JPH07327678A - α２，８ シアリルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列表配列番号１の塩基配列の 149番目のＡ
から1171番目のＣまでの塩基配列と相同性を有する塩基
配列を含むcDNA。α2,8 シアリルトランスフェラーゼを
コードする。 【効果】 純粋なα2,8 シアリルトランスフェラーゼを
工業的に多量生産することができ、生化学試薬等の調製
に有用である。また、本発明のcDNAを用いたノーザンブ
ロット法により、簡便で高感度な腫瘍抗原の検出が期待
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α2,8 シアリルトラン
スフェラーゼ(GD3合成酵素、α2,8 シアル酸転移酵素)
[EC2.4.99.8] をコードするcDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】シアル酸を含む糖脂質や糖蛋白質は中枢
神経系に高濃度存在することが見出されている。これら
複合糖質のシアル酸含有糖鎖は発生、分化、がん化にと
もなって顕著に変化し、糖鎖のシアリル化がこれらの生
物学的現象に深く関わっていることが示唆されてきた。
シアル酸を含む糖脂質であるガングリオシドは微生物産
生毒素やウイルスの受容体さらに細胞表面抗原として働
くことが知られている。特に、α2,8 シアリル結合を糖
鎖部分に有するGD3 ガングリオシドが細胞接着、がん細
胞の増殖、腎臓の発生期における細胞間相互作用にきわ
めて重要であることが報告されてきた。このようなα2,
8 シアリル結合の生物学的関与に関して多くの知見があ
るが、その発現および調節機構に関しては不明であっ
た。この疑問を解決するためにはα2,8 シアリル結合を
生成する遺伝子をクローン化することが必須であると考
えられてきた。

【０００３】複合糖質糖鎖は細胞内ゴルジ装置膜で一連
の糖転移酵素の働きにより合成される。哺乳動物におい
ては、シアル酸を糖鎖に付加するシアル酸転移酵素 (シ
アリルトランスフェラーゼ) に関してこれまで１２種類
の基質特異性の異なる酵素が想定されている。現在ま
で、５種類の異なるシアリルトランスフェラーゼがクロ
ーン化されているが、α2,8 シアリル結合を生成するシ
アリルトランスフェラーゼの遺伝子は未だ単離されてい
ない(Livingston, B.D. ら，J.Biol.Chem., 268,11504-
11507(1993); Wen, D.X.ら，J.Biol.Chem., 267, 21011
-21019(1992); Sasaki, K.ら，J.Biol.Chem., 268, 227
82-22787(1993); Gillespie, W. ら，J.Biol.Chem., 26
7, 21004-21010(1992); Lee, Y.C. ら, Eur.J.Bioche
m., 216, 377-385(1993); Grundmann, U. ら，Nuc.Acid
s Res., 18, 667(1990); Weinstein,J.ら，J.Biol.Che
m., 262, 17735-17743(1987)) 。したがって、α2,8 シ
アリル結合を生成するシアリルトランスフェラーゼをコ
ードするcDNAを単離することは、生体内で細胞間相互作
用にかかわると考えられているポリシアル酸の役割を明
らかにするために急務である。さらに単離した遺伝子を
発現ベクターに組み換え、酵素蛋白の活性標品が大量に
得られれば、これまで極めて困難であったポリシアロ糖
鎖の合成技術の開発の糸口になる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
見地からなされたものであって、その課題はα2,8 シア
リルトランスフェラーゼをコードするcDNAを得ようとす
るものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】GD3 ガングリオシド（以
下、GD3 という) は、ガングリオシド生合成経路におけ
るα2,8 シアリル結合を有する最初の糖脂質である。α
2,8 シアリルトランスフェラーゼはGM3 ガングリオシド
（以下、GM3 という) の末端シアル酸の８位の水酸基に
シアル酸を付加する反応を触媒する。そこでこのGD3 を
合成するα2,8シアリルトランスフェラーゼのcDNAを単
離するために、GM3 を細胞表面上に高発現し、さらに一
過性発現に適したポリオーマラージＴ抗原を発現するチ
ャイニーズハムスター卵巣に由来する細胞(CHOP)を宿主
細胞として用いて、α2,8 シアリルトランスフェラーゼ
の発現クローニング法を実施した。GD3 はヒトメラノー
マに大量に存在することが知られており、GD3 を合成す
るα2,8 シアリルトランスフェラーゼの活性が高いこと
が知られている。そこでヒトメラノーマmRNAから調製し
たcDNAライブラリーよりGD3発現に関与する遺伝子をコ
ードするcDNAを得た。この単離したcDNAを発現させた細
胞のガングリオシドの解析と、シアリルトランスフェラ
ーゼ活性の解析の結果より、単離したcDNAはGD3 を合成
するα2,8 シアリルトランスフェラーゼをコードするこ
とがわかった。本発明をさらに詳細に説明する。

