CN1238778A

CN1238778A - 用于测定apc蛋白质异常形式表达的方法

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Publication number: CN1238778A
Application number: CN97199017A
Authority: CN
Inventors: 米夏埃尔·普夫伦德舒; 克里斯托夫·伦纳
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1996-08-21
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 1999-12-15
Also published as: AU4233197A; AU719934B2; EP0948516A4; EP0948516A1; US5861308A; WO1998007737A1; NZ334744A; CA2264054A1; JP2001501459A; KR20000068257A

Abstract

本发明公开了一组与T细胞活化有关的蛋白质，也公开了编码它们的核酸分子。同时讨论了这些物质的各种用途，例如用于测定APC蛋白质异常形式的存在与否。此测定方法可用于测定结肠癌的诱因，或用作该病情的诊断方法。同时公开了编码这些蛋白质的核酸分子。

Description

用于测定APC蛋白质异常形式表达的方法

相关申请

本申请是1996年8月21日提交的系列号08/701,223的部分连续申请，并且本文作为参考文献引用。本发明领域

本发明涉及编码与活化T细胞有关蛋白质的分离的核酸分子。本发明还涉及所编码的蛋白质以及该核酸分子和蛋白质在各种方法学，如在与T细胞活化有关病情和与腺瘤性结肠息肉病(“APC”)蛋白质表达有关病情的诊断中的应用。背景和现有技术

在过去的10年里，T细胞生物学领域中的研究骤增，并且该领域随着对T细胞在各种生物学过程中的各种作用逐渐明了或更明了而继续扩展。

现已经接受T细胞在肿瘤免疫学中发挥重要作用。具体地说，T细胞识别细胞表面上MHCⅠ类分子和肽的各种复合物并且裂解这些“靶子”。其发生的过程是复杂的，并且已经在许多众所周知的文献中讨论过。

癌症病人中可见到T细胞活性的下降，并且已表明抑制T细胞活性导致防止发生肿瘤免疫学控制。已经开发出数种免疫治疗方法，其共同目的为恢复病人T细胞活性。为了获得对本领域的总体了解，参见，如，Pardoll，今日免疫学14:310-316(1993),Boon等，今日免疫学15:11-15(1994)，本文引用这两篇文献仅供参考。

已开发出的一种更为成功的策略是双特异性单克隆抗体(下文称为“Bi-MAbs”)的使用，该抗体靶向和活化针对抗原阳性肿瘤细胞的广泛的静息T细胞，继而诱导肿瘤细胞的破坏。参见Renner&Pfreundschuh，免疫学综述145:179-191(1995)，本文引用仅供参考。在该技术的具体应用中，何杰金氏淋巴瘤用作模型。混合2种Bi-MAbs，其中第一种由识别何杰金氏病相关性CD30抗原的一条臂所组成，第二种识别触发T细胞的CD3或CD28分子，从而导致肿瘤细胞在体外和体内的有效裂解。参见Renner等，科学264:833-835(1994)，本文引用仅供参考。如Renner等，在血液87:2930-2933(1996)中所报导的，具有何杰金氏淋巴瘤的SCID小鼠优先对该方法做出应答。

对涉及Bi-MAb介导的T细胞活化和肿瘤细胞裂解机制的进一步研究揭示了多种活化标记、细胞因子和细胞因子蛋白质在结合的CD3和CD28抗原交联后迅速被上调。参见，Renner等，欧洲免疫学杂志：25:2027-2032(1995)。该研究的效果依据下面的事实，即Bi-MAb介导的T细胞刺激模拟依赖于2个信号的T细胞活化的生理途径。按常规，一个信号由MHC限制性方式提供的肽活化T细胞受体来传送，并且第二个特有的信号由T细胞上的CD28抗原与众多相应抗原呈递细胞上B-7家族的相互作用提供。参见Linsley等，实验医学杂志173:721-730(1991)；Linsley等，免疫学年鉴11:191-212(1993)。

细胞中基因表达频繁涉及细胞上各种分子的作用。研究各种基因表达的变化需要具有各种可使用的分析模型。一种这样的方法为差异显示，或差异mRNA显示。该方法由Liang等，科学257:967-971(1992)；Liang等，当前免疫学观点7:274-280(1995)(引用这两篇文献以供参考)以及Pardee和Liang的美国专利号5,762,311(同样引用以供参考)教导。简单地说，该方法学的完成需要从2种待比较的细胞种群中分离总RNA。分离后，2种RNA的第一条链拷贝用在其末端具有的特异性二核苷酸的寡聚-dT引物经反转录制备。然后为聚合酶链式反应。其中的3’引物和随机5’引物用于产生cDNA片段。此短的随机引物的使用使研究者摆脱了需要依赖于已知DNA序列并且使寻找未知基因更为容易。

已经进行了这样的研究，即其中的差异显示方法学已经用于分离在恶性肿瘤(如，脑瘤)、心脏病和糖尿病中差异性表达的基因。参见Zhang等，分子癌症学8:123-126(1993),Utans等，美国科学院院报91:6463-6471(1994)；Joseph等，生化及生物物理研究通讯20:1227-1234(1994)。此方法也已用于乳腺癌研究，并且已经鉴定了与正常组织相比在肿瘤细胞中被上调的一些cDNA片段。这些基因在肿瘤发生中的作用有待阐明。参见Liang等，癌症研究52:6966-6968(1992)。

本申请包括将差异显示技术应用于T细胞活化并鉴定此过程中涉及的分子。具体地说，本申请涉及鉴定在CD3和CD28激发分子的联合刺激后那些差异性表达的分子。从下面的内容，这将变得一目了然。

