JPH09502863A

JPH09502863A - Ｍｈｃ分子ｈｌａ−ｃ−クローン１０と複合体を形成する分離されたペプチドとその利用方法

Info

Publication number: JPH09502863A
Application number: JP7502880A
Authority: JP
Inventors: ファン・デア・ブルッゲン，ピエール; ブーン‐ファラー，ティエリー; クーリ，ピエール; ルノー，ジャン‐クリストフ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1993-06-17
Filing date: 1994-06-10
Publication date: 1997-03-25
Anticipated expiration: 2018-12-10
Also published as: EP0711173A1; US20030138854A1; KR960703014A; KR100306464B1; US6093540A; DE69433790D1; EP0711173A4; NZ268490A; AU677680B2; ATE267254T1; DE69433790T2; CN1102213A; NO955063D0; US6638512B1; FI956019A0; AU7171694A; WO1995000159A1; NO955063L; US6110694A; FI956019A

Abstract

(57)【要約】腫瘍拒絶抗原先駆体の新規なファミリと、これらをコード化する核酸分子とが開示される。これらの腫瘍拒絶抗原先駆体は、ＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体と称され、これらをコード化する前記核酸分子は、ＢＡＧＥコード化分子と称される。前記コード化シーケンスと前記腫瘍拒絶抗原先駆体の様々な診断上及び治療上の使用方法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と複合体を形成する分離されたペプチドとその利用方法関連出願本出願は、１９９３年６月１７日に出願され現在係属中の出願第０８／０７９，１１０号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、病状の診断及び治療に於て有用なペプチドに関する。詳しくは、プロセッシングされることによりＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０によって提示されるペプチドと、その提示されたペプチド自身とに関する。これらのペプチドは、診断及び治療において有用である。背景及び従来技術ほ乳類の免疫システムが外来の又は異質の物質を認識し、これに対して反応するプロセスは複雑である。このシステムの重要な一面は、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、又は主要組織適合抗原（ＭＨＣｓ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドとの複合体を認識し、これと相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、前記ＨＬＡ／ＭＨＣ分子も提示する細胞によってプロセッシングされるより大きな分子から誘導される。この点に関しては、メール（Ｍａｌｅ）他の”ＡｄｖａｎｃｅｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｐ．ＬｉｐｉｎｃｏｔＣｏｍｐａｎｙ，１９８７）、特にその第６〜１０章を参照。前記Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体との相互作用は、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組合せに特異的なＴ細胞を必要とする点で、限定されたものである。たとえ、特定の複合体が存在しても、特異的なＴ細胞が存在しなければＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存在しても、特異的な複合体が存在しなければ応答は起こらない。このメカニズムは、免疫システムの、自己免疫病状に於ける外来の物質に対する応答や、細胞異常に対する応答に関係している。最近、タンパク質がＨＬＡ結合ペプチドにプロセッシングされるメカニズムに関して多くの研究が行われている。この点に関して、バリナガ（Ｂａｒｉｎａｇａ），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：８８０（１９９２）；フリーモント（Ｆｒｅｍｏｎｔ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９１９（１９９２）：マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９２７（１９９２）、ラトロン（Ｌａｔｒｏｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：９６４（１９９２）参照。Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムは癌にも関連付けられてきた。例えば、ここに参考文献として添付される１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４には、細胞表面上に発現されるペプチドにプロセッシングされ、特定のＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を可能にする遺伝子の一つのファミリが開示されている。これらの遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原先駆体」、即ち、”ＴＲＡＰ”分子をコード化するものであると言われており、これらから誘導されるペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」、又は、”ＴＲＡｓ”と呼ばれている。この遺伝子ファミリの詳細については、トラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５（１９９２）：ファン・デア・ブルッゲン（ｖａｎｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６４３（１９９１）参照。