KR100306464B1 - Mhc분자hla-c-클론10과복합체를형성하는분리된펩티드및그것의사용 - Google Patents

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Abstract

새로운 족의 종양 거부 항원 전구체 및 그것들을 암호화하는 핵산 분자가 개시되어 있다. 이들 종양 거부 항원 전구체는 BAGE 종양 거부 항원 전구체라 칭하고, 그것들을 암호화하는 핵산 분자는 BAGE 암호화 분자라고 칭한다. 암호화 서열 및 종양 거부 항원 전구체 분자의 다양한 진단 및 치료 용도가 기술되어 있다.

Description

[발명의 명칭]
MHC 분자 HLA-C- 클론10과 복합체를 형성하는 분리된 펩티드 및 그것의 사용
[도면의 간단한 설명]
제1도는 다양한 세포주에 대한 CTL클론 82/82를 사용한 크로뮴방출분석의 결과를 도시한다.
제2도는 한 패널의 다른 세포주에 대한 CTL클론 82/82를 사용한 TNF방출분석의 결과를 도시한다.
제3도는 감염된 COS세포를 사용한 TNF방출분석의 결과를 도시한다.
제4도는 CTL클론 82/82를 사용하고 TNF방출을 측정하는 다양한 트랜스펙탄트에 대한 시험의 결과를 도시한다.
제5도는 SEQ ID NO:10의 펩티드로 세포융해 T세포클론 CTL 82/82를 자극한 다음, 세포의 반(half) 최대융해를 결정하기 위해 수행된 연구의 결과를 도시한다.
[발명의 상세한 설명]
[발명의 분야]
본 발명의 병리적 상태의 진단 및 치료와 관련하여 유용한 펩티드에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 MHC 분자 HLA-C-클론10에 의해 제공된 펩티드로 프로세싱(processing)된 펩티드 및 제공된 펩티드 자체에 관한 것이다. 이들 펩티드는 진단 및 치료과정에 유용하다.
[배경 및 종래기술]
포유동물 면역시스템이 외부물질을 인식하고 반응하는 과정은 복합하다. 시스템의 중요한 국면은 T세포응답이다. 이 응답은 T세포가 세포표면분자(인간 백혈구 항원(“HLA”) 또는 주요 조직적합성복합체(“MHC”라 칭함)와 펩티드의 복합체를 인식하고 상호작용하는 것이 필요하다. 펩티드는 HLA/MHC분자를 또한 제공하는 세포에 의해 프로세싱되는 거대분자로부터 유래된다. 이러한 점에서는 Male et al., Advanced Immunology (J. P. Lipincott Company, 1987), 특히 6-10장을 참고한다.
T세포와 HLA/펩티드 복합체의 상호작용은 제한되며, HLA분자 및 펩티드의 구체적 결합에 특이적인 T세포를 요구한다. 만약 특이적 T세포가 존재하지 않으면, 그것의 파트너 복합체가 존재하여도 T세포응답이 없다.
유사하게 만약 특이적 복합체가 부재하면, T세포가 존재하여도 응답이 없다.
이 메카니즘은 외부물질에 대한 면역시스템의 응답, 자동면역 병리학 및 세포이상(異常)에 대한 응답에 관련된다.
많은 연구가 단백질이 HLA결합 펩티드로 프로세싱되는 메카니즘에 집중되어 왔다.
이러한 점에 있어서 Barinaga, Science 257: 880(1992); Fremont 일동, Science 257:919(1992); Matsumura et al., Science 257:927(1992); Latron et al., Science 257:964(1992) 참조.
T세포가 세포의 이상을 인식하는 메카니즘은 또한 암에 연관되어 있었다.
예를 들면 PCT출원 PCT/US92/04354(1992.5.22에 출원, 1992.11.26에 공개, 참고문헌으로 포함된)에서 한족의 유전자가 개시되었는데, 그것은 이어서 세포표면 위에 표현되는 펩티드로 프로세싱되며, 그것은 특이적 CTL에 의해 종양세포의 융해(lysis)를 이끌 수 있다.
그 유전자는 “종양거부항원전구체” 또는 “TRAP”분자를 암호화한다고 말해지며, 거기서부터 유래된 펩티드는 “종양거부항원” 또는 “TRAs”라고 칭하여진다. 이족의 유전자에 대한 더 이상의 정보에 대해서는 Traversari et al., Immunogenetics 35:145(1992); van der Bruggen et al., Science 254:1643(1991) 참조. 또한 1991.12.12에 출원된 미국특허출원 제807,043호, 지금은 미국특허 제5,342,774호 참조.
미국특허출원 제 938,334호(그 개시는 참고문헌으로 포함됨)에서 HLA-A1 분자에 의해 제공되는 노나펩티드(nonapeptides)를 가르치고 있다. 참고문헌은 만약 특정한 HLA분자에 대한 특정한 펩티드의 기지의 특성이 주어진다면, 특정한 펩티드가 다른 것이 아닌 어떤 한개의 HLA분자와 결합할 것을 기대할 수 있다고 가르친다.
이것은 다른 개체는 다른 HLA표현형을 가지므로 중요하다.
