JP4063359B2 - 硫酸基転移酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡおよび発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換体、該形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法およびポリペプチド、前記遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、前記遺伝子にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーならびに前記ポリペプチドに結合する抗体またはその断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞の膜に存在する糖タンパク質や糖脂質等の、いわゆる複合糖質と呼ばれる分子の糖鎖部分が持つ様々な生理機能が注目されている。糖鎖に結合した硫酸基は、種々の生物学的機能に関連して興味がもたれている。硫酸基は、ウイルス糖タンパク質、糖タンパク質性ホルモン、基底膜糖タンパク質、粘菌のリソソーム酵素などの糖鎖にエステル結合している他に、ムチンやムコ多糖、糖脂質の糖鎖にも種々の結合様式で結合している。しかし、その生物学的意義は今後の解明すべき問題として残されている。
【０００３】
これまでに基質特異性の異なる種々の硫酸基転移酵素の存在が知られている。例えば、糖タンパク質に働く硫酸基転移酵素としては、Ｎ−グリコシド型糖鎖のガラクトースの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２６４巻、第６号、第３３６４−３３７１頁（１９８９）〕、Ｎ−グリコシド型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journal) 、第３１９巻、第２０９−２１６頁（１９９６）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔グライコバイオロジー（Glycobiology) 、第５巻、第７号、第６８９−６９７頁（１９９５）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２７０巻、第４６号、第２７５４４−２７５５０頁（１９９５）〕、および脳下垂体で産生される糖タンパク質性ホルモン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６６巻、第２６号、第１７１４２−１７１５０頁（１９９１）〕等が知られている。
【０００４】
また、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）に働く硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸のイズロン酸の２位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１巻、第１３号、第７６４５−７６５３頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第８号、第４１７２−４１７９頁（１９９５）〕、ヘパリンのイズロン酸の２位とＮ−硫酸化グルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第４０号、第２４５３８−２４５４１頁（１９９４）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１巻、第４３号、第２７０７２−２７０８２頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６３巻、第５号、第２４１７−２４２２頁（１９８８）〕、ヘパリンのＮ−硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６６巻、第１３号、第８０４４−８０４９頁（１９９１）〕、コンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンとケラタン硫酸のガラクトースの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素およびコンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第２９号、第２１９６８−２１９７４頁（１９９３）〕、角膜に存在するケラタン硫酸にのみ働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５９巻、第１９号、第１１７７１−１１７７６頁（１９８４）〕等が知られている。
【０００５】
さらに、糖脂質に働く硫酸基転移酵素としては、本発明の硫酸基転移酵素以外に、単クローン抗体ＨＮＫ−１で認識される糖鎖を合成する、グルクロン酸の３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第１号、第３３０−３３６頁（１９９３）〕が知られている。
【０００６】
これらの中でクローニングされている複合糖質に働く硫酸基転移酵素としては、ラット肝由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−ヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、 第２２号、第１５７４４−１５７５０頁（１９９２）］、ＭＳＴ細胞由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−デアシラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第３号、第２２７０−２２７６頁（１９９４）］、ニワトリ胎児軟骨細胞（chick embryo chondrocytes)由来のコンドロイチン糖鎖の合成にかかわるＮ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位に硫酸基を転移する酵素［コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第３１号、第１８５７５−１８５８０頁（１９９５）］が知られている。
【０００７】
本発明者らは、ガラクトースの３位の水酸基に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素である３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕をヒト腎癌細胞株（ＳＭＫＴ−Ｒ３）より精製した〔ジャーナル オブ バイオケミストリー(Journal of Biochemistry) 、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕。該硫酸基転移酵素は、ヒト腎癌組織又はその細胞株で高発現しており、腎癌における硫酸化糖脂質の蓄積と相関しており、癌との関連が示唆されるが、そのアミノ酸配列は決定されておらず、その遺伝子もクローニングされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに知られている硫酸基転移酵素を工業的に有利に製造しようとする場合、天然に存在する該酵素の量が少なかったり、プロテアーゼやスルファターゼ等の他の酵素の混在の為、目的の硫酸基転移酵素を純粋な形で、簡便かつ大量に単離することは非常に困難であった。
【０００９】
従って、硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的手法を用いて、安価に高純度な硫酸基転移酵素を製造する方法が求められている。従来、硫酸基転移酵素遺伝子のクローニングについて前述のような報告があるが、その数は著しく少ない。また、基質特異性の異なる硫酸基転移酵素が多数存在するため、前述の報告の硫酸基転移酵素遺伝子配列を用いて他の基質特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子を得ようとしても、基質特異性が異なる酵素間の遺伝子のホモロジーが低く、目的の硫酸基転移酵素遺伝子を得ることは困難である。ましてや、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素のアミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明であるため、該硫酸基転移酵素をクローニングし、遺伝子工学的に製造することは困難である。
【００１０】
よって、本発明の第１の目的は、腎細胞に特徴的であり、特に腎癌細胞で高発現している、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子を提供することにある。本発明の第２の目的は、前記遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的に高純度の硫酸基転移酵素を製造する方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、前記遺伝子がコードするポリペプチドを提供することにある。本発明の第４の目的は、本発明の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを提供することにある。本発明の第５の目的は、本発明の遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを提供することにある。本発明の第６の目的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以上の状況に鑑みてなされたものである。糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素の塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにする為、該硫酸基転移酵素を高発現するヒト腎癌細胞株ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素について鋭意検討を重ねた結果、遂に該硫酸基転移酵素遺伝子の完全解明に成功した。更に該硫酸基転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により工業的に有利で高純度な硫酸基転移酵素を簡便に製造することにも成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の要旨は、
（１）配列表の配列番号：２に記載の塩基配列からなり、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離された遺伝子、
（２）前記（１）記載の遺伝子とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができ、かつＧａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）前記（１）又は（２）記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ、
（４）前記（３）記載の組換えＤＮＡを挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター、
（５）前記（４）記載の発現ベクターを導入されてなる形質転換体、並びに
（６）前記（５）記載の形質転換体を培養し、該培養物より硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの製造方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有する」（以下、硫酸基転移酵素活性を有すると略す場合がある）とは、下記に示すような作用および基質特異性を有する性質をいい、このような硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドとしては、下記の物理化学的性質を有するものが挙げられ、その一例がジャーナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載されている。
【００１４】
１．作用
Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する。
【００１５】
２．基質特異性
ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ガラクトシル １−アルキル−２−アシルグリセロール（ＧａｌＡＡＧ）、ガラクトシルジアシルグリセロール（ＧａｌＤＧ）、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）、グロボテトラオシルセラミド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）、ガングリオトリアオシルセラミド（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、ガングリオテトラオシルセラミド（Ｇｇ４Ｃｅｒ）、ネオラクトテトラオシルセラミド（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）に反応し、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）、ガラクトース、ラクトースに反応しない。
【００１６】
３．至適ｐＨ及び安定ｐＨ
至適ｐＨは約７．０、安定ｐＨは６．０〜８．０。
４．至適温度及び安定温度
至適温度は約３７℃であり、８０℃まで安定である。
５．分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）により約５４ｋＤａである。
【００１７】
また、硫酸基転移酵素活性の測定方法としては、アナリティカル バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第１８２巻、第９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正した方法が挙げられる。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製する。該混合液を３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で反応を停止する。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定する。１ユニットの活性は、前記測定条件下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量として定義する。該方法により測定した場合、１×１０-7ミリユニット以上の活性を示すものを、硫酸基転移酵素活性を有するものと判定する。
【００１８】
本発明において遺伝子とは、前記硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又は該遺伝子を含む遺伝子である。具体的には配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子または配列表の配列番号：２に記載の塩基配列又はその一部からなる遺伝子が挙げられる。このように、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子または配列番号：２に記載の塩基配列の一部からなる遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発明の範囲内である。これらは、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕の遺伝子であるが、本発明においてはこれらに限定されるものではなく、同様の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎりその他のヒト組織由来の遺伝子はもちろん、細菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来の遺伝子、あるいは植物、動物由来の遺伝子も含まれる。さらに、機能的に同様の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする、前記遺伝子の変異体が挙げられる。例えば、配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換されているポリペプチドをコードする遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。このように天然から単離された遺伝子のみならず人為的に調製された遺伝子であっても硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発明に含まれる。
【００１９】
また、本発明の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。
【００２０】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件を言う。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Denhardt's、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件を言う。
【００２１】
本発明において、組換えＤＮＡとは、遺伝子工学的手法により、本発明の遺伝子を含んで得られるＤＮＡである。
【００２２】
本発明において、発現ベクターとは、前記組換えＤＮＡを挿入され、所望の宿主細胞で発現するように構築されたベクターである。また、後述のアンチセンスＤＮＡを挿入したベクターも本発明の発現ベクターに含まれる。挿入されるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクターいずれでも構わない。プラスミドベクターとしてはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴ７などの市販品が好適に使用でき、ファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１等のラムダファージベクターなどの市販品が好適に使用できるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞としては、微生物、動物細胞又は植物細胞が挙げられ、用いる発現ベクターに応じて、適宜選ばれる。
【００２３】
本発明において、形質転換体とは、前記発現ベクターを前記宿主細胞に導入されて得られた、本発明の遺伝子を発現する細胞である。
発現ベクターを導入する方法としては、例えば、モレキュラー クローニングア ラボラトリー マニュアル［Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス(T. Maniatis) 他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８２年発行］、第２４９−２５４頁に記載の方法を用いることができる。次に、目的の遺伝子を発現する形質転換体を選択するためには、発現ベクターの特性を利用する。例えばプラスミドベクターがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで、大腸菌を宿主細胞とする場合、アンピシリンを含むプレート上でアンピシリン耐性を有するコロニーを、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示し、かつ、白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導入されたコロニーを選別する。
【００２４】
本発明は、本発明の遺伝子が発現され、該遺伝子がコードするポリペプチドが生産されるような条件下で前記形質転換体を培養することにより、該培養物から硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００２５】
目的の硫酸基転移酵素の発現が認められた場合は、その形質転換体の培養における培地組成、培地のｐＨ、培養温度、インデューサーの使用量・使用時期、培養時間等の条件が硫酸基転移酵素発現の最適条件を満たすように決定することにより、効率よく硫酸基転移酵素を生産させることができる。
【００２６】
形質転換体の培養物から硫酸基転移酵素を精製するには、公知の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌のように細胞内に発現産物を蓄積させる場合は、培養終了後遠心分離によって該形質転換体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等により、無細胞抽出液を得る。塩析あるいは、イオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィー等の通常のタンパク質精製法により、該抽出液から目的の硫酸基転移酵素を精製することができる。用いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体外に分泌される場合がある。この場合は培養上清から同様に精製を行えばよい。
【００２７】
用いる宿主−ベクター系によっては、形質転換体中で発現されたポリペプチドが不溶物（封入体）として蓄積される場合がある。この場合は、この不溶物を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等の変性剤で可溶化した後に、変性剤を除くことによって活性を回復させることができる。
【００２８】
