TW442568B - Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2 - Google Patents

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44256 8 經濟部中央揉丰局員工消费合作杜印聚 A7 _____B7 _五、發明説明（丨） 發明籲圈 本發明係關於編碼一種腫瘤排斥抗原前驅物（tumor rejection antigen precursor)的核酸分子。說的更具體 ，本發明係關於一種基因及其它的事物；該基因編碼的腫 瘤排斥抗原前驅物會處理（processed)成至少一種以 HU-A2分子表現於细胞表面的腫瘤排斥抗原。 先前文獻趾背最 哺乳類免疫系铳辨識外來物質及與外來物質發生反想是 相當複雑的過程。而此系統中重要步驟是T细朐反應。此 反應需要T细胞辨識名為人類白血球抗原（hu®an leukocyte antigens; HLA)或主要姐嫌相容複合體 (靈ajor histocompatibility complexes; MHCs)與胜狀之 複合物*並且與其發生反應。該胜肽是源自细胞將大分子 處理後而得，該胜呔亦存於HLA/MHC分子中。參考麥爾 (Male)等人；高等免疫學（Advanced Immunology} (J.P. 林皮吉特公司，1987 )，特別是第&至第10章。T细胞與 HLA/胜肽複合物之間的交互作用是具限制的 > 此作用需要 對HU分子及胜呔特殊姐合具專一性的Τ细胞，若是此專 一性Τ细胞不存在，即使其隅合體複合物（partner· co*i>l ex)存在亦不會發生T细胞反應。相同地，假若缺乏 專一性複合物，但T细胞存在時，亦不會有反應的發生。 此櫬制影響對抗外來物質的免疫糸統反應，自體免疫病理 及對抗失常性细胞的反懕。近來，許多研究工作焦點集中 ------：----t------TT-----^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國B家揉率（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83. 3,10,000 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印« 442568 A7 __B7 五、發明説明（>) 在蛋白質處理成HLA键結胜肽的機制上。在此方面請參考 巴瑞那卡（Barinaga)，科學（Science) 257:880 (1992); 佛瑞摩特（Fremont)等人；科學257:919 (1992);馬自馬 拉（Matsumura)等人；科學 257:927 ( 1992 );拉特龍 (Latron)等人；科學 257:964 ( 1992)。 T细胞辨識细胞失常性的機制亦與癌症有關。例如· PCT申請專利系PCT/US92/04354 ( 1 992年5月22日建檔， 於1992年11月22日發表）揭示一族可處理成表現於细胞表 面的基因群，藉著專一性CTLs可導致腫頫细胞的溶解。這 些基因即是编碼”腫瘤排斥抗原前驅物” （tuB〇r rejection antigen precursors)® 稱TRAP分子 * 而源自 於此的胜狀即命名為腫瘤排斥抗原（tunor rejection antigens)或稱TRAs。參考特瑞佛撤利（Traversari)等人 ;免疫遗傳學（Imtuunogenetics) 35:145 (1992);文德布 路金（van der Brugsen)等人；科學 254 : 1643 (1991)， 等文章中有翮此基因群的資訊。 美國專利申請案第938,334號中揭示HU-A1分子展現九 個胺基酸胜肽* (該申請案一併併人本文Μ供參考）*該申 請案中敘明特定的HL Α分子是針對已知專一性的特定胜肽 ，而特定的胜肽也只會鐽结至一個HL A分子，而不是其它 的分子。這點是相當重要的，因為不同的個體擁有不同的 HLA表現型。因此，當鑑定出某一特定胜肽是專一性HLA 分子的隅合體時則具有診斷及治療價值，因為只有相關的 個體具有該特定的HL A表現型。在此領域中仍需進—步的 本紙張尺度逍用中國國家橾丰{ CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 ----------i------IT-----^- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) 442568 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（$ ) 努力，因為细胞失常性不限於某種特定HL A表現型*而檷 的治療（targeted therapy)所箱不正常细胞表現型的知識 尚在研討中。 