결과적으로, 특정한 HLA분자에 대한 파트너로서의 특정한 펩티드의 동정은 진단적 및 치료적인 결과를 가지는 반면, 이것들은 오직 특정한 HLA표현형을 갖는 개체에만 관련된다.
세포 이상은 한 개의 특정한 HLA표현형에만 제한되지 않기 때문에 이 분야에 대한 더 이상의 연구가 필요하며, 표적된 치료는 조직에서 이상세포의 표현형에 대한 약간의 지식이 필요하다.
미국특허출원 제008,446호(1993.1.22에 출원, 참고문헌으로 포함됨)에서 MAGE-1 발현 산물이 제2의 TRA로 프로세싱된다는 사실이 개시되었다. 이 제2의 TRA는 HLA-C 클론10분자에 의해 제공된다. 이 개시는 주어진 TRAP가 다수의 TRA을 얻을 수 있다는 것을 보여준다.
미국특허출원 제994,928호(1992.12.22에 출원, 참고문헌으로 포함됨)에서 티로신아제는 종양거부항원 전구체로서 기술되었다. 이 참고문헌은 몇몇 정상세포(예를 들면 멜라닌 세포)에 의해 생산되는 분자는 종양세포에서 프로세싱되어 HLA-A2 분자에 의해 제공되는 종양거부항원을 얻을 수 있다는 것을 개시한다.
미국특허출원 제08/032,978호(1993.3.18에 출원, 전체가 참고문헌으로 포함됨)에서 제2의 TRA(티로신아제로부터 유래되지 않은)는 HLA-A2 분자에 의해 제공된다는 것을 교시한다. TRA는 TRAP로부터 유래되나, 비 MAGE 유전자에 의해 암호화된다. 이 개시는 특정한 HLA분자는 다른 원천으로부터 유래된 TRA를 제공할 수 있다는 것을 보여준다.
미국특허출원 제08/079,110호(1993.6.17에 출원, 본 출원의 모출원임, 전체가 참고문헌으로 포함됨)에서 새로운 족의 유전자(상기 출원에는 BAGE 족으로 칭하여짐)가 개시되었다. 이들 유전자도 또한 종양거부항원 전구체를 암호화한다는 것이 관찰되었다.
상기 출원에서 HLA-C-클론10으로 알려진 MHC분자가 BAGE 종양거부항원 전구체로부터 유래된 종양거부항원을 제공한다는 것이 관찰되었다; 그러나 종양거부항원은 개시되지 않았다. 본 출원은 이 펩티드의 동정으로부터 유래한 다른 결과뿐만 아니라 이 펩티드(여기서는 SEQ ID NO:10이라 칭하여짐)를 다룬다.
본 발명은 다음의 개시에서 더욱 상세히 설명된다.
[바람직한 구체예의 상세한 설명]
[실시예 1]
표준계통적 분류법을 사용하여 환자 MZ2로부터 얻은 흑종 세포로부터 흑종세포주, 즉 MZ2-MEL을 확립하였다.
이 세포주는 예를 들면 PCT출원 제PCT/US92/04354호(1992.5.22에 출원, 1992.11.26에 공개, 전체가 참고문헌으로 포함됨)에서 기술되었다.
일단 세포주가 확립되면, 그것의 샘플을 비번식성이 되도록 조사(照射)하였다.
이들 조사된 세포는 그 다음 그것에 특이적인 세포융해 T세포클론(“CTL”)을 분리하는데 사용되었다.
말초혈 단핵세포(“PBMCs”)의 한 샘플을 환자 MZ2로부터 획득하여 조사된 흑종(melanoma)세포에 접촉시켰다. 혼합물에서 흑종세포의 융해가 관찰되었으며, 이것은 흑종세포에 의해 제공된 펩티드와 HLA분자의 복합체에 특이적인 CTLs가 샘플에서 제공되었다는 것을 교시한다.
사용한 융해분석법은 Herin et al, Int. J. Cancer 39:390-396(1987)(그 개시가 참고문헌으로 포함됨)에 따른 크로뮴방출 분석법이었다. 그러나 분석법은 여기에 기술되었다.
표적 멜라노마 세포를 in vitro에서 성장시킨 다음, DMEM에 107세포/ml로 재현탁하고, 10mM HEPES 및 30% FCS를 보충한 후, 200μCi/ml의 Na(51Cr)O4와 함께 37℃에 45분동안 배양시켰다. 표지된(labelled) 세포는 DMEM으로 3회 세척하고, 10mM Hepes를 보충하였다.
그 다음 이것들을 10mM Hepes 및 10%FCS로 보충된 DMEM에 재현탁시킨후, 103세포를 함유하는 100μl 앨리컷을 96 웰(well) 마이크로플레이트 안으로 분배시켰다. 100μl의 동배지에 PBLs의 샘플을 첨가하고, 이중으로 분석을 수행하였다. 플레이트를 100g에 4분동안 원심분리시킨후, 8% CO2분위기에서 37℃에 4시간동안 배양시켰다.
플레이트를 다시 원심분리한후, 100μl 앨리컷 상청액을 수집하고 계수하였다.
