CN1241945A - 分离的与HLA-Cw*16分子复合的肽及其用途 - Google Patents

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皮埃尔·范德布鲁根
艾蒂安·德普莱恩
蒂埃里·布恩法勒尔
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Abstract

本发明涉及鉴定与HLA-Cw*16分子复合并随后可激发与其结合的细胞被溶细胞的T细胞溶胞的肽。还描述了其诊断和治疗用途。

Description

分离的与HLA-Cw*16分子复合的肽及其用途
本发明领域
本发明涉及免疫遗传学和肽化学。更具体地说,它涉及以各种方式使用的肽,包括作为免疫原和作为HLA-Cw*16分子的配体使用。更具体地说,它涉及所谓的“肿瘤排斥抗原”,该抗原来自基因MAGE-6编码的肿瘤排斥抗原前体,且由MHC类HLA-Cw*16分子提供。背景和现有技术
目前已经以许多不同的方式对宿主生物能否识别癌细胞进行了研究。对这一领域的了解使得对基础免疫学和癌症学都有了一些了解。
对小鼠肿瘤的早期研究揭示了当移植进同源动物时这些表现分子导致肿瘤细胞的排斥。这些分子在受体动物中被T细胞“识别”并激发溶解移植细胞的溶胞性T细胞反应。用诸如甲基胆蒽的化学致癌剂体外诱导的肿瘤首先获得了这一证据。发现肿瘤表达的且诱导T-细胞反应的抗原对于各肿瘤是不同的。参见Prehn等,国家癌症研究所杂志,18:769-778(1957);Klein等,癌症研究,20:1561-1572(1960);Gross,癌症研究,3:326-333(1943),Basombrio,癌症研究,30:2458-2462(1970)关于用化学致癌剂诱导肿瘤和细胞表面抗原差异的一般教导。这类抗原最后称为“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTAs”。当以化学致癌剂诱导时观察到存在该抗原后,经紫外照射体外诱导肿瘤时可获得相似的结果。参见Kripke,国家癌症研究所杂志,53:333-1336(1974)。
尽管对于上文所述的肿瘤类型观察到了T-细胞介导的免疫反应,但据认为自发肿瘤一般无免疫原性。因此据信在携带肿瘤的受试者中不存在激发与肿瘤反应的抗原。参见,Hewitt等,英国癌症杂志,33:241-259(1976)。
存在tum-抗原家族的细胞系是经过诱变小鼠肿瘤细胞或细胞系获得的免疫原性变异体,如Boon等,实验医学杂志,152:1184-1193(1980),其公开内容作为参考文献引用。详细来说,经过突变在同源小鼠中不产生免疫反应且形成肿瘤的肿瘤细胞(即,“tum+”细胞)获得tum-抗原。当诱变这些tum+细胞时,它们受同源小鼠排斥且不能形成肿瘤(因此称为“tum-”)。参见Boon等,美国科学院学报,74:272(1977),其公开内容作为参考文献引用。已显示许多肿瘤类型表现出这一表型。参见,例如,Frost等,癌症研究,43:125(1983)。
似乎tum-变异体不能形成进行性肿瘤,因为它们起动免疫排斥过程。支持这一假说的证据包括肿瘤的“tum-”变异体,即正常情况下不形成肿瘤的变异体在免疫系统受亚致死辐射损伤的小鼠中形成肿瘤的能力,Van Pel等,美国科学院学报,76:5282-5285(1979);以及腹膜内注射的肥大细胞瘤P815的tum-细胞指数繁殖12-15天且然后在中等流入量的淋巴细胞和巨噬细胞存在下仅仅几天即被清除的观察结果(Uyttenhove等,实验医学杂志,152:1175-1183(1980))。进一步的证据包括即使在细胞攻击后施用免疫抑制量的辐射时,小鼠仍能获得使其抗随后针对相同tum-变异体的攻击的免疫记忆的观察结果(Boon等,美国科学院学报,74:272-275(1977);Van Pel等,出处同上;Uyttenhove等,出处同上)。
随后的研究发现当对自发肿瘤进行诱变时,产生发生反应的免疫原性变异体。事实上,这些变异体能诱导针对原发性肿瘤的免疫保护反应。参见Van Pel等,实验医学杂志,157:1992-2001(1983)。因此,已表明可在作为同源排斥反应靶的肿瘤中诱导提供所谓的“肿瘤排斥抗原”。当将外源基因转染进自发肿瘤时已获得了相似的结果。在这方面,参见Fearon等,癌症研究,48:2975-1980(1988)。
已识别了一类抗原,它存在于肿瘤细胞的表面,且被溶细胞的T细胞识别,导致溶解。这类抗原称为“肿瘤排斥抗原”或下文称为“TRAs”。TRAs可以或不能诱导抗体反应。经过体外溶细胞的T细胞鉴定研究,即以特定溶细胞的T细胞(下文称为“CTL”)亚类鉴定抗原的研究已研究了这些抗原的诱导程度。当识别存在的肿瘤排斥抗原时,该亚类增殖,且存在肿瘤排斥抗原的细胞溶解。鉴定研究已鉴定了特异性溶解表达肿瘤排斥抗原的细胞的CTL克隆。这类研究的例子可参见Levy等,癌症研究进展,24:1-59(1977);Boon等,实验医学杂志,152:1184-1193(1980);Brunner等,免疫学杂志,124:1627-1634(1980);Maryanski等,欧洲免疫学杂志,124:1627-1634(1980);Maryanski等,欧洲免疫学杂志,12:406-412(1982);Palladino等,癌症研究,47:5074-5079(1987)。这类分析对于CTLs识别的其它类抗原是必需的,包括次要组织相容性抗原,雄性特异性H-Y抗原,和称为“tum-”抗原且在本文中讨论的这类抗原。
