CN1162543C

CN1162543C - 编码磺基转移酶的基因

Info

Publication number: CN1162543C
Application number: CNB971214131A
Authority: CN
Inventors: 本家孝一
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc; Takara Holdings Inc
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1997-09-20
Publication date: 2004-08-18
Anticipated expiration: 2017-09-20
Also published as: KR19980069951A; DE69735568D1; US5773274A; EP0857783A3; DE69735568T2; US6020467A; EP0857783A2; CN1188806A; KR100491573B1; EP0857783B1; US5965419A

Abstract

编码具有磺基转移酶活性的多肽的分离基因，该多肽通过作用于Ga1β1-R为代表的糖链将硫酸基团转移到Ga1的C-3-位置的羟基基团上，其中Ga1代表半乳糖；R代表碳水化合物，类脂或复合糖，和生产该多肽的方法。

Description

编码磺基转移酶的基因

技术领域

本发明涉及一种新的负责将糖脂中的糖的硫酸盐化的磺基转移酶，编码从人细胞分离的所述的酶的基因，利用表达载体生产磺基转移酶。

本发明还涉及利用反义DNA或反义RNA控制磺基转移酶的表达的方法和利用合成的低聚核苷酸探针或引物，以及抗体或它的片段检测磺基转移酶的方法。

背景技术

最近几年，已知是复合碳水化合物的细胞膜上的分子的糖链成份如糖蛋白和糖脂的各种生理学功能已经引起人们的关注。与糖链结合的硫酸基团与各种生物学功能相关。硫酸基团以各种结合方式与粘蛋白，粘多糖和糖脂的糖链结合，以及通过酯键和病毒糖蛋白，糖蛋白激素，底层膜糖蛋白，粘液霉菌溶酶体酶，等等的糖链结合。但是，它的生物学意义仍然有待阐明。

已知各种不同底物特异性的磺基转移酶。例如，作用于糖蛋白的磺基转移酶包括加硫酸基团到N-糖苷型糖链的半乳糖的3-位置[生物化学杂志，264(6)，3364-3371(1989)]的，加硫酸基团到N-糖苷型糖链的N-乙酰氨基葡糖的6-位置[生物化学杂志，319，209-216(1996)]的，加硫酸基团到粘蛋白糖链的N-乙酰半乳糖胺的3-位置[糖生物学，5(7)，689-697(1995)]的，加硫酸基团到粘蛋白糖链的N-乙酰氨基葡糖的3-位置[生物化学杂志，270(46)，27544-27550(1995)]的，和加硫酸基团到脑垂体中产生的糖蛋白激素糖链的N-乙酰氨基葡糖的4-位置[生物化学杂志，266(26)，17142-17150(1991)]的磺基转移酶。

作用于氨基葡聚糖(粘多糖)的磺基转移酶包括加硫酸基团到乙酰肝素硫酸盐的艾杜糖醛酸的2-位置[生物化学杂志，271(13)，7645-7653(1996)]，加硫酸基团到乙酰肝素硫酸盐的N-硫酸化氨基葡萄糖的6-位置[生物化学杂志，270(8).4172-4179(1995)]，加硫酸基团到肝素的艾杜糖醛酸的2-位置和N-硫酸化氨基葡萄糖的6-位置[生物化学杂志，269(40)，24538-24541(1994)]，加硫酸基团到乙酰肝素硫酸盐的N-硫酸化氨基葡萄糖的3-位置[生物化学杂志，271(43)，27072-27082(1996)]，作用于乙酰肝素硫酸盐的N-硫酸化[生物化学杂志263(5)，2417-2422(1988)]，作用于肝素的N-硫酸化[生物化学杂志，266(13)，8044-8049(1991)]，加硫酸基团到硫酸软骨素的N-乙酰半乳糖胺和硫酸角质素的半乳糖的6-位置和加硫酸基团到硫酸软骨素的N-乙酰半乳糖胺的4-位置[生物化学杂志，268，(29)，21968-21974(1993)，和仅作用于角膜硫酸角质素[生物化学杂志，259，(19)，11771-11776(1984)]的磺基转移酶。

除了本发明的磺基转移酶，已知通过加硫酸基团到葡糖苷酸的3-位置[生物化学杂志，268(1)，330-336(1993)]参与被单克隆抗体HNK-1识别的糖链的合成的磺基转移酶作用于糖脂。

在这些磺基转移酶中，已知起源于大鼠肝脏的参与肝素糖链的合成的N-磺基转移酶[N-乙酰肝素硫酸盐磺基转移酶，生物化学杂志，267(22)，15744-15750(1992)]，起源于MST细胞的参与肝素糖链的合成的N-磺基转移酶[N-脱酰酶/N-磺基转移酶，生物化学杂志，269(3)，2270-2276(1994)]，起源于鸡胚软骨细胞的通过转移硫酸基团到N-乙酰半乳糖胺的C-6位置参与软骨素糖链的合成的酶[软骨素6-磺基转移酶，生物化学杂志，270(31)，18575-18580(1995)]作用于已经被克隆的复合碳水化合物。

本发明人纯化了3’-磷酸腺苷酸-5’-磷酸硫酸盐：GalCer磺基转移酶[EC 2.8.2.11]，一种加硫酸基团到半乳糖的3-位置的羟基上的磺基转移酶，它来自人肾癌细胞系(SMKT-R3)[生物化学杂志，119(3)，421-427(1996)]。所述磺基转移酶在人肾癌组织或其细胞系中高水平表达，它的水平与肾癌细胞中硫酸化糖脂的积累有关。尽管这一事实暗示了该酶和癌症的关系，但该酶的氨基酸序列仍有待测定，其基因仍有待克隆。

在过去对已知磺基转移酶的工业利益的生产的尝试中，由于该酶的低天然丰度并且与其它酶如蛋白酶和硫酸酯酶共同存在，通过简单的方法和大量地以纯化形式分离所需要的磺基转移酶非常困难。

所以需要利用基因工程技术克隆磺基转移酶基因和低耗高纯度生产磺基转移酶的方法。虽然如上所述，有克隆磺基转移酶基因的报道，但可得到的报道的数量很少。同时因为存在大量的不同底物特异性的磺基转移酶，利用一种上面提到的磺基转移酶基因获得另一种不同底物特异性的磺基转移酶的基因的尝试遇到的困难是由于不同底物特异性的酶之间的低基因同源性而难于获得所需要的磺基转移酶基因。此外，由于作用于糖脂糖链的磺基转移酶的氨基酸序列和基因结构仍然未知，难于用基因工程手段克隆和生产这样的磺基转移酶。

因此，本发明的第一个目的是提供编码在肾细胞中特定表达，在肾癌细胞中以高水平特定表达和作用于糖脂的糖链的磺基转移酶的基因。

本发明的第二个目的是提供生产高纯度磺基转移酶的方法，该酶是利用导入含有前面所述的基因的表达载体的转化体的遗传工程方法得到的。

本发明的第三个目的是提供前面所述的基因编码的多肽。

本发明的第四个目的是提供与本发明的基因或其一部分互补的反义DNA和反义RNA。

本发明的第五个目的是提供与本发明的基因特异地杂交的合成低聚核苷酸探针或引物。

本发明的第六个目的是提供与多肽特异结合的抗体或其片段。

本发明的第七个目的是提供纯化的磺基转移酶。

从下面的叙述中能明了本发明的这些和其它目的。

发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及一种编码具有磺基转移酶活性的多肽的分离基因，该多肽通过作用于以Galβ1-R为代表的糖链特异地将硫酸基团转移到Gal的C-3-位置的羟基基团上，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，类脂或复合糖。

在另一个实施方案中，本发明涉及生产具有磺基转移酶活性的多肽的方法，该方法包括步骤：培养导入本发明的基因的转化体和从得到的培养物中收集具有磺基转移酶活性的多肽。

仍然在另一个实施方案中，本发明涉及被本发明的基因编码的具有磺基转移酶活性的多肽。

仍然在另一个实施方案中，本发明涉及与本发明的多肽特异结合的抗体或其片段。

仍然在另一个实施方案中，本发明涉及纯化的磺基转移酶，该酶作用于以Galβ1-R为代表的糖链，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，类脂或复合糖，以便特异地转移硫酸基团到Gal的C-3-位置的羟基基团上。