又、１９９１年１２月１２日出願で現在は米国特許第５，３４２，７７４号である米国特許出願第８０７，０４３号参照。この開示内容をここに参考文献として添付する米国特許出願第９３８，３３４号には、前記ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるノナペプチドが教示されている。この参考文献は、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの特異性が既知であれば、特定のペプチドが一つのＨＬＡ分子と結合し、他の分子には結合しないと予期される、と教示している。これは重要である。というのは、保存するＨＬＡ表現型は個体それぞれで異なるからである。その結果、ある特定のペプチドが特異的ＨＬＡ分子のパートナとして同定されることが様々な診断上又は治療上の派生効果を有するとしても、これらはこの特定のＨＬＡ表現型を保有する個体にしか関連性を有していないことになる。細胞異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限られている訳ではないので、この分野において更に研究が必要であり、標的治療の為には対象となる異常細胞の表現型に関するいくらかの知識が必要である。ここに参考文献として添付する１９９３年１月２２日出願の米国特許出願第００８，４４６号には、ＭＡＧＥ−１発現生成物が、第２のＴＲＡにプロセッシングされるという事実が開示されている。この第２のＴＲＡは、ＨＬＡ−Ｃクローン１０−分子によって提示される。この開示には、あるＴＲＡＰが複数のＴＲＡを産生することが可能であることが示されている。ここに参考文献として添付する１９９２年１２月２２日出願の米国特許出願第９９４，９２８号にはチロシナーゼが腫瘍拒絶抗原先駆体として記載されている。この文献には、いくつかの正常細胞（例えば、メラニン細胞）によって生成される分子が、腫瘍細胞内でプロセッシングされてＨＬＡ−Ａ２によって提示される腫瘍拒絶抗原を作ることが開示されている。ここに参考文献として添付する１９９３年３月１８日出願の米国特許出願第０８／０３２，９７８号には、チロシナーゼから誘導されたのではない第２のＴＲＡが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されることが教示されている。このＴＲＡは、ＴＲＡＰから誘導されるものではあるが、非ＭＡＧＥ遺伝子によってコード化される。この開示は、特定のＨＬＡ分子が、異なった起源から誘導されたＴＲＡを提示する可能性があるということを示している。本発明の親出願でありここのその全部を参考文献として添付する１９９３年１月１７日出願の米国特許出願第０８／０７９，１１０号には、そこにおいてＢＡＧＥファミリと称されているところの遺伝子の新規なファミリが開示された。これらの遺伝子は、腫瘍拒絶抗原先駆体もコード化することが観察された。該出願に於て、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０として知られている前記ＭＨＣ分子がＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体から誘導された腫瘍拒絶抗原を提示することが観察されたが、前記腫瘍拒絶抗原は開示されなかった。本出願は、ここで配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０と称するこのペプチドと、このペプチドの同定から派生するその他の派生効果とを扱う。本発明及びその他の様々な側面を、以下の開示において詳述する。図面の簡単な説明図１は、様々な細胞系に対してＣＴＬクローン８２／８２を使用したクロム放出アッセイの結果を示している。図２は、ＣＴＬクローン８２／８２を、様々な細胞系のパネルに対して使用したＴＮＦ放出アッセイを結果を示している。図３は、トランスフェクションされたＣＯＳ細胞を使用したＴＮＦ放出アッセイの結果を示している。図４は、ＣＴＬクローン８２／８２を使用した様々なトランスフェクション体のテスト結果とＴＮＦ放出測定を示している。図５は、細胞溶解性Ｔ細胞クローンＣＴＬ８２／８２を配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のペプチドで刺激した後、細胞の半最大溶解を測定するために行った研究によって得られた結果を示している。好適実施例の詳細説明例１標準方法を使用して、患者ＭＺ２から得たメラノーマ細胞からメラノーマ細胞系ＭＺ２−ＭＥＬを定着した。この細胞系は、例えば、ここにその全体を参考文献として添付する１９９２年５月２２日出願、１９９２年１１月２６日公開のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４号に記載されている。細胞系の定着後、そのサンプルを照射して、これを非増殖性とした。次に、これらの照射済みサンプルを使用して、これに対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞（”ＣＴＬｓ”）を分離した。末梢血液単核細胞（”ＰＢＭＣｓ”）のサンプルを、患者ＭＺ２から採取し、前記照射済みメラノーマ細胞に接触させた。この混合物のメラノーマ細胞の溶解を観察したところ、該サンプル中に、メラノーマ細胞によって提示されたペプチドとＨＬＡ分子との複合体に対して特異的なＣＴＬｓが存在することが判った。上述の使用した溶解アッセイは、ここに参考文献としてその開示内容を添付するヘリン（Ｈｅｒｉｎ）他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ３９：３９０〜３９６（１９８７）に基づくクロム放出アッセイであった。但し、このアッセイについてはここに記載しておく。標的メラノーマ細胞を生体外で生育し、次に、これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳと３０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中で１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁させ、２００μＣｉ／ｍｌのＮａ（⁵¹Ｃｒ）Ｏ₄と３７℃で４５分間培養した。標識化した細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓを添加したＤＭＥＭで３回洗浄した。次に、これらを１０ｍＭのＨｅｐｅｓと１０％のＦＣＳとを追加したＤＭＥＭ中に再懸濁させ、その後、１０³個の細胞を含む１００μｌのアリコットを、９６ウェルマイクロプレート中に分布させた。