家族性腺瘤结肠息肉病是一种常染色体显性遗传病，它诱发个体的多发性结肠息肉和癌症。已经观察到具有该病的个体在肿瘤抑制(APC)基因中具有种系突变。参见Nagase等，人类突变2:425(1993)。其它学者注意到APC基因中自发性改变似乎出现于非家族性结肠肿瘤发生的早期，并且可在很小的良性瘤以及微小发育异常的病灶中监测到。参见Jen，等，癌症研究54:5523(1994)；Powell，等，自然359:235(1992)。Albertsen等的美国专利号5,352,775公开了一种APC相关基因，但其与本说明书无任何关系。

观察到APC基因最常见的改变为羧基端编码区的丢失。已经观察到APC蛋白质羧基端区域与EB1相联系，并且EB1不结合突变APC基因产物。几乎所有APC基因突变导致编码蛋白质的截短和与EB1相互作用的丧失，这表明APC蛋白质与EB1或其所属的家族成员间的相互作用对于APC正常肿瘤抑制功能是重要的。本发明特别包括下面的发现，即本文公开的分子，即RP1、RP2和RP3为EP1家族成员并且功能类似于EB1。观察到这些分子与APC基因产物(其表达与，如结肠癌病理学相关的蛋白质分子)相互作用。附图简述

图1描述了通过各种单克隆抗体刺激T细胞而获得的差异mRNA显示。照此表示了相应于RP1的带。

图2列出了设计用于测定在各种肿瘤衍生的细胞系中RP1表达的实验结果。实施例1

设计本文所述的实验以找出特异性涉及T细胞活化的基因表达。

使用静息和活化的T细胞。后者按，如Renner等，在免疫学综述145:179-191(1995)(引用以供参考)中所述通过与Bi-MABs接触而被活化。已知Renner等(出处同上)所述的Bi-MABs靶向并活化广泛的静息T细胞，使其针对抗原阳性肿瘤细胞有活性，并且因此诱导肿瘤细胞的毁坏。使用的Bi-MABs包括识别何杰金氏病相关抗原“CD30”的一条臂和识别T细胞上CD3激发分子或CD28激发分子的另一条臂。参见Renner等，科学264:833-835(1994)，本文引用仅供参考。也参见Renner等，血液87:2930-2937(1996)，本文引用仅供参考。2篇Renner的文献均描述了如何制备这些Bi-MAbs。

用确定的技术通过从健康供体的血沉棕黄色层中分离外周血单核细胞而获得T细胞样品，用Renner等的MACS技术(欧洲免疫学杂志25:2027-2032(1995)，本文引用仅供参考)同时反富集(negatively enriched)T细胞和B细胞。应用此技术后，余下的淋巴细胞＞95％分别为CD3⁺或CD19⁺。污染的细胞部分一直低于0.5％，并且经PMA(10ng/ml)或PHA(100ng/ml)刺激后2-5天时间内没有观察到扩增。用标准技术也分离CD4⁺或CD8⁺细胞以得到＞97％的纯细胞部分。

用此方式处理来自2个健康供体的样品。一旦T细胞得到纯化，按照Renner等在欧洲免疫学杂志25:2027-2032(1995)中所述(本文引用仅供参考)，在CD30融合蛋白质CD30-FP存在下，通过分别结合T细胞与200ng/ml的抗-CD3/CD30和抗-CD28/CD30的Bi-MAbs活化各样品的一部分，然后进行Renner等的活化方法达48小时。对照包括用与两种Bi-MAbs相同的条件培养具有一种Bi-MAbs或不具有抗体的样品。通过在具有10ng/ml LPS的完全培养基中培养MACS纯化的细胞18小时来活化B细胞。

活化后，用标准方法从T细胞中分离mRNA并且然后根据Liang等，核酸研究21:3269-3275(1993)(本文引用仅供参考)用于mRNA差异显示系统中。具体地说，在10ul体积中将2ug总细胞RNA与1单位DNA酶Ⅰ于37℃混合30分钟以去除染色体DNA污染。用二种寡聚d(T)锚定引物[d(T)₁₁GC和d(T)₁₁CG]对4ul无DNA的RNA反转录60分钟。通过加入1单位RNA酶至每小管中消化余下的RNA。然后用一种锚定引物和2种随机10聚体引物的组合根据Bauer等，核酸研究21:4272-4280(1993)(本文引用仅供参考)进行PCR。放射性核苷酸37PdATP用作标记。参数包括下面的循环：95℃5分钟，然后94℃1分钟，40℃1分钟，并且72℃1分钟。完成40个循环后再接着一个72℃8分钟。将得到的扩增cDNA于6％聚丙烯酰胺DNA测序胶中分离。从凝胶中切下任何目的条带，洗脱cDNA并且用相同的条件重复PCR。将扩增和纯化的cDNA用商业上可得到的产品克隆入质粒PCRⅡ中，然后用已知的方法测序。

用不同的引物进行总共20次PCR，得到大约2000个cDNA片段。分析显示这其中的15个对人类T细胞中联合CD3/CD28抗原活化的刺激是特异性的。因为在对照组没有检测到其表达，并且在其它供体中可稳定重复。发现约1/3的片段相应于已知结构和功能的基因并且2/3与已知基因仅仅具有部分同源性或无同源性。一种cDNA，下文称为“RP1”用于下面的一些实验。实施例2

为了证实差异表达发生的假说，进行Northern印迹分析。

用实施例1中所述的细胞和方法(出处同上)分离总RNA，并且将20ug样品于10％甲醛琼脂糖凝胶上分离，然后转移交联到硝酸纤维素上。印迹以³²PdCTP标记的探针在甲酰胺缓冲系统(50％甲酰胺，5×SSC,5×Denhardts,1％SDS,200ug/ml热变性鲑精)中于42℃杂交12-16小时，然后的12-16小时内于42℃洗膜15分钟2次，接着X-光胶片曝光24-48小时。使用的探针为实施例1中讨论的RP1 mRNA(出处同上)。作为对照，使用了覆盖TCR相关zeta-链或GAPDH cDNA部分编码区的700个碱基对的cDNA片段。