附图说明

图1以图谱显示本发明的重组磺基转移酶的最适pH；

图2以图谱显示本发明的重组磺基转移酶的最适温度；

图3以图谱显示本发明的重组磺基转移酶的稳定pH；和

图4以图谱显示本发明的重组磺基转移酶的稳定温度。

发明详述

如本文所述，术语“具有通过作用于以Galβ1-R，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，类脂或复合糖，为代表的糖链将硫酸基团特异地转移到Gal的C-3-位置的羟基基团上的磺基转移酶活性”(下文中也称为“具有磺基转移酶活性”)是指具有下面作用和底物特性的特征的特性。具有这样的磺基转移酶活性的多肽包括那些具有下面物理化学特性的多肽，生物化学杂志，119(3)，421-427(1996)给出了一个例子。

1.作用

作用于以Galβ1-R为代表的糖链，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物，类脂或复合糖，以便特异地转移硫酸基团到Gal的C-3-位置的羟基基团上。

2.底物特异性

与半乳糖基神经酰胺(GalCer)，乳糖神经酰胺(LacCer)，半乳糖1-烷基-2-酰基甘油(GalAAG)，半乳糖二酰基甘油(GalDG)，葡糖神经酰胺(GlcCer)，神经酰胺四己糖苷(Gb4Cer)，gangliotriaosyl神经酰胺(Gg3Cer)，gangliotetraosyl神经酰胺(Gg4Cer)和neolactotetraosyl神经酰胺(nLc4Cer)反应，与神经酰胺三己糖苷(Gb3Cer)，半乳糖和乳糖不反应。

3.最适pH和稳定pH

最适pH约为7.0，稳定pH是6.0-8.0。

4.最适温度和稳定温度

最适温度约为37℃，稳定温度高达80℃。

5.分子量

在还原条件下SDS-PAGE测定，约为54kDa。

用根据分析生化，182，9-15(1989)叙述的方法稍微修改的方法可以测定磺基转移酶的活性。具体地说，制备了50μl反应混合物，其中包括溶于5nmolGalCer，0.5μmol，MnCl₂，lnmol[³⁵S]PAPS(100cpm/pmol)，0.5mgLubrolPX，12.5nmol/二硫苏糖醇，0.25μmol NaF，0.1μmol ATP，20μg BSA和25mM二甲胂酸钠-HCl(pH6.5)中的20ng酶蛋白。在37℃温育混合物30分钟后，加入1ml氯仿/甲醇/水(30∶60∶8)终止反应。用DEAE-葡聚糖凝胶A-25分离反应产物，用液体闪烁计数器测定放射性。将一单位的活性定义为每分钟转移1μmol硫酸基团的酶量。如果反应产物显示不低于1×10^-7毫单位的如这一方法所测定的活性，那么判定产物具有磺基转移酶活性。

如本文所用，术语“基因”指编码具有上述磺基转移酶活性的多肽的基因，或含有所述基因的基因。具体地说，本发明的基因的例子是编码含有序列表的SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列的多肽或其一部分的基因和含有序列表的SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其一部分的基因。甚至编码含有部分SEQID NO：1所示的氨基酸序列的多肽的基因或含有部分SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的基因也在本发明的范围内，只要它们编码具有磺基转移酶活性的多肽。这些是起源于人肾癌细胞系SMKT-R3的3’-磷酸腺苷酸-5’-磷酸硫酸盐：GalCer磺基转移酶[EC2.8.2.11]的基因，但本发明并不局限于它们。任何基因，甚至起源于微生物，如细菌，酵母，丝状真菌，子囊菌和担子菌，植物，和动物以及其它人组织的基因都包括在本发明的范围内，只要它们编码具有同样的磺基转移酶活性的多肽，本发明还包括上述编码具有相同磺基转移酶活性功能的多肽的基因的突变体。例如，任何编码由于序列表的SEQID NO：1所示的氨基酸序列的一个到几个氨基酸残基的缺失，叠加，插入或替代产生的多肽的基因都包括在本发明的基因中，只要它们编码具有磺基转移酶活性的多肽。简要地说，不仅那些从天然源分离的基因而且人工制备的基因都包括在本发明的范围内，只要它们编码具有磺基转移酶活性的多肽。

同时，那些编码能与本发明的基因在严格条件下杂交，并具有磺基转移酶活性的多肽的基因也包括在本发明的范围内。

如本文所述，术语“在严格条件下”意指，例如下面所示的条件.具体地说，温育在50℃在含有0.5％SDS，5×Denhardt’s[Denhardt’s＝0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯基吡咯烷酮，0.1％Ficoll 400]和100μg/ml的鲑精子DNA的6×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.0)中进行4小时。

在本发明中，重组DNA是基因工程技术得到的DNA，含有本发明的基因。

在本发明中，表达载体是通过插入上述重组DNA构建的载体以便它在所需的寄主细胞中表达。掺入下面叙述的反义DNA的载体也包括在本发明的表达载体中。被插入的载体可以是质粒载体或噬菌体载体。有用的质粒载体包括，但不限于，pUC18，pUC19，pBluescr ipt，pT7和其它商业可获得产品；有用的噬菌体载体包括，但不限于，λgt10和λgt11λ噬菌体载体和其它商业可获得产品。寄主细胞包括微生物，动物细胞和植物细胞，可根据所用的表达载体适当选择。

在本发明中，转化体是通过在上述寄主细胞中导入上述表达载体得到的细胞，它表达本发明的基因。

通过例如分子克隆，实验室手册，T.Maniatis et al.，eds.，冷泉港实验室出版，1982，pp249-254叙述的方法可以完成表达载体的导入。其次，为了选择表达所需基因的转化体，利用了表达载体的特性。例如，当质粒载体是pBluescript并且寄主细胞是大肠杆菌时，通过选择在含有氨苄青霉素的平板上选择具有氨苄青霉素抗性的菌落，或在含有氨苄青霉素，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的平板上选择具有氨苄青霉素抗性的白色菌落来分离掺入外源基因的菌落。

本发明提供从在表达本发明的基因和生产所述基因编码的多肽的条件下培养上述转化体得到的培养物中生产具有磺基转移酶活性的多肽的方法。

如果确认了所需磺基转移酶的表达，通过使转化体的培养基组成，培养基pH，培养温度，所用诱导物的量和时间，培养时期和表达磺基转移酶的其它条件最佳化，就可以有效地生产磺基转移酶。

利用已知的方法可以从转化体培养物中纯化磺基转移酶。当转化体在细胞内积累表达产物，如在大肠杆菌，那么在完成培养后离心收集转化体，然后用超声波或诸如此类方法破碎，接着离心等等，以便产生无细胞提取物。通过普通蛋白质纯化方法，如盐析，凝胶过滤，和疏水，亲和和其它各种层析法，可以从所述的提取物中纯化所需的磺基转移酶。在某些寄主-载体系统的情况中，表达产物分泌到转化体外。在这种情况下，可以用上述同样方法从培养物的上清液中纯化所述酶。

对于某些寄主-载体系统的情况中，在转化体中表达的多肽以不溶物质积累(内含体)。在这种情况下，可以回收不溶物质并在温和条件下溶解如变性处理，例如脲溶解，接着去除变性，恢复原始活性。

虽然寄主细胞中转化体产生的外源磺基转移酶与各种内源磺基转移酶共存，但由于它的量远远超过内源磺基转移酶的量，它的纯化非常容易。同时，当磺基转移酶分泌到转化体外时，培养基成份等是共同存在的，但它们通常差不多没有干扰磺基转移酶纯化的蛋白质成份，一个有利的方面是与从SMKT-R3细胞纯化磺基转移酶相比，它的纯化不需要费力的分离过程。

对于真核细胞起源的磺基转移酶的情况，酶本身具有糖链。在这样的情况，利用不能生物合成糖链的宿主细胞，例如，原核细胞，如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌或放线菌类，或失去糖链生物合成能力的突变酵母，真菌，动物，昆虫或植物细胞，生产具有磺基转移酶活性但没有糖链的多肽。此外，可以将糖链添加到酶本身。在这样的情况下，利用能生物合成糖链的寄主细胞，例如，酵母，真菌，动物，昆虫或植物细胞，可以生产具有磺基转移酶活性并具有糖链的多肽。

本发明的多肽是被本发明的上述基因编码的多肽，并具有磺基转移酶活性，那些具有上述各种物理-化学特性的即是例子。具体地说，本发明的多肽的例子是具有SEQ ID N0：1显示的氨基酸序列的天然存在的磺基转移酶多肽或含有其一部分的多肽，和由于SEQ ID NO：1显示的氨基酸序列的一个至几个氨基酸残基的缺失，叠加，插入或替代产生的多肽。