ＰＢＬｓのサンプルを、１００μｌの同じ培地に添加し、同じようにアッセイを行った。プレートを１００ｇで４分間遠心分離し、３７℃で８％のＣＯ₂雰囲気中にて４時間培養した。プレートを再び遠心分離し、１００μｌの上清のアリコットを採取し、計数した。⁵¹Ｃｒ放出の百分率は以下の式に基づいて計算された。ここで、ＥＲは観察された実験⁵¹Ｃｒ放出量、ＳＲは１０³標識化細胞を２００μｌの媒体中のみで培養することによって測定された自発的放出量、そしてＭＲは、１００μｌの０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を標的細胞に添加することによって得られた最大放出量である。高いＣＴＬ活性を示した前記単核血液サンプルを制限希釈によって拡張及びクローン化を行い、同じ方法を使用して再スクリーニングした。このようにしてＣＴＬクローンＭＺ２−ＣＴＬ８２／８２を分離した。該クローンを、以後「８２／８２」と称する。同じ方法を使用して、標的Ｋ５６２細胞と、メラノーマ細胞系とをテストした。図１Ａに示されたこれらの結果は、このＣＴＬクローンがメラノーマ細胞系は認識して溶解するが、Ｋ５６２は認識も溶解もしないことを示している。次に、上述したものと同じ方法によって、ＣＴＬクローン８２／８２をメラノーマ細胞系に対してテストした。図１は、ＭＺ２−ＭＥＬ．４３は、ＣＴＬクローン８２／８２によって溶解されるが、ＨＬＡ−Ａ２８，ＨＬＡ−Ｂ４４，及びＨＬＡ− Ｃクローン１０の発現を欠失した変異体である細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５は、溶解されないことを示しており、これは、前記ＴＲＡがこれらのＨＬＡ分子の一つによって提示されるものであることを示唆している。細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５を、周知の技術を使用して、ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化するＤＮＡとトランスフェクションさせた時、これらの細胞は、ＣＴＬクローン８２／８２による溶解に対して感応するようになり、従って、前記ＣＴＬクローン８２／８２によって認識される抗原がＨＬＡ−Ｃクローン１０によって提示されていることを示した。例２８２／８２を標的細胞と接触させた時に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）も生成したか否かを調べるために更に研究を行った。ここで使用した方法は、ここにその開示内容を参考文献として添付するトラヴァーサリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）等、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２（１９９２）に記載されたものであった。簡単に説明すると、前記ＣＴＬ系のサンプルを、培地中にて対象となる標的細胞のサンプルと結合した。２４時間後、前記培養物からの上清を除去し、次に、ＴＮＦ感応性のＷＥＨＩ細胞上でテストした。図２に示されているように、１４の異なった細胞系のパネルをテストした。図２は、その結果を、前記上清に対する暴露によって死滅したＷＥＨＩ細胞の百分率として示している。これらの結果は、三つのメラノーマ細胞系がこの抗原を提示することを示している。ＭＺ２ＭＥＬ４３による強い応答の結果により、これを以下の実験に使用した。例３例２から得た結果は、ＭＡ２．ＭＥＬ．４３が目的の標的抗原を提示したことを示すものであった。従って、これを、ｃＤＮＡライブラリを準備するための全ｍＲＮＡソースとして使用した。前記細胞系から全ＲＮＡを分離した。前記ｍＲＮＡは、周知の技術に従って、オリゴ−ｄｔ結合キットを使用して分離した。ｍＲＮＡが得られた後、これを、再び標準的方法を使用して、ｃＤＮＡに転写した。次に、製造業者の指示に従って、このｃＤＮＡをＥｃｏＲＩアダプタに連結し、プラスミドｐｃＤ−ＳＲαのＥｃｏＲＩサイトにクローン化した。次に、組替えプラスミドを、ＪＭ１０１Ｅ．ｃｏｌｉに電気穿孔した（電気穿孔条件：２５μＦにて１パルス、２５００Ｖ）。トランスフェクションしたバクテリアを、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で選択し、次に、これらをそれぞれが４００バクテリアから成る８７のプールと、２００のバクテリアから成る２９７のプールとに分割した。分析に依れば約７０％のプラスミドがインサートを有していたので、各プールは、約２８０又は約１４０のｃＤＮＡを表すものであった。マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．，１９８２）に従って、各プールを飽和状態にまで増幅し、プラスミドＤＮＡを、アルカリ溶解、酢酸カリウム沈澱によって、フェノール抽出無しで分離した。例４例３に記載したライブラリの準備後、前記ｃＤＮＡを真核生物細胞にトランスフェクションした。このトランスフェクションは前述したトランスフェクションと全く同様に行った。ＣＯＳ−７細胞のサンプルを、１０％の胎児ウシ血清を添加したＤｅｌｂｅｃｏ’ｓ変性Ｅａｇｌｅｓ培地（”ＤＭＥＭ”）中で、組織培養平底マイクロウェルに１５，０００細胞／ウェルの割合で接種した。これらの細胞を３７℃で一晩培養し、培地を取り除き、これを、１０％のＮｕ血清、４００μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン、１００μＭクロロキン、１００ｎｇの対象プラスミドを含むＤＭＥＭ培地５０μｌ／ウェルにて置換した。これらのプラスミドは、上述した種々のプールのプラスミドと、プラスミドｐｃＤ−ＳＲα中でＨＬＡ− Ｃクローン１０をコード化するＤＮＡを含む１００ｎｇのプラスミドとであった。３７℃にて４時間培養した後、前記培地を除去し、１０％のＤＭＳＯを含む５０μｌのＰＢＳによって置換した。この培地を２分後に除去し、１０％のＦＣＳを添加した２００μｌのＤＭＥＭによって置換した。この培地の交換後、ＣＯＳ細胞を３７℃で２４〜４８時間培養した。次に培地を廃棄し、１０％のプールされたヒト血清を含有し、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した１００μｌのＩｓｃｏｖｅ培地中で、１５００細胞のＣＴＬクローン８２／８２を添加した。２４時間後に上清を除去し、参考文献として添付したトラヴァサーリ（Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉ）他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ３５：１４５〜１５２の記載に従い、ＴＮＦ含有量をＷＥＨＩ細胞上のアッセイで測定した。