JP5657890B2 - ヒト塩味受容体および塩味知覚を調節する方法 - Google Patents
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Description
本出願は2006年10月19日出願の米国仮出願第60/853,290号の利益を主張し、その全内容は、その全体があらゆるの目的のために、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般的には細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本発明はナトリウムイオンチャネルおよびヒトでの塩味認識におけるその役割に関する。
特許、公開された出願、技術論文および学術論文を含む種々の出版物が本明細書中に引用されている。これらの引用された出版物の各々は、その全体があらゆるの目的のために、本明細書中の参照によって組み込まれる。
本発明は、少なくとも1つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも1つのガンマポリペチドサブユニット、および少なくとも1つのデルタポリペチドサブユニットを含む単離されたヒトの塩味受容体を提供し、ここで、デルタポリペチドサブユニットは配列番号12のアミノ酸配列を含む。いくつかの側面において、デルタポリペチドサブユニットは、配列番号9のアミノ酸配列を有する。また、少なくとも1つのアルファポリペチドサブユニット、少なくとも1つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも1つのデルタポリペチドサブユニット、および少なくとも1つのガンマポリペチドサブユニットを含む、単離されたヒトの塩味受容体も提供される。
当然のことながら、この発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されず、もちろん多様であり得る。また当然のことながら、ここで用いる用語は特定の側面だけを記述することを目的としているに過ぎず、限定することを意図するものではない。
ヒト茸状乳頭および味覚細胞を得るための手法
ヒト茸状乳頭を含む味蕾は、局所麻酔下で実行される小手術生検法によって、ボランティアの舌の前背面から日常的に得られる。一般的な手法は、Spielman, AI et al. Collection of taste tissue from mammals. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Spielman AI and Brand JG eds. CRC Press, Boca Raton, FL, pp 25-32に記載されている。ボランティアは、インフォームドコンセントを提供する。この手法は施設内倫理委員会によりチェックされ、承認されたものである。切除された乳頭は、その後、RNA抽出、免疫組織化学またはin situハイブリダイゼーションのために、または、単離された味覚細胞の懸濁液をもたらす手法に用いることができる。
全RNA抽出に用いる場合、乳頭を直ちにTRIzolTM試薬(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いた標準的な抽出手法に供する。RNA抽出物は、大部分のゲノムDNAを除去するために、DNA分解酵素で処理する。さもなければ、残存するあらゆるDNAは、イントロンを挟んだ(intron-spanning)プライマーが利用できないその後の工程において、偽陽性の結果をもたらし得る。しかしながら、ゲノム材料は、ゲノムDNAの単一コピーがPCRの最も高い感度の時点を知らせ、それによって当該手法における便利なエンドポイントを提供するため、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(QRT−PCR)に有用である。その後、逆転写をRNAに対して行い、相補的DNAまたはcDNAとして知られるRNAのDNAによるコピーを得る。このcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応において基質として用いる。
生検で得た茸状乳頭からの総RNAの抽出を上記の通り、DNA分解酵素処理なしで行い、次に第一鎖cDNAの合成を行う。ENaCサブユニット(500bp以下のサイズ)の増幅は、上記のプライマーを用いて、PCR Core System I試薬キット(Promega Corp., Madison WI)により行うことができる。
ヒト塩味受容体の同定およびデルタサブユニットの重要性
本発明により、ヒト茸状(味覚)乳頭におけるENaCのデルタサブユニットが提供される。当該サブユニットが見出されたクローンは、舌の前背面から複数の茸状乳頭を取り出すための生検処置を受けることに同意した3名の個人からのプールされたcDNAからのものであった。