在本发明中，将“反义DNA”和“反义RNA”定义为具有与本发明的磺基转移酶基因或其一部分互补的核苷酸序列并通过与该基因形成双链结构抑制或调节从内源磺基转移酶基因(基因组DNA和mRNA)表达基因信息(转录，翻译)。反义DNA或反义RNA的长度是可以根据核苷酸序列的特异性和导入细胞的方法而变化。通过利用合成仪，以相反于正常方向的方向(反义方向)表达基因，或诸如此类的人工合成可以制备反义DNA或反义RNA。例如，已知有大量的反义技术，包括用tat基因[核酸研究，19，3359-3368(1991)]或rev基因[美国国立科学院进程，86，4244-4248(1989)]抑制HIV繁殖。通过这些方法，和利用本发明的反义DNA或反义RNA，可以抑制或调节内源磺基转移酶基因的表达。也可以将本发明的反义DNA或反义RNA用作实验室原位杂交等的试剂。

在本发明中，合成的低聚核苷酸探针或引物是与上述基因特异杂交的核苷酸。通过利用合成仪的人工合成方法或PCR方法通常可以制备所述的低聚核苷酸探针或引物。

在本发明中，任何抗体，单克隆的或多克隆的，或其片段，只要能与本发明的多肽特异结合都能满足目的。通过例如，John Wiley和Sons，Inc.，1992出版的免疫学，John E.Coligan，ed.，的现有方案叙述的方法，利用本发明的整个或部分多肽免疫接种兔，鼠或其它动物可以容易地制备本发明的抗体。在纯化后，可以用肽酶等处理该抗体以便生产抗体片段。得到的抗体或其片段的用途包括亲和层析，cDNA文库筛选，和药学，诊断试剂和研究试剂。

下文通过来自泌尿学研究，17，317-324(1989)叙述的SMKT-R3，人肾癌细胞系的磺基转移酶的例子对本发明作了详细的描述。

通过生物化学杂志，119(3)，421-427(1996)(该公开物引入本文作为参考)，叙述的方法，首先大量培养SMKT-R3细胞得到本发明的磺基转移酶，然后从细胞培养物中分离和纯化磺基转移酶。具体地说，本发明的纯化磺基转移酶是通过下面叙述的方法生产的。

收集用EGF处理的SMKT-R3细胞(约1×10¹⁰个细胞)，用PBS洗涤，储存于-80℃直到使用。使用时，融化2.5×10⁹个细胞，悬浮于等体积的TBS，用Potter型匀浆器简单地匀浆。用等体积的2×溶解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，10mM MgCl₂，2mM β-巯基乙醇，2％Lubrol PX，40％甘油，0.5mM氟化苯甲砜，和0.02mM E-64)补充到匀浆并在冰上声处理10分钟。在离心后，将得到的上清液在缓冲液A(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，10％甘油，和5mMMnCl₂)中透析。

离心透析物质除去透析过程中出现的沉淀。将上清液加到DE-52柱上，柱的出口直接与用缓冲液B(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，10％甘油，和5mM MnCl₂)平衡过的肝素-琼脂糖CL6B柱相连。然后用缓冲液B洗柱直到流出物在280nm处的吸光值小于0.02。在脱离DE-52柱后，用溶于缓冲液C(20mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.1％Lubrol PX，20％甘油，和10mMMnCl₂)的0.2M NaCl洗脱在肝素-琼脂糖CL6B柱上的酶。

合并肝素-琼脂糖层析的酶活性馏分，并在缓冲液B中透析。将渗析液加到用缓冲液B平衡过的半乳糖基鞘氨醇(GalSph)-琼脂糖柱上。然后用缓冲液B洗柱直到洗脱液基本无蛋白，用含有0.1M NaCl的缓冲液C洗脱磺基转移酶。

合并Gal Sph-琼脂糖上的洗脱馏分，并在含有10％甘油的10mM三乙醇胺-HCl(pH7.0)中透析并加到直接与用缓冲液D(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，和10％甘油)平衡过的HiTrap3’，5’-二磷酸腺苷酸(PAP)柱相连的PLP-琼脂糖柱上。用缓冲液D和缓冲液B连续洗柱直到洗出液基本无蛋白，然后用缓冲液D中的0-0.3mM PAP的线性梯度洗脱磺基转移酶。

合并HiTrap PAP层析的酶活性馏分，直接在用缓冲液D平衡过的肝素-琼脂糖柱上进行第二次层析。在用缓冲液D洗柱后，用含有0.3M NaCl的缓冲液C以0.3ml的每个馏分洗脱本发明的磺基转移酶。通过这一步，酶制剂被浓缩到约为起始体积的五分之一，并且在无逆流馏分中回收包含于前面的层析得到的酶制剂中的PAP。合并纯化的酶活化馏分并在存在20％甘油时储存于-80℃。

然后，获取纯化的磺基转移酶的部分氨基酸序列的信息。为了测定部分氨基酸序列，用Edman分解方法[生化杂志，256，7990-7997(1981〕将磺基转移酶直接用于氨基酸序列仪(蛋白质序列仪476A，Applied Biosystems生产)以测定磺基转移酶中10-20个N-末端的氨基酸残基。可替代地，可以通过高底物特异性的蛋白酶，例如，无色杆菌蛋白酶I或N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶的作用有限水解磺基转移酶，通过反相HPLC分离和纯化得到的肽片段，在这之后，对纯化的肽片段进行氨基酸序列分析，有效地测定需要的氨基酸序列。

在本发明中，测定了七个肽片段的氨基酸序列：P1(SEQ ID NO：3)，P2(SEQID NO：4).P3(SEQ ID NO：5)，P4(SEQ ID NO：11)，P5(SEQ ID NO：12)，P6(SEQ IDNO：13)和P7(SEQ ID NO：14)。

在这样测定的部分氨基酸序列的基础上，克隆本发明的磺基转移酶基因。为此，利用了通常使用的PCR方法或杂交方法。根据PCR技术，Erhich，HA，ed.，Stockton出版社出版，1989叙述的方法可以完成PCR方法。根据例如，冷泉港实验室出版社，1989年出版的分子克隆，实验室手册，第二版，T.Maniatis et al.，eds.叙述的方法可以完成杂交方法。

但是，用下面的使用混合引物(SEQ ID NO：22-27)(MOPAC方法)的PCR方法，使用含有肌苷的混合引物(SEQ ID NO：28-33)的MOPAC方法或使用合成的低聚核苷酸(SEQ ID NO：22和24)的杂交方法不能克隆本发明的磺基转移酶基因。

1)使用混合引物的PCR方法(MOPAC方法)

这一克隆方法包括选择测定的氨基酸序列中两个低简并性的区域，合成所有简并密码子的可能的核苷酸序列的组合，并利用它们作为混合引物通过PCR扩增需要的DNA片段。

用这一方法，已经克隆了编码尿酸氧化酶的基因[科学，239，1288-1291(1988)]。

本发明人曾试图用这一方法获得本发明的磺基转移酶。制备了各种合成的低聚核苷酸：根据部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)合成的低聚核苷酸S1(SEQID NO：22)和A1(SEQ ID NO：23)，根据部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO：4)合成的低聚核苷酸S2(SEQ ID NO：24)和A2(SEQ ID NO：25)，根据部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO：5)合成的低聚核苷酸S3(SEQ ID NO：26)和A3(SEQ ID NO：27)。利用这些合成的低聚核苷酸作为混合引物，用SMKT-R3细胞cDNA作为模板通过常规方法进行PCR。

用琼脂糖凝胶电泳分离得到的PCR产物。发现大量的DNA片段已经得到扩增，将它们每个从凝胶上切下，萃取，掺入质粒载体，在这之后用常规方法(双脱氧链终止方法)测定它的核苷酸序列，虽然发现了用作混合引物的合成低聚核苷酸的核苷酸序列，但没有发现类似来自所需的磺基转移酶基因的序列。

2)使用肌苷的MOPAC方法

这一方法与上面项目1)叙述的方法相同，所不同的是使用了由用肌苷替代高简并性的密码子的第三个碱基以减少混合引物的组合的数目[核酸研究，16(22)，10932(1988)]得到的引物。

制备了各种合成的低聚核苷酸：根据部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)的合成的低聚核苷酸SI1(SEQ ID NO：28)和AI1(SEQ ID NO：29)，根据部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO：4)的合成的低聚核苷酸SI2(SEQ ID NO：30)和AI2(SEQ IDNO：31)，和根据部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO：5)的合成的低聚核苷酸SI3(SEQID NO：32)和AI3(SEQ ID NO：33)。利用这些合成的低聚核苷酸作为含有肌苷的混合引物，用SMKT-R3细胞作模板通过常规方法进行PCR。

