剂用于肠内给药。其载体可选自来源于石油、动物油、植物油或合成油的多种油类，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。适当的药学赋形剂包括，例如，淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

应该承认的是，当本发明的MBP肽和多肽复合物以口服方式给药时必须要使其免受消化作用。其实现通常是将肽或多肽复合物与一种组合物相混合而使其能够抵抗酸解和酶解，或将肽或复合物包装在脂质体等适当抗性载体中。使复合物免受消化作用的方法已为该领域所熟知，例如，可参考Fix(1996)Pharm Res.13：1760-1764；Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48：119-135；美国专利号5,391,377则描述用于将治疗剂经口服给药的脂类组合物(下文将对脂质体给药做更详细的讨论)。

用于穿皮/穿粘膜给药的局部制剂

通过穿粘膜或穿皮方式也可实现全身给药。用于穿粘膜或穿皮给药的制剂中可含有适于穿透屏障的渗透剂。这些渗透剂通常已为该领域所了解，其中包括，例如，用于穿粘膜给药的胆盐和梭链孢酸衍生物。此外，还可使用去污剂来促进渗透。穿粘膜给药可通过鼻腔喷雾或使用栓剂来实现。例如，可参考Banga，第10章；Sayani(1996)“肽与蛋白经吸收粘膜的全身输送”Crit.Rev.Ther.Drug CarrierSyst.13：85-184。用于局部穿粘膜给药的制剂可配制成软膏剂、乳膏剂、油膏剂、粉剂和凝胶。穿皮给药系统还可包括，例如，贴剂。例如，可参考Banga，第9章。

肽和多肽复合物也可置于能够在内部输送制剂的持续递送或持续释放装置中给药。诸如可生物降解微球或胶囊，或其它能够持续递送组合物(如MBP肽：II型多肽复合物)的可生物降解聚合物结构均可在本发明的制剂中使用(例如，参考Putney(1998)Nat.Biotechnol.16：153-157)。

用于吸入给药的制剂

用于吸入给药的肽或多肽可利用该领域所了解的任何系统来递送，其中包括干粉烟雾剂、流体送递系统、空气喷雾器、推进系统等。例如可参考Patton(1998)Biotechniques 16：141-143；用于多肽大分子的产品及吸入递送系统有，例如，Dura Pharmaceuticals(SanDiego，CA)、Aradigm(Hayward，CA)、Aerogen(Santa Clara，CA)、吸入治疗系统(San Carlos，CA)等。

举例来说，药用制剂可通过烟或雾的形式给药。用于喷雾给药的制剂可采用磨碎的形式，并与表面活性剂和发射剂一同提供。优选的表面活性剂应能够溶于发射剂中。典型的这些制剂是由己酸、辛酸、月桂酸、软脂酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸和油酸等含有6-22个碳原子的脂肪酸与乙二醇、丙三醇、赤藓醇、阿糖醇、甘露醇、山梨醇和来源于山梨醇的已糖醇酐等脂肪族多元醇或其环酐形成的酯或部分酯化物，以及这些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物。也可使用混合酯，如混合的或天然的甘油酯。表面活性剂可占组合物重量的0.1％-20％，优选的则为0.25％-5％。制剂的平衡采用普通推进剂。液化推进剂通常在环境条件下为气体，并可在压力作用下凝结。适当的液化推进剂为含有多至5个碳原子的较低级烷烃，如丁烷和丙烷；优选的则为氟化烷烃或氟氯化烷烃。也可使用上述物质的混合物。生产烟雾剂时，可将含有磨碎的复合物和表面活性剂的适当推进剂填充在配有适当阀门的容器中。在通过阀门被释放之前，各种成分均维持在较高的压力之下。例如，可参考Edwards(1997)“用于肺部给药的大型多孔颗粒”Science 276：1868-1871。

在另一项实施方案中，用于将制剂递送到呼吸组织的装置为吸入器，制剂可在该吸入器中汽化。其它流体递送系统包括，例如，空气喷雾器。

其它制剂

在制备本发明的药物时，可通过多种制剂修饰来改变药物动力学及体内分解。有多种可用来改变药物动力学和体内分解的方法已为该领域的技术人员所了解。这些方法的实例包括将该复合物保护在含有蛋白、脂类(如下文所述的脂质体)、糖类或合成聚合物(上文所述)等物质的囊泡中。对药物动力学的一般论述可参考，例如，Remington’s，第37-39章，或Banga，第6章。

给药途径

在本发明的方法中使用的肽和多肽复合物可单独或作为药用组合物以该领域所了解的任何方法进行，例如，全身给药、区域给药或局部给药；如动脉内给药、鞘内(IT)给药、静脉内(IV)给药、胃肠外给药、胸膜腔内给药、局部给药、口服给药，或诸如皮下给药、气管内给药(如利用烟雾剂)或穿粘膜给药(如颊粘膜、膀胱粘膜、阴道粘膜、子宫粘膜、直肠粘膜、鼻粘膜)等局部给药。用来制备可给药组合物的实际方法已为该领域技术人员所了解，或对他们而言是显而易见的，这些方法在科学文献和专利文献中均有详细描述，例如，可参考Remington’s或Banga。特别优选的给药方式包括动脉内或鞘内(IT)注射，当希望，例如，只针对脑和CNS等特定器官产生“局域效应”时尤其如此(例如，可参考Gurun(1997)Anesth Analg.85：317-323)。举例来说，若希望将本发明的肽或多肽复合物直接递送给脑，则颈动脉内注射为优选的给药方法。若需要较高的全身剂量，则胃肠外给药为优选的给药途径。若给药的治疗目的是诱导口服耐受性，则肠内给药为优选的方法，例如，可参考Kennedy(1997)J.Immunol.159：1036-1044；Kent(1997)Ann.NY Acad.Sci.815：412-422。用来制备胃肠外给药组合物的实际方法已为该领域技术人员所了解，或对他们而言是显而易见的，这些方法在，例如，Remington’s、Banga第7章均有详细描述。另外也可参考Bai(1997)J.Neuroimmunol.80：65-75；Warren(1997)J.Neurol.Sci.152：31-38；Tonegawa(1997)J.Exp.Med.186：507-515。