51Cr방출의 백분율은 다음과 같이 계산되었다:
(상기 식에서 ER은 관찰된 실험의51Cr방출이고, SR은 200μl의 배지만에 103개의 표지된 세포를 배양함으로써 측정된 자발적 방출이며, MR은 표적세포에 100μl 0.3% 트리톤 X-100을 첨가함으로써 얻어진 최대방출임).
높은 CTL활성을 보이는 이들 단핵혈액샘플을 팽창시키고 제한희석을 통해 클로닝시킨후, 동일 계통적 분류법을 사용하여 다시 스크리닝(screening)하였다.
그래서 CTL클론 MZ2-CTL 82/82를 분리하였다. 그 클론은 이하 “82/82”이라 칭한다.
흑종 세포주뿐만 아니라 표적 K562 세포를 시험하기 위해 동일한 방법을 사용하였다. 제1(a)도에 제시된 이들 결과는 이 CTL클론은 흑종세포주를 인식하여 융해시키나, K562는 그렇지 않다는 것을 보여준다. 그 다음 CTL 클론 82/82를 상기한 동일한 방법으로 흑종 세포주에 대하여 시험하였다. 제1도는 MZ2-MEL. 43은 CTL 클론 82/82에 의해 융해되는 반면, 세포주 MZ2-MEL 2.2.5(HLA-A29, HLA-B44 및 HLA-C클론10의 발현을 상실한 변종)는 그렇지 않다는 것을 보여주며, TRA는 이들 HLA분자중의 한 개에 의해 제공된다는 것을 제시한다.
세포주 MZ2-MEL 2.2.5를 잘 알려진 기술을 사용하여 HLA-C클론10을 암호화하는 DNA로 트랜스펙션시켰을때, 세포는 CTL클론 82/82에 의한 융해에 민감해졌으며, 따라서 CTL클론 82/82에 의해 인식된 항원은 HLA-C클론 10에 의해 제공된다는 것을 증명하였다.
[실시예 2]
82/82가 표적세포와 접촉되었을 때 또한 종양괴사인자(“TNF”)를 생산하는지를 결정하기 위해 더 연구를 수행하였다: 사용된 방법은 Traversari et al., Immunogenetics 35:145-152(1992)(이것의 개시는 참고문헌으로 포함됨)에 기술된 것이었다.
요약하면, CTL 주의 샘플을 배양배지에서 관심의 표적세포의 샘플과 조합시켰다. 24시간 후에 배양액으로부터 상청액을 제거한 다음, TNF 민감성 WEHI 세포에 대해 시험하였다.
제2도에 보여진 바대로 한 패널의 14가지 다른 세포주를 시험하였다.
상청액에 노출시 죽은 WEHI 세포의 백분율의 점에서 제시된 결과가 제2도에 보여진다. 결과는 3가지 흑종 세포주가 이 항원을 제공한다는 것을 증명한다. MZ2 MEL43에 의한 강한 응답의 결과로서 그것은 다음의 실험들에 사용되었다.
[실시예 3]
실시예 2의 결과는 MZ2. MEL43이 관심의 표적항원을 제공했다는 것을 가리켰다. 그대로 그것을 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 총mRNA의 원천으로서 사용하였다.
총 RNA를 세포주로부터 분리시켰다. 잘 인식된 기술에 따라 oligo-dT 결합키트를 사용하여 mRNA를 분리시켰다. 일단 mRNA를 획득했으면, 다시 표준계통적 분류법을 사용하여 그것을 cDNA로 전사시켰다. 그 다음 제조자의 지시서에 따라 cDNA를 EcoRI아댑터에 라이게이션(ligation)시키고, 플라스미드 pcD-SRα의 EcoRI위치 안으로 클로닝(cloning)하였다.
그 다음 재조합 플라스미드를 JM101 E. coli안으로 일렉트로포레이션(electroporation) 시켰다(일렉트로포레이션조건: 25μ패럿, 2500v에서 1펄스).
트랜스펙션된 박테리아를 암피실린(50㎍/ml)으로 선별한 다음, 400개 박테리아 87풀 및 200개 박테리아 297풀로 나눴다.
각각의 풀은 분석이 약 70%의 플라스미드가 삽입체를 함유하는 것으로 보여준 바와 같이 약 280 또는 약 140 cDNAs를 나타내었다.
각각의 풀을 포화상태까지 증식시킨 후, Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y., 1982)에 따라 페놀추출없이 알칼리성 융해, 아세트산 칼륨 침전을 통해 플라스미드 DNA를 분리하였다.
[실시예 4]
실시예 3에 기술된 라이브러리의 제조에 이어서, cDNA를 진핵세포 안으로 트랜스펙션시켰다. 여기에 기술된 트랜펙션은 이중으로 수행되었다.
COS-7 세포의 샘플을 10% 소태아 혈청으로 보충된 Dulbeco의 수정된 이글배지(“DMEM”)에서 조직배양 평평바닥 마이크로웰안으로 15,000세포/웰이 되게 파종하였다.
세포를 37℃에 하룻밤동안 배양시키고, 배지를 제거한 다음, 10% Nu혈청, 400㎍/ml DEAE-덱스트란 및 100μM 클로로퀸을 함유하는 50μl/웰의 DMEM 배지 더하기 100ng의 피험 플라스미드로 대체하였다.
