DE69735568T2

DE69735568T2 - Für eine Sulfotransferase kodierendes Gen

Info

Publication number: DE69735568T2
Application number: DE69735568T
Authority: DE
Inventors: Koichi Izumi-shi Honke
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2017-09-19
Also published as: CN1188806A; EP0857783A2; EP0857783A3; EP0857783B1; CN1162543C; US6020467A; KR100491573B1; KR19980069951A; US5965419A; US5773274A; DE69735568D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Sulfotransferasegen, isoliert aus einer menschlichen Zelle und die Herstellung der Sulfotransferase, verantwortlich für die Sulfatierung von Zuckern von Glycolipiden, durch Verwendung eines Expressionsvektors.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweis der Sulfotransferase unter Verwendung einer synthetischen Oligonucleotidsonde oder eines Primers.
Besprechung des Fachgebiets
In vergangenen Jahren haben verschiedene physiologische Funktionen der Zuckerkettenreste von Molekülen in der Zellmembran, bekannt als komplexe Kohlenhydrate, wie zum Beispiel Glycoproteine und Glycolipide, die Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Die an eine Zuckerkette gebundene Sulfatgruppe ist hinsichtlich verschiedener biologischer Funktionen interessant. Die Sulfatgruppe ist in mannigfaltigen Bindungsarten an die Zuckerketten von Muzin, Mucopolysacchariden und Glycolipiden gebunden sowie über Esterbindungen an die Zuckerketten von viralen Glycoproteinen, Glycohormonen, Basalmembranglycoproteinen, Schleimpilz-Lysosomenzymen usw. Ihre biologische Bedeutung muss jedoch noch aufgeklärt werden.
Verschiedene Sulfotransferasen mit verschiedenen Substratspezifitäten sind bereits bekannt. Zum Beispiel schließen auf Glycoproteine wirkende Sulfotransferasen die Sulfotransferase, welche die Sulfatgruppe an die Position 3 von Galactose von Zuckerketten des N-Glycosidtyps anhängt [Journal of Biological Chemistry, 264 (6), 3364-3371 (1989)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 6 von N-Acetylglucosamin von Zuckerketten des N-Glycosidtyps anhängt [Biochemical Journal, 319, 209-216 (1996)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 3 von N-Acetylgalactosamin von Muzinzuckerketten anhängt [Glycobiology, 5 (7), 689-697 (1995)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 3 von N-Acetylglucosamin von Muzinzuckerketten anhängt [Journal of Biological Chemistry, 270 (46), 27544-27550 (1995)] und jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 4 von N-Acetylglucosamin von in der Hypophyse erzeugten Glycoprotein-Hormonzuckerketten anhängt [Journal of Biological Chemistry, 266 (26), 17142-17150 (1991)], ein.
Sulfotransferase, die auf Glycosaminoglycane (Mucopolysaccharide) wirken, schließen die Sulfotransferase, welche die Sulfatgruppe an die Position 2 von Iduronsäure von Heparansulfat anhängt [Journal of Biological Chemistry, 271 (13), 7645-7653 (1996)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 6 von N-sulfatiertem Glucosamin von Heparansulfat anhängt [Journal of Biological Chemistry, 270 (8), 4172-4179 (1995)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 2 der Iduronsäure von Heparin und an die Position 6 von N-sulfatierem Gluosamin anhängt [Journal of Biological Chemistry, 269 (40), 24538-24541 (1994)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 3 von N-sulfatiertem Glukosamin von Heparansulfat anhängt [Journal of Biological Chemistry, 271 (43), 27072-27082 (1996)], jene, welche in der N-Sulfatierung von Heparansulfat wirkt [Journal of Biological Chemistry, 263 (5), 2417-2422 (1988)], jene, welche in der N-Sulfatierung von Heparin agiert [Journal of Biological Chemistry, 266 (13), 8044-8049 (1991)], jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 6 von N-Acetylgalactosamin von Chondroitinsulfat und Galactose von Keratansulfat anhängt, und jene, welche die Sulfatgruppe an die Position 4 von N-Acetylgalactosamin von Chondroitinsulfat anhängt [Journal of Biological Chemistry, 268 (29), 21968-21974 (1993)], und jene, welche ausschließlich auf corneales Keratansulfat wirkt [Journal of Biological Chemistry, 259 (19), 11771-11776 (1984)], ein.
Zusätzlich zu der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung ist von Sulfotransferasen bekannt, welche durch Hinzufügen der Sulfatgruppe an die Position 3 der Glucuronsäure [Journal of Biological Chemistry, 268 (1), 330-336 (1993)] an der Synthese von Zuckerketten beteiligt sind, die durch den monoclonalen Antikörper HNK-1 erkannt werden, dass sie auf Glykolipide wirken.
Von diesen Sulfotransferasen ist von der N-Sulfotransferase, die an der Synthese von Heparin-Zuckerketten, stammend aus der Rattenleber, beteiligt ist [N-Heparansulfat-Sulfotransferase, Journal of Biological Chemistry, 267 (22), 15744-15750 (1992)], der N-Sulfotransferase, die an der Synthese von Heparin-Zuckerketten, stammend von MST-Zellen, beteiligt ist [N-Deacylase/N-Sulfotransferase, Journal of Biological Chemistry, 269 (3), 2270-2276 (1994)] und dem Enzym, das an der Synthese von Chondroitin-Zuckerketten, stammend aus Hühnerembryo-Chondrocyten, durch Übertragung der Sulfatgruppe an die Position C-6 von N-Acetylgalactosamin beteiligt ist [Chondroitin 6-Sulfotransferase, Journal of Biological Chemistry, 270 (31), 18575-18580 (1995)], bekannt, dass sie auf bereits clonierte komplexe Kohlenhydraten wirken.
Die vorliegenden Erfinder reinigten 3'-Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat:GalCer-Sulfotransferase [EC 2.8.2.11], eine Sulfotransferase, welche die Sulfatgruppe an die Hydroxylgruppe der Position-3 von Galactose anhängt, aus einer menschlichen Nierenkrebs-Zelllinie (SMKT-R3) [Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996)]. Diese Sulfotransferase wird in menschlichem Nierenkrebsgewebe oder einer Zelllinie davon in großer Menge exprimiert, diese Mengen stimmen mit der Anreicherung von sulfatierten Glycolipiden in Nierenkrebs überein. Obwohl diese Tatsache auf eine Beziehung zwischen dem Enzym und Krebs hindeutet, muss die Aminosäuresequenz des Enzyms noch bestimmt werden und das Gen muss daher noch cloniert werden.
In vergangenen Versuchen, bekannte Sulfotransferasen industriell günstig zu produzieren, war es aufgrund der niedrigen natürlichen Häufigkeit des Enzyms und er gleichzeitigen Anwesenheit anderer Enzyme wie zum Beispiel Proteasen und Sulfatase, sehr schwierig die gewünschte Sulfotransferase in einer reinen Form durch einfache Verfahren in großen Mengen herzustellen.
Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren zur Clonierung von Sulfotransferasegenen und preiswerten Produktion von Sulfotransferasen von hoher Reinheit unter Verwendung von Genmanipulationstechnologie. Obwohl, wie oben angegeben, von der Clonierung eines Sulfotransferasegens berichtet worden ist, gibt es nur sehr wenige zur Verfügung stehende Berichte. Außerdem stößt ein Versuch, die Sequenz eines der vorstehend erwähnten Sulfotransferasegene zu verwenden, um das Gen für eine andere Sulfotransferase mit unterschiedlicher Substratspezifität zu erhalten, aufgrund der geringen Genhomologie zwischen Enzymen von unterschiedlichen Substratspezifitäten auf Schwierigkeiten in der Erlangung des gewünschten Sulfotransferasegens, da es eine große Zahl von Sulfotransferasen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten gibt. Darüber hinaus sind solche Sulfotransferasen schwierig zu clonieren und durch Gentechnik herzustellen, da die Aminosäuresequenzen und Genstrukturen von Sulfotransferasen, die auf Glykolipidzuckerketten wirken, unbekannt bleiben.
Folglich ist es die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Gen bereitzustellen, das eine Sulfotransferase codiert, die vorzugsweise in Nierenzellen, in größeren Mengen in Nierenkrebszellen, exprimiert wird und auf die Zuckerketten von Glycolipiden wirkt.
Der zweite Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Produktion einer Sulfotransferase von hoher Reinheit bereitzustellen, welche durch Gentechnologie unter Verwendung einer Transformante erhalten wird, in welche ein Expressionsvektor eingeführt wird, der das vorhergehende Gen enthält.
Der dritte Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine vorzugsweise synthetische Oligo- oder Polynucleotidsonde oder einen Primer bereitzustellen, der spezifisch an das Gen der vorliegenden Erfindung hybridisiert.
Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung deutlich werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Gen oder eine davon abgeleitete Nucleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, welches eine Sulfotransferaseaktivität besitzt, die spezifisch eine Sulfatgruppe auf die Hydroxylgruppe in der C3-Position von Gal durch Wirkung auf eine Zuckerkette überträgt, dargestellt durch Galβ1-R, wobei Gal Galactose und R ein Kohlehydrat, Lipid oder Glycokonjugat darstellt.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines Polypeptids, das Sulfotransferaseaktivität besitzt, umfassend die Schritte der Züchtung der Transformante, in welche das Gen der vorliegenden Erfindung eingeführt ist, und Gewinnung eines Polypeptids von der resultierenden Kultur, welches Sulfotransferaseaktivität besitzt.
In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Arzneimittel bereitgestellt, umfassend das Nucleinsäuremolekül, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Das Arzneimittel kann, wenn es das das Polypeptid codierende Nucleinsäuremolekül umfasst, verwendet werden, um die Sulfotransferaseexpression zu hemmen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dieses Arzneimittel verwendet, um Nierenkrebs zu behandeln.