【０００６】本発明者等は、前記した課題を達成するた
めに、高いα2,8 シアリルトランスフェラーゼ活性をも
つヒトメラノーマから、発現クローニング法の手法を用
いてα2,8 シアリルトランスフェラーゼのcDNAを単離し
てその一次構造を解析した。そして、この単離したcDNA
をCHOP細胞中に組み込んで発現させ、このcDNAがGD3を
合成するα2,8 シアリルトランスフェラーゼをコードに
していることを確認した。

【０００７】本発明は上記cDNAによってコードされる、
α2,8 シアリルトランスフェラーゼに関する。すなわ
ち、本発明は、配列表配列番号1(図1)に示すように、１
番目のメチオニンから341 番目のセリンまでの341 のア
ミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列を含む配列を
コードするcDNAに関する。また、本発明は配列表配列番
号1(図1)に示すように 149番目のアデニンから1171番目
のシトシンまでの1023の塩基配列と相同性を有する塩基
配列を含むcDNAに関する。本発明のcDNAはα2,8 シアリ
ルトランスフェラーゼをコードしている。本発明におい
てアミノ酸配列において相同性を有するとは、α2,8 シ
アリルトランスフェラーゼが由来する生物種が相違して
も同一機能を有する酵素においては一定の割合のアミノ
酸配列が維持され、共通性を有していることを意味す
る。例えば、 Galβ1,4GlcNAc α2,6 シアリルトランス
フェラーゼでは、ラット肝臓由来の酵素とヒト顎下腺お
よび胎盤からの酵素のアミノ酸配列は、それぞれ86％お
よび87.6％の相同性を有している。また、 Galβ1,3Gal
NAc α2,3 シアリルトランスフェラーゼでは、ブタとマ
ウスとの間でアミノ酸配列に約80％の相同性がある。し
たがって、本発明のα2,8 シアリルトランスフェラーゼ
も、種間におけるアミノ酸配列の相同性は約75〜80％以
上と想定される。また、上記α2,8 シアリルトランスフ
ェラーゼをコードするcDNAのうちで最も好ましいものは
配列表配列番号1(図1)に示されるcDNAである。

【０００８】本発明のcDNAは次の手法によって作成さ
れ、α2,8 シアリルトランスフェラーゼの発現が確認さ
れた。まず、高いGD3 活性をもつヒトメラノーマ SK-Me
l-28細胞(ATCC HTB72)よりmRNAを調製し、逆転写酵素を
用いてcDNAを合成する。これを真核細胞発現ベクターの
pCEV18に組み込んでcDNAライブラリーを作製する。一
方、CHO 細胞は、GM3 を発現し、GD3 を発現しない性質
を有する。本発明ではこの性質に着目し、CHO 細胞にポ
リオーマウイルスのラージＴ抗原を発現させてCHOP細胞
(Heffernan, M. and Dennis, J.W., Nuc. Acids Res.,
19, 85-92(1991) を作製し、このCHOP細胞を用いてエレ
クトロポレーション法により前記cDNAライブラリーのDN
A をトランスフェクションする。このようにしてトラン
スフェクションされたCHOP細胞を、抗GD3 モノクローナ
ル抗体 R24 [ハイブリドーマ(ATCC HB8445) が産生する
モノクローナル抗体][Cancer Res. 49, 191-196(1989)]
と、フルオレスセインイソチオシアネート(FITC)標識抗
イムノグロブリン抗体（２次抗体）とを用いてその表面
を染色し、セルソーターでGD3 陽性細胞だけを選別し、
これからプラスミドDNA を抽出する。このDNA で大腸菌
DH10B(ギブコ社製) を形質転換し、トランスフェクショ
ンと選択とを数回くり返し、GD3 陽性のコロニーのなか
からさらにGD3 発現活性で選別し、単一のクローン、pC
EVh2,8STを単離する。このクローンをCHOP細胞に一過性
に発現させて抗GD3 抗体を用いて解析したところ、この
pCEVh2,8STは細胞表面上でGD3 を発現していることが判
明した。このpCEVh 2,8ST はアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(ATCC)に寄託を申請し受理された
（受理日1994年６月１日)(受託番号未定）。