上文所述的受试者的肿瘤例子称为P815。参见DePlaen等,美国科学院学报,85:2274-2278(1988);Szikora等,EMBO杂志,9:1041-1050(1990),和Sibille等,实验医学杂志,172:35-45(1990),其公开内容作为参考文献引用。P815肿瘤是在DBA/2小鼠中用甲基胆蒽诱导且作为体外肿瘤及细胞系培养的肥大细胞瘤。P815细胞系经诱变后已产生了许多tum-变异体,包括称为P91A(DePlaen,出处同上),35B(Szikora,出处同上),和P198(Sibille,出处同上)的变异体。与肿瘤排斥抗原相反(且它是关键性区别),肿瘤细胞仅在诱变后存在tum-抗原。肿瘤排斥抗原存在于未经诱变的给定肿瘤的细胞上。因此,根据参考文献,细胞系可以是tum+,例如称为“P1”的细胞系,且可以被激发产生tum-变异体。由于tum-表型不同于亲本细胞系,人们预期tum-细胞系与其tum+亲本细胞系相比DNA有区别,且该区别可用于定位tum+细胞中感兴趣的基因。结果,发现诸如P91A,35B和P198的tum-变异体的基因与其正常等位基因的区别在于该基因编码区的点突变。参见Szikora和Sibille,出处同上,和Lurquin等,细胞,58:293-303(1989)。用本发明的TRAs证实事实并非如此。这些论文还证实来自tum-抗原的肽由Ld分子提供用于被CTLs识别。P91A由Ld提供,P35由Dd提供且P198由Kd提供。
转让给与本申请相同的受让人的1992年5月22日申请的PCT申请PCT/US92/04354教导了一个编码人肿瘤排斥抗原前体的基因家族,称为MAGE家族。一些这类基因也在Van der Bruggen等,科学,254:1643(1991)中讨论。现在已清楚MAGE家族的各种基因在肿瘤细胞中表达,且可用作诊断这些肿瘤的标记,以及用于本文讨论的其它目的。也参见Traversari等,免疫遗传学,35:145(1992);vander Bruggen等,科学,254:1643(1991)和De Plaen等,免疫遗传学,40:360(1994)。现在已相当充分地证实了蛋白质加工并出现在细胞表面的机制。本领域进展的综述可参见Barinaga,“获得一些‘骨架’:MHC如何结合肽”,科学257:880(1992);也参见Fremont等,科学,257:919(1992);Matsumura等,科学257:927(1992);Latron等,科学,257:964(1992)。这些论文总的来说表明结合MHC/HLA分子的肽需要9个氨基酸长(一个“九肽”),且表明了该九肽的第一个和第九个残基的重要性。
对MAGE基因家族的研究现在已揭示了特定的九肽事实上存在于一些肿瘤细胞的表面且九肽的存在需要存在HLA-A1分子。MAGE-1肿瘤排斥抗原复合物(“TRA”或“九肽”)导致存在该复合物的细胞被溶细胞的T细胞(“CTLs”)溶解。
应注意的是,例如,Melief等的申请系列号08/217,188,Traversari等的系列号08/217,187,和Townsend等的系列号08/217,186均提供了对其它来自MAGE的肽的研究。
在例如,1992年8月31日申请的美国专利申请系列号07/938,334中和在1993年7月7日申请的美国专利申请系列号073,103中提供的研究发现当比较各种MAGE基因同源区与编码相关九肽的MAGE-1基因区域时,有很大的同源性。事实上,这些观察导致本文中所公开的并在权利要求中所要求的本发明的一个方面,它是一个九肽家族,其中均具有相同的N末端和C末端氨基酸。这些九肽描述为单独或与载体肽偶联用于各种目的,包括其用作免疫原。九肽具有构成抗原表位的足够大小,对其产生的抗体描述为单独或作为更大多肽的一部分用于鉴定九肽。
