DE60112476T2

DE60112476T2 - Glucuronyl-c5-epimerase der maus, diese codierende dna und deren verwendung

Info

Publication number: DE60112476T2
Application number: DE60112476T
Authority: DE
Inventors: Markku Jalkanen; Kamel El Darwish; Ulf Lindahl; Jin-Ping Li
Original assignee: Biotie Therapies Corp
Current assignee: Biotie Therapies Corp
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2001-12-07
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-12-08
Also published as: HUP0500099A2; DE60112476D1; US20100261253A1; AU2002217174B2; ZA200304136B; WO2002046379A2; HUP0500099A3; SK8592003A3; SK286819B6; EE05296B1; US20020127696A1; ES2245707T3; CA2436728A1; EE200300265A; ATE301185T1; PT1379639E; US6887698B2; WO2002046379A3; JP2004515239A; EP1379639B1

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante Proteine und insbesondere Glucuronyl-C5-Epimerasen und ihre Verwendung zur Modifikation von Glucosaminoglycanen.
Hintergrund der Erfindung
Glucuronyl-C5-Epimerase (hier "C5-Epimerase") katalysiert die Umwandlung von D-Glucuronsäure (GIcA) in L-Iduronsäure (IdoA) im zweiten Schritt der Polymermodifikation der Heparin/Heparansulfat (HS)-Synthese. Die an der Heparin/HS-Synthese beteiligte Epimerase benötigt unbedingt N-Sulfat auf der nicht reduzierenden Seite der Ziel-HexA, deren Bildung im ersten (vorhergehenden) Schritt der biosynthetischen Polymermodifikation durch eine N-Deacetylase-N-sulfotransferase (NDST) katalysiert wird. Die Epimerase wird auch durch O-Sulfatgruppen in der Nähe des Wirkorts gehemmt, so dass spätere O-Sulfatierungsschritte in der Heparin-Biosynthese die Hin- oder Rückreaktion der Epimerisierung hemmen. Die Reaktion umfaßt reversibles Abspalten und erneutes Anfügen eines Protons am C5 der Ziel-Hexuronsäure, über ein Carbanionintermediat, und beinhaltet vermutlich zwei polyprotische basische Aminosäuren (insbes. Lys).
Die C5-Epimerase scheint, wie andere an der Heparin/HS-Biosynthese beteiligte Enzyme, membrangebunden oder mit dem Golgi assoziiert zu sein. Solubilisierte Epimerase katalysiert interessanterweise beide (reversiblen) Reaktionen, in Mikrosomenfraktionen ist jedoch keine Rückreaktion der Epimerisierung detektierbar. Das erstmals gereinigte und charakterisierte aktive C5-Epimeraseprotein stammte aus Leber (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)).
Campbell, P. et al beschrieben die Reinigung der D-Glucuronyl-C5-epimerase aus Rinderleber (Campbell et al., J. Biol. Chem. 269:26953-26958 (1994)), und es wurden auch verschiedene DNA-Sequenzen beschrieben. Während die vorhergesagte Größe der bovinen C5-Epimerase aus genomischen und cDNA-Sequenzen 70.1 kD (618 Aminosäuren) beträgt (unten diskutiert), enthielt das reinste native Präparat, das wie oben extrahiert worden war, überwiegend Spezies von 52 und 20 kDa, was darauf hinweist, dass eine proteolytische Spaltung (Prozessierung) stattgefunden haben könnte. Der Nachweis von Aktivität in Fraktionen mit höherem MW (200 kDa) aus Größenausschlußchromatographie zeigte, dass eine Aggregation oder Oligomerisierung auftreten kann. Das Enzym ist in einem breiten pH-Bereich (6,5-7,5) aktiv, wobei das Optimum bei 7,4 liegt. Das Enzym benötigt keine Metallionen oder andere Cofaktoren. Kinetische Untersuchungen haben überraschend gezeigt, dass K_m mit steigender Enzymkonzentration zunimmt, was möglicherweise auf Hinderung durch polymeres Substrat und sterische Hinderung und/oder auf Oligomerisierung der Epimerasemoleküle zurückzuführen ist.
Lindahl, U. und Li, J-P., WO98/48006 reinigten kürzlich die 52 kDa-C5-Epimerase aus Rinderleber und erhielten eine partielle Aminosäuresequenz. Es wurden Primer gegen eine innere Sequenz hergestellt und zur Amplifizierung einer Sequenz aus einer cDNA-Präparation der Rinderleber verwendet. Die Rinderlebersequenz wurde zum Screenen einer cDNA-Bank von Rinderlunge verwendet. Man fand eine Sequenz mit einem offenen Leserahmen mit 444 Aminosäuren, was einem Polypeptid von 49,9 kDa entspricht. Es wurde festgestellt, dass das Enzym, das zuvor aus Rinderleber isoliert worden war, eine trunkierte Form des nativen Proteins war. Gesamt-RNA aus Rinderleber, Rinderlunge und Mäusemastozytom wurde über Hybridisierung an den cDNA-Klon der Rinderlungenepimerase analysiert. Rinderleber und Rinderlunge ergaben die gleichen Ergebnisse, mit einem dominierenden Transkript von 9 kb und einer schwachen 5 kb-Bande. Die RNA aus dem Mäusemastozytom zeigte nur das Transkript bei etwa 5 kb.
Der Beschreibung der Klonierung einer für C5-Epimerase codierenden cDNA aus Rinderlunge erschien auch bei Li et al., J. Biol. Chem., 272:28158-28163 (1997). Li et al. klonierten und exprimierten die Rinderlungenepimerase in einem Baculovirus-/Insektenzellensystem, wodurch erstmals einer klonierten (rekombinanten) Sequenz Aktivität zugeordnet wurde. Das aktive rekombinante Protein wurde nicht für eine endgültige Zuordnung gereinigt.
C5-Epimerase-cDNA-Sequenzen aus Drosophila (GenBank-Zugangsnummer AAF57373), C. elegans (GenBank-Zugangsnummer P46555) und Methanococcus (GenBank-Zugangsnummer U67555) wurden beschrieben.
Die enzymatische Aktivität der rekombinanten bovinen Epimerase, die von Lindahl et al. beschrieben wurde, war relativ gering. Versuche, die C5-Epimerase aus Rinderlunge, die einzige klonierte Säugerepimerase, in Systemen zu exprimieren, die eine bessere Produktion liefern könnten, schlugen jedoch fehl. Man versuchte eine Expression in Säugerzellen, Saccharomyces cerevisiae und E. coli. Bis heute gibt es keine Berichte über die erfolgreiche Herstellung einer löslichen, aktiven C5-Epimerase. Es war daher nicht möglich, die frühen Ergebnisse des Baculovirus-Zellsystems auf andere rekombinante Systeme zu übertragen oder konventionelle Expressionsverfahren wie Säuger-, Hefe- und Bakteriensysteme zur Expression dieses Enzyms zu verwenden.
Es besteht daher auf diesem Gebiet Bedarf an einer hochaktiven C5-Epimerase und an Verfahren zur Herstellung größerer Mengen davon.
Zusammenfassung der Erfindung
Mit der Erkenntnis, dass bei der Expression rekombinanter Epimerasen aus Säugern Probleme unbestimmter Art bestehen und im Bewusstsein des Bedarfs an einem nützlichen Verfahren zur Expression und Herstellung brauchbarer Mengen der C5-Epimerase, haben die Erfinder Herstellungsverfahren für rekombinante C5-Epimerasen untersucht. Die Untersuchungen führten zur Entdeckung eines neuen Mausgens und des davon codierten murinen C5-Epimeraseproteins. Die murine C5-Epimerase der Erfindung ist unter anderem deshalb einzigartig, als sie im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Sequenzen des C5-Epimerase-Proteins zusätzliche Sequenzen an ihrem N-Terminus enthält. Man hat überraschend gefunden, dass die Fusion des N-terminalen Fragments der Maus-C5-Epimerase, oder verkürzter Versionen davon, mit dem N-Terminus anderer C5-Epimerasen die Aktivität dieser anderen rekombinanten C5-Epimerase um Größenordnungen steigert. Die Verlängerung des Maus-N-Terminus kann daher dazu verwendet werden, um die Expression von Sequenzen, die funktionsfähig damit verknüpft sind, und insbesondere die Expression nativer (Mäuseleber) und heterologer (sowohl nicht-muriner als auch muriner nicht-hepatischer) C5-Epimeraseformen in rekombinanten Systemen zu erleichtern.
In einer ersten Ausführungsform betrifft die Erfindung daher gereinigte und/oder isolierte Polynukleotide, die für eine murine oder Maus-C5-Epimerase aus der Leber codieren, und rekombinante Vektoren und Wirte zu deren Haltung und Expression.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein gereinigtes und/oder isoliertes Mäuseleber-C5-Epimeraseprotein, das von diesen Polynukleotiden codiert wird, oder Präparate, die dieses enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der murinen C5-Epimerase mit Hilfe solcher Polynukleotide und der rekombinanten Vektoren und Wirte der Erfindung zu deren Expression.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Polynukleotide, insbesondere gereinigte und/oder isolierte Polynukleotide, die für ein Fusionsprotein codieren, wobei dieses Fusionsprotein die N-terminale Sequenz der murinen C5-Epimerase enthält, die funktionsfähig im Leserahmen mit der Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins verknüpft ist, und insbesondere mit einer heterologen C5-Epimerasesequenz, und Vektoren und Wirte zur Haltung und Expression solcher Polynukleotide.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein gereinigtes und/oder isoliertes C5-Epimerase-Fusionsprotein, das von solchen Polynukleotiden codiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, indem man ein Polynukleotid, das für die murine C5-Epimerase oder ihre N-terminate Sequenz codiert, funktionsfähig mit einem Polynukleotid verknüpft, das für ein solches interessantes Protein codiert, und dieses in einem rekombinanten Wirt der Erfindung exprimiert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Polynukleotidsequenzen und Vektoren, die Polynukleotide vorsehen, die für das N-terminale Fragment der murinen C5-Epimerase codieren, wobei die Polynukleotide und Vektoren am 3'-Terminus des Fragments geeignete Restriktionsschnittstellen für die Insertion (Verknüpfung) einer gewünschten Sequenz aufweisen, insbesondere einer Sequenz, die für ein interessierendes Protein und ganz besonders für eine andere Epimerasesequenz codiert.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung der N-terminalen Sequenz von muriner C5-Epimerase zur Expression von nativen und heterologen Sequenzen, die damit verknüpft sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. DNA-Sequenz eines Fusionsproteins mit der Sequenz der bovinen C5-Epimerase (nicht fett) und dem N-Terminus der murinen C5-Epimerase (fett). Der offene Leserahmen (ORF), der die für das Polypeptid codierende Sequenz zeigt, ist unterstrichen.
2. Vollständige DNA-Sequenz von muriner C5-Epimerase.
3. Vollständige Aminosäuresequenz von muriner C5-Epimerase.
4. Alignment-Analyse von muriner C5-Epimerase mit anderen Sequenzen, die homologe Bereiche zeigen. Die Trefferquoten (Scores) sind in der obersten Zeile gezeigt und in der Spalte nach dem Ursprung der Sequenz angegeben. Die Sequenzen haben folgenden Ursprung: Zeile 2: Mäuseleber; Zeile 3: Rinderlunge; Zeile 4: humanes EST; Zeile 5: Drosophila; Zeile 6: C. elegans; Zeile 7: Methanococcus.
5. Schematische Darstellung der Domänenstruktur der murinen C5-Epimerase. Gefülltes Rechteck am N-Terminus: Signalsequenz (stark hydrophobe Transmembran (TM)-Sequenz); schraffierte Rechtecke: hydrophobe Transmembran (TM)- oder verborgene („buried") Sequenzen; volle Rechtecke im Peptid: konservierte Peptidsequenzen mit mehr als 50 % Ähnlichkeit zum hypothetischen 71,9 KD-Protein von C. elegans.
6A-6B. 6A: Schematische Darstellungen der Produkte der mit Tag versehenen rekombinanten (bovinen) C5-Epimerasekonstrukte. i: Erstes aktives, mit Tag versehenes rekombinantes (bovines) C5-Epimerasekonstrukt. Die spezifische Aktivität betrug 5 × 105cpm/mg/h. ii: Das aktivste rekombinante (vollständige murine) C5-Konstrukt. Die spezifische Aktivität betrug 2 × 10⁹ cpm/mg/h. iii: Chimäres Konstrukt mit murinen und bovinen Sequenzen. Die Aktivität lag bei 87 % der Aktivität der vollständig murinen Sequenz. iv: Trunkiertes murines Konstrukt. Die Aktivität war gleich der des bovinen Konstrukts bei "i". 6B: Sequenz- und Domäneninformationen des Tags, das jedem rekombinanten Konstrukt in 6A voransteht.