图1列出了这些结果，并且显示了单个2.6千碱基对的转录产物。实施例3

实施例1中发现的cDNA片断为350个碱基对长，而Northern印迹显示出2.6kb的转录产物。鉴于此差别，根据作为参考文献引用的Frohmann等，美国科学院院报85:8998-9002(1988)进行RACE PCR。具体地说，从100ug从活化T细胞中提取的总RNA纯化poly(A)mRNA，并且用商业RACE试剂盒产生全长cDNA。用标准方法将得到的cDNA克隆入质粒PCRⅡ中。

进行标准的测序方法学并且SEQ ID NO:1列出了该序列。该序列为2.6kb长。

在核苷酸141-1121中发现了一个开放阅读框，导致产生了一个推断的327个氨基酸的蛋白质，其计算出的分子量约为37千道尔顿。实施例4

然后进行进一步的RACE-PCR实验以测定是否有其它的5’序列。发现2个与SEQ ID NO:1具有高度同源性的其它核苷酸序列。这些分别称为RP2和RP3。RP2的核苷酸序列与推导的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中描述。RP3的部分序列在SEQ ID NO:3中描述。

RP1在核苷酸和推断的氨基酸水平的序列表现出与已知EB1基因家族显著的同源性。RP1显示出与称为EB2并且由Su等，癌症研究55:2972-2977(1995)所报导的序列具有最高的同源性。该序列是Su等所述各种ESTs的构建体。实施例5

上面讨论的Northern印迹分析显示RP1表达仅仅在活化的T细胞中被诱导。为了避免与EB1的交叉反应性，仅用来自该序列3’-端的探针进行检测。

观察到当由2种Bi-Mabs刺激时发生的RP1信息的上调在细胞因子，如IL-2而不是CD28介导的CD3共刺激的二级信号时发生，尽管没有提供这些数据。单独CD3特异性抗体或细胞因子的信号传导不影响此表达水平。

当对RP1 mRNA表达动力学进行研究时，观察到mRNA表达迅速，并且活化后约4小时达到峰值。

当对纯化的T细胞亚种群进行研究时，在CD8⁺淋巴细胞中发现最高水平的转录产物。实施例6

进行一系列实验以研究在各种肿瘤来源细胞系中RP1的表达。在这些实验中，用上述方法学从不同肿瘤细胞系或T细胞提取20ug总mRNA。此外，在3个不同的实验中，用50,000个细胞根据Renner等，欧洲免疫学杂志25:2027-2032(1995)(本文引用仅供参考)在细胞周期分析中测试各细胞系中的2×10⁶个细胞。在S/M/G2期中的细胞百分比认为是增殖的细胞，并且这些百分比在本文中给出。测试静息和活化T细胞(分别为图2中1道和2道(5％和45％))，同样测试不同何杰金氏病来源的细胞系L428(3道，12％)和L540(4道，20％)以及HDLM2(5道，13％)、KMH2(6道，15％)、Jurkat(7道，33％)、静息PBLs(8道，14％)、K562(9道，53％)、Daudi(10道，48％)、U937(11道，27％)、KARPAS(12道，22％)和HPP-ALL(13道，23％)。使用的探针为RP1 cDNA(SEQ ID NO:1)，GAPDH片段用作对照。也测试在G1期被阻断的细胞或未处理细胞(K562，在每种情况)中RP1的表达，分别显示出7.4％和42％的增殖。

图2中见到的数据显示RP1在不同肿瘤细胞系中的表达变化相当大。各个细胞系的RP1的表达与增殖活性间存在相关性。在S/M/G2细胞周期时相中具有高细胞比例的快速分裂的细胞具有高水平的RP1表达。此证据可见于何杰金氏病来源的细胞系L428和HDLM2，它们仅仅约12％的细胞位于S/M/G2期，并且没有或仅仅具有低水平的表达。相反，快速分裂的其细胞中有53％和48％位于S/M/G2期中的K562和Daudi细胞显示出高水平RP1的表达。RP1表达与细胞周期活性间的相关性由上述对K562的阻断实验所证实。类似的模型见于B细胞。实施例7

进行其它的实验以证实实施例6中提出的观察结果。在这些实验中，使用了K562肿瘤细胞。

已知嗜酸菌素捕获G1期的肿瘤细胞，并且通过在完全培养基中混合1×10⁷个细胞与5μg/ml嗜酸菌素，然后孵育20小时而用于阻断G1期K562肿瘤细胞。

孵育后，用上述方法分析细胞的RP1 mRNA。仅仅7.5％的K562肿瘤细胞正在增殖，并且这与未阻断的细胞相比仅仅显示出最小量的RP1，未阻断细胞中42％位于S/M/G2期，并且有强烈的RP1 mRNA的表达。

这些结果也见于B淋巴细胞中。实施例8

然后进行研究以测定RP1在事实上是否与腺瘤性结肠息肉病蛋白质(下文称为“APC”蛋白质)相互作用。鉴于观察到的RP1和EB1家族成员(已经报导与APC相互作用)间的同源性，进行了这些实验。

使用2个结肠细胞系，一个表达全长APC(细胞系SW48)，另一个与何杰金氏病来源的肿瘤细胞系L540CY一样表达截短的APC(细胞系SW480)。使用这些细胞系是因为与其它研究过的细胞相比，观察到它们表达明显更高水平的APC。