テストした３８４のプールの内、９９％が５ｐｇ／ｍｌ以下の濃度でＴＮＦを刺激した。二つのプールは、４０ｐｇ／ｍｌ以上産生し、その複製ウェルも同様の結果であった。図３はこの結果を示している。これらのプールの一つ、即ち、プール１９からのバクテリアを選択し、更に実験した。例５前記プール１９のバクテリアをクローン化し、８００のバクテリアをテストした。そこからプラスミドを抽出し、上述したものと同じ方法で、ＣＯＳ細胞の新たなサンプルにトランスフェクションし、これらの細胞のＣＴＬクローン８２／８２の刺激を再びテストした。１２の陽性クローンが見つかった。ｃＤＮＡクローンＡＤ５と称するこれらの一つを更にテストした。比較テストにおいて、ＣＯＳ細胞を、ｃＤＮＡクローンＡＤ５とＨＬＡ−Ｃクローン１０、ＨＬＡ−Ｃクローン１０とＭＡＧＥ−１、ＡＤ５のみ、又はＨＬＡ−Ｃクローン１０のみ、にてトランスフェクションした。コントロール細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ２．２．５及びＭＺ２−ＭＥＬ．４３も使用した。ＣＴＬ上清中のＴＮＦ放出を、前述したように、ＷＥＨＩ細胞上でテストした。生存ＷＥＨＩ細胞の光学密度を、ＭＴＴを使用して測定した。図４は、ＨＬＡ−Ｃクローン１０とｃＤＮＡ−ＡＤ５とでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞と、元の細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ．４３のみがＣＴＬクローン８２／８２からのＴＮＦ放出を刺激したことを示している。例６前記ｃＤＮＡＡＤ５を公知の技術に従って配列決定した。配列検索により、前記プラスミドインサートは公知の遺伝子又はタンパク質に対して相同性を示さないことが明らかになった。配列認識番号（ＳＥＱＵＥＮＣＥＩＤＮＯ）：１は、以後、”ＢＡＧＥ−１”と称する、同定された遺伝子のｃＤＮＡヌクレオチド情報を提示する。推定転写解読枠は、前記分子の塩基２０１〜３３２に位置している。例７例６と同様に、前記ｃＤＮＡの配列決定後、正常組織の細胞が前記遺伝子を発現するかどうかを調べる実験を行った。これを調べるために、正常組織から分離したＲＮＡを、オリゴ−ｄｔをプライマーとして使用して逆転写した。次にその結果得られたｃＤＮＡを下記のプライマーと標準ＰＣＲ法を使用して増幅した。プライマー： 5’CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3’ （配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２）及び、 5’-GAG CGG TTT TTC TGG CAT TG-3’（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３）増幅生成物の量がけい光画像化によって測定できるように放射性ヌクレオチドを添加した。生成物の量は、細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ３．０から得られ前記遺伝子を発現することが示された生成物の百分率として表された。その結果は以下の通りである。ＭＺ−ＭＥＬ３．０１００％肺＜０．５％胸 ” 胃 ” 皮膚 ” 脳 ” 前立腺 ” 腎臓 ” 精巣８％ここでは詳細しない追加実験に於て、細胞系ＭＺ２−ＭＥＬの前記ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、次に、ここに記載のｃＤＮＡの最初の３００のヌクレオチドに対応するＰＣＲプローブでハイブリダイゼーションした。標準サザンブロッチングに従って、約５．８，７．５，８．５及び１１キロベースの大きさに対応する４つのバンドが同定され、これはＢａｇｅ遺伝子のファミリの存在を示唆するものである。例８腫瘍サンプルと腫瘍細胞系とによる前記遺伝子の発現も調べられた。ｃＤＮＡを例４と全く同じようにして得て、次いで、関連配列を増幅するために組（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー法を行った。最初に、下記のプライマーを使用して２０サイクルの増幅を行った。 5’-CGG CTT AGA GGA CCA GGA GAA-3’（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４）及び 5’CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3’（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）この後、下記のプライマーを使用して更に２０サイクル行った。 5’-GGC TCC AAC CTC CAG CTC AC-3’（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：６）及び 5’-TTA GAG GAC CAG GAG AAG G-3’（配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）以下にその結果を示す。最初の数字は陽性サンプルの数、二番目の数字はテストしたサンプルの総数を示す。メラノーマ１２／２０乳癌２／５小細胞肺癌２／８非小細胞肺癌２／５肉腫１／４頭部及び首部腫瘍１／６結腸癌０／４腎臓癌０／５白血病／リンパ腫０／３例９上述の実験は、細胞溶解Ｔ細胞クローンＣＴＬ８２／８２が、ＢＡＧＥ遺伝子によってコード化され、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０によって提示される抗原を認識することを示した。この例に記載の作業は、提示された抗原のアミノ酸配列がいかにして決定されるかを詳述するものである。ＢＡＧＥ、即ちＡＤ５をコード化すると同定された前記ｃＤＮＡクローンを使用して、多数の不完全なｃＤＮＡ分子を生成した。前記ｃＤＮＡクローンを発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに挿入し、ＮｏｔＩ及びＳｐｈＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後、製造業者の指示に従って、エクソヌクレアーゼＩＩＩで処理した。時間の長さを変えるためにエクソヌクレアーゼＩＩＩを使用することによって、ＡＤ５の３’末端において連続的に欠失した物が得られた。