美國專利申議蒹第003,446號（1993年1月22日建檔）揭示 MAGE-1表現產物可處理成第二種的TRA。（該申請案一併併 入本文以供參考）。此第二種TRA是由HLA-C10分子所編 碼，該發明中敘明特定TRAP能產生多數的TR As。 美國專利申講案第994,92 8號（1992年12月22日建檔）揭 示酪胺酸海（tyrosinase)是為一棰腫瘤排斥抗原前顆物（ 該申請案一併併人本文以供參考）。&申請案中說明某些 正常钿胞（例如黒色素细胞（melanocytes))所產生的分子 會在腫瘤细胞中處理而產生由HL A-A2分子所展現的腫瘤排 斥抗原。 現在已發現另一種能钃碼不苘於先前所敘述的腫癯排斥 抗原前驅物之核酸分子。本發明的TRAP處理後至少能產生 一種由HLA-A2分子展現的腥塯排斥抗原，而且其序列顯示 本發明的TRAP不是酪胺酸酶，亦與酪胺酸酶無關。因此， 本發明係關於一種編碼腥頫排斥抗原前驅物或稱為 ”TRAP”分子之核酸分子。此”TRAP”分子酪胺酸誨，除 此之外*本發明的TRAP處理後至少產生一種由HLA-A2分子 所展現的腫瘤排斥抗原；或稱為"TRA”。此TR A與酪胺酸 酶無關，而源自本發明的TRAPs之其它TRAs可由其它的 HLA分子所展規。 本發明及其各種不同的方面將於下列的揭示中詳细地說 -------->. —裝------訂-----線 (请先閱读背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國圉家梯準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83. 3.1〇 〇〇〇 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 442568 A7 _B7_ 五、發明説明（从） 明。 圔形的簡里說明 圖1A是利用對抗LB39-MEL, K562及LB39之CTL選殖體 1/95所得的细胞溶解實驗结果。 圖1B是利用對抗SK23-MEL及SK29-MEL之CTL選殖體 1/95所得的细胞溶解實驗結果。 圖2是利用具CTL 1/95之各種细胞株所得的TNF釋放檢 測结果。 圖3A是包括轉植Si (transfectants)之不同细胞株與 CTL選殖體1/95測驗時所誘發的TNF釋放结果。 圖38是利用CTL選殖體IVSB所呈現的THF釋放數據。 圖3C是利用CTL選殖骽10/196所里現的THF釋放數據。 圖4是Μ源自本發明中所敘述之核酸分子的寡核苷酸探 針利用聚合酶鐽结反應卜〇〗？《16『836 chain reaction; PCR>測試組嫌，细胞株及腫瘤表現AaGlcl24基因的结果 較任亘髁窨例的註钿雜沭 範例1 . ” LB-39-MEL”是利用標準方法取自病人LB39之黑色素细 胞瘤细胞（melanoaa cel丨s)所建立的黑色素瘤细胞株。 —旦细胞株建立後，其樣品用放射線處理，使其不能增生 (non-pr〇nferative)，然後使用這些放射線處理過的细 ~ 7 ~____ 本紙張尺度逋用中國困家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） βΓΓΓο,Οοο I I— ^inn ^ I- n ^ (請先閲讀背面之注^K項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 “2568 A7 B7五、發明説明（今） 胞來分雛更其專一性的佃胞溶解性T细胞（cytolyUc T cell； CTLs) ° 自病人LB39中抽取周圍血液單核掘胞（peripheral blood Bono nuclear cells; PBMCs)檢體，並與放射媒處 理遇的黑色素厢细胞混合•覼察混合物中黑色素摑细胞溶 解作用•此表示混合物中存在對由黑色素瘸细胞所展現之 HLA分子與胜呔的複合物有專一性的CTLs。 所應用的溶解作用檢測法是根據亨利（Her U)等人；國 際癌症雜誌（Ut. J. Cancer) 39:390-396 (1987)的路釋 畋檢測法，該文章所揭示的内容一併併入本文Μ供參考。 而本文亦將敘述該檢測法。在活體外（ΰι_ vitro)培養隳的 黑色素瘤细胞，而後用内含10 西皮斯（HEPES)及30¾ 眙牛血清（FCS)的DMEM配製成濃度為107细朐/毫升的细 胞懸浮液。並與200毫居里/¾升的Na(slCr)〇4於37Ό 下反應45分鐘。