用已知的方法将RP1编码区克隆进商业上可得到的载体，即，pQE-31中以制备HIS标记的融合蛋白质。该融合蛋白质用于下面的实验中。以该方式还制备了含有CD30抗原胞外域的第二种蛋白质。此蛋白质用作对照。

裂解上面所称的细胞，然后将裂解液与20μg/ml抗HIS-标记的鼠单克隆抗体和20ug/ml RP1-His标记蛋白质混合。混合物在4℃孵育过夜。

然后通过添加0.2ml 1∶1(v/v)蛋白质A小珠和羊抗小鼠多克隆抗体的混合物完成免疫沉淀。从这些小珠上洗脱沉淀的蛋白质，并且然后进行6％SDS-PAGE凝胶电泳。用10μg/ml抗APC特异性单克隆抗体和辣根过氧化物酶交联的羊抗小鼠多克隆抗血清(1∶1000)进行Western印迹。用标准的方法观察抗体结合。

用CD30 HIS标记融合蛋白质作为对照进行平行实验(以显示特异性的RP1-APC相互作用)，并且第二个对照基于何杰金氏病来源肿瘤细胞系的裂解物。

全长APC显示出300kD的分子量，而本文所述的实验类型中截短的APC显示出150kD的分子量，故区分这二者是简单的事。

这些结果表明相互作用仅仅在SW48产生的全长APC中出现，但在SW480产生的截短蛋白质中不出现。实施例9

继续进行上面实施例8中所述的实验以进一步对RP蛋白质在APC介导过程中的作用进行鉴定。为达到此目的，从活化的PBLs(其中的第一个RP分子(RP1)已经被检测到)中制备cDNA文库。然后一般按照由Fields等所述(自然340:245(1993)，本文引用仅供参考)对此文库进行双杂交筛选程序。在该系统中，扩增RP1的整个编码区，然后此扩增产物用作钓饵。测试大约100万个转化子。在阳性克隆中存在一个表达部分肌动蛋白分子的克隆。在下面的研究中追踪该观察结果。实施例10

通过在2ml缓冲液中裂解1×10⁷个SE480结肠癌细胞(见上文)完成共沉淀研究。然后将裂解液(200ul)与20ug RP1-HIS蛋白质(上述)或100ul RP1特异性抗体混合。这些RP1特异性mAbs通过对重组RP1淘选人抗体噬菌体文库而产生，其细节在下面实施例中描述。混合物于4℃孵育过夜，然后1000g离心10分钟，以5％的终浓度添加以裂解缓冲液平衡的金属亲和树脂，从而将表达HIS的蛋白质或His标记的抗体结合到该树脂上。然后将此混合物在室温下搅拌20分钟。

通过500g离心20分钟然后以裂解缓冲液洗树脂而分离结合的与未结合的蛋白质。将洗过的沉淀物重悬于200ul样品缓冲液中，然后于100℃变性5分钟，并且加样到12.5％的SDS-凝胶电泳膜中，并且于100v免疫印迹45分钟。然后将凝胶上泳道与单克隆抗肌动蛋白抗体孵育，用兔抗小鼠的辣根过氧化物酶标记的抗体和底物观察其结合。

这些实验显示RP1与42KDa蛋白质共沉淀。这是肌动蛋白的适当大小。进一步交联实验表明RP1与非活化的肌动蛋白质形成稳定的复合物，反之亦然。实施例11

根据作为参考文献引用的Vaughar等，自然，生物技术14:309-314(1996)在噬菌体中制备重组单链Fv抗体文库。Fv片段相当于单克隆抗体。通过遵循Vaughan等所述(出处同上)，将Fv抗体用myc和HIS蛋白质标记。

然后将此scFv抗体片段噬菌体文库按如下用于筛选程序中。将按照上述制备的重组RP1(下文称为“rRPl”)用于在100mMNaHCO₃(pH9.6)中包被免疫管，并且于4℃孵育过夜。然后将免疫管用在磷酸盐缓冲液(10mM PO₄ ^3-,0.9％NaCl,pH7.2)中的2％的脱脂奶粉(下文称为“MPBS”)于室温下封闭30分钟。然后，将500微升含有6×10⁹不同克隆的噬菌体文库与500微升4％MPBS孵育30分钟。

洗涤包被的免疫管，然后加入该噬菌体文库，并且孵育2小时。任何表现出在其包被上与Fv片段反应的噬菌体附着到rRP1上。通过洗15次去除未结合的噬菌体。以1mM三甲胺，pH12筛选任何弯曲(bending)的噬菌体。10分钟后，以0.5ml 1.0MTris-HCl(pH7.4)中和高pH。然后将任何洗脱出的噬菌体用标准技术用于感染大肠杆菌TG1菌株30分钟。实施例12

通过在琼脂糖培养板上于30℃培养感染的TG1菌株过夜使洗脱的噬菌体在大肠杆菌中扩增。从平板上刮下细菌并且置于2×TYAG培养基(16g细菌用胰蛋白胨，10g酵母，5g NaCl,100mg氨苄青霉素，2％琼脂糖)中。经与辅助噬菌体M13-K07共感染对数中期的2×10⁹个细菌获取噬菌体。然后将此细菌在添加了25mg/ml卡拉霉素和100mg/ml氨苄青霉素的2×TY(即，16g细菌用胰蛋白胨，10g酵母，5g NaCl)中孵育过夜。此培养基称为TYAK。孵育后，用PEG沉淀出这些噬菌体，并且然后用于再转染大肠杆菌。获得的噬菌体按上述用于进一步筛选和扩增。总之，使用3轮筛选，然后将筛出的噬菌体用于感染大肠杆菌菌株Hb2151，然后其进一步培养于琼脂糖培养板上以获取单菌落。将这些菌落于2×TYAG中培养过夜以产生含有可溶性Fv分子的上清液。实施例13