이들 플라스미드는 상기 다양한 풀의 플라스미드 및 플라스미드 pcD-SRα안에 HLA-C클론 10을 암호화하는 DNA를 함유하는 100ng의 플라스미드이었다. 37℃에 4시간동안 배양 후에 배지를 제거하고, 10% DMSO를 함유하는 50μl의 PBS에 의해 대체하였다. 2분후에 이 배지를 제거하고, 10%FCS로 보충된 200μl의 DMEM으로 대체하였다.
배지의 이러한 변화후에, COS 세포를 37℃에 24 내지 48시간동안 배양시켰다.
그 다음 배지를 제거하고, 20U/ml의 IL-2로 보충된 10% 풀된 인간혈청을 함유하는 100μl의 Iscove 배지에 1500 세포의 CTL클론 82/82를 첨가하였따. 24시간 후에 상청액을 제거하고 Traversari et al., Immunogenetics 35:145-152(1992)(이것의 개시는 참고문헌으로 포함됨)에 기술된 바와 같이 WEHI 세포에 대한 분석에서 TNF함량을 측정하였다.
시험된 384풀중에서 99%가 5pg/ml 이하의 농도로 TNF를 자극하였다. 등가의 결과를 갖는 이중웰로 인하여 두개의 풀을 40pg/ml 이상의 농도를 가졌다. 제3도는 이것을 보여준다. 이들 풀중의 한개, 즉 풀 19로부터 박테리아를 더 이상의 실험을 위해 선별하였다.
[실시예 5]
풀19의 박테리아를 클로닝하고, 800 박테리아를 시험하였다. 거기서부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기한 것과 동일한 방법으로 COS세포의 새로운 샘플안으로 트랜스펙션시킨후, 세포를 CTL클론 82/82의 자극에 대해 다시 시험하였다. 12개의 양성 클론이 발견되었다. 이들중의 한개(cDNA 클론 AD5라 칭함)를 더 이상 시험하였다. 비교시험에서 COS세포는 cDNA 클론 AD5 및 HLA-C클론10으로 트랜스펙션시켰다. HLA-C 클론10 및 MAGE-1, AD5단독 또는 HLA-C클론10 단독. 대조세포주 MZ2-MEL 2.2.5 및 MZ2-MEL. 43을 또한 사용하였다. 상기한 바대로 그것을 WEHI 세포에 대해 시험함으로써 CTL 상청액에서의 TNF 방출을 측정하였다. 생존하는 WEHI 세포의 광학밀도를 MTT를 사용하여 측정하였다. 제4도는 오직 COS세포만이 HLA-C클론 10 및 cDNA-AD5로 트랜스펙션되었고, 원형(original) 세포주 MZ2-MEL43이 CTL클론 82/82로부터 TNF방출을 자극하였다는 것을 보여준다.
[실시예 6]
업계에 알려진 기술에 따라 cDNA AD5를 시퀀싱(sequencing)하였다. 서열조사는 플라스미드 삽입체가 공지의 유전자 또는 단백질과 상동성을 보이지 않는다는 것을 밝혀냈다. SEQ ID NO: 1은 동정된 유전자(이후 “BAGE-1”라 칭함)에 대한 cDNA 누클레오티드 정보를 제공한다. 추정상의 오픈리딩프래임은 분자의 염기 201-332에 위치된다.
[실시예 7]
실시예 6대로 cDNA의 시퀀싱에 이어서, 정상조직의 세포가 유전자를 발현시켰는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 이것을 결정하기 위해, 정상조직으로부터 분리된 RNA를 프라이머로서 올리고-dT를 사용하여 역전사시켰다. 그 다음 결과의 cDNA를 다음의 프라이머 및 표준 PCR 계통적 분류법을 사용하여 증폭시켰다:
5′ CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3′(SEQ ID NO:2) 및 5′-GAG CGG TTT TTC TGG CAT TG-3′(SEQ ID NO:3) 증식산물의 양은 포스포르(phosphor)이미징을 통해 결정될 수 있도록 방사성 누클레오티드를 첨가하였다.
생산물의 양은 세포주 MZ2-MEL 3.0으로부터 획득된 산물의 백분율로서 표현되었으며, 이것은 유전자를 발현한다는 것을 보여줬다.
그 결과는 다음과 같다:
MZ2-MEL 3.0 100%
폐 ＜0.5%
가슴 ＜0.5%
위 ＜0.5%
피부 ＜0.5%
뇌 ＜0.5%
전립선 ＜0.5%
신장 ＜0.5%
고환 8%
여기에 상술되지 않은 추가의 실험에서, 세포주 MZ2-MEL의 DNA를 EcoRI으로 절단(digestion)한 다음, 여기 기술된 cDNA의 최초 300 누클레오티드에 상응하는 PCR프로브로 혼성화(hybridization)시켰다. 표준 서던블로팅(Southern blotting)후에, 대략 5.8, 7.5, 8.5 및 11 킬로베이스(Kb)의 크기에 상응하는 4가지 밴드가 동정되었으며, 이는 한 족의 Bage 유전자가 존재함을 나타낸다.