人主要组织相容性复合物(MHC)系统是一个相关系统。该系统的一个特征是人白细胞抗原,或“HLA”。人细胞可根据其HLA特征进行“分类”。不是所有的细胞均存在所有类型的HLA分子。该系统的多样性可参见,例如,Zemmour等,免疫遗传学,37:239-250(1993)。该参考文献表明,到1992年为止,本领域已知确实有几十个不同的HLA等位基因。其公开内容作为参考文献引用的Cianetti等,免疫遗传学,29:80-91(1989)特别公开了一种MHC等位基因,文中称为HLA-C-克隆10。该等位基因后来被重新命名,如作为参考文献引用的Bodmer等,组织抗原,44:1-18(1994)。该等位基因现在称为HLA-Cw*1601。一个相关的等位基因,即,HLA-Cw*1602,也是已知的。参见也作为参考文献引用的Bodmer等,出处同上;Vilches等,人类免疫学,41:167-170(1994)。当一起讨论时,这两个等位基因称为“HLA-Cw*16”。作为参考文献引用的Van derBruggen等,欧洲免疫学杂志,24:2134-2140(1994)教导了溶细胞的T细胞(“CTLs”)识别肽与HLA-Cw*1601分子的复合物。这些数据也在现在已批准并作为参考文献引用的,1993年6月17日申请的共同未决的美国专利申请系列号08/79,110中和在作为参考文献引用的1994年2月15日申请的美国专利申请系列号08/196,630中公开。这两份申请均转让给了本申请的受让人。这两份申请公开了称为“BAGE”的肿瘤排斥抗原前体被加工成HLA-Cw*1601分子提供的肽。具体地说,该申请公开了一个优选的九肽:
Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu(SEQ ID NO:1)它与HLA-Cw*1601复合,从而刺激细胞系CTL82/82。
作为参考文献引用的美国专利号5,342,774公开了一个相关的核酸分子家族,它编码称为MAGE肿瘤排斥抗原前体的肿瘤排斥抗原前体。这些“TRAPs”编号为MAGE-1,MAGE-2等。一般来说,它们主要在肿瘤细胞上表达,正常的睾丸细胞大多数例外,它们被加工成由诸如HLA-A1,HLA-A2等各种HLA分子提供的肽。参见,例如,作为参考文献引用的美国专利号5,405,940。
不是所有的肿瘤细胞均表达全部MAGE TRAPs。因此,尽管本领域需要关于确实能刺激T细胞的肽与HLA分子的特定复合物的可用信息,但并不总是很有把握。人们需要细胞能同时表达所需的MHC分子和所需的TRAP分子,且具有将大型TRAP分子加工成更小的肿瘤排斥抗原或“TRA”。即使当特定的肽与MHC分子结合形成复合物,这本身并不保证该复合物会刺激CTL增生。换句话说,尽管肽和MHC的结合足以鉴定细胞上的MHC表型,但该结合只是必须的,不足以激发CTL增生。
然而,本发明人发现了MAGE-6基因编码的TRAP被加工成与HLA-Cw*16型MHC分子结合且由此也激发CTLs增生的TRAs。因此,本发明特别是涉及这些肽及其各种用途,并将在下面的说明书中进行解释。附图的简要描述
图1提供的数据显示了溶细胞的T细胞系CTL82/21溶解细胞系MZ2-MEL.43和MZ2-MEL.3.0,但不溶解细胞系MZ2-MEL.3.1,也不溶解天然杀伤细胞系K562。
图2描述了测定转染的,共同转染的,和未转染的各种细胞系是否刺激CTL82/21的TNF释放的试验结果。
图3显示了使用来自SEQ ID NO:2的肽的溶解试验的结果。优选实施方案的详细描述实施例1
以前的工作,例如,作为参考文献引用的Van den Eynde等,国际癌症杂志,44:634-640(1989)已显示人黑色素瘤细胞存在被溶细胞的T细胞系(下文称为“CTLs”)识别的多种抗原。4个这类抗原被Van den Eynde等,出处同上,称为MZ2-B,D,E和F。一个这种CTL被称为MZ2-CTL 82/21,且将它用于下面的实验。
一个熟知的黑色素瘤细胞系是MZ2-MEL,它来自腹部转移瘤。然后对该细胞系进行限制稀释以产生亚细胞系MZ2-MEL.3.0。随后培养该亚细胞系超过150代以产生亚细胞系MZ2-MEL.3.1。经过对MZ2-MEL.3.0进行诱变并然后限制稀释来制备另一亚细胞系MZ2-MEL.43。参见Herin等,国际癌症杂志,39:390-396(1987);Van den Eynde出处同上。然后将这三个细胞系MZ2-MEL.3.0,MZ2-MEL.3.1,和MZ2-MEL.43与杀伤细胞系K562一起用于51Cr释放试验,该试验使用上述CTL82/21并按Traversari等,免疫遗传学,35:145-152(1992)和Boon等,实验医学杂志,152:1184-1193(1980)进行。
显示于图1的结果特别表明:MZ2-MEL.3.1丧失CTL82/21靶向的抗原,但该抗原在MZ2-MEL.3.0和MZ2-MEL.43上均有发现。根据Van der Bruggen等,欧洲免疫学杂志,24:2134-2140(1994)的分析揭示该细胞系丧失编码HLA-A29,HLA-B44和HLA-Cw*1601的基因,这将其与MZ2-MEL.3.0和MZ2-MEL.3.1区分开来。这得出的结论是这三个所列的MHC分子之一负责提供与MHC分子组合并导致被CTL82/21识别的肽。实施例2
以前已经分离了编码HLA-Cw*1601的cDNA序列,可参见作为参考文献引用的van der Bruggen等,欧洲免疫学杂志,24:2134-2140(1994)。已知不能表达HLA-Cw*1601的细胞系是已知并可获得的,即,MZ2-MEL.2.2.5。也已知该细胞系不能表达MAGE-1(MZ2-MEL.2.2.5是表达MAGE-1的MZ2-MEL.2.2的一个亚细胞系)。MZ2 MEL-2.2.5表达MAGE-2,3,6和12。因此,它是用于测定HLA-Cw*1601与肽组合是否能激发被溶细胞的T细胞CTL82/21溶解的合适细胞系。