形質転換体が産生する外因性の硫酸基転移酵素は、宿主細胞内で内因性の種々の硫酸基転移酵素と共存するが、その量が内因性の硫酸基転移酵素の量に比べ過剰であるので、その精製は極めて容易である。また、硫酸基転移酵素が形質転換体外に分泌される場合は、培地成分等が共存するが、これらは通常硫酸基転移酵素の精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとんど含まないため、その精製には、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞からの硫酸基転移酵素の精製と比べ、煩雑な分離操作を必要としない利点がある。
【００２９】
また、真核生物由来の硫酸基転移酵素の場合、酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、宿主細胞として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌のような原核生物、あるいは酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能力を失った変異細胞を用いることによって、糖鎖を持たない硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。更に、酵素自身に糖鎖を付加させることも可能であり、この場合は、宿主細胞として、糖鎖生合成能力を有する細胞、例えば、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞を用いることによって、糖鎖を持つ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドとは、前記の本発明の遺伝子によりコードされ、かつ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドであり、前記のような各種の物理化学的性質を有するものが挙げられる。具体的には、天然型の硫酸基転移酵素である配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその一部からなるポリペプチド、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換されているポリペプチド等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、「アンチセンスＤＮＡ」及び「アンチセンスＲＮＡ」とは、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子又はその一部と相補的な塩基配列を有し、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡ）と２本鎖を形成することによって、該遺伝子からの遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制又は制御するものを言う。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの長さは、塩基配列の特異性や細胞内に導入する方法に応じて変えることが可能である。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、合成機を用いて人工的に合成したり、通常と逆の向き（アンチセンスの向き）に遺伝子を発現させること等により、作製することが可能である。例えば、ｔａｔ遺伝子［ヌクレイック アシドズ リサーチ（Nucleic Acids Research) 、第１９巻、第３３５９−３３６８頁（１９９１）］、あるいはｒｅｖ遺伝子［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA)、第８６巻、第４２４４−４２４８頁（１９８９）］のＨＩＶの増殖抑制に関するもの等、アンチセンス技術は数多く知られており、従って、これらの方法により、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを用いて、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑制又は制御することが可能である。また、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、in situ ハイブリダイゼーション等の研究試薬として利用可能である。
【００３２】
本発明において、合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーとは、前記遺伝子に特異的にハイブリダイズするものである。該オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、通常、合成機を用いて人工的に合成したり、ＰＣＲ法により作製することができる。
【００３３】
本発明において、抗体又はその断片とは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。本発明の抗体は、例えば、カレント プロトコルズ イン イムノロジー〔Current Protocols in Immunology 、ジョン Ｅ．コリガン（John E.Coligan) 編集、ジョン ウィリー＆ソンズ（John Wiley & Sons, Inc.)、１９９２年発行〕に記載の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。これらの抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。得られた抗体又はその断片の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、医薬・診断薬・研究用試薬等が挙げられる。
【００３４】
次に、ウロロジカル リサーチ（Urological Research ）、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）記載のヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３を用い、該ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来の硫酸基転移酵素を一例にして、本発明について更に詳しく説明する。
まず、本発明の硫酸基転移酵素は、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞を大量に培養し、ついでその培養細胞から硫酸基転移酵素を単離精製する。具体的には、以下の方法が挙げられる。
【００３５】
ＥＧＦで処理したＳＭＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで−８０℃で保存する。約２．５×１０9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズする。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理する。遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析する。
【００３６】
透析した材料を遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去する。上清をＤＥ−５２カラムにアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラムに、直接出口を接続させる。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、バッファーＢでカラムを洗浄する。ＤＥ−５２カラムの接続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出する。
【００３７】
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透析する。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させておいたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セファロースカラムにアプライする。次いで、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３８】
ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析する。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡＰ）カラムに直接接続したピリドキサル５’−ホスフェート（ＰＬＰ）−セファロースカラムに、透析液をアプライする。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３９】
ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィーに直接供する。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させる。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５に濃縮される。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収される。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存される。
【００４０】
次に、精製された硫酸基転移酵素について、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えば、精製硫酸基転移酵素を直接常法に従ってエドマン分解法［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５６巻、第７９９０−７９９７頁（１９８１）］によるアミノ酸配列分析［プロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製］に供することにより、硫酸基転移酵素のＮ末端アミノ酸配列の１０〜２０残基を決定する。あるいは特異性の高いタンパク質加水分解酵素、例えば、アクロモバクター（Achromobacter ）由来プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製した後、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００４１】
本発明においては、Ｐ１（配列番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ６（配列番号：１３）及びＰ７（配列番号：１４）の７つのペプチド断片のアミノ酸配列が決定される。
【００４２】
こうして得られる部分アミノ酸配列に基づき、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングする。そのためには、一般的に用いられるＰＣＲ法又はハイブリダイーゼーション法を利用する。ＰＣＲ法は、ＰＣＲテクノロジー［PCR Technology、エルリッヒ ＨＡ(Erhich HA) 編集、ストックトン プレス(Stockton Press)社、１９８９年発行］に記載の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイーゼーション法は、例えばモレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル( 第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバーラボラトリー プレス社、１９８９年発行) に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４３】
しかしながら、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子は、以下のような混合プライマー（配列番号：２２〜２７）を用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）、イノシンを含む混合プライマー（配列番号：２８〜３３）を用いるＭＯＰＡＣ法及び合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２２、２４）を用いるハイブリダイゼーション法を試みたが、クローニングすることができなかった。
【００４４】
１）混合プライマーを用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）
この方法は、決定されたアミノ酸配列のうち縮重性の低い領域を２カ所選択し、縮重コドンに対して可能性のある全ての塩基配列の組み合わせを合成し、混合プライマーとしＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅するクローニング方法である。
この方法により、尿酸酸化酵素をコードする遺伝子はクローニングされている〔サイエンス、第２３９巻、第１２８８−１２９１頁（１９８８）〕。
本発明者らもこの方法に従って、本発明の硫酸基転移酵素の取得を試みた。
【００４５】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）と合成オリゴヌクレオチドＡ１（配列番号：２３）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）と合成オリゴヌクレオチドＡ２（配列番号：２５）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳ３（配列番号：２６）と合成オリゴヌクレオチドＡ３（配列番号：２７）をそれぞれ合成し、これらを混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
【００４６】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離した結果、複数のＤＮＡ断片が増幅されたので、それぞれ別々にゲルから切り出し、抽出し、プラスミドベクターに組み込んだ後、塩基配列を常法（ジデオキシ チェーン ターミネーター法）に従い決定したが、混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかった。
【００４７】
２）イノシンを用いるＭＯＰＡＣ法
１）と方法はほぼ類似しているが、混合プライマーの組み合わせ数を減少させるため、縮重性の高いコドンの３番目をイノシンに置換したプライマーを用いる〔ヌクレイック アシドズ リサーチ、第１６巻、第２２号、第１０９３２頁（１９８８）〕。
【００４８】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ１（配列番号：２８）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ１（配列番号：２９）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ２（配列番号：３０）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ２（配列番号：３１）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ３（配列番号：３２）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ３（配列番号：３３）をそれぞれ合成し、これらをイノシン含有混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
【００４９】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を上述の方法と同様に決定したが、イノシン含有混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかった。
【００５０】
３）合成オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法
アミノ酸配列の情報をもとに、常法に従って合成オリゴヌクレオチドをデザインし、ハイブリダイゼーションによって目的のＤＮＡをクローニングする方法も一般的に用いられる。本発明者らもこの方法に従って本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の検出を試みた。
【００５１】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）を合成し、プラークハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを、常法に従いファージベクターに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをプレートにまき、得られたプラークをナイロン膜にブロッティングした。ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行った。
【００５２】
その結果、プローブとして用いた合成オリゴヌクレオチドＳ１及びＳ２のどちらの場合にも複数の陽性プラークが検出されたが、これら陽性プラークのファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従い決定したところ、プローブとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列にホモロジーを示す配列は得られたが、ファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列から決定したアミノ酸配列は上記の部分アミノ酸配列とのホモロジーはなく、目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考えられる配列を見出すことができなかった。
【００５３】
以上に述べたように、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡから本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングすることは非常に難しい。硫酸基転移酵素遺伝子はＧ＋Ｃ含量が高いため二次構造を取りやすく、それゆえポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法において非特異的ＤＮＡ断片の増幅が起こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点を考慮し鋭意検討を重ねた結果、アミノ酸配列の判明している一つのペプチド断片に対応する短い遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅することにした。
【００５４】
ＰＣＲ法のプライマーとしては、混合プライマーの組合わせ数を減らすためにイノシンを用いるとともに、アミノ酸のロイシンに対しては使用頻度の高いコドンを採用し、セリンに対するコドンの組合わせを複数用意することにより塩基配列の縮重性を減少させたものを合成するのが好ましい。これにより、初めて本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を増幅することが可能となる。次に、この増幅されたＰＣＲ産物をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより、非特異的ＤＮＡ断片の中から目的の硫酸基転移酵素遺伝子由来のＤＮＡ断片を見出すことに成功したのである。
【００５５】
以下、より詳細に説明すれば、ＰＣＲ法のプライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチド１Ｓｄ（配列番号：６）と合成オリゴヌクレオチド１Ａ（配列番号：７）をそれぞれ合成し、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。
【００５６】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を、例えばジデオキシ チェーン ターミネーター法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７４巻、第１２号、第５４６３−５４６７頁（１９７７）］により決定したところ、部分アミノ酸配列Ｐ１をコードする配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部が得られる。この塩基配列を基に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番号：８）を合成し、この合成オリゴヌクレオチドＯＰ１を常法に従い３’−末端標識し、ハイブリダイゼーション用のプローブとする。
【００５７】
また、ＰＣＲ法のプライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）と部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド３Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成して、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、常法に従いナイロン膜にブロッティングし（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１９８９年発行）、３’−末端標識合成オリゴヌクレオチドＯＰ１を用いたハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、前記したように、ストリンジェントな条件下で行い、標識に応じた検出法を用いて、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