一旦制备出可溶性分子，进行实验以从非特异性中分离RP1特异性物质。这通过以下步骤完成，首先经过向平板每孔中添加(100ul)rRP1以rRP1包被微滴定板或者用牛血清蛋白(100ul)包被微滴定板，两者在100mMNaHCO₃(pH9.6)中以100ug/ml的溶液加入。于4℃孵育微滴定板过夜，然后以BPS-Tween20冲洗3次，并且然后以2％MPBS于室温封闭至少30分钟。然后，以0.1％PBS-Tween20洗平板3次并且随后加入(100ul)4％脱脂奶粉培养基，接着加入(100ul)含有可溶性抗体片段的上清液。于室温孵育此混合物2小时，然后以上述PBS-Tween 20洗涤孔3次。通过加入(90ul)4％MPBS中的抗-myc抗体以结合到Fv抗体上的myc标记而检测结合的Fv片段。使其孵育1小时并且随后再次以PBS溶液洗3次，接着染色。以这种方式，鉴定出了27个阳性克隆。实施例14

然后用His-标记的重组RP1将上面鉴定出的Fv克隆用于标准的Western印迹中并且抗His的单克隆抗体用作对照。检测到相当的蛋白带。实施例15

进行进一步研究以更为准确地证实RP1和肌动蛋白间结合的性质。这通过以DNA酶(已知结合肌动蛋白)进行抑制分析而加以测定。

肌肉G-肌动蛋白用众所周知的技术用凝胶过滤获自兔肌肉组织。然后用N-芘基碘乙酰胺将其标记。随后，加入20ul G-肌动蛋白和等摩尔量的标记的DNA酶和RP1混合物。在第二套实验中，加入G-肌动蛋白之前以超过4.5摩尔的量将RP1加入到G-肌动蛋白中，并且立即测定孵育前的荧光，然后在5分钟时间内再测定。

结果表明RP1的确与DNA酶竞争结合肌动蛋白。实施例16

进行进-步实验以测定是否RP1可通过胸腺素β4或本领域已知的肽THp1从与肌动蛋白的结合中解离。该肽被鉴定为含有胸腺素β4最小长度的肌动蛋白结合片段。参见van Troys等，EMBO J 15:201(1996)；Feinberg等，生化及生物物理研究通讯222:127(1996)；K.Vancompernolle等，EMBO J 11:4739(1992)。除了使用胸腺素或THp1以及DNA酶外，这些实验与实施例11中的实验完全相同。发现当胸腺素β4或该肽以3.5或20倍过量摩尔数使用时RP1与G-肌动蛋白的结合完全被阻断。当该实验用胸腺素来源的不含已知G-肌动蛋白结合位点的肽进行时，该分子不受阻止。

这些实验证实了下面的观察结果，即RP1的氨基酸101-106，即：Leu Lys Lys Thr Glu Thr(SEQ ID NO:4)与胸腺素β4的肌动蛋白相互作用区域的六聚体基序是相同的。实施例17

RP1结合G-肌动蛋白并且G-肌动蛋白参与微丝组织的事实提出了这样的问题，即是否此结合对微丝组织具有功能后果。

为了测肌动蛋白在RP1、胸腺素β4或RP1来源的肽，即：KPDMAEIEKFDKSKLKKTETQ(SEQ ID NO:5)存在下肌动蛋白聚合的能力。根据Brenner等，生物化学杂志．258:5013(1983)检测芘基标记的肌动蛋白荧光的增加测定聚合。简言之，用本领域公认的技术以芘基标记单聚G-肌动蛋白。然后，将测试分子于20℃与10uM G-肌动蛋白(其中5％被标记)预孵育。通过添加盐至100mM(KCl)的终浓度起始聚合。然后将获得的值与0时间没有盐时加入蛋白质而获得的值作比较。

发现0.1摩尔浓度的RP1仅仅部分抑制聚合，而等摩尔比率的RP1或胸腺素β4完全抑制聚合。在THp1或SEQ ID NO:5的情况中，发现聚合以剂量依赖性的方式受到抑制以提供抗所述RP蛋白质的抗体反应并且分离出由此产生的抗体。

前面实施例描述了一些分离的核酸分子，本文称为编码RP1、RP2和RP3的核酸分子(分别为SEQ ID NO:1,2和3)。这些分离的核酸分子与活化的T细胞相关。因此，本发明的一个方面包括分离的核酸分子，如SEQ ID NO:1,2和3中列出的分子，这些分子是活化的T细胞中的特征性分子。在严格条件下与SEQ IDNO:1,2和3中任何一个或所有序列均杂交的那些分离的核酸分子也是本发明的一部分。本文使用的“严格条件”指至少严格到下面的条件，即以1.0×SSC于42℃洗涤15-30分钟。可以在更高温度/或更低SSC条件，且其它参数适当改变的条件下洗涤。

以有效键(即，“有效连接”)将本发明核酸分子掺入到启动子中的表达载体也是本发明的一部分。与细胞转化或转染以制备真核细胞系或编码目的分子的原核细胞菌株一样，这些载体的构建为本领域所熟知。以这种方式可利用的宿主细胞的实例为COS细胞、CHO细胞、酵母细胞、昆虫细胞(如，草地夜蛾)、NIH3#3细胞等。也可以使用原核细胞，如大肠杆菌和其它细菌。

本文所述的蛋白质的原始形式和翻译后修饰的形式也是本发明的一部分，这些分子足够大从而在没有任何翻译后修饰情况下具有抗原性，并且因此其以前体和翻译后修饰形式与佐剂(或无佐剂)结合用作免疫原。如下所述，它们可作为完整蛋白质或其一部分的形式使用。抗该抗原的抗体也是本发明的一部分，它们可以是多克隆抗体、单克隆抗体、反应性片段，如Fab、F(ab)₂’和其它片段以及是嵌合体、人源化抗体、重组产生的抗体等。这些可用前述的蛋白质制备。