7. Ergebnisse des Aktivitätsassays der murinen C5-Epimerase (mC5).
8. Mit anti-FLAG angefärbter Western Blot. Spur 1: Molekulargewichtstandards (New England Biolabs' Broad Range, vorgefärbt). Spur 2: Probe von muriner C5-Epimerase (mC5).
9. Western Blot der Proteine im Medium aus stabilen Insektenzellinien von Klonen, die verschiedene mit Tag versehene rekombinante C5-Epimerasen enthalten, angefärbt mit anti-FLAG-Antikörper.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Es wurde ein Mäuselebergen, das für C5-Epimerase codiert, kloniert. Die Nukleotidsequenz ist in 2 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des Mäuseleber-C5-Epimeraseproteins ist 618 Aminosäuren lang (3) und das Molekulargewicht beträgt 71.180,1 Dalton (71,18 kDa). Die murine C5-Epimerase hat einen isoelektrischen Punkt von 8,25 und die Nettoladung bei pH 7 beträgt + 4,01.
Die Aminosäuresequenz der Mäuseleber-C5-Epimerasesequenz ohne N-terminale Erweiterung ist homolog (>96% Aminosäureidentität) zur bovinen C5-Epimerasesequenz. Eine Sequenzanalyse offenbarte jedoch, dass der N-Terminus des Enzyms, das von der murinen Genomsequenz codiert wird, 154 zusätzliche Aminosäuren (AS) enthielt, die bei der klonierten bovinen Sequenz "fehlten".
Die codierende murine Sequenz zeigte > 95 % Peptididentität mit den entsprechenden bovinen und humanen Sequenzen (Expressed Sequence Tags" aus einer Hirn-cDNA-Bank), > 50 % Ähnlichkeit mit einem hypothetischen 71,9 kDa-Protein aus einer exprimierten Sequenz von C. elegans und 38 % Ähnlichkeit mit einem Protein aus einer exprimierten Sequenz von Methanococcus sp.
Die vorhergesagte Transmembrantopologie (Hydrophobizitätsplot) des murinen C5-Epimeraseenzyms ähnelt der der NDST. Diese und andere Beobachtungen (z.B. Geschwindigkeit der Heparinsynthese) zeigten, dass die C5-Epimerase und andere Enzyme der Heparinbiosynthese in vivo wahrscheinlich in einem Komplex assoziiert sind.
Die rekombinante murine C5-Epimerase aus dem Baculovirus-Insektenzellensystem, wie sie mittels eines Insektenzellensignals exprimiert und sekretiert wird, ist in Medium bei 4 °C am stabilsten. Die Reinigung der rekombinanten C5-Epimerase kann Verfahren wie Kationenaustausch- oder Aftinitätschromatographie umfassen, beschränkt sich aber nicht darauf. Das rekombinante Protein kann zum Beispiel so konstruiert sein, dass das Protein ein FLAG-Tag oder His-Tag enthält, das an einem Ende des rekombinanten Proteins vorkommt. Wie ein Fachmann erkennt, kann das rekombinante Protein in solchen Fällen mit Hilfe kommerziell erhältlicher Harze gereinigt werden, bei denen zum Beispiel monoklonale anti-FLAG-Antikörper zum „Capture" des das FLAG-Epitop umfassenden rekombinanten Proteins verwendet werden.
Das Enzym wird am schnellsten durch Zweiphasenextraktion des vom C5-markierten Substrat in einen organischen Szintillationscocktail freigesetzten Tritiums und anschließende Zählung getestet, wenn auch die letztendliche Bestätigung der Aktivität, wie in den Beispielen beschrieben, durch NMR-Analyse des umgewandelten Produkts erfolgt.
Das native Mäuseleberenzym besitzt eine spezifische Aktivität von 5-10 × 10⁹ cpm/mg/h, während die spezifische Aktivität der rekombinanten Form des Mäuseenzyms etwa 2 × 10⁹ cpm/mg/h betrug. Im Vergleich dazu besitzt das rekombinante Rinderenzym eine spezifische Aktivität von etwa 0,5-1,0 × 10⁶ cpm/mg/h. Das rekombinante Mäuseenzym ist daher eine besonders aktive C5-Epimerase.
Es wurde unerwartet festgestellt, dass der 154 Aminosäuren (AS) lange N-Terminus der murinen C5-Epimerase, und besonders bestimmte Fragmente davon, die Fähigkeit besitzen, die C5-Epimerase-Enzymaktivität anderer C5-Epimerasen enorm verstärken zu können, wenn sie im Leserahmen mit deren N-Terminus fusioniert sind. Das zusätzliche 154 Aminosäuren (AS) lange Fragment scheint mindestens drei Merkmale zu besitzen, die für die rekombinante Expression und Sekretion einer aktiven C5-Epimerase erwünscht sind. Erstens beinhaltet es eine Sequenz ein, die vermutlich als Signalsequenz fungiert und die ersten 33-34 Reste (Aminosäuren 1-33 oder 1-34 von 3) umfaßt. Zweitens liefert es zusätzliche Cysteinreste, die für die Bildung von Disulfidbrücken und für die Stabilisierung der Sekundärproteinstruktur zugänglich sind. Drittens stellt es eine Amidierungsstelle bereit, die mit einer zur posttranslationalen proteolytischen Prozessierung geeigneten Stelle übereinstimmt.
Fragmente der 154 Aminosäuren langen Sequenz, denen die Signalsequenz fehlt, besitzen immer noch die Fähigkeit, die Aktivität von heterologen Epimerasen, und insbesondere von C5-Epimerasen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu steigern. Wie in den Beispielen gezeigt, erhöhte zum Beispiel ein Fusionsprotein, das die Aminosäuren 34-154 im Leserahmen direkt verknüpft mit dem N-Terminus der bovinen C5-Epimerase enthielt, die Aktivität der bovinen C5-Epimerase mehr als 100-fach.
Nukleinsäuremoleküle
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuremoleküle bereit, umfassend:

(1) ein Polynukleotid, das das Mäuseleber-C5-Epimerasepolypeptid mit der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz codiert;
(2) ein Polynukleotid, das geeignete Fragmente des Mäuseleber-C5-Epimerasepolypeptids mit der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz codiert, wobei solche geeigneten Fragmente, ohne darauf beschränkt zu sein, beinhalten: (a) Fragmente, die die Signalsequenz der Aminosäuren 1-33 oder 1-34 beinhalten; (b) Fragmente, die die reife Mäuseleber-C5-Epimeraseproteinsequenz und insbesondere die Aminosäuren 33-618 oder 34-618 bereitstellen, und (c) Fragmente, die die Sequenz des aktivitätsstimulierenden N-terminalen Fragments mit den Aminosäuren 1-154 bereitstellen, einschließlich Fragmente davon wie die Aminosäuren 33-154 oder 34-154, die die Fähigkeit besitzen, die Aktivität anderer C5-Epimerasen, mit denen sie funktionsfähig verknüpft sind, zu steigern.

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle hier durch Sequenzierung eines DNA-Moleküls bestimmten Nukleotidsequenzen wie in den Beispielen beschrieben bestimmt, und alle Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die von hier bestimmten DNA-Molekülen codiert werden, wurden durch Translation einer wie oben bestimmten DNA-Sequenz vorhergesagt. Wie für jede mit diesem Ansatz bestimmte DNA-Sequenz bekannt, kann daher jede hier bestimmte Nukleotidsequenz Fehler enthalten. Automatisisert bestimmte Nukleotidsequenzen sind üblicherweise wenigstens zu etwa 90 % identische, typischerweise wenigstens zu etwa 95 % bis wenigstens etwa 99,9 % identisch mit der tatsächlichen Nukleotidsequenz des sequenzierten DNA-Moleküls. Die tatsächliche Sequenz kann durch andere Ansätze, einschließlich manueller DNA-Sequenzierverfahren, die der Fachwelt allgemein bekannt sind, genauer bestimmt werden. Es ist der Fachwelt auch bekannt, dass eine einzelne Insertion oder Deletion in einer bestimmten Nukleotidsequenz, verglichen mit der tatsächlichen Sequenz, bei der Translation der Nukleotidsequenz ab einer solchen Insertions- oder Deletionsstelle zu einer Verschiebung des Leserahmens führen kann, so dass sich die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die von einer bestimmten Nukleotidsequenz codiert wird, vollständig von der Aminosäuresequenz unterscheidet, die tatsächlich von dem sequenzierten DNA-Molekül codiert wird.
Unter "Nukleotidsequenz" eines Nukleinsäuremoleküls oder Polynukleotids wird bei einem DNA-Molekül oder -Polynukleotid eine Sequenz von Desoxyribonukleotiden und bei einem RNA-Molekül oder -Polynukleotid die entsprechende Sequenz von Ribonukleotiden (A,G,C und U) verstanden, bei der jedes Thymidindesoxyribonukleotid (T) in der speziellen Desoxyribonukleotidsequenz gegen das Uridinribonukleotid (U) ausgetauscht ist.
Mit den hier zur Verfügung gestellten Informationen, wie zum Beispiel der in den Figuren und dem Sequenzprotokoll angegebenen Nukleotidsequenz, kann mit üblichen Klonierungs- und -Screeningverfahren, wie solchen zur Klonierung von cDNAs mit Hilfe von mRNA als Ausgangsmaterial, ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung erhalten werden, das ein C5-Epimerasepolypeptid codiert, oder ein chimäres Konstrukt davon. Veranschaulichend für die Erfindung wurde das C5-Epimerasenukleinsäuremolekül, das in den 2 und 3 beschrieben ist, in einer von murinem hepatischem Gewebe (Lebergewebe) stammenden cDNA-Bank gefunden.
Die bestimmte Nukleotidsequenz der C5-Epimerase-DNA von 2 enthält einen offenen Leserahmen, der für ein etwa 618 Aminosäurereste langes Protein mit einem Startcodon an Nukleotidposition 1 der Nukleotidsequenzen in 2 codiert.
Wie der Fachmann aufgrund der oben diskutierten Möglichkeit von Sequenzierfehlern erkennt, kann das tatsächliche vollständige C5-Epimerasepolypeptid, das von der Sequenz in 2, die wie in 3 gezeigt etwa 618 Aminosäuren umfasst, codiert wird, etwas länger oder kürzer sein. Auf jeden Fall stellt die Erfindung, wie weiter unten diskutiert, außerdem Polypeptide bereit, bei denen verschiedene Reste am N-Terminus oder C-Terminus des vollständigen Polypeptids deletiert sind, einschließlich Polypeptide, denen ein oder mehrere Aminosäuren am N-Terminus oder C-Terminus der hier beschriebenen extrazellulären Domäne fehlen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle beinhalten solche, die die C5-Epimerase-Signalsequenz, wie sie in 3 gezeigt ist, codieren, nämlich die Aminosäuren 1-33 oder die Aminosäuren 1-34 der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz. Solche Moleküle können im Leserahmen funktionsfähig mit jeder gewünschten Nukleotidsequenz verknüpft sein, insbesondere einer Sequenz, die für ein Protein von Interesse codiert, das von einem Wirt sekretiert werden soll, in dem die C5-Epimerase-Signalsequenz eine Sekretion bewirken kann.
Ferner beinhalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle solche, die für die "heterologe aktivitätsverstärkende" Sequenz der Mäuseleber-C5-Epimerase codieren, nämlich Aminosäuren 1-154 oder wenigstens 30 Aminosäuren davon, wie in 3 gezeigt. Was unter "heterologe" Nukleinsäure zu verstehen ist, ist einem Fachmann als von der Nukleinsäure einer unterschiedlichen Spezies abstammend allgemein bekannt. Vorzugsweise codieren solche Nukleinsäuremoleküle, wie in 3 gezeigt, für die Aminosäuren 1-154, 33-154 oder 34-154, plus oder minus 1,2,3,4,5,6,7,8,9 oder 10 Aminosäuren an einem oder beiden Enden. Eine Nukleinsäure, die für ein solches Polypeptid codiert, kann im Leserahmen funktionsfähig mit der codierenden Sequenz für eine andere Epimerase, insbesondere andere C5-Epimerasen, verknüpft sein, wodurch von dem Nukleinsäurekonstrukt ein Fusionsprotein codiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die heterologen aktivitätsverstärkenden Sequenzen am N-Terminus des Fusionsproteins exprimiert und sind mit dem N-Terminus eines anderen Proteins verknüpft, dessen Aktivität durch das Vorhandensein der Maussequenz gesteigert wird, ganz besonders einer nicht-murinen C5-Epimerase oder eines Isozyms der murinen C5-Epimerase.