上皮ナトリウムチャネルのデルタサブユニットは、RT−PCRによって13名の個人からの茸状乳頭で検出された。検出された断片はPCRによって増幅し、サブクローニングした。次いで、これらの13名の個人からのデルタサブユニットをコードしているポリヌクレオチドを完全にシーケンシングした。茸状乳頭からのヒトのデルタサブユニットが、腎臓からクローニングしたヒトのデルタサブユニットと、推定アミロライド結合部位において異なることが決定された。推定アミロライド結合部位は、腎臓からのデルタサブユニットでは第532アミノ酸にチロシンを含むが(配列番号8)、茸状乳頭からのデルタの第532アミノ酸は、シーケンシングした13サンプルの各々においてシステインであった(配列番号9)。
ヒトの味蕾は図1に示されており、そこでは、ヒト茸状乳頭の8ミクロン切片をATPアーゼ組織化学法によって染色してある。問題は今度は、これらの味覚細胞の一部がデルタENaCを発現するのか、全てが発現するのか、またはいずれも発現しないかということになる。デルタサブユニットを発現する細胞のみを見るために、デルタ型のヒトENaCに対する抗体をウサギで作製した。代表的な写真を図5に示す。スライドは、ヒト味蕾内の細胞のサブセットに対する組織特異的標識を示す。この意味は、ヒト塩味受容体が、デルタ、ベータおよびガンマサブユニット、あるいは、アルファ、デルタ、ベータおよびガンマサブユニットの多量体から構成されるENaCであるということである。味覚細胞におけるデルタのこの特異性は、これらの同じ味蕾における全長アルファの顕著な不足とともに、ヒト塩味受容体がデルタを含むENaCであり、他者が示唆するような単なるアルファ、ベータ、ガンマENaCではないことを示唆している。
単離された味蕾単一細胞の懸濁液は、ヒト茸状乳頭から、生検で得た乳頭のコラゲナーゼベースの酵素的手法でのインキュベーション、引き続く、酵素を効果的に除去するための乳頭の洗浄、その後のガラスのピペットによるその破砕により調製した。得られた懸濁液は、味蕾細胞について濃縮した。個々の細胞をガラス製マイクロピペットで捕獲し(図6参照)、後に、2〜10μlのRNAlaterを含むチューブに個別に入れた。
cDNAを、上述のとおり個別に単離、捕獲した7種のヒト茸状味覚細胞から得、次いでプールした。正しいサイズ(〜500bp)の生成物が認められ、シーケンシングによりそのヒトENaCデルタサブユニットとしての同一性が確認された。デルタENaCのORFの重複セグメントを同定するこのPCR手法を用いて、味覚細胞デルタENaCの完全なORFを得た。
リポソームおよび人工脂質二重層の調製
この例は、大量の受容体をその膜環境から可溶化し、受容体を精製し、脂質二重層などの人工脂質膜に受容体を再構成するために容易に行うことができる技法を示す。かかる膜は、そこで受容体がそのネイティブなコンフォメーションを回復し、詳細に、単離状態で、例えば、他のタンパク質または生細胞の代謝的な気紛れからの干渉なしに研究できる、人工生体膜として用いられる。
リポソームは、可溶化された受容体を二重層構築物へ運ぶのに用いる。膜溶解性タンパク質を研究するための大きな課題は、タンパク質をその天然の膜または合成エンドポイントから人工脂質二重層まで動かすための手法を開発することである。可溶化は通常界面活性剤を用いるが、この界面活性剤は、二重層の損傷を避けるために除去しなければならない。リポソームは、界面活性剤系からタンパク質を取り込み、それを二重層に引き渡すことによって、この移送を実行する。
複数の界面活性剤、例えばTween、CHAPS、Triton、コール酸ナトリウムまたは/およびオクチル−グルコシドのうちの1つを含む100mMのNaCl/50mMのトリス、pH=7.1に溶解した、所定量(0.01〜0.5μg)のL−ArgRをリポソームに加えた。シングルチャンネル事象としてのチャンネル活性を測定するためのタンパク質の脂質に対する比率(質量:質量)は、1:2000〜5000である。巨視的特性を測定するための比率は、1:50〜100の範囲である。タンパク質−脂質混合物は、20〜30分間インキュベートする。
複数の界面活性剤、例えばTween、CHAPS、Triton、コール酸ナトリウムまたは/およびオクチル−グルコシドのうちの1つを含む100mMのNaCl/50mMのトリス、pH=7.1に溶解した、所定量(0.01〜0.5μg)の対象とするナトリウムチャネル、例えば、ENaCα、ENaCδ、またはENaCサブユニット、α、β、γ、δに由来する特定の比率の混合物をリポソームに加える。シングルチャンネル事象としてのチャンネル活性を測定するためのタンパク質の脂質に対する比率(質量:質量)は、1:2000〜5000である。巨視的特性を測定するための比率は、1:50〜100の範囲である。タンパク質−脂質混合物は、20〜30分間インキュベートする。膜チャネルであるENaCタンパク質は、リポソームに再構成される間溶液のままである必要があるため、この手順を引き続き行う。
平面脂質二重層は2つの水性コンパートメントの間の開口上に形成され、これらを、作業上の目的のために、シスおよびトランスコンパートメントと呼ぶ。制御膜電位を制御するために、電圧発生器をシスコンパートメントにAg/AgCl電極により接続する。トランスコンパートメント(仮想アース)は、第2のAg/AgCl電極によって、電流測定用増幅器の入力に接続する。