治疗方案：药物动力学

该药用组合物可采用多种单位剂量形式进行给药，这将取决于给药的方法。典型的肽和多肽药用组合物的剂量已为该领域的技术人员所熟知。事实上，这些剂量通常可通过咨询获得，并可根据特定的治疗方案、患者的耐受性等因素进行调整。足以实现这一点的MBP肽或II型：肽复合物的量被定义为“治疗有效剂量”。剂量计划表和用于此用途的有效量，即“给药方案”，将取决于多种因素，其中包括疾病或病情所处的阶段、疾病或病情的严重程度、患者的一般健康状况、患者的身体状况、年龄、药用制剂，以及活性剂的浓度等。在计算患者的剂量方案时，还需考虑给药的方式。剂量方案还必须考虑药物动力学，即药用组合物的吸收率、生物利用率、代谢率和清除率等。例如，可参考最新的Remington’s；Egleton(1997)“肽和肽类药物向脑内的运输及其生物利用率”Peptides 18：1431-1439；Langer(1990)Science 249：1527-1533。

在治疗应用中，可将组合物给药于患有脱髓鞘病的患者，其剂量需足以治愈或至少能够部分抑制该疾病和/或其并发症。足以实现这一点的剂量被定义为“治疗有效剂量”。用于此用途的有效量将取决于疾病的严重程度、患者的一般健康状况、给药的频率和途径以及临床医师的判断等。例如在一项实施方案中，用于静脉内(IV)给药的可溶性II型：肽复合物药用组合物的剂量为给药数小时(通常为1、3或6小时)，每小时约0.01-1.0mg，该剂量可按间歇循环方式重复数周。也可使用更高的剂量(例如约10mg/ml)，将药物给药于选定部位而不使其进入血流，如进入体腔或诸如脑脊液(CSF)等器官的内腔，时尤其如此。

也可通过对症状缓解或改善的评定，或利用血液样品或组织病理样品的分析结果等客观标准而根据经验来确定剂量。例如，MS疾病的特征是可引起多种不适，并导致CNS功能障碍，伴有症状缓解和持续复发性转剧。该疾病通常为隐袭发作。最常见的外在症状包括，一处或多处肢体、躯干或面部一侧感觉异常；一条腿或一只手无力或笨拙；或视力障碍(如一只眼部分失明并疼痛、复视、视觉不清、暗点)。其它常见的早期症状有短暂性眼麻痹、一处或多处肢体短暂性无力、肢体轻度僵硬或不正常易疲劳、轻度步态障碍、排尿控制困难、眩晕或轻度情绪障碍；这些症状均与分散的CNS有关，它们通常在该疾病被确诊的数月或数年之前即已出现。也可利用组织病理学方法来监测治疗的成功与否。在MS的CNS，特别是白质，中散布着伴有少突胶质细胞破坏及血管周围性炎症的脱髓鞘斑或脱髓鞘岛，侧柱与后柱(特别是颈部和背部)、视神经和室周区尤其如此。中脑、脑桥和小脑内的神经束也受到影响，大脑和脊髓内的灰质也可能受到影响。胞体和轴突通常可以维持，尤其是在早期病变时。此后，轴突可被破坏，长神经束中的轴突尤其如此，并且纤维性神经胶质增生使神经束表现出其“硬化”特征。早期病变和晚期病变可同时出现。因此，可将本发明的组合物给药以抑制该疾病的发展，并减少这些症状或其它症状的发作、频率或严重程度。

在一项示范性实施方案中，剂量约为0.5-25mg/kg，优选实施方案则约为3-15mg/kg。在另一项示范性实施方案中，单位剂量约为每剂0.01-1000mg，优选实施方案则约为每剂10-100mg。也可参考1995年11月21日发表的美国专利号5,468,481。在另一项实施方案中，是将肽进行肠内给药以诱导口服耐受性，其剂量为每天约10-2500μg，优选实施方案则为每天约20-50μg。也可参考，例如，Barnett(1998)Arthritis Rheum，41：290-297，它是将来源于软骨的II型胶原蛋白以20、100、500或2500μg/天的剂量进行口服给药，得出最佳结果的是20μg/天的剂量。

含有本发明所述肽和复合物的药用组合物的给药可单独进行，或与其它治疗协同进行。用该组合物进行单次或多次给药取决于患者所需的和耐受的剂量和频率。

脂质体制剂

本发明提供一些含有本发明所述复合物的II型亚基跨膜区的药物。在一项实施方案中，含有该II型：MBP肽复合物的药用制剂被掺入到脂单层或脂双层中。本发明还提供一些将水溶性肽或复合物连接到脂单层或脂双层表面的制剂。举例来说，可将肽与含有酰肼-PEG-(二硬脂酰磷脂酰)乙醇胺的脂质体相连接(例如，可参考Zalipsky(1995)Bioconjug.Chem.6：705-708)。脂质体或任何形式的脂膜，如平面脂膜或诸如红细胞等完整细胞的细胞膜等，均可使用。脂质体制剂可采用任何方式进行给药，其中包括静脉内给药、穿皮给药(例如，可参考Vutla(1996)J.Pharm.Sci.85：5-8)、穿粘膜给药或口服给药。本发明还提供将本发明所述肽和/或复合物掺入微胶粒和/或脂质体的药用制品(例如，可参考Suntres(1994)J.Pharm.Pharmacol.46：23-28；Woodle(1992)Pharm.Res.9：260-265)。

脂质体和脂质体制剂可按照该领域熟知的标准方法加以制备，可参考，如Remington’s；Akimaru(1995)Cytokines Mol.Ther.1：197-210；Alving(1995)Immunol.Rev.145：5-31；Szoka(1980)Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；以及美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028。在一项实施方案中，本发明的脂质体所包含的II型：肽复合物通常位于脂质体表面，这种方式使该复合物能够与TCR相互作用。跨膜区通常是在膜形成时即首先被掺入膜内。脂质体也可用来将预期药物(如毒素或化学治疗剂)定向于特定的自身反应性T细胞。