用内含10 西皮斯（HEPES)的DMEM清洗 欏記细胞3次，而後用内含10 mM西皮斯（HEPES)及10¾ 胎牛血清（FCS)的DUE Μ配製细胞懸浮液。使每1〇〇微升中 含有1〇3個I细胞，分別取100微升的细胞懸浮液至96個槽 孔微量盤之檐孔中。M U檢體加至相同的100微升培養中 ，而檢測時是為兩重覆。將微量盤Μ100 g的速度離心4 分鐘，並在80¾ C〇2的條件下於37 TO培養4小時。 再將微量盤離心一次，分別收集1 〇〇微升的澄清液並計 數之，根據下列的公式計算51Cr釋放的比例： ---------, ------t-----0 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10 000 442568 A 7 B7___五、發明説明（乙） 旧-SR ) It 51Cr 釋出 S：二-：-X 100 (MR -S R ) 其中ER是實驗&B1Cr釋放覼察值，SR是將1〇3個棟記细胞 只培養於200微升培養基時所得的自然釋放值’而,MR是將 100微升的0.3¾特瑞通（Triton)加至搮的细胞畤所得的最 大釋放值。 具有高CTL活性的單核血液檢體再經由限量稀釋擴增及 選殖，利用相同的方法再篩選之。因而分嫌到CTL選殖 LB39-EU 1/95 。 相同的方法亦用來測試檷的K562细胞及自體的 (autologous)PHA誘發T细胞裂殖備UUsts)。這些列於 圖1 A的结果顯示此CTL選殖能辨識並溶解黑色素瘤细胞株 ，但K562及T綑胞裂殖體卻不行。然後K前述相同的方式 測試LB39-CTL 1/95對抗黑色素瘤细胞株SK23-HEL及 SK29-MEL。結果發琨這兩種细胞株的细胞均會被溶解，這 兩種细胞株均是從具有HLA-A2分型的病人所分離的，這點 和LB39是相同的。因而推測該CTL選殖體LB39-CTL 1/95 能辨識由HU-A2展現的抗原。 --------.威------1T-----^ (請先閎讀背面之注^^項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局貝工消費合作社印袋 進一步研究LB39-CTL 1/95與標的细胞混合後是否亦能 產生腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor; TNF)。所用 本紙張尺度適用中®國家樣率（CNS > A4規格（210X297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央標準局負工消費合作社印裝 •14.； 56¾ A7 __B7_ 五、發明説明（7 ) 的方法是根據特瑞佛撖利（Traversari)等人；免疫遺傳學 35:1 45-1 52 (1992)所敘，該文章所揭示的内容一併併入 本文Μ供參考。扼要的說是將CTL细胞株與有興趣的標的 妞胞檢體於培養基中混合之。24小時之後，從培養媚中取 出澄清液，然後在THF敏感WEHI细胞上測試。除了前述的 LB39-MEL 及 SK23-MEL外，另外的 HAL-A2 细胞株（如 SK29-MEL.1)及HLA-A2失去變異细胞株（例如SEK29-MEL1.22)及 非HLA-A2细胞株（例如為HU-A1细胞株的MZ2-MEL)均測試 之。 所得结果是Κ和澄清液混合物WEHI细胞死亡的百分比例 表示之*结果列於圖2 。這些结果顯示HLA-A2失去變異细 胞株SK29-MEL.1.22不再能刺激CTL選殖體，因而更確認 由LB39-CTL-I/95所辨識的抗原是由HLA-A2所展現。 節例3 從範例2的結果顯示SK HEL 29.1存有我們興趣的標的 抗原。因此，其做為用Μ製備cDNA基因庫的總mRNA來源。 從细胞株分離缌RNA 。根據相當熟習的技術*利用寡去 氧胸腺噃啶（oligo-dT)鍵結套姐（binding kit)來分離 mRHA。一旦獲得nRHA *再次利用榑準方法將ffiRHA轉錄成 cDHA，然後根據廠商的提議將cDNA接合至EcoRI接合器 (adaptors)，並選殖至質體 pcDNA-1/Abp 的 EcoRI 位置。 然後將重组質體電擊（electroporated)至JM101 E_. cο 1 i 中（電擊條件：25微法拉第，2500 V跳動一次）。 -10 -_____ ϋ張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4坑格（210X297公釐} 83. 3.1〇,〇^ ---^-------;-裝------訂-----線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} “2568 Αν B7五、發明説明（？） 