根据van der Bruggen等,欧洲免疫学杂志,24:2134-2140(1994)将HLA-Cw*1601 cDNA插入质粒pcDSRα。经过EcoRI位点将MAGE-1 cDNA插入质粒pcDNAI。因此构建了两个不同的质粒。根据van der Bruggen等,科学,254:1634(1991)的磷酸钙方法将这两个质粒与赋予G418抗性的质粒(即,pSVtkneo8)一起共同转染进MZ2-MEL.2.2.5。
首先选择转染子对G418的抗性,然后,经过按Traversari等,免疫遗传学,35:145-152(1992)测定它们是否刺激TNF生产,用CTL81/21来试验MAGE-1和HLA-Cw*1601的表达。简单来说,将1500CTLs加入补充了10%人血清和25U/ml重组人IL-2的100ulIscove’s培养基中。将该混合物与转染的MZ-MEL.2.2.5细胞组合,培养24小时,然后,收集上清。在Hansen等,免疫学方法杂志,119:203-21-(1989);Traversari等,免疫遗传学,35:145-152(1992)所述的MTT比色试验中,按Espevik等,免疫学方法杂志,95:99-105(1986)所述经过试验对WEHI-164克隆13细胞的细胞毒性来测定TNF含量。
图2中的前三条线段显示了这些结果,使用细胞系MZ2-MEL.43和MZ-MEL.3.1作为对照。MZ2-2.2.5的转染清楚地导致刺激CTL82/21。然而,从该研究还不清楚MAGE-1是否对刺激是必须的。实施例3
为了证实实施例2的实验获得的结果,以Brichard等,实验医学杂志,178:489-495(1993);Coulie等,实验医学杂志,180:35-42(1994);Seed等,美国科学院学报,84:3365-3369(1987)的DEAE-葡聚糖氯奎方法转染COS-7细胞,并以试验MZ2-MEL.2.2.5细胞相同的方式进行试验。除MAGE-1外,还使用编码其它TRAP的cDNA,包括MAGE-2,3,4和12,BAGE,Melan-A,酪氨酸酶,和GAGE-1,2,3,4,5和6。如上文所述,MZ2-MEL.2.2.5天然表达MAGE-2,3,6和12,且被转染以表达MAGE-1。这两组实验之间的一个区别是在MZ2-MEL.2.2.5细胞系中存在MAGE-6。实施例4
在实施例3的实验之后,从MZ2-MEL.43制备cDNA文库并使用标准方法插入pCDSRα。使用上文实施例2的方法学将该文库与在pCDSRα中含HLA-Cw*1601的质粒一起转染进COS细胞,然后也按上文所述试验TNF释放。获得了两个阳性克隆。使用熟知的方法将阳性克隆的质粒DNA电穿孔进细菌(大肠杆菌DH5α)。
鉴定阳性克隆后,提取质粒DNA,并将大约1/3与HLA-Cw*1601构建体一起转染进COS-7细胞。克隆GEP 3/317 2/B7获得被CTL82/21识别的特征。测序时,该克隆被鉴定为MAGE-6,如作为参考文献引用的DePlaen等,免疫遗传学,40:360-369(1994)中所述。SEQ ID NO:2提供了该序列。实施例5
MAGE-6被鉴定为TRAP,它被加工成所提供的肽,为测定有关的具体肽进行了研究。
为此,使用了PCR引物:
GACCAGAGTC ATCATGCCTCT    (SEQ IN NO:3)和
TCCTCCACTG ATCTTTACC      (SEQ ID NO:4)它们分别是有意义和反义引物,相应于SEQ ID NO:2 MAGE-6 cDNA的核苷酸147-167和1029-1047。
对克隆GEP 3/317 2/B7进行PCR扩增。在94℃处理4分钟后,进行20轮PCR循环(1个循环:94℃1分钟,60℃2分钟和72℃2分钟),随后在72℃进行15分钟。然后使用标准方法将PCR产物插入质粒pCR3,并转染进COS-7。所得的转染子不编码该抗原。
当经过序列分析比较截短形式与“基础克隆”,即GEP 3/317 2B/7时,注意到PCR产物由ORF的核苷酸147至1047组成,而基础克隆由核苷酸160-1104组成,表明该抗原肽必须具有核苷酸1047-1104上的C-末端。
根据该假说,构建了一系列肽,并在试验前冻干。冻干的肽溶于1体积的DMSO中,然后溶于加有10mM乙酸的9体积水中。由此稀释的肽贮存于-20℃。
经过Boon等,实验医学杂志,152:1184-1193(1980)的51Cr释放方法试验肽刺激CTLs溶解的能力。具体地说,37℃下51Cr标记HLA-Cw*1601阳性类淋巴母细胞细胞系,即LB678-EBV 1小时并充分洗涤。然后,在各种浓度的肽存在下,在96孔微量平板中,室温下培养1000个靶细胞15分钟。然后加入CTLs,4小时后在37℃下测量51Cr释放。