In noch einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit, umfassend das Nucleinsäuremolekül, welches das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert. Dieser diagnostische Kit oder einzelne Komponenten davon können z.B. durch Hybridisierung zellulärer RNA mit dem Nucleinsäuremolekül der Erfindung als Sonde verwendet werden, um Sulfotransferase auf dem RNA-Niveau nachzuweisen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine graphische Darstellung, die den optimalen pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt;
2 ist eine graphische Darstellung, welche die optimale Temperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt;
3 ist eine graphische Darstellung, welche den Stabilisierungs-pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt; und
4 ist eine graphische Darstellung, welche die Stabilisierungstemperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hierin verwendet, bedeutet die Aussage „Sulfotransferaseaktivität aufweisen für spezifische Übertragung der Sulfatgruppe auf die Hydroxylgruppe in der C3-Position von Gal durch Wirkung auf eine Zuckerkette, dargestellt durch Galβ1-R, wobei Gal Galactose darstellt; R ein Kohlenhydrat, Lipid oder Glycokonjugat darstellt" (nachstehend auch als „Sulfotransferaseaktivität aufweisen" bezeichnet) die Beschaffenheit, gekennzeichnet durch die folgende Wirkung und Substratspezifität. Polypeptide, die eine solche Sulfotransferaseaktivität besitzen, schließen jene ein, die folgende physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen, und ein Beispiel wird im Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996) gegeben.
1. Wirkung
Wirkt auf eine Zuckerkette, dargestellt durch Galβ1-R, wobei Gal Galactose darstellt; R ein Kohlenhydrat, Lipid oder Glycokonjugat darstellt, um die Sulfatgruppe spezifisch auf die Hydroxylgruppe in der C3-Position von Gal zu übertragen.
2. Substratspezifität
Reagiert mit Galactosyl-Ceramid (GalCer), Lactosyl-Ceramid (LacCer), Galactosyl-1-Alkyl-2-Acylglycerin (GalAAG), Galactosyl-Diacylglyzerin (GalDG), Glucosyl-Ceramid (GlcCer), Globotetraosyl-Ceramid (Gb4Cer), Gangliotriaosyl-Ceramid (Gg3Cer), Glangliotetraosyl-Ceramid (Gg4Cer) und Neolactotetraosyl-Ceramid (nLc4Cer) und reagiert nicht mit Globotriaosyl-Ceramid (Gb3Cer), Galactose und Lactose.
3. Optimaler pH-Wert und Stabilisierungs-pH-Wert
Der optimale pH-Wert ist etwa 7,0 und der Stabilisierungs-pH-Wert ist 6,0 bis 8,0.
4. Optimale Temperatur und Stabilisierungstemperatur
Die optimale Temperatur ist etwa 37°C und die Stabilisierungstemperatur ist bis zu 80°C.
5. Molekulargewicht
Etwa 54 kDa, wie bestimmt durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen.
Sulfotransferaseaktivität kann durch ein leicht verändertes Verfahren bestimmt werden, basierend auf dem Verfahren, beschrieben in Analytical Biochemistry, 182, 9-15 (1989). Genau gesagt werden 50 μl eines Reaktionsgemisches erzeugt, umfassend 20 ng Enzymprotein in 5 nMol GalCer, 0,5 μMol MnCl₂, 1 nMol [³⁵S]PAPS (100 ZpM/pMol), 0,5 mg Lubrol PX, 12,5 nMol Dithiothreit, 0,25 μMol NaF, 0,1 μMol ATP, 20 μg BSA und 25 mM Natrium-Cacodylat-HCl (pH-Wert 6,5). Nachdem das Gemisch für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde, wird die Umsetzung durch die Zugabe von 1 ml Chloroform/Methanol/Wasser (30:60:8) beendet. Das Reaktionsprodukt wird unter Verwendung von DEAE-Sephadex A-25 isoliert und die Radioaktivität wird unter Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillationszählers bestimmt. Eine Aktivitätseinheit wird als die Enzymmenge definiert, die 1 μMol Sulfatgruppe pro Minute überträgt. Wenn das Reaktionsprodukt eine Aktivität von nicht weniger als 1 × 10^–7 Millieinheiten aufweist, wie bestimmt durch dieses Verfahren, wird das Produkt so bewertet, dass es Sulfotransferaseaktivität besitzt.
Der Begriff „Gen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz wie zum Beispiel eine cDNA, die ein Polypeptid codiert, welches die vorstehend beschriebene Sulfotransferaseaktivität aufweist, oder ein Nucleinsäuremolekül, welches dieses Gen darstellt oder umfasst. Genau gesagt wird das Gen der vorliegenden Erfindung durch das Gen, welches ein Polypeptid codiert, umfassend die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR:1 gezeigte Aminosäuresequenz, und das Gen, umfassend die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID NR:2 gezeigte Nucleotidsequenz, beispielhaft dargestellt. Sogar Gene, die ein Polypeptid codieren, welches einen Teil der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst, oder Gene, die einen Teil der durch SEQ ID NR: 2 gezeigten Nucleotidsequenz umfassen, fallen in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung, solange sie ein Polypeptid codieren, welches Sulfotransferaseaktivität besitzt. Das sind Gene für 3'- Phosohoadenosin-5'-Phosphosulfat:GalCer-Sulfotransferase [EC 2.8.2.11], abgeleitet von der menschlichen Nierenkrebszelllinie SMKT-R3, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf sie beschränkt.
Ferner sind jene ein Polypeptid mit Sulfotransferaseaktivität codierenden Gene, die in der Lage sind, mit einem Gen der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, auch in den Genen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Darüber hinaus umfasst die vorliegende Erfindung Gene, die mit den vorstehend erwähnten Genen durch Degeneration des genetischen Codes verwandt sind, solange sie ein Polypeptid mit Sulfotransferaseaktivität codieren.
Die Aussage „unter stringenten Bedingungen", wie sie hierin verwendet wird, bedeutet zum Beispiel die nachstehend gezeigten Bedingungen. Genau gesagt wird die Inkubation bei 50°C für 4 Stunden bis über Nacht in 6 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natrium-Citrat, pH-Wert 7,0) enthaltend 0,5% SDS, 5 × Denhardt-Lösung [Denhardt = 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Ficoll 400] und 100 μg/ml Lachssperma DNA, durchgeführt wird.
In der vorliegenden Erfindung stellt eine rekombinante Nucleinsäuresequenz eine Nucleinsäuresequenz dar, die durch Genmanipulationstechniken erhalten wird und das Gen der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wie hierin verwendet, kann ein „Gen" oder eine „Nucleinsäuresequenz" sowohl DNA als auch RNA sein.
In der vorliegenden Erfindung ist ein Expressionsvektor ein Vektor, der durch Insertion der vorstehend beschriebenen rekombinanten Nucleinsäuresequenz so konstruiert ist, dass sie in der gewünschten Wirtszelle exprimiert wird. Vektoren, welche die nachstehend beschriebene Antisense-DNA beinhalten, sind in den Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingeschlossen. Der inserierte Vektor kann ein Plasmidvektor oder ein Phagenvektor sein. Nützliche Plasmidvektoren schließen pUC18, pUC19, pBluescript, pT7 und andere im Handel erhältliche Produkte ein, sind aber nicht auf sie beschränkt; nützliche Phagenvektoren schließen λgt10- und λgt11-Lambda-Phagenvektoren und andere im Handel erhältliche Produkte ein, sind aber nicht auf sie beschränkt. Wirtszellen schließen Mikroorganismen, tierische Zellen und Pflanzenzellen ein und werden in Übereinstimmung mit dem verwendeten Expressionsvektor als geeignet ausgewählt.
In der vorliegenden Erfindung stellt eine Transformante eine Zelle dar, die durch Einführung des vorstehend beschriebenen Expressionsvektors in die vorstehend beschriebene Wirtszelle erhalten wird, welche das Gen der vorliegenden Erfindung exprimiert.
Die Einführung des Expressionsvektors kann zum Beispiel durch das in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., Hrsg., veröffentlicht durch Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, Seiten 249-254 beschriebene Verfahren erreicht werden. Als Nächstes werden Merkmale des Expressionsvektors genutzt, um eine Transformante auszuwählen, die das gewünschte Gen exprimiert. Zum Beispiel wird, wenn der Plasmidvektor pBluescript und die Wirtszelle Escherichia coli ist, eine Kolonie, die das Fremdgen beinhaltet, durch Selektion einer Ampicillin-resistenten Kolonie auf einer Ampicillin-enthaltenden Platte oder einer Ampicillin-resistenten weißen Kolonie auf einer Platte, die Ampicillin, 5-Brom-4-Chloro3-Indolyl-β-D-Galactosid (X-Gal) und Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) enthält, isoliert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion eines Sulfotransferaseaktivität aufweisenden Polypeptids aus der Kultur bereit, erhalten durch Züchtung der vorstehend beschriebenen Transformante unter solchen Bedingungen, dass das Gen der vorliegenden Erfindung exprimiert und das von diesem Gen codierte Polypeptid produziert wird.
Vorausgesetzt, dass die Expression der gewünschten Sulfotransferase realisiert wird, kann die Sulfotransferase durch Optimierung der Zusammensetzung des Kulturmediums der Transformante, des pH-Werts des Mediums, der Züchtungstemperatur, der Menge und der Zeit des verwendeten Induktors, der Züchtungsperiode und anderen Bedingungen für die Expression der Sulfotransferase effizient produziert werden.
Die Sulfotransferase kann von der Transformantenkultur unter Verwendung bekannter Verfahren gereinigt werden. Wenn die Transformante wie in Escherichia coli das Expressionsprodukt intrazellulär anreichert, wird die Transformante durch Zentrifugation nach Beendigung der Züchtung geerntet, dann durch Ultraschall oder ähnlichem aufgebrochen, gefolgt von Zentrifugation usw., um einen zellfreien Extrakt zu ergeben. Durch gewöhnliche Proteinreinigungsverfahren wie zum Beispiel Aussalzung, Gelfiltration und hydrophoben-, Affinitäts- und verschiedenen anderen Chromatographien kann die gewünschte Sulfotransferase von diesem Extrakt gereinigt werden. Im Falle von manchen Wirt-Vektorsystemen wird das Expressionsprodukt aus der Transformante abgesondert. In diesem Fall kann es vom Kulturüberstand in der gleichen Weise wie vorstehend gereinigt werden.
Im Falle von manchen Wirt-Vektorsystemen wird das in der Transformante exprimierte Polypeptid als eine unlösliche Substanz akkumuliert (Einschlusskörper). In diesem Fall kann die unlösliche Substanz gewonnen und unter schonenden Bedingungen solubilisiert werden, wie zum Beispiel Behandlung mit einem Denaturierungsmittel, z.B. Harnstoff, gefolgt von der Entfernung des Denaturierungsmittels, um die ursprüngliche Aktivität wiederherzustellen.