【０００９】本発明では、このpCEVh2,8STをダイデオキ
シチェーンターミネーション法で解析したところ配列表
配列番号１に示されるようなcDNA配列を有していること
が判明した。特に、1.7Kb のcDNAインサートを含んでお
り、ここでは 341個のアミノ酸からなるタンパク質がコ
ードされている。そして、Ｎ末端側13番目から34番目の
アミノ酸領域に疎水性膜貫通ドメインがあり、Ｎ−グリ
コシレーションサイトと想定されるAsn-X-Thr(式中 Xは
任意のＬ−アミノ酸で表わされる配列）が２ケ所存在す
ることが判明した（図１＊参照）。また、アミノ酸配列
の判明しているα2,3 シアリルトランスフェラーゼ及び
α2,6 シアリルトランスフェラーゼと対比したところ図
３に示すようなシアリルモチーフと呼ばれる相同アミノ
酸配列が存在することが判明した。

【００１０】さらに、本発明では、このpCEVh2.8STを導
入したCHOP細胞をホモジナイズし、α2,8 シアリルトラ
ンスフェラーゼ活性を測定して、この細胞が高いα2,8
シアリルトランスフェラーゼ活性を発現していることを
確認した。また、前記pCEVh2,8ST導入CHOP細胞からガン
グリオシドを抽出したところ、CHOP細胞に本来存在して
いたGM3 に加えて、本来存在していなかったGD3 が合成
されていることが確認された。これらのことからpCEVh
2,8STに含まれるcDNAインサートはα2,8 シアリルトラ
ンスフェラーゼをコードしていることが確認された。

【００１１】また、ヒトメラノーマSK-Mel-28 細胞およ
びCHOP細胞から、mRNAを調製し、³²P でラベルしたpCEV
h2,8STの BstXI断片(1.7kb) をプローブとしてノーザン
ブロットを行ったところ、ヒトメラノーマSK-Mel-28 細
胞において2.4kb のバンドが１本検出された。しかし、
CHOP細胞ではα2,8 シアリルトランスフェラーゼのmRNA
は発現していないことが示された。以上のことから、本
発明における前記cDNAはα2,8 シアリルトランスフェラ
ーゼの遺伝子であることが分る。

【００１２】次ぎに本発明を実施例をあげて具体的に証
明する。 1.発現ライブラリーの構築 ヒトメラノーマSK-Mel-28(ATCC HTB72) よりpoly(A)+RN
Aを単離し、逆転写酵素を用いてOligo(dT)-primed cDNA
を合成した。BstXI アダプター (インビトロジェン社
製) を付加した後、1kb以上のcDNAを分画し、pCEV4 発
現ベクターに由来する発現ベクターpCEV18に組み込んで
約３×10⁶ 個よりなるcDNAライブラリーを作成した。

【００１３】2.ヒトα2,8 シアル酸転移酵素cDNAクロー
ンの単離 12サンプルのCHOP細胞 (各サンプル 3×10⁶ 個のCHOP細
胞を含む) に、上記のcDNAライブラリーのプラスミドDN
A 30μg を、ヘペス(HEPES) 緩衝液[20mM ヘペス(pH7.0
5),137mM NaCl, 5mM KCl,0.7mM Na₂HPO₄, 6mM デキスト
ロース] に溶解し、エレクトロポレーション法により40
0 ボルト、980 μFDでトランスフェクションした。トラ
ンスフェクションの３日後に、抗GD3 モノクローナル抗
体R24(ハイブリドーマ(ATCC HB8445) によって産生され
る）とフルオレスセインイソチオシアネート(FITC)標識
ウサギ抗マウスIgG/IgA/IgM 抗体 (ザイメッド社製) を
用いた間接蛍光抗体染色を行った。GD3 陽性細胞をセル
ソーター [FACStarPlus(ベクトン・ディッキンソン社
製] により選別した。選別したGD3 陽性細胞からプラス
ミドDNA を抽出し、エレクトロポレーション法にて大腸
菌DH10B(ギブコ社製）を形質転換した。トランスフェク
ションとアンピシリンによる選別とを２回繰り返した
後、陽性のコロニー群を、マイクロプレート９６穴当た
り４コロニーの割合で小分けした。それぞれのサブプー
ルについてさらにGD3 発現活性にて選別し、単一のクロ
ーン(pCEVh2,8ST)を得た。このpCEVh2,8STをCHOP細胞に
一過性に発現させて上記と同様に抗GD3 抗体によるフロ
ーサイトメトリー解析を行った。その結果を図2 に示し
た。図2Aに示すようにCHOP細胞にpCEV18をトランスフェ
クションした場合は、GD3 の発現は認められなかった
が、図2Bに示すようにCHOP細胞にpCEVh2,8STをトランス
フェクションした場合はGD3 の発現が認められた。この
結果、pCEVh2,8STはCHOP細胞表面上でのGD3の発現を決
定することがわかった。