脂质体的电荷是决定脂质体从血液中清除的重要因素，带负电荷的脂质体可被网状内皮系统更快地吸收(Juliano(1975)Biochem.Biophys.Res.Commun.63：651)，因此肽在血流中的半衰期更短。掺入磷脂酰乙醇胺可通过防止脂质体聚集而延长循环时间。例如，在L-α-二硬脂酰磷脂酰胆碱的大型单层囊泡中掺入N-(ω-羧基)酰基酰氨基-磷脂酰乙醇胺可大大提高脂质体的体内循环寿命(例如，可参考Ahl(1997)Biochim.Biophys.Acta 1329：370-382)。用于治疗或诊断的脂质体通常需要有较长的循环半衰期。例如，本发明的特别优选实施方案是能够在血流中维持8、12或直至24小时的脂质体。

这些脂质体通常是使用约百分之5-15摩尔的带负电荷的磷脂，如磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇，来加以制备。加入的带负电荷的磷脂，如磷脂酰甘油，也具有防止脂质体自发聚集的作用，从而使尺寸过小的脂质体产生聚集的风险降至最低。浓度至少约为百分之50摩尔的膜固化剂，如鞘磷脂或饱和中性磷脂，和百分之5-15摩尔的单唾液酰神经节苷脂可延长脂质体制品在血流中的循环，这些在美国专利号4,837,028中均有一般描述。

此外，脂质体悬浮液中可含有能够在储存时保护脂类免受自由基和脂质过氧化损伤的脂类保护剂。优选的是α-生育酚等亲脂性自由基猝灭剂和ferrioxiaine等水溶性离子特异性螯合剂。

本发明的制剂可含有大小不同的多层囊泡。方法是将用于形成囊泡的脂类溶解在适当有机溶剂或溶剂系统中，并在真空或惰性气体中干燥以形成脂类薄膜。如果需要，可将该薄膜再溶解于叔丁醇等适当溶剂中，然后冻干以形成更均一、更易于水化的粉样脂类混合物。将该膜用肽或多肽的水性溶液覆盖以使其水化，该过程通常需在搅拌的情况下持续15-60分钟。将脂类在更激烈的搅拌条件下水化或加入去氧胆酸盐等增溶去污剂可使所得多层囊泡的粒径分布向更小的尺寸转移。水化介质中包含的肽或多肽的浓度即为脂质体最终悬浮液中的脂质体内部体积中的预定浓度。药物溶液中通常含有浓度为10-100mg/ml的溶于磷酸缓冲盐溶液的本发明所述肽或复合物。

制备出脂质体后，可将其大小进行调整，以得到尺寸范围满足需要并且粒径分布相对狭窄的脂质体。优选的尺寸范围约为0.2-0.4微米，这一范围使脂质体悬浮液可通过用传统滤器，通常为0.22微米滤器，进行过滤来实现除菌。如果脂质体的大小已被调整为约0.2-0.4微米，则可在高通过量的基础上实施这种过滤除菌方法。有几种可用来将脂质体的大小调整至所需尺寸的方法(例如，可参考美国专利号4,737,323)。利用水浴超声或探针超声方法对脂质体悬浮液进行超声处理可产生粒径逐步减小的单层小泡，其尺寸可小于约0.05微米。另一种方法是匀化法，该方法利用剪切能将大脂质体破碎成更小的脂质体。典型的匀化方法是将多层囊泡反复通过一种标准的乳剂匀化器，直至观察到选定大小，通常约为0.1-0.5微米，的脂质体。在这两种方法中均可利用传统的粒径激光鉴别方法对颗粒的粒径分布进行监测。用于使脂质体的尺寸减小并且粒径分布更加优化的另一有效方法是挤压脂质体使其穿过一种小孔聚碳酸酯膜或非对称陶瓷膜。通常是一次或多次将悬浮液循环过膜，直至达到所需的脂质体粒径分布。也可将脂质体挤压过微孔依次减小的膜，以使脂质体的尺寸逐步减小。

即使是最高效的封装方法，在已分级的脂质体初级悬浮液中也会含有多至50％或更高的游离(未封装)形式的复合物。如果需要在特定的制剂使用，则有几种方法可用来将未包载的复合物从脂质体悬浮液中去除。一种方法是将悬浮液中的脂质体经高速离心沉淀，使游离复合物和极小的脂质体保留在上清液中。另一种方法是通过超滤将悬浮液浓缩，然后将浓缩的脂质体重悬在替代介质中。作为选择，也可利用凝胶过滤法将大脂质体颗粒从可溶分子中分离出来。经过该处理后，可将脂质体悬浮液的浓度配制成用于，例如，静脉内给药、I.P给药、穿皮给药或穿粘膜给药的所需浓度。这包括将通过离心或超滤等方法而被浓缩的脂质体重悬于适当体积的适当介质中，或将药物去除步骤导致总体积增加的悬浮液浓缩。然后利用上文所述的过滤方法将该悬浮液除菌。这些含有肽或II型：肽复合物的脂质体可用于胃肠外给药或局部给药，其剂量可依据，例如，给药方式、给药种类、治疗的疾病种类等而有所不同。