从这些内容很明显，人们可以在诊断上使用本发明的蛋白质及核酸分子。例如，可以经过，如，测试受试者体液样品，如血清与抗原本身的反应性而分析相关的病理学。反应性将认为是病理学可能存在的指标从而也可以经过本领域众所周知的任何一种标准核酸杂交分析来测定该抗原的表达，并且在本文中不必详述。人们可以用标准的免疫分析等测定抗受试分子的抗体。

RP家族成员在活化T细胞中的表达表明以异常T细胞活化为特征的病理学，如T细胞淋巴瘤通过施用RP抑制剂是可以治疗的。这些抑制剂的实例有蛋白质抑制剂，如包括上述蛋白质的抗体、可溶性受体、相互作用的小分子等。在核酸水平上，合适的治疗剂包括反义分子，如10到75个，优选17到50个核苷酸长的寡核苷酸，表达抑制剂等。

本发明也包括应用RP1,2和/或3分子与APC蛋白质的相互作用作为APC蛋白质异常表达的指标。如上面所显示的，RP蛋白质，如RP1，与全长APC而不是羧基截短的APC相互作用。由于截短的形式涉及病理学症状，本发明的一个方面为用于通过测定是否RP蛋白质结合样品中的靶分子而测定是否发生APC的异常表达。本文所用的“异常”指APC分子中的任何突变，如导致其羧基端部分缺失的突变以及该分子不表达。这种检测可以经过，例如可鉴定形式的RP1蛋白质(即，以可检测的标记来标记的RP蛋白质)之间配体/受体型结合，使用RP特异性抗体的免疫分析等来完成。使用的标记可以是放射性、荧光、电化学、发光物，诸如金的方法，等。这些标记也可以是标记系统中的一部分，如酶，或与共-反应物反应后产生可检测信号的其它分子。这些系统在本领域中是众所周知的，并且不必在此列出。

使用的RP分子可以是由SEQ ID NO:1,2或3编码的完整分子或其结合正常APC分子而不结合异常形式的任何一部分。如上所述，对这种结合或其缺失的研究是结肠癌、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎的诱因或存在的指标或者是其存在的指标。

本发明的其它特征对技术人员将是显而易见的，并且不必在此重复。

所采用的术语及表达方式用作描述术语并且不是限制性术语，且并不打算使用这些术语和表达方式来排除所示及所述特征的任何等价物或其部分，应该认识到在本发明范围内的各种修饰是可能的。(1)一般信息：

(ⅰ)申请人：Pfreundschuh,Michael；

Renner,Christoph

(ⅱ)发明题目：与T细胞活化有关的分离的核酸分

子及其应用

(ⅲ)序列数目：2

(ⅳ)通讯地址：

(A)地址：Felfe&Lynch

(B)街道：805第三大街

(C)城市：纽约市

(D)州：纽约

(F)邮编：10022

(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：磁盘，3.5英寸，360kb存储量

(B)计算机：IBM

(C)操作系统：PC-DOS

(D)软件：Wordperfect

(ⅵ)当前申请数据：

(A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：

(ⅵ)优先申请数据：

(A)申请号：08/701,233

(B)提交日期：1996年8月21日

(C)分类：435

(ⅷ)律师/代理人信息：

(A)姓名：Hanson,Norman D.

(B)登记号：30,946

(C)参考/登记号：LUD 5440.1-PCT

(ⅸ)电讯信息：

(A)电话：(212)688-9200

(B)电传：(212)838-3884(2)SEQ ID NO:1信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2606个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1：CTAGAATTCA GCGGCCGCTG AATTCTAGCG AGCAGGCGGC AGGCACGGTC CGTGCGGAGAGGCGAGCGAG CGGGAAGACG CAGCCACCTT CCTCACCAGC CAGCCCACAG CGGTTTGTTCCCCTTCTCGG GAGTGCGCCA ATG CCT GGG CCG ACC CAA ACC CTG TCC CCA AAT