用肽:Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu(SEQ ID NO:5)首先出现溶解,该肽相应于MAGE-6的氨基酸126-137。也试验了更短的肽,发现由SEQ ID NO:5氨基酸2-10组成的九肽在30nM的肽浓度下实现一半的最大溶解。参见图3。
该九肽相应于在MAGE-3中所发现的序列,除了一个例外,即,该九肽的Arg在MAGE-3中是His。合成并试验了相应于MAGE-3序列的九肽,但发现不刺激溶解。同样,当试验由SEQ ID NO:5的氨基酸1-9,和SEQ ID NO:5的氨基酸3-10组成的肽时,发现它们都不刺激溶解。
因此,与HLA-Cw*1601结合的肽可限定为Ile是相对于Tyr的N-末端的肽,这两个残基被7个氨基酸分开。这些间隔氨基酸的第5个必须是Arg,Ile不一定是该肽的N-末端,Tyr也不一定是C-末端,因为如上文所述,SEQ ID NO:4的肽也结合HLA-Cw*1601并激发被溶细胞的T细胞溶解。
因此,本发明的一个方面是具有通式:
NH2-Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2TyrXaa-COOH(SEQ ID NO:6)的分离的肽,其中N末端Xaa和C末端Xaa是总共从0到3个氨基酸,并且可以是任意氨基酸。特别优选的是诸如SEQ ID NO:5的分子,其中N-末端Xaa是一个氨基酸,C-末端Xaa是两个氨基酸。还优选的是不存在NH2-Xaa和Xaa-COOH的分子,如由SEQ ID NO:5的氨基酸2-10限定的肽。这些肽是与诸如HLA-Cw*1601和HLA-Cw*1602的HLA-Cw*16型MHC分子结合的肽,且优选因此特异性地激发被CTLs溶解。因此,经过使用这些肽,包括带有可检测的信号标记的肽可鉴定存在HLA-Cw*16的细胞。如果该肽以足够复合细胞表面的HLA-Cw*16分子的量存在,那么该肽也可用于激发存在HLA-Cw*1601的细胞的溶解。经过例如,将细胞与肽接触,或用编码HLA-Cw*16和MAGE-6的一种核酸分子转化或转染宿主细胞可做到这点。其中任一或两种核酸分子可以是gDNA或cDNA。
关于HLA-C分子的结合基序已做了一些工作,尽管并没有取得象HLA-A分子一样的进展。参见,例如,Falk等,美国科学院学报90:12005-12009(1993),和Ramensee等,免疫遗传学41:178-228(1995),两篇文献均作为参考文献引用。这些参考文献,特别是Falk的文献表明,对于结合HLA-C分子的九聚体,位置3,5和6是重要的。因此,参考SEQ ID NO:6,特别优选的是没有NH2-Xaa和Xaa-COOH的分子,其中,产生下面通式:
Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr(SEQ ID NO:7),
其中在(Xaa)4内,第二个氨基酸是Gly,和/或第4个氨基酸是Pro。特别优选的是(Xaa)4中第二个Xaa是Gly,且(Xaa)4中第4个氨基酸是Pro的九肽。所有其它残基可以是任意其它氨基酸。
与本发明的这一方面相联系,应注意SEQ ID NO:2中所述的MAGE-6 cDNA的核苷酸1047至1104至少编码有关肿瘤排斥抗原的C-末端。测定SEQ ID NO:5抗原肽的位置开始于SEQ ID NO:2的核苷酸1033。因此,本发明的另一方面是由SEQ ID NO:2的核苷酸1033到1104组成的分离的核酸分子。该序列可单独用作,例如,测定MAGE-6表达的探针,或可用于与启动子有效连接的表达载体以表达相关肿瘤排斥抗原。用该核酸分子单独或与编码HLA-Cw*16的核酸分子结合转化或转染的细胞也是本发明的一个特征。
TRA的鉴定和其复合MHC分子的鉴定使得可以形成一种治疗方法,用于治疗具有以表达HLA-Cw*16分子为特征的疾病的受试者,如当提供TRA时的SEQ ID NO:5,或作为TRA与HLA的复合物,如HLA-Cw*16,可与诸如佐剂的物质结合以产生疫苗用于治疗以表达TRAP分子为特征的疾病。另外,可从在其表面存在TRA/HLA复合物的细胞,如非增生性癌细胞,非增生性转染子等制备疫苗。在细胞被用作疫苗的所有情况下,它们可以是用证实CTL反应所必须的一种或两种成分的编码序列转染的细胞或是表达两种分子的未转染的细胞。而且,使用本领域熟知的标准技术可将MAGE-6分子,其相关TRAs,如本文所公开的那些以及TRA和HLA的复合物用于生产抗体。
本文使用的“疾病”是指表达肿瘤排斥抗原前体的任何病理状态。这类疾病的例子是癌症,特别是黑色素瘤。
根据本说明书的治疗方案以受试者免疫系统的反应为前提,导致存在TRA的细胞,如存在HLA-Cw*16的细胞溶解。一个这种方案是给具有所述异常细胞表型的受试者施用对该复合物具有特异性的CTLs。体外产生该CTLs在技术人员所掌握的技术范围内。具体地说,将诸如血细胞的细胞样品与存在该复合物并能激发特定CTL增生的细胞接触。该靶细胞可以是转染子,如上文所述类型的COS细胞。这些转染子在其表面存在所需的复合物,且当与感兴趣的CTL结合时,刺激其增生。COS细胞,如本文所用的那些细胞可广泛获得,与其它合适的宿主细胞一样。