该领域常使用微胶粒来提高具有非极性区的分子的可溶性。因而技术人员都会认可，微胶粒也能够用于本发明的组合物。含有本发明所述复合物的微胶粒可根据该领域熟知的方法加以制备(例如，可参考Remington’s，第20章)。含有本发明所述肽和/或复合物的微胶粒通常可利用普通的表面活性剂或去污剂来制备。微胶粒可在表面活性剂(含有疏水性部分和一种或多种离子基团或强亲水性基团的分子)的作用下于水性溶液中形成。随着固体表面活性剂浓度的增加，吸附在气/水界面或固/水界面的脂单层被压缩得非常紧密，以至于要将两层脂单层上的表面活性剂分子过度压缩才可进一步占用。在该浓度的基础上进一步增加溶解的表面活性剂的量会导致相当于新加入量的分子聚集成微胶粒。适当的表面活性剂包括月桂酸钠、油酸钠、硫酸月桂酯钠、八氧乙二醇单十二烷基酯、辛苯醇醚9和PLURONICF-127^(Wyandotte Chemicals Corp.)。优选的表面活性剂为适用于IV注射的非离子型聚氧乙烯和聚氧丙烯去污剂，如PLURONIC F-127^、n-辛基-α-D-葡糖吡喃糖苷等。诸如用于脂质体产生的那些磷脂也可用于微胶粒的形成。由于在本发明的某些实施方案中，复合物的II型亚基含有一段亲脂性跨膜区和一段较亲水的胞外区，因此在存在普通表面活性剂或磷脂以及这些亚基的情况下即可形成混合微胶粒。本发明的混合微胶粒可含有任意组合的亚基、磷脂和/或表面活性剂。因此，本发明的微胶粒可含有亚基和去污剂，或含有亚基和磷脂及去污剂，或含有亚基和磷脂。

也可提供用于治疗或诊断用途的试剂盒。在一项实施方案中，本发明的药用制剂为冻干形式，可置于一种容器中。试剂盒中可包括结合或不结合有一种标记或毒素的复合物、诸如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液等缓冲液、稳定剂、杀生物剂、诸如血清白蛋白等惰性蛋白，以及一套使用说明。提供的这些物质通常低于复合物重量的约5％，而总量通常至少为蛋白重量的约0.001％。试剂盒中往往需要含有一种用来稀释活性成分的惰性增充剂或赋形剂，该赋形剂的提供量可为组合物总量的约1-99％。若测定中需要使用能够与该复合物结合的抗体，则通常可在单独的小瓶中提供。该抗体一般结合有一种标记，这可按照该领域熟知的技术来加以制备。

定义

为了便于理解本发明，以下给出一些术语的定义。

术语“抗体”是指基本由一种或多种免疫球蛋白基因编码的一种多肽，或肽段，或合成的或重组的其类似物，它们能够特异结合并识别分析物和抗原，例如上文描述的本发明的多肽种类或亚类。

术语“保守取代”是指肽或蛋白，如本发明所述含有MBP肽序列的多肽，的氨基酸组成中基本不改变其活性的一种变化。其中包括特定氨基酸序列的保守修饰变化，即对蛋白活性不起决定作用的那些氨基酸的取代，或将氨基酸取代为具有类似性质(如酸性、碱性、带正电荷或带负电荷、极性或非极性等)的其它氨基酸，这样可以使甚至关键氨基酸的取代也基本不会使活性改变。本发明的多肽序列隐含了其保守取代的变体。有关功能类似的氨基酸的保守取代表已为该领域所熟知。下列6组氨基酸中每组内的氨基酸彼此均为保守取代：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(也可参考Creighton(1984)Proteins，W.H.Freeman and Company)。该领域的技术人员都将理解，以上确定的取代并不是唯一可能出现的保守取代。例如在某些情况下，可将所有带电荷氨基酸之间的取代视为保守取代，而不管它们是带正电荷或是带负电荷。此外，在编码序列中改变、添加或去除单个氨基酸或小比例氨基酸的个别取代、缺失或添加也可被视为“保守修饰变化”。术语“保守取代”还涉及核酸序列中基本不改变核酸的预期活性的一种变化，例如不改变由该核酸编码的肽或蛋白的活性。本发明的核酸序列隐含了其保守修饰的变体(如简并密码子取代)和互补序列以及暗示的序列。明确而言，简并密码子取代可通过将序列中的一个或多个选定的(或所有的)密码子用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代来加以实现(Batzer(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；Rossolini(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。

“融合蛋白”是指至少含有一种与第二结构域相连的多肽或肽结构域的组合物。第二结构域可以是一种多肽、肽，或多糖等。“融合”可以是由化学连接或电荷(静电吸引，即盐键、氢键等)相互作用而产生的一种结合。如果多肽为重组体，则“融合蛋白”可由共用信息翻译而来。作为选择，也可通过任何化学或静电方式将结构域的成分相连接。

“异种序列”是指除髓鞘碱性蛋白序列以外的任何氨基酸序列或核酸序列。

文中使用的“分离的”一词当指一种分子或组合物，如MBP肽、II型：肽复合物或核酸，时意思是该分子或组合物至少与一种其它复合物，如蛋白，或其它核酸(如RNAs)，或其它在体内或其天然存在状态下相结合的污染物相分离。因此，当一种多肽或核酸已经与天然状态下相结合的其它任何组分，如细胞提取物中的细胞膜，相分离时即可被认为是分离的。但一种分离的组合物也可以是基本纯净的。一种分离的组合物可以处于同质状态，也可以是干燥的或处于一种水性溶液中。纯度和同质性的测定可采用，例如，分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或高效液相色谱(HPLC)。

术语“核酸”或“核酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。该术语包括了含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，即寡核苷酸，这些类似物具有相似的或为特定目的而改进的结合性质，如文中作为参考的核酸。该术语还包括了代谢方式与天然存在的核苷酸相类似的核酸，或为特定目的而改进其代谢率的核酸。该术语还包括具有合成的主链的核酸样结构。本发明提供的DNA主链类似物包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、烷基磷酸三酯、氨基磺酸酯、3’-硫代乙缩醛、亚甲(甲叉)、3’-N-氨基甲酸酯、吗啉代氨基甲酸酯，以及肽核酸(PNAs)；可参考F.Eckstein，寡核苷酸及类似物，实用方法，IRL Press，Oxford University Press(1991)；反义策略，Annals of the NewYork Academy of Sciences，Volume 600，Eds.Baserga andDenhardt(NYAS 1992)；Milligan(1993)J.Med.Chem.36：1923-1937；反义研究及应用(1993，CRC Press)。PNAs含有非离子性主链，如N-(2-氨乙酸)甘氨酸单位。硫代磷酸酯连接在WO97/03211、WO 96/39165、Mata1997Toxicol Appl Pharmacol144：189-197中均有描述。该术语还包括其它的合成主链，如膦酸甲酯连接或膦酸甲酯与的磷酸二酯交替连接(Strauss-Soukup(1997)Biochemistry 36：8692-8698)，以及苯甲基膦酸酯连接(Samstag(1996)Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6：153-156)。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸引物、探针和扩增产物等词替换使用。