【００５９】
その結果、約６００ｂｐの位置に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１とハイブリダイズするバンドを得る。この断片の塩基配列を前記したように決定したところ、硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）と部分アミノ酸配列Ｐ４（配列番号：１１）に対応する配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を取得したことを確認する。
【００６０】
一方、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製法は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１９８９年発行）、第８章に記載の方法を用いることができる。
【００６１】
更に、前記約６００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブにして、前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、硫酸基転移酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移酵素のゲノムＤＮＡを得ることも可能である。
【００６２】
以上のようにして得られる、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞の産生する硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列は、配列表の配列番号：２に記載したものであり、これからコードされる全アミノ酸配列は配列表の配列番号：１に記載したものである。また、このアミノ酸配列及び塩基配列と公知の基質特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子とはホモロジーはなく、全く新しい配列である。
【００６３】
本発明により硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列が明らかになったことで、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡをクローニングすることができる。
【００６４】
また、本発明の硫酸基転移酵素の塩基配列に基づき、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーから、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ断片を検出したり、さらにはその全長の遺伝子を得ることもできる。
【００６５】
得られた遺伝子が目的の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の硫酸基転移酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較してその相同性から推定することもできる。さらに、前記の測定方法により硫酸基転移酵素活性を測定し、１×１０-7ミリユニット以上の活性を示すものを本発明のポリペプチドをコードする遺伝子として判定する。
【００６６】
同様の硫酸基転移酵素活性を有する機能的同等物を製造するには、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の硫酸基転移酵素遺伝子群を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入することにより、天然の硫酸基転移酵素のアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換を生じさせる遺伝子が得られる。これにより、天然の硫酸基転移酵素と同様の活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なった硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれらの硫酸基転移酵素を製造することが可能である。
【００６７】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７９巻、第１４０８−１４１２頁（１９８２）］、生化学的方法として、［α−Ｓ］ｄＮＴＰ存在下で２本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法［ジーン(Gene)、第６４巻、第３１３−３１９頁（１９８８）］、ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取込の正確さを低くする方法［アナリティカル バイオケミストリー、第２２４巻、第３４７−３５３頁（１９９５）］等が知られている。
【００６８】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド デュプレックス（gapped duplex)法、ヌクレイック アシドズリサーチ、第１２巻、第２４号、第９４４１−９４５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法［アナリティカル バイオケミストリー、第２００巻、第８１−８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第６７−７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase ）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［クンケル（Kunkel) 法、プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第４８８−４９２頁（１９８５）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber 、ＯＤＡ）法、ジーン、第１５２巻、第２７１−２７５頁（１９９５）］、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ ５，５１２，４６３）等が知られている。
【００６９】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュプレックス法を用いたミュータン−Ｇ（Mutan R -G、宝酒造社製）、クンケル法を用いたミュータン−Ｋ（Mutan R -K、宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたミュータン−エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Express Km 、宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮＡポリメラーゼを用いたクイックチェンジ サイト−ダイレクティッド ミュータジェネシス キット［QuikChangeTM Site-directed Mutagenesis Kit、ストラタジーン（STRATAGENE）社製］等があり、更に、ＰＣＲ法を利用する方法として、ＴａＫａＲａ ＬＡ−ＰＣＲ イン ビトロ ミュータジェネシス キット（TaKaRa LA-PCR in vitro Mutagenesis Kit、宝酒造社製）、ミュータン−スーパー エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Super Express Km 、宝酒造社製）等が挙げられる。
【００７０】
このように、本発明により、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造方法が可能となる。
また、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の検索、検出や増幅等に有用である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片は、本発明の硫酸基転移酵素の検索、検出や精製等において有用である。
【００７１】
なお、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造した本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、および熱安定性は、以下に示すように天然の硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕とほぼ同様の結果が得られている。
【００７２】
（１）至適ｐＨ
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示すように６〜８付近に高い活性を有している。
（２）至適温度
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示すように約４０℃付近で最大活性を示す。
（３）ｐＨ安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性は、図３に示すようにｐＨ６〜１０の範囲で安定である。
（４）熱安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性は、図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の処理で８５％の活性が失われる。
【００７３】
【実施例】
以下、実験例、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例等になんら限定されるものではない。
【００７４】
実験例１．ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞からの硫酸基転移酵素の精製
５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１２〜２４時間処理したＳＭＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで−８０℃で保存した。２．５×１０9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズした。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理した。１００，０００×ｇで１時間遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析した。
【００７５】
透析した材料を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去した。上清をＤＥ−５２カラム[ ３×２０ｃｍ、ワットマン(Whatman) 社製] にアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭＭｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム [２×１０ｃｍ、ファルマシア バイオテク(Pharmacia Biotech) 社製] に、直接出口を接続させた。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、４０ｍｌ／ｈの流速でバッファーＢでカラムを洗浄した。ＤＥ−５２カラムの接続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出した。
【００７６】
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透析した。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させておいたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシア バイオテク社製）に５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。次いで、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
【００７７】
ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析した。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡＰ）カラム（５ｍｌのベッド体積、ファルマシア バイオテク社製）に直接接続したピリドキサル５’−ホスフェート（ＰＬＰ）−セファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社製）に、透析液を５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
【００７８】
ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィー（０．３ｍｌのベッド体積）に直接供した。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させた。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５に濃縮された。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収された。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存した。得られた精製酵素の活性を、実験例２に記載の方法により測定したところ、１．２ユニット／ｍｇであった。
【００７９】
実験例２．精製硫酸基転移酵素の作用、基質特異性、物理化学的性質の検討
アナリティカル バイオケミストリー、第１８２巻、第９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正して、実験例１で得られた本発明の精製硫酸基転移酵素の活性を測定した。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製した。また、基質特異性を調べるために、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒの代わりに２５ｎｍｏｌの種々の基質を受容体として用いた。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で反応を停止した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定した。受容体を欠いた前記反応混合液を用いて得られたブランク値に対して、測定値を補正した。１ユニットの活性は、前記測定条件下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量として定義した。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１より、本発明の精製硫酸基転移酵素は、ＧａｌＣｅｒを最良の基質とし、ＬａｃＣｅｒを第２位の基質とした。ＧａｌＡＡＧおよびＧａｌＤＧも基質として用いられる。また、本発明の精製硫酸基転移酵素は、ＧａｌＣｅｒと比べて１０％未満の比活性であるけれども、ＧｌｃＣｅｒ、Ｇｂ４Ｃｅｒ、Ｇｇ３Ｃｅｒ、Ｇｇ４ＣｅｒおよびｎＬｃ４Ｃｅｒに対しても作用した。しかし、Ｇｂ３Ｃｅｒには、作用しなかった。
【００８２】
本発明の精製硫酸基転移酵素の他の性質としては、０．１Ｍまでの濃度のＮａＣｌにより、硫酸基転移活性が増強されたが、０．１Ｍを越える濃度では活性を阻害した。Ｋm 値は、ＧａｌＣｅｒおよびＰＡＰＳに対して、それぞれ、２７μＭ、２５μＭであった。また、ｐＨ６．５〜７．０の間で、本発明の精製硫酸基転移酵素は最大活性を示した。また、２０％グリセリンの存在下で−８０℃で保存した場合、少なくとも３ヶ月間は失活を認めなかった。
【００８３】
Laemmli の方法〔ネイチャー（Nature) 、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７０）〕により、本発明の精製硫酸基転移酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。５％β−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー中で処理した場合に（還元条件下）、約５４ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが得られた。
【００８４】
実施例１．硫酸基転移酵素遺伝子のクローニング
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株［ウロロジカル リサーチ、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）］より全ＲＮＡを抽出［アナリティカル バイオケミストリー、第１６２巻、第１５６−１５９頁（１９８７）］し、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（OligotexTM-dT30 、宝酒造社製）を用いて精製した。精製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡから、スーパースクリプト チョイス システム［SUPERSCRIPT TM Choice System、ライフ テクノロジーズ(Life Technologies) 社製］を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ｃＤＮＡにEco R I アダプター（ライフテクノロジーズ社製）を結合させたｃＤＮＡ断片と、制限酵素Eco RIで消化したλｇｔ１０ファージベクター（ファルマシア バイオテク社製）とをライゲーションを行い、その後、レディ−トゥ−ゴー ラムダ パッケージング キット［Ready-To-Go TM Lambda Packaging Kit 、ファルマシアバイオテク社製］ を用いてイン ビトロでパッケージングを行い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーとした。
【００８５】
（２）硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列の決定
実験例１で精製した硫酸基転移酵素１０μｇを６Ｍ塩酸グアニジウムを含む１ｍＭＥＤＴＡ溶液（１ｍｌ）に溶解させ、２−メルカプトエタノールを２μｌ加え、窒素封入し、３７℃、２時間保温し還元した。その後、４−ビニルピリジンを１０μｌ加え、窒素封入し、３７℃、２時間保温することにより、Ｓ−ピリジルエチル化を行った。
【００８６】
こうして得られたピリジルエチル化酵素タンパク質を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［システム：Ｗａｔｅｒｓ６２５ＬＣ、ミリポア(Millipore) 社製、カラム：コスモシール(Cosmosil)５Ｃ４−ＡＲ−３００、４．６×５０ｍｍ、ナカライテスク社製、流速：０．４ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、５５分間で溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］に供すことにより、精製した。
【００８７】
精製したＳ−ピリジルエチル化酵素タンパク質（約２μｇ／ｍｌ）を、３Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶解し、０．３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）で、３７℃、１２時間消化した。
【００８８】
得られた消化物からペプチド断片をＲＰ−ＨＰＬＣ［システム：モデル１３０Ａ、アプライド バイオシステムズ社製、カラム：ＯＤ−３００Ｃ，アクアポア(Aquapore)、７μｍ、１．０×２５０ｍｍ、アプライド バイオシステムズ社製、流速：０．１ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ溶液、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、８５分間で溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］により、分離精製した。
【００８９】
分離したペプチド断片を常法に従って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分析（プロテイン シークエンサー モデル４９２、アプライド バイオシステムズ社製）に供して、部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ６（配列番号：１３）、Ｐ７（配列番号：１４）を決定した。
【００９０】
（３）プライマーの合成
前記（２）で決定した部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成ヌクレオチド１Ｓａ（配列番号：１５）、１Ｓｂ（配列番号：１６）、１Ｓｃ（配列番号：１７）、１Ｓｄ（配列番号：６）、１Ａ（配列番号：７）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）、２Ｓｂ（配列番号：１８）、２Ａａ（配列番号：１９）、２Ａｂ（配列番号：２０）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成ヌクレオチド３Ｓ（配列番号：２１）、３Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成し（ＤＮＡシンセサイザ モデル３９２、アプライド バイオシステムズ社製）、合成ヌクレオチドプライマーとした。