Obwohl die durch die Transformante produzierte exogene Sulfotransferase gleichzeitig mit verschiedenen endogenen Sulfotransferasen in der Wirtszelle anwesend ist, ist ihre Reinigung sehr einfach, da ihre Menge im Überschuss zu der Menge der endogenen Sulfotransferasen ist. Außerdem sind, wenn die Sulfotransferase aus der Transformante ausgeschieden wird, gleichzeitig Mediumkomponenten usw. vorhanden, aber sie sind normalerweise fast frei von Proteinkomponenten, welche die Reinigung der Sulfotransferase störend beeinflussen, ein Aspekt, der im Vergleich mit der Sulfotransferase-Reinigung aus SMKT-R3-Zellen dahingehend vorteilhaft ist, da seine Reinigung keine mühsamen Auftrennungsverfahren erfordert.
Im Falle einer Sulfotransferase eukaryontischen Ursprungs kann das Enzym selbst eine Zuckerkette aufweisen. In einem solchen Fall kann ein Polypeptid, das Sulfotransferaseaktivität besitzt, aber keine Zuckerkette aufweist, unter Verwendung einer Wirtszelle produziert werden, die nicht im Stande ist, eine Zuckerkettenbiosynthese durchzuführen, z.B.: ein Prokaryont wie zum Beispiel Escherichia coli, Bacillus subtilis oder ein Actinomyzet oder eine veränderte Hefe-, Pilz-, Tier-, Insekten- oder Pflanzenzelle, welche die Fähigkeit verloren hat, eine Zuckerketten-Biosynthese durchzuführen. Darüber hinaus kann eine Zuckerkette zu dem Enzym selbst hinzugefügt werden. In diesem Fall kann ein Polypeptid, das Sulfotransferaseaktivität besitzt und eine Zuckerkette aufweist, unter Verwendung einer Wirtszelle produziert werden, welche in der Lage ist, eine Zuckerketten-Biosynthese durchzuführen, z.B. eine Hefe, Pilz-, Tier-, Insekten- oder Pflanzenzelle.
Das Polypeptid ist ein Polypeptid, welches durch das vorstehend beschriebene Gen der vorliegenden Erfindung codiert ist und Sulfotransferaseaktivität ausweist, beispielhaft dargestellt durch jene, welche die vorstehend erwähnten verschiedenen physikkalisch-chemischen Eigenschaften aufweisen. Das Polypeptid wird speziell durch ein natürlich vorkommendes Sulfotransferase- Polypeptid, welches die Aminosäuresequenz, gezeigt durch SEQ ID No: 1, aufweist oder ein Polypeptid, umfassend einen Teil davon, sowie durch Polypeptide, resultierend aus Deletion, Addition, Insertion oder Austausch von einem bis mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz, gezeigt durch SEQ ID No: 1, beispielhaft dargestellt.
In der vorliegende Erfindung sind „Antisense-DNA" und Antisense-RNA" so definiert, dass sie eine Nucleotidsequenz aufweisen, die komplementär zum Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon ist und die Expression der Geninformation (Transkription, Translation) von einem endogenen Sulfotransferasegen (genomische DNA und mRNA) durch Bildung einer doppelsträngigen Struktur mit dem Gen unterdrücken oder regulieren. Die Länge der Antisense-DNA oder Antisense-RNA variiert entsprechend der Nucleotidsequenzspezifität und dem Verfahren für die Einführung in die Zellen.
Antisense-DNA oder Antisense-RNA kann durch künstliche Synthese unter Verwendung eines Synthesegeräts erzeugt werden, indem das in der entgegengesetzten Richtung zu der gewöhnlichen Richtung (Antisense-Richtung) exprimiert wird, oder ähnliches. Zum Beispiel sind eine große Zahl an Antisense-Techniken bekannt, welche die Unterdrückung der HIV-Vermehrung mit dem tat-Gen betreffen [Nucleic Acids Research, 19, 3359-3368 (1991)] oder dem rev-Gen [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 86, 4244-4248 (1989)]. Durch diese Verfahren und unter Verwendung der Antisense-DNA oder Antisense-RNA der vorliegenden Erfindung kann die Expression eines endogenen Sulfotransferasegens unterdrückt oder reguliert werden. Die Antisense-DNA oder Antisense-RNA der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Reagens zur Verwendung im Labor für in situ-Hybridisierung usw. verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung ist eine Oligo- oder Polynucleotidsonde oder ein Oligo- oder Polynucleotidprimer, entweder synthetisch oder durch Restriktionsenzymspaltung erhalten, einer) die (der) spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen Gen hybridisiert. Diese synthetische Oligonucleotidsonde oder dieser synthetische Oligonucleotidprimer kann normalerweise durch künstliche Synthese unter Verwendung eines Synthesegeräts oder durch das PCR-Verfahren erzeugt werden.
Jeder Antikörper, egal ob polyclonal oder monoclonal, oder ein Fragment davon erfüllt den Zweck, solange er spezifisch an das Polypeptid der vorliegenden Erfindung bindet. Der Antikörper kann leicht durch Immunisierung von Kaninchen, Mäusen oder anderen Tieren unter Verwendung des gesamten oder eines Teils des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, zum Beispiel durch das Verfahren, beschrieben in Current Protocols in Immunology, John E. Coligan, Hrsg., veröffentlicht von John Wiley & Sons, Inc., 1992. Nach der Reinigung kann ein solcher Antikörper mit Peptidase usw. behandelt werden, um ein Antikörperfragment zu ergeben. Verwendungen für den resultierenden Antikörper oder ein Fragment davon schließen Affinitätschromatographie, cDNA-Bank-Durchmusterung und pharmazeutische Mittel, diagnostische Reagenzien und Forschungsreagenzien ein.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch eine Beispiel-Sulfotransferase, abgeleitet von der menschlichen Nierenkrebszelllinie SMKT-R3, beschrieben in Urological Research, 17, 317-324 (1989), ausführlicher beschrieben.
Das Sulfotransferasegen oder die -Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung wird erhalten, indem zuerst eine Massenkultur von SMKT-R3-Zellen durch das in Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996) beschriebene Verfahren durchgeführt und dann die Sulfotransferase von der Zellkultur isoliert und gereinigt wird. Die gereinigte Sulfotransferase wird spezifisch durch das nachstehend beschriebene Verfahren produziert.
Mit EGF behandelte SMKT-R3-Zellen (etwa 1 × 10¹⁰ Zellen) werden geerntet, mit PBS gewaschen und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Zur Verwendung werden 2,5 × 10⁹ Zellen aufgetaut, im gleichen Volumen TBS suspendiert und kurz mit einem Potter-artigen Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wird mit dem gleichen Volumen an 2 × Solubilisierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 10 mM MgCl₂, 2 mM β-Mercaptoethanol, 2% Lubrol PX, 40% Glycerin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,02 mM E-64) ergänzt und für 10 Minuten auf Eis mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation wird der erhaltene Überstand gegen Puffer A dialysiert (10 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 10% Glycerin und 5 mM MnCl₂).
Das dialysierte Material wird zentrifugiert, um den während der Dialyse auftretenden Niederschlag zu entfernen. Der Überstand wird dann auf eine DE-52-Säule aufgetragen, deren Ablass direkt mit einer Heparin-Sepharose CL6B-Säule verbunden war, welche mit Puffer B (10 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,05% Lubrol PX, 10% Glyzerin und 5 mM MnCl₂) äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit Puffer B gewaschen, bis die Absorption des Abflusses bei 280 nm weniger als 0,02 war. Nach Trennung der DE-52-Säule wurde das Enzym auf der Heparin-Sepharose CL6B-Säule mit 0,2 M NaCl in Puffer C eluiert (20 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,1% Lubrol PX, 20% Glycerin und 10 mM MnCl₂).
Die bei der Heparin-Sepharose-Chromatographie aktiven Enzymfraktionen werden vereinigt und gegen Puffer B dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Galactosyl-Sphingosin (GalSph)-Sepharosesäule aufgetragen, die mit Puffer B äquilibriert worden war. Die Säule wird dann mit Puffer B gewaschen, bis das Eluat im Wesentlichen frei von Protein ist, und die Sulfotransferase wird mit Puffer C eluiert, der 0,1 M NaCl enthält.
Die Eluatfraktionen der GalSph-Sepharose werden vereinigt und gegen 10 mM Triethanolamin-HCl (pH-Wert 7,0) dialysiert, der 10% Glycerin enthält, und auf eine PLP-Sepharosesäule aufgetragen, die direkt mit einer HiTrap-3',5'-Bisphosphoadenosin (PAP)-Säule verbunden ist, welche mit Puffer D (10 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,05% Lubrol PX und 10% Glycerin) äquilibriert worden war. Die Säule wird dann nacheinander mit Puffer D und Puffer B gewaschen, bis das Eluat im Wesentlichen frei von Protein ist, dann wird die Sulfotransferase mit einem linearen Gradienten von 0-0,3 mM PAP in Puffer D eluiert.
Die aktiven Enzymfraktionen der HiTrap-PAP-Chromatographie werden vereinigt und direkt einer zweiten Chromatographie auf einer Heparin-Sepharosesäule unterzogen, die mit Puffer D äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer D wird die Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung in 0,3 ml-Fraktionen mit Puffer C eluiert, der 0,3 M NaCl enthält. Durch diesen Schritt wird die Enzympräparation zu etwa einem Fünftel des Ausgangsvolumens konzentriert und PAP, welches in der Enzympräparation von der vorherigen Chromatographie enthalten ist, wird in den Durchflussfraktionen wiedergefunden. Die gereinigten aktiven Enzymfraktionen werden vereinigt und bei –80°C in der Anwesenheit von 20% Glycerin gelagert.
Als Nächstes wird die Information über die partielle Aminosäuresequenz der gereinigten Sulfotransferase erhalten. Um die partielle Aminosäuresequenz zu bestimmen, wird die Sulfotransferase direkt durch das Edman-Abbauverfahren [Journal of Biological Chemistry, 256, 7990-7997 (1981)] einer Aminosäuresequenzierung unterzogen (Proteinsequenziergerät 476A, hergestellt von Applied Biosystems), um 10 bis 20 N-terminate Aminosäurereste in der Sulfotransferase zu bestimmen. Alternativ kann die Sulfotransferase durch die Wirkung einer hoch substratspezifischen Protease, z.B.: Achromobacter-Protease I oder N-Tosyl-L-Phenylalanin-Chloromehtylketon-(TPCK)-Trypsin, einer limitierten Hydrolyse unterzogen werden, das daraus resultierende Peptidfragment wird durch Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt und gereinigt, nach dieser wird das gereinigte Peptidfragment einer Aminosäuresequenzierung unterzogen, um die erwünschte Aminosäuresequenz effizient zu bestimmen.