术语“药用组合物”指适于作为药物用于主体的组合物。本发明的药用组合物为含有药学有效剂量的MBP肽和/或II型：肽复合物以及一种药学容许的载体的制剂。

术语“来治疗”或“治疗”是指对主体实施的预防性或治疗性处理。预防性处理包括为了降低或消除获得一种疾病或病情的风险，或为了降低或消除由该疾病或病理导致的或与其相关的症状或病理状态，而对不患有该疾病或病情的、或不表现出该疾病或病情的迹象的、亦或仅表现出该疾病或病情的早期征兆的个体实施的处理。本发明提供一种方法，通过将MBP肽和/或II型：肽复合物向被认为产生脱髓鞘性疾病或病情的高风险个体给药来治疗主体内由T细胞介导的抗髓磷脂碱性蛋白的免疫应答。治疗性处理还包括为了防止、减少、改善或消除所有症状或病理而对表现出病理或疾病迹象的、或被认为具有产生或招致一种病情或疾病风险的个体实施的处理。因此，如上文所述，本发明的方法可提供一种手段，用来治疗脱髓鞘病，或用来防止、减少、消除或改善该疾病的临床症状和组织病理。“药学有效剂量”是指为了对个体的疾病或病情进行有效的预防性或治疗性处理而向个体给予的复合物的量。

应该了解的是，文中所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，该领域的技术人员均能够由其得出多种修改和变化方案，这些方案将均被包括在该申请的精神和领域以及附加权利要求的范围之内。

                       实施例

以下提供的实施例用于对申请专利的本项发明进行说明，而不作为其限制。实施例1：通过测量T细胞活化信号来确定抗原性MBP肽中的核心结构和与TCR接触的关键残基

本发明提供新型MBP肽和MBP肽：II型复合物、含有这些组合物的药用制剂、以及通过将这些新型组合物给药来治疗主体内由T细胞介导的抗MBP免疫应答的方法。以下实施例详细描述了新型MBP肽的鉴定方法，其中包括TCR识别核心序列的氨基酸残基的鉴定，这些残基参与了与脱髓鞘病，如MS，相关的自身反应性TCR与MBP肽及适当II型分子的结合。

人类髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽中参与同自身反应性TCR的相互作用的最小结构及关键残基已被确认。将合成的肽类似物与转化的人类T细胞克隆(SS8T)上的TCRs共保温，该克隆具有DRB5*0101限制性，并可表达MHC II型(DR2)分子。利用一种基于硅的生物传感器微生理测量仪来实时测量该细胞对II型：肽与TCR结合所激发的T细胞活化事件的应答。微生理测量仪用来监测由MBP肽：II型多肽与自身反应性TCRs的结合所导致的胞外酸化率的变化。早期的T细胞信号事件，如TCR与II型：肽复合物的高亲和力结合，可直接导致胞外酸化率的增加。在微生理测量仪的样品室中将培养的SS8T细胞分别暴露于N-端(氨基端)截尾的和C-端(羧基端)截尾的MBP肽，以确定引起T细胞应答所需的最少氨基酸残基。为了确定参与TCR相互作用的关键氨基酸残基，还在该测定的平行实验中对带有单个丙氨酸取代的MBP肽类似物进行了测试。如下文所述，确定的最小核心长度为10个氨基酸残基，相当于肽的MBP(91-100)，并且还测定出F-91、K-93、N-94、I-95和V-96残基为TCR相互作用所必需。酸化率的测量结果与γ-干扰素的增加以及肿瘤坏死因子(TNF)-α细胞因子的产生具有很好的相关性。

在体外测定中使用了由松鼠猴疱疹病毒(HVS)导致无限增殖的人类T细胞，以检测本发明的新型MBP肽。HVS T细胞表达TCR的水平与正常人类T细胞相同，并且没有丧失任何抗原识别能力(Weber(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11049)。明确而言，在这些测试中使用的经HVS转化的人类T细胞克隆称为SS8T，它产生于一名MS患者。此前已确定SS8T的特征为具有HLA II型DR2(DRB5*0101)多肽限制性和MBP肽限制性(Weber(1993)见上文)。在N端具有一个N-乙酰酪氨酸残基的MBP(84-102)的肽修饰类似物(Ac-MBP(83-102)Y⁸³)的特征是，当与HLA DR2(DRB5*0101)混合时能够被SS8T转化的T细胞识别(Mukku(1995)Mol.Immunol.32：555；Arimilli(1995)J.Biol.Chem.270：971)。为了确定该MBP(83-102)Y⁸³肽的最小长度以及与TCR接触的核心残基，而对不同末端截尾形式的肽及丙氨酸类似肽进行了分析。该研究中使用的多种肽均利用示意图列于图1A和图1B中。丙氨酸类似肽是用丙氨酸取代MBP(83-102)Y⁸³序列各残基中的单个氨基酸。