【００１４】3.ＤＮＡ塩基配列の決定とノーザンブロッ
ト解析 pCEVh2,8STの二重鎖DNA 塩基配列を、オートサイクル
シークエンシング キット（ファルマシア社製）と、フ
ァルマシア A.L.F. DNA シークエンサー（ファルマシア
製）を用いた、ダイデオキシチェーンターミネーション
法により決定した。その結果を図１に示す。図に示すよ
うに、pCEVh2,8STは1.7kb のcDNAインサートを有し、14
9 番目の塩基を翻訳開始点とする 341アミノ酸からなる
蛋白質（分子量38,858 Da ）をコードすることがわかっ
た。ハイドロパチー解析の結果、Ｎ末端13番目から34番
目のアミノ酸の領域に膜貫通領域が存在する典型的な２
型膜蛋白質であることが判明した。さらに、N-グリコシ
レーションサイトにコンセンサスな配列が２つ存在する
ことが示された。この配列をGenBank に登録されている
遺伝子データベースで検索した結果、高度に相同性を示
す配列は認められなかった。今日までクローン化されて
いる他の種類のシアリルトランフェラーゼとアミノ酸配
列の比較を行った。その結果、従来知られている７種の
シアリルトランスフェラーゼ（前述のとおり、酵素とし
ては５種類が知られているが、生物種の違いを含めて現
在クローン化されている酵素は７種類)(図３参照) と17
-30%の相同性を示すのみであった。しかしながら、図３
に示すようにシアリルトランスフェラーゼ蛋白質の配列
の中央部およびC-末端側領域に存在するシアリルトラン
スフェラーゼ相同領域、シアリルモチーフについては高
い相同性が認められた（図３）。したがって、pCEVh2,8
STはシアリルトランスフェラーゼファミリーに属すると
考えられた。

【００１５】4. pCEVh2,8ST 発現細胞のGD3合成酵素活
性 GD3 合成酵素活性を次の方法で測定した。3mM CMP-［¹⁴
C ］-Neu Ac (5×10⁴cpm) 、0.3mM GM3 、0.4%(w/v) Tr
iton CF-54, 10mM MgCl₂, 100mM カコジル酸ナトリウム
(pH6.5) 、150 μg 細胞蛋白質(pCEVh2,8ST をトランス
フェクトしたCHOP細胞をホモジナイズしたもの) 、1mM
2,3-デヒドロ -2-デオキシ-N- アセチルノイラミン酸
(2,3-dehydro-2-deoxy-NeuAc)(シアリダーゼ阻害剤)(ベ
ーリンガー・マンハイム社製) を含む20μl 反応液を用
いた。この混合物を37℃で30分間インキュベートした
後、10μl のメタノールを加えて反応を停止した。反応
液 8μl をC18 逆相系薄相クロマトグラフィープレート
(RP-18W HPTLC プレート)(メルク社製）にかけ、水で10
分間展開した。放射能標識反応産物を原点からかきと
り、GD3 をクロロホルム- メタノール(1:1, v/v) 300μ
l にて抽出回収した。抽出物を乾固後、シリカゲル薄相
クロマトグラフィー 60HPTLCプレート（メルク社製) に
供した。クロロホルム- メタノール-0.5%(w/v)CaCl₂ 水
溶液(55:45:10, v/v/v) にて展開後オルシノール硫酸に
て発色するとともに、ガングリオシドに取り込まれた放
射活性をフジックスBAS2000 バイオ・イメージング・ア
ナライザー [富士写真フイルム (株)]にて測定した。そ
の結果、図4Bレーン2 に示すように、¹⁴C が取り込まれ
たGD3 が検出されたことから、α2,8 シアリルトランス
フェラーゼ活性がpCEVh2,8ST発現細胞に検出された。

【００１６】5. pCEVh2,8ST発現細胞のガングリオシド
の単離と解析 上記細胞を0.05％EDTAを含むPBS を用いて培地から取り
出し、PBS で２回洗滌し遠心分離してペレットとした。
このペレットとした細胞を１０倍量のクロロホルム- メ
タノール(1:1, v/v)で２回抽出し、抽出液を合わせ、蒸
発乾固させた。この残渣をクロロホルム−メタノール−
水(30:60:8,v/v/v)(溶液A)に溶解し、DEAE-Sephadex A-
25カラムクロマトグラフィー (アセテート型) にて精製
した。カラムを５倍量の溶液Ａで洗滌し、ガングリオシ
ドをクロロホルム−メタノール−0.8M酢酸ナトリウム水
溶液(30:60:8, v/v/v)10容量で溶出した。この溶出液を
乾固し、水に溶解し、これを、C18 逆相系カラムにて脱
塩後、クロロホルム−メタノール−0.5 ％ CaCl₂水溶液
(55:45:10,v/v/v)を展開溶媒として用いた薄層クロマト
グラフィーを行って展開し、100 ℃でオルシノール−硫
酸法によって発色させた（図5A参照）。薄層クロマトグ
ラフィー免疫染色を従来の方法(Anal.Biochem.109, 399
-402(1980), J.Biochem.95 , 1517-1529) を僅かに変え
て実施した。ガングリオシドをプラスチック薄層クロマ
トグラフィープレート Polygram Sil G.（マーシュレー
・ナーゲル社製) 上に展開させた。このプレートを減圧
乾燥し、鶏卵アルブミン１％含有PBS に30分間浸漬し、
その後抗GD3 モノクローナル抗体R24 と２時間インキュ
ベートした。このプレートを0.05％(w/v)Tween20を含有
するPBS で洗滌し、ホースラデッシュペルオキシダーゼ
標識抗マウスイムノグロブリン抗体（生化学工業（株）
製）と２時間インキュベートした。最後に、このプレー
トを0.6mg/ml 4- クロロ-1- ナフトール、0.01％H₂O₂、
200mM NaCl、100mM トリス／塩酸緩衝液(pH7.4) で染色
してGD3 を検出した。この結果を図5Bに示した。図5Bに
示されるように、GD3 がpCEVh2,8ST発現細胞で検出され
た。