In der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäuresequenzen von sieben Peptidfragmenten bestimmt: P1 (SEQ ID NR: 3), P2 (SEQ ID NR: 4), P3 (SEQ ID NR: 5), P4 (SEQ ID NR: 11), P5 (SEQ ID NR: 12), P6 (SEQ ID NR: 13), P7 (SEQ ID NR: 14).
Auf der Basis der auf diese Weise bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen wird das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung cloniert. Zu diesem Zweck wird das allgemein verwendete PCR-Verfahren oder Hybridisierungsverfahren genutzt. Das PCR-Verfahren kann gemäß dem Verfahren, beschrieben in PCR-Technology, Erhich, HA, Hrsg., veröffentlicht von Stockton Press, 1989, erzielt werden. Das Hybridisierungsverfahren kann zum Beispiel in Übereinstimmung mit dem Verfahren, beschrieben in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, T. Maniatis et al., Hrsg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, erzielt werden.
Das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung konnte jedoch durch das folgende PCR-Verfahren unter Verwendung gemischter Primer (SEQ ID Nos: 22-27) (MOPAC-Verfahren), das MOPAC-Verfahren unter Verwendung von Inosin-enthaltenden gemischten Primern (SEQ ID Nos: 28-33) oder das Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden (SEQ ID Nos: 22 und 24) nicht cloniert werden.
1) PCR-Verfahren unter Verwendung gemischter Primer (MOPAC-Verfahren)
Dieses Clonierungsverfahren umfasst Auswählen von zwei Bereichen mit niedriger Degeneration in der bestimmten Aminosäuresequenz, Synthetisieren aller möglichen Nucleotidsequenzkombinationen für degenerierte Codons und Amplifizieren des gewünschten DNA-Fragments durch PCR, indem sie als gemischte Primer verwendet werden.
Durch dieses Verfahren ist das Gen cloniert worden, welches Harnsäure-Oxidase codiert [Science, 239, 1288-1291 (1988)].
Die vorliegenden Erfinder versuchten, die Sulfotransferase durch dieses Verfahren zu erhalten. Verschiedene synthetische Oligonucleotide wurden erzeugt: Synthetische Oligonucleotide S1 (SEQ ID No: 22) und A1 (SEQ ID No: 23) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P1 (SEQ ID No: 3), synthetische Oligonucleotide S2 (SEQ ID NR: 24) und A2 (SEQ ID No: 25) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P2 (SEQ ID No: 4) und synthetische Oligonucleotide S3 (SEQ ID No: 26) und A3 (SEQ ID No 27) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P3 (SEQ ID No: 5). Unter Verwendung dieser synthetischen Oligonucleotide als gemischte Primer wurde durch ein herkömmliches Verfahren PCR durchgeführt, mit SMKT-R3-Zell-cDNA als eine Matrize.
Das daraus resultierende PCR-Produkt wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Von etlichen DNA-Fragmenten wurde festgestellt, dass sie amplifiziert worden waren, jedes davon wurde aus dem Gel herausgeschnitten, extrahiert und in einen Plasmidvektor eingeführt, danach wurde seine Nucleotidsequenz durch ein herkömmliches Verfahren (Didesoxy-Kettenabbruchverfahren) bestimmt, aber die Sequenz, die wahrscheinlich von dem gewünschten Sulfotransferasegen stammte, wurde nicht gefunden, obwohl die Nucleotidsequenzen der als gemischte Primer verwendeten synthetischen Oligonucleotide gefunden wurden.
2) MOPAC-Verfahren unter Verwendung von Inosin
Dieses Verfahren ist dem unter Punkt 1) beschriebenen Verfahren ähnlich, verwendet aber einen Primer, der aus dem Austausch der dritten Base eines hoch degenerierten Codons mit Inosin resultiert, um die Zahl der gemischten Primerkombinationen zu reduzieren [Nucleic Acids Research, 16 (22), 10932 (1988)].
Verschiedene synthetische Oligonucleotide wurden erzeugt: synthetische Oligonucleotide SI1 (SEQ ID No: 28) und AI1 (SEQ ID No: 29) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P1 (SEQ ID No: 3), synthetische Oligonucleotide S12 (SEQ ID No: 30) und AI2 (SEQ ID No: 31) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P2 (SEQ ID No: 4) und synthetische Oligonucleotide S13 (SEQ ID No: 32) und AI3 (SEQ ID NR: 33) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P3 (SEQ ID No: 5). Unter Verwendung dieser synthetischen Oligonucleotide als einen Inosin-enthaltenden gemischten Primer wurde durch ein herkömmliches Verfahren mit SMKT-R3-Zell-cDNA als einer Matrize PCR durchgeführt.
Die Nucleotidsequenzen der daraus resultierenden PCR-Produkte wurde in der gleichen Weise wie vorstehend bestimmt, aber die Sequenz, die wahrscheinlich vom gewünschten Gen stammte, wurde nicht gefunden, obwohl die Nucleotidsequenzen der synthetischen Oligonucleotide, die als ein Inosin-enthaltender gemischter Primer verwendet wurden, gefunden wurden.
3) Hybridisierungsverfahren unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide
Ein anderes allgemein verwendetes Verfahren umfasst Clonierung der gewünschten DNA durch Entwerfen synthetischer Oligonucleotide auf der Basis der Aminosäuresequenzinformation und Durchführung der Hybridisierung damit durch ein herkömmliches Verfahren. Die hier genannten Erfinder haben versucht, das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung durch dieses Verfahren nachzuweisen.
Abgeleitete synthetische Oligonucleotide S1 (SEQ ID No: 22) und S2 (SEQ ID No: 24) wurden von partiellen Aminosäuresequenzen P1 (SEQ ID No: 3) bzw. P2 (SEQ ID No: 4) erzeugt und als Sonden für Plaque-Hybridisierung verwendet. SMKT-R3-Zell-cDNA wurde durch ein herkömmliches Verfahren in einen Phagenvektor inseriert, um eine cDNA-Bank zu ergeben. Mit dieser cDNA-Bank infizierter Escherichia coli wurde auf einer Platte ausgesät; jeder erhaltene Plaque wurde auf eine Nylonmembran übertragen. Hybridisierung wurde unter allgemein verwendeten Bedingungen durchgeführt.
Als Ergebnis wurden, im Falle von beiden als Sonde verwendeten synthetischen Oligonucleotiden S1 und S2, etliche positive Plaques nachgewiesen. Die Nucleotidsequenzen der DNA-Insertionen im Phagenvektor dieser positiven Plaques wurden durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt. Obwohl eine Sequenz erhalten wurde, die zur Nucleotidsequenz eines der als Sonde verwendeten synthetischen Oligonucleotide homolog war, wurde die Sequenz, die wahrscheinlich das gewünschte Sulfotransferasegen darstellte, nicht gefunden; den Aminosäuresequenzen, welche von den Nucleotidsequenzen der DNA-Insertionen in den Phagenvektoren bestimmt wurden, fehlte die Homologie zu den vorstehend erwähnten partiellen Aminosäuresequenzen.
Wie vorstehend festgestellt, ist es sehr schwierig, das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung von SMKT-R3-Zell-cDNA zu clonieren. Es ist wahrscheinlich, dass als ein Ergebnis der Tendenz des Sulfotransferasegens, aufgrund des hohen G + C-Gehalts eine sekundäre Struktur einzugehen, nicht-spezifische DNA-Fragmente in dem PCR-Verfahren aufgrund der Hemmung der Polymerasereaktion, nicht-spezifischer Anlagerung und ähnlichem amplifiziert werden. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte haben die hier genannten Erfinder umfassende Untersuchungen durchgeführt und versucht, ein kurzes Genfragment durch das PCR-Verfahren zu amplifizieren, das einem Peptidfragment von bekannter Aminosäuresequenz entspricht.
Es ist vorzuziehen, dass der Primer für das PCR-Verfahren so entworfen ist, dass er Inosin enthält, um die Anzahl der gemischten Primerkombinationen zu vermindern, dass ein häufig verwendetes Codon für Leucin ausgewählt wird und dass der Primer synthetisiert wird, nachdem die Nucleotidsequenzdegeneration durch Bereitstellung von etlichen Codonkombinationen für Serin reduziert wird. Es wird dadurch möglich, einen Teil des Sulfotransferasegens der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren. Als Nächstes haben die hier genannten Erfinder mit diesem amplifizierten PCR-Produkt als Sonde eine Southern-Hybridisierung durchgeführt und waren beim Auffinden eines DNA-Fragments, welches von dem gewünschten Sulfotransferasegen abstammte, über die nicht-spezifischen, erhaltenen DNA-Fragmente erfolgreich.
Genauer gesagt werden die synthetischen Oligonucleotide 1Sd (SEQ ID No: 6) und 1A (SEQ ID No: 7) anhand der partiellen Aminosäuresequenz P1 (SEQ ID No: 3) als Primer für das PCR-Verfahren neu erzeugt und PCR wird mit SMKT-R3-Zell-cDNA als eine Matrize durchgeführt.
Die Nucleotidsequenz von jedem erhaltenen PCR-Produkt wird zum Beispiel durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren bestimmt [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 74 (12), 5463-5467 (1977)]; eine Nucleotidsequenz, welche die partielle Aminosäuresequenz P1 codiert, wird entdeckt, d. h. ein Teil des gewünschten Sulfotransferasegen wird erhalten. Auf Basis dieser Nucleotidsequenz wird das synthetische Oligonucleotid OP1 (SEQ ID No: 8) durch ein herkömmliches Verfahren mit 3'-Endmarkierung erzeugt und als Sonde für die Hybridisierung verwendet.
Außerdem werden die synthetischen Oligonucleotide 2Sa (SEQ ID No: 9) und 3A (SEQ ID No: 10) neu als Primer für das PCR-Verfahren anhand der partiellen Aminosäuresequenzen P2 (SEQ ID No: 4) bzw. P3 (SEQ ID No: 5) neu erzeugt und PCR wird mit SMKT-R3-Zell-cDNA als eine Matrize durchgeführt.