在该模型系统中，与TCR结合所必需的MBP肽关键氨基酸残基取决于两种因素：负责与MHC II型结合沟的氨基酸残基结合的肽残基(肽抗原识别位)和负责与TCR产生有效相互作用的某些肽氨基酸残基(表位)。为了确定免疫优势表位的最小长度，而在微量滴定板中将不同浓度的多种末端截尾的肽与SS8T细胞于37℃共保温48小时。将T细胞与肽保温后，利用抗γ-IFN和抗TNF-β的单克隆抗体(mAbs)经ELISA测定法测试流体培养物中分泌的γ-IFN和TNF-β的存在情况(抗人γ-IFN mAb和兔抗人γ-IFN多克隆抗体，Endogen Inc.，Woburn，MA；结合过氧化物酶的山羊IgG和兔IgG，Jackson ImmunoresearchLaboratories，West Grove，PA；人γ-IFN，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN；抗人TNF-βmAb，山羊抗人TNF-β多克隆抗体及重组人TNF-β，R&D Systems Ins，Minneapolis，MN)。在平行实验中，还将SS8T固定于琼脂糖，并在微生理测量仪的样品室中将其暴露于多种末端截尾的肽以监测其胞外酸化率。

这些研究所使用的肽为N(氨基)端乙酰化并且C(羧基)端酰胺化的形式。以标准的固相方法利用侧链被保护的Fmoc氨基酸在Applied Biosystems 431A自动肽合成仪上合成序列为Ac-YDENPVVHFFKNIVTPRTPP的MBP(83-102)肽(序列编号：1)；以及序列为Ac-GFGYGGRASDYKSAHKGFKG的MBP(124-143)肽(序列编号：37)。利用反相HPLC将脱保护的粗制肽纯化，并利用质谱测定法验证纯化的肽的均质性和同一性。所有末端截尾的MBP肽和MBP丙氨酸类似肽(图1)都是利用Fmoc化学物以固相肽合成方法合成。所有化学制剂，包括Rink酰胺MBRA树脂和侧链被保护的Fmoc氨基酸，均来自Nova Biochem，San Diego，CA。按Luu(1996)Int.J.PeptideProtein Res.47：91所述，利用HBTU/HOBt或PyBOP化学活化物将被保护的氨基酸结合在ABI431 A自动肽合成仪或ABIMED/GILSONAMS422多重肽合成仪上。当肽经固相合成后，用含有5％4-甲氧苯硫醇和5％4-甲基巯基苯酚的TFA作为清除剂将其裂解。用戊烷∶丙酮混合物(4∶1，v∶v)将粗制肽沉淀并离心分离。将肽用戊烷∶丙酮混合物清洗3次，然后用戊烷清洗，并真空干燥。用C18柱经反相HPLC将肽纯化；收集纯化组分并冻干。利用电子溅射质谱测定法对肽进行鉴定。

将T细胞于37℃下培养在补加有2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、100μl/ml链霉素、10％胎牛血清和50单位/ml人重组IL-2(rIL-2)的RPMI培养基中。每隔一天将细胞转移到新鲜培养基中。在不加rIL-2的情况下，将不同浓度的各种肽与密度为20,000细胞/200μl/孔的细胞共保温于组织培养微量滴定板中。37℃保温48小时后，收集各孔的流体培养基并测试其中的γ-IFN和TNF-β细胞因子。γ-IFN的检测是按照上文Arimilli(1995)所述用Ab ELISA方法进行。TNF-β的检测方法是，用浓度为0.5μg/孔的抗人TNF-βmAb包被Nunc Maxisorb 96孔板，并4℃保温过夜。孔的封闭使用0.1％的牛血清白蛋白，并将样品于室温保温2小时。用稀释度为500-0.01ng/ml的重组人TNF-β做出标准曲线。然后加入浓度为1μg/ml的山羊抗人TNF-β，并于25℃再保温2小时。将板清洗3次，再用浓度为1μg/ml的结合有HRP的鼠抗山羊抗体21℃孵育1小时，然后以3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB，Moss，Inc，Pasadena，MD)作为底物进行显色。用2N硫酸作用5分钟以终止反应，然后于450nm下测量吸光度。

按Nag et al.，1992所述用低融点琼脂糖(Molecular DevicesCorp.，Sunnyvale，CA)将新培养的SS8T细胞固定在微生理测量仪的样品囊中。简单地说，将T细胞用IL-2脉冲作用2天以使其休眠。细胞计数，并将细胞悬浮于无血清负荷培养基中(含有10％不含脂肪酸和内毒素的BSA的低缓冲RPMI1640)。离心收集细胞并以3×10⁵T细胞/7.5μl负荷培养基的浓度重悬于负荷培养基中。在悬浮细胞中加入于37℃下融解并储存的低融点琼脂糖，浓度为2.5μl/7.5μl。立即取10μl琼脂糖/细胞混合物加到置于12孔培养板中的样品囊(Molecular Devices Corp.)的中心。5分钟后，在样品囊内凝固的琼脂糖上加2ml负荷培养基，并用一嵌入膜盖住细胞。将装好的样品囊放到37℃的Cytosensor腔中，每分钟灌注50μl含有10％BSA但不加HEPES或碳酸氢盐的低缓冲RPMI1640培养基。胞外酸化作用的测量是按照McConnell(1992)Science 257：1906所述在Cytosensor微生理测量仪中进行，每2分钟采集45秒的电势测量值。以细胞刺激前的数据为100％，将酸化率数据(μV/秒)换算成百分率标准值，这样可以将数据与隔离腔中的细胞数据进行比较。

图2A、2B和2C显示这些分析的结果，该结果表明用前6种N端截尾的MBP肽：MBP(84-102)(序列编号：2)、MBP(85-102)(序列编号：3)、MBP(86-102)(序列编号：4)、MBP(87-102)(序列编号：5)、MBP(88-102)(序列编号：6)和MBP(89-102)(序列编号：7)均可导致γ-IFN、TNF-β及细胞外酸化率水平增加。暴露于这些肽的SS8T细胞表现出γ-IFN产量增加了2-4倍，而TNF-β产量增加了3-4倍，并且增加倍数与剂量相关(图2A、2B)。与此类似，在10分钟内即观测到酸化率已增加至基础酸化率的118％(图2C)，这表明残基84、残基85、残基86、残基87、残基88和残基89对SS8T细胞中的TCR识别不具有重要作用。48小时(h)后测量的γ-IFN和TNF-β细胞因子的浓度与酸化率具有很好的相关性。