Met Pro Gly Pro Thr Gln Thr Leu Ser Pro AsnGGC GAG AAC AAC AAC GAC ATC ATC CAG GAT AAT AAC GGG ACC ATC ATTGly Glu Asn Asn Asn Asp Ile Ile Gln Asp Asn Asn Gly Thr Ile IleCCT TTC CGG AAG CAC ACA GTG CGC GGG GAG CGT TCC TAC AGT TGG GGAPro Phe Arg Lys His Thr Val Arg Gly Glu Arg Ser Tyr Ser Trp GlyATG GCG GTC AAT GTG TAT TCT ACC TCG ATA ACC CAA GAG ACT ATG AGCMet Ala Val Asn Val Tyr Ser Thr Ser Ile Thr Gln Glu Thr Met SerATC ATT GCA TGG GTT AAT GAC ATA GTA TCT AGA CAT GAC TTA AAC TACArg His Asp Ile Ile Ala Trp Val Asn Asp Ile Val Ser Leu Asn TyrACA AAA GTG GAA CAG CTT TGT TCA GGA GCG GCC TAT TGC CAA TTC ATGThr Lys Val Glu Gln Leu Cys Ser Gly Ala Ala Tyr Cys Gln Phe MetGAC ATG CTC TTC CCT GGC TGC ATT AGT TTG AAG AAA GTA AAA TTT CAAAsp Met Leu Phe Pro Gly Cys Ile Ser Leu Lys Lys Val Lys Phe GlnGCA AAG CTG GAA CAT GAA TAT ATT CAC AAT TTT AAA CTT CTG CAA GCAAla Lys Leu Glu His Glu Tyr Ile His Asn Phe Lys Leu Leu Gln AlaTCA TTT AAG CGA ATG AAC GTT GAT AAG GTA ATT CCA GTG GAG AAG CTASer Phe Lys Arg Met Asn Val Asp Lys Val Ile Pro Val Glu Lys LeuGTG AAA GGA CGT TTC CAG GAC AAC CTG GAT TTT ATT CAA TGG TTT AAGVal Lys Gly Arg Phe Gln Asp Asn Leu Asp Phe Ile Gln Trp Phe LysAAA TTC TAT GAT GCT AAC TAC GAT GGG AAG GAG TAT GAT CCT GTA GAGLys Phe Tyr Asp Ala Asn Tyr Asp Gly Lys Glu Tyr Asp Pro Val GluGCA CGA CAA GGG CAA GAT GCA ATT CCT CCT CCT GAC CCT GGT GAA CAGAla Arg Gln Gly Gln Asp Ala Ile Pro Pro Pro Asp Pro Gly Glu GlnATC TTC AAC CTG CCA AAA AAG TCT CAC CAT GCA AAC TCC CCC ACA GCAIle Phe Asn Leu Pro Lys Lys Ser His His Ala Asn Ser Pro Thr AlaGGT GCA GCT AAA TCA AGT CCA GCA GCT AAA CCA GGA TCC ACA CCT TCTGly Ala Ala Lys Ser Ser Pro Ala Ala Lys Pro Gly Ser Thr Pro SerCGA CCC TCA TCA GCC AAA AGG GCT TCT TCC AGT GGC TCA GCA TCC AAAArg Pro Ser Ser Ala Lys Arg Ala Ser Ser Ser Gly Ser Ala Ser LysTCC GAT AAA GAT TTA GAA ACG CAG GTC ATA CAG CTT AAT GAA CAG GTASer Asp Lys Asp Leu Glu Thr Gln Val Ile Gln Leu Asn Glu Gln ValCAT TCA TTA AAA CTT GCC CTT GAA GGC GTG GAA AAG GAA AGG GAT TTCHis Ser Leu Lys Leu Ala Leu Glu Gly Val Glu Lys Glu Arg Asp PHeTAC TTT GGG AAG TTG AGA GAG ATC GAG CTA CTC TGC CAA GAA CAC GGGTyr Phe Gly Lys Leu Arg Glu Ile Glu Leu Leu Cys Gln Glu His GlyCAG GAA AAT GAT GAC CTC GTG CAG AGA CTA ATG GAC ATC CTG TAT GCTGln Glu Asn Asp Asp Leu Val Gln Arg Leu Met Asp Ile Leu Tyr AlaTCA GAA GAA CAC GAG GGC CAC ACA GAA GAG CCG GAA GCA GAG GAG CAASer Glu Glu His Glu Gly His Thr Glu Glu Pro Glu Ala Glu Glu GlnGCC CAC GAA CAG CAG CCC CCG CAG CAG GAA GAG TACAla His Glu Gln Gln Pro Pro Gln Gln Glu Glu TyrTGACCCACCC CGGCTGCTCT TGACACTTCC ATTGTGTGTG GGAACGTTTC TTCTGGAGAATTGGAACATG TGTGGCCCCA AGCTCAACAG AAACCAGTTG TTCCCAATCT GCCGTTACCATCAACGCACT GTTGCATATG CCAGCCACTG CGCTTGGTTC CCATTTTCTT TGCTAAGGTGTATTAGCGGA CGGCCCTCTG GCCACCTACC CGAGAGATCG TAGGGTCACA TTCATCCAACTTCACCACTT GGCTGCTTGA GATTGGTTCT GCTCTTTTCT TCATTCCTTT CCAGAACAACTCTTTCCCAC CCCAACACCA CTGCCACCAC CCCTCTTTTT ATCCTGGTGT GAAACAATGGTAATTTGATA TATGGTATTT ATATTGGCAT TTTTCAACCC AGTGTCACTA GATGTCACACACATTTGTGG TGCTTTGATG TTTGCAAGTC TAACCTCTGA ACATAAATTT GGTCAAATAATTGGAACAAA GGGAAACAGA TACTTGATAT GAAAGCCATA ATGACGGTGA CTTGTGTCGTGGGGGAAAAC ATAAGGTCAT TTTCTCCCTC TACTCACAAT ACTAAAGGGA AAAAATGGATTCAAAGCTAG GATTTCAGGG CCCAGCAGTG TTCCTCCATC AGCATGTTAG ACAACTACACAGTATGTTGT TAGTTTTGAA AGACATTCAC TCAAGGAAAA CACCATCTCA ACTTTGCCCGCTCACCATGT CCCTTGCCCC CATGTAGCCC ATTTCCCAGG TTATGCTCTT TTCTTTCTCAGGGTCCTCTT TGGTGGGCAG CCACTCCCCG AGATGTTGCC ATCAGTTTTC TGCAGTCCAAAGAGGGTATG GTTAGGTACG GGTCTTCCTG CCTCATTCCT CTTCCTCTTT GTGTAGGTTTCAGCCACAAA ACTGTCATTC ACTCTAGGGG ACCCCTACTA AAGGGTAACT TCAGGTGTGCAGCCCTGAGC TCCAAGGCTC TGCACCATGC CACACACTTG CTGTAAGGCT AGAAGTGAAGACCTTATTAA TAGGAGCATA ATTGCGAGGG AGAATCATCG TTCTGCAGTC TGGTGTAGACACTGGAATAA CAGCACAGAA AAATCTATGA CTCCCAATAT CTTCTAGAAT AAAGAATTTTCCCTCTTTAA CACAAGGGCC CTCCTTGTCA TTGACCTTAG CTAAACCATG GCAATTCATAAATAGAGGAA ACATTAATGA ATTAAAAGCA TTCCTTATTT TTTAACTAAT ATTTGTACATTTTCTTAGTC TCTTTCCAAG TCTTTGCCTC TTTTTTTTCT TTATTTTTAT TTTTTCCTTTGACAGATGGT ATCCCTTCCT GGATCATTCA TTTCACCTTG GTTTCTAACT TTAGGTTTACTTTCACTTGT TATTTGACTT AGCAGGTGCA ACAAAAACAA GAAACAAATG TGCCCACCCCACTTTCCGCT TAACTGAAAA GCTTAAAATA AATTTCCGAA TTATG(2)SEQ ID NO:2信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：380个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:GGTGAGTGGG TAAAGTTGAG ATGGTGTTTT CCTTGAGTGA ATGTCTTTCA AAACTAACAA 60CATACTGTGT AGTTGTCTAA CATGCTGATG GAGGAACACT GCTGGGCCCT GAAATCCTAG 120CTTTGAATCC ATTTTTTCCC TTTAGTATTG TGAGTAGAGG GAGAAAATGA CCTTATGTTT 180TCCCCCACGA CGCAAGTCAC CGTCATTATG GCTTTCATAT CAAGTATCTG TTTCCCTTTC 240GTTCCAATTA TTTGACCAAA TTTATGTTCA GAGGTTAGAC TTGCAAACAT CAAAGCACCA 300NAAANGTGCC CACCCCACTT TCCGNTTAAC TGAAAAGCTT AAAATAAATT TCTGAATTAT 360GTATCCCGAA AAAAAAAAAA 380(2)SEQ ID NO:3信息：