为了更详细地描述称为过继转移的治疗方法(Greenberg,免疫学杂志,136(5):1917(1986);Reddel等,科学257:238(7-10-92);Lynch等,欧洲免疫学杂志,21:1403-1410(1991);Kast等,细胞,59:603-614(11-17-89)),存在所需复合物的细胞与CTLs结合导致对其特异性的CTLs增生。然后将增生的CTLs施用给具有其特征在于某些异常细胞存在特定复合物的细胞异常的受试者。然后CTLs溶解异常细胞,从而实现所需的治疗目的。
上述疗法假定至少一些受试者的异常细胞存在相关的HLA/TRA复合物。这很容易测定,因为本领域对于鉴定存在特定HLA分子的细胞以及如何鉴定表达有关序列(在本例中是MAGE-6序列)的DNA的细胞是非常熟悉的。一旦经过上述筛选方法鉴定了存在相关复合物的细胞,它们可与来自病人的样品结合,其中,该样品含有CTLs。如果存在该复合物的细胞被混合的CTL样品溶解,那么可假定存在BAGE产生的肿瘤排斥抗原,且该受试者是上述治疗方案的合适的候选人。
过继转移不是根据本发明可用的疗法的唯一形式。使用许多方法也可在体内激发CTLs。一种方法,即,使用表达该复合物的非增生性细胞已在上文进行了描述。用于该方法的细胞可以是正常情况下表达该复合物的那些细胞,如辐射过的黑色素瘤细胞或用一种或两种对提供该复合物所必需的基因转染的细胞。Chen等,美国科学院学报,88:110-114(1991年1月)例证了该方法,显示了在治疗方案中使用表达HPVE7肽的转染细胞。可使用各种细胞类型。同样,可使用携带一种或两种感兴趣的基因的载体。特别优选病毒和细菌载体。在这些系统中感兴趣的基因被,例如,牛痘病毒或细菌BCG携带且事实上用该材料“感染”宿主细胞。所得的细胞存在感兴趣的复合物并被自体CTLs识别,然后增生。经过将肿瘤排斥抗原或其前体与佐剂结合以帮助掺入存在感兴趣的HLA分子的提供HLA-Cw*16的细胞可实现相似的效果。TRAP被加工以产生HLA分子的肽配偶体,而TRA的存在不需进一步加工。
本发明的其它方面对技术人员来说是显而易见的,且在此不必重复。
已采用的术语和表达用作描述术语而不是限定,且并不打算用这些术语和表达来排除所示和所述特征的任何等价物或其部分,因为应认识到在本发明范围内作出各种修饰是可能的。(1)一般信息:
(i)申请人:van der Bruggen,Pierre;DePlaen
           Etienne;Boon-Falleur,Thierry
(ii)发明名称:分离的与HLA-Cw*16分子复合的的
              肽及其用途
(iii)序列数:9
(iv)联系地址:
  (A)联系人:Felfe & Lynch
  (B)街道:805 Third Avenue
  (C)城市:纽约城
  (D)州:纽约州
  (F)邮编:10022
(v)计算机可读形式:
  (A)媒体类型:3.5英寸软盘,360kb存储量
  (B)计算机:IBM
  (C)操作系统:PC-DOS
  (D)软件:Wordperfect
(vi)最近申请数据:
  (A)申请号:
  (B)申请日:
  (C)分类:
(vi)在先申请数据:
  (A)申请号:08/713,354
  (B)申请日:1996年9月13日
  (C)分类:435
(viii)律师/代理人信息;
  (A)姓名:Hanson,Norman D.
  (B)登记号:30,946
  (C)参考/文摘号:LUD 5460-PCT
(ix)电信信息:
  (A)电话:(212)688-9200
  (B)电传:(212)838-3884(2)序列鉴定号1的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:9个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:1:
  Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu
                   5(2)序列鉴定号2的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:1375个核苷酸
  (B)类型:核酸
  (C)链型:单链