これらの裁頭変異体を、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに再連結させ、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＦ’ＩＱに電気穿孔し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）によって選択した。このようにして４００のクローンが得られた。これらの４００のクローンからプラスミドＤＮＡを得て、ｃＤＮＡをコード化するＨＬＡ−Ｃ−クローン１０とともにＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。次に、上述したように、これらのトランスフェクション体を、ＴＮＦ放出アッセイでテストした。ＣＴＬ８２／８２によるＴＮＦ放出を刺激したものは陽性クローンであった。細胞を陽性トランスフェクション体と陰性トランスフェクション体とに分けた後、１０の陽性体からと１０の陰性体からのプラスミドＤＮＡの配列を調べた。陽性クローンであるクローン１９Ｃ２は、ヌクレオチド１からヌクレオチド６７までにおいて、上述したＢＡＧＥ遺伝子のための転写解読枠の一部を有していた。これに対して、陰性トランスフェクション体であるクローン１７Ｇ１２は、前記遺伝子のヌクレオチド１〜６を有していた。陽性クローンと陰性クローンのインサートを比較することによって、２２のアミノ酸からなる一つの領域が、おそらく前記提示されたペプチドの配列を有するものとして同定された。即ち、 Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Leu Gln Ala Arg Leu Met Lys Glu （配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８）次に、この配列に基づいて合成ペプチドを作り、そのＨＬＡ−Ｃ−クローン１０でトランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞をＴＮＦ放出の刺激を可能にする能力についてテストした。第１の陽性ペプチドは１６−ｍｅｒであった。 Met Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu Ser Ala Gln Leu Leu Gln （配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９）比較的小さいペプチドのテストによって次のペプチドが同定された。 Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu （配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０）このペプチドは、ＣＴＬ８２／８２を効果的に刺激し、８０ｎＭのペプチド濃度において半最大溶解に到達した。これが図５に示されている。上記の諸例は、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する核酸分子の分離を示している。この”ＴＲＡＰ”コード化分子は、しかしながら、上述した参考文献に記載された過去に開示されたいずれのＭＡＧＥコード化配列とも相同ではない。従って、本発明の一側面は、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載の前記ヌクレオチド配列を有する分離された核酸分子である。参考文献に記述された、いかなるＭＡＧＥの配列と比較してもわかるように、この配列はＭＡＧＥをコード化する配列ではない。又、本発明の一部である核酸配列は、非−ＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体もコード化するが、ストリンジェントな条件下においては、記載したヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイゼーションをする。ここで「ストリンジェントな条件」とは、当該技術において周知のパラータをいう。より具体的には、ここでのストリンジェントな条件とは、３．５ｘＳＳＣ、１ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液と、２５ｍＭ燐酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、及び２ｍＭＥＤＴＡ中における、６５℃で１８時間のハイブリダイゼーションをいう。その後、フィルタは、６５℃で２０分間の２ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中での洗浄を４回行い、更に、０．３ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中にて最大２０分間の洗浄を一回行う。同じ程度のストリンジェントな条件をもたらすために使用可能なその他の条件、試薬等もあるが、これらの条件は当業者には周知であるのでここでは記載しない。上記諸例から、又、本発明が前記配列の発現ベクターに於ける使用と、更に、これら配列の原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）あるいは真核（例えば、ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞）の宿主細胞及び細胞系をトランスフェクションするための使用とも含むことが理解されるであろう。前記発現ベクターは、関連配列、即ち、上述の配列が、プロモータと操作可能にリンクされていることを必要とする。ヒト白血球抗原ＨＬＡ−Ｃクローン１０がこれらの遺伝子から派生した腫瘍拒絶抗原を提示することが判っているので、前記発現ベクターは、また、ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化する核酸配列も含んでいる。ベクターが両方のコード化配列を含む場合には、それを使用して正常にはいずれをも発現しない細胞をトランスフェクションすることも可能である。上記腫瘍拒絶抗原先駆体コード化配列は、例えば、宿主細胞が既にＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現する場合等において、単独で使用することも可能である。もちろん、使用可能な具体的な宿主細胞についての限定はない。