經濟部中央揉率局員工消費合作社印t 用安皮西林（ampicniin)(50微克/毫升）篩選轉殖细菌 ，而後將其分別分装内含有1〇〇個選殖體的族群*每個族 群代表約50倨不同的cDNA，如分析顯示其内約50«的質體 含有插入序列。每個族群擴增至飽和*經由尼亞第斯 (Maniatis)等人*分子選殖：實驗手冊（Cold Spring Harbor, N.Y., 1982)所敘方法之鹼溶解法（alkaline lysis)及不經酚萃取之醋酸鉀沉澱法來分離質賭DNA ° 節例4 在範例3所敘的基因庫製備後，將cDMA轉殖至真核细胞 ，本文所敘的轉殖作用均是Μ二重覆完成的。將C0S-7细 胞種植在姐織培養用之平底的微量盤槽孔中，每個槽孔是 15000涠细胞。所用的培養基是内含10X胎牛血清之杜爾 貝古氏修飾依格爾培養基（Dulbeco's modified Eagles Medium; DMEM)。將细胞置於37¾下隔夜培養，去除培養 基，而在每個榷孔中加人30微升内含10¾ Nu血清* 400微 克/毫升DEAE-糊精（dextran)*100 氣暉 (c h 1 〇 r 〇 ci u i n e)，10 0 n g 的質賭 p c D H A - I / Α β p - A 2 及 1 0 0 n g 前敘之cDNA基因庫的族群。質體pcDKA-I/Abp-A2含有來自 SK29-MEL的HLA-A2基因。在371C下培養4小時之後•去除 培養基，而用50微升内含10¾ DMS0之PBS取代之《在兩分 鐘之後去除此液體*而用20 0微升内含10S5胎牛血清的 DMEM取代之。 茌換掊養基之後，將C0S妞胞置於37 t；下培養48小時， 11 本紙張尺度適用中囷困家樑準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 ---^------- 1¾.------tr-----^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本莧) 442568 A? B7五、發明説明（7) 然後去除培養基*加人含於100微升中的艾斯古佛 (Iscove)培養基（内含10¾族群人類血清及25單位/毫升 的IL-2)之1000掘CTL 1/95的细胞。24小時後取出其澄清 液，用前先併人本文中供參考的特瑞佛撖利之方法於 WEHI细胞上澜定TNF含量。 在800個族群測試中，有99¾會釋放出TNF ，且在澄清 液的濃度為3-6 pg/毫升。兩儷族群的產量超遇8 pS/毫升 *其重覆的槽孔產量亦超過8 pg/毫升。 經濟部中央揉準局負工消费合作社印裝 在澄清液中顯示出具有高產量TNF之族群選出來加K進 一步的研究。特別是將细菌選殖•每假族群測驗800個細 菌。從其中萃取出質體DNA ，用前述相同的方式將質體轉 殖一新的C0S细胞樣品中*並再測試對LB39-CTL選殖體 ί/95的剌激作用。因此發琨一個陽性反應的選殖臑•命名 為AaGicl24。藉由進行陽性株之cDNA及HLA-A2基因轉感染 之C0S细胞，只以HLA-A2，及SK29-MEL糸轉感染C0S細胞 之競爭型測試。用前述的方法測定CTL澄淸液在WEHI细胞 的THF釋放。利用MTT測定存活WEHI细胞的光學密度。圔 3A是用CTL選殖體1/95所得的结果。 進一步的測試發琨在轉殖细胞由HLA-A2展現的胜肽不同 於先前發現者，也就是酪胺酸_衍生胜肽。CTL選殖體 IVSB是與酪胺酸酶衍生胜肽及HLA-A2的複合钧有專一性， 當此CTL選殖體與M/UGlcl24及HLA-A2轉殖之细胞接觸時 IL-------1^------tr-----線 - - (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) __ - 12 -__ 尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83. 3.10,000 經濟部中央樣率局負工消費合作社印复 d 4 2 5 e β A7 _B7 五、發明説明（丨C) ，其THF釋放量最低*如圖3B所示。 自圼陽性反應選殖體中抽取cDN A，並根攞技藝中熟知的 技術定序之。從定序研究中得知所插入的質體之序列與已 知的基因或蛋白質沒有相似性（homology)。鑑別序列第1 號表示cDN A核苷酸資訊，顯示出從第75至431位置之大的 ，開放讀取序列（open reading frame)，其對應的是為 119個胺基酸的蛋白質產物。鑑別序列第2號是鑑別序列 第1號為其部分的延伸序列。 