【００９１】
合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄ、２Ｓａ、２Ｓｂ、３Ｓはセンス方向のプライマーであり、合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ａ、２Ａａ、２Ａｂ、２Ａ、３Ａはアンチセンス方向のプライマーである。
【００９２】
ハイブリダイゼーションの際にプライマーが相互結合をすることを防ぐ目的で、全てのオリゴヌクレオチドの合成においてはデオキシイノシンによる塩基置換を行った。デオキシイノシン置換はコドンの重なりが２よりも多いアミノ酸残基部分について行った。また、セリン残基をコードする部分についてはＴＣＸとＡＧ（Ｔ／Ｃ）の2 種のうちいずれかのコドンを有するオリゴヌクレオチドの組合せを用意した。
【００９３】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法による硫酸化転移酵素遺伝子の検索
全液量２０μｌ中、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞より抽出したポリ（Ａ）+ ＲＮＡ２μｇ、４０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）12-18 プライマー（ライフ テクノロジーズ社製）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素［スーパースクリプトＩＩＲＮａｓｅＨ- 逆転写酵素（SUPERSCRIPT TMII RNase H- Reverse Transcriptase)、ライフ テクノロジーズ社製] ２００ユニットを含む反応系で、３７℃、１時間、逆転写反応を行った。この反応液の内４μｌを鋳型とし、前記各１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス方向プライマーとアンチセンス方向プライマー）と各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ〔パーキン エルマー(Perkin Elmer)社製〕１．２５ユニットを含む全液量５０μｌの反応系でＰＣＲ反応を行った（ＲＴ−ＰＣＲ）。反応条件は、９４℃で３０秒間（変性）、４５〜５５℃で３０秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃で１〜２分間（合成反応）のサイクルを３５サイクル行った。
【００９４】
このＰＣＲ反応後の反応液全量を２％アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲルからＤＮＡ断片を切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター[ ノバジェン(Novagen) 社製] を用いてサブクローニングを行った。これらのＤＮＡ断片の塩基配列をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いたジデオキシ チェーン ターミネーター法〔ダイ ターミネーター サイクル シークエンシング キット(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit) 、パーキン エルマー社製、ＤＮＡシークエンサー モデル３７３Ａ、アプライド バイオシステムズ社製〕で決定した。
【００９５】
初めに４種のセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄとアンチセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ａを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、１Ｓｄと１Ａの組合せで４７ｂｐのｃＤＮＡ断片と２Ｓａと３Ａの組合せで約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。
【００９６】
このｃＤＮＡ断片の内、４７ｂｐのｃＤＮＡ断片をサブクローニンし塩基配列を決定した結果、そこから予想されるアミノ酸配列と部分アミノ酸配列Ｐ１のアミノ酸配列が一致した。
【００９７】
次に、この４７ｂｐのｃＤＮＡ断片の塩基配列を基にして混合オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番号：８）を合成し、その３’末端をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）オリゴヌクレオチド テイリング キット[DIG oligonucleotide Tailing Kit、ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim) 社製] を用いてターミナルトランスフェラーゼでＤＩＧ標識した。
【００９８】
ＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯＰ１をプローブとして、前記ＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に対してサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００９９】
まず、ＲＴ−ＰＣＲで得られた約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社製）にＤＮＡを転写した。このナイロン膜を用いて、２ｐｍｏｌ／ｍｌのＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯＰ１、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５５℃、４時間、ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテクション キット（DIG Luminescent Detection Kit 、ベーリンガー マンハイム社製）を用いて行った。
【０１００】
その結果、合成オリゴヌクレオチドプライマー２Ｓａと３Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に、ＯＰ１プローブがハイブリダイズした。
【０１０１】
この約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片をサブクローニングし、塩基配列を決定した結果、この約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片中に部分アミノ酸配列Ｐ１とＰ４をコードする配列が見出された。
【０１０２】
（５）硫酸基転移酵素遺伝子を含むｃＤＮＡ断片のクローニング
実施例１の（１）で調製したＳＭＫＴ−３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離するために、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
【０１０３】
実施例１の（４）で得られた約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを用いてＤＩＧ標識［ＤＩＧ ＲＮＡ ラベリング キット(DIG RNA Labeling Kit)、ベーリンガー マンハイム社製］されたＲＮＡプローブを合成した。
【０１０４】
約２×１０5 個のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーと大腸菌ＬＥ３９２を混合し、９×１３ｃｍの角シャーレ１０枚に、１枚当たり２×１０4 個のプラークを形成させた。次に、得られたプラークをナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社製）上に写し、４℃で１時間保温した後、アルカリ変性（０．５ＮＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、５分間）、中和［１．５ＭＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３分間を２回、その後、２×ＳＳＣで２分間を１回］を行った。このフィルターを用いて、ナイロン膜１ｃｍ2 当たり１ｎｇのプローブ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテクション キット（ベーリンガー マンハイム社製）を用いて行った。その結果、６個の陽性ラムダファージクローンが得られた。これらのクローンからプラスミドを調製し、その挿入ｃＤＮＡ断片を制限酵素Eco RI（宝酒造社製）で切り出し、Eco RI消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（ストラタジーン社製）を用いてサブクローニングした。
【０１０５】
その結果、最長約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を有しているプラスミドが得られ、このプラスミドをｐＢＳ−ｈＣＳＴ１と命名した。その塩基配列を決定したところ、４３２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする読みとり枠（ＯＲＦ）が見いだされた。このＯＲＦ中に、前記精製硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列分析により得られたアミノ酸配列が全て見いだされた。
【０１０６】
以上の結果より、硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。硫酸基転移酵素をコードする塩基配列を配列表の配列番号：２に、その塩基配列からコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に示す。
【０１０７】
実施例２．硫酸基転移酵素ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｈＣＳＴ１を制限酵素Eco RIで消化し、得られたＤＮＡ断片を哺乳類発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア バイオテク社製）のEco RI部位に挿入した。挿入ＤＮＡ断片の方向は制限酵素の切断地図を基に決定した。得られた挿入方向が正の方向と逆の方向の互いに異なる発現プラスミドを、それぞれ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴとｐＳＶ−ｈＣＳＴＲと命名した。
【０１０８】
これらのプラスミドのうちｐＳＶ−ｈＣＳＴを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体を得た。該形質転換体は、Escherichia coli JM109／pSV-hCSTと命名され、Escherichia coli JM109／pSV-hcSTと表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５８１１として寄託されている。
【０１０９】
実施例３．組換え硫酸基転移酵素遺伝子のＣＯＳ−１細胞における発現
直径３５ｍｍのディッシュに、２×１０5 個のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を蒔き、次の日に実施例２で得られた発現プラスミドｐＳＶ−ｈＣＳＴ又はｐＳＶ−ｈＣＳＴＲを１μｇとリポフェクトアミン（LIPOFECTAMINE TM ライフ テクノロジーズ社製）５μｌを加えることにより、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。その後、３７℃で７２時間培養後、得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を２ｍｌの冷ＴＢＳ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．２ｍｌの０．１％トリトン（TritonR ）Ｘ−１００を含むＴＢＳを加え、シリコンスクレーパー［silicon scraper 、ファルコン(Falcon)社製］を用いて採集した。
【０１１０】
次に、採集した形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して上清を回収した。
【０１１１】
得られた上清を酵素溶液として、上清の硫酸基転移酵素活性をジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って測定し、また、同時にこの上清のタンパク質濃度をＢＣＡ プロテイン アッセイ試薬[BCA Protein Assay Reagent、ピアス(PIERCE)社製] を用いて測定した。
【０１１２】
その結果、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の比活性は１．８×１０-5Ｕ／ｍｇ（蛋白質）であった。これはコントロールとしてｐＳＶＫ３を導入したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の活性の約１６倍であり、また、ｐＳＶ−ｈＣＳＴＲで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の活性の約８倍であった。
【０１１３】
次に、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換したＣＯＳ−１細胞が、硫酸化糖脂質を発現しているかどうかを調べた。
【０１１４】
まず、１０4 個のＣＯＳ−１細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ チャンバー スライド[Lab-Tek chamber slide、ヌンク(Nunc)社製] に入れ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴを１μｇ、リポフェクトアミン（ライフ テクノロジーズ社製）１μｌを加えて形質転換させた。その後、３７℃で４８時間培養後、形質転換ＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、１％パラホルムアルテヒドを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で固定し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でブロックした。これに抗スルファチドモノクローナル抗体Ｓｕｌｐｈ１［バイオケミカル ジャーナル、 第２５１巻、第１７−２２頁（１９８８）］を加え、４５分間インキュベーションし、さらにＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ［ザイムド ラボラトリーズ(Zymed Laboratories)社製］を加え、４５分間インキュベーションした。
【０１１５】
このようにして処理した形質転換ＣＯＳ−１細胞と形質転換していないＣＯＳ−１細胞をそれぞれベクタシールド マウンティング メディウム［Vectashield mounting medium 、ベクターラボ(Vector Labo) 社製］中にマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１６】
その結果、形質転換していないＣＯＳ−１細胞は全く染色されていないのに対し、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換した細胞では細胞表面が免疫蛍光染色されていることが確認された。すなわち、形質転換したＣＯＳ−１細胞中で硫酸基転移酵素が活性を発現しスルファチドを合成していることが示された。
【０１１７】
実施例４．組換え硫酸基転移酵素の物理化学的性質
実施例３で得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して得られた上清を組換え硫酸基転移酵素の酵素溶液とし、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って物理化学的性質を測定した。その結果を以下に示す。
【０１１８】
（１）至適ｐＨ
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示すように６〜８付近に高い活性を有していた。すなわち、図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。ｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍＭトリス緩衝液を使用し、活性測定を行った。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
【０１１９】
（２）至適温度
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示すように約４０℃付近で最大活性を示した。すなわち、図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。
【０１２０】
（３）ｐＨ安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素をそれぞれのｐＨにおいて６℃で１６時間保持した後、ｐＨを７．０に戻して酵素活性を測定してｐＨ安定性を調べた。緩衝液としてｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍＭトリス緩衝液を使用した。図３に示すように本発明の組換え硫酸基転移酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲で安定である。すなわち、図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸はｐＨを示す。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
【０１２１】
（４）熱安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を調べたところ図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の処理で８５％の活性が失われた。すなわち、図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。
【０１２２】
【発明の効果】
本発明により、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素遺伝子が提供される。また、該遺伝子を用いる硫酸基転移酵素活性を持つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法、該遺伝子からコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供される。
【０１２３】
【配列表】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【０１３８】
【０１３９】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【０１４３】
【０１４４】
【０１４５】
【０１４６】
【０１４７】
【０１４８】
【０１４９】
【０１５０】
【０１５１】
【０１５２】
【０１５３】
【０１５４】
【０１５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図２】図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す図である。
【図３】図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えＤＮＡおよび発現ベクター、該発現ベクターを導入した形質転換体、該形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法およびポリペプチド、前記遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ、前記遺伝子にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーならびに前記ポリペプチドに結合する抗体またはその断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞の膜に存在する糖タンパク質や糖脂質等の、いわゆる複合糖質と呼ばれる分子の糖鎖部分が持つ様々な生理機能が注目されている。糖鎖に結合した硫酸基は、種々の生物学的機能に関連して興味がもたれている。硫酸基は、ウイルス糖タンパク質、糖タンパク質性ホルモン、基底膜糖タンパク質、粘菌のリソソーム酵素などの糖鎖にエステル結合している他に、ムチンやムコ多糖、糖脂質の糖鎖にも種々の結合様式で結合している。しかし、その生物学的意義は今後の解明すべき問題として残されている。
【０００３】