[실시예 8]
종양샘플 및 종양세포주에 의한 유전자의 발현도 또한 결정하였다.
실시예 4에서와 같이 cDNA를 획득한 다음, 적절한 서열을 증식하기 위해 네스티드(nested) 프라이머 계통적 분류법을 수행하였다.
우선, 다음 프라이머를 사용하여 20 사이클의 증식을 수행하였다:
5′-CGG CTT AGA GGA CCA GGA GAA-3′(SEQ ID NO:4)
및
5′ CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3′(SEQ ID NO:5)
이것은 다음 프라이머를 사용하는 20 추가 사이클에 의해 이어진다:
5′-GGC TCC ACC CTC CAG CTC AC-3' (SEQ ID NO:6)
및 5′-TTA GAG GAC CAG GAG AAG G-3′(SEQ ID NO:7)
그 결과는 아래에 제시된다. 첫 번째 숫자는 양성 샘플의 개수이고; 두 번째 숫자는 시험된 샘플의 총 개수이다:
흑종 12/20
유암 2/5
작은 세포 폐암 2/8
비-작은 세포 폐암 2/5
육종 1/4
머리 및 목종양 1/6
결장암 0/4
신장종양 0/5
백혈병/임파종 0/3
[실시예 9]
상기한 실험들은 세포융해(cytolytic) T 세포클론 CTL 82/82는 BAGE 유전자에 의해 암호화되고 HLA-C-클론 10에 의해 제공되는 항원을 인식하였다는 것을 보여줬다. 본 실시예에 기술된 실험은 어떻게 제공된 항원의 아미노산 서열이 결정되었는지를 상술한다.
BAGE를 암호화하는 것으로 동정된 cDNA 클론, 즉 AD5를 다수의 불완전 cDNA 분자를 발생시키기 위해 사용하였다. 제조자의 지시서에 따라, cDNA클론을 발현벡터 pcDNAI/Amp안으로 삽입시키고, Not I 및 SphI 제한 효소로 절단한 후, 엑소누클레아제III로 처리하였다.
변화하는 길이의 시간동안 엑소누클레아제III를 사용함으로써, 그것의 3′ 말단에서 AD5의 점진적인 결실을 얻었다. 끝이 잘린 변이체를 pcDNAI/Amp 안으로 재라이게이션시키고, E. Coli 변종 DH5αF′IQ안으로 일렉트로포레이션시킨후, 암피실린(50㎍/ml)을 통해 선발하였다. 이 방법으로 400개의 클론을 얻었다.
이들 400클론으로부터 플라스미드 DNA를 얻은 후, cDNA를 암호화하는 HLA-C-클론 10과 함께 COS-7 세포안으로 트랜스펙션시켰다. 그 다음 트랜스펙탄트를 상기한 바대로 TNF 방출분석에서 시험하였다. 양성 클론은 CTL 82/82에 의해 TNF 방출을 자극하는 것들이었다. 일단 세포가 양성 및 음성 트랜스펙탄트로 나누어지면, 10개의 양성 및 10개의 음성인 것으로부터 플라스미드 DNA의 서열을 결정하였다. 양성 클론인 클론 19C2는 상기한 BAGE 유전자의 오픈리딩프래임의 한 부분, 누클레오티드 1부터 누클레오티드 67까지를 함유하였다. 대조적으로, 음성 클론인 클론 17G12는 동일 유전자의 누클레오티드 1-6을 함유하였다.
양성 및 음성 클론의 삽입체를 비교함으로써 22개의 아미노산의 영역이 아마도 제공된 펩티드의 다음 서열을 함유하는 것으로 동정되었다:
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu (SEQ ID NO:8)
그 다음 이 서열에 기초하여 합성펩티드를 제조하고, COS-7 세포를 TNF방출을 자극할 수 있는 HLA-C-클론10으로 트랜스펙션시키게 해주는 그것들의 능력을 시험하였다.
첫 번째 양성 펩티드는 다음 16량체이었다:
Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Leu Gln(SEQ ID NO:9)
더 작은 펩티드의 시험은 다음 펩티드의 동정을 이끌었다.
Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu(SEQ ID NO:10)
이 펩티드는 CTL 82/82를 효과적으로 자극하며, 제5도에 보여진 바대로 반최대융해가 80nM의 펩티드 농도에 이르렀다.
앞의 실시예들은 종양거부항원 전구체를 암호화하는 핵산분자의 분리를 보여준다. 그러나 이 “TRAP” 암호화 분자는 상기 참고문헌에 기술된 이전에 개시된 어떤 MAGE 암호화 서열과도 상동적이지 않다. 그러므로 본 발명의 한 측면은 SEQ ID NO:1에서 기술된 누클레오티드 서열을 함유하는 분리된 핵산분자이다. 이 서열은 그것을 참고문헌에 기술된 어떤 MAGE 유전자의 서열과도 비교해보면 알 수 있듯이, MAGE 암호화 서열이 아니다. 또한 본 발명의 한 부분은 또한 비-MAGE 종양거부항원 전구체를 암호화하나, 긴축(stringent) 조건하에서 상기 누클레오티드 서열을 함유하는 핵산분자와 혼성화하는 핵산서열이다. 여기서 사용된 “긴축조건”이란 용어는 당업계에 친숙한 매개변수들을 말한다. 더욱 구체적으로는 여기서 사용된 긴축조건은 65℃에 18시간동안 3.5×SSC, 1xDenhardt용액, 25mM 인산나트륨버퍼(pH 7.0), 0.5% SDS 및 2mM EDTA에서의 혼성화를 말한다. 이것 다음에 2×SSC, 0.1% SDS에서 65℃에 20분동안 필터를 4회 세척하고, 0.3×SSC, 0.1%SDS에서 최대 20분동안 한번 세척한다.