【００１７】ヒトメラノーマSK-Mel-28(ATCC HTB72) よ
り単離した全RNA 20μg およびpoly(A) ⁺ RNA 2 μg を
それぞれ常法によりホルムアルデヒド/ アガロースゲル
で電気泳動し、ニトロセルロース膜へRNA を転写した。
このRNA が転写されたニトロセルロース膜を、³²P でラ
ベルした前記pCEVh 2,8ST のBstXI 断片(1.7kb) と共に
50％(v/v) ホルムアミド、5 X Denhardt's solution, 2
％(W/V)SDS, 5 X SSPE〔1 X SSPEは10mM NaH₂PO₄, 150m
M NaCl, 1mM EDTA, (pH 7.4)〕中で反応させた。その
後、このニトロセルロース膜を0.1 ％(W/V)SDSを含む 2
X SSC〔30mMクエン酸ナトリウム、300mM NaCl, (pH 7.
0)〕により室温で３回洗浄し、さらに0.1％(W/V)SDSを
含む 1 X SSCにより、68℃で２回洗浄した。³²P でラベ
ルした前記 pCEVh 2,8STのBstXI 断片に反応したRNA の
バンドは、フジックスBAS2000 バイオ・イメージング・
アナライザー [富士写真フイルム (株)]により検出し
た。その結果、図4A レーン2 に示すように、ヒトメラ
ノーマSK-Mel-28細胞には2.4kbpの単一のmRNAが検出さ
れた。

【００１８】

【発明の効果】本発明のα2,8 シアリルトランスフェラ
ーゼはGM3 を基質にするｂ系列への分岐酵素でありGD3
を生成する。GD3 は細胞の癌化、特にヒトメラノーマま
たは、ラット線維芽細胞への発癌遺伝子導入によって発
現することが知られている。メラノーマ化によるα2,8
シアリルトランスフェラーゼ活性の増大、抗GD3 抗体に
よる発生期の上皮細胞と間葉細胞の接着阻害、あるいは
メラノーマの増殖阻害といった現象はα2,8 シアリルト
ランスフェラーゼの哺乳動物細胞における生物学的重要
性を示す。また、胎生期のラット脳でもGD3 は高濃度に
発現しているが、生後、α2,8 シアリルトランスフェラ
ーゼ活性の減少にともない、急激に消長する。α2,8 シ
アリルトランスフェラーゼは脳神経系の分化と成熟にお
いても重要な機能を果たしていると考えられる。本発明
のcDNAを用いたノーザンブロット法により、簡便で微量
な酵素活性の測定が可能となり、癌診断、発生、細胞接
着、神経疾患の診断等の分野に応用可能である。また、
in situ ハイブリダイゼイション法により、細胞レベル
あるいは組織レベルでの本発明の酵素の発現の解析が可
能となり、神経機能の解明において有効である。一方、
自然界の動物はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧ
ｃ）を含むガングリオシド由来の異好性抗原Ｈ−Ｄ抗原
(Hanganutziu-Deicher抗原) を発現する種と、ヒトを含
む発現しない種に分類される。Ｈ−Ｄ抗原発現の生物学
的意義は不明であるが、ヒトの大腸癌に発現しているこ
とが知られており、腫瘍抗原的作用もすると考えられて
いる。GD3 にはNeuAc とNeuGc の異性体が存在すること
が知られているが、分離単離することは困難である。本
発明のα2,8 シアリルトランスフェラーゼはCMP-NeuGc
もドナー基質として利用できるので、GD3 のNeuGc 異性
体の酵素合成も可能になる。従って、本発明のα2,8 シ
アリルトランスフェラーゼをコードするcDNAを用いるこ
とによって、GD3 の酵素合成が可能となり、このcDNAは
生化学用試薬として用いることができる。また、放射性
同位元素をラベルしたラベル体を作製して腫瘍抗原の検
出に用いることができる。さらに、神経疾患の診断にも
用いることができる。