これまでに基質特異性の異なる種々の硫酸基転移酵素の存在が知られている。例えば、糖タンパク質に働く硫酸基転移酵素としては、Ｎ−グリコシド型糖鎖のガラクトースの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry)、第２６４巻、第６号、第３３６４−３３７１頁（１９８９）〕、Ｎ−グリコシド型糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔バイオケミカル ジャーナル(Biochemical Journal) 、第３１９巻、第２０９−２１６頁（１９９６）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチルガラクトサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔グライコバイオロジー（Glycobiology) 、第５巻、第７号、第６８９−６９７頁（１９９５）〕、ムチン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー、第２７０巻、第４６号、第２７５４４−２７５５０頁（１９９５）〕、および脳下垂体で産生される糖タンパク質性ホルモン糖鎖のＮ−アセチルグルコサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６６巻、第２６号、第１７１４２−１７１５０頁（１９９１）〕等が知られている。
【０００４】
また、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）に働く硫酸基転移酵素としては、ヘパラン硫酸のイズロン酸の２位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナルオブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１巻、第１３号、第７６４５−７６５３頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第８号、第４１７２−４１７９頁（１９９５）〕、ヘパリンのイズロン酸の２位とＮ−硫酸化グルコサミンの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第４０号、第２４５３８−２４５４１頁（１９９４）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化グルコサミンの３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７１巻、第４３号、第２７０７２−２７０８２頁（１９９６）〕、ヘパラン硫酸のＮ−硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６３巻、第５号、第２４１７−２４２２頁（１９８８）〕、ヘパリンのＮ−硫酸化に働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６６巻、第１３号、第８０４４−８０４９頁（１９９１）〕、コンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンとケラタン硫酸のガラクトースの６位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素およびコンドロイチン硫酸のＮ−アセチルガラクトサミンの４位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第２９号、第２１９６８−２１９７４頁（１９９３）〕、角膜に存在するケラタン硫酸にのみ働く硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５９巻、第１９号、第１１７７１−１１７７６頁（１９８４）〕等が知られている。
【０００５】
さらに、糖脂質に働く硫酸基転移酵素としては、本発明の硫酸基転移酵素以外に、単クローン抗体ＨＮＫ−１で認識される糖鎖を合成する、グルクロン酸の３位に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６８巻、第１号、第３３０−３３６頁（１９９３）〕が知られている。
【０００６】
これらの中でクローニングされている複合糖質に働く硫酸基転移酵素としては、ラット肝由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−ヘパラン硫酸スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、 第２２号、第１５７４４−１５７５０頁（１９９２）］、ＭＳＴ細胞由来のヘパリン糖鎖の合成にかかわるＮ−硫酸基転移酵素［Ｎ−デアシラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２６９巻、第３号、第２２７０−２２７６頁（１９９４）］、ニワトリ胎児軟骨細胞（chick embryo chondrocytes)由来のコンドロイチン糖鎖の合成にかかわるＮ−アセチルガラクトサミンのＣ−６位に硫酸基を転移する酵素［コンドロイチン６−スルホトランスフェラーゼ、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２７０巻、第３１号、第１８５７５−１８５８０頁（１９９５）］が知られている。
【０００７】
本発明者らは、ガラクトースの３位の水酸基に硫酸基を付加する硫酸基転移酵素である３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕をヒト腎癌細胞株（ＳＭＫＴ−Ｒ３）より精製した〔ジャーナル オブ バイオケミストリー(Journal of Biochemistry) 、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕。該硫酸基転移酵素は、ヒト腎癌組織又はその細胞株で高発現しており、腎癌における硫酸化糖脂質の蓄積と相関しており、癌との関連が示唆されるが、そのアミノ酸配列は決定されておらず、その遺伝子もクローニングされていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
これまでに知られている硫酸基転移酵素を工業的に有利に製造しようとする場合、天然に存在する該酵素の量が少なかったり、プロテアーゼやスルファターゼ等の他の酵素の混在の為、目的の硫酸基転移酵素を純粋な形で、簡便かつ大量に単離することは非常に困難であった。
【０００９】
従って、硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的手法を用いて、安価に高純度な硫酸基転移酵素を製造する方法が求められている。従来、硫酸基転移酵素遺伝子のクローニングについて前述のような報告があるが、その数は著しく少ない。また、基質特異性の異なる硫酸基転移酵素が多数存在するため、前述の報告の硫酸基転移酵素遺伝子配列を用いて他の基質特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子を得ようとしても、基質特異性が異なる酵素間の遺伝子のホモロジーが低く、目的の硫酸基転移酵素遺伝子を得ることは困難である。ましてや、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素のアミノ酸配列や遺伝子構造は全く不明であるため、該硫酸基転移酵素をクローニングし、遺伝子工学的に製造することは困難である。
【００１０】
よって、本発明の第１の目的は、腎細胞に特徴的であり、特に腎癌細胞で高発現している、糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素遺伝子を提供することにある。本発明の第２の目的は、前記遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換体を用いる遺伝子工学的に高純度の硫酸基転移酵素を製造する方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、前記遺伝子がコードするポリペプチドを提供することにある。本発明の第４の目的は、本発明の遺伝子又はその一部に相補的なアンチセンスＤＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを提供することにある。本発明の第５の目的は、本発明の遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを提供することにある。本発明の第６の目的は、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以上の状況に鑑みてなされたものである。糖脂質糖鎖に働く硫酸基転移酵素の塩基配列及びアミノ酸配列を明らかにする為、該硫酸基転移酵素を高発現するヒト腎癌細胞株ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素について鋭意検討を重ねた結果、遂に該硫酸基転移酵素遺伝子の完全解明に成功した。更に該硫酸基転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法により工業的に有利で高純度な硫酸基転移酵素を簡便に製造することにも成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明の要旨は、
（１）配列表の配列番号：２に記載の塩基配列からなり、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離された遺伝子、
（２）前記（１）記載の遺伝子とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができ、かつＧａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（３）前記（１）又は（２）記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ、
（４）前記（３）記載の組換えＤＮＡを挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター、
（５）前記（４）記載の発現ベクターを導入されてなる形質転換体、並びに
（６）前記（５）記載の形質転換体を培養し、該培養物より硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの製造方法、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有する」（以下、硫酸基転移酵素活性を有すると略す場合がある）とは、下記に示すような作用および基質特異性を有する性質をいい、このような硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドとしては、下記の物理化学的性質を有するものが挙げられ、その一例がジャーナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載されている。
【００１４】
１．作用
Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する。
【００１５】
２．基質特異性
ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）、ガラクトシル １−アルキル−２−アシルグリセロール（ＧａｌＡＡＧ）、ガラクトシルジアシルグリセロール（ＧａｌＤＧ）、グルコシルセラミド（ＧｌｃＣｅｒ）、グロボテトラオシルセラミド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）、ガングリオトリアオシルセラミド（Ｇｇ３Ｃｅｒ）、ガングリオテトラオシルセラミド（Ｇｇ４Ｃｅｒ）、ネオラクトテトラオシルセラミド（ｎＬｃ４Ｃｅｒ）に反応し、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）、ガラクトース、ラクトースに反応しない。
【００１６】
３．至適ｐＨ及び安定ｐＨ
至適ｐＨは約７．０、安定ｐＨは６．０〜８．０。
４．至適温度及び安定温度
至適温度は約３７℃であり、８０℃まで安定である。
５．分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件下）により約５４ｋＤａである。
【００１７】
また、硫酸基転移酵素活性の測定方法としては、アナリティカル バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、第１８２巻、第９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正した方法が挙げられる。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製する。該混合液を３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で反応を停止する。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定する。１ユニットの活性は、前記測定条件下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量として定義する。該方法により測定した場合、１×１０-7ミリユニット以上の活性を示すものを、硫酸基転移酵素活性を有するものと判定する。
【００１８】
本発明において遺伝子とは、前記硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子又は該遺伝子を含む遺伝子である。具体的には配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子または配列表の配列番号：２に記載の塩基配列又はその一部からなる遺伝子が挙げられる。このように、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドをコードする遺伝子または配列番号：２に記載の塩基配列の一部からなる遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発明の範囲内である。これらは、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホスルフェート：ＧａｌＣｅｒスルホトランスフェラーゼ〔ＥＣ２．８．２．１１〕の遺伝子であるが、本発明においてはこれらに限定されるものではなく、同様の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎりその他のヒト組織由来の遺伝子はもちろん、細菌類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来の遺伝子、あるいは植物、動物由来の遺伝子も含まれる。さらに、機能的に同様の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする、前記遺伝子の変異体が挙げられる。例えば、配列表の配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換されているポリペプチドをコードする遺伝子であっても、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。このように天然から単離された遺伝子のみならず人為的に調製された遺伝子であっても硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかぎり本発明に含まれる。
【００１９】
また、本発明の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。
【００２０】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件を言う。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Denhardt's、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃で４時間〜一晩保温を行う条件を言う。
【００２１】
本発明において、組換えＤＮＡとは、遺伝子工学的手法により、本発明の遺伝子を含んで得られるＤＮＡである。
【００２２】
本発明において、発現ベクターとは、前記組換えＤＮＡを挿入され、所望の宿主細胞で発現するように構築されたベクターである。また、後述のアンチセンスＤＮＡを挿入したベクターも本発明の発現ベクターに含まれる。挿入されるベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクターいずれでも構わない。プラスミドベクターとしてはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＴ７などの市販品が好適に使用でき、ファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１等のラムダファージベクターなどの市販品が好適に使用できるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞としては、微生物、動物細胞又は植物細胞が挙げられ、用いる発現ベクターに応じて、適宜選ばれる。
【００２３】
本発明において、形質転換体とは、前記発現ベクターを前記宿主細胞に導入されて得られた、本発明の遺伝子を発現する細胞である。
発現ベクターを導入する方法としては、例えば、モレキュラー クローニングア ラボラトリー マニュアル［Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス(T. Maniatis) 他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory) 、１９８２年発行］、第２４９−２５４頁に記載の方法を用いることができる。次に、目的の遺伝子を発現する形質転換体を選択するためには、発現ベクターの特性を利用する。例えばプラスミドベクターがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで、大腸菌を宿主細胞とする場合、アンピシリンを含むプレート上でアンピシリン耐性を有するコロニーを、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示し、かつ、白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導入されたコロニーを選別する。
【００２４】
本発明は、本発明の遺伝子が発現され、該遺伝子がコードするポリペプチドが生産されるような条件下で前記形質転換体を培養することにより、該培養物から硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００２５】
目的の硫酸基転移酵素の発現が認められた場合は、その形質転換体の培養における培地組成、培地のｐＨ、培養温度、インデューサーの使用量・使用時期、培養時間等の条件が硫酸基転移酵素発現の最適条件を満たすように決定することにより、効率よく硫酸基転移酵素を生産させることができる。
【００２６】
形質転換体の培養物から硫酸基転移酵素を精製するには、公知の方法が用いられる。形質転換体が大腸菌のように細胞内に発現産物を蓄積させる場合は、培養終了後遠心分離によって該形質転換体を集め、これを超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等により、無細胞抽出液を得る。塩析あるいは、イオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフィー等の通常のタンパク質精製法により、該抽出液から目的の硫酸基転移酵素を精製することができる。用いる宿主−ベクター系によっては発現産物が形質転換体外に分泌される場合がある。この場合は培養上清から同様に精製を行えばよい。
【００２７】
用いる宿主−ベクター系によっては、形質転換体中で発現されたポリペプチドが不溶物（封入体）として蓄積される場合がある。この場合は、この不溶物を回収し、穏和な条件、例えば、尿素等の変性剤で可溶化した後に、変性剤を除くことによって活性を回復させることができる。
【００２８】
形質転換体が産生する外因性の硫酸基転移酵素は、宿主細胞内で内因性の種々の硫酸基転移酵素と共存するが、その量が内因性の硫酸基転移酵素の量に比べ過剰であるので、その精製は極めて容易である。また、硫酸基転移酵素が形質転換体外に分泌される場合は、培地成分等が共存するが、これらは通常硫酸基転移酵素の精製の妨げとなるようなタンパク質成分をほとんど含まないため、その精製には、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞からの硫酸基転移酵素の精製と比べ、煩雑な分離操作を必要としない利点がある。
【００２９】
また、真核生物由来の硫酸基転移酵素の場合、酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、宿主細胞として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌のような原核生物、あるいは酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能力を失った変異細胞を用いることによって、糖鎖を持たない硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。更に、酵素自身に糖鎖を付加させることも可能であり、この場合は、宿主細胞として、糖鎖生合成能力を有する細胞、例えば、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞を用いることによって、糖鎖を持つ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。
【００３０】
本発明のポリペプチドとは、前記の本発明の遺伝子によりコードされ、かつ硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドであり、前記のような各種の物理化学的性質を有するものが挙げられる。具体的には、天然型の硫酸基転移酵素である配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその一部からなるポリペプチド、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換されているポリペプチド等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、「アンチセンスＤＮＡ」及び「アンチセンスＲＮＡ」とは、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子又はその一部と相補的な塩基配列を有し、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子（ゲノムＤＮＡ及びｍＲＮＡ）と２本鎖を形成することによって、該遺伝子からの遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制又は制御するものを言う。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡの長さは、塩基配列の特異性や細胞内に導入する方法に応じて変えることが可能である。アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、合成機を用いて人工的に合成したり、通常と逆の向き（アンチセンスの向き）に遺伝子を発現させること等により、作製することが可能である。例えば、ｔａｔ遺伝子［ヌクレイック アシドズ リサーチ（Nucleic Acids Research) 、第１９巻、第３３５９−３３６８頁（１９９１）］、あるいはｒｅｖ遺伝子［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA)、第８６巻、第４２４４−４２４８頁（１９８９）］のＨＩＶの増殖抑制に関するもの等、アンチセンス技術は数多く知られており、従って、これらの方法により、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡを用いて、内因性の硫酸基転移酵素遺伝子の発現を抑制又は制御することが可能である。また、本発明のアンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、in situ ハイブリダイゼーション等の研究試薬として利用可能である。
【００３２】
本発明において、合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーとは、前記遺伝子に特異的にハイブリダイズするものである。該オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、通常、合成機を用いて人工的に合成したり、ＰＣＲ法により作製することができる。
【００３３】
本発明において、抗体又はその断片とは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片であれば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでも構わない。本発明の抗体は、例えば、カレント プロトコルズ イン イムノロジー〔Current Protocols in Immunology 、ジョン Ｅ．コリガン（John E.Coligan) 編集、ジョン ウィリー＆ソンズ（John Wiley & Sons, Inc.)、１９９２年発行〕に記載の方法により、本発明のポリペプチドの全部又は一部を用いてウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。これらの抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより、抗体の断片が得られる。得られた抗体又はその断片の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、医薬・診断薬・研究用試薬等が挙げられる。
【００３４】
次に、ウロロジカル リサーチ（Urological Research ）、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）記載のヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３を用い、該ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来の硫酸基転移酵素を一例にして、本発明について更に詳しく説明する。
まず、本発明の硫酸基転移酵素は、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞を大量に培養し、ついでその培養細胞から硫酸基転移酵素を単離精製する。具体的には、以下の方法が挙げられる。
【００３５】
ＥＧＦで処理したＳＭＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで−８０℃で保存する。約２．５×１０9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズする。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理する。遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析する。
【００３６】
透析した材料を遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去する。上清をＤＥ−５２カラムにアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラムに、直接出口を接続させる。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、バッファーＢでカラムを洗浄する。ＤＥ−５２カラムの接続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出する。
【００３７】
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透析する。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させておいたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セファロースカラムにアプライする。次いで、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３８】
ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析する。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡＰ）カラムに直接接続したピリドキサル５’−ホスフェート（ＰＬＰ）−セファロースカラムに、透析液をアプライする。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させる。
【００３９】
ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィーに直接供する。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させる。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５に濃縮される。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収される。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存される。
【００４０】
次に、精製された硫酸基転移酵素について、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えば、精製硫酸基転移酵素を直接常法に従ってエドマン分解法［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第２５６巻、第７９９０−７９９７頁（１９８１）］によるアミノ酸配列分析［プロテインシーケンサ４７６Ａ、アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems)社製］に供することにより、硫酸基転移酵素のＮ末端アミノ酸配列の１０〜２０残基を決定する。あるいは特異性の高いタンパク質加水分解酵素、例えば、アクロモバクター（Achromobacter ）由来プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプシン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣを用いて分離精製した後、精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
【００４１】
本発明においては、Ｐ１（配列番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ６（配列番号：１３）及びＰ７（配列番号：１４）の７つのペプチド断片のアミノ酸配列が決定される。
【００４２】
こうして得られる部分アミノ酸配列に基づき、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングする。そのためには、一般的に用いられるＰＣＲ法又はハイブリダイーゼーション法を利用する。ＰＣＲ法は、ＰＣＲテクノロジー［PCR Technology、エルリッヒ ＨＡ(Erhich HA) 編集、ストックトン プレス(Stockton Press)社、１９８９年発行］に記載の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイーゼーション法は、例えばモレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル( 第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバーラボラトリー プレス社、１９８９年発行) に記載の方法に準じて行うことができる。
【００４３】
しかしながら、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子は、以下のような混合プライマー（配列番号：２２〜２７）を用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）、イノシンを含む混合プライマー（配列番号：２８〜３３）を用いるＭＯＰＡＣ法及び合成オリゴヌクレオチド（配列番号：２２、２４）を用いるハイブリダイゼーション法を試みたが、クローニングすることができなかった。
【００４４】
１）混合プライマーを用いるＰＣＲ法（ＭＯＰＡＣ法）
この方法は、決定されたアミノ酸配列のうち縮重性の低い領域を２カ所選択し、縮重コドンに対して可能性のある全ての塩基配列の組み合わせを合成し、混合プライマーとしＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅するクローニング方法である。
この方法により、尿酸酸化酵素をコードする遺伝子はクローニングされている〔サイエンス、第２３９巻、第１２８８−１２９１頁（１９８８）〕。
本発明者らもこの方法に従って、本発明の硫酸基転移酵素の取得を試みた。
【００４５】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）と合成オリゴヌクレオチドＡ１（配列番号：２３）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）と合成オリゴヌクレオチドＡ２（配列番号：２５）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳ３（配列番号：２６）と合成オリゴヌクレオチドＡ３（配列番号：２７）をそれぞれ合成し、これらを混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
【００４６】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離した結果、複数のＤＮＡ断片が増幅されたので、それぞれ別々にゲルから切り出し、抽出し、プラスミドベクターに組み込んだ後、塩基配列を常法（ジデオキシ チェーン ターミネーター法）に従い決定したが、混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかった。
【００４７】
２）イノシンを用いるＭＯＰＡＣ法
１）と方法はほぼ類似しているが、混合プライマーの組み合わせ数を減少させるため、縮重性の高いコドンの３番目をイノシンに置換したプライマーを用いる〔ヌクレイック アシドズ リサーチ、第１６巻、第２２号、第１０９３２頁（１９８８）〕。
【００４８】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ１（配列番号：２８）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ１（配列番号：２９）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ２（配列番号：３０）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ２（配列番号：３１）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチドＳＩ３（配列番号：３２）と合成オリゴヌクレオチドＡＩ３（配列番号：３３）をそれぞれ合成し、これらをイノシン含有混合プライマーとして用い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを常法に従い行った。
【００４９】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を上述の方法と同様に決定したが、イノシン含有混合プライマーとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見出すことができなかった。
【００５０】
３）合成オリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション法
アミノ酸配列の情報をもとに、常法に従って合成オリゴヌクレオチドをデザインし、ハイブリダイゼーションによって目的のＤＮＡをクローニングする方法も一般的に用いられる。本発明者らもこの方法に従って本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の検出を試みた。
【００５１】
部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドＳ１（配列番号：２２）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチドＳ２（配列番号：２４）を合成し、プラークハイブリダイゼーション用のプローブとして用いた。ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを、常法に従いファージベクターに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをプレートにまき、得られたプラークをナイロン膜にブロッティングした。ハイブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行った。
【００５２】
その結果、プローブとして用いた合成オリゴヌクレオチドＳ１及びＳ２のどちらの場合にも複数の陽性プラークが検出されたが、これら陽性プラークのファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を常法に従い決定したところ、プローブとして用いた合成オリゴヌクレオチドの塩基配列にホモロジーを示す配列は得られたが、ファージベクターに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列から決定したアミノ酸配列は上記の部分アミノ酸配列とのホモロジーはなく、目的の硫酸基転移酵素遺伝子と考えられる配列を見出すことができなかった。
【００５３】
以上に述べたように、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡから本発明の硫酸基転移酵素遺伝子をクローニングすることは非常に難しい。硫酸基転移酵素遺伝子はＧ＋Ｃ含量が高いため二次構造を取りやすく、それゆえポリメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニーリングが起こるなどして、ＰＣＲ法において非特異的ＤＮＡ断片の増幅が起こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点を考慮し鋭意検討を重ねた結果、アミノ酸配列の判明している一つのペプチド断片に対応する短い遺伝子断片をＰＣＲ法で増幅することにした。
【００５４】
ＰＣＲ法のプライマーとしては、混合プライマーの組合わせ数を減らすためにイノシンを用いるとともに、アミノ酸のロイシンに対しては使用頻度の高いコドンを採用し、セリンに対するコドンの組合わせを複数用意することにより塩基配列の縮重性を減少させたものを合成するのが好ましい。これにより、初めて本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を増幅することが可能となる。次に、この増幅されたＰＣＲ産物をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことにより、非特異的ＤＮＡ断片の中から目的の硫酸基転移酵素遺伝子由来のＤＮＡ断片を見出すことに成功したのである。
【００５５】
以下、より詳細に説明すれば、ＰＣＲ法のプライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチド１Ｓｄ（配列番号：６）と合成オリゴヌクレオチド１Ａ（配列番号：７）をそれぞれ合成し、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。
【００５６】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を、例えばジデオキシ チェーン ターミネーター法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７４巻、第１２号、第５４６３−５４６７頁（１９７７）］により決定したところ、部分アミノ酸配列Ｐ１をコードする配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部が得られる。この塩基配列を基に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番号：８）を合成し、この合成オリゴヌクレオチドＯＰ１を常法に従い３’−末端標識し、ハイブリダイゼーション用のプローブとする。
【００５７】
また、ＰＣＲ法のプライマーとして新たに部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成オリゴヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）と部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成オリゴヌクレオチド３Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成して、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行う。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、常法に従いナイロン膜にブロッティングし（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版、Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１９８９年発行）、３’−末端標識合成オリゴヌクレオチドＯＰ１を用いたハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、前記したように、ストリンジェントな条件下で行い、標識に応じた検出法を用いて、該プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出する。
【００５９】
その結果、約６００ｂｐの位置に合成オリゴヌクレオチドＯＰ１とハイブリダイズするバンドを得る。この断片の塩基配列を前記したように決定したところ、硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）と部分アミノ酸配列Ｐ４（配列番号：１１）に対応する配列が見出され、目的の硫酸基転移酵素遺伝子の一部を取得したことを確認する。
【００６０】
一方、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製法は、モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル、第２版（Ｔ．マニアティス他著、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス社、１９８９年発行）、第８章に記載の方法を用いることができる。
【００６１】
更に、前記約６００ｂｐのＤＮＡ断片をプローブにして、前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、硫酸基転移酵素全長をコードする遺伝子をクローニングすることができる。また、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞由来のゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移酵素のゲノムＤＮＡを得ることも可能である。
【００６２】
以上のようにして得られる、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞の産生する硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列は、配列表の配列番号：２に記載したものであり、これからコードされる全アミノ酸配列は配列表の配列番号：１に記載したものである。また、このアミノ酸配列及び塩基配列と公知の基質特異性の異なる硫酸基転移酵素遺伝子とはホモロジーはなく、全く新しい配列である。
【００６３】
本発明により硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列が明らかになったことで、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡをクローニングすることができる。
【００６４】
また、本発明の硫酸基転移酵素の塩基配列に基づき、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いて、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞以外の生物体由来のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーから、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子と相同性の高いＤＮＡ断片を検出したり、さらにはその全長の遺伝子を得ることもできる。
【００６５】
得られた遺伝子が目的の硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を本発明の硫酸基転移酵素の塩基配列又はアミノ酸配列と比較してその相同性から推定することもできる。さらに、前記の測定方法により硫酸基転移酵素活性を測定し、１×１０-7ミリユニット以上の活性を示すものを本発明のポリペプチドをコードする遺伝子として判定する。
【００６６】
同様の硫酸基転移酵素活性を有する機能的同等物を製造するには、例えば、次の方法が挙げられる。本発明の硫酸基転移酵素遺伝子群を用いて、ランダム変異あるいは部位特異的変異を導入することにより、天然の硫酸基転移酵素のアミノ酸配列中に、１個又は数個のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入又は置換を生じさせる遺伝子が得られる。これにより、天然の硫酸基転移酵素と同様の活性を有するが、至適温度、安定温度、至適ｐＨ、安定ｐＨ等の性質が少し異なった硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を得ることが可能であり、遺伝子工学的にこれらの硫酸基転移酵素を製造することが可能である。
【００６７】
ランダム変異を導入する方法としては、例えば、ＤＮＡを化学的に処理する方法として、亜硫酸水素ナトリウムを作用させシトシン塩基をウラシル塩基に変換するトランジション変異を起こさせる方法［プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第７９巻、第１４０８−１４１２頁（１９８２）］、生化学的方法として、［α−Ｓ］ｄＮＴＰ存在下で２本鎖を合成する過程で塩基置換を生じさせる方法［ジーン(Gene)、第６４巻、第３１３−３１９頁（１９８８）］、ＰＣＲを用いる方法として、反応系にマンガンを加えてＰＣＲを行い、ヌクレオチドの取込の正確さを低くする方法［アナリティカル バイオケミストリー、第２２４巻、第３４７−３５３頁（１９９５）］等が知られている。
【００６８】
部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法［ギャップド デュプレックス（gapped duplex)法、ヌクレイック アシドズリサーチ、第１２巻、第２４号、第９４４１−９４５６頁（１９８４）］、制限酵素部位を利用する方法［アナリティカル バイオケミストリー、第２００巻、第８１−８８頁（１９９２）、ジーン、第１０２巻、第６７−７０頁（１９９１）］、ｄｕｔ（dUTPase ）とｕｎｇ（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ）変異を利用する方法［クンケル（Kunkel) 法、プロシーディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８２巻、第４８８−４９２頁（１９８５）］、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼを用いたアンバー変異を利用する方法［オリゴヌクレオチド−ダイレクティッド デュアル アンバー（Oligonucleotide-directed Dual Amber 、ＯＤＡ）法、ジーン、第１５２巻、第２７１−２７５頁（１９９５）］、制限酵素の認識部位を付加した２種類の変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法（ＵＳＰ ５，５１２，４６３）等が知られている。
【００６９】
また、市販されているキットを使用することにより、部位特異的変異を容易に導入することができる。市販のキットとしては、例えば、ギャップド デュプレックス法を用いたミュータン−Ｇ（Mutan R -G、宝酒造社製）、クンケル法を用いたミュータン−Ｋ（Mutan R -K、宝酒造社製）、ＯＤＡ法を用いたミュータン−エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Express Km 、宝酒造社製）、変異導入用プライマーとピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus ）由来ＤＮＡポリメラーゼを用いたクイックチェンジ サイト−ダイレクティッド ミュータジェネシス キット［QuikChangeTM Site-directed Mutagenesis Kit、ストラタジーン（STRATAGENE）社製］等があり、更に、ＰＣＲ法を利用する方法として、ＴａＫａＲａ ＬＡ−ＰＣＲ イン ビトロ ミュータジェネシス キット（TaKaRa LA-PCR in vitro Mutagenesis Kit、宝酒造社製）、ミュータン−スーパー エキスプレス Ｋｍ（Mutan R -Super Express Km 、宝酒造社製）等が挙げられる。
【００７０】
このように、本発明により、ヒト腎癌細胞ＳＭＫＴ−Ｒ３由来の硫酸基転移酵素の一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの安価で高純度な遺伝子工学的な製造方法が可能となる。
また、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子に特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子の検索、検出や増幅等に有用である。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片は、本発明の硫酸基転移酵素の検索、検出や精製等において有用である。
【００７１】
なお、本発明の硫酸基転移酵素遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造した本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、および熱安定性は、以下に示すように天然の硫酸基転移酵素〔ジャーナル オブ バイオケミストリー、 第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）〕とほぼ同様の結果が得られている。
【００７２】
（１）至適ｐＨ
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示すように６〜８付近に高い活性を有している。
（２）至適温度
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示すように約４０℃付近で最大活性を示す。
（３）ｐＨ安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性は、図３に示すようにｐＨ６〜１０の範囲で安定である。
（４）熱安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性は、図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の処理で８５％の活性が失われる。
【００７３】
【実施例】
以下、実験例、実施例を挙げて本発明を具体的に示すが、本発明は以下の実施例等になんら限定されるものではない。
【００７４】
実験例１．ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞からの硫酸基転移酵素の精製
５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで１２〜２４時間処理したＳＭＫＴ−Ｒ３細胞（約１×１０10個）を集め、ＰＢＳで洗浄後、使用するまで−８０℃で保存した。２．５×１０9 個の細胞を融解し、細胞と等容量のＴＢＳに懸濁し、ポッター型ホモジナイザーで短時間でホモジナイズした。ホモジネートに等容量の２×溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、２％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、４０％グリセロール、０．５ｍＭ ＰＭＳＦおよび０．０２ｍＭ Ｅ−６４）を加え、氷上で１０分間超音波処理した。１００，０００×ｇで１時間遠心分離後、得られる上清をバッファーＡ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１０％グリセロールおよび５ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）に対して透析した。
【００７５】
透析した材料を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、透析中に生じた沈殿物を除去した。上清をＤＥ−５２カラム[ ３×２０ｃｍ、ワットマン(Whatman) 社製] にアプライし、バッファーＢ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、１０％グリセロールおよび５ｍＭＭｎＣｌ2 ）で予め平衡化させておいたヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム [２×１０ｃｍ、ファルマシア バイオテク(Pharmacia Biotech) 社製] に、直接出口を接続させた。次いで、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０２未満になるまで、４０ｍｌ／ｈの流速でバッファーＢでカラムを洗浄した。ＤＥ−５２カラムの接続を外した後、ヘパリン−セファロースＣＬ６Ｂカラム上の酵素を、０．２ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣ（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１％ＬｕｂｒｏｌＰＸ、２０％グリセロールおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ2 ）で溶出した。
【００７６】
ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、バッファーＢに対して透析した。透析液を、予めバッファーＢで平衡化させておいたガラクトシルスフィンゴシン（ＧａｌＳｐｈ）−セファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシア バイオテク社製）に５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。次いで、溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＢでカラムを洗浄し、０．１ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
【００７７】
ＧａｌＳｐｈ−セファロースカラムの溶出画分をプールし、１０％グリセロールを含む１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対して透析した。予めバッファーＤ（１０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．０５％ＬｕｂｒｏｌＰＸおよび１０％グリセロール）で平衡化させておいたＨｉＴｒａｐ ３’，５’−ビスホスホアデノシン（ＰＡＰ）カラム（５ｍｌのベッド体積、ファルマシア バイオテク社製）に直接接続したピリドキサル５’−ホスフェート（ＰＬＰ）−セファロースカラム（１×１０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社製）に、透析液を５ｍｌ／ｈの流速でアプライした。溶出液が実質的にタンパク質を含まなくなるまで、バッファーＤとバッファーＢで連続してカラムを洗浄し、バッファーＤ中０〜０．３ｍＭのＰＡＰの直線グラジエントで、硫酸基転移酵素を溶出させた。
【００７８】
ＨｉＴｒａｐ ＰＡＰクロマトグラフィーの酵素活性画分をプールし、予めバッファーＤで平衡化させておいた第２のヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィー（０．３ｍｌのベッド体積）に直接供した。バッファーＤでカラムを洗浄後、０．３ＭのＮａＣｌを含むバッファーＣで、０．３ｍｌの画分で本発明の硫酸基転移酵素を溶出させた。この工程により、酵素調製品は初期体積の約１／５に濃縮された。前記クロマトグラフィー由来の酵素調製品に含まれるＰＡＰは、フロースルー画分に回収された。精製酵素活性画分をプールし、２０％のグリセロールの存在下、−８０℃で保存した。得られた精製酵素の活性を、実験例２に記載の方法により測定したところ、１．２ユニット／ｍｇであった。
【００７９】
実験例２．精製硫酸基転移酵素の作用、基質特異性、物理化学的性質の検討
アナリティカル バイオケミストリー、第１８２巻、第９−１５頁（１９８９）に記載の方法を若干修正して、実験例１で得られた本発明の精製硫酸基転移酵素の活性を測定した。すなわち、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒ、０．５μｍｏｌのＭｎＣｌ2 、１ｎｍｏｌの〔35Ｓ〕ＰＡＰＳ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、０．５ｍｇのＬｕｂｒｏｌ ＰＸ、１２．５ｎｍｏｌのジチオスレイトール、０．２５μｍｏｌのＮａＦ、０．１μｍｏｌのＡＴＰ、２０μｇのＢＳＡ、および２５ｍＭのカコジル酸Ｎａ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５中の２０ｎｇの酵素タンパク質を含む反応混合液を、全量５０μｌに調製した。また、基質特異性を調べるために、５ｎｍｏｌのＧａｌＣｅｒの代わりに２５ｎｍｏｌの種々の基質を受容体として用いた。３７℃で３０分間インキュベートした後、１ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（３０：６０：８）で反応を停止した。ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５を用いて反応生成物を単離し、液体シンチレーションカウンターを使用して放射活性を測定した。受容体を欠いた前記反応混合液を用いて得られたブランク値に対して、測定値を補正した。１ユニットの活性は、前記測定条件下で、１分間に１μｍｏｌの硫酸基を転移する酵素の量として定義した。
【００８０】
【表１】
表１より、本発明の精製硫酸基転移酵素は、ＧａｌＣｅｒを最良の基質とし、ＬａｃＣｅｒを第２位の基質とした。ＧａｌＡＡＧおよびＧａｌＤＧも基質として用いられる。また、本発明の精製硫酸基転移酵素は、ＧａｌＣｅｒと比べて１０％未満の比活性であるけれども、ＧｌｃＣｅｒ、Ｇｂ４Ｃｅｒ、Ｇｇ３Ｃｅｒ、Ｇｇ４ＣｅｒおよびｎＬｃ４Ｃｅｒに対しても作用した。しかし、Ｇｂ３Ｃｅｒには、作用しなかった。
【００８２】
本発明の精製硫酸基転移酵素の他の性質としては、０．１Ｍまでの濃度のＮａＣｌにより、硫酸基転移活性が増強されたが、０．１Ｍを越える濃度では活性を阻害した。Ｋm 値は、ＧａｌＣｅｒおよびＰＡＰＳに対して、それぞれ、２７μＭ、２５μＭであった。また、ｐＨ６．５〜７．０の間で、本発明の精製硫酸基転移酵素は最大活性を示した。また、２０％グリセリンの存在下で−８０℃で保存した場合、少なくとも３ヶ月間は失活を認めなかった。
【００８３】
Laemmli の方法〔ネイチャー（Nature) 、第２２７巻、第６８０−６８５頁（１９７０）〕により、本発明の精製硫酸基転移酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。５％β−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファー中で処理した場合に（還元条件下）、約５４ｋＤａの分子量を有する単一のバンドが得られた。
【００８４】
実施例１．硫酸基転移酵素遺伝子のクローニング
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
前記ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株［ウロロジカル リサーチ、第１７巻、第３１７−３２４頁（１９８９）］より全ＲＮＡを抽出［アナリティカル バイオケミストリー、第１６２巻、第１５６−１５９頁（１９８７）］し、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡをオリゴテックス−ｄＴ３０（OligotexTM-dT30 、宝酒造社製）を用いて精製した。精製したポリ（Ａ）+ ＲＮＡから、スーパースクリプト チョイス システム［SUPERSCRIPT TM Choice System、ライフ テクノロジーズ(Life Technologies) 社製］を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた２本鎖ｃＤＮＡにEco R I アダプター（ライフテクノロジーズ社製）を結合させたｃＤＮＡ断片と、制限酵素Eco RIで消化したλｇｔ１０ファージベクター（ファルマシア バイオテク社製）とをライゲーションを行い、その後、レディ−トゥ−ゴー ラムダ パッケージング キット［Ready-To-Go TM Lambda Packaging Kit 、ファルマシアバイオテク社製］ を用いてイン ビトロでパッケージングを行い、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーとした。
【００８５】
（２）硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列の決定
実験例１で精製した硫酸基転移酵素１０μｇを６Ｍ塩酸グアニジウムを含む１ｍＭＥＤＴＡ溶液（１ｍｌ）に溶解させ、２−メルカプトエタノールを２μｌ加え、窒素封入し、３７℃、２時間保温し還元した。その後、４−ビニルピリジンを１０μｌ加え、窒素封入し、３７℃、２時間保温することにより、Ｓ−ピリジルエチル化を行った。
【００８６】
こうして得られたピリジルエチル化酵素タンパク質を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）［システム：Ｗａｔｅｒｓ６２５ＬＣ、ミリポア(Millipore) 社製、カラム：コスモシール(Cosmosil)５Ｃ４−ＡＲ−３００、４．６×５０ｍｍ、ナカライテスク社製、流速：０．４ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸溶液（ＴＦＡ）、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、５５分間で溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］に供すことにより、精製した。
【００８７】
精製したＳ−ピリジルエチル化酵素タンパク質（約２μｇ／ｍｌ）を、３Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）４００μｌに溶解し、０．３μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）で、３７℃、１２時間消化した。
【００８８】
得られた消化物からペプチド断片をＲＰ−ＨＰＬＣ［システム：モデル１３０Ａ、アプライド バイオシステムズ社製、カラム：ＯＤ−３００Ｃ，アクアポア(Aquapore)、７μｍ、１．０×２５０ｍｍ、アプライド バイオシステムズ社製、流速：０．１ｍｌ／分、溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ溶液、溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液Ｂの割合を０％に、その後、８５分間で溶出液の割合を７０％にまで直線的に上げた］により、分離精製した。
【００８９】
分離したペプチド断片を常法に従って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分析（プロテイン シークエンサー モデル４９２、アプライド バイオシステムズ社製）に供して、部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）、Ｐ２（配列番号：４）、Ｐ３（配列番号：５）、Ｐ４（配列番号：１１）、Ｐ５（配列番号：１２）、Ｐ６（配列番号：１３）、Ｐ７（配列番号：１４）を決定した。