Das erhaltene PCR-Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, nach der es durch ein herkömmliches Verfahren auf eine Nylonmembran übertragen wird [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, T. Maniatis et al., Hrsg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], gefolgt von Hybridisierung unter Verwendung des 3'-endmarkierten synthetischen Oligonucleotids OP1. Wie vorstehend angegeben, wird die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt und ein DNA-Fragment, welches an diese Sonde hybridisiert, wird unter Verwendung des für diese Markierung passendem Nachweisverfahrens, nachgewiesen.
Als Ergebnis wird eine Bande bei einer Position entsprechend etwa 600 bp erhalten, die mit dem synthetischen Oligonucleotid OP1 hybridisiert. Die Nucleotidsequenz dieses Fragments wird in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, bestimmt. Sequenzen, welche den partiellen Aminosäuresequenzen P1 (SEQ ID No: 3) und P4 (SEQ ID No: 11) der Sulfotransferase entsprechen, werden festgestellt, was zeigt, dass Teile des gewünschten Sulfotransferasegens erhalten werden.
Gesondert wird eine von SMKT-R3-Zellen abgeleitete cDNA-Bank erzeugt. Eine cDNA-Bank kann unter Verwendung des Verfahrens, beschrieben in Kapitel 8, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, T. Maniatis et al., Hrsg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, erzeugt werden.
Darüber hinaus kann mit dem vorstehend beschriebenen etwa 600 bp-DNA-Fragment als Sonde durch Durchmusterung der vorstehend beschriebenen, von SMKT-R3-Zellen abgeleiteten cDNA-Bank ein Gesamtlängengen cloniert werden, welches die Sulfotransferase codiert. Außerdem kann durch Durchmusterung der von SMKT-R3-Zellen abgeleiteten genomischen DNA-Bank auch genomische DNA der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Die auf diese Weise erhaltene gesamte Nucleotidsequenz des durch SMKT-R3-Zellen der menschlichen Nierenkrebszelllinie produzierten Sulfotransferasegens ist die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID No: 2 gezeigte Sequenz, die dadurch codierte gesamte Aminosäuresequenz ist die im Sequenzprotokoll durch SEQ ID No: 1 gezeigte Sequenz. Außerdem sind diese Aminosäuresequenz und Nucleotidsequenz neue Sequenzen, welchen eine Homologie zu jeglichen bekannten Sulfotransferasegenen mit unterschiedlichen Substratspezifitäten fehlt.
Da die gesamte Nucleotidsequenz des Sulfotransferasegens der vorliegenden Erfindung aufgeklärt worden ist, kann zum Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung hoch homologe DNA durch Durchmusterung von genomischer DNA oder cDNA, oder genomischer DNA-Bank oder cDNA-Bank, abgeleitet von einem anderen Organismus als SMKT-R3-Zellen, unter Verwendung des gesamten oder eines Teils des Sulfotransferasegens der vorliegenden Erfindung als eine Sonde zur Hybridisierung cloniert werden.
Außerdem kann auf der Basis der Nucleotidsequenz der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung ein Primer für die PCR entworfen werden. Unter Verwendung dieses Primers ist es möglich, ein zum Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung hoch homologes DNA-Fragment aus genomischer DNA oder cDNA oder aus einer genomischen DNA-Bank oder cDNA-Bank nachzuweisen, welche von einem anderen Organismus als SMKT-R3-Zellen abgeleitet ist, oder das Gesamtlängengen zu erhalten.
Um zu bestätigen, ob das erhaltene Gen ein Gen ist, welches ein Polypeptid codiert, das die gewünschte Sulfotransferaseaktivität besitzt, ist eine Beurteilung anhand der Homologie der bestimmten Nucleotidsequenz oder der bestimmten Aminosäuresequenz zu der Nucleotidsequenz bzw. der Aminosäuresequenz der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung möglich. Zusätzlich wird Sulfotransferaseaktivität durch das vorstehend beschriebene Testverfahren bestimmt, nachdem das Genprodukt durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde; wenn eine Aktivität nicht geringer ist als 1 × 10^–7 Millieinheiten ist, wird es so bewertet, dass das Gen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Um ein funktionell äquivalentes Produkt zu produzieren, welches ähnliche Sulfotransferaseaktivität besitzt, kann zum Beispiel das folgende Verfahren verwendet werden. Durch Einführung einer zufälligen Mutation oder stellenspezifischen Mutation in das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung wird ein Gen erhalten, welches Deletion, Addition, Insertion oder Austausch von einem oder mehreren Aminosäureresten in der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Sulfotransferase aufweist. Es ist dadurch möglich, ein Gen zu erhalten, welches eine Sulfotransferase codiert, welche die gleiche Aktivität wie die natürlich vorkommende Sulfotransferase besitzt, aber etwas unterschiedliche Eigenschaften wie zum Beispiel Temperaturoptimum, Stabilisierungstemperatur, optimaler pH-Wert und Stabilisierungs-pH-Wert aufweist, und eine solche Sulfotransferase durch Genmanipulation zu erzeugen.
Verfahren für die zufällige Mutagenese schließen zum Beispiel das chemische DNA-Behandlungsverfahren in welchem die Cytosinbase durch die Wirkung von Natriumhydrogensulfit, welches die Transitionsmutation bewirkt, in die Uracilbase umgewandelt wird [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 79, 1408-1412 (1982)], das biochemische Verfahren, in welchem die Basensubstitution während der Doppelstrangsynthese in der Anwesenheit von [α-S]dNTP bewirkt wird [Gene, 64, 313-319 (1988)] und das auf PCR basierende Verfahren ein, in welchem PCR in der Anwesenheit von zum Reaktionssystem hinzugefügtem Mangan durchgeführt wird, um die Genauigkeit des Nucleotideinbaus zu vermindern [Analytical Biochemistry, 224, 347-353 (1995)].
Bekannte Verfahren zur stellenspezifischen Mutagenese schließen zum Beispiel das Verfahren, basierend auf Ambermutation [Gapped-Duplex-Verfahren, Nucleic Acids Research, 12 (24), 9441-9456 (1984)], das Verfahren, welches Restriktionsenzymstellen nutzt [Analytical Biochemistry, 200, 81-88 (1992); Gene, 102, 67-70 (1991)], das Verfahren, basierend auf dut- (dUTPase) und ung- (Uracil-DNA-Glykosylase)-Mutation [Kunkel-Verfahren, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, 488-492 (1985)], das Verfahren, basierend auf Ambermutation, unter Verwendung von DNA-Polymerase und DNA-Ligase [Oligonucleotid-spezifisches doppeltes Amberverfahren (ODA), Gene, 152, 271-275 (1995)] und das auf PCR basierende Verfahren ein, welches zwei Arten von Primern für die Mutagenese verwendet, wobei Restriktionsenzym-Erkennungsstellen daran angefügt wurden (USP 5.512.463).
Außerdem kann unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits eine stellenspezifische Mutation leicht eingeführt werden. Beispiele von im Handel erhältlichen Kits schließen Mutan^R-G, basierend auf dem Gapped-Duplex-Verfahren (hergestellt von Takara Shuzo), Mutan^R-K, basierend auf dem Kunkel-Verfahren (hergestellt von Takara Shuzo), Mutan^R-Express Km, basierend auf dem ODA-Verfahren (hergestellt von Takara Shuzo), und den stellenspezifischen QuickChange^TM-Mutagenesekit (hergestellt von STATAGENE) ein, welcher einen Primer für die Mutagenese und eine von Pyrococcus furiosus abgeleitete DNA-Polymerase verwendet. Auf PCR basierende Verfahren schließen auch den TaKaRa-LA-PCR- in vitro- Mutagenesekit (hergestellt von Takara Shuzo) und den Mutan^R-Super Express Km (hergestellt von Takara Shuzo) ein.
Wie vorstehend festgestellt, klärt die vorliegende Erfindung die Primärstruktur und Genstrukturen der von der menschlichen Nierenkrebs-Zelllinie SMKT-R3 abgeleiteten Sulfotransferase auf und ermöglicht ein preiswertes Verfahren zur Produktion eines hoch gereinigten Polypeptids durch Genmanipulation, welches Sulfotransferaseaktivität besitzt.
Darüber hinaus sind die synthetischen Oligonucleotidsonden oder -Primer, welche spezifisch an das Sulfotransferasegen der vorliegenden Erfindung hybridisieren, bei der Suche, dem Nachweis, der Amplifikation usw. des Sulfotransferasegens der vorliegenden Erfindung nützlich. Ein Antikörper, welcher spezifisch an das Polypeptid oder ein Fragment davon bindet, ist nützlich in der Suche, dem Nachweis, der Reinigung usw. der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung.
Im Übrigen hat die rekombinante Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung, erzeugt durch Genmanipulation unter Verwendung eines Gens, welches ein Polypeptid codiert, das Sulfotransferaseaktivität besitzt, den folgenden optimalen pH-Wert, die folgende optimale Temperatur, den folgenden Stabilisierungs-pH-Wert und die folgende Stabilisierungstemperatur, für welche, wie nachstehend gezeigt, ähnliche Ergebnisse wie bei der nativen Sulfotransferase, offenbart im Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996), erhalten wurden.
(1) Optimaler pH-Wert
Der optimale pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung ist, wie in 1 gezeigt, etwa 6 bis etwa 8, innerhalb dieses Bereichs wird die höchste Aktivität erzielt.
(2) Optimale Temperatur
Die optimale Temperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung liegt, wie in 2 gezeigt, um 40°C, bei dieser Temperatur wir die maximale Aktivität erzielt.
(3) Stabilisierungs-pH-Wert
Der Stabilisierungs-pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung ist 6 bis 10, wie in 3 gezeigt.
(4) Stabilisierungstemperatur
Die Stabilisierungstemperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung ist so, dass sie, wie in 4 gezeigt, Stabilität bei 30°C zeigt, 85% ihrer Enzymaktivität gehen aber nach einer 30-minütigen Behandlung bei 40°C verloren.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1
Reinigung der Sulfotransferase von SMKT-R3-Zellen
Für 12 bis 24 Stunden mit 50 ng/ml EGF behandelte SMKT-R3-Zellen wurden geerntet, mit PBS gewaschen und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Zur Verwendung wurden 2,5 × 10⁹ Zellen aufgetaut, im gleichen Volumen an TBS supendiert und kurz mit einem Potter-artigen Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde dann mit gleichem Volumen an 2 × Solubilisierungspuffer ergänzt (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 10 mM MgCl₂, 2 mM β-Mercaptoethanol, 2% Lubrol PX, 40% Glycerin, 0,5 mM Phenylmethylsulfonfluorid und 0,02 mM E-64) und für 10 min auf Eis mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation bei 100.000 × g für 1 Stunde wurde der erhaltene Überstand über Nacht gegen Puffer A dialysiert (10 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 10% Glycerin und 5 mM MnCl₂).