图2D、2E和2F显示后5种N端截尾的MBP(90-102)(序列编号：8)、MBP(91-102)(序列编号：9)、MBP(92-102)(序列编号：10)、MBP(93-102)(序列编号：11)和MBP(94-102)(序列编号：12)肽的γ-IFN、TNF-β及酸化率的比较结果。其中，截断残基91、截断残基92和截断残基93均不能产生γ-IFN、TNF-β细胞因子，也不能引起酸化率改变。这表明这些残基在T细胞刺激过程中具有关键作用。由于在一项研究中发现，残基92(F-92)对结合II型分子具有重要作用(Wucherpfennig(1994)J.Exp.Med.179：270)。因此，用II型：MBP(93-102)(序列编号：11)复合物不能引起T细胞应答的原因可能是由于缺乏与II型多肽结合的肽，或是由于缺乏与TCR接触的关键残基(表位残基)。

在一项独立测试中，将SS8T细胞与MBP(83-101)(序列编号：13)、MBP(83-100)(序列编号：14)、MBP(83-99)(序列编号：15)、MBP(83-98)(序列编号：16)、MBP(83-97)(序列编号：17)和MBP(83-96)(序列编号：18)这6种C端截尾的肽共保温。如图3A、3B和3C所示，只有亲本序列(序列编号：1)和MBP(83-101)(序列编号：13)显示出γ-IFN、TNF-β或酸化率的增加。这表明C端的残基100、残基99、残基98、残基97和残基96在MBP残基TCR的过程中均具有重要作用。用MBP(83-100)(序列编号：14)和MBP(83-99)(序列编号：15)产生了少量的γ-IFN和TNF-β。用MBP(83-95)(序列编号：19)、MBP(83-94)(序列编号：20)、MBP(83-93)(序列编号：21)、MBP(83-92)(序列编号：22)和MBP(83-91)(序列编号：23)这另外5种C端截尾的肽也获得了类似的结果，它们均未显示出对γ-IFN和TNF-β的刺激或酸化率的增加(图3D、3E和3F)。这些数据表明残基92、残基93、残基94和残基95在T细胞对肽的识别过程中均具有重要作用。由N端截尾与C端截尾所得出的结果表明，FFKNIVTPRT(MBP(91-100)(序列编号：38))是在提供II型DRB5*0101的情况下可用MBP刺激TCR的最小核心序列。

肽中的单个氨基酸对TCR结合的作用可利用多种方法来进行研究，其中包括D-氨基酸模拟法、保守氨基酸取代法、转换氨基酸电荷法以及丙氨酸取代法。丙氨酸取代法则被更普遍地使用，因为丙氨酸是一种具有手性中心的侧链最简单的氨基酸，它只会对多肽和蛋白的二级结构造成很小的影响。在对进化上相关的蛋白进行对比后发现，除芳香族氨基酸以外的所有氨基酸都可被替代，并且这种现象很常见。因此，本发明使用丙氨酸取代策略来确定TCR接触的重要残基。将多种用丙氨酸对MBP(90-102)(序列编号：8)进行单个氨基酸取代所得的类似肽与SS8T细胞共保温。测试流体培养物中的γ-IFN和TNF-β，并与酸化率进行比较。图4A、4B和4C显示，当由II型DRB5*0101呈递给SS8T细胞时，MBP(83-102)A90(序列编号：24)和MBP(83-102)A92(序列编号：26)这两种肽均能够诱导γ-IFN和TNF-β产生，并使酸化率增加。而MBP(83-102)A91(序列编号：25)、MDP(83-102)A93(序列编号：27)、MDP(83-102)A94(序列编号：28)和MDP(83-102)A95(序列编号：29)肽均不能诱导细胞因子产生，并且未表现出酸化率的增加。这表明残基F-91、K-93、N-94和I-95在T细胞刺激过程中具有重要作用。在一项研究中表明，残基F-91和K-93是MBP(84-102)肽中与TCR接触的次要残基，而N-94是与TCR接触的主要残基(Vergelli(1997)J.Immunol.158：3746)。这些数据即表明，MBP(84-102)肽中的残基F-91、K-93、N-94和I-95是该系统中与TCR接触的重要残基。

丙氨酸类似物MBP(83-102)A97(序列编号：31)、MBP(83-102)A98(序列编号：32)、MBP(83-102)A99(序列编号：33)、MBP(83-102)A100(序列编号：34)、MBP(83-102)A101(序列编号：35)和MBP(83-102)A102(序列编号：36)均可表现出γ-IFN和TNF-β细胞因子水平的增加以及酸化率的提高。只有MBP(83-102)A96(序列编号：30)不能诱导细胞因子产生，并且未表现出酸化率的增加(图4D、4E和4F)。该实验表明，V-96也是对T细胞识别起重要作用的残基。如图4F所示，除MBP(83-102)A96(序列编号：30)肽之外，所有肽均在10分钟内即显示出酸化率的直接增加。因此，丙氨酸类似肽的酸化率结果与SS8T细胞产生γ-IFN和TNF-β的结果相吻合。在另一项研究中表明，残基N-94和V-96也是与DRB5*0101和MBP(84-102)肽限制性T细胞克隆的TCR相接触的残基(Wucherpfennig(1994)见上文)。

所有实验均用MBP(124-143)(序列编号：37)作为阴性对照。MBP(124-143)肽能够与DR2高亲和力结合(Mukku(1995)见上文)，但不能对DRB5*0101限制性T细胞产生刺激(Arimilli(1995)见上文)。

图5A突出显示了TCR识别的核心序列(加框区域)，即MBP(91-100)(序列编号：38)。如上文所述用末端截尾的肽对该肽进行检测，测量其细胞外酸化率和SS8T细胞中的γ-IFN及TNF-β应答。图5B(用箭头)指出了参与TCR接触的重要氨基酸残基，即F-91、K-93、N-94、I-95和V-96。如上文所述利用丙氨酸类似肽检测这些氨基酸对细胞外酸化率和SS8T细胞中的γ-IFN及TNF-β细胞因子应答的影响。