Wie ausgeführt, können die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung in Form von RNA, wie mRNA, oder in Form von DNA, einschließlich zum Beispiel cDNA und genomischer DNA, die durch Klonierung oder synthetisch erhalten wurden, vorliegen. Die DNA kann doppel- oder einzelsträngig sein. Die einzelsträngige DNA oder RNA kann den codierenden Strang darstellen, auch als sense-Strang bekannt, oder sie kann den nicht-codierenden Strang darstellen, der auch als anti-sense-Strang bezeichnet wird.
Unter "isoliertem(n)" Nukleinsäuremolekül(en) wird ein Nukleinsäuremolekül, DNA oder RNA, verstanden, das(die) aus seiner (ihrer) natürlichen Umgebung entfernt wurde(n). Im Sinne der vorliegenden Erfindung gelten zum Beispiel in einem Vektor enthaltene rekombinante DNA-Moleküle als isoliert. Weitere Beispiele für isolierte DNA-Moleküle beinhalten rekombinante DNA-Moleküle, die in heterologen Wirtszellen gehalten werden, oder (teilweise oder im Wesentlichen) gereinigte DNA-Moleküle in Lösung. Isolierte RNA-Moleküle beinhalten in vivo- oder in vitro- RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle. Erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäuremoleküle beinhalten ferner solche synthetisch hergestellten Moleküle.
Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuremoleküle beinhalten DNA-Moleküle, die einen offenen Leserahmen (ORF) umfassen, der für ein erfindungsgemäßes C5-Epimeraseprotein oder Fusionsprotein codiert; DNA-Moleküle, die die codierende Sequenz für das C5-Epimeraseprotein, wie es in 2 gezeigt ist, oder ein gewünschtes Fragment davon umfassen; und DNA-Moleküle, die eine von den oben beschriebenen Sequenzen deutlich verschiedene Sequenz umfassen, die aber aufgrund der Degeneration des genetischen Codes immer noch für die Aminosäuresequenz des C5-Epimerase-Proteins codieren, wie sie in 3 gezeigt ist. Natürlich ist der genetische Code der Fachwelt allgemein bekannt. Es ist daher für einen Fachmann eine Routineaufgabe, solche degenerierte Varianten zu erzeugen. In einer weiteren Ausführungsform werden Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die wie oben für das C5-Epimerasepolypeptid codieren, denen aber das N-terminale Methionin fehlt oder die Signalsequenz, die von den Aminosäuren 1-33 oder 1-34, wie in 3 gezeigt, codiert ist, oder die funktionsfähig damit verknüpft die codierende Sequenz einer anderen (heterologen) Signalsequenz tragen.
Die Erfindung stellt ferner nicht nur die oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle bereit, sondern auch Nukleinsäuremoleküle, die zu den obigen Sequenzen komplementäre Sequenzen haben. Solche isolierten Moleküle, insbesondere DNA-Moleküle, eignen sich als Sonden für Genkartierungen, durch in situ Hybridisierung mit Chromosomen, und zum Nachweis der Expression des C5-Epimerasegens in verschiedenen Spezies und Geweben, zum Beispiel durch Northern Blot-Analyse.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Fragmente der hier beschriebenen isolierten Nukleinsäuremoleküle, die eine gewünschte Eigenschaft beibehalten oder die für ein Polypeptid codieren, das eine gewünschte Eigenschaft oder Aktivität beibehält. Unter einem Fragment eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, wie es oben beschrieben ist, werden Fragmente mit wenigstens etwa 15 Nukleotiden (nt), insbesondere wenigstens etwa 20 nt, vorzugsweise wenigstens etwa 30 nt und besonders bevorzugt wenigstens etwa 40 nt Länge verstanden, die sich, wie hier diskutiert, als diagnostische Sonden oder Primer eignen, oder ein gewünschtes Motiv oder gewünschte Domänen für ein Fusionsproteinkonstrukt liefern. Natürlich eignen sich auch größere Fragmente mit 50-300 nt oder sogar 600 nt Länge als erfindungsgemäße Fragmente, sowie Fragmente, die dem größten Teil, wenn nicht sogar der gesamten Nukleotidsequenzen der in 2 gezeigten oder die Aminosäuresequenz in 3 codierenden DNA entsprechen. Unter einem Fragment von beispielsweise wenigstens 20 nt Länge im Vergleich mit dem von 2 werden Fragmente verstanden, die 20 oder mehr benachbarte Basen aus der Nukleotidsequenz der in 2 gezeigten Nukleotidsequenz enthalten.
Die Erfindung stellt insbesondere Polynukleotide bereit, die eine Nukleotidsequenz besitzen, die den in 2 gezeigten Anteil darstellt oder die in 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Es kommen auch Polynukleotide in Betracht, die für C5-Epimerasepolypeptide codieren, denen ein aminoterminales Methionin fehlt. Es werden auch Polypeptide bereitgestellt, die von solchen Polynukleotiden codiert werden, wobei diese Polypeptide eine Aminosäuresequenz aus den Positionen 2 bis 618 der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz umfassen, ihnen aber ein aminoterminales Methionin fehlt.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das ein Polynukleotid umfaßt, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an einen Teil oder vorzugsweise das ganze Polynukleotid in einem wie oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül hybridisiert. Der Teil kann jeder gewünschte Teil sein, zum Beispiel das Polynukleotid von 2, das für die Aminosäuren 1-154 oder 33-154 oder 34-154 codiert. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" wird eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung verstanden, die 50 % Formamid, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml denaturierte, gescherte Lachssperma-DNA umfasst, gefolgt von Waschen der Filter in 0,1 × SSC bei etwa 65 °C.
Unter einem Polynukleotid, das an einen "Teil" eines Polynukleotids hybridisiert, wird ein Polynukleotid (entweder DNA oder RNA) verstanden, das an wenigstens etwa 15 Nukleotide (nt), besonders bevorzugt wenigstens etwa 20 nt, noch bevorzugter wenigstens etwa 30 nt und ganz besonders bevorzugt etwa 30-70 (z. B 50) nt des Referenzpolynukleotids hybridisiert. Sie eignen sich als diagnostische Sonden und Primer, wie oben bereits ausgeführt wurde und weiter unten noch ausführlicher diskutiert wird.
Unter einem Teil eines Polynukleotids von "wenigstens 20 nt Länge" werden zum Beispiel 20 oder mehr benachbarte Nukleotide aus der Nukleotidsequenz des Referenzpolynukleotids (z.B. der in 2 gezeigten Nukleotidsequenz) verstanden. Ein Polynukleotid, das nur an eine poly-A-Sequenz oder an einen komplementären Strang aus T (oder U)-Resten hybridisiert, wäre natürlich nicht von einem erfindungsgemäßen Polynukleotid umfasst, das zur Hybridisierung an einen Teil einer Nukleinsäure der Erfindung verwendet wird, da ein solches Polynukleotid an jedes Nukleinsäuremolekül hybridisieren würde, das einen poly(A)-Strang oder den dazu komplementären Strang enthält (d. h. praktisch jeden doppelsträngigen cDNA-Klon).
Wie angeführt können erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle, die für ein C5-Epimerasepolypeptid codieren, die codierende Sequenz für das Polypeptid an sich (auch reife C5-Epimerase genannt, wenn das Sekretionssignal fehlt); die codierende Sequenz für das Polypeptid und zusätzliche Sequenzen wie solche, die für eine Leader- oder sekretorische Sequenz, wie zum Beispiel eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz codieren; die codierende Sequenz für das Polypeptid, mit oder ohne die vorgenannten zusätzlichen codierenden Sequenzen, zusammen mit zusätzlichen, nicht-codierenden Sequenzen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise Introns und nicht-codierenden 5'- und 3'-Sequenzen, wie den transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die bei der Transkription, der mRNA-Prozessierung – einschließlich beispielsweise Spleiß- und Polyadenylierungssignalen – und bei der Ribosomenbindung und der mRNA-Stabilität eine Rolle spielen; einer zusätzlichen codierenden Sequenz, die für zusätzliche Aminosäuren codieren, wie solchen, die zusätzliche Funktionalitäten liefern; enthalten, sind aber nicht darauf beschränkt. Das Polypeptid kann also zum Beispiel mit einer Markersequenz, beispielsweise einem Peptid, fusioniert sein, das die Reinigung des fusionierten (den Marker enthaltenden) Polypeptids erleichtert.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein hexa-Histidinpeptid, wie das Tag, das u.a. in einem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) geliefert wird, von denen viele kommerziell erhältlich sind. Wie zum Beispiel bei Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989) beschrieben, ermöglicht beispielsweise hexa-Histidin eine bequeme Reinigung des Fusionsproteins. Das "HA"-Tag ist ein weiteres zur Reinigung geeignetes Peptid, das einem von Influenza-Hämagglutininprotein stammenden Epitop entspricht, das bei Wilson et al., Cell, 37:767-778 (1984) beschrieben wurde.
Polynukleotidvarianten und -mutanten
Die vorliegende Erfindung betrifft zudem Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die für Teile, Analoge oder Derivate der C5-Epimerase codieren. Varianten können natürlich vorkommen, beispielsweise als natürliche Allelvariante. Unter "Allelvariante" wird eine mehrerer alternativer Formen eines Gens bezeichnet, die einen gegebenen Lokus auf dem Chromosom eines Organismus besetzt. Genes II, Lewin, B., Hrsg, John Wiley & Sons, New York (1985). Nicht natürlich auftretende Varianten können mit Hilfe fachmännisch bekannter Mutagenesemethoden erzeugt werden.
Solche Varianten umfassen diejenigen, die durch Nukleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen gebildet werden. Die Substitutionen, Deletionen oder Additionen können ein oder mehrere Nukleotide betreffen. Die Varianten können in codierenden Regionen, nicht-codierenden Regionen oder beiden verändert sein. Änderungen in den codierenden Regionen können zu konservativen oder nicht-konservativen Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen führen. Stille Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten des C5-Epimerasepolypeptids oder Teilen davon nicht verändern, sind dabei besonders bevorzugt. In dieser Hinsicht sind auch konservative Substitutionen besonders bevorzugt.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 80 % identisch und vorzugsweise zu wenigstens 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Aminosäuren 1 bis 118 der 3; (b) den Aminosäuren 1 bis 119 der 3; (c) den Aminosäuren 1 bis 120 der 3; (d) den Aminosäuren 1 bis 121 der 3; (e) den Aminosäuren 119 bis 618 der 3; (f) den Aminosäuren 120 bis 618 der 3; (g) den Aminosäuren 121 bis 618 der 3; (h) den Aminosäuren 122 bis 618 der 3; (i) den Aminosäuren 34 bis 147 der 3; (j) den Aminosäuren 35 bis 154 der 3; (k) den Aminosäuren 34 bis 154 der 3; und (l) den Aminosäuren 1 bis 154 der 3; (m) der gesamten in 3 gezeigten Aminosäuresequenz.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen isolierte Nukleinsäuremoleküle ein, die ein Polynukleotid umfassen, das unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Polynukleotid der obigen (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n) hybridisiert. Das hybridisierende Polynukleotid hybridisiert unter stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht mit einem Polynukleotid mit einer nur aus A-Resten oder nur aus T-Resten bestehenden Nukleotidsequenz.
Unter einem Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die beispielsweise zu 95 % mit einer Referenznukleotidsequenz identisch ist, die für ein C5-Epimerasepolypeptid codiert, versteht man, dass die Nukleotidsequenz des Polynukleotids mit der Referenzsequenz identisch ist, außer dass die Polynukleotidsequenz bis zu fünf Punktmutationen pro jeweils 100 Nukleotiden der für das C5-Epimerasepolypeptid codierenden Referenznukleotidsequenz enthalten kann. Anders ausgedrückt, um ein Polynukleotid mit einer wenigstens zu 95 % mit einer Referenznukleotidsequenz identischen Nukleotidsequenz zu erhalten, können bis zu 5 % der Nukleotide in der Referenzsequenz deletiert oder durch andere Nukleotide substituiert werden, oder es können Nukleotide in einer Anzahl von bis zu 5% der gesamten Nukleotide der Referenzsequenz in die Referenzsequenz inseriert werden. Die Mutationen der Referenzsequenz können an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, und zwar entweder einzeln zwischen den Nukleotiden in der Referenzsequenz verstreut oder in Form ein oder mehrerer zusammenhängender Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül zu wenigstens 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % mit beispielsweise der in 2 gezeigten Nukleotidsequenz identisch ist, kann in der Praxis auf übliche Weise mit Hilfe bekannter Computerprogramme wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bestfit verwendet den Algorithmus der lokalen Homologie von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), um das Segment mit der besten Homologie zwischen zwei Sequenzen zu finden. Wenn Bestfit oder ein anderes Sequence- Alignment-Programm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel zu 95 % mit einer erfindungsgemäßen Referenzsequenz identisch ist, werden die Parameter natürlich so festgelegt, dass der Prozentsatz der Identität über die Gesamtlänge der Referenznukleotidsequenz berechnet wird und dass Lücken in der Homologie von bis zu 5 % der Gesamtzahl an Nukleotiden in der Referenzsequenz zugelassen werden.