【００１９】

【配列表】

配列番号 ：1 配列の長さ：1704 配列の型 ：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起 源 ：ヒトメラノーマ細胞株SK-Mel-28 配列の特徴：149-1171 CDS 配列 10 20 30 40 GGTGTGTGTGCATGGGGGGCTGGCGGTGGGGGACCCTCCGCTGCC 50 60 70 80 90 ACTTCGCCTAGCTTTGTGCTGAGGCCCCGGCCCCCGCCCCTGGGA 100 110 120 130 CGCCGGGGCTGCGATGAGCCCCTGCGGGCGGGCCCGGCGACAAAC 140 150 160 170 180 GTCCAGAGGGGCCATGGCTGTACTGGCGTGGAAGTTCCCGCGGAC MetAlaValLeuAlaTrpLysPheProArgThr 1 5 10 190 200 210 220 CCGGCTGCCCATGGGAGCCAGTGCCCTCTGTGTCGTGGTCCTCTG ArgLeuProMetGlyAlaSerAlaLeuCysValValValLeuCys 15 20 25 230 240 250 260 270 TTGGCTCTACATCTTCCCCGTCTACCGGCTGCCCAACGAGAAAGA TrpLeuTyrIlePheProValTyrArgLeuProAsnGluLysGlu 30 35 40 280 290 300 310 GATCGTGCAGGGGGTGCTGCAACAGGGCACGGCGTGGAGGAGGAA IleValGlnGlyValLeuGlnGlnGlyThrAlaTrpArgArgAsn 45 50 55 320 330 340 350 360 CCAGACCGCGGCCAGAGCGTTCAGGAAACAAATGGAAGACTGCTG GlnThrAlaAlaArgAlaPheArgLysGlnMetGluAspCysCys 60 65 70 370 380 390 400 CGACCCTGCCCATCTCTTTGCTATGACTAAAATGAATTCCCCTAT AspProAlaHisLeuPheAlaMetThrLysMetAsnSerProMet 75 80 85 410 420 430 440 450 GGGGAAGAGCATGTGGTATGACGGGGAGTTTTTATACTCATTCAC GlyLysSerMetTrpTyrAspGlyGluPheLeuTyrSerPheThr 90 95 100 460 470 480 490 CATTGACAATTCAACTTACTCTCTCTTCCCACAGGCAACCCCATT IleAspAsnSerThrTyrSerLeuPheProGlnAlaThrProPhe 105 110 115 500 510 520 530 540 CCAGCTGCCATTGAAGAAATGCGCGGTGGTGGGAAATGGTGGGAT GlnLeuProLeuLysLysCysAlaValValGlyAsnGlyGlyIle 120 125 130 550 560 570 580 TCTGAAGAAGAGTGGCTGTGGCCGTCAAATAGATGAAGCAAATTT LeuLysLysSerGlyCysGlyArgGlnIleAspGluAlaAsnPhe 135 140 145 590 600 610 620 630 TGTCATGCGATGCAATCTCCCTCCTTTGTCAAGTGAATACACTAA ValMetArgCysAsnLeuProProLeuSerSerGluTyrThrLys 150 155 160 640 650 660 670 GGATGTTGGATCCAAAAGTCAGTTAGTGACAGCTAATCCCAGCAT AspValGlySerLysSerGlnLeuValThrAlaAsnProSerIle 165 170 175 680 690 700 710 720 AATTCGGCAAAGGTTTCAGAACCTTCTGTGGTCCAGAAAGACATT IleArgGlnArgPheGlnAsnLeuLeuTrpSerArgLysThrPhe 180 185 190 730 740 750 760 ValAspAsnMetLysIleTyrAsnHisSerTyrIleTyrMetPro 195 200 205 770 780 790 800 810 TGCCTTTTCTATGAAGACAGGAACAGAGCCATCTTTGAGGGTTTA AlaPheSerMetLysThrGlyThrGluProSerLeuArgValTyr 210 215 220 820 830 840 850 TTATACACTGTCAGATGTTGGTGCCAATCAAACAGTGCTGTTTGC TyrThrLeuSerAspValGlyAlaAsnGlnThrValLeuPheAla 225 230 235 860 870 880 890 900 CAACCCCAACTTTCTGCGTAGCATTGGAAAGTTCTGGAAAAGTAG AsnProAsnPheLeuArgSerIleGlyLysPheTrpLysSerArg 240 245 250 910 920 930 940 AGGAATCCATGCCAAGCGCCTGTCCACAGGACTTTTTCTGGTGAG GlyIleHisAlaLysArgLeuSerThrGlyLeuPheLeuValSer 255 260 265 950 960 970 980 990 CGCAGCTCTGGGTCTCTGTGAAGAGGTGGCCATCTATGGCTTCTG AlaAlaLeuGlyLeuCysGluGluValAlaIleTyrGlyPheTrp 270 275 280 1000 1010 1020 1030 GCCCTTCTCTGTGAATATGCATGAGCAGCCCATCAGCCACCACTA ProPheSerValAsnMetHisGluGlnProIleSerHisHisTyr 285 290 295 1040 1050 1060 1070 1080 CTATGACAACGTCTTACCCTTTTCTGGCTTCCATGCCATGCCCGA TyrAspAsnValLeuProPheSerGlyPheHisAlaMetProGlu 300 305 310 1090 1100 1110 1120 GGAATTTCTCCAACTCTGGTATCTTCATAAAATCGGTGCACTGAG GluPheLeuGlnLeuTrpTyrLeuHisLysIleGlyAlaLeuArg 315 320 325 1130 1140 1150 1160 1170 AATGCAGCTGGACCCATGTGAAGATACCTCACTCCAGCCCACTTC MetGlnLeuAspProCysGluAspThrSerLeuGlnProThrSer 330 335 340 1180 1190 1200 1210 CTAGGAACAATGGAAGAAGAAAGGACTGAACCAGGGTATTTTTGT 1220 1230 1240 1250 1260 TAGGTTTTCTATGTGACTCCAAGAGGGAATGGTCAAGTTGTTTCA 1270 1280 1290 1300 TGAGTTTGCATGGGCCCTTGGAAAAACAGGAAAGGAGCAATGAAG 1310 1320 1330 1340 1350 ATCCAAGCAAAACTTTACTTTCAGCGTTGGCTTGGAGGACAAATA 1360 1370 1380 1390 AGAAATGAAACATCCTATGAAATACTTTATAGCACATGGCAGATT 1400 1410 1420 1430 1440 TGCAACTAGTAAAATGCTGGTGAAATGCTGTTGGTAAAGCACATG 1450 1460 1470 1480 GTTCAAATCTAGAAGATGCAGTTCAAAAACAAGACAGACTCGAGT 1490 1500 1510 1520 1530 TGTTAGGGCTGAGGAACCAATCAAGGTAGAACAAAGAAAATGTTG 1540 1550 1560 1570 GGGTAAAAGTGTTGCTGATTGTCAACACAAACTGGCTTAATAATA 1580 1590 1600 1610 1620 TTAATAAGAACCTGTCTTATTAAGACTGGCTTTAGAACCGTAGGT 1630 1640 1650 1660 TTTTTTAAAAAATTATTATTTATTTTTGCCCTCTTTGGGGAAGTG 1670 1680 1690 1700 1710 GGTGGGTAGATTTAAAAAATCCCTTCCTGAGTAATAAAG