所望の場合、前記二つのコード化配列を有するベクターをＨＬＡ− Ｃクローン１０提示細胞に使用することが可能であるので、腫瘍拒絶抗原先駆体の遺伝子を、ＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現しない宿主細胞に使用することが可能である。本発明は、更に、技術者がそれによって所望の単数又は複数の発現ベクターを作ることが可能ないわゆる発現キットをも含む。このような発現キットは、前述したコード化配列のそれぞれの少なくとも分離部分を含むものである。前述した必要な配列が含まれる限り、所望の場合、他のコンポーネントを追加することも可能である。本発明の核酸分子とＴＲＡＰｓを前述したＭＡＧＥファミリから区別するために、本発明を、遺伝子とＴＲＡＰｓとのＢＡＧＥファミリと称する。従って、ここで”ＢＡＧＥ”を使用する場合は、常に、これは前述した配列によってコード化される前記腫瘍拒絶抗原先駆体を指す。”ＢＡＧＥコード化分子”とこれに類似の用語は、前記核酸分子自身を記載するのに使用される。更に、例９に記載した配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８，９及び１０のペプチドも本発明の一部である。これらのペプチドは、例えば、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｃクローン１０を提示する細胞の同定に使用することができる。これを達成する一つの方法は、検出可能な信号を備えたこれらのペプチドの投与し、その後、ペプチドが結合した細胞を同定することであり、又、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０提示細胞が結合する固相結合ペプチドを使用して、それらをアッセイされているサンプルから除去することである。更に、本発明によって、当業者はＴＲＡＰの発現によって特徴付けられる疾患を診断することができる。これらの方法は、前記ＴＲＡＰ遺伝子の発現の測定及び／又は、ＨＬＡ−Ｃクローン１０によって提示されるＴＲＡ等のそこから派生するＴＲＡｓ等の発現の測定を含む。前者の場合、このような測定は、ポリメラーゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定方法、又は、標識化ハイブリダイゼーションプローブによるアッセイ等によって行うことが出来る。後者の場合には、抗体等の、ＴＲＡ及びＨＬＡの複合体の結合パートナーによるアッセイが特に好ましい。測定の別の方法としては、上述したタイプのＴＮＦ放出アッセイがある。ＴＲＡＰ遺伝子の分離によって、ＴＲＡＰ分子自身、特に、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１によってコード化される前記アミノ酸配列を含むＴＲＡＰ分子を分離することも可能になる。これらの分離された分子は、ＴＲＡとして、又は、ＨＬＡ−Ｃクローン１０等のＴＲＡとＨＬＡの複合体として提示された場合、アジュバント等の物質と結合させて、ＴＲＡＰ分子の発現によって特徴付けられる疾患の治療に有用なワクチンを製造することができる。更に、ワクチンは、非増殖性癌細胞、非増殖性トランスフェクション体等の、その表面にＴＲＡ／ＨＬＡ複合体を提示する細胞から作ることが出来る。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合、これらは、ＣＴＬ応答を証明するのに必要な成分の片方又は両方をコード化する配列でトランスフェクションされた細胞、又は、トランスフェクション無しで両方の分子を発現する細胞とすることができる。更に、前記ＴＲＡＰ分子、その関連ＴＲＡｓ、及びＴＲＡとＨＬＡの複合体は、当該技術分野において周知の技術を使用して、抗原の製造に利用することができる。ここで「疾患」という時、これは、腫瘍拒絶抗原先駆体が発現されるすべての病状を指す。このような疾患の一例は、特に、癌メラノーマである。当該開示に基づく治療方法は、対象体の免疫システムが応答し、ＨＬＡ−Ｃクローン１０細胞等のＴＲＡ提示細胞が溶解されることを前提としている。このような方法の一つは、前記複合体に対して特異的なＣＴＬｓを、問題の表現型の異常細胞を有する対象体に投与することである。このようなＣＴＬｓを生体外で開発することは十分に当業者の技術範囲に含まれる。具体的には、血液細胞等のサンプル細胞を、前記複合体を提示し、特定のＣＴＬの増殖を促進することが可能な細胞に接触させる。標的細胞は、上述したタイプのＣＯＳ細胞等のトランスフェクション体であってよい。これらのトランスフェクション体は、その表面に所望の複合体を提示し、対象のＣＴＬと結合された時に、その増殖を刺激する。ここに使用したようなＣＯＳ細胞は、広く一般に入手可能であり、その他の適当な宿主細胞も同様である。養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｅｒ）と称される前記治療方法（グリンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６（５）：１９１７（１９８６）：レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：２３８（７−１０−９２）：リンチ（Ｌｙｎｃｈ）他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１４０３〜１４１０（１９９１）；カスト（Ｋａｓｔ）他、Ｃｅｌｌ５９：６０３〜６１４（１１−１７−８９）について詳述すると、所望の複合体を提示する細胞を、ＣＴＬｓと結合させ、この細胞に対して特異的なＣＴＬｓを増殖させる。次に、この増殖したＣＴＬｓを、前記特定の複合体を提示している前記異常細胞のいいずれかによって特徴付けられる細胞異常を有する対象体に投与する。すると、ＣＴＬｓが異常細胞を溶解し、所望の治療目的を達成する。上述の治療方法は、対象体の異常細胞の内の少なくともいくつかが前記ＨＬＡ／ＴＲＡ複合体を提示することを前提としている。これは、その技術が特定のＨＬＡ分子を提示する細胞を同定する方法と、前記特定の配列、ここではＢＡＧＥ配列、を有するＤＮＡを発現する細胞を同定する方法とに非常に類似しているため、非常に容易に判断することが出来る。一旦、関連複合体を提示する細胞を上述のスクリーン法によって同定した後は、そのような細胞を、対象体からの、ＣＴＬｓを含むサンプルと結合させることが出来る。もしも細胞提示複合体が前記混合ＣＴＬサンプルによって溶解されるならば、ＢＡＧＥ派生の腫瘍拒絶抗原が提示されていると推定することが出来、その対象体は、上述の治療アプローチを使用するのに適切な候補となる。養子移入のみが本発明によって利用可能な治療方法ではない。