Die vorliegende Anmeldung betrifft Nukleinsäuremoleküle, die zu wenigstens 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch mit einer in 2 gezeigten Nukleinsäuresequenz sind, unabhängig davon, ob diese für ein Polypeptid mit C5-Epimeraseaktivität codieren. Selbst wenn ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül kein Polypeptid mit C5-Epimeraseaktivität codieren würde, wüsste der Fachmann nämlich immer noch, wie man das Nukleinsäuremolekül beispielsweise als Hybridisierungssonde oder als Primer für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) verwenden könnte. Verwendungsmöglichkeiten für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, die nicht für ein Polypeptid mit C5-Epimeraseaktivität codieren, umfassen unter anderem: (1) Isolieren eines C5-Epimerasegens oder Allelvarianten davon aus einer cDNA-Bibliothek; (2) in situ Hybridisieren (z.B. "FISH") an Metaphase-Chromosomen-Spreads zur exakten Lokalisierung des C5-Epimerasegens auf den Chromosomen, wie bei Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) beschrieben; und Northern Blot-Analyse zum Nachweis von C5-Epimerase-mRNA-Expression in spezifischen Geweben.
Bevorzugt sind jedoch Nukleinsäuremoleküle mit Sequenzen, die zu wenigstens 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % mit einem in 2 gezeigten Nukleinsäuremolekül identisch sind, das tatsächlich ein Polypeptid mit C5-Epimeraseaktivität codiert. Unter "Polypeptid mit C5-Epimeraseaktivität" sind Polypeptide mit einer Aktivität zu verstehen, die ähnlich einer Aktivität der erfindungsgemäßen C5-Epimerase (entweder des vollständigen Proteins oder vorzugsweise des identifizierten Aminosäurefragments, das die Aminosäuren 33-618 oder 34-618 enthält), aber nicht notwendig identisch mit dieser ist, gemessen mit einem bestimmten biologischen Assay.
Natürlich weiß ein Fachmann aufgrund der Degeneration des genetischen Codes sofort, dass ein großer Teil der Nukleinsäuremoleküle mit einer zu wenigstens 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % mit einer Nukleinsäure einer hinterlegten cDNA oder mit der in 2 gezeigten Nukleinsäuresequenz identischen Sequenz für ein Polypeptid mit "C5-Epimeraseprotein-Aktivität" codiert. Da degenerierte Varianten dieser Nukleotidsequenzen alle das gleiche Polypeptid codieren, ist dies einem Fachmann natürlich auch ohne Durchführung des oben beschriebenen Vergleichsassays klar. Der Fachmann weiß ferner, dass auch von den Nukleinsäuremolekülen, die keine degenerierten Varianten darstellen, ein gewisser Anteil für ein Polypeptid mit C5-Epimeraseprotein-Aktivität codiert. Der Fachmann kennt nämlich die Aminosäuresubstitutionen, bei denen es weniger wahrscheinlich oder unwahrscheinlich ist, dass sie die Proteinfunktion wesentlich beeinträchtigen (z.B. Ersetzen einer aliphatischen Aminosäure durch eine zweite aliphatische Aminosäure), wie weiter unten beschrieben.
Vektoren und Wirtszellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, die die erfindungsgemäßen isolierten DNA-Moleküle enthalten, Wirtszellen, die gentechnisch mit den erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren manipuliert sind, und die Produktion von C5-Epimerasepolypeptiden oder Fragmenten davon mit Hilfe rekombinanter Methoden.
Die Polynukleotide können mit einem Vektor verknüpft werden, der einen selektierbaren Marker für die Vermehrung in einem Wirt enthält. Allgemein wird ein Plasmidvektor in ein Präzipitat, beispielsweise ein Calciumphosphatpräzipitat, oder in einen Komplex mit einem geladenen Lipid eingebracht. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann er in vitro mit einer geeigneten Verpackungszellinie verpackt und dann in Wirtszellen transduziert werden.
Das DNA-Insert sollte funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor, wie zum Beispiel dem PL-Promotor des Phagen Lambda, den lac-, trp- und tac-Promotoren von E.coli, den frühen und späten SV40-Promotoren und den Promotoren retroviraler LTRs, um nur einige zu nennen, verknüpft sein. Andere geeignete Promotoren sind einem Fachmann bekannt. Die Expressionskonstrukte sollten zudem Stellen für die Transkriptionsinitiation, die Transkriptionstermination und, in der transkribierten Region, eine Ribosomenbindungsstelle für die Translation enthalten. Der codierende Teil der von den Konstrukten exprimierten reifen Transkripte beinhaltet vorzugsweise einen Translationsinitiationscodon am Anfang und ein Stopcodon (UAA, UGA oder UAG), das sich in geeigneter Position am Ende des zu translatierenden Polypeptids befindet.
Wie angegeben enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise wenigstens einen selektierbaren Marker. Entsprechende Marker umfassen Gene für eine Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz bei eukaryontischen Zellkulturen und für eine Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz bei der Kultivierung in E. coli oder anderen Bakterien. Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterienzellen, wie E. coli-, Corynebacterium-, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen, wie Aspergillus, Aspergillus niger oder Trichoderma, oder Hefezellen wie Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae; Insektenzellen wie Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen, wie CHO, COS und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen. Bevorzugte Wirte umfassen Insektenzellen. Geeignete Kulturmedien und – bedingungen für die oben beschriebenen Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Zu den Vektoren, die für Bakterien bevorzugt sind, gehören pQE70, pQE60 und pQE-9, die bei Qiagen erhältlich sind; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, die bei Stratagene erhältlich sind; und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, die bei Pharmacia erhältlich sind. Zu den bevorzugten eukaryontischen Vektoren gehören pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, die bei Sratagene erhältlich sind; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, die bei Pharmacia erhältlich sind. Virale Vektoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, retrovirale Vektoren, Pockenvirus-Vektoren, einschließlich Vacciniavirus- und Adenovirus-Vektoren. Andere geeignete Vektoren sind für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Das Einschleusen des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, durch kationische Lipide vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Infektion oder andere Verfahren erfolgen. Entsprechende Verfahren sind in vielen Standard-Laborhandbüchern, wie beispielsweise Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986), beschrieben.
Polypeptide und Fragmente
Die Erfindung stellt zudem ein isoliertes oder gereinigtes C5-Epimerasepolypeptid mit den von der Aminosäuresequenz in 3 codierten Aminosäuresequenzen bereit, oder ein Peptid oder Polypeptid, das einen Teil des obigen Polypeptids, insbesondere wie es oben beschrieben und von einem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül codiert wird.
Die Erfindung stellt außerdem Fusionsproteine bereit, die einen funktionellen Teil des N-Terminus der murinen C5-Epimerase enthalten, der an seinem C-Terminus mit dem N-Terminus eines Proteins von Interesse fusioniert ist, wie zum Beispiel der Signalsequenz mit den Aminosäuren 1-33 oder 1-34, wie sie in 3 gezeigt sind, oder der die Aktivität verstärkenden Sequenz mit den Aminosäuren 1- 154, 33-154 oder 34-154, wie sie in 3 gezeigt sind. In einer Ausführungsform ist das Protein von Interesse mit einem Teil des N-Terminus fusioniert, der die 30-154 Aminosäuren des N-Terminus der murinen C5-Epimerase der 3 und insbesondere die Aminosäuren 33-154 oder 34-154 enthält. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Protein von Interesse mit einem funktionellen Teil des N-Terminus fusioniert, der die Reste 33-154 der in 3 gezeigten Sequenz enthält. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Protein von Interesse mit einem funktionellen Teil des N-Terminus fusioniert, der das Sekretionssignal mit den Aminosäuren 1-33 oder 1-34 enthält, die in der Sequenz der 3 gezeigt sind.
Das Polypeptid kann in einer modifizierten Form, zum Beispiel als Fusionsprotein, exprimiert werden und kann nicht nur Sekretionssignale sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen enthalten. Wie der Begriff "heterologes" Polypeptid zu verstehen ist, ist einem Fachmann als von unterschiedlichen Spezies stammend bekannt. So kann zum Beispiel eine Region zusätzlicher Aminosäuren, insbesondere geladener Aminosäuren, an den N-Terminus des Polypeptids angehängt werden, um die Stabilität und Persistenz in der Wirtszelle, bei der Reinigung oder bei der nachfolgenden Handhabung oder Aufbewahrung zu verbessern. Ferner können, um die Reinigung zu erleichtern, auch Peptideinheiten an das Polypeptid angehängt werden. Diese Regionen können vor der endgültigen Präparation des Polypeptids entfernt werden. Die Addition von Peptideinheiten an Polypeptide u.a. zur Sekretion oder Exkretion, zur Verbesserung der Stabilität und Erleichterung der Reinigung sind im Stand der Technik bekannte und routinemäßig verwendete Methoden.
Die C5-Epimerase oder das Fusionsprotein, das ein Fragment davon enthält, kann durch allgemein bekannte Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie aus rekombinanten Zellkulturen gewonnen und gereinigt werden.
Erfindungsgemäße Polypeptide umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die mit rekombinanten Techniken aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt, einschließlich beispielsweise Bakterienzellen, Hefezellen, höheren Pflanzenzellen, Insektenzellen und Säugerzellen, hergestellt wurden. Abhängig von dem bei einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendeten Wirt können die erfindungsgemäßen Polypeptide glykosyliert oder nicht glykosyliert sein. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Polypeptide am Start auch einen modifizierten Methioninrest enthalten, der in manchen Fällen das Resultat wirtsvermittelter Verfahren ist. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann auch eine Modifikation mit einem Histidin oder poly-Histidin umfassen, die für Proteinreinigungsverfahren an die Termini angehängt werden.
Die C5-Epimerasepolynukleotide und -polypeptide können erfindungsgemäß für zahlreiche Anwendungen eingesetzt werden, insbesondere solche, die sich die chemischen und biologischen Eigenschaften der C5-Epimerase zu Nutze machen. Insbesondere können die erfindungsgemäßen rekombinanten Epimerasen in größerem Maßstab zur Herstellung von Heparin und/oder Heparansulfat verwendet werden, die, als Antikoagulantien nützlich sind. Die erfindungsgemäßen Epimerasen können sich auch für Experimente eignen, um die Wirkung von extrazellulären Matrixmolekülen, wie Heparin und Heparansulfat, auf Prozesse wie Embryologie, Angiogenese und Tumorentwicklung zu untersuchen. Das Enzym kann zum Beispiel das Verhältnis D-Glucuronsäure-/L-Iduronsäurereste in Heparin oder Heparansulfat modulieren. Man vermutet, dass L-Iduronsäurereste aufgrund ihrer einzigartigen Konformationseigenschaften als Promotor für die Wechselwirkungen von Polysacchariden mit Proteinen wirken. Die erfindungsgemäßen Epimerasen können ferner verwendet werden, um industriell nützliche Zucker zu modifizieren, die als Stabilisator oder Geliermittel in manchen Lebensmitteln Verwendung finden.
Polypeptidvarianten und -mutanten
Die Eigenschaften eines C5-Epimerasepolypeptids lassen sich durch Protein-Engineering verbessern oder verändern. Die dem Fachmann bekannte rekombinante DNA-Technologie kann verwendet werden, um neuartiger mutierte Proteine oder "Muteine" zu erzeugen, die Einzel- oder Mehrfach-Aminosäuresubstitutionen, – deletionen, -additionen oder Fusionsproteine beinhalten. Solche modifizierten Polypeptide können beispielsweise verstärkte Aktivität oder bessere Stabilität aufweisen. Zudem können sie mit höheren Ausbeuten gereinigt werden und eine bessere Löslichkeit aufweisen, als das entsprechende natürliche Polypeptid, zumindest unter bestimmten Reinigungs- und Lagerungsbedingungen.