用分離CTL選殖體LB39-CTL 1/95相同的方法，用自病 人SK29UV)的PBMCs檢體及所達立的黑色素细胞钃细胞株 來分離CTL選殖體SK29-CTL 10/196 。此新的细胞株是用 範例5中相囘的方式測試之*這®檢測的结果列於圈3C中 ，這些结果顯示此CTL選殖體亦可辨識由AaGlcl24所煽碼 的腫瘤排斥抗原（本文後簡稱為抗原”LB39-Aa”）。這些賁 驗顯示其它的病人能產生對此抗原有專一性之CTL ，實際 上發現亦是如此。 自所敘的序列衍生出寡核苷酸探針，並用於檷準聚合酶 鍵結反應汸法中以測定這些基因在正常組織，腫瘤及腫癯 细胞株中表現的情形。這些結果列於圖4 ，結果顯示在测 試之正常的姐嫌中只有黑色素细胞才會表現該基因，而在 ~ 13 ~_ 本紙張尺度適用中囷困家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 83.3.10,000 ---^-------- —裝------訂-----線 <請先閱讀背面之注$項再填寫本頁) 經濟部中央樣準局貝工消费合作社印製 442568 A7 _B7 _五、發明説明（丨/) 測試之腫瘤及腫瘤细胞株中均有該基因表現。 接下來的簧驗是敘述一種編碼腥癯排斥抗原前驅物 (TRAP分子）的新分離之核酸序列。該分子是在细胞内處理 而導致至少產生一種由H LA-A2分子所展琨的腫瘤排斥抗原 或稱TRA 。然而在Κ前已發現HLA-A2分子展現胜肽是源自 酪胺酸但本發明的核酸序列不是編碼酪胺酸»的核酸分子 ，且TRAs不是源自酩胺酸酶。 因此本發明是闞於一種煸碼腫瘤排斥抗原前驅物或稱為 ” TRAP”之核酸分子，且該TRAP不是酪胺酸酶。所钃磉的 TRAP是種在處理過後至少形成一種由细胞表面HLA-A2分子 所展琨的腫頫排斥抗原或種TRA 。本發明的核酸分子可Μ 是基因體DNA (”gDNA”），互補DHA (cDHA)或RNA型式。本 發明亦涉及互補於前述分子獨立核酸分子。本發明一個特 別佳的型式是內含鑑別序列第1號序列的分子。 本發明亦包括内含本發明核酸分子Μ人工接合至啟動子 (p r ο β oje r)上的載.體（vectors)。該載體亦包括編碼 HL.A-A2之分子。由於此兩種分子；也就是HLA-A2及TRAP * 最JI生细胞溶解性T细胞反懕（cytolytic T cell response)所必需的，所K本發明亦包含編碼TRAP或 HLA-A2之核酸分子分處於不同部分之表琨系統；例如套姐 (kit)。本發明亦包括由本文載體所轉殖之細胞株，不論 是原核细胞如大腸桿菌（E_. coLi)或是真核細胞如中國倉 鼠卵巢细脃（CH0)或COSM-胞。 ·. - ........-.. 正如所指》TRA及HLA-A2裡合物引發钿胞溶解性T细胞 I-^-------i------.訂-----i 1 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _ 14 -__ 本紙張尺度適It國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ΪΓΓίΟβΟΟ 經濟部中央揉準局貝工消费合作社印装 44256Θ A7 B7五、發明説明（f >) 反應*也因此本發明亦包括該腫瘤排斥抗原及HL A-A2分子 的複合體* Μ及由先前所述核酸序列所編碼之匯瘤排斥抗 原前驅物。 本發明有一些用途，本文將介紹一些。第一是能鑑定特 別是由HLA-A2分子所展現的腥瘤排斥抗原，以及編碼其對 臑腥瘤排斥抗原前驅物之核酸分子以便於讓技術員能診斷 具TRAP表現特撖之疾病。遒些方法涉及測定TRAP基因的表 現，及/或TRAs的來源*如由HLA-A2展規的TRA 。其它的 TRAs亦可能是是源自本發明的TRAPs 。並由不同的HLA分 子所展琨。在前者的情形，可經由任何樓準的核酸檢定方 法來完成檢定*包括有聚合_鍵结反應，或是用檁記雜化 探計（labelled hybridization probes)檢定方法。在後 者的情形，可用鍵结TR A及HLA複合物的偶合體來檢定* 例如抗體是特別佳的方法。 分雛TRAP基因亦可用來分雛其TRAP分子，特別是内含有 鑑別序列第1號核酸序列的TRAP分子。這些K TRA或K TRA及HLA如HLA-A2複合物所圼現的分離分子可與諸如佐藥 (adjuvants)物質結合K產生疫苗，這種疫曲對治療具 TRAP分子表現特徵之疾病是有用的c除此之外•可從在其 细胞表面展現出TRA/HLA複合物之细胞來製備疫苗，諸如 不具增生能力的癌症细胞*不具增生能力的轉殖體等等。 