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のヒトα2,8 シアリルトランスフェラー
ゼの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す。

【図２】本発明の実施例におけるプラスミドpCEVh2,8ST
によるGD3 の発現を示すサイトメトリーを示す。

【図３】本発明のα2,8 シアリルトランスフェラーゼの
シアリルモチーフ領域のアミノ酸配列と他のシアリルト
ランスフェラーゼのそれとの対比を示す。 rSTX; J.Biol. Chem., 268, 11504-11507(1993) rST3N-1; J. Biol. Chem., 267, 21011-21019(1992) hST3N-2; J. Biol. Chem., 268, 22782-22787(1993) pST30-1; J. Biol. Chem., 267, 21004-21010(1992) mST30-2; Eur. J. Biochem., 216, 377-385(1993) hST6N; Nuc. Acids Res. 18, 667(1990) rST6N; J. Biol. Chem., 262, 17735-17743(1987) 図中の数値：Ｎ末端からのアミノ酸の順番を示す。 またr はラット由来、h はヒト由来、p はブタ由来、m
はマウス由来をそれぞれ示す。

【図４】図４Ａ：ヒトメラノーマSK-Mel-28 細胞におけ
るα2,8 シアリルトランスフェラーゼのノーザンブロッ
ト解析を示す。 レーン１：全RNA 20μg レーン２： poly(A)⁺ RNA 2 μg ³²PラベルしたpCEVh
2,8ST断片により検出した。 図４Ｂ：プラスミドpCEVh2,8STを一過性に発現したCHOP
細胞におけるα2,8 シアリルトランスフェラーゼ活性
を、GD3 への¹⁴C の取り込みにより検出したオートラジ
オグラフ。