Mutanten mit N-terminalen und C-terminalen Deletionen
Von vielen Proteinen, einschließlich der extrazellulären Domäne eines membrangebundenen Proteins oder der reifen Form(en) eines sekretierten Proteins, ist beispielsweise im Stand der Technik bekannt, dass eine oder mehrere Aminosäuren am N-terminalen Ende oder am C-terminalen Ende ohne wesentlichen Verlust der biologischen Funktion deletiert sein können. Ron et al., J. Biol. Chem., 268:2984-2988 (1993) beschrieben zum Beispiel modifizierte KGF-Proteine, die noch eine Heparinbindungsaktivität besaßen, selbst wenn 3, 8 oder 27 aminoterminale Aminosäurereste fehlten.
Doch selbst wenn die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren am N-Terminus eines Proteins zur Modifikation oder zum Verlust einer oder mehrerer biologischer Funktionen des Proteins führt, können andere biologische Aktivitäten erhalten bleiben. So bleibt die Fähigkeit des verkürzten Proteins, Antikörper zu induzieren und/oder zu binden, die das ganze C5-Epimeraseprotein oder einen Teil davon erkennen, im allgemeinen erhalten, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des ganzen Proteins oder der extrazellulären Domäne am N-terminalen Ende entfernt werden. Ob bei einem bestimmten Polypeptid, dem N-terminate Reste eines ganzen Proteins fehlen, noch immunologische Aktivitäten erhalten sind, kann leicht mit den hier beschriebenen und ansonsten im Stand der Technik bekannten Routinemethoden bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend ferner Polypeptide bereit, bei denen einer oder mehrere Reste vom aminoterminalen Ende der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz deletiert sind.
Selbst wenn die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren vom am C-Terminus eines Proteins zur Modifikation oder zum Verlust einer oder mehrerer biologischer Funktionen des Proteins führt, können jedoch andere biologische Aktivitäten erhalten bleiben. So bleibt die Fähigkeit des verkürzten Proteins, Antikörper, die das ganze oder die reife Form des Proteins zu induzieren und/oder zu binden, im allgemeinen erhalten, wenn weniger als die Mehrheit der Reste des ganzen Proteins oder der reifen Form des Proteins vom C-terminalen Ende entfernt werden. Ob bei einem bestimmten Polypeptid, dem C-terminale Reste eines ganzen Proteins fehlen, noch immunologische Aktivitäten erhalten sind, kann leicht mit den hier beschriebenen und ansonsten im Stand der Technik bekannten Routinemethoden bestimmt werden.
Die Erfindung stellt auch Polypeptide bereit, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren sowohl am amino- als auch am carboxyterminalen Ende deletiert sind.
Andere Mutanten
Zusätzlich zu den oben diskutierten terminalen Deletionsformen des Proteins erkennt der Fachmann auch, dass einige Aminosäuresequenzen des C5-Epimerasepolypeptids ohne signifikante Auswirkungen auf die Struktur oder Funktion des Proteins variiert werden können. Wenn entsprechende Sequenzunterschiede in Betracht gezogen werden, sollte man sich daran erinnern, dass es im Protein kritische Bereiche gibt, die die Aktivität bestimmen. Daher umfasst die Erfindung außerdem Variationen des C5-Epimerasepolypeptids, die eine deutliche Aktivität des C5-Epimerasepolypeptids aufweisen oder die Regionen des C5-Epimeraseproteins einschließen, wie die weiter unten diskutierten Proteinteile. Solche Mutanten umfassen Deletionen, Insertionen, Inversionen, Wiederholungen und Typ-Substitutionen. Hinweise dazu, welche Aminosäureänderungen wahrscheinlich phänotypisch still sind, lassen sich bei Bowie, J.U. et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990) finden.
Daher kann das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids der 3 oder das Fusionsprotein, das dieses enthält: (i) eines sein, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste gegen einen konservierten oder nichtkonservierten Aminosäurerest (vorzugsweise (ein) konservierter) Aminosäurerest(e) und besonders bevorzugt wenigstens ein aber weniger als zehn konservierter) Aminosäurerest(e)) substituiert sind und solche substituierten Aminosäurereste können vom genetischen Code codiert oder nicht codiert sein; oder (ii) eines sein, bei dem ein oder mehrere Aminosäurereste eine Substituentengruppe aufweisen; oder (iii) eines sein, bei dem das reife oder lösliche extrazelluläre Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, beispielsweise einer Verbindung, die die Halbwertszeit des Polypeptids erhöht (zum Beispiel Polyethylenglycol); oder (iv) eines sein, bei dem die zusätzlichen Aminosäuren mit einer Leader- oder sekretorischen Sequenz oder einer Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids eingesetzt wird, oder einer Pro-Proteinsequenz, fusioniert sind. Diese Fragmente, Derivate und Analoge ergeben sich für den Fachmann aufgrund der hier gegebenen technischen Lehre.
Die erfindungsgemäße C5-Epimerase kann daher ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen enthalten, entweder als Folge natürlicher Mutationen oder aufgrund menschlicher Manipulation. Wie bereits angegeben sind die Änderungen vorzugsweise geringfügiger Art, wie beispielsweise konservative Aminosäuresubstitutionen, die die Faltung oder die Aktivität des Proteins nicht signifikant beeinträchtigen (siehe Tabelle 1).
TABELLE 1. Konservative Aminosäuresubstitutionen
Die Aminosäuren in dem erfindungsgemäßen C5-Epimeraseprotein, die für die Funktion essentiell sind, können mit Hilfe im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie ortsspezifischer Mutagenese oder Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244:1081-1085 (1989)) bestimmt werden. Das letztere Verfahren führt an jedem Rest im Molekül einzelne Alaninmutationen ein. Die resultierende mutierten Moleküle werden dann auf ihre biologische Aktivität, wie Rezeptorbindung oder in vitro-Proliferationsaktivität, getestet.
Von besonderem Interesse sind Substitutionen von geladenen Aminosäuren durch andere geladene Aminosäuren und neutrale oder negativ geladene Aminosäuren. Letzteres führt zu Proteinen mit reduzierter positiver Ladung, um die Eigenschaften des C5-Epimeraseproteins zu verbessern. Das Verhindern von Aggregatbildungen ist äußerst wünschenswert. Proteinaggregationen führen nicht nur zu Aktivitätsverlust, sondern können auch bei der Herstellung pharmazeutischer Formulierungen problematisch sein, da sie immunogen sein können (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carner Systems 10:307-377 (1993)).
Der Austausch von Aminosäuren kann auch die Bindungsselektivität eines Liganden an Zelloberflächenrezeptoren verändern. Ostade et al., Nature 361:266-268 (1993) beschreiben beispielsweise bestimmte Mutationen, die zur selektiven Bindung von TNF-α an nur einen der zwei bekannten TNF-Rezeptortypen führen. Stellen, die für eine Liganden-Rezeptor-Bindung kritisch sind, können auch durch Strukturanalyse wie Kristallisation, Kernresonanz oder Photoaffinitätsmarkierung bestimmt werden (Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) und de Vos et al., Science 255:306-312 (1992)).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden vorzugsweise in isolierter Form bereitgestellt. Unter "isoliertem Polpeptid" wird ein Polypeptid verstanden, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Das in einer rekombinanten Wirtszelle produzierte und/oder in ihr enthaltene Polypeptid gilt im Sinne der Erfindung als isoliert. Unter "isoliertem Polypeptid" sind auch Polypeptide zu verstehen, die teilweise oder im Wesentlichen aus einer rekombinanten Wirtszelle gereinigt wurden. Eine rekombinant hergestellte Form des C5-Epimerasepolypeptids kann zum Beispiel im Wesentlichen mit dem bei Smith und Johnson, Gene 67:31-40 (1988) beschriebenen einstufigen Verfahren gereinigt werden. Das erfindungsgemäße Protein wird vorzugsweise in einem zur Sequenzanalyse ausreichenden Grad gereinigt oder so, dass es 99 % des proteinhaltigen Materials im Präparat darstellt.
Die Erfinder haben das murine C5-Epimerasegen und -protein gefunden und haben festgestellt, dass das C5-Epimerasepolypeptid ein aus 618 Resten bestehendes Protein ist, das eine N-terminale Domäne mit 154 Aminosäuren und insbesondere eine Domäne mit 33 oder 34 Aminosäuren aufweist, die die Aminosäuren 1-33 oder 1-34 enthält und die an der Sekretion und Stabilisation von Aminosäuresequenzen beteiligt ist, die mit ihr verknüpft sind. Diese Domäne, oder ein funktioneller Teil davon, eignet sich dementsprechend zur Expression und Sekretion von Proteinen wie der C5-Epimerase oder einem anderen Protein, insbesondere einem Protein, das mit dem Golgi-Apparat assoziiert oder auf andere Weise mit der Heparin- oder Heparansulfatsynthese zusammenhängt.
Die Erfinder haben auch gefunden, dass der N-Terminus des murinen C5-Epimeraseproteins, und insbesondere die Aminosäuren 1-154, 33-154 oder 34-154, besonders geeignet sind, um die Aktivität anderer Enzyme, insbesondere anderer C5-Epimerasen, zu verstärken. Diese Domäne, oder eine funktioneller Teil davon, eignet sich dementsprechend zur Expression und Sekretion von Fusionsproteinen, die C5-Epimerasesequenzen beinhalten, die zu der in 3 gezeigten, insbesondere der bovinen C5-Epimerase, heterolog sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, wie oben diskutiert, das C5-Epimerasepolypeptid und Fragmente davon, deren Aminosäuresequenz zu wenigstens 80 % mit einer Sequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Aminosäuren 1 bis 118 der 3; (b) den Aminosäuren 1 bis 119 der 3; (c) den Aminosäuren 1 bis 120 der 3; (d) den Aminosäuren 1 bis 121 der 3; (e) den Aminosäuren 119 bis 618 der 3; (f) den Aminosäuren 120 bis 618 der 3; (g) den Aminosäuren 121 bis 618 der 3; (h) den Aminosäuren 122 bis 618 der 3; (i) den Aminosäuren 34 bis 147 der 3; (j) den Aminosäuren 35 bis 154 der 3; (k) den Aminosäuren 34 bis 154 der 3; (l) den Aminosäuren 1 bis 154 der 3; und (m) der vollständigen in 3 gezeigten Aminosäuresequenz.
Die Erfindung umfasst Polypeptide, die zu wenigstens 80 %, vorzugsweise zu wenigstens 90 % oder 95 %, und besonders bevorzugt zu wenigstens 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % identisch mit den oben beschriebenen Polypeptiden sind, und umfasst auch Teile solcher Polypeptide mit wenigstens 30 Aminosäuren und besonders bevorzugt wenigstens 50 Aminosäuren Länge.
Unter einem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die beispielsweise zu wenigstens 95 % mit einer Referenzaminosäuresequenz eines C5-Epimerasepolypeptids „identisch" ist, versteht man, dass die Aminosäuresequenz des Polypeptids mit der Referenzsequenz identisch ist, außer dass die Polypeptidsequenz pro jeweils 100 Aminosäuren der Referenzaminosäuresequenz des C5-Epimerasepolypeptids bis zu fünf Aminosäureänderungen enthalten kann. Anders ausgedrückt, um ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz zu erhalten, die zu wenigstens 95 % mit einer Referenzaminosäuresequenz identisch ist, können bis zu 5 % der Aminosäurereste der Referenzsequenz deletiert oder durch andere Aminosäuren substituiert werden, oder es können Aminosäuren in einer Anzahl von bis zu 5 % der gesamten Aminosäurereste der Referenzsequenz in die Referenzsequenz inseriert werden. Diese Änderungen der Referenzsequenz können an den amino- oder carboxyterminalen Positionen der Referenzaminosäuresequenz oder irgendwo zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen, und zwar entweder einzeln zwischen den Resten in der Referenzsequenz verstreut oder in Form ein oder mehrerer zusammenhängender Gruppen innerhalb der Referenzsequenz.