在所有用來製備疫苗之细胞，可Μ是用编碼一種或兩種能 引發CTL反懕所需成分之核酸所轉殖之妞胞，或是不需轉 殖作用而表現兩種分子的細胞。除此之外*利用檷準已熟 丨.L-------'"裝------訂-----線 -' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _-15 -_ 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS > Α4规格（210 X 297公釐） 83. 3.10,000 Λ4256Β A7 B7 經濟部中央揉準局貞工消费合作社印笨 五、發明説明（丨多） 知的技藝可用TRAP分子，其相闢TRAs，K及TRA與HLA的 複合物來產生抗體。 本文所用”疾病”一詞是指任何腫瘤排斥抗原前驅物表 現的病理狀態•此”疾病”的一個例子特別是黑色素细胞 瘤。 根據本發明的治療方法是Μ病人兔疫糸統反應為前提， Μ導致TRA展現细胞的溶解，如HLA-A2细胞。其中一種尚 在討論中的方法是對具表現型失常细胞病人施以對其複合 物有專一性之CTU，此是技術人員在活體外欲發展的技藝 。特別是细胞檢體；如血液细胞•與展現該複合物佃胞接 觸後並能夠引發專一性CTL而增生。標的细胞可Κ是轉殖 體，如前段的COS細胞型式。這些轉殖體在其表面上存有 所要的複合物，並且當與有興趣的CTL结合後便剌激了增 生。諸如本文廣泛使用的COS细胞及其它可用的宿主细胞 〇 有闞詳细的治療方法係稱為收養轉移（adoptive transfer)(格林伯（Greenberg)免疫雜誌 136(5) :1917 (19 86);瑞德（Reddel)等人；科學257:238 (7-10-9 2); 萊奇（Lynch)等人；歐洲免疫雜誌21:1403-1410 U991) ;卡斯特 Uast)等人；细胞 59:603-614 (11-17-89))。圼 現所要複合物的细胞與CTLs结合後導致與CTLs有専一性之 细胞的增生。然後將增生CTLs施用某些不正常细胞有特殊 複合物為特徵的病人身上。而後CTLs溶解不正常的细胞， 藉此達到治療的目的。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家揉率（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 83. 3.10,000 ---^-------—裝------訂-----線 : * (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局負工消费合作杜¥製 442568 A7 . __B7五、發明説明（W ) 前述的治療是假設至少某S病人不正常细胞圼現出 HLA/TR A複合物。此非常容易测定*此技蕤如鑑定圼現特 殊HLA分子细胞的方法一般，以及鑑定内含所指表現DNA 序列的细胞。一但分離後*此種细胞可與病人不正常细胞 檢體來測定活髅外溶解作用，假若發現溶解作用*則在此 一治療法使用專一性CTLs可減輕與不正常细胞相闞的症狀 。利用標準檢定法來測定不正常妞胞中HLA之表現以及如 利用PCR經增殖作用來測定表現是較少使用的方法。 根據本發明收養轉移（Adoptive transfer)不是唯一可 用的治療型式。利用一些方法亦可激發活體内的CTLs。例 如使用能表現該複合物的不具增生性之细胞，此方法已在 前文詳綑說明。在此方法中所使用的细胞可K是正常表規 該複合物的细胞•如經放射線處理過的黑色素细胞瘤细胞 或是用一種或兩種展現該複合物所需之基因轉殖過的细胞 。陳（Chen)等人；PNAS USA 88 : 110-114 (1991年 1月）文 中例證此方法•該方法是將表規HPVE7胜肽的轉殖细胞利 用於治療過程中。可Μ使用不同的细胞型式*同理，可使 用帶有一種或兩種有興趣之基因的載髏。病毒性或细菌性 載體是特別佳的。在這些糸統中，可用如痘病毒 (Vaccinia virus)或细菌BCG，並將該物質實際上”感染” 宿主细胞，而细胞因而產生有興趣的複合物*並可被自體 CTLs所辨識，而後CTU增生。腫瘤排斥抗原或其前趨物與 一種佐第結合後可加速併入至存有有興趣HL A分子之 HU-A2展現细胞中，此可達到相似的效果。TRAP經處理後 ! n ~^ —裝 訂*~ - 線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -17-_ 本紙3L尺度通用中國國家標準（CNS > Λ4規格（210X297公釐 1 83. 3.10,000 Α79 月）Β7