(ⅰ)序列特征：

(A)长度：碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:GAGCCGCCTC GTGCACTCTG GGGTATGCCC GTCAATGTGT ACTCCACATCTGTGACCAGT GTAAATCTGA GTCGCCATGA TATGCTTGCA TGGGTCAACGACTCCCTGCA CCTCAACTAT ACCAAGATAG AACAGCTTTG TTCAGGGGCAGCCTACTGCC AGTTCATGGA CATGCTCTTC CCCGGCTGTG TGCACTTGAGGAAAGTGAAG TTCCAGGCCA AACTAGAGCA TGAATACATC CACAACTTCAAGGTGCTGCA AGCAGCTTTC AAGAAGATGG GTGTTGACAA AATCATTCCTGTAGAGAAAT TAGTGA

Claims

1．用于测定样品中腺瘤性结肠息肉病(APC)蛋白质的异常形式表达的方法，包括将所述样品与RP分子的至少一部分接触，其中所述的部分结合正常的APC蛋白质而不结合异常形式的APC蛋白质，并且测定所述RP分子的结合或其缺失作为所述APC蛋白质异常形式表达的指标。

2．权利要求1的方法，其中所述的RP分子的至少一部分选自：(a)具有SEQ ID NO:1描述的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，(b)具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质和(c)具有SEQ ID NO:3描述的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质。

3．权利要求1的方法，其中分子的所述部分用可检测到的标记进行标记。

4．权利要求1的方法，进一步包括将所述的样品与RP特异性的结合配偶体接触并且测定所述结合配偶体的结合作为所述异常APC表达存在或其缺失的指标。

5．权利要求4的方法，其中所述的结合配偶体为抗体。

6．权利要求5的方法，其中所述的抗体为标记的抗体。

7．特异性结合RP分子的分离的抗体或抗体结合片段。

8．权利要求7的分离的抗体或抗体结合片段，其中所述的RP分子是RP1。

9．权利要求7的分离的抗体或抗体结合片段，其中所述的RP1具有SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列。

10．权利要求7的分离的抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。

11．权利要求7的分离的抗体结合片段，其中所述的抗体结合片段是Fv片段。

12．通过以RP蛋白质免疫非人的动物而制备的抗RP蛋白质的多克隆抗体。

13．权利要求12的多克隆抗体，其中所述的RP是RP1。

14．权利要求7的分离的抗体或抗体结合片段，其中所述的抗体是嵌合抗体。

15．权利要求14的分离的抗体或抗体结合片段，其中所述的嵌合抗体为人源化的。

16．编码与活化T细胞有关的蛋白质的分离的核酸分子，所述的分离的核酸分子包括SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2，或SEQ IDNO:3的核苷酸序列。

17．编码与活化T细胞有关的蛋白质的分离的核酸分子，所述的分离的核酸分子在严格的条件下与SEQID NO:1,SEQ IDNO:2，或SEQ ID NO:3中至少一个杂交。

18．含有可操作地连接到启动子上的权利要求16的分离的核酸分子的表达载体。

19．含有可操作地连接到启动子上的权利要求17的分离的核酸分子的表达载体。

20．含有权利要求18的表达载体的转化或转染的细胞。

21．含有权利要求19的表达载体的转化或转染的细胞。

22．用于筛选以异常T细胞活化为特征的疾病的方法，包括将含有T细胞的样品与权利要求17的分离的核酸分子接触并且测定所述分离核酸分子的杂交作为潜在T细胞疾病的指标。

23．权利要求22的方法，其中所述的分离的核酸分子是SEQID NO:1,SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:3。

24．由权利要求17的分离的核酸分子所编码的分离的蛋白质。

25．由权利要求16的分离的核酸分子所编码的分离的蛋白质。

26．特异性地结合权利要求24的分离的蛋白质的抗体。

27．权利要求26的抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。

28．用于筛选以异常T细胞活化为特征的疾病的方法，包括将含有T细胞的样品与权利要求26的抗体接触并测定所述抗体的结合作为可能的T细胞相关性疾病的测定方法。