사용할 수 있는 다른 조건, 시약 등이 있으며, 이것들은 동일한 정도의 긴축의 결과를 나타낸다. 숙련된 당업자는 그러한 조건들에 친숙할 것이기 때문에 그것들은 여기에 주어지지 않는다.
본 발명은 서열을 원핵세포(예를 들면 E. coli) 또는 진핵세포(예를 들면 CHO 또는 COS세포) 숙주세포 및 세포주를 트랜스펙션시키는데 뿐만 아니라 발현벡터에 사용하는 것을 포함한다는 것은 실시예들로부터 또한 알 수 있을 것이다. 발현벡터는 적절한 서열(즉 상기한 것들)이 프로모터에 작동가능하도록 연결될 것을 필요로 한다. 인간 백혈구 항원 MLA-C클론 10이 이들 유전자로부터 유래된 종양거부항원을 제공하는다는 것이 밝혀진 바와 같이, 발현벡터는 또한 HLA-3 클론 10을 암호화하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 벡터가 둘다의 암호화 서열을 함유한다면, 그것은 보통 어느 한가지도 발현하지 않는 세포를 트랜스펙션시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면 숙주가 이미 HLA-C클론10을 발현할 때 종양거부항원 전구체 암호화 서열은 혼자 사용될 수 있다. 물론 사용될 수 있는 특정숙주 세포에는 제한이 없다. 원한다면 두 가지 암호화 서열을 함유하는 벡터가 HLA-C클론10 제공세포에 사용될 수 있듯이, 종양거부항원 전구체에 대한 유전자는 HLA-C클론10을 발현하지 않는 숙주세포에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 소위 발현키트를 포함하며, 이것은 당업자가 원하는 발현벡터 또는 벡터들을 제조할 수 있도록 해준다. 그러한 발현키트는 적어도 분리된 포션의 각각의 상기 암호화 서열을 포함한다. 필수적인 상기 서열이 포함되는 한, 원한다면 다른 성분들도 첨가될 수 있다.
본 발명의 핵산분자 및 TRAP를 상기 MAGE 족과 구별하기 위해, 본 발명은 BAGE 족의 유전자 및 TRAP라고 칭해질 것이다. 그러므로, “BAGE”가 여기서 사용되었을 때 그것을 상기 서열에 의해 암호화되는 종양거부항원 전구체를 나타낸다. “BAGE 암호화분자” 및 유사용어들이 핵산분자 그 자체들을 기술하기 위해 사용된다.
또한 본 발명의 한 부분은 실시예 9에서 기술된 SEQ ID NO: 8,9 및 10의 펩티드들이다. 이들 펩티드는 예를 들면 MHC분자 HLA-C-클론10을 제공하는 세포들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. HLA-C-클론10 제공세포가 결합하는 고체상 결합펩티드의 사용 및 분석중인 샘플로부터 그것들을 제거하는 것이 그렇듯이, 검출가능한 신호를 수반하는 예를 들면 펩티드가 결합한 세포의 동정을 수반하는 펩티드의 투여는 이것을 성취하는 한 방법이다. 게다가 본 발명은 당업자가 TRAP의 발현에 의해 특성지어지는 병을 진단할 수 있도록 해준다. 이들 방법은 TRAP 유전자 및/또는 HLA-C클론10에 의해 제공되는 TRA와 같은 그로부터 유래된 TRA들의 발현의 결정을 포함한다. 전자의 경우에 그러한 결정은 중합효소 연쇄반응을 포함하거나, 표지화된 혼성화 프로브로 분석하는 어떤 표준핵산결정 분석법을 통해 수행될 수 있다. 후자의 경우에 항체와 같은 TRA 및 HLA의 복합체에 대한 결합파트너로 분석하는 것이 특히 바람직하다. 결정을 위한 선택적인 방법은 상기 타입의 TNF방출분석법이다.
TRAP 유전자의 분리는 또한 TRAP 분자자체, 특히 SEQ ID NO:1에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 함유하는 TRAP 분자를 분리하는 것을 가능하게 해준다. TRA로서 또는 TRA 및 HLA의 복합체로서 제공되었을 때 HLA-C클론10과 같은 이들 분리된 분자는 보조약과 같은 물질과 결합되어 TRAP 분자의 발현에 의해 특성지어지는 병의 처리에 유용한 백신을 생산할 수 있다. 더욱이 백신은 비-번식성 암세포, 비-번식성 트랜스펙탄트 등과 같은 세포표면에 TRA/HLA 복합체를 제공하는 세포로부터 제조될 수 있다. 세포가 백신으로서 사용되는 모든 경우에 이것들은 CTL응답을 증명하는데 필요한 한개 또는 둘 다의 성분들을 암호화하는 서열로 트랜스펙션된 세포 또는 트랜스펙션없이 둘 다의 분자들을 발현하는 세포일 수 있다.