Ob ein bestimmtes Polypeptid zu wenigstens 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % mit beispielsweise der in 3 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist, kann in der Praxis auf übliche Weise mit Hilfe bekannter Computerprogramme wie dem Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) bestimmt werden. Wenn Bestfit oder ein anderes Sequence-Alignment-Programm verwendet wird, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz zum Beispiel zu 95 % mit einer erfindungsgemäßen Referenzsequenz identisch ist, werden die Parameter natürlich so festgelegt, dass der Prozentsatz der Identität über die Gesamtlänge der Referenzaminosäuresequenz berechnet wird und dass Lücken in der Homologie von bis zu 5 % der Gesamtzahl an Aminosäuren in der Referenzsequenz zugelassen werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide mit C5-Epimeraseaktivität können dazu verwendet werden, um diese in vitro bereitzustellen, beispielsweise bei der Entwicklung von Assays für diese oder bei der Standardisierung von Assays zur Verwendung mit komplexeren Systemen. Die erfindungsgemäße Signalsequenz kann verwendet werden, um das homologe C5-Epimeraseenzym aus eukaryontischen rekombinanten Wirten zu sezernieren, oder um heterologe Sequenzen, die funktionsfähig mit ihr verknüpft sind, zu sezernieren. Die erfindungsgemäße aktivitätsverstärkende Sequenz kann verwendet werden, um die inhärente Epimeraseaktivität rekombinanter Präparate anderer C5-Epimerasen zu steigern, und wird als solche am besten in Form eines Gens vorgesehen, das ein Fusionsprotein für diese codiert.
Antikörper
Spezifische Antikörper gegen das C5-Epimeraseprotein zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können gegen intakte C5-Epimeraseproteine oder gegen ein antigenes Polypeptidfragment davon gebildet werden, die einem Tiersystem (wie Kaninchen oder Maus) zusammen mit einem Trägerprotein, wie beispielsweise einem Albumin, oder bei genügender Länge (wenigstens etwa 25 Aminosäuren) ohne einen Träger, oder in Liposomen oder mit PEG komplexiert angeboten werden, um die Halbwertszeit im Blut zu verlängern.
Der Begriff "Antikörper" (Ab) oder "monoklonaler Antikörper" (Mab), wie er hier verwendet wird, soll intakte Moleküle sowie Antikörperfragmente (wie zum Beispiel Fab- und F(ab')₂-Fragmente) umfassen, die in der Lage sind, spezifisch an ein C5-Epimeraseprotein zu binden. Fab- und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden schneller aus dem Blutkreislauf entfernt und können weniger unspezifische Gewebe Bindung an Gewebe aufweisen als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Aus diesem Grund sind diese Fragmente bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Um die Produktion von Seren zu induzieren, die polyklonale Antikörper enthalten, können einem Tier beispielsweise Zellen appliziert werden, die das C5-Epimeraseprotein oder ein antigenes Fragment davon exprimieren. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Präparat des C5-Epimeraseproteins hergestellt und gereinigt, um natürliche Verunreinigungen im Wesentlichen zu entfernen. Ein derartiges Präparat wird dann zur Herstellung polyklonaler Antiseren mit höherer spezifischer Aktivität in ein Tier eingebracht.
In einem ganz besonders bevorzugten Verfahren sind die erfindungsgemäßen Antikörper monoklonale Antikörper. Solche monoklonalen Antikörper können mit der Hybridomtechnik hergestellt werden (Köhler et al., Nature, 256:495 (1975); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. (1981) S.563-681). Im Allgemeinen umfasst ein solches Vorgehen das Immunisieren eines Tieres (vorzugsweise einer Maus) mit einem C5-Epimeraseproteinantigen oder, besonders bevorzugt, mit einer Zelle, die das C5-Epimeraseprotein exprimiert. Geeignete Zellen können aufgrund ihrer Fähigkeit erkannt werden, Anti-C5-Epimeraseprotein-Antikörper zu binden. Solche Zellen können in jedem geeigneten Gewebekulturmedium kultiviert werden; bevorzugt werden die Zellen jedoch in Earle's modifiziertem Eagle-Medium kultiviert, das mit 10 % fötalem Rinderserum (bei etwa 56°C inaktiviert) supplementiert und mit 10 g/l nicht essentiellen Aminosäuren, etwa 1.000 U/ml Penicillin und etwa 100 μg/ml Streptomycin supplementiert ist. Die Splenocyten solcher Mäuse werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzellinie fusioniert. Erfindungsgemäß kann jede geeignete Myelomzellinie verwendet werden; bevorzugt wird jedoch die Myelomstammzellinie (SP20) eingesetzt, die bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhältlich ist. Nach der Fusionierung werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten und dann durch eine limitierende Verdünnung kloniert, wie bei Wands et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981) beschrieben. Die durch eine solche Selektion erhaltenen Hybridomzellen werden dann getestet, um Klone zu identifizieren, die Antikörper sekretieren, die in der Lage sind, das gewünschte C5-Epimeraseantigen zu binden.
Alternativ können zusätzliche Antikörper, die in der Lage sind, das C5-Epimerasegen zu binden, in einem zweistufigen Verfahren durch die Verwendung von anti-idiotypischen Antikörpern hergestellt werden. Ein solches Verfahren nutzt die Tatsache, dass Antikörper selbst Antigene sind, und es daher möglich ist, einen Antikörper zu erhalten, der an einen zweiten Antikörper bindet. Gemäß diesem Verfahren werden spezifische Antikörper gegen das C5-Epimeraseprotein dazu verwendet, ein Tier, vorzugsweise eine Maus, zu immunisieren. Die Splenocyten eines solchen Tieres werden dann zur Produktion von Hybridomzellen verwendet, und die Hybridomzellen werden gescreent, um Klone zu identifizieren, die einen Antikörper produzieren, dessen Fähigkeit, an den für das C5-Epimeraseprotein spezifischen Antikörper zu binden, durch das C5-Epimeraseprotein-Antigen blockiert werden kann. Solche Antikörper umfassen anti-idiotypische Antikörper gegen den für das C5-Epimeraseprotein spezifischen Antikörper und können zur Immunisierung eines Tieres verwendet werden, um die Bildung weiterer für das C5-Epimeraseprotein spezifischer Antikörper zu induzieren.
Es versteht sich, dass Fab- und F(ab')₂-Fragmente und andere Fragmente der erfindungsgemäßen Antikörper entsprechend den hier offenbarten Verfahren verwendet werden können. Solche Fragmente werden üblicherweise durch proteolytische Spaltung mit Enzymen wie Papain (zur Bildung von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Bildung von F(ab')₂-Fragmenten) hergestellt. Einzelkettenantikörper, wie Antikörper mit leichter oder schwerer Kette, werden ebenfalls von der Erfindung umfasst. Alternativ können an das C5-Epimeraseprotein bindende Fragmente mittels rekombinanter DNA-Technologie oder durch synthetische Chemie hergestellt werden. Entsprechende Antikörper würden, ohne darauf beschränkt zu sein, rekombinante Antikörper beinhalten, die komplementaritätsbestimmende Regionen („Complementary Determining Regions (CDRs)) umfassen, die unterschiedliche Bindungsspezifitäten besitzen, oder CDRs, die mittels rekombinanter DNA-Technologie oder durch synthetische Chemie modifiziert wurden, um die Bindungsspezifität der Antikörper zu modifizieren.
Zur in vivo-Verwendung einer Anti-C5-Epimerase-Antikörpern bei Menschen werden vorzugsweise "humanisierte" chimäre monoklonale Antikörper verwendet. Entsprechende Antikörper können mit genetischen Konstrukten hergestellt werden, die von Hybridomzellen stammen, welche die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper produzieren. Verfahren zur Herstellung chimärer Antikörper sind im Stand der Technik bekannt. Für eine Übersicht, siehe Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., U.S.-Patent Nr. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496 ; Morrison et al., EP 173494 ; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985).
Bifunktionelle Antikörper sind Antikörper, die antigenbindende Domänen für verschiedene Epitope besitzen oder von verschiedenen Spezies stammen, und werden von der Erfindung umfasst. Antikörper mit Fc-Regionen, die von sich in den Fab-Regionen unterscheidenden Spezies stammen, kommen ebenfalls in Betracht und können in immunspezifischen Chromatographieverfahren verwendet werden. Von der Erfindung werden auch Antikörper mit angehängten Markern, wie Fluorescein, Texas Red, Rhodamin, Peroxidase, Gold, magnetische Marker, alkalische Phosphatase, Radioisotope oder chemilumineszierende Marker, umfasst.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung soll nun mit Hilfe der folgenden Beispiele, die nur zur Illustration dienen und keinesfalls einschränkend gedacht sind, ein besseres Verständnis vermittelt werden.
Beispiele
Beispiel 1
Isolierung und Sequenzierung muriner genomischer Klone
Eine murine Genombibliothek (FIX II, Stratagene) wurde mit einer DNA-Sonde aus einer bovinen, für die C5-Epimerase codierenden Sequenz gescreent. Die Sonde wurde mit [α³²P]dCTP (NEN Life Science Products) markiert. Etwa 2 × 106 Phagen wurden auf einer 20 × 20 cm-Platte ausplattiert und von jeder Platte wurden doppelte Nylonfilter erstellt. Das Screening unter hoher Stringenz erfolgte durch Hybridisierung in 5 × Denhardts mit 100 μg Lachssperma-DNA/ml bei 60°C. Das abschließende Waschen erfolgte in 0,1 × SSC (1 × SSC entspricht 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0, mit 0,1 % SDS). Die Plaques, die auf beiden Replika positive Signale lieferten, wurden für einen zweiten und dritten Screeningdurchgang selektiert und schließlich wurden fünf positive Klone isoliert. Es stellte sich heraus, dass zwei der Klone eine ähnliche Länge von etwa 16 kb besaßen, während die anderen drei im Vergleich kürzer waren, nämlich etwa 10 – 12 kb. Der längste Klon (Klon 64) wurde mit Sac I verdaut, und die Restriktionsfragmente wurden in pBlueScript kloniert. Der zweitlängste Klon (Klon 5 A) wurde mit EcoR I verdaut und die resultierenden Fragmente wurden zur weiteren Charakterisierung in pUC119 kloniert.
Das Plasmid, das das Insert enthielt, wurde mit dem QIAGEN Plasmid-Kit gereinigt und sequenziert. Die Nukleotidsequenzierung erfolgte mit der Methode der Didesoxy-Kettentermination und wurde mit einem ABI 310-Sequenzierer durchgeführt. Die Exons und Introns wurden durch Primer Walking auf beiden Strängen bestimmt, und die Größe der Introns wurde durch die Sequenzierung in Kombination mit Agarosegelelektrophorese abgeschätzt. Es scheint nur 3 Exons zu geben, die für die C5-Epimerase codieren, wobei das längste Exon für mehr als 50 % des Proteins codiert. Die Exon-Intron-Verbindungen (Spleißstellen) folgen exakt der gt-ag-Konsensus-Regel. Aufgrund der Anwesenheit der Introns und dem genauen Passen der Exons und der cDNA-Sequenz nehmen wir an, dass der identifizierte genomische Klon das funktionelle Gen für die C5-Epimerase darstellt.
Klonierung der murinen C5-Epimerase-cDNA
Auf Basis der durch die Sequenzierung der Exons des genomischen Klons erhaltenen Nukleotidsequenz wurde ein Primerpaar konstruiert. Der sense-Primer entspricht den bp 1-26 des murinen ORF, beginnend mit dem Startcodon ATG. Der Anti-sense-Primer entspricht den bp 1829-1854 ohne das Stopcodon. PCR erfolgte mit einer Mäuseleber-QUICK-Clone^TM-cDNA (Clontech) als Templat unter den Bedingungen: 1 Zyklus bei 94°C für 1 min, 30 Zyklen jeweils bei 94 °C für 30 s, bei 60 °C für 45 s und bei 72 °C für 1 min, und einer abschließenden Extension bei 72 °C für 10 min. Man erhielt eine starke Bande von etwa 2 kb, die in einen TOPO^TM-TA-Klonierungsvektor (Invitrogen) kloniert, amplifiziert und anschließend sequenziert wurde. Durch Doppelstrangsequenzierung wurde gefunden, dass der murine C5-Epimerase-Klon 1875 bp lang ist, mit einer stark hydrophoben Domäne am N-Terminus des abgeleiteten Peptids.
Northern Blot-Analyse
Der murine Multi-Tissue-mRNA-Blot wurde von Clontech gekauft. Die DNA-Sonde aus dem bovinen cDNA-Klon wurde mittels Klenow-Enzym von Boehringer Mannheim mit [α³²P]dCTP markiert. Die Hybridisierung erfolgte bei 60°C eine Stunde in ExpressHyb (Clontech) und es wurde unter hoher Stringenz gewaschen. Die Membran wurde über Nacht bei –70°C mit Kodakfilm exponiert. Das C5-Epimeraseenzym wird in allen untersuchten Geweben exprimiert, und das Transkript ist etwa 5 kb lang. Es scheint, dass die Leber die höchste Expression für das Transkript aufweist, während die Milz eine relativ geringe Menge im Vergleich mit β-Aktin in der gleichen Membran exprimiert.