種々のフプローチを使用して、生体内でＣＴＬｓを誘発することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前記複合体を発現する非増殖性細胞の使用については既に記載した。このアプローチに於て使用される細胞としては、前記複合体を正常時において発現する細胞、例えば、照射済みメラノーマ細胞や、前記複合体の提示に必要な前記遺伝子の一つ又は両方によってトランスフェクションされた細胞、等を使用することができる。このアプローチの一具体例はチェン（Ｃｈｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉ．ＵＳＡ８８：１１０〜１１４（１９９１年１月）に記載されており、ここには、ＨＰＶＥ７ペプチドを発現するトランスフェクションされた細胞の、治療法に於ける使用が示されている。様々な細胞タイプを使用することができる。同様に、問題の遺伝子の片方又は両方を担持するベクターを使用することができる。ウィルス性又はバクテリア性のベクターが特に好ましい。これらのシステムにおいて、問題の遺伝子は、例えば、ワクシニアビールスやバクテリアＢＣＧ等によって担持され、これらの物質が実質的に（ｄｅｆａｃｔｏ）宿主細胞に感染（「インフェクション」）する。その結果得られる細胞は、問題の複合体を提示し、自己増殖ＣＴＬｓによって認識され、増殖する。前記腫瘍拒絶抗原又は前記先駆体自身を、問題のＨＬＡ分子を提示するＨＬＡ−Ｃクローン１０提示細胞への組み込みを促進するアジュバントと結合させることによっても類似の効果を達成することができる。前記ＴＲＡＰはプロセッシングされてＨＬＡ分子のペプチドパートナーを生成し、他方、ＴＲＡは、更なるプロセッシングを必要とせずに提示される。本発明のその他の側面は当業者にとって明らかであろう。従って、ここでは繰り返す必要はない。ここに使用した用語及び表現は、説明のための用語であって限定的なものではなく、従って、これらの用語及び表現の使用において、図示記載された特徴構成又はその均等物、又はそれらの一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内において様々な改変態様が可能であると理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 7/08 8517−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 14/47 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者ブーン‐ファラー，ティエリーベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者クーリ，ピエールベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459 (72)発明者ルノー，ジャン‐クリストフベルギー国ビー‐1200 ブリュッセルアベニュー・ヒポクラート 74 ユーシーエル 7459

Claims

【特許請求の範囲】１．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載のヌクレオチド配列を有する分離された核酸分子。２．ストリンジェント条件下において、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載の核酸配列にハイブリダイゼーションし、かつ、腫瘍拒絶抗原先駆体をコード化する分離された核酸分子であって、該分離された核酸分子はＭＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体はコード化しない。３．請求項１の核酸分子に対して相補的な、分離されたｍＲＮＡ分子。４．請求項１の核酸分子にてトランスフェクションされた宿主細胞。５．請求項２の核酸分子にてトランスフェクションされた宿主細胞。６．プロモータに操作可能にリンクされた請求項１の分離された核酸分子を有する発現ベクター。７．プロモータに操作可能にリンクされた請求項２の分離された核酸分子を有する発現ベクター。８．請求項４の宿主細胞であって、前記宿主細胞はＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現するほ乳類細胞である。９．請求項５の宿主細胞であって、前記宿主細胞はＨＬＡ−Ｃクローン１０を発現するほ乳類細胞である。１０．請求項６の発現ベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化する核酸分子を含む。１１．請求項７の発現ベクターであって、更に、ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化する核酸分子を含む。１２．次の要素の分離部分をそれぞれ有する発現キット、（ｉ）請求項１の分離された核酸分子、及び（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化する核酸分子。１３．次の要素の分離部分をそれぞれ有する発現キット、（ｉ）請求項２の分離された核酸分子、及び（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｃクローン１０をコード化する核酸分子。１４．請求項１の核酸分子によってコード化される分離された腫瘍拒絶抗原先駆体。１５．プロセッシングされて、ＨＬＡ−Ｃクローン１０分子によって提示される腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記ＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ｃクローン１０分子の複合体に対して特異的であって、前記複合体を提示する細胞を溶解する細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。１６．核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と前記腫瘍拒絶抗原先駆体から派生された腫瘍拒絶抗原との複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。１７．プロセッシングされて、ＨＬＡ−Ｃクローン１０分子によって提示される腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記ＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ−Ｃクローン１０分子の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記応答を誘発するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。