Das dialysierte Material wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert, um die während der Dialyse auftretenden Niederschläge zu entfernen. In den Niederschlägen wurde keine Sulfotransferaseaktivität nachgewiesen. Der Überstand wurde auf eine DE-52-Säule (3 × 20 cm, hergestellt von Whatman) aufgetragen, deren Ablass wurde direkt mit einer Säule aus Heparin-Sepharose CL6B verbunden (2 × 10 cm, hergestellt von Pharmacia Biotech), welche mit Puffer B (10 Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,05% Lubrol PX, 10% Glycerin und 5 mM MnCl₂) äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit Puffer B bei einer Durchflussrate von 40 ml/h gewaschen, bis das Absorptionsvermögen des Abflusses bei 280 nm weniger als 0,02 wurde. Nach der Trennung von der DE-52-Säule wurde das Enzym auf der Heparin-Sepharose CL6B-Säule mit 0,2 M NaCl in Puffer C eluiert (20 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,1 % Lubrol PX, 20% Glycerin und 10 mM MnCl₂).
Die bei der Heparin-Sepharose-Chromatographie aktiven Enzymfraktionen wurden vereinigt und gegen Puffer B dialysiert. Das Dialysat wurde bei einer Durchflussrate von 5 ml/h. auf eine GalSph-Sepharosesäule aufgetragen (1 × 10 cm, hergestellt von Pharmacia Biotech), welche mit Puffer B äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit Puffer B gewaschen, bis das Eluat im Wesentlichen frei von Protein war, und die Sulfotransferase wurde mit Puffer C eluiert, der 0,1 M NaCl enthielt.
Die Eluatfraktionen der GalSph-Sepharose wurden vereinigt und gegen 10 mM Triethanolamin-HCl (pH-Wert 7,0) dialysiert, das 10% Glycerin enthielt, und bei einer Durchflussrate von 5 ml/h. auf eine Säule (1 × 10 cm, hergestellt von Pharmacia Biotech) mit PLP-Sepharose aufgetragen, welche direkt mit einer HiTrap-PAP-Säule (5-ml-Bettvolumen, hergestellt von Pharmacia Biotech) verbunden war, welche mit Puffer D (10 mM Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,0, 0,05% Lubrol PX und 10% Glycerin) äquilibriert worden war. Die Säule wurde nacheinander mit Puffer D und Puffer B gewaschen, bis das Eluat im Wesentlichen frei von Protein war, dann wurde die Sulfotransferase mit einem linearen Gradienten von 0-0.3 mM PAP in Puffer D eluiert.
Die bei der HiTrap-PAP-Chromatographie aktiven Enzymfraktionen wurden vereinigt und direkt einer zweiten Chromatographie auf einer Heparin-Sepharosesäule (0,3-ml-Bettvolumen) unterzogen, welche mit Puffer D äquilibriert worden war. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer D wurde die Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung in 0,3-ml-Fraktionen mit Puffer C eluiert, der 0,3 M NaCl enthielt. Durch diesen Schritt wurde die Enzympräparation auf etwa ein Fünftel des Anfangsvolumens konzentriert und PAP, welches die Enzympräparation der vorherigen Chromatographie einschloss, wurde in den Durchflussfraktionen wiedergefunden. Die gereinigten aktiven Enzymfraktionen wurden vereinigt und bei –80°C in der Anwesenheit von 20% Glycerin gelagert. Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms wurde, wie in Beispiel 2 nachstehend beschrieben, als 1,2 Einheiten/mg ausgetestet.
Beispiel 2
Wirkung, Substratspezifität und physikalisch-chemische Eigenschaften der gereinigten Sulfotransferase
Die Aktivität der in Beispiel 1 erhaltenen Sulfotransferase wurde mit einer leichten Veränderung, wie beschrieben in Analytical Biochemistry 182, 9-15 (1989), getestet. Dieses Reaktionsgemisch enthielt 5 nMol GalCer, 0,5 μMol MnCl₂, 1 nMol [³⁵S]PAPS (100 ZpM/pMol), 0,5 mg Lubrol PX, 12,5 nMol Dithiothreit, 0,25 μMol NaF, 0,1 μMol ATP, 20 μg BSA und Enzymprotein in 25 mM Na-Cacodylat-HCl, pH-Wert 6,5, in einem Gesamtvolumen von 50 μl. In den Experimenten zur Überprüfung der Substratspezifität wurden 25 nMol von jedem Testglycolipid als ein Akzeptor anstatt von 5 nMol GalCer verwendet. Nach Inkubation bei 37°C für 30 Minuten wurde die Reaktion mit 1 ml Chloroform/Methanol/Wasser (30:60:8) beendet. Das Umsetzungsprodukt wurde auf einer DEAE-Sephadex A-25-Säule isoliert und unter Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillationszählers auf Radioaktivität überprüft. Die Werte wurden um einen Leerwert korrigiert, welcher durch Verwendung des vorstehenden Reaktionsgemisches ohne Akzeptor erhalten wurde. Eine Aktivitätseinheit wurde als die Menge an Enzym definiert, welche unter den vorstehend erwähnten Testbedingungen 1 μMol Sulfat pro Minute übertrug.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 definiert, war GalCer der beste und LacCer der zweitbeste Akzeptor unter den angewandten Bedingungen. GalAAG und GalDG dienten zu einem gewissen Ausmaß auch als Akzeptoren. Die gereinigte Sulfotransferase hat auf GlcCer, Gb4Cer, Gg3Cer, Gg4Cer und nLc4Cer nicht gewirkt, obwohl die relativen Aktivitäten verglichen mit der Aktivität gegen GalCer weniger als 10% waren, hat aber nicht auf Gb3Cer gewirkt.
Andere Eigenschaften der Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung schlossen ein, dass NaCl die Sulfotransferaseaktivität bei Konzentrationen bis zu 0,1 M verstärkte, aber bei höheren Konzentrationen hemmte, und dass die offensichtlichen K_m-Werte für die gereinigte Sulfotransferase für GalCer und PAPS 27 bzw. 25 μM waren. Das Enzym zeigte maximale Aktivität zwischen 6,5 und 7,0. Das gereinigte Enzym konnte in der Anwesenheit von 20% Glycerin ohne nachweisbaren Aktivitätsverlust für mindestens 3 Monate bei –80°C gelagert werden.
Die gereinigte Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung wurde gemäß dem Verfahren von Laemmli [Nature 227, 680-685 (1970)] einer SDS-PAGE unterzogen. Im Falle der Behandlung des gereinigten Enzyms mit Probenpuffer, der 5% β-Mercaptoethanol enthielt, zeigte es eine einzelne Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa 54 kDa.
Beispiel 3
Clonierung des Sulfotransferasegens
(1) Konstruktion einer cDNA-Bank
Von der vorstehend beschriebenen SMKT-R3-Zelllinie [Urological Research, 17, 317-324 (1989)] wurde die gesamte RNA extrahiert [Analytische Biochemistry, 162, 156-159 (1987)], danach wurde unter Verwendung von Oligotex^TM-dT30 (hergestellt von Takara Shuzo) poly(A)⁺-RNA gereinigt. Doppelsträngige cDNA wurde von der gereinigten poly(A)⁺-RNA unter Verwendung des SUPERSCRIPT^TM Choice System (hergestellt von Life Technologies) synthetisiert. Die resultierende doppelsträngige cDNA wurde mit einem EcoRI-Adaptor (hergestellt von Life Technologies) vereinigt. Dieses cDNA-Fragment wurde mit dem λgt10-Phagenvektor ligiert (hergestellt von Pharmacia Biotech), welcher vorher mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten wurde, danach wurde unter Verwendung des Ready-To-Go^TM Lambda Packaging Kit (hergestellt von Pharmacia Biotech) eine in vitro-Verpackung durchgeführt, um eine von der SMKT-R3-Zelllinie abgeleitete λgt10-cDNA-Bank zu ergeben.
(2) Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz der Sulfotransferase
Zehn Mikrogramm der in Beispiel 1 gereinigten Sulfotransferase wurden in einer 1 mM EDTA-Lösung (1 ml) aufgelöst, die 6 M Guanidium-Hydrochlorid enthielt. Danach wurden 2 μl 2-Mercaptoethanol hinzugefügt, das Teströhrchen wurde mit Stickstoff gefüllt und verschlossen und dann bei 37°C für 2 Stunden zur Reduktion inkubiert. 10 Mikroliter 4-Vinylpyridin wurden dann hinzugefügt, danach wurde das Teströhrchen mit Stickstoff gefüllt und verschlossen und dann bei 37°C für 2 Stunden zur S-Pyridylethylierung inkubiert.
Das auf diese Weise erhaltene pyridylethylierte Enzymprotein wurde durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) [System: Waters 625LC, hergestellt von Millipore; Säule: Cosmosil 5C4-AR-300, 4,6 × 50 mm, hergestellt von Nacalai Tesque; Durchflussrate: 0,4 ml/min; Eluant A: 0,1% Trifluoressigsäurelösung (TFA); Eluant B: 0,1 % TFA- enthaltendes 70% Acetonitril; Elution: durchgeführt auf einem linearen Dichtegradienten von 0% bis 70% von Eluant B über eine Dauer von 55 Minuten, beginnend beim Auftragen der Probe], erhalten.
Das gereinigte S-pyridylethylierte Enzymprotein (etwa 2 μg/ml) wurde in 400 μl eines 0,1 M Tris-HCl-Puffers (pH-Wert 9,0) aufgelöst, der 3 M Harnstoff enthielt, und mit 0,3 μg Lysyl-Endopeptidase (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries) bei 37°C für 12 Stunden gespalten.
Ein Peptidfragment wurde von der resultierenden Spaltung durch RP-HPLC aufgetrennt und gereinigt [System: Modell 130A, hergestellt von Applied Biosystems; Säule: OD-3000, Aquapore, 7 μm, 1,0 × 250 mm, hergestellt von Applied Biosystems; Durchflussrate: 0,1 ml/Min; Eluant A: 0,1% TFA-Lösung; Eluant B: 0,1% TFA-enthaltendes 70% Acetonitril; Elution: durchgeführt auf einem linearen Dichtegradienten von 0% bis 70% von Eluant B über eine Dauer von 85 Minuten, beginnend beim Auftragen der Probe].