【図５】図５：実施例のpCEVh2,8ST発現細胞におけるガ
ングリオシドの発現を示すプロフィール。 図５Ａ：オルシノール染色によるプロフィール。 レーン１：スタンダード レーン２：ヒトメラノーマSK-Mel-28 細胞のガングリオ
シドプロフィール レーン３：コントロールのCHOP細胞のガングリオシドプ
ロフィール レーン４：pCEVh2,8STを組み込んだCHOP細胞のガングリ
オシドプロフィール レーン５：pCEV18を組込んだCHOP細胞のガングリオシド
プロフィール 図５Ｂ：抗GD3 抗体による薄層クロマトグラフィーのイ
ムノ染色によるプロフィール レーン１：pCEV18を組込んだCHOP細胞のガングリオシド
GD3 のプロフィール レーン２：pCEVh2,8STを組込んだCHOP細胞のガングリオ
シドGD3 のプロフィール レーン３：ガングリオシドGD3 のスタンダードのプロフ
ィール

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【手続補正書】

【提出日】平成６年７月２６日

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】本発明のｃＤＮＡは次の手法によって作成
され、α２，８シアリルトランスフェラーゼの発現が確
認された。まず、高いＧＤ３活性をもつヒトメラノーマ
ＳＫ−Ｍｅｌ−２８細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ７２）より
ｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成
する。これを真核細胞発現ベクターのｐＣＥＶ１８に組
み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製する。一方、ＣＨ
Ｏ細胞は、ＧＭ３を発現し、ＧＤ３を発現しない性質を
有する。本発明ではこの性質に着目し、ＣＨＯ細胞にポ
リオーマウイルスのラージＴ抗原を発現させてＣＨＯＰ
細胞（Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｎｎｉ
ｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９，
８５−９２（１９９１）を作製し、このＣＨＯＰ細胞を
用いてエレクトロポレーション法により前記ｃＤＮＡラ
イブラリーのＤＮＡをトランスフェクションする。この
ようにしてトランスフェクションされたＣＨＯＰ細胞
を、抗ＧＤ３ モノクローナル抗体 Ｒ２４［ハイブリ
ドーマ（ＡＴＣＣ ＨＢ８４４５）が産生するモノクロ
ーナル抗体］［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９，１９１−
１９６（１９８９）］と、フルオレスセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）標識抗イムノグロブリン抗体（２
次抗体）とを用いてその表面を染色し、セルソーターで
ＧＤ３陽性細胞だけを選別し、これからプラスミドＤＮ
Ａを抽出する。このＤＮＡで大腸菌ＤＨ１ＯＢ（ギブコ
社製）を形質転換し、トランスフェクションと選択とを
数回くり返し、ＧＤ３陽性のコロニーのなかからさらに
ＧＤ３発現活性で選別し、単一のクローン、ｐＣＥＶｈ
２，８ＳＴを単離する。このクローンをＣＨＯＰ細胞に
一過性に発現させて抗ＧＤ３ 抗体を用いて解析したと
ころ、このｐＣＥＶｈ２，８ＳＴは細胞表面上でＧＤ３
を発現していることが判明した。このｐＣＥＶｈ２，８
ＳＴはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託されている（受託日１９９４年６月
１日、受託番号ＡＴＣＣ ７５７９８）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１に示す１番目のメチオ
   ニン（Met)から341番目のセリン(Ser) までのアミノ酸
   配列と相同性を有するアミノ酸配列を含む配列をコード
   するcDNA。
2. 【請求項２】 配列表配列番号１に示す 149番目のアデ
   ニン(A) から1171番目のシトシン(C) までの塩基配列と
   相同性を有する塩基配列を含むcDNA。
3. 【請求項３】 配列表配列番号１に示す 149番目のアデ
   ニン(A) から1171番目のシトシン(C) までの塩基配列よ
   りなる請求項(2) 記載のcDNA。
4. 【請求項４】 α2,8 シアリルトランスフェラーゼをコ
   ードする請求項(1)〜(3) のいずれかに記載のcDNA。
5. 【請求項５】 配列表配列番号1 の 120番目から168 番
   目または258 番目から280 番目のシアリルモチーフを示
   すアミノ酸配列を含有するα2,8 シアリルトランスフェ
   ラーゼをコードするcDNA。
6. 【請求項６】 配列表配列番号１に示すＮ末端１３番目
   から３４番目のアミノ酸配列の疎水性膜貫通ドメインを
   有するアミノ酸配列を含有する請求項(1) 〜(5) のいず
   れかに記載のcDNA。
7. 【請求項７】 Asn-X-Thr(式中X は任意のＬ−アミノ
   酸）で表わされるＮ−グルコシレーションサイトを含む
   アミノ酸配列のα2,8 シアリルトランスフェラーゼをコ
   ードする請求項(1) 〜(5) のいずれかに記載のcDNA。