１８．核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と腫瘍拒絶抗原先駆体の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。１９．プロセッシングされて、ＨＬＡ−Ｃクローン１０分子と複合体を形成するＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との相互作用を、前記疾患であるとの確定として測定する工程を有する方法。２０．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載の配列を有する核酸分子によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記配列又はその発現生成物に対して特異的な抗原と接触させる工程と、前記配列又は前記発現生成物との間の相互作用を、前記疾患であるとの確定として測定する工程を有する方法。２１．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：８，配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：９及び配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０からなるグループから選択される分離されたペプチド。２２．細胞溶解性Ｔ細胞応答を誘発する方法であって、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０提示細胞を、細胞溶解性Ｔ細胞の存在下において、ＨＬＡ−Ｃ−クローン１０と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０の複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞の増殖を誘発するのに十分な量の請求項２１の分離されたペプチドと接触させる工程を有する方法。２３．プロセッシングされて、ＨＬＡ−Ｃクローン１０によって提示される配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のアミノ酸配列から成る腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記ＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ− Ｃクローン１０分子の複合体に対して特異的で、かつ前記複合体を提示する細胞を溶解する細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。２４．核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列を含む腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ分子と配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原の複合体に対して特異的な細胞溶解性Ｔ細胞を、前記疾患を軽減するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。２５．プロセッシングされて、ＨＬＡ−Ｃクローン１０によって提示される配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のアミノ酸配列から成る腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、前記ＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原とＨＬＡ− Ｃクローン１０分子の複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対して前記応答を誘発するに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。２６．核酸分子によってコード化され、かつ、配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１のヌクレオチド配列を有する腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を治療する方法であって、ＨＬＡ−Ｃ−クローンと配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）： 1.0のアミノ酸配列からなるペプチドの複合体に対する免疫応答を誘発する薬剤を、前記複合体を提示する細胞に対する前記免疫応答を誘発するのに十分な量を、前記対象体に投与する工程を有する方法。２７．プロセッシングされることによって、ＨＬＡ−Ｃクローン１０分子と複合体を形成する配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のアミノ酸配列から成るＢＡＧＥより派生の腫瘍拒絶抗原となるＢＡＧＥ腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を有する対象体を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記複合体に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記複合体と前記薬剤との間の相互作用を、前記疾患であることの確定として測定する工程を有する方法。２８．配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１に記載の配列を有する核酸分子によってコード化される腫瘍拒絶抗原先駆体の発現によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、対象体からのサンプルを、前記先駆体から派生しかつ配列認識番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：１０のアミノ酸からなる腫瘍拒絶抗原に対して特異的な薬剤と接触させる工程と、前記薬剤と前記配列又は前記発現生成物との間の相互作用を、前記疾患であることの確定として測定する工程を有する方法。