게다가 TRA 및 HLA의 복합체뿐만 아니라 TRAP 분자, 그것의 연합한 TRA들은 당업계에 잘 알려진 표준기술을 사용하여 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
여기서 “병”이 사용되었을 때, 그것은 종양거부항원 전구체가 발현되는 어떤 병리적 조건을 나타낸다. 그러한 병의 한 예는 특히 암 흑종이다.
본 개시에 기초한 치료적 접근법은 HLA-C클론10세포와 같은 TRA제공세포의 융해를 이끄는 피험자의 면역시스템에 의한 응답을 전제로 한다. 한가지 그러한 접근법은 복합체에 특이적인 CTL들을 논의되는 표현형의 이상세포를 가지는 피험자에 투여하는 것이다. 그러한 CTL들을 in vitro에서 개발하는 것은 당업자의 기술범위내이다. 특히 혈액세포와 같은 세포의 샘플은 복합체를 제공하고 특정 CTL가 번식하도록 자극할 수 있는 세포에 접촉된다. 표적세포는 상기 타입의 COS세포와 같은 트랜스펙탄트일 수 있다. 이들 트랜스펙탄트는 그들의 표면 위에 원하는 복합체를 제공하며, 관심의 CTL과 결합되었을 때 그것의 번식을 자극한다. 여기서 사용된 것과 같은 COS세포는 다른 적당한 숙주세포와 마찬가지로 넓게 구할 수 있다.
양자전달(adoptive transfer)(Greenberg, J. Immunol. 136(5):1917(1986); Reddel et al., Science 257:238(7-10-92); Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21:1403-1410(1991); Kast et al., Cell59; 603-614(11-17-89))이라고 칭하여지는 치료적 체계적 분류법을 상술하기 위해 원하는 복합체를 제공하는 세포는 CTL와 결합되어 거기에 특이적인 CTL의 번식을 이끈다. 그 다음 번식된 CTL는 특정한 복합체를 제공하는 일정한 이상세포에 의해 특성지어지는 세포이상을 갖는 물질에 투여된다. 그 다음 CTL은 이상세포를 융해하고, 그에 의해 원하는 치료목표를 달성한다.
상기 치료법은 최소한 몇몇 피험자의 이상세포는 관련된 HLA/TRA복합체를 제공한다고 추측한다. 당업계는 적절한 서열, 이 경우에는 BAGE 서열의 DNA를 발현하는 세포를 동정하는 방법뿐만 아니라 특정한 HLA분자를 제공하는 세포를 동정하는 방법에도 매우 익숙하기 때문에, 이것은 매우 쉽게 결정될 수 있다. 일단 관련 복합체를 제공하는 세포가 상기 스크린닝 계통적 분류법을 통해 동정되면, 그들은 환자로부터의 샘플과 결합될 수 있으며, 여기서 샘플은 CTL를 함유한다. 만약 복합체 제공세포가 혼합된 CTL 샘플에 의해 융해되면, BAGE유래된 종양거부항원이 제공되고 있고, 피험자는 상기 치료적 접근법을 위한 적당한 후보라는 것이 가정될 수 있다.
양자전달은 본 발명에 따라 구할 수 있는 유일한 형태의 치료법은 아니다. CTL은 다수의 접근법을 사용하여 in vivo에서 또한 자극될 수 있다. 한가지 접근법, 즉 복합체를 발현하는 비-증식성 세포의 사용이 앞에서 상술되었다. 이 접근법에 사용되는 세포는 조사된 흑종 세포 또는 복합체의 제공에 필요한 한 개 또는 둘 다의 유전자로 트랜스펙션된 세포와 같은 보통 복합체를 발현하는 것들 일 수 있다.
Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110-114(1991.1월)는 이 접근법을 예시하며, 치료적 양생법에서 HPVE7펩티드를 발현하는 트랜스펙션된 세포의 사용을 보여준다. 다양한 세포타입이 사용될 수 있다. 유사하게, 한 개 또는 둘 다의 관심의 유전자를 수반하는 벡터가 사용될 수 있다. 바이러스 또는 박테리아의 벡터가 특히 바람직하다. 이들 시스템에서 관심의 유전자는 예를 들면 Vaccinia 바이러스 또는 박테리아 BCG에 의해 수반되며, 물질은 사실상 숙주세포를 “감염”한다. 결과의 세포는 관심의 복합체를 제공하고, 자기유래의 CTL에 의해 인식되며, 그것은 그 다음 증식한다. 유사한 효과가 종양거부항원 또는 전구체 자체를 관심의 HLA분자를 제공하는 HLA-C클론10 제공 세포로의 통합을 촉진하는 보조약과 조합함으로써 성취될 수 있다. TRAP는 프로세싱되어 HLA분자의 펩티드파트너를 산출하는 반면에, TRA는 더 이상의 프로세싱의 필요없이 제공된다.
본 발명의 다른 측면은 숙련된 당업자에 명백할 것이며, 여기에 반복할 필요가 없다.