通过实验来论证肽在刺激T细胞之前与II型多肽结合的必要性，即确定T细胞刺激是细胞表面形成的MHC-肽复合物与TCR结合的直接结果，还是由肽与TCR直接结合而引起。利用抗TCR mAb和抗II型mAb进行进行抗体阻断实验(可产生抗单形性人类HLA DR分子的mAB的杂交瘤细胞系L243来自American Type Culture Collection，Bethesda，MD)。利用流式细胞光度计对表面带有II型分子的转化SS8T人类T细胞进行验证。将SS8T细胞与抗TCR或抗DR的抗体共保温，以阻断TCR位点和II型位点。然后将细胞清洗并加在微生理测量仪腔中，再将其暴露于10μg/ml的MBP(83-102)(序列编号：1)肽。用特异性mAb阻断TCR或II型可完全抑制酸化率增加。这些结果同样表明，肽与细胞表面II型分子的结合是快速细胞活化的征兆(McConnell(1995)Proc.Matl.Acad.Sci.USA 92：2750)。利用微生理测量仪对细胞外酸化作用进行测量的结果表明，在TCR与肽：II型多肽复合物产生高亲和力结合后的10分钟内即可出现细胞活化的早期事件(信号)。细胞活化晚期事件(信号)则可在48小时内测量到；在这些研究中测量的代表性晚期活化事件为γ-IFN和TNF-β细胞因子应答。在鉴定对TCR识别具有重要作用的肽的实验中，早期与晚期活化事件的测量结果彼此吻合，对本发明所述MBP肽的鉴定结果亦是如此。

总之，这些研究确定了MBP肽的一个新家族，其特征是具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。这些肽也被包括在本发明的新型II型：MBP复合物中。这些复合物中包括能够与一种T细胞受体结合的MHC II型复合物，该复合物基本包括：含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHC II型多肽，和一种具有Phe-X-Lys-R₁-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列的髓磷脂碱性蛋白，其中X为任意一种氨基酸，R₁为Asn或Gln；其中该MBP肽结合在MHC II型成分的抗原结合袋上。

Claims (23)

1.一种分离的髓磷脂碱性蛋白(MBP)肽，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

2.权利要求1的分离的髓磷脂碱性蛋白肽，该肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。

3.权利要求1的分离的髓磷脂碱性蛋白肽，该肽与一异种序列相连接。

4.权利要求3的分离的髓磷脂碱性蛋白肽，该肽为一种融合蛋白。

5.一种能够特异性结合一种抗体的分离的髓磷脂碱性蛋白肽，该抗体可定向抗一种特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro氨基酸序列的肽。

6.一种编码髓磷脂碱性蛋白肽的分离的核酸，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

7.权利要求6的分离的核酸，其中编码的髓磷脂碱性蛋白肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。

8.权利要求6的分离的核酸，其中该核酸含有序列编号：1的序列。

9.一种组合物，该组合物含有一种能够与T细胞受体结合的MHC II型复合物，该复合物的组成基本如下：

一种含有足以形成抗原结合袋的MHC II型分子胞外区域的MHCII型多肽，该成分由与作用于髓磷脂碱性蛋白的自身免疫疾病相关的等位基因编码，其中该II型成分在不存在去污剂或脂类的生理条件下为可溶性；以及

一种具有Phe-X-Lys-R₁-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列的髓磷脂碱性蛋白，其中X为任意一种氨基酸，R₁为Asn或Gln；

其中该髓磷脂碱性蛋白肽结合在MHC II型成分的抗原结合袋上。

10.权利要求9的组合物，其中的髓磷脂碱性蛋白肽具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列，或其保守取代物。

11.权利要求9的组合物，该组合物为一种融合蛋白。

12.权利要求9的组合物，该组合物进一步含有一种效应剂组分。

13.权利要求9的组合物，其中作用于髓磷脂碱性蛋白的自身免疫疾病为多发性硬化症。

14.权利要求9的组合物，其中的II型多肽含有HLA DR2的抗原结合袋。

15.一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的一种肽，该肽的特征为具有Phe-X-Lys-Asn-Ile-Val-X-X-X-Thr-X-X的氨基酸序列，其中X为任意一种氨基酸。

16.一种药用组合物，该药用组合物含有一种药学容许的载体和药学有效剂量的权利要求9的组合物。

17.一种抗体，该抗体在免疫反应条件下能够与一种髓磷脂碱性蛋白肽发生特异性免疫反应，该肽的特征为具有Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-Pro的氨基酸序列。

18.一种抗体，该抗体在免疫反应条件下能够与一种髓磷脂碱性蛋白肽发生特异性免疫反应，该肽含有由权利要求6的核酸编码的肽。

19.一种方法，用于抑制主体中由T细胞介导的抗髓磷脂碱性蛋白免疫应答，该方法包括将有效剂量的权利要求1的肽或权利要求9的组合物向主体给药，以治疗由T细胞介导的该免疫应答。

20.权利要求17的方法，其中由T细胞介导的该免疫应答可导致一种神经系统病变。

21.权利要求17的方法，其中该神经系统病变为多发性硬化症。

22.一种方法，用于鉴定抗原上的一种T细胞表位，当该表位结合在MHC II型分子的抗原结合袋上时能够与T细胞受体结合，这种结合可通过T细胞表达的该T细胞受体而触发一种细胞外酸化反应，该方法的步骤包括：

a)提供一种组合物，该组合物含有结合在MHC II型分子的抗原结合袋上的T细胞表位；

b)将表达该T细胞受体的T细胞与该表位接触；以及

c)测量细胞外酸化作用，其中细胞外酸化作用的改变可表明T细胞表位与该T细胞受体的结合。

23.权利要求20的方法，其中细胞外酸化作用的改变是利用微生理测量仪来进行测量。

Images