五：發明説明（/ί) 產生HU分子的胜狀偁合髑，而TR Α卻不需進一步的南理 過程。 本發明的其它方面有技術的技術員均已清楚不需在此重 覆之。 所闬的'名詞及說明是用K敘述不是限制本文，而這些名 詞及說明不是用來排除任何有闞的顯示特徵及敘述或其部 分，並且注意的是各種修飾均可包含在本發明的範圍中。 序列表 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榇準局貝工消費合作社印製 ATG CGA AGA GAA GAT GCT Met Pro Arg Glu Asp. 5 Ala GAC GGC CAC TCT TAC ACC His Gly His Ser 20 Tyr Thr CTG ACA GTG ATC CTG GGA Leu Thr Val 35 lie Leu Gly AGA AGA CGA AAT GGA TAC Arg Arg 50 Arg Asn Gly Tyr GGC ACT CAA TGT GCC TTA Gly 65 Thr Gin Cys Ala Leu 70 CAT CGG GAC AGC AAA GTG His Arg Asp Ser Lys 85 Val GTT ccc AAT GCT CCA CCT Val Pro Asn Ala 100 Pro pro CCA CCA CCT TAT TCA CCT Pro Pro Pro 115 Tyr Ser Pro 55 40 10 25 75 GTG TCT CTT CAA GAG •r Leu Gin Glu 90 T TAT GAG AAA a Tyr Glu Lys 105 鑑別序列第1號 60 CTC TCT CCC AAG AAG GGG 43 Pro Lys Lys IS Gly GGG ATC GGC ATC 96 Gly lie 30 Gly lie TGT TGG TAT TGT 144 Cys 45 Trp Tyr Cys AGT CTT CAT GTT 192 Ser Leu His Val GAA GGG TTT GAT 240 Glu Gly Phe Asp 80 TGT GAA CCT GTG 288 Cys Glu Ore 95 Val GCA GAA CAG TCA 336 Als GlU Gin Ser 110 354 ,1Τ

-IS 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } Α4规格（210Χ297公釐） 第83106543號專利φ請茱 Ρ 修 Ε 頁（86年 9 月 五、發明説明（⑴k修正 -補克 TCTTCATACA CGCGGCCAGC CAGCAGACAG AGGACTCTCA TTAAGGAAGG TGTCCTGTGC 60 CCTGACCCTA CAAGATGCCA AGAGAAGATG CTCACTTCAT CTATGGTTAC CCCAAGAAGG 120 GGCACGGCCA CTCTTACACC ACGGCTGAAC AGGCCGCTGG GATCGGCATC CTGACAGTGA 180 TCCTGGGAGT CTTACTGCTC ATCGGCTGTT GGTATTGTAG AAGACGAAAT GGATACAGAG 240 CCTTGATGGA TAAAAGTCTT CATGTTGGCA CTCAATGTGC CTTAACAAGA AGATGCCCAC 300 AAGAAGGGTT TGATCATCGG GACAGCAAAG TGTCTCTTCA AGAGAAAAAC TGTGAACCTG 360 TGGTTCCCAA TGCTGCAGGT GCTTATGAGA AACTCTCTGC AGAACAGTCA GGACCACCTT 420丨 ATTCACCTTA AGAGCCAGCG AGACACCTGA GACATGGCTG AAATTATTTC TCTCACACTT 480 TTGCTTGAAT TTAATACAGA CATCTAATGT TCTCCTTTGG AATCCTGTAG GAAAAATGCA 540 AGCCATCTCT AATAATAAGT CAGTGTTAAA ATTTTAGTAG GTCCGCTAGC AGTACTAATC 600| 1 ATGTGAGGAA ATGATGAGAA ATATTAAATT GGGAAAACTC CATCAATAAA TGTTGCAAAT 660 GCATAGTAAA AAAAAA 1 676 ' ________I— j_____ Γ VK^^i. ml nn tm —^nfl I —an 巧-# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 鑑別序列第2號 ' 18a - 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 第83106543¾專$申@案 園修正 本（90年3月) ABCD