사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용된 것이지 제한의 용어로서가 아니며, 그러한 용어 및 표현의 사용에 보여지고 기술된 특징의 어떤 등가물 또는 그것의 일부분도 배제하는 의도는 없으며, 다양한 변형이 본 발명의 범위내에서 가능하다는 것이 인정된다.

Claims (20)

  1. SEQ ID NO:1에 기술된 누클레오티드 서열로 이루어진 분리된 핵산 분자.
  2. 분리된 핵산 분자로서, 상기 분리된 핵산 분자는 MAGE 종양 거부 항원 전구체를 암호화하지 않고, 65℃에 18시간동안 3.5×SSC, 1×Denhardt용액, 25mM 인산나트륨버퍼(pH 7.0), 0.5% SDS 및 2mM EDTA에서 혼성화하고 2×SSC, 0.1% SDS에서 65℃에 20분동안 필터를 4회 세척하고, 0.3×SSC, 0.1% SDS에서 최대 20분동안 한번 세척하는 조건에서 SEQ ID NO:1과 혼성화하는 상보성 서열로 구성되는 분리된 핵산 분자.
  3. 제1항의 핵산 분자에 상보적인 분리된 mRNA 분자.
  4. 제1항의 핵산 분자에 의해 트랜스펙션된 숙주세포.
  5. 제2항의 핵산 분자에 의해 트랜스펙션된 숙주세포.
  6. 프로모터에 작동가능하도록 연결된 제1항의 분리된 핵산 분자로 이루어진 발현 벡터.
  7. 프로모터에 작동가능하도록 연결된 제2항의 분리된 핵산 분자로 이루어진 발현 벡터.
  8. 제4항에 있어서, 상기 숙주세포가 HLA-C 클론 10을 발현하는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  9. 제5항에 있어서, 상기 숙주세포가 HLA-C 클론 10을 발현하는 포유동물세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  10. 제6항에 있어서, HLA-C 클론 10을 암호화하는 헥산 분자를 더 포함하는 발현 벡터.
  11. 제7항에 있어서, HLA-C 클론 10을 암호화하는 핵산 분자를 더 포함하는 발현 벡터.
  12. 다음 각각의 분리된 포션으로 이루어진 발현 키트: (i) 제1항의 분리된 핵산 분자, 및 (ii) HLA-C 클론 10을 암호화하는 핵산 분자.
  13. 다음 각각의 분리된 포션으로 이루어진 발현 키트: (i) 제2항의 분리된 핵산 분자, 및 (ii) HLA-C 클론 10을 암호화하는 핵산 분자.
  14. 제1항의 핵산 분자에 의해 암호화되는 분리된 종양 거부 항원 전구체.
  15. HLA-C 클론 10분자와 복합체를 형성하는 BAGE 유래된 종양 거부 항원으로 프로세싱되는 BAGE 종양 거부 항원 전구체의 발현에 의해 특성지어지는 세포의 확인방법으로서, 샘플 세포를 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 세포융해 T세포와 접촉시키고, 상기 세포의 확인으로서 상기 복합체와 상기 항체 또는 세포융해 T세포 사이의 결합을 결정하는 것을 포함하는 확인방법.
  16. SEQ ID NO:1에 기술된 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화되는 종양 거부 항원 전구체의 발현에 의해 특성지어지는 세포의 확인방법으로서, 샘플 세포를 상기 서열 또는 그것의 발현산물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 세포융해 T세포와 접촉시키고, 상기 세포의 확인으로서 상기 항체 또는 세포융해 T세포와 상기 서열 또는 상기 발현산물 사이의 결합을 결정하는 것을 포함하는 확인방법.
  17. SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:10으로 이루어진 군으로부터 선발된 분리된 펩티드.
  18. 시험관내에서 세포융해 T세포 응답을 자극하는 방법에 있어서, HLA-C 클론 10 및 SEQ ID NO:10의 복합체에 특이적인 세포융해 T세포의 번식을 자극하기에 충분한 양으로, HLA-C 클론 10 제공 세포를 포함하는 혈액샘플을 세포융해 T세포의 존재하에 제서항의 분리된 펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 자극방법.
  19. HLA-C 클론 10분자와 복합체를 형성하는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 구성된 BAGE 유래된 종양 거부 항원으로 프로세싱되는 BAGE 종양 거부 항원 전구체의 발현에 의해 특성지어지는 세포의 확인방법으로서, 샘플 세포를 상기 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 세포융해 T세포와 접촉시키고, 상기 세포의 확인으로서 상기 복합체와 상기 항체 또는 세포융해 T세포 사이의 결합을 결정하는 것을 포함하는 확인방법.
  20. SEQ ID NO:1에 기술된 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화되는 종양 거부 항원 전구체의 발현에 의해 특성지어지는 세포의 확인방법으로서, 샘플 세포를 상기 전구체로부터 유래되고 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 구성된 종양 거부 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 세포융해 T세포와 접촉시키고, 상기 세포의 확인으로서 상기 항체 또는 세포융해 T세포와 상기 서열 또는 상기 발현산물 사이의 결합을 결정하는 것을 포함하는 확인방법.
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