DOPE:DOPCの4:1混合物を25μlのn−デカンに溶解する(15〜25mg/mlの範囲の濃度)。この混合は室温に保ち、実験を行う各日に調製する。電極コンパートメントを3MのKClで満たし、Ag/AgCl電極をコンパートメントに設置する。シスおよびトランスコンパートメントを記録用浴溶液(100mMのNaCl、10のTris、pH7)で満たし、これらと電極コンパートメントとの間に寒天ブリッジを設置する。二重層を形成するために、脂質混合物滴をシス側から穴の上へ散布する。
二重層が形成された後、10〜15μlのプロテオリポソームを、継続的に攪拌しながら二重層のシス側に加える。チャンネルサブユニットが二重層に取り込まれるとき、電流は段階的に変化するとみられる。多数のチャンネルを組み入れる場合、巨視的な電流を測定する。
脂質二重層における種々の比率のENaC受容体サブドメインの発現
これは、理論例である。ENaCは、通常、サブユニットα、βおよびγ(大部分の組織ではα2βγ複合体)か、サブユニットδ、βおよびγの、いずれかの3つのサブユニットを含むヘテロ多量体複合体である。これらのサブユニットは、しばしば組織源により決定される種々の比率で集合することができる。サブユニットの相対比を変えることにより、これらのチャンネルにユニークなキネティクスおよび薬理が付与される。いかなる特定の理論または作用機序に制限されることを意図することなく、δサブユニットは多くの組織でαサブユニットと置き換わっており、かかる置換が特にチャンネルの薬理を変更すると考えられる。
メッセージの量とタンパク質の量との間の1対1対応は保証されていないが、Q−PCRはENaC比率の評価に利用できる1つのツールである。塩味覚細胞が活動しているならば、特定のサブユニットの複数のコピーを有していると考えられる。メッセージのコピーの比率は、少なくとも近似的にタンパク質生成物の比率であると考えられる。定量単一細胞PCRを用いて、対象とする任意のタンパク質についての、メッセージの相対的存在量の半定量的な像を得ることができる。この手法は、理論的には単純であるが、多数の困難な障害がある。味覚細胞に関しては、例えば、現在単離細胞を得るために用いている時間のかかる手法(上記参照)がRNAの破壊をもたらすため、RNAの品質が問題となることがある。実験技法を信頼あるものとするために、以下の手法を行うことができる。(1)対象とする各々の遺伝子について複数のユニークプライマーを設計し、同じPCR条件下で対象とするすべての遺伝子についてほぼ同一の効率を有するもののみを用いる。(2)水を対照とするPCRを用いた場合にブランクとして記録されるものより上の適切なペアから、プライマーセット(プライマーペアの混合物)を構築する。(3)個別の細胞(上記のとおりの)をRNaseのない環境で回収し、細胞を溶解させ、市販のキットを用いて単一細胞mRNA内容物を逆転写する。(4)全ての反応が線形増幅相となるよう、第1段階のPCRの限定された数(10〜25)のサイクルを、上記のプライマーセットおよび条件で行う。(5)上記の反応物を希釈し(100×〜1000×)、アリコートをテンプレートとして、上記セットからの1対のプライマーとともに用い、Q−PCR装置を用いてPCRの第2段階を行う(2反復/3反復で)。(6)データ分析に、相対定量法を用いる。正規化は、定義上、遺伝子の1つのコピーが存在する、翻訳/転写されていないゲノムDNAの増幅に基づく。遺伝子発現の違いは、比率(サンプル中の標的遺伝子とゲノム参照配列との間のΔCt)の差(2サンプル間のΔCtの差であるΔΔCt)を比較することによって決定することができる。
Claims (20)
- ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法であって:
少なくとも1つのヒト塩味受容体を人工脂質膜において構築すること、ここで、前記ヒト塩味受容体は、少なくとも1つのベータサブユニット、少なくとも1つのガンマサブユニット、および少なくとも1つの配列番号12のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットを含み、
ヒト塩味受容体と試験化合物とを、ナトリウムまたはリチウムの存在下で接触させること、
および
前記試験化合物の非存在下における前記ヒト塩味受容体の生物学的活性と比較した、前記試験化合物の存在下における前記ヒト塩味受容体の生物学的活性の調節を決定すること
を含む、前記方法。 - ヒト塩味受容体と上皮ナトリウムイオンチャネルアンタゴニストとを接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 人工脂質膜が、ミセル、リポソームまたは脂質二重層である請求項1または2に記載の方法。
- ヒト塩味受容体の少なくとも2つのサブユニットが、互いと比較して異なる比率で脂質膜に存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ハイスループットスクリーニングに適合している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種のリン脂質と、上皮ナトリウムイオンチャネルもしくは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを含み、少なくとも1つのアルファサブユニット、少なくとも1つのベータサブユニット、少なくとも1つの配列番号12のアミノ酸配列を含むデルタサブユニット、および少なくとも1つのガンマサブユニットを含む少なくとも1つの上皮ナトリウムイオンチャネルを含む、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するための人工脂質膜。