   二·種分離之核酸分子•其摁碼或完全互補於腫瘤排斥抗 原前驅物之核酸分子•該腫描排斥抗原前驅物可經處理 形成由HLA-A2分子表現的腫掴排斥抗原·其中該膣溷排 斥抗原萷驅物具有鑑別序列第1號所述之胺基酸序列 ATG CGA AGA Met Pro Arg GAT GCT CAC TTC ATC TM GGT TAC CCC AAG AAG Glu Asp Ala His Phe lie Tyr Gly Tyr Pro Lys Lys Gly 5 10 15 TCT TAC ACC ACG GCT ΟΆΑ GAG Glu GCC GCT GGG Gly ATC GGC ATC Ser Tyr Thr Thr Ala Glu Ala Ala lie Gly lie 20 25 30 ATC CTG GGA GTC TTA CTG CTC ATC GGC TGT TGG TAT TGT He Leu Gly Val Leu Leu leu lie Gly Cys Trp Tyr Cys 45 48 96 144 35 AGA AGA CGA AAT GGA TAC AGA GCC TTG ATG GAT AAA AGT CTT CAT GTT Arg Arg Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met Asp Lys Ser Leu His Val " 60 CCA CAA GAA GGG TTT GAT Pro Gin Glu Gly Phe Asp 75 80 AAA AAC TGT GAA CCT GTG Lys Asn Cys Glu Pro Val 95 GTT CCC AAT GCT CCA CCT GCT TAT GAG AAA CTC TCT GCA GAA CAG TCA Val Pro Asn Ala Pro pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ser Ala Glu Gin Ser 100 105 HO CCA CCA CCT TAT TCA CCT Pro Pro Pro Tyr Ser Pro 115 50 55 GGC Gly 65 ACT Thr CAA Gin TGT Cys GCC Ala TTA Leu 70 ACA Thr AGA Arg AGA Arg TGC Cys CAT His CGG Arg GAC Asp AGC Ser AAA Lys 85 GTG Val TCT Ser CTT Leu CAA Gin GAG Glu 90 192 240 288 336 354 -- ---- ----I ----11- ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消费合作社印策 a 4‘ 根據申請專利範圃第i項的分雛之核酸分子，其中該核 酸分子煽碼該臞瘤排斥抗原前驅物。 根據申請専利範圍第2項的分離之核酸分子，其中該核 酸分子是DNA » 根據申請專利範国第3項的分齄之核酸分子，其中該核 本紙張尺度逍用中國國家梯準（CNS ) A4規格（210X297公漦) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 A8^ 442568 ll D8々、申請專利範圍 酸分子是cDHA。 & 根據申請専利範困第4項的分雄之核酸分子，其係為申 謓專利範圍第1項所述之核普酸序列或其簡併序列。 & 一種活體外鑑定K表現腫》排斥抗原前驅物為特徵之病 症之方法，該腫瘤排斥抗原前驅物烴鹿理後成腫瘤排斥 抗原而形成與HL A-A2分子之複合物•其步驟包括將病人 檢體與專一於該複合物之試劑接觸K及測定該複合物與 該試劑之間的相互作用而用來澜定該疾病。 7. 一種活體外鑑定Μ表現腫瘤排斥抗原前驅物為特徵之病 症之方法·該腫瘤排斥前驅物係繾碼具有鑑別序列第1 號中揭示之序列的核酸分子成其簡併序列*其步驟包括 將病人檢賭與專一於該序列或其表現產物的抗原接觸以 及澍定該試劑與該序列或該表琨產物之間的相互作用而 用來測定該疾病。 a —種分離之蛋白質，其係由根據申請専利範画第2項的 核酸分子所编碼。 In n^i ^^^1 ^^^1 n^f -> mj-ai {請先聞讀背面之注意事磺再填寫本頁) 本紙張尺度逍用中BH家#準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐）