KR100491573B1 - 황산기전이효소를코드하는유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Galβ1-R (이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다) 으로 나타낸 당 사슬에 작용함으로써 Gal 의 C-3 위치의 히드록실기로 술페이트기를 특이적으로 전이시키는 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 유전자, 및 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

황산기 전이효소를 코드하는 유전자 {GENE ENCODING SULFOTRANSFERASE}
본 발명은 당지질의 당을 황화시키는 신규한 황산기 전이효소, 인간 세포로부터 단리시킨 상기 효소를 코드하는 유전자, 및 발현 벡터의 사용에 의한 황산기 전이효소의 생성 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 를 사용하여 황산기 전이효소 발현을 조절하는 방법 및 합성 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머, 뿐 아니라 항체 또는 그의 단편을 사용하여 황산기 전이효소를 확인하는 방법에 관한 것이다.
최근에, 당단백질 및 당지질과 같은 복합 탄수화물로서 알려진 세포막중 분자의 당 사슬 부분의 각종 생리학적 기능이 주목을 받고 있다. 당 사슬에 결합된 술페이트기가 각종 생물학적 기능면에서 흥미롭다. 술페이트기는 다양한 형태의 결합으로, 뮤신, 뮤코 다당류 및 당지질의 당 사슬에 뿐만 아니라 에스테르 연결을 통해 바이러스 당단백질, 당단백질 호르몬, 기저막 당단백질, 점균류 리소좀 효소 등의 당 사슬에 결합되어 있다. 그러나, 그의 생물학적 중요성은 밝혀져야 하는 상태이다.
상이한 기질 특이성의 다양한 황산기 전이효소가 이미 공지되어 있다. 예를 들어, 당단백질에 작용하는 황산기 전이효소로는 N-글리코시드형 당 사슬의 갈락토스의 3-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 264 (6), 3364-3371 (1989)], N-글리코시드형 당 사슬의 N-아세틸글루코스아민의 6-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Biochemical Journal, 319, 209-216 (1996)], 뮤신 당 사슬의 N-아세틸갈락토스아민의 3-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Glycobiology, 5 (7), 689-697 (1995)], 뮤신 당 사슬의 N-아세틸글루코스아민의 3-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 270 (46), 27544-27550 (1995)], 및 뇌하수체에서 생성되는 당단백질 호르몬 당 사슬의 N-아세틸글루코스아민의 4-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 266 (26), 17142-17150 (1991)] 가 포함된다.
글리코스아미노글리칸 (뮤코 다당류) 에 작용하는 황산기 전이효소로는 헤파란 술페이트의 이두론산의 2-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 271 (13), 7645-7653 (1996)], 헤파란 술페이트의 N-술페이트화 글루코스아민의 6-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 270 (8), 4172-4179 (1995)], 헤파린의 이두론산의 2-위치 및 N-술페이트화 글루코스아민의 6-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 269 (40), 24538-24541 (1994)], 헤파란 술페이트의 N-술페이트화 글루코스아민의 3-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 271 (43), 27072-27082 (1996)], 헤파란 술페이트의 N-술페이트화에 작용하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 263 (5), 2417-2422 (1988)], 헤파린의 N-술페이트화에 작용하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 266 (13), 8044-8049 (1991)], 콘드로이틴 술페이트의 N-아세틸갈락토스아민 및 케라탄 술페이트의 갈락토스의 6-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 및 콘드로이틴 술페이트의 N-아세틸갈락토스아민의 4-위치에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 268 (29), 21968-21974 (1993)], 및 각막 케라탄 술페이트에만 작용하는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 259 (19), 11771-11776 (1984)] 가 포함된다.
본 발명의 황산기 전이효소와 더불어, 글루쿠론산의 3-위치에 술페이트기를 첨가함으로써 모노클로날 항체 HNK-1 에 의해 인식되는 당 사슬의 합성에 관여되는 황산기 전이효소 [Journal of Biological Chemistry, 268 (1), 330-336 (1993)] 가 당지질에 작용하는 것으로 공지되어 있다.
상기 황산기 전이효소중, 쥐 간으로부터 유래된 헤파린 당 사슬의 합성에 관여되는 N-황산기 전이효소 [N-헤파란 술페이트 황산기 전이효소, Journal of Biological Chemistry, 267 (22), 15744-15750 (1992)], MST 세포로부터 유래된 헤파린 당 사슬의 합성에 포함되는 N-황산기 전이효소 [N-데아실라제/N-황산기 전이효소, Journal of Biological Chemistry, 269 (3), 2270-2276 (1994)], 및 N-아세틸갈락토스아민의 C-6 위치에 술페이트기를 전이시킴으로써 닭 배아 연골세포로부터 유래된 콘드로이틴 당 사슬의 합성에 관여되는 효소 [콘드로이틴 6-황산기 전이효소, Journal of Biological Chemistry, 270 (31), 18575-18580 (1995)] 가 이미 클론된 복합 탄수화물에 작용하는 것으로 공지되었다.
본 발명자들은 인간 신장암 셀라인 (cell line) (SMKT-R3) 로부터, 갈락토스의 3-위치 히드록실기에 술페이트기를 첨가하는 황산기 전이효소인, 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트:GalCer 황산기 전이효소 [EC 2.8.2.11] 을 정제하였다 [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)]. 상기 황산기 전이효소는 인간 신장암 조직 또는 그의 셀라인에서 높은 수준으로 발현되고, 그 수준은 신장암에서의 술페이트화된 당지질의 축적과 관련된다. 상기 사실이 효소와 암 사이의 연관성을 나타낸다해도, 효소의 아미노산 서열은 앞으로 확인되어야 하고, 그의 유전자는 클론되어져야 하는 상태이다.
공지된 황산기 전이효소의 공업적으로 유리한 생산을 위한 과거의 시도에 있어서, 효소의 천연적으로 적은 양, 및 프로테아제 및 술파타제와 같은, 공존하는 기타 효소로 인해, 단순한 공정으로 다량의 정제된 형태의 목적 황산기 전이효소를 단리시키는 것이 매우 어려웠다.
그러므로, 유전 공학 기술을 사용하여 황산기 전이효소 유전자의 클로닝 방법 및 저가이면서 고순도인 황산기 전이효소의 생성 방법이 필요하게 되었다. 황산기 전이효소 유전자의 클로닝이 상기 서술한 바와 같이 보고되었다해도, 유용한 보고의 수는 매우 적다. 또한, 상이한 기질 특이성의 많은 황산기 전이효소가 있기 때문에, 상이한 기질 특이성의 또 다른 황산기 전이효소의 유전자를 수득하기 위한 상기-언급된 황산기 전이효소 유전자중 하나의 서열을 사용하는 시도는 상이한 기질 특이성의 효소 사이에 낮은 유전자 상동성으로 인해 목적 황산기 전이효소 유전자를 수득하는데 있어 어려움과 직면하였다. 더구나, 당지질 당 사슬에 작용하는 황산기 전이효소의 아미노산 서열 및 유전자 구조는 알려지지 않은 상태이므로, 상기 황산기 전이효소는 유전자 조작에 의해 클론되어 생산되기 어렵다.
따라서, 본 발명의 첫번째 목적은, 신장 세포에서, 특히 신장암 세포에서 높은 수준으로 발현되고 당지질의 당 사슬에 작용하는 황산기 전이효소를 코드하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 선행 유전자를 함유하는 발현 벡터가 도입된 형질 전환체를 사용하는 유전자 공학에 의해서 수득되는 고순도의 황산기 전이효소 생성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 선행 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 본 발명의 유전자 또는 그의 일부분에 대해 상보적인 안티센스 DNA 및 안티센스 RNA 를 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯번째 목적은 본 발명의 유전자와 특이적으로 혼성화되는 합성 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯번째 목적은 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 일곱번째 목적은 정제된 황산기 전이효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 및 기타 목적은 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
하나의 구현예로서, 본 발명은 Galβ1-R [이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다] 으로 나타낸 당 사슬에 작용함으로써 술페이트기를 Gal 의 C-3-위치 히드록실기로 특이적 전이시키는 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 유전자에 관한 것이다.
다른 구현예로서, 본 발명은, 본 발명의 유전자가 도입된 형질전환체를 배양하여 생성된 배양액으로부터 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 수합하는 단계를 포함하는, 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드 생성 방법에 관한 것이다.
또 다른 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 유전자로 코드되는 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또 다른 구현예로서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.
또 다른 구현예로서, 본 발명은 술페이트기를 Gal 의 C-3-위치 히드록실기에 특이적으로 전이시키는 Galβ1-R [이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다] 로 나타낸 당 사슬에 작용하는 정제된 황산기 전이효소에 관한 것이다.
여기에서 사용되는 것으로, 서술 "Galβ1-R [이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다] 로 나타낸 당 사슬에 작용하여 술페이트기를 Gal 의 C-3-위치 히드록실기에 특이적으로 전이시키는 황산기 전이효소 활성을 갖는" (이후, "황산기 전이효소 활성을 갖는" 으로 언급) 은, 하기 작용 및 기질 특이성으로 특징화되는 성질을 의미한다. 상기 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 하기 물리-화학적 성질을 갖는 것을 포함하고, 한 예가 문헌 [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)] 에 기재되어 있다.
1. 작용
술페이트기를 Gal 의 C-3-위치 히드록실기에 특이적으로 전이시키는 Galβ1-R [이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다] 으로 나타낸 당 사슬에 대한 작용한다.
2. 기질 특이성
갈락토실 세라미드 (GalCer), 락토실 세라미드 (LacCer), 갈락토실 1-알킬-2-아실글리세롤 (GalAAG), 갈락토실 디아실글리세롤 (GalDG), 글루코실 세라미드 (GlcCer), 글로보테트라오실 세라미드 (Gb4Cer), 강글리오트리아오실 세라미드 (Gg3Cer), 강글리오테트라오실 세라미드 (Gg4Cer) 및 네오락토테트라오실 세라미드 (nLc4Cer) 와 반응하고, 글로보트리아오실 세라미드 (Gb3Cer), 갈락토스 및 락토스와는 반응하지 않는다.
3. 적정 pH 및 안정화 pH
적정 pH 는 약 7.0 이고, 안정화 pH 는 6.0 ∼ 8.0 이다.
4. 적정 온도 및 안정화 온도
적정 온도는 약 37 ℃ 이고, 안정화 온도는 80 ℃ 이하이다.
5. 분자량
환원 조건하에서 SDS-PAGE 로 결정된, 약 54 kDa.
황산기 전이효소 활성은 문헌 [Analytical Biochemistry, 182, 9-15 (1989)] 에 기재된 방법을 근거로 하여 약간 변형된 방법에 의해서 결정될 수 있다. 구체적으로, 5 nmol GalCer 중 20 ng 의 효소 단백질, 0.5 μmol MnCl2, 1 nmol [35S]PAPS (100 cpm/pmol), 0.5 mg 의 루브롤 PX, 12.5 nmol 디티오트레이톨, 0.25 μmol NaF, 0.1 μmol ATP, 20 μg 의 BSA 및 25 mM 소듐 카코딜레이트-HCl (pH 6.5) 을 함유하는 반응 혼합물 50 μl 를 제조한다. 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분간 항온배양한 후, 1 ml 의 클로로포름/메탄올/물 (30:60:8) 을 첨가하여 반응을 종료시킨다. 반응 생성물을 DEAE-세파덱스 A-25 를 사용하여 단리시키고, 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사활성을 측정한다. 활성의 1 유니트을 분당 1 μmol 의 술페이트기를 전이시키는 효소의 양으로 정의한다. 반응 생성물이, 상기 방법으로 측정한 바, 1 × 10-7 밀리유니트 이상의 활성을 나타낸다면, 생성물은 황산기 전이효소 활성을 갖는 것으로 판단된다.
여기에서 사용되는, 용어 "유전자" 는, 상기 기재된 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 또는 상기 유전자를 함유하는 유전자를 나타낸다. 구체적으로, 본 발명의 유전자는 서열표에서 SEQ ID NO:1 로 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 일부분을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 및 서열표에서 SEQ ID NO:2 로 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부분을 함유하는 유전자로서 예시된다. SEQ ID NO:1 로 나타낸 아미노산 서열의 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 코드하는 유전자 또는 SEQ ID NO:2 로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 일부분을 함유하는 유전자는, 그들이 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 한, 본 발명의 범위내에 속한다. 상기는 인간 신장암 셀라인 SMKT-R3 로부터 유래되는 3'-포스포아데노신-5'-포스포술페이트:GalCer 황산기 전이효소 [EC 2.8.2.11] 에 대한 유전자이지만, 본 발명은 그에 국한되지는 않는다. 박테리아, 효모, 선상균, 자낭균 및 담자균과 같은 미생물, 식물 및 동물, 뿐만 아니라 다른 사람 조직으로부터 유래되는 임의 유전자는, 그들이 유사한 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 한, 본 발명의 범위내에 포함된다. 본 발명은 또한 기능적으로 유사한 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 상기-언급된 유전자의 변종을 포함한다. 예를 들어, 서열표에서 SEQ ID NO:1 로 나타낸 아미노산 서열중 하나 이상의 아미노산 잔기가 결손, 첨가, 삽입 또는 치환되어 생성된 폴리펩티드를 코드하는 임의 유전자는, 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 한, 본 발명의 유전자중에 포함된다. 간단하게, 천연원으로부터 단리된 상기 유전자 뿐 아니라 인위적으로 제조된 유전자가, 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 한, 본 발명의 범위내에 포함된다.
또한, 엄격한 조건하에서 본 발명의 유전자와 혼성화 가능한 폴리펩티드를 코드하고, 황산기 전이효소 활성을 갖는 상기 유전자 또한 본 발명의 유전자내에 포함된다.
여기에서 사용된, 서술 "엄격한 조건하" 는, 예를 들어, 하기에 나타낸 조건을 의미한다. 구체적으로, 항온배양을 0.5 % SDS, 5 × 덴하르트 [덴하르트 = 0.1 % 소혈청 알부민 (BSA), 0.1 % 폴리비닐피롤리돈, 0.1 % 피콜 400] 및 100 μg/ml 연어 정자를 함유하는 6 × SSC (1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0) 중 50 ℃ 에서 4 시간 내지 하룻밤동안 수행한다.
본 발명에서, 재조합 DNA 는, 본 발명의 유전자를 함유하는, 유전 공학 기술에 의해 수득된 DNA 이다.
본 발명에서, 발현 벡터는 목적하는 숙주 세포에서 발현되도록 상기-기재된 재조합 DNA 를 삽입시키므로서 구축된 벡터이다. 하기 기재되는 안티센스 DNA 를 함유하는 벡터는 또한 본 발명의 발현 벡터중에 포함된다. 삽입된 벡터는 플라스미드 벡터 또는 파아지 벡터일 수 있다. 유용한 플라스미드 벡터로는, 이에 국한되지 않고, pUC18, pUC19, pBluescript, pT7 및 기타 시판되는 상품이 포함되고, 유용한 파아지 벡터로는, 이에 국한되지 않고, λgt10 및 λgt11 람다 파아지 벡터 및 기타 시판되는 상품이 포함된다. 숙주 세포로는 미생물, 동물 세포 및 식물 세포가 포함되고, 사용된 발현 벡터에 따라서 적절하게 선택된다.
본 발명에서, 형질전환체는 상기-기재된 발현 벡터를 본 발명의 유전자를 발현하는 상기-기재된 숙주 세포에 도입시킴으로써 수득되는 세포이다.
발현 벡터 도입은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., eds., published by Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, pp. 249-254] 에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. 이어서, 목적 유전자를 발현하는 형질발현체를 선택하기 위해서, 발현 벡터의 특징을 이용한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터가 pBluescript 이고 숙주세포가 대장균인 경우, 외부 유전자를 포함하는 콜로니는 앰피실린-함유 플레이트상에서 앰피실린-내성 콜로니, 또는 앰피실린, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드 (X-Gal) 및 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 를 함유하는 플레이트상에서 앰피실린-내성 백색 콜로니를 선택함으로써 단리될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 유전자가 발현되고 상기 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드가 생성되는 상기 조건하에서 상기-기재된 형질전환체를 배양함으로써 수득된 배양액으로부터 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다.
목적 황산기 전이효소의 발현이 인식된다면, 황산기 전이효소는 형질전환체 배양 배지 조성, 배지 pH, 배양 온도, 사용된 유발인자의 양 및 시간, 배양 기간 및 황산기 전이효소의 발현을 위한 다른 조건들을 적정화시킴으로써 효율적으로 생성될 수 있다.
황산기 전이효소는 공지된 방법을 사용하여 형질전환체 배양액으로부터 정제될 수 있다. 형질전환체가, 대장균 내에서와 같이, 세포내에 발현 생성물을 축적하는 경우, 형질전환체를 배양 완료후 원심분리시켜 수합한 다음, 초음파 등으로 파쇄시킨 후 원심분리 등을 수행하여 세포-유리 추출물을 수득한다. 염석, 겔 여과법, 및 소수성, 친화성 및 기타 다양한 크로마토그래피와 같은 통상적인 단백질 정제 방법에 의해서, 목적 황산기 전이효소는 상기 추출물로부터 정제될 수 있다. 일부 숙주-벡터 시스템의 경우에 있어서, 발현 생성물이 형질전환체로부터 분비된다. 상기 경우에 있어서, 상기와 동일한 방법으로 배양 상층액으로부터 정제될 수 있다.
일부 숙주-벡터 시스템의 경우에 있어서, 형질전환체에서 발현되는 폴리펩티드가 불용성 물질 (세포 봉입체) 로서 축적된다. 상기 경우에 있어서, 우레아와 같은 변성제로 처리한 다음 변성제를 제거하여 본래 활성을 회복시키는 처리와 같은, 온화한 조건하에 불용성 물질이 회수되어 용해될 수 있다.
형질전환체에 의해 생성되는 외인성 황산기 전이효소가 숙주 세포내의 각종 내인성 황산기 전이효소와 공존한다해도, 그의 정제는 내인성 황산기 전이효소의 양 보다 과량이기 때문에 매우 용이하다. 또한, 황산기 전이효소가 형질전환체 밖으로 분비되는 경우, 배지 성분 등이 공존하지만 그들은 통상 황산기 전이효소 정제를 방해하는 단백질 성분이 거의 없고, 그의 정제가 SMKT-R3 세포로부터 황산기 전이효소 정제와 비교하여 분리를 위한 수고를 수반하는 공정을 필요로 하지 않는다는 유리한 점이 있다.
진핵생물원의 황산기 전이효소의 경우에 있어서, 효소 자체는 당 사슬을 가질 수 있다. 상기 경우에 있어서, 황산기 전이효소 활성을 갖지만 당 사슬을 갖지 않는 폴리펩티드는 당 사슬 생합성을 할 수 없는 숙주 세포, 예를 들어, 대장균, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtillis) 또는 악티노마이세트 (Actinomycete) 와 같은 원핵생물, 또는 당 사슬 생합성의 기능을 잃어버린 효모, 균류, 동물, 곤충 또는 식물 세포의 변이체를 사용하여 생성될 수 있다. 더구나, 당 사슬이 효소 자체에 첨가될 수 있다. 상기 경우에서, 황산기 전이효소 활성을 가지며 당 사슬을 갖는 폴리펩티드는 당 사슬 생합성을 할 수 있는 숙주 세포, 예를 들어, 효모, 균류, 동물, 곤충 또는 식물 세포를 사용하여 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 상기-기재된 유전자에 의해 코드되며, 상기-언급된 각종 물리-화학적 성질을 갖는 것으로 예시된, 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1 로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 천연-발생 황산기 전이효소 폴리펩티드 또는 그의 일부분을 함유하는 폴리펩티드, 및 SEQ ID NO:1 로 나타낸 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 결손, 첨가, 삽입 또는 치환으로부터 생성되는 폴리펩티드로 예시된다.
본 발명에 있어서, "안티센스 DNA" 및 "안티센스 RNA" 는 본 발명의 황산기 전이효소 유전자 또는 그의 일부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며 유전자와 이중 가닥 구조를 형성함으로써 내인성 황산기 전이효소 유전자 (게놈 DNA 및 mRNA) 로부터 유전자 정보의 발현 (전사, 번역) 을 억제 또는 조절하는 것으로 정의된다. 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 의 길이는 뉴클레오티드 서열 특이성 및 세포로의 도입 방법에 따라 다양할 수 있다. 안티센스 DNA 또는 안티센트 RNA 는, 정상 방향에 반대인 방향 (안티센스 방향) 등으로 유전자를 발현하는, 합성기를 사용하여 인위적인 합성에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, tat 유전자 [Nucleic Acids Research, 19, 3359-3368 (1991)] 또는 rev 유전자 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86, 4244-4248 (1989)] 를 갖는 HIV 증식의 억제에 관하여, 다수의 안티센스 기술이 공지되어 있다. 상기 방법에 의해서, 및 본 발명의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 를 사용하여, 내인성 황산기 전이효소 유전자의 발현은 억제 또는 조절될 수 있다. 본 발명의 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA 는 또한 원 위치 (in situ) 혼성화 등을 위한 실험실용의 시약으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 합성 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머는 상기-기재된 유전자에 특이적으로 혼성화되는 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머는 합성기를 사용하는 인위적인 합성, 또는 PCR 방법에 의해서 정상적으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리클로날 또는 모노클로날인, 임의 항체 또는 그의 단편이, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합되는 한, 목적을 위해서 제공된다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, John E. Coligan, ed., published by John Wiley & Sons, Inc., 1992] 에 기재된 방법에 의해서, 본 발명의 폴리펩티드 전체 또는 일부분을 사용하여 토끼, 마우스 또는 다른 동물을 면역화시켜 용이하게 제조될 수 있다. 정제후, 상기 항체를 펩티다제 등으로 처리하여 항체 단편을 수득할 수 있다. 생성된 항체 또는 그의 단편의 용도로는 친화성 크로마토그래피, cDNA 라이브러리 스크리닝, 및 약제학적, 진단 시약 및 연구 시약이 포함된다.
본 발명은 이후 문헌 [Urological Research, 17, 317-324 (1989)] 에 기재된 인간 신장암 셀라인, SMKT-R3 로부터 유래된 황산기 전이효소를 일례로 보다 상세하게 설명된다.
본 발명의 황산기 전이효소는 본 발명에서 참고로 포함되는 문헌 [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)] 에 기재된 방법에 의해서 SMKT-R3 세포를 일차 대량-배양한 다음, 세포 배양액으로부터 황산기 전이효소를 단리 정제함으로써 수득된다. 구체적으로, 본 발명의 정제된 황산기 전이효소는 하기 기재되는 방법에 의해서 생성된다.
EGF 로 처리된 SMKT-R3 세포 (약 1× 1010 세포) 를 수합하여, PBS 로 세척하고, 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 보관한다. 사용시, 2.5 × 109 세포를 해동시켜, 동일 부피의 TBS 중에 현탁시키고, 포터-타입의 균질기로 간단하게 파쇄시킨다. 파쇄액에 동일 부피의 2 × 용해 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 2 mM β-메르캅토에탄올, 2 % 루브롤 PX, 40 % 글리세롤, 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 및 0.02 mM E-64) 를 공급하여 얼음 상에서 10 분간 초음파처리한다. 원심분리후, 수득된 상층액을 완충액 A (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 10 % 글리세롤, 및 5 mM MnCl2) 으로 투석시킨다.
투석된 물질을 원심분리시켜 투석중에 나타난 침전물을 제거한다. 상층액을 DE-52 컬럼에 적용시켜, 그의 배출구를, 완충액 B (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.05 % 루브롤 PX, 10 % 글리세롤, 및 5 mM MnCl2) 로 평형화시킨 헤파린-세파로스 CL6B 컬럼에 직접 연결시킨다. 컬럼을 이어서 280 nm 에서의 방출액의 흡광도가 0.02 미만이 될 때까지 완충액 B 로 세척한다. DE-52 컬럼을 해체한 후, 헤파린-세파로스 CL6B 컬럼상의 효소를 완충액 C (20 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.1 % 루브롤 PX, 20 % 글리세롤, 및 10 mM MnCl2) 중 0.2 M NaCl 로 용출시킨다.
헤파린-세파로스 크로마토그래피에서의 효소-활성 분획을 모두 합하여 완충액 B 에 대해 투석시킨다. 투석물을 완충액 B 로 평형화시킨 갈락토실 스핑고신 (GalSph)-세파로스 컬럼에 적용한다. 컬럼을 이어서 용출액에 본질적으로 단백질이 없어질 때까지 완충액 B 로 세척하고 황산기 전이효소를 0.1 M NaCl 을 함유하는 완충액 C 로 용출시킨다.
GalSph-세파로스에서의 용출 분획을 합하여 10 % 글리세롤을 함유하는 10 mM 트리에탄올아민-HCl (pH 7.0) 에 대해 투석하고, 완충액 D (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.05 % 루브롤 PX, 및 10 % 글리세롤) 로 평형화시킨 HiTrap 3',5'-비스포스포아데노신 (PAP) 컬럼에 직접적으로 연결된 PLP-세파로스 컬럼에 적용한다. 컬럼을 용출액에서 단백질이 본질적으로 제거될 때까지 완충액 D 및 완충액 B 로 연속적으로 세척한 다음, 황산기 전이효소를 완충액 D 중 0 ∼ 0.3 mM PAP 의 선형 구배로 용출시킨다.
HiTrap PAP 크로마토그래피에서의 효소-활성 분획을 합하여 완충액 D 로 평형화된 헤파린-세파로즈 컬럼상에서 이차 크로마토그래피를 직접 수행한다. 완충액 D 로 컬럼을 세척한 후, 본 발명의 황산기 전이효소를 0.3 M NaCl 을 함유하는 완충액 C 로 0.3-ml 분획씩 용출시킨다. 상기 단계를 통해서, 효소 제제를 초기 부피의 약 1/5 로 농축하고, 선행된 크로마토그래피로부터 효소 제제에 포함된, PAP 를 플로우-쓰루 (flow-through) 분획에서 회수한다. 정제된 효소-활성 분획을 합하여 20 % 글리세롤의 존재하에 -80 ℃ 에서 보관한다.
다음으로, 정제된 황산기 전이효소의 부분적인 아미노산 서열상의 정보를 수득한다. 부분적인 아미노산 서열을 결정하기 위해서, 황산기 전이효소를 직접적으로 에드만 분해 방법 [Journal of Biological Chemistry, 256, 7990-7997 (1981)] 에 의한 아미노산 시퀀서 (Protein Sequencer 476A, produced by Applied Biosystems) 에 적용시켜, 황산기 전이효소중 10 ∼ 20 N-말단 아미노산 잔기를 결정한다. 이와는 달리, 황산기 전이효소는 높은 기질 특이성 프로테아제, 예를 들어, 아크로모박터 프로테아제 I 또는 N-토실-L-페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-트립신의 작용에 의해서 제한된 가수분해가 수행될 수 있고, 생성된 펩티드 단편을 역상 HPLC 로 분리 정제한 후, 정제된 펩티드 단편으로 아미노산 서열분석을 수행하여 목적한 아미노산 서열을 효율적으로 결정한다.
본 발명에서, 7 개의 펩티드 단편의 아미노산 서열을 결정하였다 : P1 (SEQ ID NO:3), P2 (SEQ ID NO:4), P3 (SEQ ID NO:5), P4 (SEQ ID NO:11), P5 (SEQ ID NO:12), P6 (SEQ ID NO:13) 및 P7 (SEQ ID NO:14).
상기 결정된 부분적인 아미노산 서열을 근거로 하여, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자를 클론시킨다. 상기 목적을 위해서, 통상적으로 사용되는 PCR 방법 또는 혼성화 방법이 이용된다. PCR 방법은 문헌 [PCR Technology, Erhich, HA, ed., published by Stockton Press, 1989] 에 기재된 방법에 따라서 수행될 수 있다. 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, T. Maniatis et al., eds., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 에 기재된 방법에 따라서 수행될 수 있다.
그러나, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자는 혼합된 프라이머 (SEQ ID NO:22-27) 를 사용하는 하기 PCR 방법 (MOPAC 방법), 이노신-함유 혼합된 프라이머 (SEQ ID NO:28-33) 를 사용하는 MOPAC 방법, 또는 합성 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO:22 및 24) 를 사용하는 혼성화 방법에 의해서 클론될 수 없었다.
1) 혼합된 프라이머를 사용하는 PCR 방법 (MOPAC 방법)
상기 클로닝 방법은 결정된 아미노산 서열에 있어서 2 개의 낮은 축퇴성 (degeneracy) 부분을 선택하여, 축퇴성있는 코돈에 대한 모든 가능한 뉴클레오티드 서열 조합을 합성하고, 그들을 혼합된 프라이머로서 사용하여 PCR 로 목적 DNA 단편을 증폭시키는 것을 포함한다.
상기 방법에 의해서, 요산 옥시다제를 코드하는 유전자가 클론되었다 [Science, 239, 1288-1291 (1988)].
본 발명자들은 상기 방법에 의해서 본 발명의 황산기 전이효소를 수득하고자 시도하였다. 다양한 합성 올리고뉴클레오티드가 제조되었다 :
부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 S1 (SEQ ID NO:22) 및 A1 (SEQ ID NO:23), 부분적인 아미노산 서열 P2 (SEQ ID NO:4) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 S2 (SEQ ID NO:24) 및 A2 (SEQ ID NO:25), 및 부분적인 아미노산 서열 P3 (SEQ ID NO:5) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 S3 (SEQ ID NO:26) 및 A3 (SEQ ID NO:27). 혼합된 프로이머로서 상기 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, 주형으로서 SMKT-R3 세포 cDNA 로의 통상적인 방법에 의해서 PCR 을 수행하였다.
생성된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 다수의 DNA 단편들이 증폭된 것으로 발견되었고, 그 각각을 겔로부터 절단 분리하여, 추출하고, 플라스미드 벡터로 삽입시킨 후, 그의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법 (데옥시 사슬 종결 방법) 으로 결정되지만, 혼합 프라이머로서 사용된 합성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 밝혀졌다해도, 목적 황산기 전이효소 유전자로부터의 유사한 서열은 발견되지 않았다.
2) 이노신을 사용하는 MOPAC 방법
상기 방법은 상기 1) 에 기재된 방법과 유사하지만 높은 축퇴성의 코돈중 세번째 염기를 이노신으로 치환하여 생성된 프라이머를 사용하여 혼합 프라이머 조합의 수를 감소시킨다 [Nucleic Acids Research, 16 (22), 10932 (1988)].
다양한 합성 올리고뉴클레오티드가 제조되었다 :
부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 SI1 (SEQ ID NO:28) 및 AI1 (SEQ ID NO:29), 부분적인 아미노산 서열 P2 (SEQ ID NO:4) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 SI2 (SEQ ID NO:30) 및 AI2 (SEQ ID NO:31), 및 부분적인 아미노산 서열 P3 (SEQ ID NO:5) 을 근거로 합성 올리고뉴클레오티드 SI3 (SEQ ID NO:32) 및 AI3 (SEQ ID NO:33). 이노신-함유 혼합 프라이머로서 상기 합성 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, 주형으로서 SMKT-R3 세포 cDNA 를 사용하는 통상적인 방법에 의해 PCR 을 수행하였다.
생성된 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열은 상기와 동일한 방법으로 결정되지만, 이노신-함유 혼합 프라이머로서 사용된 합성 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 밝혀졌다해도, 목적 유전자로부터와 유사한 서열은 발견되지 않았다.
3) 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 혼성화 방법
또다른 통상적으로 사용되는 방법은 아미노산 서열 정보를 기초로 하여 합성 올리고뉴클레오티드를 고안하여 목적 DNA 를 클로닝시키고, 통상적인 방법으로 그와 혼성화시키는 것을 포함한다. 본 발명자들은 상기 방법에 의해서 본 발명의 황산기 전이효소 유전자를 확인하는 시도를 하였다.
추정되는 합성 올리고뉴클레오티드 S1 (SEQ ID NO:22) 및 S2 (SEQ ID NO:24) 가 부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 및 P2 (SEQ ID NO:4) 각각으로부터 제조되고, 플라크 혼성화를 위한 탐침으로서 사용되었다. SMKT-R3 세포 cDNA 를 통상적인 방법에 의해서 파아지 벡터로 삽입시켜 cDNA 라이브러리를 수득하였다. 상기 cDNA 라이브러리로 감염된 대장균을 플레이트상에 파종하고; 수득된 각 플라크를 나일론 막상에 블롯팅시켰다. 혼성화를 통상적으로 사용되는 조건하에서 수행하였다.
결과적으로, 합성 올리고뉴클레오티드 S1 및 S2 를 탐침으로서 사용하는 두 경우 모두에 있어서 다수의 양성 플라크가 확인되었다. 상기 양성 플라크의 파아지 벡터에 있어서 DNA 삽입부의 뉴클레오티드 서열을 통상적인 방법으로 결정하였다. 탐침으로서 사용된 합성 올리고뉴클레오티드중 하나의 뉴클레오티드 서열과 동일한 서열이 수득된다해도, 목적 황산기 전이효소 유전자로부터와 유사한 서열은 발견되지 않았다; 파아지 벡터에 있어서 DNA 삽입부의 뉴클레오티드 서열로부터 결정된 아미노산 서열은 상기-언급된 부분적인 아미노산 서열과의 상동성이 부족하였다.
상기 서술된 바와 같이, SMKT-R3 세포 cDNA 로부터 본 발명의 황산기 전이효소 유전자를 클론시키는 것은 매우 어렵다. 높은 G + C 함량때문에 황산기 전이효소 유전자가 이차 구조로 되려는 경향이 있으므로, 비-특이적 DNA 단편이 폴리머라제 반응의 억제, 비-특이적 어닐링 등으로 인해 PCR 방법으로 증폭되기 쉽다. 상기 측면을 고려하여, 본 발명자들은 폭 넓은 연구를 하고, 공지된 아미노산 서열의 한 펩티드 단편에 해당하는 짧은 유전자 단편을 PCR 방법으로 증폭시키고자 시도하였다.
PCR 방법에 대한 프라이머가 이노신을 함유하도록 고안되어 많은 혼합 프라이머 조합을 감소시키고, 빈번히 사용된 코돈이 루이신으로 선택되고, 프라이머가 합성되는 것이 바람직하며, 그후 뉴클레오티드 서열 축퇴성은 세린에 대한 다수의 코돈 조합을 제공함으로써 감소된다. 그러므로, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자의 일부분을 증폭시키는 것이 가능하다. 다음으로, 본 발명자들은 탐침으로서 상기 증폭된 PCR 생성물을 가지고 써던 혼성화를 수행하였고, 수득된 비-특이적 DNA 단편중 목적 황산기 전이효소 유전자로부터 유래된 DNA 단편을 발견하는데 성공하였다.
보다 구체적으로, 합성 올리고뉴클레오티드 1Sd (SEQ ID NO:6) 및 1A (SEQ ID NO:7) 은 PCR 방법에 대한 프라이머로서 부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 을 근거로 하여 새로이 제조되고, PCR 은 SMKT-R3 세포 cDNA 를 주형으로하여 수행된다.
수득된 각 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 디데옥시 사슬 종결 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74 (12), 5463-5467 (1977)] 에 의해 결정되고; 부분적인 아미노산 서열 P1 을 코드하는 뉴클레오티드 서열이 밝혀지는데, 즉, 목적 황산기 전이효소 유전자의 일부분이 수득된다. 상기 뉴클레오티드 서열을 근거로 하여, 합성 올리고뉴클레오티드 OP1 (SEQ ID NO:8) 이 통상적인 방법에 의해 3'-말단 표지되어 제조되고, 혼성화를 위한 탐침으로서 사용된다.
또한, 합성 올리고뉴클레오티드 2Sa (SEQ ID NO:9) 및 3A (SEQ ID NO:10) 가 부분적인 아미노산 서열 P2 (SEQ ID NO:4) 및 P3 (SEQ ID NO:5) 를 각각 근거로 하여 PCR 방법을 위한 프라이머로서 새로이 합성되고, PCR 은 SMKT-R3 세포 cDNA 를 주형으로 하여 수행된다.
수득된 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리한 후, 이를 통상적인 방법으로 나일론 막상에 블롯팅시키고 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, T. Maniatis et al., eds., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 다음으로 3'-말단 표지된 합성 올리고뉴클레오티드 OP1 을 사용하여 혼성화시킨다. 상기 서술된 바와 같이, 혼성화는 엄격한 조건하에서 수행되고, 상기 탐침과 혼성화되는 DNA 단편이 표지에 적절한 감식 방법을 사용하여 확인된다.
결과적으로, 합성 올리고뉴클레오티드 OP1 과 혼성화되는 밴드는 약 600 bp 에 해당하는 위치에서 수득된다. 상기 단편의 뉴클레오티드 서열은 상기와 동일한 방법으로 결정되고; 황산기 전이효소의 부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 및 P4 (SEQ ID NO:11) 에 해당하는 서열로 밝혀지고, 목적 황산기 전이효소 유전자의 부분들이 수득된 것으로 증명되었다.
이와는 별개로, SMKT-R3 세포로부터 유래된 cDNA 라이브러리가 제조된다. cDNA 라이브러리는 문헌 [Chapter 8, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, T. Maniatis et al., eds., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
더구나, SMKT-R3 세포로부터 유래된 상기-기재된 cDNA 라이브러리를 탐침으로서 상기-기재된 약 600 bp DNA 단편으로 스크리닝함으로써, 황산기 전이효소를 코드하는 총-길이 유전자가 클론될 수 있다. 또한, SMKT-R3 세포로부터 유래된 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 본 발명의 황산기 전이효소의 게놈 DNA 가 또한 수득될 수 있다.
인간 신장암 셀라인 SMKT-R3 세포에 의해 생성된 황산기 전이효소 유전자의 상기-수득된 전체 뉴클레오티드 서열은 서열표에 SEQ ID NO:2 로 나타낸 서열이고, 그에 의해 코드된 전체 아미노산 서열은 서열표에서 SEQ ID NO:1 로 나타낸 서열이다. 또한, 상기 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은, 상이한 기질 특이성의 임의 공지된 황산기 전이효소 유전자와의 상동성이 없는 새로운 서열이다.
본 발명의 황산기 전이효소의 전체 뉴클레오티드 서열이 규명되었기 때문에, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자와 매우 유사한 DNA 를 본 발명의 황산기 전이효소 유저자 전체 또는 일부분을 혼성화용 탐침으로 사용하여 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 SMKT-R3 세포 이외의 유기체로부터 유래된 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 클론될 수 있다.
또한, 본 발명의 황산기 전이효소의 뉴클레오티드 서열을 근거로 하여, PCR 용 탐침이 고안될 수 있다. 상기 프라이머를 사용하여, SMKT-R3 세포 이외의 유기체로부터 유래된, 게놈 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 또는 cDNA 로부터 본 발명의 황산기 전이효소 유전자와 상당히 유사한 DNA 단편을 확인하거나, 또는 총-길이 유전자를 수득하는 것이 가능하다.
수득된 유전자가 목적 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자인지를 확인하기 위해서, 본 발명의 황산기 전이효소의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 각각에 대해 측정된 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 동종성을 근거로 하여 평가하는 것이 가능하다. 또한, 황산기 전이효소 활성은 상기-기재된 검정 방법으로 측정되고, 이후 유전자 생성물이 상기-기재된 방법으로 수득되며; 활성이 1 × 10-7 밀리유니트 이상인 경우, 유전자가 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 것으로 판단된다.
유사한 황산기 전이효소 활성을 갖는 기능적으로 동일한 생성물을 생성하기 위해서, 예를 들어, 하기 방법이 사용될 수 있다. 무작위 돌연변이 또는 위치-지정 돌연변이를 본 발명의 황산기 전이효소 유전자에 도입시킴으로써, 천연-발생 황산기 전이효소의 아미노산 서열상에 1 개 이상의 아미노산 잔기의 결실, 첨가, 삽입 또는 치환을 유발하는 유전자가 수득된다. 그러므로, 천연-발생 황산기 전이효소와 동일한 활성을 갖지만 적정 온도, 안정화 온도, 적정 pH 및 안정화 pH 와 같은, 약간은 상이한 성질을 갖는 황산기 전이효소를 코드하는 유전자를 수득하고, 유전 공학에 의해서 상기 황산기 전이효소를 생성하는 것이 가능하다.
무작위 돌연변이 방법으로는, 예를 들어, 시토신 염기를 황화수소나트륨의 작용에 의해서 우라실 염기로 전환시켜 전이 돌연변이를 유발하는 화학적 DNA 처리 방법 [Proceedings of the National Academy of Science of the USA, 79, 1408-1412 (1982)], [α-S]dNTP 의 존재하에 이중 가닥 합성중 염기 치환을 유발시키는 생화학적 방법 [Gene, 64, 313-319 (1988)], 및 PCR 이 반응 시스템에 첨가된 망간의 존재하에 수행되어 뉴클레오티드 삽입의 정확성을 감소시키는 PCR-기재 방법 [Analytical Biochemistry, 224, 347-353 (1995)] 이 포함된다.
위치-지정 돌연변이를 위한 공지된 방법으로는, 예를 들어, 앰버 돌연변이를 기재로 하는 방법 [gapped duplex method, Nucleic Acids Research, 12 (24) 9441-9456 (1984)], 제한효소 위치를 이용하는 방법 [Analytical Biochemistry, 200, 81-88 (1992); Gene, 102, 67-70 (1991)], dut (dUTPase) 및 ung (우라실 DNA 글리코실라제) 돌연변이를 기재로 하는 방법 [Kunkel method, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, 488-492 (1985)], DNA 폴리머라제 및 DNA 리가아제를 사용하는 앰버 돌연변이를 기재로 하는 방법 [oligonucleotide-directed dual amber (ODA) method, Gene, 152, 271-275 (1995)], 및 첨가되는 제한효소 인식 위치에 돌연변이를 위한 2 종류의 프라이머를 사용하는 PCR 기재 방법 (USP 5,512,463) 이 포함된다.
또한, 시판되는 키트를 사용하여, 위치-지정 돌연변이가 용이하게 도입될 수 있다. 시판되는 키트의 예로는 이중가닥의 갭 (gapped duplex) 방법을 기재로 하는 뮤탄R-G (MutanR-G) (다까라 슈조사 제), 쿤켈 (Kunkel) 방법을 기재로 하는 뮤탄R-K (MutanR-K) (다까라 슈조사 제), ODA 방법을 기재로 하는 뮤탄R-익스프레스 Km (다까라 슈조사 제), 및 돌연변이를 위한 프라이머 및 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 로부터 유래된 DNA 폴리머라제를 사용하는 퀵체인지TM (QuikChangeTM) 위치-지정 돌연변이 키트 (STRATAGENE 사제) 가 포함된다. PCR-기재 방법은 또한 다까라 (TaKaRa) LA-PCR 시험관 내 돌연변이 키트 (다까라 슈조 사제) 및 뮤탄R-슈퍼 익스프레스 Km (MutanR-Super Express Km) (다까라 슈조 사제) 을 포함한다.
상기 서술한 바와 같이, 본 발명은 인간 신장암 셀라인 SMKT-R3 로부터 유래된 황산기 전이효소의 일차 구조 및 유전자 구조를 명확히 하고, 유전 공학에 의해서 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 저가 및 높은 순도로 생성하는 방법을 가능케 한다.
더구나, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자와 특이적으로 혼성화되는 합성 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머는 본 발명의 황산기 전이효소 유전자의 연구, 확인, 증폭 등에 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명의 황산기 전이효소의 연구, 확인, 정제 등에 유용하다.
우연하게도, 본 발명의 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 사용하는 유전자 기술에 의해서 제조된 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소는 하기의 적정 pH, 적정 온도, 안정화 pH, 및 안정화 온도를 가지며, 문헌 [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)] 에 개시된 천연 황산기 전이효소에 대해서와 유사한 결과가 얻어졌다.
(1) 적정 pH
본 발명의 재조합 황산기 전이효소의 적정 pH 는 도 1 에 나타낸 바와 같이 약 6 ∼ 약 8 이고, 이러한 범위내에서 가장 높은 활성이 달성된다.
(2) 적정 온도
본 발명의 재조합 황산기 전이효소의 적정 온도는 도 2 에 나타낸 바와 같이 약 40 ℃ 이고, 상기 온도에서 최대 활성이 달성된다.
(3) 안정화 pH
본 발명의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 pH 는 도 3 에 나타낸 바와 같이 6 ∼ 10 이다.
(4) 안정화 온도
본 발명의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 온도는 도 4 에 나타낸 바와 같이 30 ℃ 에서 안정화를 나타내지만, 그의 효소 활성의 85 % 는 40 ℃ 에서의 처리 30 분 후에 소실된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하지만, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
SMKT-R3 세포로부터의 황산기 전이효소의 정제
50 ng/ml EGF 로 12 ∼ 24 시간 동안 처리한 SMKT-R3 세포를 수합하여, PBS 로 세척하고, 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 보관한다. 사용을 위해, 2.5 × 109 세포를 해동하여, 동일한 부피의 TBS 중에 현탁시키고 포터-형태 균질기로 간단하게 파쇄시킨다. 파쇄액에 동일한 부피의 2 × 용해화 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl2, 2 mM β-메르캅토에탄올, 2 % 루브롤 PX, 40 % 글리세롤, 0.5 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 및 0.02 mM E-64) 을 공급하여, 얼음상에서 10 분간 초음파 처리한다. 100,000 × g 에서 1 시간 동안 원심분리한 후, 수득된 상층액을 완충액 A (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 10 % 글리세롤, 및 5 mM MnCl2) 에 대해서 하룻밤 동안 투석시킨다.
투석된 물질을 10,000 × g 에서 30 분간 원심분리시켜 투석중에 나타난 침전물을 제거한다. 황산기 전이효소 활성은 침전물에서 나타나지 않는다. 상층액을 DE-52 컬럼 (3 × 20 cm, Whatman 제) 에 적용시키고, 그의 방출부를 완충액 B (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.05 % 루브롤 PX, 10 % 글리세롤, 및 5 mM MnCl2) 로 평형화시킨 헤파린-세파로스 CL6B 의 컬럼 (2 × 10 cm, Pharmacia Biotech 제) 에 직접 연결한다. 이어서, 컬럼을 280 nm 에서의 방출물의 흡광도가 0.02 미만이 될 때 까지 40 ml/h 의 유속의 완충액 B 로 세척한다. DE-52 컬럼을 해체한 후, 헤파린-세파로스 CL6B 컬럼상의 효소를 완충액 C (20 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.1 % 루브롤 PX, 20 % 글리세롤, 및 10 mM MnCl2) 중 0.2 M NaCl 로 용출시킨다.
헤파린-세파로스 크로마토그래피상의 효소-활성 분획을 합하여 완충액 B 에 대해 투석시킨다. 투석물질을 완충액 B 로 평형화시킨 GalSph-세파로스 컬럼 (1 × 10 cm, Pharmacia Biotech 제) 에 5 ml/h 의 유속으로 적용한다. 컬럼을 이어서 용출액에서 단백질이 본질적으로 제거될 때까지 완충액 B 로 세척하여 0.1 M NaCl 을 함유하는 완충액 C 로 황산기 전이효소를 용출한다.
GalSph-세파로스상의 용출 분획을 합하여 10 % 글리세롤을 함유하는 10 mM 트리에탄올아민-HCl (pH 7.0) 에 대해 투석하여 완충액 D (10 mM 트리에탄올아민-HCl, pH 7.0, 0.05 % 루브롤 PX, 및 10 % 글리세롤) 로 평형화된 HiTrap PAP 컬럼 (5-ml 베드 부피, Pharmcia Biotech 제) 에 직접 연결된 PLP-세파로스의 컬럼 (1 × 10 cm, Pharmcia Biotech 제) 상에 5 ml/h 의 유속으로 적용시킨다. 컬럼을 용출액에서 단백질이 본질적으로 제거될 때까지 완충액 D 및 완충액 B 로 연속적으로 세척한 다음, 술포-트랜스퍼라제를 완충액 D 중 0 ∼ 0.3 mM PAP 의 선형 구배로 용출시킨다.
HiTrap PAP 크로마토그래피상에 효소-활성 분획을 합하여 완충액 D 로 평형화시킨 헤파린-세파로스 컬럼 (0.3-ml 베드 부피) 상에서 이차 크로마토그래피를 직접적으로 수행한다. 완충액 D 로 컬럼을 세척한 후, 본 발명의 황산기 전이효소를 0.3 M NaCl 을 함유하는 완충액 C 로 0.3-ml 분획씩 용출시킨다. 상기 단계를 통하여, 효소 제제가 처음 부피의 약 1/5 로 농축되고, 선행 크로마토그래피로부터 효소 제제에 포함되는, PAP 는 플로우-쓰루 분획에서 회수된다. 정제된 효소-활성 분획을 합하여 20 % 글리세롤의 존재하에 -80 ℃ 에서 보관한다. 정제된 효소의 비활성은 하기 실시예 2 에 기재된 바와 같이 1.2 유니트/mg 인 것으로 검정된다.
실시예 2
정제된 황산기 전이효소의 작용, 기질 특이성 및 물리-화학적 성질
실시예 1 에서 수득된 황산기 전이효소의 활성은 문헌 [Analytical Biochemistry 182, 9-15 (1989)] 에 기재된 바와 같이 약간의 변형을 가하여 검정된다. 반응 혼합물은 5 nmol 의 GalCer, 0.5 μmol 의 MnCl2, 1 nmol 의 [35S]PAPS (100 cpm/pmol), 0.5 mg 의 루브롤 PX, 12.5 nmol 의 디티오트레이톨, 0.25 μmol 의 NaF, 0.1 μmol 의 ATP, 20 μg 의 BSA, 및 25 mM Na 카코딜레이트-HCl, pH 6.5, 중 효소 단백질을 총 부피 50 μl 로 함유한다. 기질 특이성을 조사하기 위한 실험에서, 25 nmol 의 각 시험 당지질이 5 nmol 의 GalCer 대신에 수용기로서 사용된다. 37 ℃ 에서 30 분간 항온배양한 후, 1 ml 의 클로로포름/메탄올/물 (30:60:8) 로 반응을 종결시킨다. 반응 생성물을 DEAE-세파덱스 A-25 컬럼상에서 단리시켜 액체 섬광 계수기를 사용하여 방사활성을 검정한다. 수치를 블랭크 수치로 정정하고, 이는 수용기가 없는 상기 반응 혼합물을 사용함으로써 수득된다. 1 유니트의 활성은 상기 언급된 검정 조건하에서 분당 1 μmol 의 술페이트를 전이시키는 효소의 양으로 정의된다.
기 질 구 조 상대 활성 (%)
GalCer GalβCer 100
LacCer Galβ4GlcβCer 61
GalAAG GalβAAG 21
GalDG GalβDG 12
GlcCer GlcβCer 5.9
Gb3Cer Galα4Galβ4GlcβCer 0
Gb4Cer GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer < 1
Gg3Cer GalNAcβ4Galβ4GlcβCer 2.8
Gg4Cer Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer 3.2
nLc4Cer Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer < 1
표 1 에 정의된 바와 같이, 이용된 조건하에서 GalCer 이 가장 좋고 LacCer 이 두번째로 좋은 수용기이다. GalAAG 및 GalDG 는 또한 어느 정도 수용기로서 제공된다. 정제된 황산기 전이효소는 GlcCer, Gb4Cer, Gg3Cer, Gg4Cer, 및 nLc4Cer 에 작용하지 않고, 상대 활성이 GalCer 에 대한 활성과 비교하여 10 % 미만이라 해도, Gb3Cer 에 작용하지 않는다.
본 발명의 황산기 전이효소의 다른 성질로는 NaCl 이 0.1 M 이하의 농도에서 황산기 전이효소 활성을 향상시키지만, 더 높은 농도에서는 억제하고, 및 GagCer 및 PAPS 에 대한 정제된 황산기 전이효소의 겉보기 Km 수치가 각각 27 및 25 μM 인 것이 포함된다. 효소는 최대활성을 pH 6.5 ∼ 7.0 에서 나타낸다. 정제된 효소는 3 개월 이상 동안 활성의 감지 가능한 소실없이 20 % 의 글리세롤의 존재하에 -80 ℃ 에서 저장될 수 있다.
본 발명의 정제된 황산기 전이효소는 램밀리의 방법 [Nature 227, 680-685 (1970)] 에 따라서 SDS-PAGE 를 수행한다. 정제된 효소를 5 % β-메르캅토에탄올을 함유하는 시료 완충액으로 처리하는 경우, 약 54 kDa 의 분자량을 갖는 단일 단백질 밴드를 나타낸다.
실시예 3
황산기 전이효소 유전자의 클로닝
(1) cDNA 라이브러리의 구축
상기-기재된 SMKT-R3 셀라인 [Urological Research, 17, 317-324 (1989)] 으로부터, 총 RNA 를 추출하고 [Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1987)], 그후 폴리(A)+ RNA 는 올리고텍스TM-dT30 (OligotexTM-dT30) (다까라 슈조사 제) 를 이용하여 정제된다. 이중 가닥 cDNA 는, 슈퍼스크립트TM (SUPERSCRIPTTM) 쵸이스 시스템 (Life Technologies 제) 를 사용하여, 정제된 폴리(A)+ RNA 로부터 합성된다. 생성된 이중 가닥 cDNA 를 EcoRI 어뎁터 (Life Technologies 제) 와 결합시킨다. 상기 cDNA 단편을 λgt10 파아지 벡터 (Pharmcia Biotech 제) 와 결찰시키고, 미리 제한효소 EcoRI 으로 절단한 후, 레디-투-고우TM (Ready-To-GoTM) 람다 패키징 키드 (Pharmacia Biotech 제) 를 이용하여 시험관 내 패키징을 수행함으로써 SMKT-R3 셀라인으로부터 유래된 λgt10 cDNA 라이브러리를 수득한다.
(2) 황산기 전이효소의 부분적인 아미노산 서열의 결정
실시예 1 에서 정제된 황산기 전이효소의 10 마이크로그램을 6 M 구아니듐 히드로클로라이드를 함유하는 1 mM EDTA 용액 (1 ml) 중에 용해시킨다. 2 μl 의 2-메르캅토에탄올을 첨가한 후, 시험관을 질소로 충진시켜 밀봉한 다음, 37 ℃ 에서 2 시간 동한 환원을 위해 항온배양시킨다. 10 마이크로리터의 4-비닐피리딘을 이어서 첨가한 후, 시험관을 질소로 충진시켜 밀봉하고, 이어서 S-피리딜에틸화를 위해 37 ℃ 에서 2 시간 동안 항온배양시킨다.
상기 수득된 피리딜에틸화 효소 단백질을 역상 HPLC (RP-HPLC) [시스템: Waters 625LC, Millipore 제; 컬럼: 코스모실 5C4-AR-300, 4.6 × 50 mm, Nacalai Tesque 제; 유속: 0.4 ml/분; 용출액 A: 0.1 % 트리플루오로아세트산 용액 (TFA); 용출액 B: 0.1 % TFA 를 함유하는 70 % 아세토니트릴; 용출: 시료 적용시 시작하여 55 분에 걸쳐 용출액 B 의 0 % ∼ 70 % 의 선형 농도구배로 수행] 에 의해서 정제된다.
정제된 S-피리딜에틸화 효소 단백질 (약 2 μg/ml) 을 3 M 우레아를 함유하는 400 μl 의 0.1 M 트리스-HCl 완충액 (pH 9.0) 중에 용해시키고 0.3 μg 의 리실 엔도펩티다제 (Wako Pure Chemical Industries 제) 로 37 ℃ 에서 12 시간 동안 절단시킨다.
펩티드 단편을 생성된 절단액으로부터 RP-HPLC [시스템: 모델 130A, Applied Biosystems 제; 컬럼: OD-300C, Aquapore, 7 μm, 1.0 × 250 mm, Applied Biosystems 제; 유속: 0.1 ml/분; 용출액 A: 0.1 % TFA 용액; 용출액 B: 0.1 % TFA 를 함유하는 70 % 아세토니트릴; 용출: 시료 적용시 시작하여 85 분에 걸쳐 용출액 B 의 0 % ∼ 70 % 의 선형 농도구배로 수행] 로 분리 정제한다.
상기 분리된 펩티드 단편은 통상적인 방법에 의한 기체상 에드만 분해에 의해서 아미노산 서열분석기 (Protein Sequencer Model 492, Applied Biosystems 제) 를 수행하여 부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3), P2 (SEQ ID NO:4), P3 (SEQ ID NO:5), P4 (SEQ ID NO:11), P5 (SEQ ID NO:12), P6 (SEQ ID NO:13) 및 P7 (SEQ ID NO:14) 을 결정한다.
(3) 프라이머의 합성
상기 (2) 에서 결정된 부분적인 아미노산 서열로부터, 합성 뉴클레오티드가 제조되어 (DNA 합성기 모델 392, Applied Biosystems 제) 합성 뉴클레오티드 프라이머를 수득한다 : 부분적인 아미노산 서열 P1 (SEQ ID NO:3) 을 근거로 하는 합성 뉴클레오티드 1Sa (SEQ ID NO:15), 1Sb (SEQ ID NO:16), 1Sc (SEQ ID NO:17), 1Sd (SEQ ID NO:6) 및 1A (SEQ ID NO:7), 부분적인 아미노산 서열 P2 (SEQ ID NO:4) 를 근거로 하는 합성 뉴클레오티드 2Sa (SEQ ID NO:9), 2Sb (SEQ ID NO:18), 2Aa (SEQ ID NO:19) 및 2Ab (SEQ ID NO:20), 및 부분적인 아미노산 서열 P3 (SEQ ID NO:5) 로부터 합성 뉴클레오티드 3S (SEQ ID NO:21) 및 3A (SEQ ID NO:10).
합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 1Sa, 1Sb, 1Sc, 1Sd, 2Sa, 2Sb 및 3S 가 센스 방향으로의 프라이머이고, 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 1A, 2Aa, 2Ab, 2A 및 3A 는 안티센스 방향으로의 프라이머이다.
혼성화중 프라이머의 상호 결합을 방지하기 위해서, 데옥시이노신으로의 염기 치환이 모든 올리고뉴클레오티드의 합성에 있어서 수행된다. 데옥시이노신은 코돈 축퇴성이 2 초과인 위치에서 치환된다. 세린 잔기를 코드하는 부분에 대해서, 2 종류의 코돈 TCX 및 AG(T/C) 의 프라이머 조합이 제조되었다.
(4) RT-PCR 방법에 의한 황산기 전이효소 유전자의 스크리닝
SMKT-R3 세포로부터 추출된 폴리(A)+ RNA 를 2 μg, 40 pmol 올리고(dT)12-18 프라이머 (Life Technologies 제), 0.25 mM (각각) dNTP, 50 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 8.3), 75 mM 염화칼륨, 3 mM 염화마그네슘, 10 mM 디티오트레이톨 및 몰로니 마우스 백혈병 바이러스로부터 유래된 200 유니트의 역전사효소 [SUPERSCRIPTTM II RNase H- 역전사효소, Life Technologies 제] 를 함유하는 반응 시스템 20 μl 중에서, 역전사효소 반응은 37 ℃ 에서 1 시간 동안 수행된다. 4 μl 분량의 상기 반응 혼합물을 주형으로 사용하여, 100 pmol 의 각각의 상기-기재된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (센스 방향 프라이머 및 안티센스 방향 프라이머), 0.25 mM (각각) dNTP 혼합물, 10 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 8.3), 50 mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화마그네슘 및 1.25 유니트의 Taq DNA 폴리머라제 (Perkin Elmer 제) 를 함유하는 50 μl 의 반응 시스템에서 PCR 을 수행한다 (RT-PCR). 반응은 94 ℃ 에서 30 초간 (변성화), 45 ∼ 55 ℃ 에서 30 초간 (프라이머 어닐링) 및 72 ℃ 에서 1 ∼ 2 분 (합성 반응) 의 순차적인 처리를 35 회 반복함으로써 수행된다.
상기 PCR 후, 전체 반응 혼합물을 2 % 아가로스 겔상에서 전기영동을 수행한다. DNA 단편을 겔로부터 절단 분리하여 pT7Blue 벡터 (Novagen 제) 에 서브클론시킨다. 상기 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 디데옥시 사슬 종결 방법에 의해서 결정된다 [Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, Perkin Elmer 제; DNA 시퀀서 모델 373A, Applied Biosystems 제].
RT-PCR 은 센스 방향을 위한 4 개의 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 1Sa, 1Sb, 1Sc 및 1Sd 및 안티센스 방향을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 1A 를 사용하여 우선적으로 수행되어, 1Sd 및 1A 의 조합으로부터 47 bp 의 cDNA 및 2Sa 및 3A 의 조합으로부터 약 600 bp 의 cDNA 를 증폭시킨다.
상기 cDNA 단편들중, 47 bp cDNA 단편을 서브클론시켜 뉴클레오티드 서열분석을 수행하고; 결정된 뉴클레오티드 서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 부분적인 아미노산 서열 P1 과 일치한다.
다음으로, 혼합된 올리고뉴클레오티드 OP1 (SEQ ID NO:8) 은 47 bp cDNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 근거로 하여 합성되고, 그의 3' 말단은 디곡시제닌 (DIG) 올리고뉴클레오티드 테일링 키트 (Boehringer Mannheim 제) 를 사용하여 말단 트랜스퍼라제로 DIG 표지된다.
DIG 표지된 혼합 올리고뉴클레오티드 OP1 을 탐침으로 사용하여, 써던 블롯 혼성화는 상기 기재된 바와 같이 RT-PCR 에 의해 증폭된 약 600 bp 의 cDNA 단편에 대해 수행된다.
일차적으로, RT-PCR 에 의해 수득된 약 600 bp cDNA 단편을 1.5 % 아가로스 겔상에서 전기영동을 수행한 후, DNA 를 나일론 막 (Boehringer Mannheim 제) 상으로 전이시킨다. 상기 나일론 막을 사용하여, 혼성화를 2 pmol/ml DIG 표지된 혼합 올리고뉴클레오티드 OP1, 5 × SSC, 2 % 블로킹 시약 (Boehringer Mannheim 제), 0.1 % N-라우릴 사르코신 및 0.20 % SDS 를 함유하는 용액중에서 55 ℃ 에서 4 시간 동안 수행된다. DIG 발광 감식 키트 (Boehringer Mannheim 제) 를 사용하여 감식이 수행된다.
결과로서, OP1 탐침은 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 2Sa 및 3A 를 사용하여 RT-PCR 에 의해 증폭된 약 600 bp cDNA 단편에 혼성화된다.
상기 약 600 bp cDNA 단편을 서브클론시켜 뉴클레오티드 서열분석을 수행하고; 부분적인 아미노산 서열 P1 및 P4 를 코드하는 서열이 상기 약 600 bp cDNA 단편내에서 발견되었다.
(5) 황산기 전이효소 유전자를 함유하는 cDNA 단편의 클로닝
실시예 3 (1) 에서 제조된 SMKT-R3 셀라인으로부터 유래된 λgt10 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 단리하기 위해서, 플라크 혼성화에 의해 스크리닝을 수행한다.
실시예 3 (3) 에서 수득된 약 600 bp cDNA 단편을 주형으로 사용하여, 이전에 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 DIG 표지된 (DIG RNA 표지 키트, Boehringer Mannheim 제) RNA 탐침이 합성된다.
약 2 × 105 재조합 λ 파아지 및 대장균 LE392 를 혼합함으로써 10 스퀘어 플레이트 (9 × 13 cm) 상에서 플레이트당 2 × 104 플라크를 형성한다. 수득된 플라크를 나일론 막 (Boehringer Mannheim 제) 상으로 전이시킨다. 막을 4 ℃ 에서 1 시간 동안 항온배양시키고, 알칼리 조건 (0.5 N NaOH, 1.5 M MaCl, 5 분) 하에서 변성시킨 다음 중성화시킨다 (1.5 M NaCl 을 함유하는 0.5 M 트리스-HCl 완충액 (pH 7.4) 로, 3 분씩, 2 회; 이어서, 2 × SSC 로 2 분씩 1 회). 막의 cm2 당 1 ng 의 디곡시제닌-표지된 RNA 탐침, 50 % 포름아미드, 5 × SSC, 2 % 블로킹 시약 (Boehringer Mannheim 제), 0.1 % N-라우릴사르코신, 및 0.02 % SDS 를 함유하는 혼성화 완충액중에서 나일론 막을 50 ℃ 에서 하룻밤 동안 혼성화시킨다. DIG 발광 감식 키트를 사용하여 감식을 수행한다. 6 개의 λ 파아지 클론을 양성 플라크로부터 수득하여 삽입된 cDNAs 를 EcoRI 절단에 의해서 pBluescript 벡터 (Stratagene 제) 에 서브클론시킨다.
결과로서, 약 1.8 kb 의 길이 이하의 cDNA 단편을 갖는 플라스미드를 수득하여 pBS-hCST1 으로 명명한다. 그의 뉴클레오티드 서열을 결정하고; 432 개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 를 발견하였다. 상기 ORF 는 상기-기재된 정제 황산기 전이효소의 부분적인 아미노산 서열분석에 의해 확인된 전체 아미노산 서열을 포함한다.
상기 결과를 토대로 하여, 황산기 전이효소 유전자의 전체 뉴클레오티드 서열 및 일차 구조가 결정된다. 황산기 전이효소를 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열표에서 SEQ ID NO:2 로 나타내고, 그에 의해 코드되는 아미노산 서열은 서열표에서 SEQ ID NO:1 로 나타낸다.
실시예 4
황산기 전이효소 폴리펩티드의 발현을 위한 플라스미드의 구축
실시예 3 에서 수득된 플라스미드 pBS-hCST1 을 제한효소 EcoRI 으로 절단하고; 생성된 DNA 단편을 포유류에 있어서의 발현 벡터인, pSVK3 (Pharmcia Biotech 제) 의 EcoRI 위치로 삽입시킨다. DNA 삽입 방향은 제한효소 절단 지도를 근거로 하여 결정된다. 상호 반대 방향으로 삽입된 2 개의 발현 플라스미드를 각각 pSV-hCST 및 pSV-hCSTR 로 명명한다.
상기 플라스미드중, pSV-hCST 를 대장균 JM109 로 형질전환시켜 형질전환체를 수득한다. 대장균 JM109/pSV-hCST 으로 명명된, 상기 형질전환체를 국제기탁기관 [National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry] 에 대장균 JM109/pSV-hCST 에 대한 기탁번호 FERM BP-5811 로 기탁한다.
실시예 5
COS-1 세포에서 재조합 황산기 전이효소 유전자의 발현
35 mm 직경 디쉬에서 하룻동안 예비 배양된 2 × 105 의 COS-1 세포 (ATCC CRL 1650) 를 1 μg 의 발현 플라스미드 pSV-hCST 또는 pSV-hCSTR 및 5μl 의 리포펙타민TM (Life Technologies 제) 로 형질감염시킨다. 37 ℃ 에서 72 시간 동안 항온배양시킨 후, 수득되는 형질전환된 COS-1 세포를 차가운 TBS (20mM 트리스-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) 로 2 회 세척하고, 실리콘 스크래퍼 (Falcon 제) 를 사용하여 0.1 % 트리톤 X-100 를 함유하는 0.2 ml TBS 로 수합하여, 얼음상에서 초음파처리함으로써 세포를 파쇄시키고, 그들을 원심분리시켜 상층액을 회수한다.
결과로서, pSV-hCST 로 형질전환된 COS-1 세포의 세포 추출 분획에서 비활성은, 대조군으로서 그 안에 도입된 pSVK3 를 갖는 COS-1 세포의 세포 추출 분획에서의 활성의 약 16 배, 및 pSV-hCSTR 로 형질전환된 COS-1 세포의 세포 추출 분획에서의 활성의 약 8 배 수준인, 1.8 × 10-5 U/mg (단백질) 인 것으로 측정된다.
다음으로, pSV-hCST 로 형질감염된 COS-1 세포가 술파티드를 발현하는지 여부를 조사하였다. COS-1 세포 (1 × 104) 는 Lab-Tek 쳄버 슬라이드 (Nunc Inc. 제) 에서 1 μg 의 pSV-hCST 및 1 μl 의 리포펙타민으로 형질감염된다. 37 ℃ 에서 48 시간 동안 항온배양한 후, 형질전환된 COS-1 세포를 PBS (pH 7.4) 로 세척하고, PBS (pH 7.4) 중 1 % 파라포름알데히드에서 고정시키고, PBS (pH 7.4) 중 1 % BSA 로 차단하고, 항-술파티드 모노클로날 항체, Sulph 1 [Biochemical Journal, 251, 17-22 (1988)] 과 항온배양한 다음, FITC-접합 염소 항-마우스 IgG 항체 (Zymed Laboratories 제) 와 항온배양시킨다. 각 항온배양 시간은 45 분이다. 표지된 세포를 벡타쉴드 (Vectashield) 봉입제 (Vector Labo 제) 에 봉입시키고, 형광 및 상 현미경을 사용하여 관찰한다.
결과로서, 세포 표면은 pSV-hCST 로 형질전환된 COS-1 세포에서 면역형광으로 염색되고, 비형질전환된 COS-1 세포는 전혀 염색되지 않으므로, 황산기 전이효소가 형질전환된 COS-1 세포에서 술파티드를 합성하는 활성을 나타내는 것이 증명되었다.
실시예 6
재조합 황산기 전이효소의 물리-화학적 성질
실시예 5 에서 수득되는 형질전환된 COS-1 세포를 얼음상에서 초음파처리하여 세포를 파쇄한다. 파쇄된 세포를 원심분리시켜 수득된 상층액은 재조합 황산기 전이효소의 효소 용액으로 사용되어 문헌 [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)] 에 기재된 방법에 따라서 그의 물리-화학적 성질을 측정한다. 결과를 하기에 나타낸다.
(1) 적정 pH
본 발명에서 재조합 황산기 전이효소의 적정 pH 는 도 1 에 나타낸 바와 같이 약 6 ∼ 8 이고, 상기 범위내에서 높은 활성이 달성된다. 달리 말하면, 도 1 은 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 적정 pH 를 나타내는 그래프이고, 여기에서 세로좌표는 상대 활성 (%) 을 나타내고, 가로좌표는 pH 를 나타낸다. 하기 완충용액은 상대 활성을 측정하기 위해서 각각 하기 pH 범위에서 사용된다 :
pH 3.0 ∼ 6.0 : 50 mM 아세테이트 완충용액;
pH 6.0 ∼ 7.0 : 50 mM 카코딜레이트 완충용액;
pH 7.0 ∼ 8.0 : 50 mM 트리에탄올아민 완충용액; 및
pH 8.0 ∼ 10.0 : 50 mM 트리스 완충용액.
도면에서, 네모 표식은 아세테이트 완충액을 나타내고, 원형 표식은 카코딜레이트 완충액을 나타내고, 세모 표식은 트리에탄올아민 완충액을 나타내고, x 표식은 트리스 완충액을 나타낸다.
(2) 적정 온도
본 발명에서 재조합 황산기 전이효소의 적정 온도는 도 2 에 나타낸 바와 같이 약 40 ℃ 이고, 상기 온도에서 최대 활성이 달성된다. 달리 말하면, 도 2 는 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 적정 온도를 나타내는 그래프이고, 여기에서 세로좌표는 상대 활성 (%) 을 나타내고, 가로좌표는 반응 온도 (℃) 를 나타낸다.
(3) 안정화 pH
안정화 pH 는 각 pH 에서 6 ℃ 로 16 시간 동안 유지시킨 다음, pH 를 7.0 으로 되돌린 후 수득된 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 각각에 대한 효소 활성을 측정함으로써 평가된다. 하기 완충용액은 잔류 활성을 측정하기 위해 하기 pH 범위 각각에 대해서 사용된다 :
pH 3.0 ∼ 6.0 : 50 mM 아세테이트 완충용액;
pH 6.0 ∼ 7.0 : 50 mM 카코딜레이트 완충용액;
pH 7.0 ∼ 8.0 : 50 mM 트리에탄올아민 완충용액; 및
pH 8.0 ∼ 10.0 : 50 mM 트리스 완충용액.
본 발명에서 재조합 황산기 전이효소는 도 3 에 나타낸 바와 같이 6 ∼ 10 인 범위의 pH 에서 안정하다. 달리 말하면, 도 3 은 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 pH 를 나타내는 그래프이고, 세로좌표는 잔류 활성 (%) 을 나타내고, 가로좌표는 pH 를 나타낸다. 도면에서, 네모 표식은 아세테이트 완충액을 나타내고, 원형 표식은 카코딜레이트 완충액을 나타내고, 세모 표식은 트리에탄올아민 완충액을 나타내고, x 표식은 트리스 완충액을 나타낸다.
(4) 안정화 온도
본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 온도를 측정한다. 결과로서, 재조합 황산기 전이효소가 30 ℃ 에서 안정하지만, 그의 활성중 85 % 는 도 4 에 나타낸 바와 같이 40 ℃ 에서의 30 분 처리에 의해서 소실된다는 것이 밝혀졌다. 달리 말하면, 도 4 는 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 온도를 나타내는 그래프이고, 세포좌표는 잔류 활성 (%) 을 나타내고, 가로좌표는 반응 온도 (℃) 를 나타낸다.
상기 서술한 바와 같이, 본 발명은 인간 신장암 셀라인 SMKT-R3 로부터 유래된 황산기 전이효소의 일차 구조 및 유전자 구조를 명확히 하고, 유전 공학에 의해서 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 저가 및 높은 순도로 생성하는 방법을 가능케 한다.
더구나, 본 발명의 황산기 전이효소 유전자와 특이적으로 혼화되는 합성 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머는 본 발명의 황산기 전이효소 유전자의 연구, 확인, 증폭 등에 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명의 황산기 전이효소의 연구, 확인, 정제 등에 유용하다.
서열표
(1) 일반 정보 :
(iii) 서열수 : 33
(2) SEQ ID NO:1 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 423 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:1 :
[서열 1a]
Figure pat00001
[서열 1b]
Figure pat00002
(2) SEQ ID NO:2 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 1269 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 이중
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: cDNA 내지 mRNA
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:2 :
[서열 2a]
Figure pat00003
(2) SEQ ID NO:3 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 16 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:3 :
[서열 3]
Figure pat00004
(2) SEQ ID NO:4 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 8 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:4 :
[서열 4]
Figure pat00005
(2) SEQ ID NO:5 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 8 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:5 :
[서열 5]
Figure pat00006
(2) SEQ ID NO:6 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3, 6 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:6 :
[서열 6]
Figure pat00007
(2) SEQ ID NO:7 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6 및 12 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:7 :
[서열 7]
Figure pat00008
(2) SEQ ID NO:8 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 47 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:8 :
[서열 8]
Figure pat00009
(2) SEQ ID NO:9 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 19 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6, 9 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:9 :
[서열 9]
Figure pat00010
(2) SEQ ID NO:10 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 23 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6, 15 및 18 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:10 :
[서열 10]
Figure pat00011
(2) SEQ ID NO:11 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 6 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:11 :
[서열 11]
Figure pat00012
(2) SEQ ID NO:12 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 9 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:12 :
[서열 12]
Figure pat00013
(2) SEQ ID NO:13 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 4 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:13 :
[서열 13]
Figure pat00014
(2) SEQ ID NO:14 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 8 개의 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 펩티드
(v) 단편 형태: 내부 단편
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:14 :
[서열 14]
Figure pat00015
(2) SEQ ID NO:15 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3, 6, 9, 12 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:15 :
[서열 15]
Figure pat00016
(2) SEQ ID NO:16 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3, 6, 12 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:16 :
[서열 16]
Figure pat00017
(2) SEQ ID NO:17 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3, 6, 9 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:17 :
[서열 17]
Figure pat00018
(2) SEQ ID NO:18 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 19 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6 및 9 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:18 :
[서열 18]
Figure pat00019
(2) SEQ ID NO:19 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 19 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 2, 8, 14 및 17 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:19 :
[서열 19]
Figure pat00020
(2) SEQ ID NO:20 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 19 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 2, 14 및 17 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:20 :
[서열 20]
Figure pat00021
(2) SEQ ID NO:21 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 23 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6, 15 및 18 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:21 :
[서열 21]
Figure pat00022
(2) SEQ ID NO:22 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:22 :
[서열 22]
Figure pat00023
(2) SEQ ID NO:23 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:23 :
[서열 23]
Figure pat00024
(2) SEQ ID NO:24 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:24 :
[서열 24]
Figure pat00025
(2) SEQ ID NO:25 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:25 :
[서열 25]
Figure pat00026
(2) SEQ ID NO:26 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:26 :
[서열 26]
Figure pat00027
(2) SEQ ID NO:27 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:27 :
[서열 27]
Figure pat00028
(2) SEQ ID NO:28 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 9 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:28 :
[서열 28]
Figure pat00029
(2) SEQ ID NO:29 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 17 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6 및 12 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:29 :
[서열 29]
Figure pat00030
(2) SEQ ID NO:30 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:30 :
[서열 30]
Figure pat00031
(2) SEQ ID NO:31 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3, 6 및 18 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:31 :
[서열 31]
Figure pat00032
(2) SEQ ID NO:32 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 6, 9 및 18 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:32 :
[서열 32]
Figure pat00033
(2) SEQ ID NO:33 의 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이: 20 개의 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 직쇄
(ii) 분자형태: 기타 핵산 (합성 DNA)
(ix) 특징:
(D) 기타 정보: 3,12 및 15 위치의 N 은 이노신이다.
(xi) 서열 표시: SEQ ID NO:33 :
[서열 33]
Figure pat00034
도 1 은 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 적정 pH 를 나타내는 그래프이다.
도 2 는 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 적정 온도를 나타내는 그래프이다.
도 3 은 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 pH 를 나타내는 그래프이다.
도 4 는 본 발명에서의 재조합 황산기 전이효소의 안정화 온도를 나타내는 그래프이다.

Claims (9)

  1. Galβ1-R (이중, Gal 은 갈락토스를 나타내고; R 은 탄수화물, 지질 또는 당접합물을 나타낸다) 으로 나타낸 당 사슬에 작용함으로써 Gal 의 C-3 위치의 히드록실기로 술페이트기를 특이적으로 전이시키는 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 단리된 유전자에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO:1 의 아미노산 서열을 갖는 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2 의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자.
  3. 제 1 항의 유전자를 함유하는 재조합 DNA.
  4. 미생물, 동물 세포 또는 식물 세포가 숙주세포로서 사용되는, 제 3 항의 재조합 DNA 를 함유하는 발현 벡터.
  5. 제 4 항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  6. 제 5 항의 형질전환체를 배양하고, 생성된 배양액으로부터 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 수합하는 단계를 포함하는, 황산기 전이효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법.
  7. 제 1 항의 유전자와 상보적인 안티센스 DNA.
  8. 제 1 항의 유전자와 상보적인 안티센스 RNA.
  9. 제 7 항의 안티센스 DNA 를 함유하는 발현 벡터.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541095A (en) * 1992-06-16 1996-07-30 University Of Massachusetts Medical Center Glycosaminoglycan specific sulfotransferases
US5585479A (en) * 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
US5569830A (en) * 1994-05-03 1996-10-29 Regents Of The University Of California Plant inhibitors of fungal polygalacturonases and their use to control fungal disease
JP3818676B2 (ja) * 1994-07-22 2006-09-06 生化学工業株式会社 ヘパラン硫酸６−ｏ−硫酸基転移酵素
JPH08322573A (ja) * 1995-05-31 1996-12-10 Seikagaku Kogyo Co Ltd スルホトランスフェラーゼをコードするｄｎａ
JP3672359B2 (ja) * 1995-07-24 2005-07-20 生化学工業株式会社 ヘパラン硫酸 ２−ｏ−硫酸基転移酵素

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biochemistry (1996.) 1부 *

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