用相同于上面的方法测定得到的PCR产物的核苷酸序列，但没有发现类似于来自所需基因的序列虽然发现了用作含有肌苷的混合引物的合成低聚核苷酸的核苷酸序列。

3)使用合成的低聚核苷酸的杂交方法

另一个通常使用的方法包括通过在氨基酸序列信息基础上设计合成的低聚核苷酸克隆所需的DNA，和用常规方法与此进行杂交。本发明人曾试图用该方法检测本发明的磺基转移酶基因。

从部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)和P2(SEQ ID NO：4)分别制备推测的合成低聚核苷酸S1(SEQ ID NO：22)和S2(SEQ ID NO：24)，并用作噬菌斑杂交的探针。用常规方法将SMKT-R3细胞的cDNA插入噬菌体载体以便生成cDNA文库。将用这一cDNA文库感染的大肠杆菌散布于平板；将得到的每个噬菌斑影印在尼龙膜上。在常规使用的条件下进行杂交。

结果是，在两种合成低聚核苷酸S1和S2用作探针的情况中检测到大量的阳性噬菌斑。用常规方法测定这些阳性噬菌斑的噬菌体载体中的插入DNA的核苷酸序列。虽然得到了同源于一个用作探针的合成的低聚核苷酸的核苷酸序列的序列，没有发现类似于所需磺基转移酶基因的序列；从噬菌体载体中的DNA插入物的核苷酸序列测定的氨基酸序列与上面提到的部分氨基酸序列没有同源性。

如上所述，从SMKT-R3细胞的cDNA克隆本发明的磺基转移酶基因是非常困难的。由于聚合酶反应的抑制，非特异性退火，或诸如此类而在PCR方法中扩增了非特异DNA片段似乎是磺基转移酶基因由于高G+C含量而采用二级结构的趋势的结果。考虑到这些方面，本发明人做了广泛的研究，试图用PCR方法扩增对应于已知氨基酸序列的一个肽片段的短基因片段。

优选的是将PCR方法的引物设计为含有肌苷以减少混合的引物组合的数目，和更优选的是对于亮氨酸选择经常使用的密码子，和通过提供大量的丝氨酸密码子的组合减少核苷酸序列的简并性后合成引物。因此扩增部分本发明的磺基转移酶基因是可能的。其次，本发明人用这一扩增的PCR产物作为探针进行Southern杂交，并成功地在得到的非特异的DNA片段中发现了起源于所需的磺基转移酶基因的DNA片段。

更具体地说，根据部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)新制备合成的低聚核苷酸1Sd(SEQ ID NO：6)和1A(SEQ ID NO：7)作为PCR方法的引物，用SMKT-R3细胞的cDNA作模板进行PCR。

用例如，双脱氧链终端方法[美国国立科学院进程，74(12)，5463-5467(1977)]测定得到的每个PCR产物的核苷酸序列；发现了编码部分氨基酸序列P1的核苷酸序列，即，得到了所需要的磺基转移酶基因的一部分。根据这一核苷酸序列，制备合成的低聚核苷酸OP1(SEQ ID NO：8)，并用常规方法标记3’末端，用作杂交的探针。

同时，分别根据部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO：4)和P3(SEQ ID NO：5)新制备合成的低聚核苷酸2Sa(SEQ ID NO：9)和3A(SEQ ID NO：10)作为PCR方法的引物，用SMKT-R3细胞cDNA作模板进行PCR。

用琼脂糖凝胶电泳分离得到的PCR产物，之后用常规方法[冷泉港实验室出版社1989年出版的分子克隆，实验室手册，第二版，T.Maniatis etal.，eds.]将它影印到尼龙膜上，接着用3’末端标记的合成的低聚核苷酸OP1杂交。如上所述，在严格条件下进行杂交，用适用于标记物的检测方法检测与所述探针杂交的DNA片段。

结果是，在对应于约600bp位置得到与合成的低聚核苷酸OP1杂交的带。用同样于上面的方法测定该片段的核苷酸序列；发现了对应于磺基转移酶的部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)和P4(SEQ ID NO：11)的序列，证明得到了所需的磺基转移酶基因部分。

单独地，制备了起源于SMKT-R3细胞的cDNA文库。用冷泉港实验室出版社1989年出版的分子克隆，实验室手册，第二版，T.Maniatis et al.，eds.，第八章叙述的方法可以制备cDNA文库。

此外，通过用上述约600bpDNA片段作探针筛选起源于SMKT-R3细胞的上述cDNA文库，可以克隆编码磺基转移酶的全长基因。同时，通过筛选起源于SMKT-R 3细胞的基因组DNA文库，也可以得到本发明的磺基转移酶的基因组DNA。

这样得到的人肾癌细胞系SMKT-R3细胞产生的磺基转移酶基因的整个核苷酸序列是序列表的SEQ ID NO：2所示的序列，而整个氨基酸序列是序列表的SEQ ID NO：1所示的序列。同时，该氨基酸序列和核苷酸序列是新序列，缺乏与任何已知的不同底物特异性的磺基转移酶基因的同源性。

由于本发明的磺基转移酶基因的整个核苷酸序列已经阐明，利用本发明的磺基转移酶基因的全部或部分作为杂交的探针，通过筛选起源于除了SMKT-R3细胞的有机体的基因组DNA或cDNA，或基因组DNA文库或cDNA文库可以克隆与本发明的磺基转移酶基因高度同源的DNA。

同样，根据本发明的磺基转移酶的核苷酸序列，可以设计用于PCR的引物。利用这一引物，可以检测与来自起源于除了SMKT-R3细胞的基因组DNA或cDNA，或基因组DNA文库或cDNA文库的本发明的磺基转移酶基因高度同源的DNA片段，或获得全长基因。

为了证实是否得到的基因是编码具有所需的磺基转移酶活性的多肽的基因，分别根据测定的核苷酸序列或测定的氨基酸序列与本发明的磺基转移酶的核苷酸序列或氨基酸序列的同源性进行估计是可能的。另外，在用上述方法得到该基因产物后，用上述测定方法测定磺基转移酶的活性；如果活性不低于1×10^-7毫单位，判定该基因编码了本发明的多肽。

为了生产具有同样的磺基转移酶活性的功能相当的产物，可以利用下面的方法。通过在本发明的磺基转移酶基因中导入随机突变或位点特异性突变，得到了在天然存在的磺基转移酶的氨基酸序列中引起一个到几个氨基酸残基的缺失，叠加，插入或替代的基因。从而可能得到编码具有与天然存在的磺基转移酶相同活性但具有稍微不同特性，如最适温度，稳定温度，最适pH和稳定pH的磺基转移酶的基因，并用基因工程生产这样的磺基转移酶。

随机突变的方法包括，例如，化学DNA处理方法，其中通过亚硫酸氢钠的作用引起易位突变[美国国立科学院进程，79，1408-1412(1982)]将胞嘧啶碱基转换成尿嘧啶碱基，生化方法，其中在存在[α-S]dNTP时在双链合成的过程中引起碱基取代[基因，64，313-319(1988)]，根据PCR的方法，其中在存在加到反应系统的锰时进行PCR以致减弱核苷酸掺入的精确度[分析生化，224，347-353(1995)]。

已知的位点特异性诱变方法，例如，琥珀样突变基础上的方法[豁口双联方法，核酸研究，12，(24)，9441-9456(1984)]，利用限制酶位点的方法[分析生化，200，81-88(1992)；基因，102，67-70(1991)]，dut(dUTPase)和ung(尿嘧啶DNA糖基化酶)突变基础上的方法[Kunkel方法，美国国立科学院进程，82，488-492(1985)]，利用DNA聚合酶和DNA连接酶的琥珀样突变基础上的方法[低聚核苷酸指导的双重琥珀(ODA)方法，基因152，271-275(1995)]，和利用两种加入限制酶识别位点的诱变引物进行的PCR基础上的方法(USP5,512,463)。

同样，利用商业途径获得的试剂盒，可以容易地引入位点特异性突变。商业途径获得的试剂盒的例子包括基于缺口豁口双联体方法的Mutan^R-G(TakaraShuzo生产〕，基于Kunkel方法的Mutan^R-K(Takara Shuzo生产)，基于ODA方法的Mutan^R-Express Km(Takara Shuzo生产)，利用诱变引物和起源于激烈热球菌的DNA聚合酶的QuikChange^TM位点特异性的诱变试剂盒(STRATAGENE生产)。PCR基础的方法还包括Takara LA-PCR体外诱变试剂盒(Takara Shuzo生产)和Mutan^R-Super Express Km(Takara Shuzo生产)。

如上所述，本发明阐明了起源于人肾癌细胞系SMKT-R3的磺基转移酶的初级结构和基因结构，以及允许通过基因工程手段低成本高纯度地生产具有磺基转移酶活性的多肽的方法。

此外，将与本发明的磺基转移酶基因特异地杂交的合成的低聚核苷酸探针或引物用于本发明的磺基转移酶基因的研究，检测，扩增等等。与本发明的多肽或其片段特异地结合的抗体可用于本发明的磺基转移酶的研究，检测，纯化，等等。

偶尔，通过利用编码具有本发明的磺基转移酶活性的多肽的基因的基因技术制备的本发明的重组磺基转移酶具有下面的最适pH，最适温度，稳定pH，和稳定温度，对于生化杂志，119(3)，421-427(1996)公开的天然磺基转移酶，得到同样的表示如下的结果。

(1)最适pH

如图1所示，本发明的重组磺基转移酶的最适pH约是6-8，在这一范围内获得最高活性。

(2)最适温度

如图2所示，本发明的重组磺基转移酶的最适温度在40℃左右，在这一温度获得最大活性。

(3)稳定pH

如图3所示，本发明的重组磺基转移酶的稳定pH是6-10。

(4)稳定温度

如图4所示，本发明的重组磺基转移酶的稳定温度是在30℃时显示稳定，而在40℃处理30分钟后失去了85％的酶活性。

实施例

下面的实施例说明了本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

从SMKT-R3细胞纯化磺基转移酶

收集用50ng/ml的EGF处理12到24小时的SMKT-R3细胞，用PBS洗涤，储存于-80℃直到使用。使用时，冻融2.5×10⁹个细胞，悬浮于等体积的TBS中，用Potter型匀浆器简单地匀浆。用等体积的2×溶解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.4，10mM MgCl₂，2mMβ-巯基乙醇，2％Lubrol PX，40％甘油，0.5mM氟化苯甲砜，和0.02mM E-64)补充到匀浆，并在冰上声处理10分钟，在100,000×g离心1小时后，在缓冲液A(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，10％甘油，和5mM MnCl₂)中透析得到的上清液过夜。

在10,000×g离心透析物质30分钟除去透析过程中出现的沉淀。在沉淀中没有检测到磺基转移酶活性。将上清液加到出口直接与用缓冲液B(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，10％甘油，和5mM MnCl₂)平衡过的肝素-琼脂糖CL6B柱(2×10cm，Pharmacia Biotech生产)连接的DE-52柱(3×20cm，Whatman生产)上。然后用缓冲液B以40ml/小时的流速洗柱直到在280nm处流出物的吸光值小于0.02。在脱离DE-52柱后，用溶解于缓冲液C(20mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.1％Lubrol PX，20％甘油，和10mM MnCl₂)中的0.2M NaCl洗脱肝素-琼脂糖CL6B柱上的酶。

合并肝素-琼脂糖层析中的酶活性馏分并在缓冲液B中透析。将渗析液以5ml/小时的流速加到用缓冲液B平衡过的GalSph-琼脂糖柱(1×10cm，Pharmacia Biotech生产)上。然后用缓冲液B洗柱直到洗脱液基本无蛋白并用含有0.1M NaCl的缓冲液C洗脱磺基转移酶。

合并GalSph-琼脂糖上的洗脱馏分，并在含有10％甘油的10mM三乙醇胺-HCl(pH7.0)中透析并以5ml/小时的流速加到直接与用缓冲液D(10mM三乙醇胺-HCl，pH7.0，0.05％Lubrol PX，和10％甘油)平衡过的HiTrapPAP柱(5ml床体积，Pharmac ia Biotech生产)相连的PLP-琼脂糖柱(1×10cm，PhaemaciaBiotech)上。用缓冲液D和缓冲液B连续洗柱直到洗脱液基本无蛋白，然后用缓冲液D中的0-0.3mM PAP的线性梯度洗脱磺基转移酶。

合并HiTrap PAP层析的酶活性馏分，直接在用缓冲液D平衡过的肝素-琼脂糖柱(0.3cm床体积)上进行二次层析。在用缓冲液D洗柱后，用含有0.3MNaCl的缓冲液C以0.3ml的馏分洗脱本发明的磺基转移酶。通过这一步，酶制剂被浓缩到约为起始体积的五分之一，并且在无逆流馏分中回收包含于前面的层析得到的酶制剂中的PAP。合并纯化的酶活性馏分并在存在20％甘油时储存于-80℃。如下面实施例2的描述进行测定，纯化的酶的比活性为1.2单位./mg。

实施例2

纯化的磺基转移酶的作用，底物特异性和物理-化学特性

如分析生化182，9-15(1989)所述，经稍微修改测定实施例1得到的磺基转移酶的活性。反应混合物含有5nmol GalCer，0.5μmol MnCl₂，1nmol[³⁵S]PAPS(100cpm/pmol)，0.5mg Lubrol PX，12.5nmol二硫苏糖醇，0.25μmolNaF，0.1μmol ATP，20μg BSA，和溶解于25mM二甲胂酸钠-HCl的酶蛋白，pH6.5，总体积50μl。在测试底物特异性的实验中，使用25nmol的测试糖脂替代5nmol GalCel作受体。在37℃温育30分钟后，用1ml的氯仿/甲醇/水(30∶60∶8)终止反应。在DEAE-琼脂糖A-25柱上分离反应产物，并用液体闪烁计数器测定放射性。用空白值校正该值，空白值是利用没有受体的上述反应混合物得到的。将一个单位的活性定义为在上面提到的测定条件下每分钟转移1μmol硫酸的酶量。

表1

底物	结构	相对活性(％)
底物	结构	相对活性(％)	GalCer	GalβCer	100
LacCer	Galβ4GlcβCer	61	GalCer	GalβCer	100
LacCer	Galβ4GlcβCer	61	GalAAG	GalβAAG	21
GalDG	GalβDG	12	GalAAG	GalβAAG	21
GalDG	GalβDG	12	GLcCer	GlcβCer	5.9
Gb3Cer	Galα4Galβ4GlcβCer	0	GLcCer	GlcβCer	5.9
Gb3Cer	Galα4Galβ4GlcβCer	0	Gb4Cer	GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer	＜1
Gg3Cer	GalNAcβ4Galβ4GlcβCer	2.8	Gb4Cer	GalNAcβ3Galα4Galβ4GlcβCer	＜1
Gg3Cer	GalNAcβ4Galβ4GlcβCer	2.8	Gb4Cer	Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer	3.2
nLc4Cer	Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer	＜1	Gb4Cer	Galβ3GalNAcβ4Galβ4GlcβCer	3.2

如表1测定，在使用条件下，GalCer是最好的，LacCer是第二好的受体。一定程度上GalAAG和GalDG也可作为受体。纯化的磺基转移酶确实作用于GlcCer，Gb4Cer，Gg3Cer，Gg4Cer，和nLc4cer，虽然与对GalCer的活性相比，相对活性小于10％，但不作用于Gb3Cer。

本发明的磺基转移酶的其它特性包括NaCl浓度高达0.1M时增强磺基转移酶活性，但高浓度时抑制活性，和对于GalCer和PAPS，纯化的磺基转移酶的表观的K_m值分别为27和25μM。在pH6.5和7.2之间时酶显示最大活性。可以在存在20％甘油时将纯化的酶储存于-80℃，至少3个月活性没有可检测的损失。

根据Laemmli的方法[自然学227，680-685(1970)]对本发明的纯化的磺基转移酶进行SDS-PAGE。在用含有5％β-巯基乙醇的样品缓冲液处理纯化酶的情况下，显示了一个分子量约为54kDa的单一蛋白带。

实施例3

磺基转移酶基因的克隆

(1)构建cDNA文库

从上述SMKT-R3细胞系[泌尿学研究，17，317-324(1989)]中，提取总RNA[分析生化，162，156-159(1987)]，之后，用Oligotex^TM-dT30(Takara Shuzo生产)纯化poly(A)⁺RNA。用SUPERSCRIPT^TM选择系统(LiftTechnologies生产)，从纯化的poly(A)⁺RNA合成双链cDNA。将得到的双链cDNA与EcoRI衔接子(Life Technologies生产)结合。将这一cDNA片段与预先用限制酶EcoRI消化的λgt10噬菌体载体(Pharmacia Biotech生产)连接，之后，用Ready-To-Go^TMλ包装试剂盒(Pharmacia Biotech生产)进行体外包装以便生产起源于SMKT-R3细胞系的λgt10 cDNA文库。

(2)磺基转移酶的部分氨基酸序列的测定

将10微克实施例1中纯化的磺基转移酶溶解于含有6M盐酸胍的1mMEDTA溶液(1ml)中。在加入2μl 2-巯基乙醇后，在测试管中充满氮并封口，然后在37℃温育2小时还原。然后加入10微升4-乙烯基吡啶，之后，在测试管中充满氮并封口，在37℃温育2小时S-吡啶乙基化。

用反相HPLC(RP-HPLC)[系统：Waters 625LC，Millipore生产；柱：Cosmosil 5C4-AR-300，4.6×50mm，Nacalai Tesque生产；流速：0.4ml/min；洗脱液A：0.1％三氟醋酸溶液(TFA)；洗脱液B：含有0.1％TFA的70％乙腈；洗脱：从使用样品开始55分钟期间在0％到70％的洗脱液B的线性密度梯度上进行]纯化这样得到的吡啶乙基化酶蛋白。

将纯化的S-吡啶乙基化酶蛋白(约2μg/ml)溶解于400μl含有3M脲的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH9.0)并用0.3μg赖氨酰肽链内切酶(Wako Pure化学工业生产)在37℃消化12小时。

用RP-HPLC从得到的消化物中分离纯化肽片段[系统：130A型，Applied Biosystems生产；柱：OD-300C，Aquapore，7μm，1.0×250mm，Applied Biosystems生产；流速：0.1ml/min；洗脱液A：0.1％TFA溶液；洗脱液B：70％含有0.1％TFA的乙腈；洗脱：从使用样品开始85分钟期间在0％到70％的洗脱液B的线性密度梯度上进行]。

用气相Edman分解通过常规方法将这样分离的肽片段用于氨基酸序列仪(492型蛋白质序列仪，Applied Biosystems生产)测序测定部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)，P2(SEQ ID NO：4)，P3(SEQ ID NO：5)，P4(SEQ IDNO：11)，P5(SEQ ID NO：12)，P6(SEQ ID NO：13)和P7(SEQ ID NO：14)。

(3)引物的合成

从上述(2)项测定的部分氨基酸序列制备合成的核苷酸(392型DNA合成仪，Applied Biosystems生产)以便生产合成的核苷酸引物：根据部分氨基酸序列P1(SEQ ID NO：3)的合成的核苷酸1Sa(SEQ ID NO：15)，1Sb(SEQ IDNO：16)，1Sc(SEQ ID NO：17)，1Sd(SEQ ID NO：6)和1A(SEQ ID NO：7)，根据部分氨基酸序列P2(SEQ ID NO：4)的合成的核苷酸2Sa(SEQ ID NO：9)，2Sb(SEQ IDNO：18)，2Aa(SEQ ID NO：19)，和2Ab(SEQ ID NO：20)，和根据部分氨基酸序列P3(SEQ ID NO：5)的合成的核苷酸3S(SEQ ID NO：21)和3A(SEQ ID NO：10)。

合成的低聚核苷酸引物1Sa，1Sb，1Sc，1Sd，2Sa，2Sb，和3S是有意义方向的引物，而合成低聚核苷酸引物1A，2Aa，2Ab，2A和3A是反义方向的引物。

为了防止杂交过程中引物相互结合，在合成所有低聚核苷酸时用脱氧肌苷替代碱基。在密码子简并性超过2的位置用脱氧肌苷替代。对于编码丝氨酸残基的部分，制备了两类密码子TCX和AG(T/C)的引物组合。

(4)用RT-PCR方法筛选磺基转移酶基因

在20μl含有从SMKT-R3细胞提取的2μg poly(A)⁺RNA，40pmol寡聚(dT)_12-18引物(Life Technologies生产)，0.25mM(每种)dNTP，50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)，75mM氯化钾，3mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇和200单位的起源于莫洛尼氏鼠白细胞病毒的逆转录酶[SUPERSCRIPT^TMII RNase H^-逆转录酶，Life Technologies生产]的反应系统中，在37℃进行逆转录反应1小时。用4μl这一反应混合物的等分试样作模板，在50μl含有100pmol每种上述合成的低聚核苷酸引物(有意义方向引物和反义方向引物)，0.25mM(每种)dNTP混合物，10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁和1.25单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer生产)(RT-PCR)的反应系统中进行PCR。通过以94℃30秒(变性)，45-55℃30秒(引物退火)和72℃1-2分钟(合成反应)的顺序处理重复35个循环进行反应。

在这次PCR之后，将全部反应混合物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳。然后从凝胶上切下一个DNA片段，并亚克隆进pT7Blue载体(Novagen生产)。用Taq DNA聚合酶通过二脱氧链终止方法测定这些DNA片段的核苷酸序列[Dye终止循环测序试剂盒，Perkin Elmer生产；373A型DNA序列仪，AppliedBiosys tems生产]。

用有意义方向的合成的低聚核苷酸引物1Sa，1sB，1Sc和1Sd和反义方向的合成的低聚核苷酸引物1A首先进行RT-PCR，导致扩增了来自1Sd和1A的组合的47bp cDNA片段和来自2Sa和3A的组合的约600bp cDNA片段。

在这些cDNA片段中，将47bp cDNA片段亚克隆并进行核苷酸序列分析；从测定的核苷酸序列推测的氨基酸序列与部分氨基酸序列P1一致。

接着，根据47bp cDNA片段的核苷酸序列合成混合低聚核苷酸OP1(SEQ IDNO：8)，利用毛地黄毒苷(DIG)低聚核苷酸加尾试剂盒(Boehringer Mannheim生产)用终端转移酶以DIG标记它的3’末端。

用DIG标记的混合低聚核苷酸OP1作探针，对如上所述通过RP-PCR扩增的约600bp cDNA片段进行Southern印迹杂交。

首先，在1.5％琼脂糖凝胶上对RT-PCR得到的约600bp cDNA片段进行电泳。之后，将DNA转移到尼龙膜上(Boehringer Mannheim生产)。利用这一尼龙膜，在55℃在含有2pmol/ml DIG标记的混合低聚核苷酸OP1，5×SSC，2％封闭剂(Boehringer Mannheim生产)，0.1％N-月桂酰肌氨酸和0.02％SDS的溶液中进行杂交。利用DIG发光检测试剂盒(Boehringer Mannheim生产)完成检测。

结果是，OP1探针与用合成的低聚核苷酸引物2Sa和3A通过RT-PCR扩增的约600bp的cDNA片段杂交。

将该约600bp的cDNA片段亚克隆并进行核苷酸序列分析；在该约600bp的cDNA片段中发现了编码部分氨基酸序列P1和P4的序列。

(5)含有磺基转移酶基因的cDNA片段的克隆

为了分离来自实施例3(1)制备的起源于SMKT-R3细胞系的λgt10 cDNA文库的cDNA克隆，通过噬菌斑杂交进行筛选。

利用实施例3(3)中得到的约600bp cDNA片段作模板，用T7 RNA聚合酶合成预先DIG标记(DIG RNA标记试剂盒，Boehringer Mannheim生产)的RNA探针。

混合约2×10⁵个重组λ噬菌体和大肠杆菌LE392，在10个矩形平板(9×13cm)的每个平板上形成2×10⁴个噬菌斑。将得到的噬菌斑转移到尼龙膜(Boehringer Mannheim生产)上。在4℃温育膜1小时，在碱性条件(0.5NNaOH，1.5M NaCl，5分钟)下变性并且随后中和(在含有1.5M NaCl的0.5MTris-HCl缓冲液(pH7.4)中，3分钟，两次；然后在2×SSC，2分钟，一次)。在含有每cm²膜上1ng毛地黄毒苷标记的RNA探针，50％甲酰胺，5×SSC，2％封闭剂(Boehringer Mannheim生产)，0.1％N-月桂酰肌氨酸，和0.02％SDS的杂交缓冲液中与尼龙膜在50℃进行杂交过夜。利用DIG发光检测试剂盒进行检测。从阳性噬菌斑中挑出六个λ噬菌体克隆并通过EcoRI消化将插入的cDNA亚克隆进pBluescript载体(Stratagene生产)。

结果是，得到了具有最大约1.8bp长度的cDNA片段的质粒并命名为pBS-hCST1。测定它的核苷酸序列；发现一个编码含有432个氨基酸的蛋白质的开放读码框架(ORF)。这一ORF含有部分氨基酸序列仪测定的上述纯化磺基转移酶的全部氨基酸序列。

根据上述结果，测定了磺基转移酶基因的全部核苷酸序列和初级结构。序列表的SEQ ID NO：2显示了编码磺基转移酶的核苷酸序列，而序列表的SEQ IDNO：1表示了由此编码的氨基酸序列。

实施例4

表达磺基转移酶多肽的质粒的构建

用限制酶EcoRI消化实施例3得到的质粒pBS-hCST1；将得到的DNA片段插入哺乳动物表达载体pSVK3(Pharmacia Biotech生产)的EcoRI位点。根据限制酶切割图谱测定DNA插入方向。将插入方向相反的两个表达质粒分别命名为pSV-hCST和pSV-hCSTR。

在这些质粒中，将pSV-hCST转化进大肠杆菌JM109产生转化体。已经将此命名为大肠杆菌JM1 09/pSV-hCST的转化体以登记号大肠杆菌JM109/pSV-hCST FERM BP-5811保存于国际贸易和工业部，工业科学和技术部，国立生物科学和人技术研究院。

实施例5

在COS-1细胞中表达重组磺基转移酶基因

用1μg表达质粒pSV-hCST或pSV-hCSTR和5μl Lipofectamine^TM(LifeTechnologies生产)转染在35mm直径的盘中预培养1天的2×10⁵个COS-1细胞(ATCC CRL 1650)。在37℃温育72小时后，用冷TBS(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，pH7.4)洗涤得到的转化COS-1细胞两次，用硅刮刀(Falcon生产)和0.2ml含有0.1％Triton X-100的TBS收获，在冰上声处理破碎细胞，通过离心回收上清液。

结果测定用pSV-hCST转化的COS-1细胞的细胞提取液组分的特异活性是1.8×10^-5U/mg(蛋白质)，是作为对照的导入了pSVK3的COS-1细胞的细胞提取液组分的活性的16倍的水平，和约为用pSV-hCSTR转化的COS-1细胞的细胞提取液组分的活性的8倍。

其次，检测了用pSV-hCST转染的COS-1细胞是否表达硫酸脂。在Lab-Tek室滑板(Nunc Inc.生产)上用1μg pSV-hCST和1μl Lipofectamine转染COS-1细胞(1×10⁴)。在37℃温育48小时后，用PBS(pH7.4)洗涤转化的COS-1细胞，在溶解于PBS(pH7.4)的1％多聚甲醛中固定，用溶解于PBS(pH7.4)的1％BSA封闭，用抗-硫酸脂单克隆抗体，Sulph1[生化杂志，251，17-22(1988)]温育，接着用与FITC共轭的山羊-鼠IgG抗体(Zymed实验室生产)温育。每次温育时间为45分钟。在Vectashield装置培养基(载体实验室生产)中装置标记细胞，并用荧光和相显微镜观察。

结果发现在用pSV-hCST转化的COS-1细胞中，细胞表面被免疫荧光染色，而未转化的COS-1细胞完全没有染色，证明磺基转移酶具有在转化COS-1细胞中合成硫酸脂的活性。

实施例6

重组磺基转移酶的物理-化学特性

在冰上声处理实施例5中得到的转化的COS-1细胞以破碎细胞。根据生化杂志119(3)，421-427(1996)叙述的方法利用离心破碎细胞得到的上清液作为重组磺基转移酶的酶溶液以便测定它的物理-化学特性。结果如下。

(1)最适pH

如图1所示本发明的磺基转移酶的最适pH约为6-8，在此范围内得到最大活性。换句话说，图1是表示本发明重组磺基转移酶的最适pH图，其中纵坐标表示相对活性(％)，横坐标表示pH。下面的缓冲液用于下面测定相对活性的相关的pH范围：

pH3.0-6.0：50mM乙酸盐缓冲液；

pH6.0-7.0：50mM二甲胂酸盐缓冲液；

pH7.0-8.0：50mM三乙醇胺缓冲液；和

pH8.0-10.0：50mM tris缓冲液。

在图中，实心方块标记是指乙酸盐缓冲液，实心圆形标记是指二甲胂酸盐缓冲液，实心三角标记是三乙醇胺缓冲液，和×标记是tris缓冲液。

(2)最适温度

如图2所示本发明的重组磺基转移酶的最适温度约为40℃，在此温度得到最大活性。换句话说，图2是表示本发明的重组磺基转移酶的最适温度的图，其中纵坐标表示相对活性(％)，横坐标表示反应温度(℃)。

(3)稳定pH

通过测定在6℃在相关的pH保持16小时，然后回到pH7.0得到的每种本发明的重组磺基转移酶的酶活性对稳定pH进行评估。下面的缓冲液用于下面每个相关的pH范围以便测定残留的活性：

pH3.0-6.0：50mM乙酸盐缓冲液；

pH6.0-7.0：50mM二甲胂酸盐缓冲液；

pH7.0-8.0：50mM三乙醇胺缓冲液；和

pH8.0-10.0：50mM tris缓冲液。

如图3所示在6-10的pH范围内本发明的重组磺基转移酶是稳定的。换句话说，图3是显示本发明的重组磺基转移酶的稳定pH的图，其中纵坐标表示残留的活性(％)，横坐标表示pH。在图中，实心方块标记是乙酸盐缓冲液，实心圆形标记是二甲胂酸盐缓冲液，实心三角标记是三乙醇胺缓冲液，和×标记是tris缓冲液。

(4)稳定温度

对本发明的重组磺基转移酶的稳定温度进行评估。结果发现在30℃重组磺基转移酶是稳定的，但如图4所示在40℃处理30分钟时失去了85％的活性。换句话说，图4是表示本发明的重组磺基转移酶的稳定温度的图，其中纵坐标表示残留活性(％)，横坐标表示反应温度(℃)。

序列表

(1)总的资料：

(iii)序列数：33

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：423个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Met Leu Pro Pro Gln Lys Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys Gly

1 5 10 15

Leu Val Leu Gly Ala Leu Phe Thr Ser Phe Leu Leu Leu Val Tyr

20 25 30

Ser Tyr Ala Val Pro Pro Leu His Ala Gly Leu Ala Ser Thr Thr

35 40 45

Pro Glu Ala Ala Ala Ser Cys Ser Pro Pro Ala Leu Glu Pro Glu

50 55 60

Ala Val Ile Arg Ala Asn Gly Ser Ala Gly Glu Cys Gln Pro Arg

65 70 75

Arg Asn Ile Val Phe Leu Lys Thr His Lys Thr Ala Ser Ser Thr

80 85 90

Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln Lys His Arg Leu Lys

95 100 105

Phe Ala Phe Pro Asn Gly Arg Asn Asp Phe Asp Tyr Pro Thr Phe

110 115 120

Phe Ala Arg Ser Leu Val Gln Asp Tyr Arg Pro Gly Ala Cys Phe

125 130 135

Asn Ile Ile Cys Asn His Met Arg Phe His Tyr Asp Glu Val Arg

140 145 150

Gly Leu Val Pro Thr Asn Ala Ile Phe Ile Thr Val Leu Arg Asp

155 160 165

Pro Ala Arg Leu Phe Glu Ser Ser Phe His Tyr Phe Gly Pro Val

170 175 180

Val Pro Leu Thr Trp Lys Leu Ser Ala Gly Asp Lys Leu Thr Glu

185 190 195

Phe Leu Gln Asp Pro Asp Arg Tyr Tyr Asp Pro Asn Gly Phe Asn

200 205 210

Ala His Tyr Leu Arg Asn Leu Leu Phe Phe Asp Leu Gly Tyr Asp

215 220 225

Asn Ser Leu Asp Pro Ser Ser Pro Gln Val Gln Glu His Ile Leu

230 235 240

Glu Val Glu Arg Arg Phe His Leu Val Leu Leu Gln Glu Tyr Phe

245 250 255

Asp Glu Ser Leu Val Leu Leu Lys Asp Leu Leu Cys Trp Glu Leu

260 265 270

Glu Asp Val Leu Tyr Phe Lys Leu Asn Ala Arg Arg Asp Ser Pro

275 280 285

Val Pro Arg Leu Ser Gly Glu Leu Tyr Gly Arg Ala Thr Ala Trp

290 295 300

Asn Met Leu Asp Ser His Leu Tyr Arg His Phe Asn Ala Ser Phe

305 310 315

Trp Arg Lys Val Glu Ala Phe Gly Arg Glu Arg Met Ala Arg Glu

320 325 330

Val Ala Ala Leu Arg His Ala Asn Glu Arg Met Arg Thr Ile Cys

335 340 345

Ile Asp Gly Gly His Ala Val Asp Ala Ala Ala Ile Gln Asp Glu

350 355 360

Ala Met Gln Pro Trp Gln Pro Leu Gly Thr Lys Ser Ile Leu Gly

365 370 375

Tyr Asn Leu Lys Lys Ser Ile Gly Gln Arg His Ala Gln Leu Cys

380 385 390

Arg Arg Met Leu Thr Pro Glu Ile Gln Tyr Leu Met Asp Leu Gly

395 400 405

Ala Asn Leu Trp Val Thr Lys Leu Trp Lys Phe Ile Arg Asp Phe

410 415 420

Leu Arg Trp

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：1269个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：双链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：由mRNA获得的cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

ATGCTGCCAC CGCAGAAGAA GCCCTGGGAG TCCATGGCTA AGGGGCTGGT GCTGGGCGCG 60

CTCTTCACTA GTTTCCTGCT GCTGGTGTAC TCCTATGCCG TGCCCCCGCT GCATGCCGGC 120

CTGGCCTCCA CGACCCCGGA GGCCGCAGCG TCCTGCTCTC CACCTGCACT CGAGCCAGAG 180

GCAGTGATCC GGGCCAACGG CTCGGCGGGG GAGTGCCAGC CGCGGCGCAA CATCGTGTTC 240

TTGAAGACGC ACAAGACGGC CAGCAGCACC CTGCTCAACA TCCTGTTCCG CTTCGGCCAG 300

AAGCACCGGC TCAAGTTCGC CTTCCCTAAC GGCCGCAATG ACTTCGACTA CCCGACCTTC 360

TTCGCCCGCA GCCTGGTGCA GGACTATCGG CCCGGGGCCT GCTTCAACAT CATCTGCAAC 420

CACATGCGCT TCCACTACGA CGAGGTGCGC GGCCTGGTGC CGACCAACGC CATCTTCATC 480

ACGGTGCTCC GCGACCCCGC CCGCTTGTTC GAGTCCTCCT TCCACTACTT CGGGCCGGTG 540

GTGCCCCTCA CGTGGAAGCT CTCGGCCGGC GACAAGCTGA CCGAGTTCCT GCAAGACCCG 600

GATCGCTACT ACGACCCCAA CGGCTTCAAT GCCCACTACC TCCGAAACCT GCTCTTCTTC 660

GACCTGGGCT ATGACAACAG CCTGGACCCC AGCAGCCCGC AGGTGCAGGA GCACATCCTG 720

GAGGTGGAGC GTCGCTTCCA CCTGGTGCTC CTTCAAGAGT ACTTCGACGA GTCGCTGGTG 780

CTGCTGAAGG ACCTGCTGTG CTGGGAGCTG GAGGACGTGC TCTACTTCAA GCTCAACGCC 840

CGCCGCGACT CGCCCGTGCC GCGGCTCTCG GGGGAGCTGT ATGGGCGCGC CACCGCCTGG 900

AACATGCTGG ACTCCCACCT CTACCGCCAC TTCAACGCCA GCTTCTGGCG CAAGGTGGAG 960

GCCTTCGGGC GGGAGCGCAT GGCCCGCGAG GTGGCCGCCC TGCGCCATGC CAACGAGCGC 1020

ATGCGGACCA TCTGCATCGA CGGGGGCCAC GCCGTGGACG CCGCCGCCAT CCAGGACGAG 1080

GCCATGCAGC CCTGGCAGCC GCTGGGCACC AAGTCCATCC TGGGCTACAA CCTCAAGAAG 1140

AGCATCGGGC AGCGGCACGC GCAGCTCTGC CGGCGCATGC TCACGCCCGA GATCCAGTAC 1200

CTGATGGACC TCGGCGCCAA CCTGTGGGTC ACCAAGCTCT GGAAGTTCAT TCGCGATTTC 1260

CTGCGGTGG 1269

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Thr Ala Ser Ser Thr Leu Leu Asn Ile Leu Phe Arg Phe Gly Gln Lys

1 5 10 15

Lys

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Lys Pro Trp Glu Ser Met Ala Lys

1 5

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Ser Ile Leu Gly Tyr Asn Leu Lys

1 5

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，6和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

ACNGCNAGYA GYACNCT

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6和12的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TTYTGNCCRA ANCGRAA

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：47个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TTCTGGCCRA AGCGGAACAG GATGTTGAGC AGCGTRCTRC TCGCCGT

(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6，9和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

AARCCNTGNG ARTCNATGG

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6，15和18的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

Leu Ser Ala Gly Asp Lys

1 5

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：9个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

Leu Asn Ala Leu Asn Asp Xaa Pro Val

1 5

(2)SEQ ID NO：13的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：4个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

His Arg Leu Lys

1

(2)SEQ ID NO：14的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：8个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

Phe Ile Leu Asp Phe Leu Glu Xaa

1 5

(2)SEQ ID NO：15的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，6，9，12和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

ACNGCNTCNT CNACNCT

(2)SEQ ID NO：16的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，6，12和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

ACNGCNAGYT CNACNCT

(2)SEQ ID NO：17的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，6，9和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

ACNGCNTCNA GYACNCT

(2)SEQ ID NO：18的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6和9的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

AARCCNTGNG ARAGYATGG

(2)SEQ ID NO：19的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置2，8，14和17的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

TNGCCATNGA YTCNCANGG

(2)SEQ ID NO：20的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：19个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置2，14和17的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

TNGCCATRCT YTCNCANGG

(2)SEQ ID NO：21的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6，15和18的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

TTRTANAGRT TRTANCCNAG RAT

(2)SEQ ID NO：22的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：

AAYATYYTNT TYCGNTTYGG

(2)SEQ ID NO：23的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

TTYTGNCCRA ANCGRAA

(2)SEQ ID NO：24的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

AARCCNTGGG ARWSNATGGC

(2)SEQ ID NO：25的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

TTNGCCATNS WYTCCCANGG

(2)SEQ ID NO：26的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA

(2)SEQ ID NO：27的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

TTNARRTTRT ANCCNARRAT

(2)SEQ ID NO：28的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置9和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

AAYATYYTNT TYCGNTTYGG

(2)SEQ ID NO：29的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：17个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6和12的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

TTYTGNCCRA ANCGRAA

(2)SEQ ID NO：30的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

AARCCNTGGG ARWSNATGGC

(2)SEQ ID NO：31的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，6和18的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：

TTNGCCATNS WYTCCCANGG

(2)SEQ ID NO：32的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置6，9和18的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：

ATYYTNGGNT AYAAYYTNAA

(2)SEQ ID NO：33的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链数：单链

(D)几何结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成的DNA)

(ix)特征：

(D)其它资料：位置3，12和15的N是肌苷

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：

TTNARRTTRT ANCCNARR AT

Claims

1.编码具有磺基转移酶活性的多肽的分离的基因，所述多肽通过作用于Galβ1-R表示的糖链将硫酸基团特异性地转移到Gal的C-3位置的羟基基团上，其中Gal代表半乳糖，R代表碳水化合物、类脂或复合糖，其中所述分离基因选自：

(a)编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽的基因；

(b)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的基因；

(c)编码含有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列中一个或几个氨基酸的缺失、添加、插入或替代得到的氨基酸序列的多肽的基因，其中多肽具有磺基转移酶活性；和

(d)在严格条件下与(a)-(c)中任一项的基因杂交并编码具有磺基转移酶活性的多肽的基因。

2.含有权利要求1所述的基因的重组DNA。

3.含有权利要求2所述的重组DNA的表达载体，对于该载体，微生物，动物细胞或植物细胞可用作寄主细胞。

4.导入权利要求3所述的表达载体的转化体。

5.生产具有磺基转移酶活性的多肽的方法，包括步骤：培养权利要求4所述的转化体，从得到的培养物中收集具有磺基转移酶活性的多肽。

6.权利要求1所述的基因编码的具有磺基转移酶活性的多肽。

7.与权利要求1所述的基因互补的反义DNA。

8.与权利要求1所述的基因互补的反义RNA。

9.含有权利要求7所述的反义DNA的表达载体。

10.与权利要求6所述的多肽特异结合的抗体或其片段。

11.纯化的磺基转移酶，它作用于Galβ1-R表示的糖链，其中Gal代表半乳糖；R代表碳水化合物、类脂或复合糖，以便将硫酸基团特异地转移到Gal的C-3位置的羟基基团上，其中所述纯化的磺基转移酶与半乳糖神经酰胺，乳糖神经酰胺，半乳糖1-烷基-2-酰基甘油，半乳糖二酰基甘油，葡糖神经酰胺，神经酰胺四己糖苷，gangliotriaosyl神经酰胺，gangliotetraosyl神经酰胺和neolactotetraosyl神经酰胺反应，并与神经酰胺三己糖苷，半乳糖和乳糖不反应，其中所述纯化的磺基转移酶具有下述特征：

(a)最适pH为7.0；

(b)最适温度为37℃；

(c)在还原条件下通过SDS-PAGE测定，分子量为54kDa；其中所述磺基转移酶由权利要求1的基因编码。

12.根据权利要求11所述的纯化的磺基转移酶，它来源于人肾癌细胞系SMKT-R3。