【００９０】
（３）プライマーの合成
前記（２）で決定した部分アミノ酸配列Ｐ１（配列番号：３）から合成ヌクレオチド１Ｓａ（配列番号：１５）、１Ｓｂ（配列番号：１６）、１Ｓｃ（配列番号：１７）、１Ｓｄ（配列番号：６）、１Ａ（配列番号：７）を、部分アミノ酸配列Ｐ２（配列番号：４）から合成ヌクレオチド２Ｓａ（配列番号：９）、２Ｓｂ（配列番号：１８）、２Ａａ（配列番号：１９）、２Ａｂ（配列番号：２０）を、部分アミノ酸配列Ｐ３（配列番号：５）から合成ヌクレオチド３Ｓ（配列番号：２１）、３Ａ（配列番号：１０）をそれぞれ合成し（ＤＮＡシンセサイザ モデル３９２、アプライド バイオシステムズ社製）、合成ヌクレオチドプライマーとした。
【００９１】
合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄ、２Ｓａ、２Ｓｂ、３Ｓはセンス方向のプライマーであり、合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ａ、２Ａａ、２Ａｂ、２Ａ、３Ａはアンチセンス方向のプライマーである。
【００９２】
ハイブリダイゼーションの際にプライマーが相互結合をすることを防ぐ目的で、全てのオリゴヌクレオチドの合成においてはデオキシイノシンによる塩基置換を行った。デオキシイノシン置換はコドンの重なりが２よりも多いアミノ酸残基部分について行った。また、セリン残基をコードする部分についてはＴＣＸとＡＧ（Ｔ／Ｃ）の2 種のうちいずれかのコドンを有するオリゴヌクレオチドの組合せを用意した。
【００９３】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ法による硫酸化転移酵素遺伝子の検索
全液量２０μｌ中、ＳＭＫＴ−Ｒ３細胞より抽出したポリ（Ａ）+ ＲＮＡ２μｇ、４０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）12-18 プライマー（ライフ テクノロジーズ社製）、各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素［スーパースクリプトＩＩＲＮａｓｅＨ- 逆転写酵素（SUPERSCRIPT TMII RNase H- Reverse Transcriptase)、ライフ テクノロジーズ社製] ２００ユニットを含む反応系で、３７℃、１時間、逆転写反応を行った。この反応液の内４μｌを鋳型とし、前記各１００ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマー（センス方向プライマーとアンチセンス方向プライマー）と各０．２５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ〔パーキン エルマー(Perkin Elmer)社製〕１．２５ユニットを含む全液量５０μｌの反応系でＰＣＲ反応を行った（ＲＴ−ＰＣＲ）。反応条件は、９４℃で３０秒間（変性）、４５〜５５℃で３０秒間（プライマーのアニーリング）、７２℃で１〜２分間（合成反応）のサイクルを３５サイクル行った。
【００９４】
このＰＣＲ反応後の反応液全量を２％アガロースゲル電気泳動を行った後、ゲルからＤＮＡ断片を切り出し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター[ ノバジェン(Novagen) 社製] を用いてサブクローニングを行った。これらのＤＮＡ断片の塩基配列をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いたジデオキシ チェーン ターミネーター法〔ダイ ターミネーター サイクル シークエンシング キット(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit) 、パーキン エルマー社製、ＤＮＡシークエンサー モデル３７３Ａ、アプライド バイオシステムズ社製〕で決定した。
【００９５】
初めに４種のセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ｓａ、１Ｓｂ、１Ｓｃ、１Ｓｄとアンチセンス方向の合成オリゴヌクレオチドプライマー１Ａを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、１Ｓｄと１Ａの組合せで４７ｂｐのｃＤＮＡ断片と２Ｓａと３Ａの組合せで約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片が増幅された。
【００９６】
このｃＤＮＡ断片の内、４７ｂｐのｃＤＮＡ断片をサブクローニンし塩基配列を決定した結果、そこから予想されるアミノ酸配列と部分アミノ酸配列Ｐ１のアミノ酸配列が一致した。
【００９７】
次に、この４７ｂｐのｃＤＮＡ断片の塩基配列を基にして混合オリゴヌクレオチドＯＰ１（配列番号：８）を合成し、その３’末端をジゴキシゲニン（ＤＩＧ）オリゴヌクレオチド テイリング キット[DIG oligonucleotide Tailing Kit、ベーリンガー マンハイム(Boehringer Mannheim) 社製] を用いてターミナルトランスフェラーゼでＤＩＧ標識した。
【００９８】
ＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯＰ１をプローブとして、前記ＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に対してサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００９９】
まず、ＲＴ−ＰＣＲで得られた約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動を行った後、ナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社製）にＤＮＡを転写した。このナイロン膜を用いて、２ｐｍｏｌ／ｍｌのＤＩＧ標識混合オリゴヌクレオチドＯＰ１、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガー マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５５℃、４時間、ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテクション キット（DIG Luminescent Detection Kit 、ベーリンガー マンハイム社製）を用いて行った。
【０１００】
その結果、合成オリゴヌクレオチドプライマー２Ｓａと３Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲで増幅された約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片に、ＯＰ１プローブがハイブリダイズした。
【０１０１】
この約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片をサブクローニングし、塩基配列を決定した結果、この約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片中に部分アミノ酸配列Ｐ１とＰ４をコードする配列が見出された。
【０１０２】
（５）硫酸基転移酵素遺伝子を含むｃＤＮＡ断片のクローニング
実施例１の（１）で調製したＳＭＫＴ−３細胞株由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離するために、プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。
【０１０３】
実施例１の（４）で得られた約６００ｂｐのｃＤＮＡ断片を鋳型とし、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを用いてＤＩＧ標識［ＤＩＧ ＲＮＡ ラベリング キット(DIG RNA Labeling Kit)、ベーリンガー マンハイム社製］されたＲＮＡプローブを合成した。
【０１０４】
約２×１０5 個のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーと大腸菌ＬＥ３９２を混合し、９×１３ｃｍの角シャーレ１０枚に、１枚当たり２×１０4 個のプラークを形成させた。次に、得られたプラークをナイロン膜（ベーリンガー マンハイム社製）上に写し、４℃で１時間保温した後、アルカリ変性（０．５ＮＮａＯＨ、１．５ＭＮａＣｌ、５分間）、中和［１．５ＭＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３分間を２回、その後、２×ＳＳＣで２分間を１回］を行った。このフィルターを用いて、ナイロン膜１ｃｍ2 当たり１ｎｇのプローブ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬（ベーリンガーマンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳを含む溶液中、５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。検出はＤＩＧ ルミネッセント ディテクション キット（ベーリンガー マンハイム社製）を用いて行った。その結果、６個の陽性ラムダファージクローンが得られた。これらのクローンからプラスミドを調製し、その挿入ｃＤＮＡ断片を制限酵素Eco RI（宝酒造社製）で切り出し、Eco RI消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクター（ストラタジーン社製）を用いてサブクローニングした。
【０１０５】
その結果、最長約１．８ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を有しているプラスミドが得られ、このプラスミドをｐＢＳ−ｈＣＳＴ１と命名した。その塩基配列を決定したところ、４３２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする読みとり枠（ＯＲＦ）が見いだされた。このＯＲＦ中に、前記精製硫酸基転移酵素の部分アミノ酸配列分析により得られたアミノ酸配列が全て見いだされた。
【０１０６】
以上の結果より、硫酸基転移酵素遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定された。硫酸基転移酵素をコードする塩基配列を配列表の配列番号：２に、その塩基配列からコードされるアミノ酸配列を配列表の配列番号：１に示す。
【０１０７】
実施例２．硫酸基転移酵素ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
実施例１で得られたプラスミドｐＢＳ−ｈＣＳＴ１を制限酵素Eco RIで消化し、得られたＤＮＡ断片を哺乳類発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア バイオテク社製）のEco RI部位に挿入した。挿入ＤＮＡ断片の方向は制限酵素の切断地図を基に決定した。得られた挿入方向が正の方向と逆の方向の互いに異なる発現プラスミドを、それぞれ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴとｐＳＶ−ｈＣＳＴＲと命名した。
【０１０８】
これらのプラスミドのうちｐＳＶ−ｈＣＳＴを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、形質転換体を得た。該形質転換体は、Escherichia coli JM109／pSV-hCSTと命名され、Escherichia coli JM109／pSV-hcSTと表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５８１１として寄託されている。
【０１０９】
実施例３．組換え硫酸基転移酵素遺伝子のＣＯＳ−１細胞における発現
直径３５ｍｍのディッシュに、２×１０5 個のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）を蒔き、次の日に実施例２で得られた発現プラスミドｐＳＶ−ｈＣＳＴ又はｐＳＶ−ｈＣＳＴＲを１μｇとリポフェクトアミン（LIPOFECTAMINE TM ライフ テクノロジーズ社製）５μｌを加えることにより、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。その後、３７℃で７２時間培養後、得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を２ｍｌの冷ＴＢＳ（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．２ｍｌの０．１％トリトン（TritonR ）Ｘ−１００を含むＴＢＳを加え、シリコンスクレーパー［silicon scraper 、ファルコン(Falcon)社製］を用いて採集した。
【０１１０】
次に、採集した形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して上清を回収した。
【０１１１】
得られた上清を酵素溶液として、上清の硫酸基転移酵素活性をジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って測定し、また、同時にこの上清のタンパク質濃度をＢＣＡ プロテイン アッセイ試薬[BCA Protein Assay Reagent、ピアス(PIERCE)社製] を用いて測定した。
【０１１２】
その結果、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の比活性は１．８×１０-5Ｕ／ｍｇ（蛋白質）であった。これはコントロールとしてｐＳＶＫ３を導入したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の活性の約１６倍であり、また、ｐＳＶ−ｈＣＳＴＲで形質転換したＣＯＳ−１細胞の細胞抽出画分中の活性の約８倍であった。
【０１１３】
次に、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換したＣＯＳ−１細胞が、硫酸化糖脂質を発現しているかどうかを調べた。
【０１１４】
まず、１０4 個のＣＯＳ−１細胞をＬａｂ−Ｔｅｋ チャンバー スライド[Lab-Tek chamber slide、ヌンク(Nunc)社製] に入れ、ｐＳＶ−ｈＣＳＴを１μｇ、リポフェクトアミン（ライフ テクノロジーズ社製）１μｌを加えて形質転換させた。その後、３７℃で４８時間培養後、形質転換ＣＯＳ−１細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、１％パラホルムアルテヒドを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で固定し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）でブロックした。これに抗スルファチドモノクローナル抗体Ｓｕｌｐｈ１［バイオケミカル ジャーナル、 第２５１巻、第１７−２２頁（１９８８）］を加え、４５分間インキュベーションし、さらにＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ［ザイムド ラボラトリーズ(Zymed Laboratories)社製］を加え、４５分間インキュベーションした。
【０１１５】
このようにして処理した形質転換ＣＯＳ−１細胞と形質転換していないＣＯＳ−１細胞をそれぞれベクタシールド マウンティング メディウム［Vectashield mounting medium 、ベクターラボ(Vector Labo) 社製］中にマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１６】
その結果、形質転換していないＣＯＳ−１細胞は全く染色されていないのに対し、ｐＳＶ−ｈＣＳＴで形質転換した細胞では細胞表面が免疫蛍光染色されていることが確認された。すなわち、形質転換したＣＯＳ−１細胞中で硫酸基転移酵素が活性を発現しスルファチドを合成していることが示された。
【０１１７】
実施例４．組換え硫酸基転移酵素の物理化学的性質
実施例３で得られた形質転換ＣＯＳ−１細胞を氷中で超音波処理を行い、細胞を破砕した。これを遠心分離して得られた上清を組換え硫酸基転移酵素の酵素溶液とし、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１９巻、第３号、第４２１−４２７頁（１９９６）に記載の方法に従って物理化学的性質を測定した。その結果を以下に示す。
【０１１８】
（１）至適ｐＨ
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨは、図１に示すように６〜８付近に高い活性を有していた。すなわち、図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸はｐＨを示す。ｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍＭトリス緩衝液を使用し、活性測定を行った。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
【０１１９】
（２）至適温度
本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度は、図２に示すように約４０℃付近で最大活性を示した。すなわち、図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。
【０１２０】
（３）ｐＨ安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素をそれぞれのｐＨにおいて６℃で１６時間保持した後、ｐＨを７．０に戻して酵素活性を測定してｐＨ安定性を調べた。緩衝液としてｐＨ３．０〜６．０においては５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０においては５０ｍＭカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０においては５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ８．０〜１０．０においては５０ｍＭトリス緩衝液を使用した。図３に示すように本発明の組換え硫酸基転移酵素は、ｐＨ６〜１０の範囲で安定である。すなわち、図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸はｐＨを示す。図中、黒四角印は酢酸緩衝液を、黒丸印はカコジル酸緩衝液を、黒三角印はトリエタノールアミン緩衝液を、×印はトリス緩衝液を示す。
【０１２１】
（４）熱安定性
本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を調べたところ図４に示すように３０℃では安定であるが、４０℃、３０分間の処理で８５％の活性が失われた。すなわち、図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す図であり、縦軸は残存活性（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。
【０１２２】
【発明の効果】
本発明により、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素遺伝子が提供される。また、該遺伝子を用いる硫酸基転移酵素活性を持つポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法、該遺伝子からコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片が提供される。
【０１２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図２】図２は本発明の組換え硫酸基転移酵素の至適温度を示す図である。
【図３】図３は本発明の組換え硫酸基転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】図４は本発明の組換え硫酸基転移酵素の熱安定性を示す図である。
Claims (6)
- 配列表の配列番号：２に記載の塩基配列からなり、Ｇａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする、単離された遺伝子。
- 請求項１記載の遺伝子とストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができ、かつＧａｌβ１−Ｒ（Ｇａｌはガラクトース、Ｒは糖、脂質又は複合脂質を示す）で表される糖鎖に作用してＧａｌのＣ−３位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
- 請求項１又は２記載の遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ。
- 請求項３記載の組換えＤＮＡを挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞とする発現ベクター。
- 請求項４記載の発現ベクターを導入されてなる形質転換体。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、該培養物より硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、硫酸基転移酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
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