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:2:GCCGGCCCAG GCTCGGTGAG GAGGCAAGGT TCTGAGGGGA CAGGCTGACC TGGAGGACCA   60GAGGCCCCCG GAGGAGCACT GAAGGAGAAG ATCTGCCAGT GGGTCTCCAT TGCCCAGCTC  120CTGCCCACAC TCCCGCCTGT TGCCCTGACC AGAGTCATCA TGCCTCTTGA GCAGAGGAGT  180CAGCACTGCA AGCCTGAAGA AGGCCTTGAG GCCCGAGGAG AGGCCCTGGG CCTGGTGGGT  240GCGCAGGCTC CTGCTACTGA GGAGCAGGAG GCTGCCTCCT CCTCTTCTAC TCTAGTTGAA  300GTCACCCTGG GGGAGGTGCC TGCTGCCGAG TCACCAGATC CTCCCCAGAG TCCTCAGGGA  360GCCTCCAGCC TCCCCACTAC CATGAACTAC CCTCTCTGGA GCCAATCCTA TGAGGACTCC  420AGCAACCAAG AAGAGGAGGG GCCAAGCACC TTCCCTGACC TGGAGTCTGA GTTCCAAGCA  480GCACTCAGTA GGAAGGTGGC CAAGTTGGTT CATTTTCTGC TCCTCAAGTA TCGAGCCAGG  540GAGCCGGTCA CAAAGGCAGA AATGCTGGGG AGTGTCGTCG GAAATTGGCA GTACTTCTTT  600CCTGTGATCT TCAGCAAAGC TTCCGATTCC TTGCAGCTGG TCTTTGGCAT CGAGCTGATG  660GAAGTGGACC CCATCGGCCA CGTGTACATC TTTGCCACCT GCCTGGGCCT CTCCTACGAT  720GGCCTGCTGG GTGACAATCA GATCATGCCC AAGACAGGCT TCCTGATAAT CATCCTGGCC  780ATAATCGCAA AAGAGGGCGA CTGTGCCCCT GAGGAGAAAA TCTGGGAGGA GCTGAGTGTG  840TTAGAGGTGT TTGAGGGGAG GGAAGACAGT ATCTTCGGGG ATCCCAAGAA GCTGCTCACC  900CAATATTTCG TGCAGGAAAA CTACCTGGAG TACCGGCAGG TCCCCGGCAG TGATCCTGCA  960TGCTATGAGT TCCTGTGGGG TCCAAGGGCC CTCATTGAAA CCAGCTATGT GAAAGTCCTG 1020CACCATATGG TAAAGATCAG TGGAGGACCT CGCATTTCCT ACCCACTCCT GCATGAGTGG 1080GCTTTGAGAG AGGGGGAAGA GTGAGTCTGA GCACGAGTTG CAGCCAGGGC CAGTGGGAGG 1140CGGTTTGGGC CAGTGCACCT TCCGGGGCCC CATCCCTTAG TTTCCACTGC CTCCTGTGAC 1200GTGAGGCCCA TTCTTCACTC TTTGAAGCGA GCAGTCAGCA TTCTTAGTAG TGGGTTTCTG 1260TTCTGTTGGA TGACTTTGAG ATTATTCTTT GTTTCCTGTT GGAGTTGTTC AAATGTTCCT 1320TTTAACGGAT GGTTGAATGA GCGTCAGCAT CCAGGTTTAT GAATGACAGT AGTCA      1375(2)序列鉴定号3的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:21个核苷酸
  (B)类型:核酸
  (C)链型:单链
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:3:
GACCAGAGTC ATCATGCCTC T                             21(2)序列鉴定号4的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:19个核苷酸
  (B)类型:核酸
  (C)链型:单链
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:4:
TCCTCCACTG ATCTTTACC                                19(2)序列鉴定号5的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:12个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:5:  Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu
           5                       10(2)序列鉴定号6的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:15个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(ix)特征:
  (D)其它信息:每个Xaa可以是任意氨基酸。一个、
     两个或所有N-末端和C-末端可以没有Xaa。
(xi)序列描述SEQ ID NO:6:
xaa xaa Xaa Ile xaa xaa xaa xaa Arg xaa xaa Tyr xaa xaa xaa
                 5                   10                 15(2)序列鉴定号7的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:9个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(ix)特征:
  (D)其它信息:每个Xaa可以是任意氨基酸。
(xi)序列描述SEQ ID NO:7:
Ila Xaa Gly xaa Pro Arg Xaa Xaa Tyr
                 5(2)序列鉴定号8的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:9个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:8:
   Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr
                       5(2)序列鉴定号9的信息:
(i)序列特征:
  (A)长度:10个氨基酸残基
  (B)类型:氨基酸
  (D)拓扑学:线型
(xi)序列描述SEQ ID NO:9:
Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr
                 5                  10

Claims (17)

1.由氨基酸序列Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr Xaa组成的分离的肽,其中第1个Xaa是0-3个氨基酸长,第4个Xaa是0-2个氨基酸长,且第1个和第4个Xaa总共不超过3个氨基酸长,各Xaa是任意氨基酸,且所述肽与HLA-Cw16分子结合。
2.权利要求1的分离的肽,由氨基酸序列Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr组成。
3.权利要求1的分离的肽,具有通式Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr,其中(Xaa)4中第2个Xaa是Gly。
4.权利要求1的分离的肽,具有通式Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr,其中(Xaa)4中第4个Xaa是Pro。
5.权利要求1的分离的肽,具有通式Ile Xaa Gly Xaa ProArg(Xaa)2Tyr。
6.权利要求2的分离的肽,其中所述的肽是Ile Ser Gly GlyPro Arg Ile Ser Tyr。
7.权利要求1的分离的肽,其中所述的肽是Lys Ile Ser GlyGly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu。
8.权利要求1的分离的肽,其中所述的肽是Lys Ile Ser GlyGly Pro Arg Ile Ser Tyr。
9.权利要求1的分离的肽,其中所述的HLA-Cw16分子是HLA-Cw*1601。
10.激发对肽与HLA-Cw16分子复合物具有特异性的溶细胞的T细胞增生的方法,包括在有利于T细胞识别所述的复合物且随后增生的条件下将含有T细胞的样品与在其表面存在HLA-Cw16分子和权利要求1的肽的复合物的细胞接触。
11.权利要求10的方法,其中所述的细胞是天然存在的人细胞。
12.权利要求11的方法,其中所述的细胞是癌细胞。
13.权利要求10的方法,其中所述的细胞是用编码HLA-Cw16分子的核酸分子转化或转染的细胞。
14.权利要求10的方法,其中所述的细胞是用编码至少部分MAGE-6肿瘤排斥抗原前体的核酸分子转化或转染的细胞,所述的部分至少编码通式Xaa Ile(Xaa)4Arg(Xaa)2Tyr Xaa的肽,其中第1个Xaa是0-3个氨基酸长,第4个Xaa是0-2个氨基酸长,各Xaa是任意氨基酸,且第1个和第4个Xaa总共不超过3个氨基酸长。
15.由MAGE-6的cDNA的核苷酸1033至1104组成的分离的核酸分子。
16.包含有效连接到启动子上的权利要求15的分离的核酸分子的表达载体。
17.用权利要求16的表达载体转化或转染的细胞系和细胞株。
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