Das auf diese Weise aufgetrennte Peptidfragment wurde durch Gasphasen-Edmanabbau durch herkömmliche Verfahren einer Aminosäuresequenzierung unterzogen (Protein Sequencer Model 492, hergestellt von Applied Biosystems), um die partiellen Aminosäuresequenzen P1 (SEQ ID No: 3), P2 (SEQ ID No: 4), P3 (SEQ ID No: 5), P4 (SEQ ID No: 11), P5 (SEQ ID No: 12), P6 (SEQ ID No: 13) und P7 (SEQ ID No: 14) zu bestimmen.
(3) Synthese von Primern
Von den in Punkt (2) vorstehend bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen wurden synthetische Nucleotide erzeugt (DNA Sequencer Model 392, hergestellt von Applied Biosystems), um synthetische Nucleotidprimer zu ergeben: synthetische Nucleotide 1Sa (SEQ ID No: 15), 1Sb (SEQ ID No: 16), 1Sc (SEQ ID No: 17), 1Sd (SEQ ID No: 6) und 1A (SEQ ID No: 7) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P1 (SEQ ID No: 3), synthetische Nucleotide 2Sa (SEQ ID No: 9), 2Sb (SEQ ID No: 18), 2Aa (SEQ ID No: 19) und 2Ab (SEQ ID No: 20) auf der Basis der partiellen Aminosäuresequenz P2 (SEQ ID No: 4) und synthetische Nucleotide 3S (SEQ ID No: 21) und 3A (SEQ ID No: 10) von der partiellen Aminosäuresequenz P3 (SEQ ID No: 5).
Synthetische Oligonucleotidprimer 1Sa, 1Sb, 1Sc, 1Sd, 2Sa, 2Sb und 3S sind Primer für die Sense-Richtung, während die synthetischen Oligonucleotidprimer 1A, 2Aa, 2Ab, 2A und 3A Primer für die Antisense-Richtung sind.
Um eine gegenseitige Bindung der Primer während der Hybridisierung zu verhindern, wurde ein Basenaustausch mit Desoxyinosin beim Synthetisieren aller Oligonucleotide durchgeführt. Desoxyinosin wurde in Positionen ausgetauscht, wo die Codondegeneration größer als 2 war. Für den Teil, der den Serinrest codierte, wurden Primerkombinationen der beiden Arten an Codons, TCX und AG(T/C), erzeugt.
(4) Durchmusterung auf das Sulfotransferasegen durch das RT-PCR-Verfahren
In 20 μl eines Reaktionssystem, welches 2 μg aus SMKT-R3-Zellen extrahierte poly(A)⁺-RNA, 40 pMol Oligo(dT)_12-18-Primer (hergestellt von Life Technologies), 0,25 mM (je) dNTP, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,3), 75 mM Kaliumchlorid, 3 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreit und 200 Einheiten reverse Transkriptase enthielt, abgeleitet vom Moloney-Maus-Leukämievirus [SUPERSCRIPT^TMII Rnase H^– Reverse Transcriptase, hergestellt von Life Technologies], wurde bei 37°C für 1 Stunde eine reverse Transkriptasereaktion durchgeführt. Unter Verwendung eines 4-μl-Aliquots von diesem Reaktionsgemisch als eine Matrize wurde PCR in 50 μl eines Reaktionssystems, welches 100 pMol von jedem der vorstehend beschriebenen Oligonucleotidprimern (Sense-Richtung- und Antisense-Richtung-Primer), 0,25 mM (je) dNTP-Gemisch, 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid und 1,25 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (hergestellt von Perkin Elmer) enthielt, durchgeführt (RT-PCR). Die Reaktion wurde in 35 Zyklen durch Wiederholung der sequenziellen Behandlung bei 94°C für 30 Sekunden (Denaturierung), 45-55°C für 30 Sekunden (Primer-Anlagerung) und 72°C für 1-2 Minuten (Synthesereaktion) durchgeführt.
Nach dieser PCR wurde das gesamte Reaktionsgemisch einer Elektrophorese auf einem 2% Agarosegel unterzogen. Ein DNA-Fragment wurde dann aus dem Gel ausgeschnitten und in den pT7Blue-Vektor (hergestellt von Novagen) subcloniert. Die Nucleotidsequenzen dieser DNA-Fragmente wurden durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase [Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, hergestellt von Perkin Elmer; DNA-Sequenziergerät Modell 373A, hergestellt von Applied Biosystems] bestimmt.
RT-PCR wurde zuerst unter Verwendung von vier synthetischen Oligonucleotidprimern 1Sa, 1Sb, 1Sc und 1Sd für die Sense-Richtung und des synthetischen Oligonucleotidprimers 1A für die Antisense-Richtung durchgeführt, was aus der Kombination von 1Sc und 1A in der Amplifikation eines 47-bp-cDNA-Fragments resultierte und eines etwa 600-bp-cDNA-Fragments aus der Kombination von 2Sa und 3A.
Von diesen cDNA-Fragmenten wurde das 47-bp-cDNA-Fragment subcloniert und dann einer Nucleotidsequenzierung unterzogen; die von dieser bestimmten Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz stimmte mit der partiellen Aminosäuresequenz P1 überein.
Als Nächstes wurde das gemischte Oligonucleotid OP1 (SEQ ID NR: 8) auf der Basis der Nucleotidsequenz des 47-bp-cDNA-Fragments synthetisiert und sein 3'-Ende wurde mit terminaler Transferase unter Verwendung eines Digoxigenin (DIG)-Oligonucleotid-Tailing-Kits (hergestellt von Boehringer Mannheim) DIG-markiert.
Unter Verwendung des DIG-markierten gemischten Oligonucleotids OP1 als eine Sonde wurde für das etwa 600-bp-cDNA-Fragment, welches, wie vorstehend beschrieben, durch PT-PCR amplifiziert wurde, eine Southern-Blot-Hybridisierung durchgeführt.
Zuerst wurde das durch RT-PCR erhaltene etwa 600-bp-cDNA-Fragment auf einem 1,5% Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, danach wurde die DNA auf eine Nylonmembran (hergestellt von Boehringer Mannheim) übertragen. Unter Verwendung dieser Nylonmembran wurde die Hybridisierung bei 55°C für 4 Stunden in einer Lösung durchgeführt, welche 2 pMol/ml DIG-markiertes gemischtes Oligonucleotid OP1, 5 × SSC, 2% Blockingreagens (hergestellt von Boehringer Mannheim), 0,1% N-Lauryl-Sarcosin und 0,02% SDS enthielt. Der Nachweis wurde unter Verwendung eines DIG Luminescent Detection Kit (hergestellt von Boehringer Mannheim) erzielt.
Als Ergebnis hybridisierte die OP1-Sonde an das etwa 600-bp-cDNA-Fragment, welches durch RT-PCR unter Verwendung der synthetischen Oligonucleotidprimer 2Sa und 3A amplifiziert wurde.
Dieses etwa 600-bp-cDNA-Fragment wurde subcloniert und einer Nucleotidsequenzierung unterzogen; eine Sequenz, welche die partiellen Aminosäuresequenzen P1 und P4 codierte, wurde in diesem etwa 600-bp-cDNA-Fragment festgestellt.
(5) Clonierung des cDNA-Fragments, welches das Sulfotransferasegen enthält.
Um einen cDNA-Clon von der in Beispiel 3 (1) erzeugten von der SMKT-R3-Zelllinie abgeleiteten λgt10-cDNA-Bank zu isolieren, wurde eine Durchmusterung durch Plaque-Hybridisierung durchgeführt.
Unter Verwendung des in Beispiel 3 (3) erhaltenen etwa 600-bp-cDNA-Fragments als eine Matrize wurde eine RNA-Sonde synthetisiert, die vorher unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase DIG-markiert wurde (DIG RNA Labeling Kit, hergestellt von Boehringer Mannheim).
Ungefähr 2 × 10⁵ rekombinante λ-Phagen und Escherichia coli LE392 wurden gemischt, um auf 10 eckigen Platten (9 × 13 cm) 2 × 10⁴ Plaques pro Platte zu bilden. Die erhaltenen Plaques wurden auf Nylonmembranen übertragen (hergestellt von Boehringer Mannheim). Die Membranen wurden bei 4°C 1 Stunde inkubiert, unter alkalischen Bedingungen denaturiert (0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl, 5 Min.) und anschließend neutralisiert (zweimal 3 Minuten in 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4), welcher 1,5 M NaCl enthielt; dann einmal in 2 × SSC für 2 Minuten). Die Hybridisierung wurde bei 50°C über Nacht mit den Nylonmembranen in einem Hybridisierungspuffer durchgeführt, der 1 ng Digoxigenin-markierte RNA-Sonde pro cm² einer Membran, 50% Formamid, 5 × SSC, 2% Blockierungs-Reagens (hergestellt von Boehringer Mannheim), 0,1 % N-Laurylsarcosin und 0,02% SDS enthielt. Der Nachweis wurde unter Verwendung eines DIG Luminescent Detection Kit durchgeführt. 6 λ-Phagenclone wurden von den positiven Plaques gepickt und die inserierten cDNAs wurden durch EcoRI-Spaltung in den pBluescript-Vektor (hergestellt von Stratagene) subcloniert.
Als Ergebnis wurde ein Plasmid erhalten, welches ein cDNA-Fragment von höchstens etwa 1,8 kbp in Länge aufweist, und als pBS-hCST1 bezeichnet. Seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt; ein offener Leserahmen (ORF) wurde ermittelt, der ein Protein, bestehend aus 432 Aminosäuren, codiert. Dieser ORF enthielt die gesamte Aminsäuresequenz, bestimmt durch partielle Aminosäuresequenzierung der vorstehend beschriebenen gereinigten Sulfotransferase.
Auf der Basis der vorstehenden Ergebnisse wurde die gesamte Nucleotidsequenz und Primärstruktur des Sulfotransferasegens bestimmt. Die Nucleotidsequenz, welche die Sulfotransferase codiert, wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID No: 2 gezeigt und die dadurch codierte Aminosäuresequenz wird im Sequenzprotokoll durch SEQ ID No: 1 gezeigt.