Southern Blot-Analyse
Southern Blot-Analyse erfolgte gemäß Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989). Mäusegenom-DNA wurde mit einem Easy Prep-Kit (Pharmacia Biotech) präpariert. 20 μg genomische DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Sac I verdaut und auf einem 0,8%igen Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 min lang mit 0,1 N NaOH behandelt und in Tris-HCl-Puffer neutralisiert. Die DNA-Fragmente wurden auf eine Nylonmembran transferiert. Ein 837 bp-Fragment der bovinen C5-Epimerase-cDNA wurde mittels Klenow-Enzym von Boehringer Mannheim mit [α³²P]dCTP markiert und als Sonde verwendet. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie bei der Northern-Analyse beschrieben. Die Expositionszeit betrug drei Tage.
Um zu bestimmen, wie viele Gene möglicherweise für die C5-Epimerase codieren, wurden 20 Mikrogramm der aus Mäuseleber gereinigten Mäusegenom-DNA mit den Restriktionsenzymen Apa I, BamH I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Nco I bzw. Xba I verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die im Gel aufgetrennte DNA wurde auf eine Nylonmembran transferiert und anschließend mit einer DNA-Sonde aus der kodierenden bovinen Sequenz (1407 bp) hybridisiert. Die Restriktionskarte der genomischen C5-Epimerase-DNA legt nahe, dass es nur ein Gen gibt, das für das C5-Epimeraseenzym in Mäusen codiert.
Test der Enzymaktivität
Die Aktivität der C5-Epimerase wurde gemäß der bei Malström et al., J. Biol. Chem. 255:3878-3883 (1980) offenbarten Vorschrift, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird, bestimmt. Kurz gesagt wurde eine Maus, der intramuskulär Mastocytomzellen transplantiert worden waren, durch Genickbruch getötet und anschließend seziert. Die jeweiligen Gewebe, einschließlich des Xenotransplantats, wurden entnommen und unmittelbar danach in einem 50 mM HEPES- Puffer, der 100 mM KCl, 15 mM EDTA, 1 % Triton X-100 und Proteaseinhibitoren enthielt, homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 4°C 30 min lang geschüttelt und zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit dem QuantiGold-Assay bestimmt, und die spezifische Aktivität der C5-Epimerase wurde auf Basis der Freisetzung von ³H (wiedergewonnen als ³H₂O) aus einem Substratpolysaccharid gemäß der bei Li et al. (Li et al., 1997) beschriebenen Verfahrensweise analysiert. Das bei dem Test auf spezifische Aktivität verwendete C5-Substrat wird wenigstens einmal pro Monat durch Messen von nur 50 μl C5-Substrat-Arbeitslösung ohne Enzym analysiert.
Wenn die anfängliche Aktivität der Probe >2000 cpm/50 μl ist, weist dies darauf hin, dass die Probe gesättigt ist und verdünnt werden muß. Die Verdünnungsfaktoren hängen von den verwendeten Proben, der Probensättigung und der Salzkonzentration ab. Die Probe darf nicht mehr als 50 mM Salz (NaCl oder KCl) enthalten, da die C5-Epimeraseaktivität bei höheren Salzkonzentrationen teilweise oder ganz gehemmt wird.
Bei dem C5-Epimerase-Aktivitätsassay werden positive und negative Kontrollen verwendet. Die positive Kontrolle muss alle zwei Monate standardisiert werden, um sicher zu stellen, dass die Stabilität erhalten geblieben ist. Als negative Kontrolle kann nur ein Vektor verwendet werden, der in den gleichen Zellen wie die Probe produziert wurde. Für die mit dem Baculovirus/Insektenzellen- Expressionssystem produzierten C5-Proben wurde beispielsweise die mit dem gleichen System produzierte Acetylcholinesterase als negative Kontrolle verwendet.
Die Proben wurden während dem Vorwärmen der C5-Substratlösung falls nötig verdünnt. Eine 50 μl Probe (Enzym) wurde zu dem vorgewärmten Substrat gegeben und genau 1 h bei + 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl einer Stoplösung für die Enzymreaktion zu der Substrat-Enzym-Mischung gegeben, und diese Reaktionsmischung wurde in ein 20 ml-Wallac-Szintillationsfläschchen gegeben. 13 ml des Szintillationscocktails für den Epimerase-Assay wurden in die Fläschchen gegeben und 10 s gevortext. Die Radioaktivität wurde in drei Versuchen jeweils 2 min nach Inkubation über Nacht mit einem Wallac 1415-Flüssigszintillationszähler gemessen. Der Szintillationszähler liefert die Ergebnisse in cpm/Reaktionsvolumen (50 μl). Wenn eine Probe verdünnt wurde, sollte die Aktivität des Verdünnungspuffers von der Aktivität der Probe abgezogen werden. In jedem Fall wurde die Aktivität der Blindprobe vor der Analyse der Ergebnisse von der Aktivität der Probe abgezogen.
Die spezifische Aktivität wurde bestimmt, indem die Gesamtaktivität (cpm/μl) durch die Gesamtproteinkonzentration (mg/ml) dividiert wurde. Die Gesamtproteinkonzentration wurde mit dem QuantiGold-Assay gemäß Stoschek, C.M., Anal. Biochem 160:301-305 (1987) bestimmt, auf den hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Die Einheit der spezifischen Aktivität ist cpm/mg/h, wobei h (Stunde) die Zeit für die Enzymreaktion beschreibt.
Beispiel 2
Identifizierung des wirklichen N-Terminus der C5-Epimerase durch Analyse der kodierenden Sequenz des Mäusegens und Expression der klonierten cDNA.
Auf Basis der Klonierung und der vorläufigen Sequenzanalyse des putativen, in Beispiel 1 identifizierten murinen C5-Epimerasegens und auf Basis des Alignments mit der zuvor offenbarten bovinen cDNA-Sequenz wurde weitere murine 5'-flankierende DNA-Sequenz isoliert und es wurde eine cDNA kloniert, die diese 5'-flankierende DNA-Sequenz enthielt.
Um festzustellen, ob diese 5'-flankierende DNA-Sequenz für zusätzliche N-terminale Peptidsequenzen codieren könnte, die den wirklichen N-Terminus der von dem Mäusegen codierten C5-Epimerase darstellt, wurde die Maussequenz (Fettdruck in der in 1 gezeigten zusammengefassten Nukleotidsequenz) an die bovine cDNA-Sequenz angefügt, die bereits in einer Computerdatei gespeichert war, wobei die bovine Sequenz verwendet und mit dem Punkt der größten Konservierung (>96 % Aminosäureidentität) begonnen wurde. Dann wurde das Gene Inspector-Programm (Textco, USA) verwendet, um nach offenen Leserahmen (ORFs, die potentielle für Polypeptide codierende Sequenzen sind) in der zusammengefassten Sequenz zu suchen. Das Ergebnis des Sequenz-Alignments ist in 1 gezeigt und die ORF-Analyse ergab die in 2 gezeigten Ergebnisse.
In 1 ist die Fusionsstelle zwischen der neuen Maussequenz und der bovinen Sequenz durch den zweifachen Doppelpunkt "::" wiedergegeben. Der Sequenzanfang nach dem zweifachen Doppelpunkt ist die bovine cDNA-Sequenz. Die Sequenz (in Fettdruck) 5' zur Fusionsstelle stellt die zusätzliche murine 5'-flankierende DNA-Sequenz dar, die wie oben beschrieben isoliert wurde. Die unterstrichene Sequenz ist der gefundene offene Leserahmen, der die für das Polypeptid kodierende Sequenz zeigt.
Es ist bekannt, dass das native C5-Epimeraseenzym im membranösen Golgi-"Kompartiment" (Mikrosomenfraktion) von Zellen (aus Leber) lokalisiert ist. Daher sollte die native Maussequenz ein geeignetes N-terminates Signal für die Translokation zu diesem Kompartiment enthalten. Um dies zu untersuchen, wurde der Algorithmus (das Programm) von Nielsen et al., Protein Engineering 10:1-6 (1997) verwendet. Der Algorithmus analysierte das "Signal"-Potential der ersten 40-60 Aminosäuren jeder der oben angegebenen Polypeptidsequenzen. Als Art Kontrolle für die Effektivität des Programms wurde das gleiche Programm verwendet, um die ersten 40 Reste der murinen Syndecan-1-Polypeptidsequenz zu testen, von der bekannt ist, dass sie ein Sekretionssignal enthält, und das Programm identifizierte diese positiv (Daten nicht gezeigt). Die Analyse zeigte ein starkes Signalpotential für die ersten 33 Reste.
Neben der schon erwähnten 33 Aminosäure langen Signalsequenz umfassen die 154 zusätzlichen N-terminalen Reste weitere Cysteinreste, die Disulfidbrücken bilden und die Proteinfaltung stabilisieren könnten, und eine vorhergesagte Amidierungsstelle (Reste 118-121), die zur posttranslationalen proteolytischen Prozessierung relevant sein könnte. Weitere Analysen der vollständigen Sequenz der C5-Epimerase sagen hydrophobe Polypeptidstränge voraus, die verborgen sein könnten oder durch (eine) Membran(en) hindurchlaufen könnten.
Die Alignment-Analyse an anderen in Datenbanken gefundenen Sequenzen zeigt Homologie-Hotspots. Diese Ergebnisse sind in den 4 und 5 zusammengefaßt.
5 zeigt eine schematische Darstellung der Polypeptidsequenz der murinen C5-Epimerase. Wie in 5 gezeigt, befindet sich die größte evolutionäre Sequenzkonservierung (Homologie-„Hotspots") im näher zum C-terminalen Ende gelegenen Teil in einem stark hydrophoben Abschnitt zwischen den Aminosäureresten Trp497 und Leu523, der der Vorhersage nach in der gefalteten Struktur des Proteins verborgen ist oder durch eine Membran verläuft, möglicherweise in das Lumen des Golgi, wo das Enzym bekanntermaßen aktiv ist. Der andere höchst signifikante und ausgedehnte konservierte Abschnitt ("Hotspot") liegt zwischen den Resten Leu546 und His580 und könnte das aktive Zentrum des Enzyms enthalten oder umfassen. Die funktionelle Bedeutung einer Konservierung der Polypeptidsequenz (Identität) von ≥ 22 % wurde durch publizierte Untersuchungen an anderen Proteinen mit bekannter Funktion bewiesen (Branden, C., und Tooze, J., Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, NY und London, S. 100-101 (1991), und Wilson, Kreychman und Gerstein und andere hier zitierte Autoren, in "Quantifying the relations between protein sequence, structure, and function through traditional and probabilistic scores", erhältlich unter http://bioinfo.mbb.yale.edu/e-print/ann-xfer-jmb/preprint.html. Wie in diesem Artikel erklärt wird, scheint eine genaue Funktion unter 30-40 % Sequenzidentität nicht konserviert zu sein, wohingegen die Funktionsklasse schon bei einer so geringen Sequenzidentität wie 20-25 % konserviert ist. Unter 20 % ist keine generelle Ähnlichkeit mehr konserviert.). SWISS-MODEL generiert zurzeit Modelle für Sequenzen, die auf diese Kriterien reagieren: P-Wert der BLAST-Suche: < 0,00001; genereller Sequenzidentitätsgrad (SIM): > 25 % und Minimal Projected Model Length – 25 Aminosäuren.
Auf dieser Basis lässt sich erkennen, dass die Drosophilasequenz näher mit der Maussequenz verwandt ist (46,6%) als die C. elegans-Sequenz (39,6%).
Bei einer anderen Art von Sequenzanalyse wurde die vorhergesagte dreidimensionale (3D) Struktur der murinen C5-Epimerasesequenz gegen die 3D-Struktur von Kelley, L.A., et al., Mol. Biol. 299(2):499-520 (2000) "gewunden" ("threaded"). Dieser Vergleich zeigt an, dass die C5-Epimerasesequenz eine signifikante Verwandtschaft mit einer Chondroitinase (Chondroitin AC/Alginatlyase)-Domäne aufweist, die ein alpha/alpha-Toroid ist. Die -Chondroitin AC-Lyase ist ein typisches Beispiel für Glycosaminoglycan abbauende Enzyme, deren Struktur/Funktions-Beziehungen mittels Kristallographie aufgeklärt wurden (Fethiere et al., J. Mol. Biol. 288:635-647 (1999)). Bemerkenswerterweise wurde gefunden, dass sich die signifikanteste 3D-Ähnlichkeit mit der Chondroitinsequenz von Ala408 nahe dem C-terminalen Ende eines internen hydrophoben (Transmembran)-Abschnitts bis zum C-Terminus der murinen C5-Epimerasesequenz erstreckt, und dass dieser Abschnitt den größten Teil der konservierten Sequenz enthält, wobei die Konservierung wahrscheinlich anzeigt, dass es sich um eine Domäne handelt, die das aktive Zentrum enthält.