- 膜がミセル、リポソームまたは脂質二重層である、請求項6に記載の人工脂質膜。
- 少なくとも1つのイプシロンサブユニットをさらに含む、請求項6または7に記載の人工脂質膜。
- 少なくとも1種のリン脂質と、上皮ナトリウムイオンチャネルもしくは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを含み、少なくとも1つの配列番号12のアミノ酸配列を含むデルタサブユニット、少なくとも1つのベータサブユニット、および少なくとも1つのガンマサブユニットを含む少なくとも1つの上皮ナトリウムチャネルを含む、ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するための人工脂質膜。
- 膜がミセル、リポソームまたは脂質二重層である、請求項9に記載の人工脂質膜。
- 請求項6〜10のいずれか一項に記載の人工脂質膜を調製する方法であって:
少なくとも1種のリン脂質を含むミセルまたはリポソームと、上皮ナトリウムイオンチャネルまたは特定の比率の上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとを混合すること、ここで、前記上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットは、少なくとも1種の界面活性剤を含む好適な水性緩衝液に溶解しており、
前記ミセルまたはリポソームを、前記上皮ナトリウムイオンチャネルまたは上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニットとともに、十分な時間インキュベートすること、および
前記少なくとも1種の界面活性剤を除去すること
を含む、前記方法。 - 平面脂質二重層にプロテオリポソームを再構成することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 塩味知覚のモジュレーターを同定する方法であって:
少なくとも1つの上皮ナトリウムイオンチャネルを人工脂質膜において構築すること、ここで、前記ナトリウムイオンチャネルは、少なくとも1つのベータサブユニット、少なくとも1つのガンマサブユニット、および少なくとも1つの配列番号12のアミノ酸配列を含むデルタサブユニットを含み、
前記イオンチャネルと試験化合物とを、ナトリウムまたはリチウムの存在下で接触させること、
前記試験化合物の非存在下における前記上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性と比較した、前記試験化合物の存在下における前記上皮ナトリウムイオンチャネルの生物学的活性の調節を決定すること、および
前記試験化合物の非存在下における対象の塩味知覚のレベルと、前記試験化合物の存在下における対象の塩味知覚のレベルとを比較すること
を含む、前記方法。 - 細胞ベースのアッセイにおいて、上皮ナトリウムチャネル活性について陽性の候補化合物をスクリーニングする工程をさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 少なくとも1つのベータポリペチドサブユニット、少なくとも1つのガンマポリペチドサブユニット、少なくとも1つのデルタポリペチドサブユニットを含み、ここで前記デルタポリペチドサブユニットが配列番号12のアミノ酸配列を含む、単離されたヒト塩味受容体。
- デルタポリペチドサブユニットが配列番号9のアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の単離されたヒト塩味受容体。
- ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定するためのキットであって:
少なくとも1種のリン脂質、
デルタサブユニット、ベータサブユニット、および配列番号12のアミノ酸配列を含むガンマサブユニットを含む、実質的に精製された上皮ナトリウムイオンチャネルサブユニット、
を含み、
任意に、上皮ナトリウムイオンチャネルモジュレーター、ナトリウムまたはリチウム、
および
ヒト塩味受容体のモジュレーターを同定する方法において前記キットを使用するための指示
を含む、前記キット。 - サブユニットが単一の容器内で既知の比率で混合されている、請求項17に記載のキット。
- 少なくとも2つのサブユニットが、互いと比較して異なる比率で存在する、請求項17または18に記載のキット。
- モジュレーターが、アミロライド、フェナミル、ベンザミル、クロルヘキシジンまたはグアニジンイオンの給源または有機ポリアミンである、請求項17〜19のいずれか一項に記載のキット。
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