Beispiel 4
Konstruktion des Plasmids für die Expression des Sulfotransferase-Polypeptids
Das in Beispiel 3 erhaltene Plasmid pBS-hCST1 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten; das daraus resultierende DNA-Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pSVK3 inseriert, einem Vektor zur Expression in Säugern (hergestellt von Pharmacia Biotech). Die Richtung der DNA-Insertion wurde anhand der Restriktionsenzym-Spaltungskarte bestimmt. Zwei Expressionsplasmide mit zueinander entgegengesetzt gerichteten Insertionen, wurden als pSV-hCST bzw. pSV-hCSTR bezeichnet.
Von diesen Plasmiden wurde pSV-hCST in Escherichia coli JM109 transformiert, um eine Transformante zu erhalten. Diese als Escherichia coli JM109/pSV-hCST bezeichnete Transformante ist unter der Zugangsnummer FERM-BP-5811 für Escherichia coli JM109/pSV-hCST am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry hinterlegt worden.
Beispiel 5
Expression des rekombinanten Sulfotransferasegens in COS-1-Zellen
2 × 10⁵ COS-1-Zellen (ATCC CRL 1650), für einen Tag in einer Schale mit 35 mm Durchmesser vorgezüchtet, wurden mit 1 μg des Expressionsplasmids pSV-hCST oder pSV-hcSTR und 5 μl Lipofectamin^TM (hergestellt von Life Technologies) transfiziert. Nach Inkubation bei 37°C für 72 Stunden wurden die erhaltenen transformierten COS-1-Zellen zweimal mit kaltem TBS gewaschen (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH-Wert 7,4), mit 0,2 ml TBS, das 0,1% Triton X-100 enthält, unter Verwendung eines Silikonkratzers (hergestellt von Falcon) geerntet, auf Eis mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen, und der Überstand wurde gewonnen, indem sie zentrifugiert wurden.
Als Ergebnis wurde die spezifische Aktivität in der Zellextraktfraktion der mit pSV-hCST transformierten COS-1-Zellen als 1,8 × 10^–5 E/mg (Protein) bestimmt, eine Menge von etwa der 16-fachen Aktivität der Zellextraktfraktion der COS-1-Zellen, welche als Kontrolle pSVK3 darin eingeführt hatten, und etwa 8-mal die Aktivität in der Zellextraktfraktion der COS-1-Zellen, die mit pSV-hCSTR transformiert waren.
Als Nächstes wurde untersucht, ob die mit pSV-hCST transfizierten COS-1-Zellen Sulfatid exprimierten oder nicht. Die COS-1-Zellen (1 × 10⁴) wurden mit 1 μg pSV-hCST und 1 μl Lipofectamin in Lab-Tek-Kammerdeckgläsem (hergestellt von Nunc Inc.) transfiziert. Nach Inkubation bei 37°C für 48 Stunden wurden die transformierten COS-1-Zellen mit PBS (pH-Wert 7,4) gewaschen, in 1% Paraformaldehyd in PBS (pH-Wert 7,4) fixiert, mit 1 % Rinderserumalbumin in PBS (pH-Wert 7,4) blockiert und mit dem monoclonalen anti-Sulfatid-Antikörper Sulph 1 [Biochemical Journal, 251, 17-22, (1988)] inkubiert, gefolgt von FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (hergestellt von Zymed Laboratories). Jede Inkubationszeit betrug 45 Minuten. Markierte Zellen wurden mit Vectashield-Einbettungsmedium (hergestellt von Vector Labo) bedeckt und unter Verwendung eines Fluoreszenz- und Phasenmikroskops beotrachtet.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Zelloberfläche in den mit pSV-hCST transformierten COS-1-Zellen mit Immunfluoreszenz gefärbt war, während die nicht transformierten COS-1-Zellen überhaupt nicht gefärbt waren, was beweist, dass die Sulfotransferase ihre Aktivität zeigte, um in den transformierten COS-1-Zellen ein Sulfatid zu synthetisieren.
Beispiel 6
Physikalisch-chemische Eigenschaften der rekombinanten Sulfotransferase
Die in Beispiel 5 erhaltenen transformierten COS-1-Zellen wurden auf Eis mit Ultraschall behandelt, um die Zellen aufzubrechen. Der durch Zentrifugation erhaltene Überstand der aufgebrochenen Zellen wurde als eine Enzymlösung der rekombinanten Sulfotransferase verwendet, um ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften gemäß dem Verfahren, beschrieben im Journal of Biochemistry, 119 (3), 421-427 (1996), zu messen. Die Ergebnisse werden nachstehend gegeben.
(1) Optimaler pH-Wert

Der optimale pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung war, wie in 1 gezeigt, etwa 6 bis 8, innerhalb welches Bereiches hohe Aktivität erzielt wurde. Mit anderen Worten ist 1 eine graphische Darstellung des optimalen pH-Wertes der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung, wobei die Ordinate die relative Aktivität (%) und die Abszisse einen pH-Wert darstellt. Die folgenden Pufferlösungen wurden in jeder der entsprechenden folgenden pH-Wert-Bereiche zur Messung der relativen Aktivitäten verwendet:

pH-Wert 3,0-6,0:	50 mM Acetat-Pufferlösung;
pH-Wert 6,0-7,0:	50 mM Cacodylat-Pufferlösung;
pH-Wert 7,0-8,0:	50 mM Triethanolamin-Pufferlösung; und
pH-Wert 8,0-10,0:	50 mM Tris-Pufferlösung.

In der Figur bezeichnen volle quadratische Kennzeichen eine Acetat-Pufferlösung, volle runde Kennzeichen bezeichnen eine Cacodylat-Pufferlösung, volle dreieckige Kennzeichen bezeichnen eine Triethanolamin-Pufferlösung und x-Kennzeichen bezeichnen eine Tris-Pufferlösung.
(2) Optimale Temperatur
Die optimale Temperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung lag, wie in 2 gezeigt, bei etwa 40°C, bei welcher Temperatur die maximale Aktivität erreicht wurde. Mit anderen Worten ist 2 eine graphische Darstellung der optimalen Temperatur der rekombinanten Sulfotransferase der vorliegenden Erfindung, wobei die Ordinate die relative Aktivität (%) und die Abszisse eine Reaktionstemperatur (°C) darstellt.
(3) Stabilisierungs-pH-Wert

Der Stabilisierungs-pH-Wert wurde durch Messen der Enzymaktivität jeder der rekombinanten Sulfotransferasen der vorliegenden Erfindung erhalten, nachdem sie für 16 Stunden bei den jeweiligen pH-Werten bei 6°C gehalten wurden und dann auf pH-Wert 7,0 zurückgeführt wurden. Die folgenden Pufferlösungen wurden für jede der jeweiligen folgenden pH-Wert-Bereiche zur Messung der verbleibenden Aktivitäten verwendet:

Die rekombinante Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung war, wie in 3 gezeigt, bei einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 10 stabil. Mit anderen Worten ist 3 eine graphische Darstellung, welche den Stabilisierungs-pH-Wert der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei die Ordinate die verbleibende Aktivität (%) und die Abszisse einen pH-Wert darstellt. In der Figur bezeichnen volle quadratische Kennzeichen eine Acetat-Pufferlösung, volle runde Kennzeichen bezeichnen eine Cacodylat-Pufferlösung, volle dreieckige Kennzeichen bezeichnen eine Triethanolamin-Pufferlösung und x-Kennzeichen bezeichnen eine Tris-Pufferlösung.
(4) Stabilisierungstemperatur
Die Stabilisierungstemperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung wurde ausgewertet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass, wie in 4 gezeigt, die rekombinante Sulfotransferase bei 30°C stabil war, aber 85% ihrer Aktivität gingen durch eine 30-minütige Behandlung bei 40°C verloren. Mit anderen Worten ist 4 eine graphische Darstellung, welche die Stabilisierungstemperatur der rekombinanten Sulfotransferase in der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei die Ordinate die verbleibende Aktivität (%) und die Abszisse eine Reaktionstemperatur (°C) darstellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Gen oder eine davon abgeleitete isolierte Nucleinsäuresequenz, das/die ein Polypeptid mit Sulfotransferase-Aktivität codiert, welches spezifisch eine Sulfatgruppe auf die Hydroxylgruppe in der C3-Position von Gal durch Wirkung auf eine Zuckerkette überträgt, dargestellt durch Galβ1-R, wobei Gal Galactose und R ein Kohlenhydrat, Lipid oder Glykokonjugat ist, und welche(s) ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus (a) einer Nucleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No.: 1 umfasst; (b) einer Nucleinsäuresequenz, umfassend die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID No.: 2; (c) einer Nucleinsäuresequenz, deren komplementärer Strang mit der Nucleinsäuresequenz aus (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert; und (d) einer Nucleinsäuresequenz, die durch die Degeneration des genetischen Codes verwandt ist mit der Nucleinsäuresequenz aus (c).
Rekombinante Nucleinsäuresequenz, umfassend das isolierte Gen oder die isolierte Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1.
Isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz, die komplementär zu dem isolierten oder rekombinanten Gen oder der isolierten oder rekombinanten Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 ist.
Isoliertes oder rekombinantes Gen oder isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welche DNA oder RNA ist.
Vektor, umfassend das isolierte oder rekombinante Gen oder die isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor nach Anspruch 5, welcher ein prokaryontischer oder eukaryontischer Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, in welche der Vektor nach Anspruch 5 oder 6 eingeführt ist und die vorzugsweise ein Mikroorganismus, eine tierische Zelle oder eine pflanzliche Zelle ist.
Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids, das durch das isolierte oder rekombinante Gen oder die isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, umfassend die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, welche zu einer Expression des Polypeptids führen, und die Gewinnung des Polypetids aus der Kultur.
Verwendung von vorzugsweise synthetischen Oligo- oder Polynucleotiden, welche spezifisch mit dem isolierten oder rekombinanten Gen oder der isolierten oder rekombinanten Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisieren, als eine Sonde oder Primer zum Nachweis des Gens oder der Nucleinsäuresequenz.
Arzneimittel, umfassend das isolierte oder rekombinante Gen oder die isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnostisches Kit, umfassend das isolierte oder rekombinante Gen oder die isolierte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verwendung des isolierten oder rekombinanten Gens oder der isolierten oder rekombinanten Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, und/oder des diagnostischen Kits nach Anspruch 11 zum Nachweis von Sulfotransferase-Expression in Zellen.
Verwendung der isolierten Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1 zur Hybridisierung mit einem Gen oder einer Nucleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4.