Auf Basis sämtlicher Ergebnisse der obigen Sequenzanalysen wurden zusätzlich zum ersten aktiven rekombinanten (bovinen) C5-Epimerasekonstrukt mit einem „Tag" neue rekombinante C5-Epimerasekonstrukte zur heterologen Sekretion-Expression aus Baculovirus- und InsectSelect-Expressionsystemen (Invitrogen, USA) hergestellt. Die Produkte aus klonierten Insektenzellinien sind, soweit sie charakterisiert sind, in 6A zusammengefaßt. Es sind vier Konstrukte gezeigt. Das erste Konstrukt ist die mit Tag versehene rekombinante bovine C5-Epimerase. Das zweite Konstrukt ist die mit Tag versehene vollständige murine Epimerase. Das dritte Konstrukt ist ein mit Tag versehenes chimäres Konstrukt aus den murinen und bovinen C5-Epimerasesequenzen. Das vierte Konstrukt ist eine mit Tag versehene trunkierte Maussequenz.
In jedem der rekombinanten Konstrukte wurde die C5-Epimerase mit einem Tag versehen. Mit dem Tag ging der C5-Epimerasesequenz eine wie in 6B gezeigte Sequenz voran, die das EGT-Signalpeptid in Verbindung mit der EGT-Signal-Spaltstelle, einer Enterokinase-Spaltstelle, sechs Histidine und schließlich die rTEV-Proteasestelle enthält. Das EGT-Signal stammt aus einem Protein von Baculovirus (das Insektenzellen infiziert). Die FLAG-Sequenz ist ein Epitop-Tag, das zum Nachweis und zur Reinigung rekombinanter Proteine gemäß der vom Hersteller vorgeschlagenen Vorschrift verwendet wird (Sigma) (Hopp, T. et al., Biotechnology 6:1204-1210 (1988)). Die Enterokinase ist ein Enzym, das zur Abspaltung der der Erkennungsstelle vorangehenden Sequenz verwendet wird. Die sechs aufeinanderfolgenden Histidine stellen ein weiteres Tag dar. Die rTEV (rekombinantes Tabakätzvirus)-Proteasestelle wurde ebenfalls verwendet, um vorangehende Sequenzen zu entfernen. Das EGT-Signal und das FLAG^TM-Tag (IBI) wurden aus Konstrukten erhalten, die in einem modifizierten pFastBac^TM (Life Technologies)-Vektor hergestellt wurden, der von Dr. Christian Oker-Blom, VTT Biotechnology, P.O. Box 1500, FIN-02044, VTT, Finnland, zur Verfügung gestellt wurde. Die Reinigung aller rekombinanten Proteine, die in dieser Anmeldung beschrieben sind, basierte auf einem FLAG-Tag.
Die repräsentativen Daten aus den Aktivitätsassays und Proteinanalysen dieser mit Tag versehenen rekombinanten C5-Epimerasen sind in 7 und in Tabelle I und Tabelle II gezeigt. 7 zeigt die Ergebnisse des Aktivitätsassays der murinen C5-Epimerase (mC5), die gemäß der vom Hersteller vorgeschlagenen Vorschrift über anti-FLAG M1 gereinigt worden war.
Der Aktivitätsassay der C5-Epimerase zur Messung der Aktivität des heterologen Proteins wurde wie in obigem Beispiel 1 durchgeführt. Kurz gesagt wurde Gesamtprotein aus Kulturen extrahiert, die mit jedem der rekombinanten C5-Epimerasekonstrukte inokuliert waren, die jeweils mit den InsectSelect-Expressionsystemen in die Insektenzellen transformiert waren. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie geerntet und lysiert und Gesamtprotein wurde isoliert und quantifiziert. Die C5-Epimeraseaktivität wurde in einem Szintillationszähler als Freisetzung von ³H aus dem Epimerasesubstrat gemessen. Epimeraseaktivität wurde gegen Gesamtprotein gemessen. 7 zeigt die Aktivität mit zunehmendem Probenvolumen (1:2000 verdünnt). Die Gesamtaktivität betrug 6360 cpm/μl. Die Proteinanalyse (mit QuantiGold, Diversified Biotech) erfolgte gemäß Stoschek, C.M., Anal. Biochem. 160:301-305 (1987) und zeigte an, dass die Proteinkonzentration 3,2 μg/ml betrug. Daher betrug die spezifische Aktivität 2,0 × 109 cpm/mg/h.
8 zeigt einen mit anti-FLAG angefärbten Western Blot. Spur 1 enthält die Molekulargewichtstandards (New England Biolabs, Broad Range, vorgefärbt). Spur 2 enthält die murine C5-Epimerase voller Länge. Die mit Tag versehene murine C5-Epimerase voller Länge (die die hier gefundenen zusätzlichen N-terminalen Sequenzen enthält) hat eine Länge von 618 Aminosäuren, ein Molekulargewicht (Dalton) von 71189,1, einen isoelektrischen Punkt (pl) von 8,25 und bei pH 7 eine Nettoladung von +4,01.
9 ist ein Western Blot des Kulturmediums, das stabilen Insektenzellinien der verschiedenen Klone für die vier oben beschriebenen, mit Tag versehenen rekombinanten C5-Epimerasen entnommen wurde und mit anti-FLAG-Antikörpern (020300) angefärbt wurde. Spur 1 enthält Molekulargewichtstandards wie in 8, wobei die Molekulargewichte an der Seite des Gels angegeben sind. Spur 2 enthält die trunkierte murine C5-Epimerase. Spur 3 enthält die ursprüngliche bovine C5-Epimerase. Spur 4 enthält die chimäre Maus:Rind-C5-Epimerase, bei der die N-terminalen murinen Sequenzen, wie in 2 und 3 gezeigt, im Leserahmen mit den bovinen Sequenzen fusioniert sind. Spur 5 enthält die vollständige murine C5-Epimerase. Man sieht, dass das chimäre Maus:Rind-Konstrukt ungefähr genauso groß wie das vollständige Maus-Konstrukt ist.
Die relative Aktivität der verschiedenen rekombinanten Konstrukte wurde auf Basis der Aktivitätsassays und der densitometrischen Analyse des Western Blots berechnet und ist unten in Tabelle I angegeben. "TruncC5" bezeichnet die verkürzte Aminosäuresequenz der murinen C5-Epimerase, bei der die ersten 154 Aminosäuren entfernt wurden, so dass die "TruncC5"-Sequenz den gleichen N-Terminus wie die rekombinante bovine Sequenz aufweist. "ExtC5" bezeichnet das rekombinante bovine C5-Epimerasepolypeptid, während "chC5" das chimäre Maus:Rind C5-Epimerasekonstrukt bezeichnet, das von der in 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz codiert wird. "mC5" bezeichnet die vollständige murine C5-Epimerasesequenz. Tabelle I. Relative Aktivitäten verschiedener rekombinanter C5-Epimerasen
Die spezifischen Aktivitäten der verschiedenen teilweise gereinigten rekombinanten C5-Epimerasen sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle II. Spezifische Aktivitäten der teilweise gereinigten rekombinanten C5-Epimerasen.
Das hergestellte chimäre Maus:Rind-Konstrukt enthält die Aminosäurereste 34-154 der N-terminalen Sequenz der murinen Polypeptidsequenz, die unmittelbar, wie in 6B gezeigt, auf die EGT-FLAG-His-rTEV-Elemente folgt. Dieses rekombinante Enzym schien jedoch vorwiegend im Cytosol zurückgehalten zu werden, wahrscheinlich aufgrund des Signalpotentials der murinen Sequenz.
Schlussfolgerung
Das Anhängen eines N-terminalen Polypeptidfragments (Asp34 bis Asp154) aus der murinen Gensequenz verstärkt die Aktivität rekombinanter C5-Epimeraseenzyme um Größenordnungen, obwohl dieses Sequenzstück nicht die größte speziesübergreifende Konservierung enthält. Die mögliche Auswirkung von Tags auf die Aktivität des ersten rekombinanten bovinen Konstrukts wurde untersucht (durch Tag-Entfernung; Daten nicht gezeigt) und könnte einen geringfügigen Faktor für den Unterschied darstellen, aber nicht in dem Ausmaß der größenordnungsmäßigen Unterschiede von spezifischen Aktivitäten zwischen längeren und kürzeren Formen der rekombinanten C5-Epimerase. Derzeit werden Expressionskonstrukte ohne Tag und Struktur/Funktions-Untersuchungen durchgeführt, um die Basis und den Mechanismus zur Kontrolle der Aktivität dieses sehr wichtigen rekombinanten Enzyms besser zu bestimmen. Seguenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95 % identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, die aus den Aminosäuren 1-618 der 3 besteht.
Polynukleotid nach Anspruch 1, welches DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, welches RNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, welches ferner ein heterologes Polynukleotid umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das heterologe Polynukleotid ein heterologes Polypeptid codiert.
Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei sich das heterologe Polynukleotid am 3'-Ende der Nukleotidsequenz befindet.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 1-6.
Vektor nach Anspruch 7, wobei das Polynukleotid funktionsfähig mit einem heterologen regulatorischen Polynukleotid verknüpft ist.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 1-6.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei das isolierte Polynukleotid funktionsfähig mit einem heterologen regulatorischen Polynukleotid verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches umfasst: Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 10 unter solchen Bedingungen, dass das Protein exprimiert wird, und Gewinnen des Proteins.
Isoliertes C5-Epimerase-Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95 % identisch mit einer Sequenz ist, die aus den Aminosäuren 1-618 von 3 besteht.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 12, welches in einer rekombinanten Wirtszelle produziert wird oder darin enthalten ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95 % identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Aminosäuren 1 bis 154 von 3; (b) den Aminosäuren 35 bis 154 von 3; (c) den Aminosäuren 34 bis 154 von 3.
Polynukleotid nach Anspruch 15, welches DNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 15, welches RNA ist.
Polynukleotid nach Anspruch 15, welches ferner ein heterologes Polynukleotid umfasst.
Polynukleotid nach Anspruch 18, wobei das heterologe Polynukleotid ein heterologes Polypeptid codiert.
Polynukleotid nach Anspruch 19, wobei sich das heterologe Polynukleotid am 3'-Ende der Nukleotidsequenz befindet.
Vektor, umfassend das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 15-20.
Vektor nach Anspruch 21, wobei das Polynukleotid funktionsfähig mit einem heterologen regulatorischen Polynukleotid verknüpft ist.
Wirtszelle, umfassend das Polynukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 15-20.
Wirtszelle nach Anspruch 23, wobei das isolierte Polynukleotid funktionsfähig mit einem heterologen regulatorischen Polynukleotid verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches umfasst: Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 24 unter solchen Bedingungen, dass das Protein exprimiert wird, und Gewinnen des Proteins.
Isoliertes C5-Epimerase-Polypeptid, umfassend ein N-terminales Fragment, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95 % identisch mit einer Sequenz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) den Aminosäuren 1 bis 154 von 3; (b) den Aminosäuren 35 bis 154 von 3; (c) den Aminosäuren 34 bis 154 von 3.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 26, welches in einer rekombinanten Wirtszelle produziert wird oder darin enthalten ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 26, wobei die rekombinante Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Verfahren, um die Aktivität einer C5-Epimerase signifikant zu erhöhen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines ersten Polynukleotids, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 90 % identisch mit einer Referenzaminosäuresequenz ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 35 bis 154 von 3 und den Aminosäuren 34 bis 154 von 3; (b) Anhängen dieses ersten Polynukleotids aus (a) an ein zweites Polynukleotid, das eine C5-Epimerase codiert; und (c) Exprimieren des Fusionspolynukleotids.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das erste Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz die Aminosäuren 35 bis 154 von 3 sind.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das erste Polynukleotid eine Nukleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, dessen Aminosäuresequenz die Aminosäuren 34 bis 154 von 3 sind.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 29-31, wobei die C5-Epimerase bovine C5-Epimerase ist.